С.І. Климнюк

І.О. Ситник

М.С. Творко

В.П. Широбоков

П Р А К Т И Ч Н А

М І К Р О Б І О Л О Г І Я

Рекомендовано Центральним методичним кабінетом

з вищої медичної освіти МОЗ України як навчальний посібник

для студентів вищих медичних навчальних закладів IV рівня акредитації

(протокол № 2 від 30.03. 2004 р.)

Тернопіль

“Укрмедкнига”

2004

ББК 28.4я73

П 69

УДК 616-093/-098(075.8)

Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.

Практична мікробіологія: Посібник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. –

440 с.

Матеріал посібника подано відповідно до навчальної програми з курсу мікробіології, іму-

нології та вірусології. Він складається з шести частин. Частина перша – “Загальна мікробіоло-

гія” – містить дані про організацію і режим роботи бактеріологічних лабораторій, методи

дослідження морфології, фізіології, екології та генетики мікроорганізмів, визначення чутли-

вості їх до антибіотиків. Друга частина присвячена імунологічній діагностиці інфекційних

хвороб, методам їх специфічної профілактики та лікування. В третій частині описані основні

властивості збудників бактеріальних інфекцій і методи їх лабораторної діагностики. Четверта

частина присвячена характеристиці і класифікації вірусів та методів класичної і експрес-діаг-

ностики вірусних інфекцій. У п’ятій частині представлені основні відомості про найбільш

поширені гриби, їх морфологічні особливості та лабораторні методи діагностики мікозів. Шоста

частина містить дані про мікроскопічні дані найбільш поширених збудників протозоозів і

методи діагностики захворювань, викликаних найпростішими.

Посібник призначений для студентів медичних факультетів вищих навчальних закладів IV

рівнів акредитації.

ISBN 966-673-059-6

Творко М.С., Широбоков В.П., 2004.

П 69

ББК 28.4я73

УДК 616-093/-098(075.8)

Рецензенти: зав. кафедри імунології, алергології та ендокринології

Буковинської державної медичної академії,

доктор мед. наук, проф. І.Й. Сидорчук;

зав. кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Дніпропетровської державної медичної академії,

доктор мед. наук, проф. Г.М. Кременчуцький.

Передмова

У ХХІ столітті постали важливі і невідкладні проблеми в галузі інфекційної

патології. Економічна нестабільність життя населення, масова міграція людей

призвели до значного погіршення епідеміологічної ситуації відносно особливо

небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, лептоспіроз, та ін.). Значно

зросла захворюваність на туберкульоз, дифтерію, гонорею, сифіліс, харчові

токсикоінфекції.

Швидке постаріння людей, несприятлива екологічна ситуація, збільшення

кількості осіб із супровідними бактерійними, грибковими і протозойними захво-

рюваннями зумовило зростання патологічних процесів, викликаних умовно-

патогенними мікроорганізмами. Широке розповсюдження мають госпітальні,

хронічні, змішані та ендогенні інфекції. З року в рік зростає кількість таких

нозологічних форм, як сепсис, септикопіємії, неспецифічні інфекції, і гнійно-

септичні захворювання шлунково-кишкового тракту, інфікування післяопера-

ційних, опікових і посттравматичних ран, мікробіологічна діагностика яких

розроблена ще недостатньо.

Бурхливий розвиток вірусології, збільшення частоти таких вірусних інфекцій

як грип, гепатити, СНІД, геморагічні гарячки, енцефаліти, герпес, краснуха та

ін. вимагають ретельного вивчення студентами особливостей їх лабораторної

діагностики.

У програмах і навчальних планах чільне місце відводиться вивченню важливих

проблем імунології, освоєнню методів імунологічної діагностики інфекційних

хвороб, визначенню тестів імунологічного статусу людини, знайомству з

методами виготовлення вакцин, діагностикумів, імунних сироваток тощо. Окрім

того, у ВНЗ введено курс клінічної імунології, а в окремих з них створені навіть

кафедри імунології. Це вимагає детального викладу постановки необхідних реакцій

і тестів, методика і оцінка яких зазнали чималих змін.

У даному посібнику описані способи і методики мікроскопічної, бакте-

ріологічної (вірусологічної), серологічної, імунологічної, біологічної та алерго-

логічної діагностики інфекційних хвороб. Велика увага приділена використанню

експрес-діагностики, новітнім люмінесцентно-серологічним дослідженням,

реакціям коаглютинації і латекс-аглютинації, застосуванню таких високо-

чутливих методів як імуноферментний, імуноелектронний, радіоімунний, визна-

чення імунних комплексів, моноклональних антитіл, реакцій гальмування гема-

глютинації, непрямої гемаглютинації та ін.

Назви мікроорганізмів, схеми їх класифікацій подано відповідно до між-

народної системи та номенклатури, викладених у “Bergey’s manual of systematic

bacteriology” (1994).

Усі критичні зауваження і побажання щодо покращання посібника автори

приймуть із щирою вдячністю.

Список умовних скорочень

АО – антитоксична одиниця

БУО – бляшкоутворююча одиниця

ВІЛ – вірус імунодефіциту людини

ГНТ – гіперчутливість негайного типу

ГСТ – гіперчутливість сповільненого типу

ДНК – дезоксірибонуклеїнова кислота

ІФА – імуноферментний аналіз

КОА – коаглютинація

КУО – колонієутворююча одиниця

ЛАГ – латекс-аглютинація

МО – міжнарожна одиниця

МПА – м’ясо-пептонний агар

МПБ – м’ясо-пептонний бульйон

ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція

РА – реакція аглютинації

РГА – реакція гемаглютинації

РГадс – реакція гемадсорбції

РГГА – реакція гальмування гемаглютинації

РГГадс – реакція гальмування гемадсорбації

РГНГА – реакція гальмування непрямої гемаглютинації

РЗК – реакція зв’язування комплементу

РЗНГА – реакція зворотної непрямої гемаглютинації

РІА – радіоімунний аналіз

РІФ – реакція імунофлуоресценції

РНГА – реакція непрямої гемаглютинації

РН – реакція нейтралізації

РНК – рибонуклеїнова кислота

РП – реакція преципітації

РПГ – реакція преципітації в гелі

СНІД – синдром набутого імунодефіциту

Розділ 1

ОРГАНІЗАЦІЯ, УСТАТКУВАННЯ, РЕЖИМ РОБОТИ

БАКТЕРІОЛОГІЧНИХ, ІМУНОЛОГІЧНИХ

І ВІРУСОЛОГІЧНИХ ЛАБОРАТОРІЙ

Бактеріологічні лабораторії – спеціальні науково-дослідні, науково-прак-

тичні або практичні установи, в яких проводять мікробіологічні, біологічні та серо-

логічні дослідження. Їх організовують при профільних науково-дослідних інститу-

тах, навчальних закладах, клінічних лікарнях, санітарно-епідеміологічних станціях

(СЕС). Мікробіологічні лабораторії в лікувально-профілактичних установах вико-

нують відповідні аналізи з метою діагностики інфекційних хвороб, визначення

строків виписування хворих з лікувальних закладів, визначення чутливості збуд-

ників до антибіотиків та інших препаратів, здійснюють контроль за ефективністю

хіміотерапії, дотриманням санітарно-протиепідемічного режиму.

Бактеріологічні лабораторії районних СЕС проводять санітарно-бактеріоло-

гічні аналізи води і харчових продуктів, мікробіологічні дослідження випорожнень,

сечі, жовчі, блювотних мас, промивних вод шлунка з метою виявлення хворобо-

творних і умовно-патогенних бактерій, виділення гемокультур при черевному тифі,

паратифах, сепсисі та інших захворюваннях. Досить часто тут роблять аналізи

харкотиння, слизу з рото- і носоглотки для виділення збудників туберкульозу, диф-

терії, коклюшу, назофарингіту, проводять серологічну діагностику тифів, туля-

ремії, бруцельозу, дослідження крові на виявлення малярійних плазмодіїв.

Бактеріологічні лабораторії міських і обласних СЕС, окрім вищеперелічених

досліджень у більш повному обсязі, проводять аналізи повітря, посіви перев’язу-

вальних матеріалів та лікарських препаратів на стерильність, змивів з рук, інстру-

ментів та інвентаря лікарняних і дитячих закладів, підприємств громадського хар-

чування, за епідеміологічними і санітарними показаннями, а також для перевірки

якості поточної і заключної дезінфекції. У лабораторіях такого рангу проводять

повний аналіз на кокову, анаеробну і кишечну мікрофлору, постановку реакцій

нейтралізації правцевого, ботулінового і стафілококового токсинів, визначення

чутливості виділених збудників до антибіотиків методом серійних розведень, серо-

логічні та люмінесцентно-серологічні дослідження при інфекційних захворюван-

нях, фаготипування і бактеріоцинотипування сальмонел і стафілококів, визначення

видів атипових мікробних культур. З метою попередження або виявлення госпіталь-

Частина І

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

Частина І. Загальна мікробіологія

них інфекцій проводять дослідження носійства стафілококів, сальмонел та інших

мікроорганізмів серед медичного персоналу, а також серед працівників харчоб-

локів і служб водопостачання для профілактики харчових токсикоінфекцій,

здійснюють діагностику дисбактеріозів.

Планування, організація, устаткування і режим роботи бактеріологічної ла-

бораторії повинні забезпечити основні вимоги до таких специфічних установ, тобто

створити умови, які б забезпечили проведення досліджень при дотриманні сте-

рильності, гарантували безумовне виключення можливого зараження персоналу і

відвідувачів та спонтанну контамінацію мікробами довкілля, живильних середо-

вищ, виділених чистих культур та інших матеріалів.

У структуру звичайної мікробіологічної лабораторії входить ряд приміщень

спеціального призначення: одна або декілька лабораторних кімнат, бокс із перед-

боксником, приміщення для приготування живильних середовищ (кухня), авто-

клавна (стерилізаційна), термостатна, мийка, препараторська, кімната для забору

або прийому досліджуваного матеріалу і його реєстрації, віварій для лаборатор-

них тварин. Ус і приміщення розташовують так, щоб заразний (“брудний”) матеріал

не стикався і не перехрещувався з “чистим”.

Функціональні кабінети мають бути світлими, просторими, теплими, з підве-

денням гарячої і холодної води, електричного струму, з виходом вікон на північ

або північний захід. Стіни, двері, підлогу виготовляють із матеріалів, які легко

миються і дезінфікуються.

Лабораторна кімната – основне приміщення для проведення досліджень. Жор-

сткий протиепідемічний режим роботи вимагає її щоденного вологого прибиран-

ня та щомісячного проведення дизінфекції підлоги, стін, столів і обладнання. Ро-

бочі столи покриваються спеціальним пластиком або склом. У лабораторії доц-

ільно виділити й обладнати окремі робочі місця та закріпити їх за кожним

співробітником.

На робочому столі лікаря-мікробіолога повинні знаходитись тільки предмети,

необхідні для проведення бактеріологічних досліджень: газовий пальник (спир-

тівка), пастерівські й градуйовані піпетки, пінцети, бактеріологічні петлі, шпателі,

предметні та покрівні скельця, пробірки, штативи, чашки Петрі, аглютиноскоп,

лупа, мікроскоп, банка з дезінфікуючим розчином. Біля стола повинна стояти по-

судина з дезрозчином, куди опускають відпрацьований заразний матеріал, який

потім автоклавується.

Меблі бактеріологічної лабораторії мають бути простими, зручними, які легко

миються і дезінфікуються. Сучасна лабораторія оснащується мікроскопами, авто-

клавами, термостатами, сушильними шафами, центрифугами, дистилятором, апа-

ратом для згортання сироватки, рН-метром, холодильником, лабораторною вагою,

фотоелектроколориметром, апаратом для автоматичного підрахунку колоній, бак-

терійними фільтрами, комп’ютером, бактерицидними лампами.

Для проведення мікробіологічних досліджень в особливо стерильних умо-

вах відводять окрему кімнату або бокс. Його площа повинна розраховуватись для

роботи двох чоловік (5-8 м

), мати окремий вхід через тамбур (передбоксник).

Розділ 1. Організація, устаткування, режим роботи лабораторій

Меблі, які встановлюють у боксі (стіл, стільці, невелика шафа для стерильного

посуду, середовищ тощо), мають бути простими, краще металевими, що спрощує

їх знезараження. Стіни покривають облицювальною плиткою або світлою масля-

ною фарбою, підлогу вистилають гладенькими плитами або лінолеумом. У там-

бурі має бути водопровідний кран і умивальник для миття рук.

Сучасні бокси мають систему подачі стерильного повітря або ламінарних його

потоків, що створює найкращі умови стерильності й безпеки. Перед початком і

після роботи проводять вологе прибирання, дезінфекцію та опромінення бактери-

цидними лампами протягом 1-2 год. Повітря боксів систематично перевіряють на

обсіменіння мікробами.

Для малих об’ємів роботи існують переносні настільні бокси або бокси-сто-

ли. Робочу його частину складає невелика скляна камера (100×70×70 см), яка має

два отвори для рук, оснащені спеціальними нарукавниками. Кращим варіантом

таких боксів є бокс з ламінарним потоком стерильного повітря.

Окрім звичайних бактеріологічних лабораторій в усіх обласних центрах, а

також у великих морських портах організовують лабораторії для проведення діаг-

ностики особливо небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, бруце-

льоз, сап, меліоїдоз, лептоспіроз, геморагічні гарячки та ін.). У цих лабораторіях

встановлюють більш жорсткий протиепідемічний режим, який регламентується

спеціальними інструкціями. Тут працює спеціально підготовлений персонал; осо-

би, які мають протипоказання для проведення щеплень, до роботи в таких лабо-

раторіях не допускаються.

Вірусологічні лабораторії – установи, які вивчають віруси, проводять діаг-

ностику вірусних інфекцій, виготовляють різноманітні вірусні препарати (вакци-

ни, діагностикуми, противірусні імунні сироватки тощо). Устрій та їх оснащення

дещо відрізняються від бактеріологічних лабораторій. У структурі вірусологічної

лабораторії обов’язково повинен бути бокс з тамбуром і ряд підсобних приміщень

для обробки і стерилізації посуду, виготовлення живильних середовищ для виро-

щування клітинних культур, інкубатора для розвитку курячих ембріонів, устатку-

ванням для ліофілізації вірусів, віварій та ін.

Окрім звичайного лабораторного оснащення, необхідно мати гомогенізатори

для подрібнення тканин, камери для глибокого і надмірного заморожування до

температур -30-70 °С, холодильники, які можуть тримати температуру -20 °С, цен-

трифуги на 2-3, 12-15 і 60 тис. об/хв. Для збереження клітинних культур потрібні

судини Д’юара з рідким азотом.

Перед і після роботи проводять вологе прибирання та дезінфекцію приміщень

таким же способом, як і бокси в бактеріологічних лабораторіях.

У мікологічних лабораторіях проводять мікроскопічні дослідження та

ідентифікацію культур патогенних грибів з метою діагностики мікозів, рідше –

ставлять досліди на тваринах. Режим їх роботи повинен попередити розсіювання

зараженого грибами матеріалу, щоб уникнути інфікування персоналу. Робочі місця

тримають у зразковому порядку, особистий одяг і речі зберігають у спеціально

відведеному місці.

Частина І. Загальна мікробіологія

Лабораторні столи покривають листовим склом, одну половину якого знизу

фарбують у чорний колір, другу – в білий. На чорному фоні краще помітні світлі

культури грибів, на білому – відтінки пігменту досліджуваних колоній. Необхідно

мати лампу з фільтром Вуда для відбору ураженого волосся при освітленні ультра-

фіолетовими променями.

При роботі з пліснявими грибами, які утворюють величезну кількість летючих

спор, для захисту дихальних шляхів необхідно користуватись марлевими пов’яз-

ками (масками). Досліджуваний матеріал беруть лише за допомогою інструментів:

ложечок Фолькмана, лопаточок, манікюрних кусачок, епіляційних, анатомічних

та хірургічних пінцетів, платинових петель, препарувальних голок тощо. Знезара-

ження відпрацьованих матеріалів проводиться такими ж способами, як і в бакте-

ріологічних лабораторіях.

Діагностичні мікологічні лабораторії організовують при шкірно-венерологіч-

них диспансерах. Із збудниками особливо небезпечних мікозів (бластомікоз, гісто-

плазмоз, кокцидіомікоз) працюють лише в спеціально оснащених лабораторіях.

Паразитологічні лабораторії – науково-практичні й практичні діагностичні

установи, в яких здійснюються макроскопічні, мікроскопічні та імунологічні до-

слідження з метою діагностики паразитарних хвороб. Їх організація і устаткування

принципово мало відрізняються від оснащення бактеріологічних лабораторій.

Обов’язково мають бути мікроскопи з окулярними мікрометрами та нагрівальни-

ми столиками.

Макроскопічні методи дослідження полягають у виявленні паразитів на

зовнішніх покривах хворого або в його випорожненнях. За допомогою мікрос-

копічних методів виявляють збудників у мазках крові, інших біологічних ріди-

нах, шматочках м’язів, взятих при біопсії, а також у харкотинні, фекаліях та

інших виділеннях. Останнім часом досить широко використовують імунологічні

методи діагностики паразитарних хвороб, особливо аскаридозу, трихінельозу і

ехінококозу.

Для попередження проникнення паразитів із досліджуваних матеріалів у рот

необхідно користуватися піпетками з гумовими грушами. При дослідженні фе-

калій препарати з них слід виготовляти у витяжній шафі.

Весь заразний і відпрацьований матеріал треба кип’ятити, автоклавувати або

обробляти дезінфікуючим розчином.

Імунологічні лабораторії виникли лише в другій половині ХХ століття. До

цього серологічні дослідження проводили в звичайних бактеріологічних лабора-

торіях. Бурхливий розвиток імунології, розробка оригінальних методик і діагнос-

тичних тестів призвели до створення спеціальних імунологічних лабораторій, які

можуть бути самостійними структурними одиницями або існувати в складі мікро-

біологічних лабораторій. Вони оснащуються термостатами, холодильниками, цент-

рифугами, спеціальним посудом і приладами чи пристроями для проведення іму-

нологічних реакцій у великих кількостях.

У сучасних імунологічних лабораторіях визначають біля 30 показників гу-

морального й клітинного імунітету (кількість Т- і В-лімфоцитів, концентрації ос-

Розділ 1. Організація, устаткування, режим роботи лабораторій

новних класів імуноглобулінів, фагоцитарна реакція лейкоцитів, реакція бласт-

трансформації лімфоцитів, циркулюючі імунні комплекси та ін.).

Для діагностики багатьох бактерійних, вірусних, паразитарних і протозойних

хвороб широко використовують різні варіанти реакцій аглютинації, преципітації,

нейтралізації, зв’язування комплементу, імунофлуоресценції, імуноелектрофорезу,

радіоімунного та імуноферментного аналізу тощо.

При проведенні бактеріологічних і вірусологічних досліджень у лабораторіях

відповідного профілю співробітники повинні дотримуватись протиепідемічного

режиму і встановлених правил роботи:

1. До роботи в бактеріологічній (вірусологічній) лабораторії допускаються

особи, які обізнані з правилами роботи в ній.

2. Кожен співробітник повинен працювати лише на закріпленому за ним ро-

бочому місці.

3. Персонал лабораторії повинен мати індивідуальний спецодяг (халат, ша-

почку, взуття). У боксі працюють у стерильних халатах, шапочках і марлевих мас-

ках. При зараженні й розтині тварин одягають ще й фартух, нарукавники й гумові

рукавички.

4. Курити, вживати їжу й зберігати харчові продукти в лабораторії категорич-

но заборонено.

5. Матеріал, що надходить у лабораторію для дослідження, завжди вважають

заразним, його обов’язково записують у спеціальному журналі і маркірують.

6. Відпрацьовані культури мікробів і заразні матеріали підлягають обов’язко-

вому щоденному знищенню. Робочі столи і використані інструменти дезінфікують.

7. Переливати рідини, які містять патогенні мікроорганізми, необхідно над

посудиною з дезінфікуючим розчином. При набиранні таких рідин у піпетки по-

трібно користуватися гумовими балонами або грушами.

8. Коли при розбиванні колби чи пробірки заразний матеріал або жива куль-

тура потрапляє на робочий стіл, інші меблі, одяг, руки, підлогу, треба негайно

повідомити про це завідувача лабораторії або лікаря-бактеріолога і в його присут-

ності провести дезінфекцію заражених ділянок, потім обробити руки дезрозчи-

ном і ретельно їх вимити.

9. У лабораторії не дозволяються зайві ходіння, різні рухи, непотрібні розмо-

ви. Виконання цих вимог попереджує проникання сторонніх мікробів із повітря й

ротової порожнини в досліджуваний матеріал.

10. Необхідно завжди уникати втрат і виносу з лабораторії заразного матері-

алу, живих культур та інфікованих тварин. Усі термостати, рефрижератори та сей-

фи з культурами потрібно обов’язково пломбувати. Контролює виконання цих

правил завідувач лабораторії або лікар-бактеріолог.

11. Музейні або виділені культури, якщо це необхідно, зберігають в агарових

стовпчиках під вазеліновим маслом або в запаяних ампулах у ліофілізованому стані.

12. Після закінчення роботи столи дезінфікують, проводять вологе прибирання

лабораторії з використанням дезінфікуючих розчинів. Предмети, матеріали, інструмен-

ти, інфіковані під час роботи, збирають у баки (відра) і в той же день стерилізують.

Частина І. Загальна мікробіологія

Правила поводження з живими культурами, виділеними в процесі досліджен-

ня, а також із музейними штамами мікроорганізмів, залежно від ступеня їх пато-

генності, регламентуються відповідними інструкціями.

Робота в лабораторіях, де проводять мікробіологічну діагностику особливо

небезпечних інфекцій, вимагає ще більш жорсткого протиепідемічного режиму.

Перед входом до лабораторії в гардеробній з індивідуальними шафами співробіт-

ники знімають верхній одяг і білизну.

Залежно від об’єму і характеру роботи одягають один із чотирьох типів про-

тичумних костюмів у певній послідовності: піжама, шкарпетки, тапки, капюшон

(косинка), протичумний халат, чоботи. Респіратор (маску) одягають так, щоб зак-

рити рот і ніс, закладають ватні тампони з обох боків носа, потім надівають окуля-

ри, гумові рукавички, за пояс халата з правого боку закладають рушник, змочений

у дезрозчині.

По закінченні роботи руки в рукавичках занурюють у 5 % розчин лізолу на

2 хв. Протичумний костюм знімають у зворотній послідовності, за винятком ру-

кавичок, які, не знімаючи з рук, занурюють у ємкість із дезінфікуючим розчином

після зняття кожного предмета одягу і знімають останніми. Одяг складають зовн-

ішньою стороною всередину і дезінфікують або автоклавують. Окуляри поміща-

ють у 70 % спирт.

Після розтину трупів тварин усі інструменти кип’ятять у розчині лізолу про-

тягом 40 хв, а самі трупи та відпрацьовані матеріали спалюють або автоклавують.

Розділ 2

МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

При проведенні мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб з метою

їх раннього і остаточного розпізнавання у сучасних лабораторіях використовують

різні методи дослідження.

Мікроскопічний (бактеріоскопічний, вірусоскопічний, протозооскопічний) –

виготовлення й забарвлення мазків із досліджуваного матеріалу від хворого і вив-

чення його під мікроскопом. Він дає змогу швидко виявити характерні морфо-

логічні особливості збудника й має важливе значення при діагностиці гонореї,

менігококового менінгіту, туберкульозу, лепри, сифілісу, поворотного тифу, віспи,

малярії, лейшманіозу, токсоплазмозу тощо.

Бактеріологічний метод зводиться до посіву матеріалу від хворого на від-

повідні живильні середовища, виділення чистої культури збудника й визначення

його виду, а, отже, і встановлення остаточного діагнозу захворювання. Він має

вирішальне значення при діагностиці черевного тифу, дизентерії, холери, дифте-

рії, чуми та інших хвороб.

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

Серологічний метод базується на виявленні специфічних антитіл у сиро-

ватці крові хворих до певного збудника. Для цього використовують різні імуно-

логічні (серологічні) реакції: аглютинації, преципітації, зв’язування комплементу

тощо. Так, наприклад, при черевному тифі часто ставлять реакцію аглютинації

Відаля, при бруцельозі – реакцію Райта, при хронічній гонореї – реакцію зв’язу-

вання комплементу Борде-Жангу та ін.

Біологічний (експериментальний) метод полягає у зараженні чутливих лабо-

раторних тварин виділеною чистою культурою збудника, досліджуваним матеріа-

лом або введенні бактерійних токсинів і відтворенні типової картини захворювання.

Для цього використовують білих мишей, щурів, гвінейських свинок, кроликів.

Цим методом визначають і вірулентність мікробів. З діагностичною метою біоло-

гічну пробу часто використовують при чумі, сибірці, туляремії, правці, ботулізмі

анаеробній газовій інфекції, кліщовому енцефаліті тощо.

Алергічний метод дає змогу встановити діагноз за допомогою внутрішньо-

шкірних алергічних проб, які виявляють стан підвищеної чутливості до збудника

чи продуктів його життєдіяльності (алергенів). Цим методом широко користуються

при діагностиці туберкульозу (проба Манту), бруцельозу (проба Бюрне), туляремії

та багатьох інших хвороб.

Для глибокого розуміння, засвоєння і логічного застосування бактеріоскопіч-

ного методу діагностики важливе значення має фундаментальне вивчення морфо-

логі й ультраструктури мікробів, методів їх простого й складного забарвлення,

виявлення окремих структур і включень у бактерійній клітині. З цією метою в

лабораторії широко використовують сучасні мікроскопи — високоінформативні

оптичні прилади.

Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, тому побачити їх

неозброєним оком неможливо. У той же час морфологія мікробів, їх розміри, фор-

ма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня

ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою

класифікації. Зважаючи на це, одним з найважливіших методів дослідження будо-

ви мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів до-

слідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як

темнопольна, фазово-контрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна,

люмінесцентна та ін. При вивченні анатомії й ультраструктури вірусів використо-

вують електронну мікроскопію.

Сучасна промисловість випускає багато видів мікроскопів залежно від їх при-

значення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користують-

ся мікроскопами МБР-1, МБР-3 (рис. 1).

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До ме-

ханічної входять штатив, тубус, револьвер, предметний столик, макро- й мікрогвинт,

до оптичної – об’єктиви й окуляри, до освітлювальної – дзеркало й конденсор.

Частина І. Загальна мікробіологія

У верхній частині штатива

є тубус, в який вставляється оку-

ляр, а знизу він має револьвер, в

отвори якого вгвинчені 3-4 об’єк-

тиви. Обертаючи револьвер,

можна встановити будь-який

об’єктив під отвір тубуса. Остан-

ній підіймається і опускається за

допомогою макро- й мікромет-

ричного гвинтів. Для грубого на-

ведення зображення користують-

ся макрогвинтом. Більш точно

це робиться за допомогою мікро-

гвинта. Мікрометричний гвинт є

однією з найбільш тендітних ча-

стин мікроскопа й вимагає обе-

режного поводження з ним.

Предметний столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знахо-

диться отвір, над яким розміщують предметне скло з препаратом (мазком). У більш

досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеці-

альних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикуляр-

них напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох

лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (×8, ×40) та

імерсійні (×90, ×120). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою

яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, у зв’язку з різницею

показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових

променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єкти-

ви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедро-

ва, персикова олія чи “імерсіол”, коефіцієнт заломлення світла яких такий самий,

як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переваж-

но імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна

здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі

роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена

такими явищами, як хроматична й сферична аберації, дифракція та ін. Якщо обидва

види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній сис-

темі і його усунути або принаймі зменшити практично неможливо. Дифракція в

значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вира-

хувати за формулою:

α⋅

sinn

61,0A

Рис.1. Мікроскопи МБР-1 (а) і МБР-3 (б).

аб

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

де А – роздільна здатність; 0,61 – коефіцієнт геометричних величин при ви-

рахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; λ – довжина світло-

вої хвилі; n· sinα – постійна величина для кожного об’єктива, яка називається чис-

ловою або нумеричною апертурою. У сучасних сухих об’єктивах вона не пере-

більшує 0,95, а в імерсійних – від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані

на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх

нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним

об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність

дорівнює:

мкм2,0

60,1

55,0

61,0A ==

Отже, при користуванні навіть найкращими імерсійними об’єктивами немож-

ливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення

об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів.

Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при вико-

ристанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить

від об’єктива, не додаючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими

збільшеннями: ×7, ×10, ×15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається

із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в кон-

денсор, а через нього – в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала увігнутий, дру-

гий – плоский. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише

плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка

променів в одній точці (фокус), яка знаходиться в площині досліджуваного препа-

рату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня

предметного столика, з штучним – опускати доти, поки зображення джерела світла

не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів

конденсор також опускають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діафрагмою, яка

знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно

до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при

відкритій, а незабарвлені – при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується

зображення та розширюються межі видимості. Перше досягнуто випуском мікро-

скопів-бінокулярів, друге – дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний

мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це

створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають

відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночас-

но досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших

клітин оптична промисловість випускає більш досконалі мікроскопи. Одним із них

Частина І. Загальна мікробіологія

є мікроскоп універсальний біологічний дослідницький МБД-15. За його допомогою

можна проводити широкий об’єм мікроскопічних досліджень: візуальне спостере-

ження, використання світлого і темного полів зору в прямому, косому та відбитому

світлі, метод фазових контрастів, люмінесцентну та інтерференційну мікроскопію.

Для мікрофотографування досліджуваних об’єктів мікроскоп оснащений фотоапа-

ратом з автоматичним затвором, фотоекспонометром та імпульсною лампою.

При вивченні динаміки розвитку і розмноження мікроорганізмів, дії на них

різних фізичних і хімічних факторів, утворення L-форм та інших проблем виго-

товляють спеціальні мікроскопи з мікроустановками для цейтраферної (перерив-

частої) мікрокінозйомки, особливо з використанням методу фазових контрастів.

Правила роботи з імерсійною системою:

1. Підняти конденсор Аббе до рівня предметного столика, повністю відкрити

іріс-діафрагму.

2. Користуючись об’єктивом 8, за допомогою плоского дзеркала домогтися

максимального освітлення поля зору.

3. На предметному столику розмістити забарвлений препарат-мазок, нанести

на нього кедрову олію і закріпити клемами.

4. Повертаючи револьвер, встановити над препаратом імерсійний об’єктив

90, під контролем зору занурити його в краплю кедрової олії.

5. Дивлячись в окуляр лівим оком (не закриваючи правого), спочатку за допо-

могою макрогвинта знайти контури зображення, потім, користуючись мікрогвин-

том, досягти максимальної чіткості, вивчити і замалювати препарат.

6. Після закінчення роботи підняти тубус, зняти предметне скло, обережно

витерти імерсійний об’єктив від кедрової олії, повернути його вбік, опустити тубус.

Освітлення за методом Келлера. Найкращі результати мікроскопії при суб’єк-

тивних дослідженнях і мікрофотографуванні можна отримати лише при умові

чіткого центрування всіх оптичних частин мікроскопа, включаючи і систему ос-

вітлення. Цього досягають при використанні методу Келлера.

1. Фабричний освітлювач з “точковим” джерелом світла встановлюють на

віддалі 25-30 см від мікроскопа так, щоб плоске дзеркало відкидало світлову пля-

му діаметром біля 8 мм на закриту діафрагму конденсора. За цим процесом слідку-

ють за допомогою дзеркальця, покладеного на праву ніжку мікроскопа.

2. На предметний столик вміщують препарат, користуючись сухими об’єкти-

вами (×8, ×40), наводять чітке зображення, знімають окуляр і на верхній кінець

тубусу кладуть матове скельце. На ньому видно зображення об’єкта в центрі світло-

вої плями. При необхідності установку коригують. Відкривають до оптимального

діаметра отвір діафрагми конденсора.

3. Встановлюють необхідний об’єктив і окуляр (краще ×10) і приступають до

вивчення або фотографування досліджуваного об’єкта.

Препарати-мазки слід виготовляти на предметних скельцях товщиною не

більше 1,1-1,4 мм.

Темнопольна мікроскопія відрізняється від звичайної імерсійної світлової

способом освітлення препарату. У звичайному мікроскопі об’єкт досліджують при

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

світлі, яке проходить, у темнопольному – при боковому освітленні. Для мікроско-

пії в темному полі використовують замість конденсора Абб е спеціальний парабо-

лоїд-конденсор (кардіоїд-конденсор), в якому бокова поверхня дзеркальна, а цент-

ральна частина нижньої лінзи затемнена, в результаті чого утворюється темне поле

зору. Яскраві бокові промені, відбиваючись від дзеркальної поверхні, фокусуються

в площині об’єкта, але в очі мікроскопіста не потрапляють. В об’єктив проникають

лише ті промені, які відбиваються частинками препарату завдяки заломленню або

дифракції. Отже, на темному полі зору мікробні клітини й інші дрібні частинки

виглядають дуже яскравими. Картина нагадує миготливі зірки на темному небі.

Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02-

0,04 мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому

темнопольний мікроскоп часто називають ультрамікроскопом. Мікроскопію в тем-

ному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення

збудників сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу. Але при цьому не можна доб-

ре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані

видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та лю-

мінесцентна.

Фазово-контрастна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження про-

зорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту

зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи

світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникних променів. У різних ділянках

клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неод-

накові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помічають. Але їх можна

зробити видимими за допомогою спеціально-

го фазово-контрастного пристрою (рис. 2). Він

включає в себе конденсор з набором кільце-

вих діафрагм, які забезпечують освітлення

препарату повним конусом світла, та фазово-

контрастні об’єктиви. Вони відрізняються від

звичайних об’єктивів тим, що в їх головному

фокусі розташовується напівпрозора фазова

пластинка у вигляді кільця. Саме вона викли-

кає здвиг фази світла, що проходить через неї.

Це дозволяє зробити незабарвлені препарати

чітко видимими.

При роботі з фазово-контрастним при-

стрієм клітини можуть виглядати темними (по-

зитивний фазовий контраст) або світлими (не-

гативний контраст) у порівнянні з оточуючим

фоном. Цей вид мікроскопії не збільшує роз-

дільної здатності, але дозволяє виявити нові

деталі внутрішньої структури живих бактерій,

стадії їх розвитку, зміни під впливом антибіо-

Рис.2. Фазово-контрастний пристрій:

а – допоміжний мікроскоп; б – револь-

верний конденсор з діафрагмами;

в – спеціальні об’єктиви-ахромати.

аб

Частина І. Загальна мікробіологія

тиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність

зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні пе-

реваги перед фазово-контрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазово-контрастної, при якій викори-

стовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у

вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько

10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричне-

вим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву

основну частину дифрагованого світла, у той час як темний шар кільця затримує

небажане периферійне дифраговане світло. За рахунок цього в значній мірі усу-

вається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких ма-

локонтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віру-

си. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стерео-

скопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набу-

вають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія базується приблизно на тих же принципах,

що й фазово-контрастна. Але на відміну від останньої вона дає можливість вивча-

ти деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається зав-

дяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку

об’єкта, а другий – поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються та інтерферу-

ють між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим са-

мим масу різних структур у клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентра-

цію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки

про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційну мікроскопію використовують у цитологічних дослідженнях,

при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпрос-

тіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в

мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або

вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих

їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі настає через світіння са-

мого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовими променями.

Метод побудований на використанні явища флуоресценції. Оскільки більшість

хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочат-

ку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які

зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найча-

стіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, кори-

фосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного

тиску, пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією такого опромі-

нення забарвлені флуорохромом бактерії починають світитися червоним, зеленим,

жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифос-

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

фіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном

збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато чутливіший порівняно з іншими

мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збуд-

ника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції диферен-

ціюють окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Вико-

ристання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення,

висока контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів

і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби,

які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінес-

центні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей ме-

тод успішно використовують для експрес-діагностики багатьох бактерійних і вірус-

них захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18,

ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроско-

пами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів,

фотонасадку, дає змогу проводити одночасно комбіновані спостереження: люміне-

сцентне – при освітленні препарату зверху і фазово-контрастне – в проникному

світлі (рис. 3).

Електронна мікроскопія. Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітин-

ному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки

вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний

прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку елект-

ронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис. до

5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі

(растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.

Принципова схема просвічуючого елект-

ронного мікроскопа мало чим відрізняється від

звичайного оптичного. Можливості світлово-

го мікроскопа обмежені не якістю лінз, а вели-

кою довжиною світлових хвиль (0,29-0,8 мкм).

Мала довжина хвилі електронів (0,0002 мкм і

навіть менше) дозволяє значно збільшити роз-

дільну здатність електронного мікроскопа.

Замість світла в ньому використовують потік

електронів, джерелом яких є вольфрамова нит-

ка, що нагрівається електричним струмом

(електронна пушка). Роль лінз оптичного

мікроскопа виконує кругове електромагнітне

поле. Пучки електронів, проходячи через дос-

ліджуваний об’єкт, відхиляються під різними

кутами залежно від неоднакової товщини та

Рис.3. Люмінесцентний мікроскоп.

Частина І. Загальна мікробіологія

щільності різних ділянок препарату і потрапляють в об’єктивну лінзу. В ній появ-

ляється перше корисне збільшення об’єкта.

Після об’єктивної лінзи електрони потрапляють у проміжну лінзу, яка слу-

жить для плавного збільшення зображення. Проекційна лінза створює кінцеве

збільшене зображення об’єкта, яке направляється на флуоресціюючий екран. Зав-

дяки взаємодії швидких електронів з люмінофором екрану виникає видиме зобра-

ження об’єктів. Після наведення чіткості проводять фотографування.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об’єктів досліджен-

ня. Необхідна спеціальна фіксація тканин або бактерій, їх ретельне зневоднення,

заливка в епоксидні смоли, виготовлення ультратонких зрізів. Для підвищення

чіткості зображення використовують методи позитивного й негативного контрас-

тування та відтінення.

Досліджуваний об’єкт спочатку зафіксовують особливими фіксаторами, потім

наносять на надзвичайно тонку колодієву або целюлозну плівку, вміщену на спеці-

альну сіточку-підкладку. При напиленні на поверхню препарату під певним кутом

у вакуумі наносять тонким шаром важкі метали, хром, золото, паладій. Розпоро-

шені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій

або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються

рельєфно й контрастно (позитивне контрастування). Негативне контрастування

зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприк-

лад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осідаючи навколо білкових частинок дос-

ліджуваного об’єкта й заповнюючи всі проміжки

між ними, атоми важких металів “забарвлюють”

фон, на якому виступають найменші деталі бу-

дови мікроорганізмів.

Широко також використовують ультратонкі

зрізи клітин, бактерій, що дає змогу вивчити їх

структуру на субклітинному й молекулярному

рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промис-

ловість випускає багато моделей електронних

мікроскопів (рис. 4), які мають величезні мож-

ливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методи електронної мікроскопії привели до

великих успіхів у розвитку таких наук як цито-

логія, бактеріологія, генетика і, особливо, віру-

сологія. Успішно розвивається імунна електрон-

на мікроскопія, яка дає змогу визначити родову

належність вірусів, що використовується для

експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагнос-

тики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.

Рис. 4. Електронний мікроскоп.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Розділ 3

МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

У даному розділі розглядаються методи дослідження морфологічних особ-

ливостей основних представників різноманітних мікроорганізмів: бактерій, акти-

номіцетів, грибів, найпростіших, рикетсій. Всі вони належать до одноклітинних

організмів, мають різну форму і внутрішню структуру, які досліджують за допо-

могою вищеописаних методів мікроскопії.

Виготовлення мазків і методи їх забарвлення

Бактеріоскопічне дослідження будь-якого клінічного матеріалу, де знаходяться

збудники інфекційних хвороб, є однією з найпоширеніших мікробіологічних ме-

тодик. У лабораторній практиці частіше проводять мікроскопію фіксованих за-

барвлених мазків і рідше нативних препаратів у вигляді стисненої чи висячої кра-

пель. Їх виготовляють на заздалегідь підготовленому і оснащеному робочому місці.

На столі повинні бути лише необхідні матеріали, інструменти і пристрої:

клінічний матеріал (кров, гній, слиз, харкотиння, сеча, випорожнення та ін.), куль-

тури мікроорганізмів у пробірках або чашках Петрі, бактеріологічні петлі, піпет-

ки, пінцети, штативи, предметні скельця, газовий пальник, ізотонічний розчин

хлориду натрію, розчини барвників, лотки з рейками для фарбування мазків, про-

мивалка з водою, фільтрувальний папір, банка з дезрозчином для знезараження

використаних препаратів і піпеток. Доцільно в лабораторії обладнати окремий

столик для забарвлення мазків.

Препарати-мазки виготовляють на предметних скельцях, товщина яких через

оптичні властивості конденсора Аббе не повинна перебільшувати 1-1,2 мм. Скельця

необхідно заздалегідь ретельно знежирити. Для цього протягом доби їх витриму-

ють у концентрованій сірчаній кислоті або кип’ятять у суміші 6 % розчину дво-

хромового калію і сірчаної кислоти, ретельно промивають проточною водою, пе-

реносять у банку з 96° спиртом, де вони зберігаються до використання. Можна

знежирені і витримані в спирті скельця витерти насухо лляною тканиною і зберігати

в герметично закритій скляній банці. Крапля води, нанесена на холодне знежире-

не скло, повинна рівномірно розтікатися, а не збиратись у дрібні крапельки.

Виготовлення препаратів-мазків із щільного (густого) клінічного матері-

алу або з культури на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце про-

водять через полум’я газового пальника і після охолодження кладуть на робоче

місце. Для виготовлення мазка матеріал чи культуру беруть бактеріологічною пет-

лею з платинового або хромонікелевого дроту довжиною 5-6 см. Петлю закріплю-

ють у петлетримачі. Кінець її згинають у вигляді замкнутого кільця розміром 1х1,5

чи 2х3 мм. Для деяких робіт потрібно мати цей інструмент у вигляді голки, коли

кінець не згинають у кільце, а залишають прямим (рис. 5).

Бактеріологічну петлю прожарюють у полум’ї, тримаючи її як олівець верти-

кально у правій руці. Два-три рази проводять через полум’я і нижню третину петле-

Частина І. Загальна мікробіологія

тримача. Не випускаючи петлі, лівою рукою

беруть пробірку з 0,9 % стерильним розчином

натрію хлориду, а 4-им і 5-им пальцями пра-

вої руки затискають ватно-марлеву пробку,

витягують її, і вінця пробірки проносять че-

рез полум’я пальника, тримають на віддалі 15-

20 см від полум’я, не випускаючи пробки.

Петлю вводять у пробірку і охолоджують її,

торкаючись стінки. Занурюючи петлю в ріди-

ну, набирають краплю фізрозчину. Виймають

петлю, проводять пробку і відкритий край

пробірки через полум’я, після чого її закрива-

ють і ставлять у штатив. На центр скельця бак-

теріологічною петлею наносять взяту краплю

ізотонічного розчину.

Петлю знову стерилізують, у ліву руку

беруть пробірку з досліджуваним матеріалом

чи культурою мікроорганізмів. Відкривають пробірку із дотриманням усіх правил,

охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість матеріалу чи культури.

Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив. Взятий матеріал

(або культуру) наносять на скло біля краплі фізрозчину і, поступово розтираючи

його та емульгуючи в краплі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи оваль-

ної форми діаметром 1-1,5 см. Після цього петлю прожарюють і ставлять у штатив.

Виготовлення мазків із рідкого клінічного матеріалу або з культури на

рідкому середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краплю досліджувано-

го матеріалу або культури з рідкого середовища із дотриманням правил стериль-

ності, як вище описано. Взятий матеріал наносять на предметне скельце і роблять

рівномірний тонкий мазок.

Якщо для забору матеріалу використовують стерильну пастерівську піпетку,

її також тримають у правій руці і проводять через полум’я перед внесенням у

пробірку. Тонкий кінчик піпетки після охолодження біля стінки пробірки занурю-

ють у рідкий досліджуваний матеріал чи бульйонну культуру, тримаючи верхній

кінець її відкритим. Після попадання в піпетку досліджуваного матеріалу чи куль-

тури верхній кінець її закривають вказівним пальцем, виймають з пробірки. Ос-

танню закривають і ставлять у штатив. На поверхню предметного скла з піпетки

випускають краплю матеріалу і опускають її в дезрозчин. Простерилізованою бак-

теріологічною петлею роблять мазок.

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. При готуванні мазків із ма-

теріалів, які погано розтираються (гній, харкотиння), використовують два пред-

метних скла. Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею

або пастерівською піпеткою наносять на середину знежиреного предметного скла

і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залиша-

лась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють дослі-

Рис. 5. Бактеріологічна петля (1);

бактеріологічна голка (2); шпатель

Дригальського (3).

12 3

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

джуваний матеріал і за вільні кінці розводять їх у сторони. Таким способом одер-

жують два однакових мазки (рис. 6).

Виготовлення мазків із крові. Скарифікатором роблять прокол пучки 4-го

пальця лівої руки. Після появи краплі крові до неї торкаються поверхнею біля

краю знежиреного стерильного предметного скла, яке швидко кладуть на стіл.

Краєм іншого трохи вужчого і шліфованого скла торкаються краплі і нахиливши

його під кутом 45° швидко і обережно проводять ним у напрямку до дальшого

краю. Внаслідок капілярності кров захоплюється краєм верхнього скла і під час

руху розмазується по нижньому склі (рис. 7). Правильно виготовлений препарат

виходить тонким, дещо просвічується та має жовтувате забарвлення.

Із крові виготовляють також препарат “товстої краплі”. На предметне скло

наносять роздільно 2-3 звичайні краплі крові, злегка змішують їх скляною палич-

кою, петлею або кутом іншого предметного скла так, щоб утворилась плоска кро-

в’яна пляма діаметром біля 1,5 см. Такі препарати виготовляють зокрема для діаг-

ностики малярії, поворотних тифів.

Мазки-відбитки роблять із органів трупів людей і тварин, харчових продуктів

щільної консистенції (сир, м’ясо, шинка, ковбаса, риба та ін.), а також з поверхні

молодих колоній грибів, актиноміцетів, рідше — бактерій. Розжареним у полум’ї

скальпелем припікають поверхню органа або харчового продукту. Потім стериль-

ними ножицями з цієї ділянки вирізають шматочок тканини. Поверхнею зрізу тор-

каються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи мазок-відбиток. Такі ж мазки-

відбитки можна виготовити з ділянки шкіри або слизової оболонки. Притискання

досліджуваного об’єкта до скла повинно бути строго вертикальним тривалістю

1-2 с. Мазки-відбитки з колоній роблять на покрівних скельцях.

Висушування і фіксування препаратів-мазків. Виготовлені мазки висушу-

ють при кімнатній температурі або в термостаті. Тонкі мазки швидко висихають

на повітрі, більш товсті можна висушувати над полум’ям газового пальника. Пред-

метне скло при цьому тримають за ребра 1-им і 2-им пальцями правої руки мазком

догори. Щоб не допустити денатурації білків бактерій і порушення їх внутріш-

ньої структури ступінь нагрівання контролюють середнім пальцем, який знахо-

диться під предметним склом.

Висушені препарати необхідно фіксувати до поверхні скла. Незафіксований ма-

зок є заразним, тому при роботі з ним треба бути дуже обережним, не торкатись до

нього руками. При фіксації одночасно відбувається прикріплення бактерій до скла

та їх знезараження. До того ж вбиті мікроорганізми значно краще забарвлюються.

Рис. 6. Виготовлення мазка з харкотиння. Рис. 7. Виготовлення мазка з крові.

Частина І. Загальна мікробіологія

У лабораторній практиці найпоширенішим методом фіксування мазків є флам-

бування – тобто фіксація в полум’ї газового пальника або спиртівки. При цьому

мазок тримають так само, як при висушуванні і тричі проводять його через полум’я.

Весь процес фіксації триває 5-6 с, а дія жару – 2 с. Більш тривале фіксування

жаром зменшує якість препарату, а недофіксований мазок при наступній обробці

змивається і таїть в собі небезпеку зараження.

При вивченні деяких структур мікробних клітин, а також мазків крові, від-

битків органів використовують такі фіксуючі рідини як етанол (протягом 10-15 хв),

метанол (5 хв), ацетон (5 хв), суміш Никифорова (10-15 хв), пари формаліну або

осмієвої кислоти (декілька секунд). При такому обережному фіксуванні значно

краще зберігаються і виявляються всі структури клітин і бактерій.

Забарвлення препаратів-мазків. Морфологію бактерій вивчають, як правило,

на зафіксованих і забарвлених препаратах. Незабарвлені мікроорганізми, за ви-

нятком грибів, погано видно у світловому мікроскопі через їх малу контрастність.

Для фарбування мазків у бактеріологічних лабораторіях широко вживають анілі-

нові барвники. Вони поділяються на кислі, нейтральні та основні. Останні добре

забарвлюють як ядерний апарат, так і цитоплазматичні структури. Позитивно заря-

джена фарбуюча частина їх молекули швидше і повніше вступає в сполуку з нега-

тивно зарядженою бактерійною клітиною. Кислі ж барвники фарбують мікробів

значно слабіше. Здатність та індивідуальна особливість бактерій фарбуватись тими

чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

У повсякденній лабораторній

практиці найчастіше вживають

такі барвники: червоні – фуксин

основний (діамантфуксин, соля-

нокислий розанілін або парароза-

нілін), фуксин кислий, нейтраль-

ний червоний, сафранін, конго

червоний; фіолетові – генціан-,

кристал- і метил-віолет; сині – ме-

тиленовий і толуїдиновий синій,

трипановий голубий; зелені – ма-

лахітовий, брильянтовий зелений;

жовто-коричневі – везувін, хризо-

їдин та ін.

Для забарвлення мазків необ-

хідно мати набір фарбуючих роз-

чинів у флаконах з піпетками і гу-

мовими балончиками. Їх зручно

розміщувати у дерев’яному шта-

тиві (колодці з гніздами). Змиван-

ня барвників і прополоскування

препаратів роблять за допомогою

спеціальних пристроїв (рис. 8).

Рис 8. Флакони для барвників і пристрій

для промивання забарвлених препаратів.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Запропоновані численні методи забарвлення бактерій. Вони поділяються на

прості й складні.

Прості способи забарвлення бактерій

Простий метод забарвлення дає можливість дослідити загальну морфологію

мікробів, їх розміри, форму, кількість, локалізацію, взаємне розташування клітин

тощо. Але за його допомогою неможливо вивчати внутрішню структуру бактерій

та їх різне відношення до декількох барвників.

Простим забарвленням називають таке, при якому застосовують лише один

барвник. Найчастіше використовують основний розведений фуксин Пфейфера і

лужну метиленову синьку Леффлера. Фуксином фарбують 1-2 хв, а синькою –

3-5 хв. Препарати, що містять, окрім бактерій, тканинні й клітинні елементи

макроорганізму, краще забарвлювати метиленовою синькою, яка фарбує фон пре-

парату порівняно слабко, а бактерії – значно інтенсивніше.

На зафіксований препарат наносять піпеткою таку кількість барвника, щоб

він покривав увесь мазок. Після фарбування препарат промивають водопровід-

ною водою і висушують на повітрі, або притискають фільтрувальним папером,

потім проводять над полум’ям, щоб випарувались залишки води. Якщо на препа-

раті залишиться вода, то, з’єднавшись з імерсійною олією, вона утворить емуль-

сію, яка заважатиме чіткому зображенню.

При висушуванні мазків за допомогою листків фільтрувального паперу по-

трібно кожного разу користуватися новими, оскільки при повторному вживанні

переносяться забарвлені бактерії з одного мазка на інший, що може призвести до

неправильних висновків.

Виготовлення барвників для простого забарвлення

1. Фуксин основний готують у вигляді концентрованого фенолового фуксину Циля.

Він дуже стійкий, може зберігатись протягом декількох місяців. У концентрованому виг-

ляді вживається лише для фарбуваня спор і кислотостійких бактерій. Для простого забар-

влення та за методом Грама його розводять дистильованою водою 1:10, отримуючи так

званий розведений, або водний фуксин Пфейфера. Цей розчин дуже нестійкий і його готу-

ють безпосередньо перед вживанням.

Феноловий фуксин Циля

Основний фуксин 1 г

Етанол 96° 10 мл

Фенол кристалічний 5 г

Гліцерин кілька крапель

Вода дистильована 100 мл

Спочатку фуксин з кристалами фенолу і гліцерином розтирають у ступці до одно-

рідної маси, потроху додаючи спирт, потім, весь час перемішуючи, доливають дистильо-

вану воду. Розчин витримують при кімнатній температурі протягом 48 год і фільтрують. З

нього потім виготовляють водний фуксин.

Частина І. Загальна мікробіологія

Фуксин Пфейфера

Фуксин Циля 1 мл

Вода дистильована 9 мл

2. Метиленова синька. Спочатку готують насичений спиртовий розчин метилено-

вої синьки, який дуже стійкий. При зберіганні його фарбуючі властивості, а також здатність

давати метахроматичне забарвлення нуклеїнових сполук (напр. волютинових зерен) знач-

но підвищується за рахунок утворення азурів.

Насичений спиртовий розчин метиленової синьки

Метиленової синьки 10 г

Етанол 96° 100 мл

Із даного розчину готують лужну метиленову синьку за Леффлером, яку дуже широ-

ко використовують для простого методу забарвлення.

Метиленова синька за Леффлером

Спиртовий розчин метиленової синьки 30 мл

Гідроксид натрію або калію 1 % 1 мл

Дистильована вода 100 мл

Водно-спиртовий розчин метиленової синьки

Спиртовий розчин метиленової синьки 10 мл

Дистильована вода 100 мл

Лужна метиленова синька за Леффлером, як і її водно-спиртовий розчин, можуть

давати забарвлення різної інтенсивності у різних видів бактерій.

До простих методів забарвлення можна віднести і негативний спосіб Буррі. При ньому

за рахунок туші створюють темний фон, а бактерії залишаються незабарвленими. Для ста-

більних і чітких результатів необхідно дуже ретельно підготувати суспензію туші. Виби-

рають найкращі сорти рідкої китайської туші й розводять її дистильованою водою 1:10.

Можна натерти сухої китайської туші й довести її до такої ж густоти. Суспензію туші

довго центрифугують при 3 тис. об/хв. Верхній шар відсмоктують піпеткою і в надавленій

краплі під імерсійним об’єктивом перевіряють її на відсутність грубих частинок. Якщо

суспензія хороша, її натягують у тонкі капіляри по 0,1-0,2 мл, запаюють і стерилізують в

автоклаві.

При дослідженні краплю туші з капіляра випускають на предметне скло, добавляють

крапельку матеріалу (рідину з сифілітичної виразки, культуру капсульних бактерій, леп-

тоспір та ін.) і ретельно перемішують петлею. Шліфованим предметним склом зі зрізани-

ми кутами готують тонкий препарат так само, як мазок крові, висушують, не фіксують.

При мікроскопії тіла бактерій, спірохет, лептоспір виглядають білими, чітко окресленими

на темному димчасто-сірому фоні. Замість туші можна використати 2-10 % розчини опа-

лового синього, конго червоного, нігрозину, коларголу та ін. В такому разі фон буде мати

інший колір.

Необхідно враховувати, що мікроорганізми в таких препаратах не вбиті і можуть

стати джерелом зараження, як і в мазках, обережно фіксованих у полум’ї пальника.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

При вивченні забарвлених препаратів царства прокаріот виділяють чотири

основні форми бактерій:

1) кулясті (сферичні), або кокоподібні; 2) паличкоподібні (циліндричні); 3) спі-

ралеподібні (звивисті); 4) ниткоподібні (трихобактерії).

Кокоподібні бактерії (від гр. kokos – зерно, кісточка) мають правильну куляс-

ту форму діаметром 1,0-1,5 мкм. Деякі з них набувають бобоподібної, ланцетопо-

дібної та еліпсоподібної форми (рис. 9). За способом ділення та взаємного розта-

шування в мазках всі коки поділяють на такі групи:

1.Мікрококи (від лат. мikros – малий). Вони діляться в одній площині, розташо-

вуються поодинці й хаотично; серед них хвороботворних видів для людини немає.

2. Диплококи (від лат.diplos – подвійний). Ділення їх проходить в одній пло-

щині з утворенням подвійних парних клітин, які мають форму квасолі (Neisseria

meningitidis), або вістря ланцета (Streptococcus pneumoniae).

3. Стрептококи (від гр. streptos – ланцюг, намисто). Після поділу в одній

площині мікроби не розходяться, а формують різної довжини ланцюжки, щонагаду-

ють намисто. Частина з них є сапрофітами, представниками нормальної мікро-

флори людини (напр., ротові стрептококи). Інші види (Streptococcus pyogenes) ви-

кликають такі тяжкі захворювання як сепсис, остеомієліт, скарлатину, бешиху,

ревматизм.

4. Стафілококи (від лат. staphyle –

гроно). Вони діляться в декількох пло-

щинах, а утворені клітини розташову-

ються у вигляді скупчень, що нагадують

виноградні грона. Стафілококи спричи-

няють більше 100 різноманітних захво-

рювань у людей і тварин, а один із типо-

вих видів Staphylococcus aureus є найча-

стішим збудником багатьох гнійно-сеп-

тичних процесів.

5. Тетракоки (від лат. tetra – чотири).

Після поділу у двох взаємно перпендику-

лярних площинах клітини не розходять-

ся, а розташовуються тетрадами. Вони, як

правило, непатогенні для людини.

6. Сарцини (від лат. sarcio – зв’я-

зую)– коки, які діляться в трьох взаємно

перпендикулярних площинах і після поді-

лу не розходяться, а розташовуються у

вигляді паків з 8, 16, 32, 64 клітин. Серед

них є умовно-патогенні представники.

Паличкоподібні бактерії не менш

різноманітні за своєю формою і розта-

шуванням у мазках. Середні розміри їх

Рис. 9. Основні форми бактерій:

1-6 – сферичної форми: 1 – стафілококи;

2-3 – диплококи; 4 – стрептококи; 5 – тетра-

коки; 6 – сарцини; 7-9 – паличкоподібні;

10-12 – спіралеподібні форми; 10 – вібріони;

11 – спірили; 12 – спірохети.

Частина І. Загальна мікробіологія

1,0-10 мкм завдовжки і 0,5-2,0 мкм завширшки (рис. 9). Вони поділяються на бак-

терії, бацили і клостридії. Власне бактерії (від гр. bacteria – паличка) – мікроорга-

нізми, що не утворюють спор. Бацили (від лат. bacillus – паличка) мають спори,

які не перебільшують діаметр мікробної клітини. Клостридії (від лат. clostridium –

веретеноподібний) утворюють спори, що перебільшують поперечний розмір кліти-

ни і дещо деформують її.

Форма паличкоподібних бактерій може бути овальна, циліндрична, еліпсо-

подібна, веретеноподібна, у вигляді барабанної палички, тенісної ракетки. Їх кінці

бувають заокруглені, загострені, булавоподібні, рівні, нібито обрублені тощо. Па-

личкоподібні бактерії розмножуються шляхом поперечного поділу.

За аналогією з коками, залежно від взаємного розташування в мазках, палич-

коподібні мікроорганізми поділяють на такі групи:

1. Монобактерії при поділі розташовуються поодинці (Escherichia coli,

Salmonella typhi).

2. Монобацили також розташовані поодиноко, але мають спори (Bacillus

subtilis, Clostridium tetani).

3. Диплобактерії розташовуються в мазках парно (Klebsiеlla pneumoniae).

4. Диплобацили – парне розташування спорових мікроорганізмів.

5. Стрептобактерії – безспорові палички, які розташовані у вигляді лан-

цюжків (Haemophilus ducrey).

6. Стрептобацили – спорові мікроби, що розташовуються ланцюгом (Bacillus

anthracis).

Спіралеподібні (звивисті) бактерії (рис. 9) за кількістю і характером за-

витків, а також за діаметром клітини поділяють на три групи:

1. Вібріони (від гр. vibrio – звиваюсь) мають одну характерну зігнутість, яка

не перебільшує чверті витка спіралі, але може мати і форму прямої палички. При-

кладом хвороботворного виду є Vibrio cholerae.

2. Спірили (від гр. speira – завиток, спіраль) – товсті звивисті мікроорганіз-

ми, які мають малу кількість завитків (2-3), що надає їм форму штопора. Патоген-

на для людини Spirillum minor викликає содоку (хворобу укусу щурів). До цієї

групи мікробів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спри-

чиняти у людини захворювання шлунково-кишкового тракту, сечостатевих органів.

3. Спірoхети (від гр. speira – завиток, haite – волосся) – тонкі штопороподібні

бактерії, які мають велику кількість завитків. Серед них є хвороботворні види

(Treponema pallidum – викликає сифіліс, Borrelia recurrentis – поворотний тиф,

Leptospira interrogans – лептоспіроз).

Ниткоподібні бактерії належать до вільноіснуючих сапрофітних мікроор-

ганізмів (напр. залізо- і сіркобактерії). Для людини вони не патогенні і в медичній

мікробіології не вивчаються.

Окрім того, останнім часом виявлені мікроби, які мають трикутну, квадрат-

ну, зіркоподібну і тарілкоподібну форми. Вони беруть участь у процесах біодегра-

дації різноманітних природних сполук.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Особливості морфології інших груп мікроорганізмів

Спірохети. Особлива група грамнегативних звивистих бактерій, що мають

вигляд довгих тонких, спірально закручених ниток, дістала загальну назву спіро-

хет. Довжина їх коливається в межах 7-50, товщина – 0,3-0,5 мкм. Вони належать

до порядку Spirochaetales, до складу якого входять три патогенних для людини

роди: Treponema, Borrelia, Leptospira. Між собою вони відрізняють рядом ознак.

Центральною структурою спірохет є цитоплазматичний циліндр, що має по-

стійну спіралеподібну форму. Зовні він покритий цитоплазматичною мембраною

і клітинною стінкою. Органом руху спірохет є периплазматичний джгутик (джгу-

тики), розташований між циліндром і цитоплазматичною мембраною. Спірохети

мають різні типи рухів: згинальний, поступальний, обертальний, маятникопо-

дібний.

Число і форма дрібних завитків характерні для кожного виду спірохет. Вони

формують завитки першого порядку. У трепонем є 8-14 таких завитків, однакових

за формою та величиною. Лептоспіри мають 12-18 дуже дрібних первинних за-

витків. На їх кінцях є вторинні завитки, які надають їм S- або С- подібної форми і

роблять їх схожими на гачок (рис. 10).

Патогенними представниками для людини є Treponema pallidum, яка викли-

кає сифіліс, Borrelia recurrentis – збудник епідемічного поворотного тифу, Leptospira

interrogans, що спричиняє лептоспіроз.

Методи виявлення спірохет у досліджуваному матеріалі можуть бути різни-

ми. При діагностиці сифілісу, бореліозу і лептоспірозу найчастіше використову-

ють метод темного поля. На тонких предметних скельцях (1,0-1,2 мм) виготовля-

ють з матеріалу надавлену краплю і вміщують на предметний столик. При дослі-

дженні використовують темнопольний конденсор. Дуже важливо при цьому

досягти точної центровки всіх оптичних систем мікроскопа і встановити освіт-

лення за методом Келлера. На верхню лінзу конденсора необхідно нанести крап-

лю кедрового масла, уникаючи бульбашок повітря. Значно рідше використовують

метод забарвлення за Романовським-Гімзою. При

цьому трепонеми фарбуються в рожевий колір, бо-

релії – в синьо-фіолетовий, лептоспіри – в блідо-ро-

жевий. При серебрінні мазків за методом Морозова

спірохети при мікроскопії мають коричнево-чорний

колір на жовтому фоні.

Актиноміцети. Це одноклітинні грампози-

тивні, прямі або трохи зігнуті, паличкоподібні бак-

терії, які раніше вважали грибами через здатність

клітин галузитись. Вони часто утворюють нитко-

подібні форми довжиною 10-50 мкм. Характерною

особливістю актиноміцетів є здатність утворювати

добре виражений міцелій. У одних видів він довгий

і рідко розгалужується, у інщих – короткий і з вітви-

Рис. 10. Патогенні спірохети:

1 – трепонеми; 2 – борелії;

3 – лептоспіри.

Частина І. Загальна мікробіологія

стістю і брунькуванням. Паличкоподібні форми схожі за будовою до звичайних

бактеріальних клітин, можуть мати цитоплазматичні влкючення. Актиноміцети

належать до родин Actinomycetacae, Nocardiaceae і Streptomycetaceae, які охоплю-

ють понад 400 видів. Переважна їх більщість є сапрофітами. Вони вільно живуть

у грунті, забезпечуючи його родючість і свєрідний запах. Часто зустрічають у воді,

повітрі інших об’єктах зовнішнього середовища. Багато з них є продуцентами

антибіотиків (тетрациклін, стрептоміцин та ін.).

До патогенних представників відносяться Actinomyces israeliі, A.bovis,

A.naeslundii, які викликають у людей актиномікоз, а також Nocardia asteroides, що

спричиняє нокардіоз. Окремі представники роду Streptomyces можуть викликати

у людини міцетому ступні.

Морфологічне дослідження актиноміцетів можливе як у нативних (нефарбо-

ваних) препаратах, так і в мазках, забарвлених за Грамом. У першому випадку

гній чи виділення з нориць обробляють 15% розчином КОН, потім відбирають

окремі шматочки (пісчинки розміром із макові зерна), кладуть їх між двома пред-

метними скельцями й обережно роздавлюють. Отримують два препарати-мазки,

які краще мікроскопувати за допомогою фазово-контрасного чи аноптрального-

мікроскопа. При цьому актиноміцети розташовуються у вигляді друз (своєрідних

скупчень переплетених гіф, які радіально розходяться як промені сонця). Забарв-

ленні мазки мікроскопують як звичайно.

Патогенні гриби. Гриби являють собою особливу групу одноклітинних і

богатоклітинних еукаріотів (понад 100 тис. видів), які широко розповсюдженні в

природі. Біля 400 видів є хвороботворними і спричиняють у людини грибкові хво-

роби (мікози).

Клітини більшості грибів маютиь щільну оболонку, до внутрішнього шару

якої прилягає цитоплазматична мембрана. В цитоплазмі міститься одне або декілька

ядер, вакуолі, мітохондрії, мікросоми, лізосоми, рибосоми, комплекс Гольджі, різно-

манітні влючення. Молоді клітини мають яйцеподібну форму, зрілі стають цилін-

дричними а старі – булаво-, грушо- та веретеноподібними. Основу тіла гриба ста-

новлять особливі трубчасті нитки – гіфи, сукупність яких називають міцелієм. У

гіфів нижчих грибів починають появлятись перегородки, які є характерною озна-

кою у вищих грибів. Кінцеві розгалуження міцелію мають своєрідну форму, за

якою можна диференціювати окре-

мі види. Це органи плодоносіння

грибів, які мають ендо- або екзос-

пори. Прикладом утворення ендос-

пор може бути мукорова пліснява

Mucor mucedo, яка має несептова-

ний міцелій, одноклітинний плодо-

носящий гіф спорангієносець, на

кінці якого знаходисться круглий

спорангій, наповнений ендоспора-

ми (рис. 11, 3). Ектоспори можна

Рис. 11. Нитчасті гриби:

1 – Penicillium; 2 – Acnergillus; 3 – Mucor.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

спостерігати у лійкової плісняви Aspergillus niger, від плодоносящого гіфа якого –

конідієносця – немов би відшнуровуються спори (конідії), що розташовуються

радіально і нагадують струмені води, які розбризкуються із садової лійки (рис.11,2).

У китиценосного гриба Penicillium glaucum міцелій і конідієносець багатоклітин-

ний, плодоносне тіло нагадує пензлик (рис. 11, 1).

Гіфи міцелію дерматофітів можуть нагадувати роги оленів, канделябри, була-

ву, гребінь півня тощо. Будова органів плодоносіння, характер плодових тіл, їх фор-

ма, велечина й морфологічні особливості покладені в основу класифікації грибів.

Виділяють нижчі та вищі гриби. До нижчих належать хітридіоміцети, оомі-

цети, зигоміцети; до вищих – аскоміцети, базидіоміцети та дейтероміцети. Нижчі

гриби, як правило, непатогенні для людини. Однак окремі види мукорової, аспер-

гілової та пеніцилової плісняви можуть уражати шкіру, очі, слухові проходи, ле-

гені, шлунково-кишковий тракт.

Велике значення в медичній практиці мають гриби роду Candida. вони часто

є представниками нормальної мікрофлори людини. Але при нераціональному засто-

суванні антибіотиків, імунодефіцитах та авітамінозах здатні викликати серйозні

захворювання – кандидомікози. Ще більшого значення в грибковій патології лю-

дини набула група недосконалих грибів-дейтероміцетів. Вони можуть викликати

епідермофітію, мікроспорію, трихофітію, фавус та ін.

Однак гриби мають і велике корисне значення. Їх використовують у харчовій,

парфюмерній, хімічній промисловості. Із окремих видів таких родів як Penicillium

і Cephalosporium виготовляють антибіотики (пеніциліни, цефалоспорини).

Мікроскопічне дослідження грибів проводять як у нативному (незабарвле-

ному) стані, так і за допомогою різних методів фарбування. Частинку подрібнено-

го досліджуваного матеріалу наносять на предметне скло, добавляють одну краплю

30 % розчину КОН, злегка підігрівають над полум’ям пальника до появи білого

обідка по периферії краплі. Після цього препарат накривають покрівним скель-

цем і мікроскопують за допомогою сухих об’єктивів при опущеному конденсорі і

звуженій діафрагмі. Ще краще досліджувати нативні препарати під фазово-кон-

трастним або аноптральним мікроскопом.

При дослідженні грибів у забарвленому стані після дії розчину лугу мазок

промивають водою, висушують, фіксують і забарвлюють метиленовим синім або

фуксином.

Рикетсії. До групи рикетсій належать унікальні мікроорганізми, в яких по-

єднані морфологічні властивості бактерій і біологічні властивості вірусів. З пер-

шими їх єднає типова будова клітин, а з вірусами – облігатний внутрішньоклітин-

ний паразитизм.

Рикетсії мають типову для грамнегативних бактерій клітинну стінку, цито-

плазматичну мембрану, ядерний апарат, не обмежений від цитоплазми будь-якою

оболонкою. Вони не утворюють спор і капсул. За Здродовським розрізняють 4

морфологічних типи рикетсій (рис. 12):

1 – дрібні овоїдні кокоподібні клітини розміром біля 0,5 мкм, часто утворю-

ють диплоформи у вигляді гантель;

Частина І. Загальна мікробіологія

2 – паличкоподібні двозернисті форми

(1-1,5 мкм), у яких зерна розташовані на полюсах

і з’єднані слабо забарвленою цитоплазмою;

3 – бацилярні видовжені або зігнуті двозер-

нисті форми (3-4 мкм), інколи мають по 4 зерна,

також розташованих на полюсах клітини;

3 – ниткоподібні багатозернисті клітини (20-

40 мкм), у яких може бути багато зерен.

Відповідно до класифікації Бергі всі рикетсії

об’єднані в порядок Rickettsiales. Більшість із них

непатогенні для людини. Вони паразитують в орга-

нізмі членистоногих. Хвороботворні представни-

ки входять до трьох родів: Rickettsia, Rochalima,

Coxiella. Окремі види з них можуть викликати у

людини такі рикетсіози як висипний тиф, марсельська лихоманка, лихоманка Цуцу-

гамуші, Ку-гарячка та ін. Збудниками цих захворювань відповідно є Rickettsia

prowazekii, R. typhi, R. tsutsugamushi, Coxiella burnetii. Велику роль у передачі та

розповсюдженні рикетсіозів відіграють різні кровососні комахи (воші, блохи, кліщі).

Морфологію рикетсій вивчають під світловим мікроскопом у препаратах за-

барвлених за Романовським-Гімзою, де вони набувають рожево-червоного кольо-

ру. Дуже зручний і простий спосіб їх забарвлення за Здродовським: тонкий зафік-

сований мазок фарбують розведеним карболовим фуксином (10-15 крапель на 10

мл дистильованої води) протягом 5 хв, потім злегка знебарвлюють препарат 0,01%

соляною кислотою і додатково 30 сек фарбують метиленовим синім. Рикетсії ста-

ють рубіново-червоними, цитоплазма клітин макроорганізму голубою, а ядра –

синіми.

Хламідії. До патогенних бактерій роду Chlamidia віднесені грамнегативні

нерухомі мікроорганізми, що не утворюють спор і капсул. Вони є облігатними

внутрішньоклітинними паразитами, не ростуть на штучних середовищах. Протя-

гом свого життєвого циклу хламідії проходять три стадії:

1) дрібні елементарні тільця розміром 0,2-0,5 мкм, які мають компактний

нуклеоїд і тришарову ригідну оболонку;

2) крупні ретикулярні тільця (0,8-1,5 мкм) сферичної форми з фібрилярним

нуклеоїдом і тонкою клітинною стінкою;

3) проміжні тільця, що являють собою перехідні морфологічні форми між

елементарними і ретикулярними тільцями.

Елементарні тільця є інфекційною, а ретикулярні – вегетативною формою

цих бактерій.

Окремі види хламідій (Chlamidia trachomatis, C. psittaci) викликають у людини

трахому, орнітоз, паховий лімфогрануломатоз, уретрити, кон’юнктивіти, поліарт-

рити, менінгоенцефаліти та інші захворювання.

Для мікроскопічного дослідження хламідій в інфікованих клітинах і тканинах

організму виготовлені мазки забарвлюють за методом Романовського-Гімзи. Тільця

Рис. 12. Основні форми

рикетсій: 1 – кокоподібні;

2 – паличкоподібні;

3 – бацилярні; 4 – ниткоподібні.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

хламідій фарбуються в голубий або фіолетовий колір. Їх можна виявити і в натив-

них препаратах (надавлена крапля) за допомогою фазово-контрастної мікроскопії.

Мікоплазми. Патогенні мікоплазми представляють собою групу унікальних

дрібних поліморфних мікроорганізмів, які не мають ригідної клітинної стінки.

Вони виглядають як сферичні або овоїдні тільця діаметром 0,1-0,2 мкм, або як

кулясті форми розміром до 1,5 мкм. Рідше зустічаються нитковидні клітини дов-

жиною до 100-150 мкм, які здатні галузитись.

Клітини мікоплазм не мають типової для бактерій оболонки. Вони оточені

лише тришаровою цитоплазматичною мембраною. У деяких із них зовнішній шар

мембрани значно товстіший і нагадує капсулу. У цитоплазмі містяться нуклеоїд,

рибосоми, кільцеподібні мембрани, які зв’язані з ядерним апаратом. Спор і джгу-

тиків не утворюють, грамнегативні.

Мікоплазми часто знаходяться в грунті, стічних водах, паразитують в організмі

багатьох видів тварин. У людини вони спричинюють пневмонії, бронхіоліти, ангі-

ни, уретрити, простатити, артрити, ендокардити тощо. Найчастіше захворювання

викликають Micoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.

Морфологію мікоплазм досліджують у живому стані в препаратах надавле-

ної краплі під фазово-контрастним мікроскопом або за допомогою електронної

мікроскопії ультратонких зрізів їх клітин. При вивченні мікоплазм у забарвлених

мазках краще користуватись методом Романовського-Гімзи.

Патогенні найпростіші. Протисти, або найпростіші, – це високоорганізовані

одноклітинні еукаріотичні організми тваринного походження. Вони належать до

типу Protozoa і, відповідно, класів саркодових, джгутикових, споровиків та інфузорій.

Будова їх складніша за бактерійну клітину. Їх розміри коливаються від 2 до

150 мкм. Вони мають чітко уособлене ядро або декілька ядер з типовою двокон-

турною оболонкою (каріолемою), пронизаною порами. В цитоплазмі багатьох

найпростіших розрізняють дві частини – більш щільну гомогенну ектоплазму і

більш рідку внутрішню ендоплазму. Досить часто самий поверхневий шар екто-

плазми становиться ще більш ущільненим і утворює периферійну плівку, або пе-

лікулу, яка являє собою особливий вид міцної еластичної мембрани, що надає

клітині постійної форми і виконує захисну функцію. Окрім того у деяких видів є

парні фібрили і мінеральний скелет.

Цитоплазма найпростіших містить велику кількість життєво важливих струк-

тур: ендоплазматичний ретикулюм, мітохондрії, пластинчастий комплекс (аппа-

рат Гольджі), лізосоми, рибосоми, різноманітні вакуолі.

Багато видів найпростіших здатні активно рухатись. У одних форм рух здійс-

нюється за рахунок псевдоподій (амеби), у інших за допомогою джгутиків або війок.

Найпростіші мають складні цикли розвитку. Вони здатні розмножуватись про-

стим (безстатевим) і множинним поділом або іх поєднанням (плазмодії малярії).

При несприятливих умовах деякі види (амеби, лямблії, балантидії) переста-

ють живитися, втрачають органелли, покриваються товстою оболонкою і пере-

творюються в цисти, що є своєрідною захисною реакцією. Саме цисти відіграють

велику роль у розповсюдженні протозойних захворювань.

Частина І. Загальна мікробіологія

Найпростіші широко розповсюдженні в природі. Більшість з них не патогенні

для людини. Однак деякі представники мають високі інфекційні властивості і

можуть викликати амебіаз, трипаносомоз, лейшманіоз, урогенітальний та кишко-

вий трихомоноз, малярію, балантідіаз. Всі ці захворювання характеризуються три-

валим і важким перебігом, ураженням числених органів і систем.

Мікроскопічне дослідження найпростіших направлене на виявлення їх у на-

тивних і забарвлених препаратах-мазках. Найчастіше для фарбування останніх

використовують методи Романовського – Гімзи, Лейшмана, Гейденгайна. В крові

паразитів виявляють шляхом виготовлення й забарвлення товстої краплі і тонких

мазків (плазмодії малярії, трипаносоми, рідше – лейшманії). У фекаліях, дуоде-

нальному вмісті, мазках із статевих органів виявляють амеби, балантидії, лямблії,

трихомонади. Детальніше методи виявлення найпростіших та лабораторна діаг-

ностика протозойних захворювань викладені у 18 розділі.

Складні методи забарвлення бактерій

Складні (диференціюючі) методи забарвлення базуються на фізико-хімічних

особливостях будови мікробних клітин. Суть їх полягає у фарбуванні мазка двома

барвниками, один з яких є основним, другий – доповнюючим (контрастним). Після

дії першого барвника мазок знебарвлюють кислотою, лугом, спиртом або ацето-

ном. Деякі мікроорганізми легко, інші важко знебарвлюються. Одні з них є кислото-

і спиртостійкими, другі тільки кислотостійкими. Спори бактерій дуже важко підда-

ються дії знебарвлюючих речовин, вони водночас є і фарбостійкими об’єктами.

Складні методи забарвлення вживають для детального вивчення структури

бактерійних клітин, а також для характеристики і диференціації одних мікроор-

ганізмів від інших. Отже, вони мають важливе діагностичне значення. У лабора-

торній практиці найчастіше використовують складні методи Грама, Ціля-Нільсе-

на, Нейссера, Буррі-Гінса та ін.

Забарвлення за Грамом

Цей метод розробив Кристіан Грам у 1884 р. Серед складних методів фарбу-

вання він є найбільш універсальним. Він має важливе диференціально-діагнос-

тичне значення, оскільки допомагає визначати таксономічне положення тих чи

інших бактерій.

Особливості забарвлення за методом Грама дозволяють поділити всі мікро-

організми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапля-

ються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризують як грамваріабельні.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних мікробів здатні

утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бак-

терій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнега-

тивних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлю-

ються фуксином у червоний колір.

До грампозитивних відносяться стафілококи, стрептококи, бацили, клостридії,

дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативними є нейсерії (менінго- і го-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

нококи), кишкові палички, сальмонели, шигели, рикетсії, всі звивисті бактерії

(вібріони, спірили, спірохети, лептоспіри).

Механізм забарвлення за Грамом досить складний і ще остаточно не вивче-

ний. Грампозитивні бактерії мають товсту клітинну стінку, яка складається з 5-6

шарів пептидоглікану (муреїну) та полімерів тейхоєвих кислот. Ці структури лег-

ко сприймають і міцно утримують фарбуючий комплекс генціанвіолет + йод і при

дії спирту протягом 30-60 с не знебарвлюються. Грамнегативні бактерії мають

значно тоншу оболонку, що складається з 1-2 шарів петидоглікану, не містить тей-

хоєвих кислот, а, отже, не втримують комплекс основного барвника при знебарв-

ленні спиртом. При додатковій обробці мазка фуксином Пфейфера вони фарбу-

ються в червоний колір. Саме в цьому полягає основний механізм забарвлення за

методом Грама. Окрім того, різне забарвлення мікроорганізмів пов’язане з більш

високою концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнату магнію в клітинах

грампозитивних бактерій, більш кислим значенням рH і різним співвідношенням

РНК:ДНК у цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1).

Виготовлення реактивів для забарвлення за Грамом. Найчастіше в лабораторії

готують такі барвники: 1) феноловий генціанвіолет, 2) розчин Люголя, 3) фуксин Пфейфе-

ра, 4) етанол 96°.

1. Феноловий генціанвіолет

Генціан фіолетовий 1 г

Фенол кристалічний 2 г

Етанол 96° 10 мл

Вода дистильована 100 мл

Феноловий генціанвіолет готують так само, як і феноловий фуксин Циля. Генціан

фіолетовий можна замінити кристалвіолетом, або водним розчином метилвіолету, який є

досить стійким. Його готують за таким прописом:

метиловий фіолетовий 0,2 г

вода дистильована 100 мл

2. Розчин Люголя

Йодид калію 2 г

Йод кристалічний 1 г

Вода дистильована 300 мл

Спочатку йодид калію розчиняють у невеликій кількості води, потім всипають крис-

талічний йод, після розчинення якого добавляють дистильовану воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера готують із концентрованого фенолового розчину цього барв-

ника, розводячи його в 10 разів дистильованою водою. Необхідно використовувати лише

свіжовиготовлений барвник.

Техніка забарвлення. Найбільш поширений, так званий стандартний спосіб

забарвлення за Грамом, проходить у декілька етапів:

1. На фіксований жаром мазок кладуть трохи коротшу і вужчу від предметно-

го скла смужку фільтрувального паперу. Зверху на неї наносять достатню кількість

Частина І. Загальна мікробіологія

розчину генціанвіолету (основний барвник) на 1-2 хв, зливають його і знімають

папірець.

2. Після прополоскування мазка водою наносять розчин Люголя на 1-2 хв (до

сильного потемніння препарату).

3. Зливають розчин Люголя і, не промиваючи мазок, знебарвлюють його 96°

етанолом протягом 30-60 с (до відходження сіро-фіолетових струмочків фарби).

4. Препарат ретельно промивають водою і додатково забарвлюють фуксином

Пфейфера (доповнюючий контрастний барвник) протягом 2 хв.

5. Мазок промивають водою, висушують, наносять краплю кедрової олії,

мікроскопують з імерсійним об’єктивом.

Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні грампозитивні мікро-

організми фарбуються в темно-фіолетовий колір, грамнегативні бактерії, ткани-

ни, клітини органів – у рожевий (див. вкл., рис. 1).

Запропоновано ряд модифікацій цього методу, з яких найпоширенішим є ва-

ріант Синьова. Він полягає в тому, що замість розчину генціанвіолету (метилвіо-

лету, кристалвіолету) використовують смужки фільтрувального паперу заздалегідь

просочені одним із вказаних барвників і висушені. При забарвленні за Синьовим

на мазок наносять декілька крапель води, опускають і притискають пінцетом до

скла просочену фарбою смужку паперу. Через 2 хв її знімають. Наступні етапи

забарвлення такі самі, як і при стандартному методі Грама. Модифікація Синьова

особливо зручна для використання на практичних заняттях та в похідних лабора-

торіях. Вона дає значну економію барвника.

Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збуд-

ники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високо-

молекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони важко фарбуються зви-

чайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим фено-

ловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються

розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії

при такій обробці легко віддають барвник. У зв’язку з цим при додатковому забарв-

ленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків

фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.

Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в

1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:

1. На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку

фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі

підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із

фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають

папірець, промивають водою.

2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи

жовтуватого відтінку (10-30 с) і декілька разів промивають водою.

3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промива-

ють водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі

бактерії виглядають рубіново-червоними (див. вкл., рис. 2).

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують

метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розве-

деним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують

метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприйма-

ють забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-

Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля,

висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у

герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дис-

тильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до

появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним мето-

дом Циля-Нільсена.

Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним із основних і найпоширені-

ших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фар-

буються різні структурні елементи паразитів крові – малярійних плазмодіїв, три-

паносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм,

спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового си-

нього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосе-

редньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою

нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барв-

ника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і вису-

шують на повітрі. Приготований розчин наносять на мазок, а ще краще предметне

скельце з мазком опускають у склянку з барвником. Забарвлення триває від 30 хв

до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник

зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикаль-

ному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних об’єктивів.

Будучи в розчині синьо-фіолетовим, поліхромний барвник Романовського-

Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин, тіла бактерій, їх капсули,

слиз – у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлю-

ються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна – у вишнево-черво-

ний; цитоплазма має рожевий колір.

Забарвлення окремих структур мікробної клітини

З науковими й діагностичними цілями в бактеріологічних лабораторіях дос-

ліджують не тільки форму, розміри, загальні тинкторіальні властивості мікроор-

ганізмів, а й окремі елементи важливих структур: нуклеоїд, цитоплазму, включен-

ня, клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану, капсулу, спори, джгутики тощо.

Нуклеоїд. У прокаріотів ще немає морфологічно оформленого ядра, а є лише

його попередник – нуклеоїд. Він представлений однією або кількома хромосома-

ми, що складаються з ДНК і вільно розташовані в цитоплазмі, не відмежовані від

Частина І. Загальна мікробіологія

неї будь-якою мембраною. Морфологічно дослідити цю структуру під світловим

мікроскопом дуже важко.

Розроблені спеціальні мікрохімічні реакції на виявлення ДНК. Однією з них

є реакція Фельгена. Після легкого гідролізу мазка розчином соляної кислоти при

підігріванні від дезоксірибофосфату відщеплюються пурини й піримідини, які

переходять в альдегіди. Останні реагують з безбарвною фуксинсірчистою кисло-

тою реактиву Шиффа, при цьому нуклеоїд забарвлюється в червоно-фіолетовий,

а цитоплазма в світло-рожевий колір.

Ядерну субстанцію можна виявити за методом Пікарського. Фіксований ме-

тиловим спиртом або сумішшю Никифорова мазок обробляють 1 % розчином со-

ляної кислоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його

забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильованою водою, ви-

сушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбуються в темно-червоний, а ци-

топлазма клітин – у рожевий колір.

Ще краще можна виявити нуклеоїд і дослідити його структуру за допомогою

електронної мікроскопії ультратонких зрізів бактерійних клітин.

Цитоплазма та її включення. Цитоплазма бактерій – складна колоїдна сис-

тема. У молодих клітин вона гомогенна, у старих набуває зернистої або волокни-

стої структури. При забарвленні аніліновими барвниками цитоплазма фарбується

рівномірно й монотонно.

У процесі життєдіяльності бактерій у цитоплазмі з’являються метахроматичні

(волютинові) зерна, краплини нейтральних ліпідів, воску, сірки, гранульози, гліко-

ген, пігмент та ін. Вони є для клітини запасним джерелом енергії.

У лабораторній практиці найбільше значення має виявлення волютинових

зерен. Волютиновими їх назвали тому, що вперше ці включення відкриті у Spirillum

volutans. Їх ще називають метахроматичними, оскільки вони дають явище мета-

хромазії – здатність забарвлюватись у тон, що відрізняється від основного кольо-

ру поліхромного барвника. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім зерна

набувають пурпурово-синього кольору через надзвичайно сильну спорідненість

їх з азурами, які завжди присутні в метиленовому синьому барвнику. Поява пур-

пурового відтінку і обумовлена здатністю давати метахромазію. Ці включення

називають також зернами Бабеша-Ернста за іменами авторів, які вперше описали

їх. Розташовуються вони переважно на полюсах бактерій, рідше – по всій дов-

жині клітини. Волютинові зерна є характерною диференціальною ознакою для

збудника дифтерії – Corynebacterium diphtheriaе.

Для виявлення цих включень використовують методи Леффлера, Нейссера,

П’ю, Мейера, Раскіної та ін.

Метод Леффлера. Фіксований мазок забарвлюють лужним спиртово-вод-

ним розчином метиленового синього протягом 4-5 хв, висушують і мікроскопу-

ють. При цьому волютинові зерна забарвлюютьcя в темно-синій, а цитоплазма – в

блідо-голубий колір (див. вкл., рис. 3).

Метод Нейссера належить до складних методів забарвлення. Він проводиться

за таким алгоритмом:

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

1. На фіксований препарат наносять оцтово-кислу синьку Нейссера і фарбу-

ють протягом 1 хв, зливають барвник і промивають водою.

2. Діють на мазок розчином Люголя протягом 20-30 с.

3. Не промиваючи препарат водою, наносять розчин везувіну (або хризоїди-

ну) і забарвлюють протягом 1-3 хв.

4. Забарвлений мазок промивають водою, висушують і досліджують під

мікроскопом.

Мікроскопічна картина: цитоплазма бактерійних клітин фарбується в світлий

жовто-коричневий відтінок, метахроматичні зерна – в темно-синій, майже чорний

колір (див. вкл., рис. 4).

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером

Метиленовий синій 0,1 г

Етанол 96° 2 мл

Льодяна оцтова кислота 5 мл

Дистильована вода 100 мл

Везувін 12 г

Етанол 96° 60 мл

Дистильована вода 40 мл

Хризоїдин 1 г

Дистильована вода 150 мл

Барвник розчиняють у киплячій воді.

Метод П’ю. Готують спеціальний барвник: до 2 мл етанолу добавляють 0,2 г

толуїдинового синього, потім 100 мл 5 % розчину оцтової кислоти. Барвник стійкий,

зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і

підігрівають до появи парів протягом 1-2 хв, охолоджують, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення.

Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну

кислотостійкість. Саме ця властивість і лежить в основі методу. З досліджуваного

матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на по-

лум’ї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв.

Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % водний розчин сірчаної кислоти, другий – на

такий же час у 4 % розчин калію карбонату. Обидва мазки, не промиваючи водою,

висушують фільтрувальним папером. Перший препарат помічають літерою К (кис-

лота), другий – Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 %

розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється у

світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна – у вишнево-червоний.

У мазку Л цитоплазма виглядає слабо забарвленою, а на місці метахроматичних

зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову при-

роду включень.

Частина І. Загальна мікробіологія

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину

Циля – 4 мл, льодяної оцтової кислоти – 5 мл, етанолу 96° – 95 мл, дистильованої

води – до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на

полум’ї газового пальника до повного випаровування барвника, промивають во-

дою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світло-

червоний колір, а зерна волютину – в чорно-синій.

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної

стінки й капсули.

Цитоплазматична мембрана – м’яка, пластична, тришарова поліфункціо-

нальна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосома-

ми, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

Клітинна стінка – своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає пос-

тійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних та осмотичних сил

і виконує ряд інших важливих функцій, є унікальним структурним компонентом,

властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно стінка складається

з двох шарів: зовнішнього – пластичного і внутрішнього – ригідного, пружного.

Зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру,

яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизо-

вий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі

під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

Капсула – це міцно зв’язаний з клітинною стінкою особливий слизовий шар.

Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники

сибірки, чуми, крупозної пневмонії), в інших – вона завжди є в усіх середовищах

(клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лей-

коносток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виді-

ляють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно зв’язані з клітин-

ною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

При повсякденних діагностичних лабораторних дослідженнях потреба вияв-

ляти клітинну стінку чи цитоплазматичну мембрану майже не виникає. Під світло-

вим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або

плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне

зневоднення, цитоплазма клітин зморщується й відстає від клітинної стінки (плаз-

моліз). Під мікроскопом видно контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо

ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостері-

гається протилежне явище – плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка зго-

дом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх

контури (чохли).

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки.

Найбільш відомими з них є методи Пєшкова, Гутштейна, Кнайзі.

Метод Пєшкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60

мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) протягом 15 хв,

потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлю-

ють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 с. Препарат висушують

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

на повітрі й мікроскопують. Оболонка виглядає як тонкий червоний обідок навко-

ло бактерійної клітини.

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутш-

тейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв

10 % розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 %

водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлюються оболонки в фіолето-

вий колір вже через 5-10 с.

Метод Кнайзі. Зафіксований у полум’ї пальника мазок протравлюють у спеці-

альному розчині (насичений водний розчин калійних галунів – 70 мл, 20 % розчин

таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, на-

кривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка

фарбується в червоний колір.

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять

складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають

гелеподібну консистенцію. При звичайних методах

фарбування вони погано сприймають барвники.

Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і

органів, мазках із гною, харкотиння вони виявля-

ються при будь-якому методі фарбування у вигляді

незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тіла-

ми бактерій і субстратом (рис. 13). Для фарбування

самих капсул запропоновані різні методи.

Спосіб Ребігера. Нефіксований мазок забарв-

люють насиченим розчином генціанового фіолето-

вого у 40% формаліні протягом 15-20 с, швидко промивають водою і висушують.

Капсули фарбуються у червоний, а бактерії – в темно-фіолетовий колір.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за

способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промива-

ють водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним

1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. На

темному димчасто-сірому фоні контрастно виділяються незабарвлені капсули, все-

редині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій (див. вкл., рис. 5).

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі або суміші Никифорова

(але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового

розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім

залишають на 30 с для охолодження. Препарат промивають великою кількістю

розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують.

Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом або сумішшю

Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої

води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують.

Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули – у блідо-рожевий. Метод постійно

дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул менш демонстративні.

Рис. 13. Капсули бактерій.

Частина І. Загальна мікробіологія

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворю-

вати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових куль-

тур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно за-

ломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліно-

вими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus)

або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись

центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової ганг-

рени) або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони

основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують про-

никнення барвників.

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок споронос-

ної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4

рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтру-

вальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за

методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла

бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний (див. вкл., рис. 6).

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не ви-

магає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за

таким алгоритмом:

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового ріжка, або

в спиртовому формаліні.

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до ки-

піння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 с.

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином

нейтрального червоного впродовж 30-40 с. Промивають дистильованою водою,

висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають сині-

ми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний

розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють

за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору,

а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають

5% водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів,

промивають струменем проточної води 30-40 с і додатково забарвлюють 0,5 %

водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій

забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні

органи руху – джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм

у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і

розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник

черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для

певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При

прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’яз-

ково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла

або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають ви-

димими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відно-

сяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надав-

леній краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазово-контрастної та анопт-

ральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з найтонших, складних і вимогливих бактеріоско-

пічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера,

Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Найнадійнішим із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготов-

лення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежи-

рених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і

вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих

пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтяг-

нутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у

воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши

препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл

20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірча-

нокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання,

перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і

профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протя-

гом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави.

Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко-

ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за

методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчи-

ном, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну

10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2 – насичений спиртовий розчин генціана

фіолетового.

Частина І. Загальна мікробіологія

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препа-

рат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають во-

дою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий

колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

Мікроскопічне дослідження живих мікробів

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надав-

леної й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх

ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Пере-

вагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді,

тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супро-

воджується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна

виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користу-

ються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні

видів збудників.

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно руха-

ються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише

загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані

крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку струк-

туру їх клітин краще, ніж у забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо

виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазово-

контрастної та аноптральної мікроскопії.

Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небез-

печна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно

обов’язково занурювати препарати в дезінфікуючий розчин.

Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею

або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури

або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють

фізіологічним розчином, оскільки наявність великої кількості мікробних тіл у полі

зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесе-

ну краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінце-

том, щоб у надавленій краплі не з’являлись бульбашки повітря. Для цього по-

крівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі

і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями.

Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не

виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмок-

тують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого

папір занурюють у дезінфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швид-

ке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла

заздалегідь змащують вазеліном.

Висяча крапля – метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів,

розроблений Р. Кохом в 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмно-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

ження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми,

явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо.

Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпрості-

ших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури,

вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в

центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої сус-

пензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежи-

реного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо зма-

щують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи, щоб крап-

ля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля

повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату

висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну

вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом

довгого часу (рис. 14).

Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій

краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опу-

щеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спо-

чатку при малому збільшенні (×8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в

дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких крап-

линок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По дру-

гий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край

краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший

сухий (×40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (×90). Трохи відкривають

діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії

проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роб-

лячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять мо-

нотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й без-

ладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молеку-

лярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно

коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів

мікробів через кривизну лунки. Для усу-

нення цього недоліку можна користува-

тись камерою Беттхера. Її легко виготови-

ти в будь-якій лабораторії. До звичайного

предметного скла за допомогою воску,

парафіну або відповідного клею при-

кріплюють скляне або пластмасове кільце

з діаметром отвору біля 10 мм і висотою

6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця

змащують вазеліном і на нього наклада-

ють покрівне скельце з живими бактерія-

Рис. 14. Висяча крапля:

а – вид зверху; б – вид збоку.

Частина І. Загальна мікробіологія

ми в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери

можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів.

Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи ви-

сячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього

використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і то-

луїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус

зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину

барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді

дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів

створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них зап-

ропонували Пєшков і Фонбрюн.

Ш-подібна камера Пєшкова. На предметне скло наливають шар розтопле-

ного агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають

дві канавки і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять

методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають

стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного

скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату.

Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розви-

ток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за до-

помогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні

смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з

тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики поперед-

ньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру,

щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають

її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло

заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не

слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

За допомогою камер Пєшкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни

клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйом-

ку особливо при використанні фазово-контрастної й аноптральної мікроскопії.

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгу-

тиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікро-

організмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього дос-

ліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середови-

ща. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають

джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рух-

ливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщині живильного середовища.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Розділ 4

ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів як окремий розділ мікробіології вивчає біохімічні

й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують

відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби. Адже бактерії є

складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні пе-

ретворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів

та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональ-

ної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов

зовнішнього середовища.

Культивування мікроорганізмів

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лаборатор-

них умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання

використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стан-

дартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності

мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови

власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту висту-

пають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче,

риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони.

Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі.

Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і

вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним дже-

релом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові

гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу се-

редовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєч-

ний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і

містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму

складі неорганічні фосфати.

Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і ток-

синоутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо).

Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та

рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів

досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до

20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Основні живильні середовища. Численні потреби мікроорганізмів зумовлю-

ють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існу-

ють спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо

Частина І. Загальна мікробіологія

перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища за-

водського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби

мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використову-

ють згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища ство-

рюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи

інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експеримен-

тального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та

щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно

0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал,

який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %),

білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропеп-

тин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає

середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бак-

терій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіо-

логічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також же-

латин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять

основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп-

тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наяв-

ністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випад-

ках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, си-

роватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду

ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види

бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для

холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група селективні середовища, які завдяки додаванню певних ком-

понентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних

видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. Так, середовище Мюллера

є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для

коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ ро-

бить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група се-

редовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів

і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення

протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, ре-

дукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Все ширше застосування в мікробіологічних лабораторіях знаходять численні

комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготов-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

лені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному

варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети

та висушуються для видалення води. До них належать системи АРІ-20 для іденти-

фікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів,

Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для

ідентифікації ентеробактерій (див.вкл., рис. 29). Непогано зарекомендували себе

тест-системи Roche та інші.

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюю-

чих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені

системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно досліди-

ти широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких

мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих

об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки.

Комп’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оці-

нити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ вхо-

дять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо,

рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готу-

ють спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і

кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат

Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання жи-

вильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні

солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду

натрію складає 5,0 г/л, KH

– 0,2-0,5 г/л, MgSO

·7H

O, інші солі додаються із

розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри,

багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до

0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар,

який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом

середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворю-

ючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С.

Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки,

кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться

при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми

здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача

середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином

застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який

потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів.

Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компо-

ненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’яз-

ково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра,

Частина І. Загальна мікробіологія

або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилі-

зації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують

через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові

фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка

курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, кол-

би, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками.

Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так,

середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при

температурі 112 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Середови-

ща без вуглеводів можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв.

Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як

нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням

через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Кон-

троль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті

протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які

найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути осно-

вою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку по-

передньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шмат-

ки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною

водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному

місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи на-

кип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтру-

вальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного

об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура

120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а

на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при

подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція

середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води

додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за до-

помогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. Бульйон

фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, про-

бірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С про-

тягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають

дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення

агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію

проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці

середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед засто-

суванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додають

Розділ 4. Фізіологія бактерій

стерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тва-

рини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідку-

ючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний

агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за

інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержа-

ти в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість

амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стаб-

ільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру,

порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним

об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить

про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У

рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують

до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попе-

редньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через м’ясорубку.

Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану суміш

ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо

активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недо-

броякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у

великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд

резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок

парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища,

встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температу-

рі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують

рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше

цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За

1-2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка на-

буває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду.

Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою

проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної води). За

наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-

фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амін-

ний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають

у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може

зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до

100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду

натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4-7,6,

розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

Частина І. Загальна мікробіологія

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецепту-

рою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартни-

ми сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промис-

ловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіолог-

ічних досліджень і стандартизувати їх.

Основні методи стерилізації

Головний напрям у боротьбі з інфекційними хворобами – профілактичний. У

зв’язку з цим у діяльності лікувальних закладів велике значення має попереджен-

ня попадання збудників захворювань в організм людини або інші об’єкти. Це про-

водиться добре розробленими й апробованими методами мікробної деконтамінації.

Основні з них – стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне

знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, ма-

теріалах, у живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, перев’язочний і шовний ма-

теріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторі-

ях – живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому

перед стерилізацією необхідно вміти підготувати інструменти, посуд, пробірки,

піпетки, перев’язочний матеріал та інше.

Інструменти обробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують

у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж роз-

чині 0,5-1 хв, прополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у

сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загорта-

ють у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилі-

заційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця за-

тикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали

по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закри-

вають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою

температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою