С.І. Климнюк

І.О. Ситник

М.С. Творко

В.П. Широбоков

П Р А К Т И Ч Н А

М І К Р О Б І О Л О Г І Я

Рекомендовано Центральним методичним кабінетом

з вищої медичної освіти МОЗ України як навчальний посібник

для студентів вищих медичних навчальних закладів IV рівня акредитації

(протокол № 2 від 30.03. 2004 р.)

Тернопіль

“Укрмедкнига”

2004

ББК 28.4я73

П 69

УДК 616-093/-098(075.8)

Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.

Практична мікробіологія: Посібник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. –

440 с.

Матеріал посібника подано відповідно до навчальної програми з курсу мікробіології, іму-

нології та вірусології. Він складається з шести частин. Частина перша – “Загальна мікробіоло-

гія” – містить дані про організацію і режим роботи бактеріологічних лабораторій, методи

дослідження морфології, фізіології, екології та генетики мікроорганізмів, визначення чутли-

вості їх до антибіотиків. Друга частина присвячена імунологічній діагностиці інфекційних

хвороб, методам їх специфічної профілактики та лікування. В третій частині описані основні

властивості збудників бактеріальних інфекцій і методи їх лабораторної діагностики. Четверта

частина присвячена характеристиці і класифікації вірусів та методів класичної і експрес-діаг-

ностики вірусних інфекцій. У п’ятій частині представлені основні відомості про найбільш

поширені гриби, їх морфологічні особливості та лабораторні методи діагностики мікозів. Шоста

частина містить дані про мікроскопічні дані найбільш поширених збудників протозоозів і

методи діагностики захворювань, викликаних найпростішими.

Посібник призначений для студентів медичних факультетів вищих навчальних закладів IV

рівнів акредитації.

ISBN 966-673-059-6

Творко М.С., Широбоков В.П., 2004.

П 69

ББК 28.4я73

УДК 616-093/-098(075.8)

Рецензенти: зав. кафедри імунології, алергології та ендокринології

Буковинської державної медичної академії,

доктор мед. наук, проф. І.Й. Сидорчук;

зав. кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Дніпропетровської державної медичної академії,

доктор мед. наук, проф. Г.М. Кременчуцький.

Передмова

У ХХІ столітті постали важливі і невідкладні проблеми в галузі інфекційної

патології. Економічна нестабільність життя населення, масова міграція людей

призвели до значного погіршення епідеміологічної ситуації відносно особливо

небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, лептоспіроз, та ін.). Значно

зросла захворюваність на туберкульоз, дифтерію, гонорею, сифіліс, харчові

токсикоінфекції.

Швидке постаріння людей, несприятлива екологічна ситуація, збільшення

кількості осіб із супровідними бактерійними, грибковими і протозойними захво-

рюваннями зумовило зростання патологічних процесів, викликаних умовно-

патогенними мікроорганізмами. Широке розповсюдження мають госпітальні,

хронічні, змішані та ендогенні інфекції. З року в рік зростає кількість таких

нозологічних форм, як сепсис, септикопіємії, неспецифічні інфекції, і гнійно-

септичні захворювання шлунково-кишкового тракту, інфікування післяопера-

ційних, опікових і посттравматичних ран, мікробіологічна діагностика яких

розроблена ще недостатньо.

Бурхливий розвиток вірусології, збільшення частоти таких вірусних інфекцій

як грип, гепатити, СНІД, геморагічні гарячки, енцефаліти, герпес, краснуха та

ін. вимагають ретельного вивчення студентами особливостей їх лабораторної

діагностики.

У програмах і навчальних планах чільне місце відводиться вивченню важливих

проблем імунології, освоєнню методів імунологічної діагностики інфекційних

хвороб, визначенню тестів імунологічного статусу людини, знайомству з

методами виготовлення вакцин, діагностикумів, імунних сироваток тощо. Окрім

того, у ВНЗ введено курс клінічної імунології, а в окремих з них створені навіть

кафедри імунології. Це вимагає детального викладу постановки необхідних реакцій

і тестів, методика і оцінка яких зазнали чималих змін.

У даному посібнику описані способи і методики мікроскопічної, бакте-

ріологічної (вірусологічної), серологічної, імунологічної, біологічної та алерго-

логічної діагностики інфекційних хвороб. Велика увага приділена використанню

експрес-діагностики, новітнім люмінесцентно-серологічним дослідженням,

реакціям коаглютинації і латекс-аглютинації, застосуванню таких високо-

чутливих методів як імуноферментний, імуноелектронний, радіоімунний, визна-

чення імунних комплексів, моноклональних антитіл, реакцій гальмування гема-

глютинації, непрямої гемаглютинації та ін.

Назви мікроорганізмів, схеми їх класифікацій подано відповідно до між-

народної системи та номенклатури, викладених у “Bergey’s manual of systematic

bacteriology” (1994).

Усі критичні зауваження і побажання щодо покращання посібника автори

приймуть із щирою вдячністю.

Список умовних скорочень

АО – антитоксична одиниця

БУО – бляшкоутворююча одиниця

ВІЛ – вірус імунодефіциту людини

ГНТ – гіперчутливість негайного типу

ГСТ – гіперчутливість сповільненого типу

ДНК – дезоксірибонуклеїнова кислота

ІФА – імуноферментний аналіз

КОА – коаглютинація

КУО – колонієутворююча одиниця

ЛАГ – латекс-аглютинація

МО – міжнарожна одиниця

МПА – м’ясо-пептонний агар

МПБ – м’ясо-пептонний бульйон

ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція

РА – реакція аглютинації

РГА – реакція гемаглютинації

РГадс – реакція гемадсорбції

РГГА – реакція гальмування гемаглютинації

РГГадс – реакція гальмування гемадсорбації

РГНГА – реакція гальмування непрямої гемаглютинації

РЗК – реакція зв’язування комплементу

РЗНГА – реакція зворотної непрямої гемаглютинації

РІА – радіоімунний аналіз

РІФ – реакція імунофлуоресценції

РНГА – реакція непрямої гемаглютинації

РН – реакція нейтралізації

РНК – рибонуклеїнова кислота

РП – реакція преципітації

РПГ – реакція преципітації в гелі

СНІД – синдром набутого імунодефіциту

Розділ 1

ОРГАНІЗАЦІЯ, УСТАТКУВАННЯ, РЕЖИМ РОБОТИ

БАКТЕРІОЛОГІЧНИХ, ІМУНОЛОГІЧНИХ

І ВІРУСОЛОГІЧНИХ ЛАБОРАТОРІЙ

Бактеріологічні лабораторії – спеціальні науково-дослідні, науково-прак-

тичні або практичні установи, в яких проводять мікробіологічні, біологічні та серо-

логічні дослідження. Їх організовують при профільних науково-дослідних інститу-

тах, навчальних закладах, клінічних лікарнях, санітарно-епідеміологічних станціях

(СЕС). Мікробіологічні лабораторії в лікувально-профілактичних установах вико-

нують відповідні аналізи з метою діагностики інфекційних хвороб, визначення

строків виписування хворих з лікувальних закладів, визначення чутливості збуд-

ників до антибіотиків та інших препаратів, здійснюють контроль за ефективністю

хіміотерапії, дотриманням санітарно-протиепідемічного режиму.

Бактеріологічні лабораторії районних СЕС проводять санітарно-бактеріоло-

гічні аналізи води і харчових продуктів, мікробіологічні дослідження випорожнень,

сечі, жовчі, блювотних мас, промивних вод шлунка з метою виявлення хворобо-

творних і умовно-патогенних бактерій, виділення гемокультур при черевному тифі,

паратифах, сепсисі та інших захворюваннях. Досить часто тут роблять аналізи

харкотиння, слизу з рото- і носоглотки для виділення збудників туберкульозу, диф-

терії, коклюшу, назофарингіту, проводять серологічну діагностику тифів, туля-

ремії, бруцельозу, дослідження крові на виявлення малярійних плазмодіїв.

Бактеріологічні лабораторії міських і обласних СЕС, окрім вищеперелічених

досліджень у більш повному обсязі, проводять аналізи повітря, посіви перев’язу-

вальних матеріалів та лікарських препаратів на стерильність, змивів з рук, інстру-

ментів та інвентаря лікарняних і дитячих закладів, підприємств громадського хар-

чування, за епідеміологічними і санітарними показаннями, а також для перевірки

якості поточної і заключної дезінфекції. У лабораторіях такого рангу проводять

повний аналіз на кокову, анаеробну і кишечну мікрофлору, постановку реакцій

нейтралізації правцевого, ботулінового і стафілококового токсинів, визначення

чутливості виділених збудників до антибіотиків методом серійних розведень, серо-

логічні та люмінесцентно-серологічні дослідження при інфекційних захворюван-

нях, фаготипування і бактеріоцинотипування сальмонел і стафілококів, визначення

видів атипових мікробних культур. З метою попередження або виявлення госпіталь-

Частина І

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

Частина І. Загальна мікробіологія

них інфекцій проводять дослідження носійства стафілококів, сальмонел та інших

мікроорганізмів серед медичного персоналу, а також серед працівників харчоб-

локів і служб водопостачання для профілактики харчових токсикоінфекцій,

здійснюють діагностику дисбактеріозів.

Планування, організація, устаткування і режим роботи бактеріологічної ла-

бораторії повинні забезпечити основні вимоги до таких специфічних установ, тобто

створити умови, які б забезпечили проведення досліджень при дотриманні сте-

рильності, гарантували безумовне виключення можливого зараження персоналу і

відвідувачів та спонтанну контамінацію мікробами довкілля, живильних середо-

вищ, виділених чистих культур та інших матеріалів.

У структуру звичайної мікробіологічної лабораторії входить ряд приміщень

спеціального призначення: одна або декілька лабораторних кімнат, бокс із перед-

боксником, приміщення для приготування живильних середовищ (кухня), авто-

клавна (стерилізаційна), термостатна, мийка, препараторська, кімната для забору

або прийому досліджуваного матеріалу і його реєстрації, віварій для лаборатор-

них тварин. Ус і приміщення розташовують так, щоб заразний (“брудний”) матеріал

не стикався і не перехрещувався з “чистим”.

Функціональні кабінети мають бути світлими, просторими, теплими, з підве-

денням гарячої і холодної води, електричного струму, з виходом вікон на північ

або північний захід. Стіни, двері, підлогу виготовляють із матеріалів, які легко

миються і дезінфікуються.

Лабораторна кімната – основне приміщення для проведення досліджень. Жор-

сткий протиепідемічний режим роботи вимагає її щоденного вологого прибиран-

ня та щомісячного проведення дизінфекції підлоги, стін, столів і обладнання. Ро-

бочі столи покриваються спеціальним пластиком або склом. У лабораторії доц-

ільно виділити й обладнати окремі робочі місця та закріпити їх за кожним

співробітником.

На робочому столі лікаря-мікробіолога повинні знаходитись тільки предмети,

необхідні для проведення бактеріологічних досліджень: газовий пальник (спир-

тівка), пастерівські й градуйовані піпетки, пінцети, бактеріологічні петлі, шпателі,

предметні та покрівні скельця, пробірки, штативи, чашки Петрі, аглютиноскоп,

лупа, мікроскоп, банка з дезінфікуючим розчином. Біля стола повинна стояти по-

судина з дезрозчином, куди опускають відпрацьований заразний матеріал, який

потім автоклавується.

Меблі бактеріологічної лабораторії мають бути простими, зручними, які легко

миються і дезінфікуються. Сучасна лабораторія оснащується мікроскопами, авто-

клавами, термостатами, сушильними шафами, центрифугами, дистилятором, апа-

ратом для згортання сироватки, рН-метром, холодильником, лабораторною вагою,

фотоелектроколориметром, апаратом для автоматичного підрахунку колоній, бак-

терійними фільтрами, комп’ютером, бактерицидними лампами.

Для проведення мікробіологічних досліджень в особливо стерильних умо-

вах відводять окрему кімнату або бокс. Його площа повинна розраховуватись для

роботи двох чоловік (5-8 м

), мати окремий вхід через тамбур (передбоксник).

Розділ 1. Організація, устаткування, режим роботи лабораторій

Меблі, які встановлюють у боксі (стіл, стільці, невелика шафа для стерильного

посуду, середовищ тощо), мають бути простими, краще металевими, що спрощує

їх знезараження. Стіни покривають облицювальною плиткою або світлою масля-

ною фарбою, підлогу вистилають гладенькими плитами або лінолеумом. У там-

бурі має бути водопровідний кран і умивальник для миття рук.

Сучасні бокси мають систему подачі стерильного повітря або ламінарних його

потоків, що створює найкращі умови стерильності й безпеки. Перед початком і

після роботи проводять вологе прибирання, дезінфекцію та опромінення бактери-

цидними лампами протягом 1-2 год. Повітря боксів систематично перевіряють на

обсіменіння мікробами.

Для малих об’ємів роботи існують переносні настільні бокси або бокси-сто-

ли. Робочу його частину складає невелика скляна камера (100×70×70 см), яка має

два отвори для рук, оснащені спеціальними нарукавниками. Кращим варіантом

таких боксів є бокс з ламінарним потоком стерильного повітря.

Окрім звичайних бактеріологічних лабораторій в усіх обласних центрах, а

також у великих морських портах організовують лабораторії для проведення діаг-

ностики особливо небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, бруце-

льоз, сап, меліоїдоз, лептоспіроз, геморагічні гарячки та ін.). У цих лабораторіях

встановлюють більш жорсткий протиепідемічний режим, який регламентується

спеціальними інструкціями. Тут працює спеціально підготовлений персонал; осо-

би, які мають протипоказання для проведення щеплень, до роботи в таких лабо-

раторіях не допускаються.

Вірусологічні лабораторії – установи, які вивчають віруси, проводять діаг-

ностику вірусних інфекцій, виготовляють різноманітні вірусні препарати (вакци-

ни, діагностикуми, противірусні імунні сироватки тощо). Устрій та їх оснащення

дещо відрізняються від бактеріологічних лабораторій. У структурі вірусологічної

лабораторії обов’язково повинен бути бокс з тамбуром і ряд підсобних приміщень

для обробки і стерилізації посуду, виготовлення живильних середовищ для виро-

щування клітинних культур, інкубатора для розвитку курячих ембріонів, устатку-

ванням для ліофілізації вірусів, віварій та ін.

Окрім звичайного лабораторного оснащення, необхідно мати гомогенізатори

для подрібнення тканин, камери для глибокого і надмірного заморожування до

температур -30-70 °С, холодильники, які можуть тримати температуру -20 °С, цен-

трифуги на 2-3, 12-15 і 60 тис. об/хв. Для збереження клітинних культур потрібні

судини Д’юара з рідким азотом.

Перед і після роботи проводять вологе прибирання та дезінфекцію приміщень

таким же способом, як і бокси в бактеріологічних лабораторіях.

У мікологічних лабораторіях проводять мікроскопічні дослідження та

ідентифікацію культур патогенних грибів з метою діагностики мікозів, рідше –

ставлять досліди на тваринах. Режим їх роботи повинен попередити розсіювання

зараженого грибами матеріалу, щоб уникнути інфікування персоналу. Робочі місця

тримають у зразковому порядку, особистий одяг і речі зберігають у спеціально

відведеному місці.

Частина І. Загальна мікробіологія

Лабораторні столи покривають листовим склом, одну половину якого знизу

фарбують у чорний колір, другу – в білий. На чорному фоні краще помітні світлі

культури грибів, на білому – відтінки пігменту досліджуваних колоній. Необхідно

мати лампу з фільтром Вуда для відбору ураженого волосся при освітленні ультра-

фіолетовими променями.

При роботі з пліснявими грибами, які утворюють величезну кількість летючих

спор, для захисту дихальних шляхів необхідно користуватись марлевими пов’яз-

ками (масками). Досліджуваний матеріал беруть лише за допомогою інструментів:

ложечок Фолькмана, лопаточок, манікюрних кусачок, епіляційних, анатомічних

та хірургічних пінцетів, платинових петель, препарувальних голок тощо. Знезара-

ження відпрацьованих матеріалів проводиться такими ж способами, як і в бакте-

ріологічних лабораторіях.

Діагностичні мікологічні лабораторії організовують при шкірно-венерологіч-

них диспансерах. Із збудниками особливо небезпечних мікозів (бластомікоз, гісто-

плазмоз, кокцидіомікоз) працюють лише в спеціально оснащених лабораторіях.

Паразитологічні лабораторії – науково-практичні й практичні діагностичні

установи, в яких здійснюються макроскопічні, мікроскопічні та імунологічні до-

слідження з метою діагностики паразитарних хвороб. Їх організація і устаткування

принципово мало відрізняються від оснащення бактеріологічних лабораторій.

Обов’язково мають бути мікроскопи з окулярними мікрометрами та нагрівальни-

ми столиками.

Макроскопічні методи дослідження полягають у виявленні паразитів на

зовнішніх покривах хворого або в його випорожненнях. За допомогою мікрос-

копічних методів виявляють збудників у мазках крові, інших біологічних ріди-

нах, шматочках м’язів, взятих при біопсії, а також у харкотинні, фекаліях та

інших виділеннях. Останнім часом досить широко використовують імунологічні

методи діагностики паразитарних хвороб, особливо аскаридозу, трихінельозу і

ехінококозу.

Для попередження проникнення паразитів із досліджуваних матеріалів у рот

необхідно користуватися піпетками з гумовими грушами. При дослідженні фе-

калій препарати з них слід виготовляти у витяжній шафі.

Весь заразний і відпрацьований матеріал треба кип’ятити, автоклавувати або

обробляти дезінфікуючим розчином.

Імунологічні лабораторії виникли лише в другій половині ХХ століття. До

цього серологічні дослідження проводили в звичайних бактеріологічних лабора-

торіях. Бурхливий розвиток імунології, розробка оригінальних методик і діагнос-

тичних тестів призвели до створення спеціальних імунологічних лабораторій, які

можуть бути самостійними структурними одиницями або існувати в складі мікро-

біологічних лабораторій. Вони оснащуються термостатами, холодильниками, цент-

рифугами, спеціальним посудом і приладами чи пристроями для проведення іму-

нологічних реакцій у великих кількостях.

У сучасних імунологічних лабораторіях визначають біля 30 показників гу-

морального й клітинного імунітету (кількість Т- і В-лімфоцитів, концентрації ос-

Розділ 1. Організація, устаткування, режим роботи лабораторій

новних класів імуноглобулінів, фагоцитарна реакція лейкоцитів, реакція бласт-

трансформації лімфоцитів, циркулюючі імунні комплекси та ін.).

Для діагностики багатьох бактерійних, вірусних, паразитарних і протозойних

хвороб широко використовують різні варіанти реакцій аглютинації, преципітації,

нейтралізації, зв’язування комплементу, імунофлуоресценції, імуноелектрофорезу,

радіоімунного та імуноферментного аналізу тощо.

При проведенні бактеріологічних і вірусологічних досліджень у лабораторіях

відповідного профілю співробітники повинні дотримуватись протиепідемічного

режиму і встановлених правил роботи:

1. До роботи в бактеріологічній (вірусологічній) лабораторії допускаються

особи, які обізнані з правилами роботи в ній.

2. Кожен співробітник повинен працювати лише на закріпленому за ним ро-

бочому місці.

3. Персонал лабораторії повинен мати індивідуальний спецодяг (халат, ша-

почку, взуття). У боксі працюють у стерильних халатах, шапочках і марлевих мас-

ках. При зараженні й розтині тварин одягають ще й фартух, нарукавники й гумові

рукавички.

4. Курити, вживати їжу й зберігати харчові продукти в лабораторії категорич-

но заборонено.

5. Матеріал, що надходить у лабораторію для дослідження, завжди вважають

заразним, його обов’язково записують у спеціальному журналі і маркірують.

6. Відпрацьовані культури мікробів і заразні матеріали підлягають обов’язко-

вому щоденному знищенню. Робочі столи і використані інструменти дезінфікують.

7. Переливати рідини, які містять патогенні мікроорганізми, необхідно над

посудиною з дезінфікуючим розчином. При набиранні таких рідин у піпетки по-

трібно користуватися гумовими балонами або грушами.

8. Коли при розбиванні колби чи пробірки заразний матеріал або жива куль-

тура потрапляє на робочий стіл, інші меблі, одяг, руки, підлогу, треба негайно

повідомити про це завідувача лабораторії або лікаря-бактеріолога і в його присут-

ності провести дезінфекцію заражених ділянок, потім обробити руки дезрозчи-

ном і ретельно їх вимити.

9. У лабораторії не дозволяються зайві ходіння, різні рухи, непотрібні розмо-

ви. Виконання цих вимог попереджує проникання сторонніх мікробів із повітря й

ротової порожнини в досліджуваний матеріал.

10. Необхідно завжди уникати втрат і виносу з лабораторії заразного матері-

алу, живих культур та інфікованих тварин. Усі термостати, рефрижератори та сей-

фи з культурами потрібно обов’язково пломбувати. Контролює виконання цих

правил завідувач лабораторії або лікар-бактеріолог.

11. Музейні або виділені культури, якщо це необхідно, зберігають в агарових

стовпчиках під вазеліновим маслом або в запаяних ампулах у ліофілізованому стані.

12. Після закінчення роботи столи дезінфікують, проводять вологе прибирання

лабораторії з використанням дезінфікуючих розчинів. Предмети, матеріали, інструмен-

ти, інфіковані під час роботи, збирають у баки (відра) і в той же день стерилізують.

Частина І. Загальна мікробіологія

Правила поводження з живими культурами, виділеними в процесі досліджен-

ня, а також із музейними штамами мікроорганізмів, залежно від ступеня їх пато-

генності, регламентуються відповідними інструкціями.

Робота в лабораторіях, де проводять мікробіологічну діагностику особливо

небезпечних інфекцій, вимагає ще більш жорсткого протиепідемічного режиму.

Перед входом до лабораторії в гардеробній з індивідуальними шафами співробіт-

ники знімають верхній одяг і білизну.

Залежно від об’єму і характеру роботи одягають один із чотирьох типів про-

тичумних костюмів у певній послідовності: піжама, шкарпетки, тапки, капюшон

(косинка), протичумний халат, чоботи. Респіратор (маску) одягають так, щоб зак-

рити рот і ніс, закладають ватні тампони з обох боків носа, потім надівають окуля-

ри, гумові рукавички, за пояс халата з правого боку закладають рушник, змочений

у дезрозчині.

По закінченні роботи руки в рукавичках занурюють у 5 % розчин лізолу на

2 хв. Протичумний костюм знімають у зворотній послідовності, за винятком ру-

кавичок, які, не знімаючи з рук, занурюють у ємкість із дезінфікуючим розчином

після зняття кожного предмета одягу і знімають останніми. Одяг складають зовн-

ішньою стороною всередину і дезінфікують або автоклавують. Окуляри поміща-

ють у 70 % спирт.

Після розтину трупів тварин усі інструменти кип’ятять у розчині лізолу про-

тягом 40 хв, а самі трупи та відпрацьовані матеріали спалюють або автоклавують.

Розділ 2

МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

При проведенні мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб з метою

їх раннього і остаточного розпізнавання у сучасних лабораторіях використовують

різні методи дослідження.

Мікроскопічний (бактеріоскопічний, вірусоскопічний, протозооскопічний) –

виготовлення й забарвлення мазків із досліджуваного матеріалу від хворого і вив-

чення його під мікроскопом. Він дає змогу швидко виявити характерні морфо-

логічні особливості збудника й має важливе значення при діагностиці гонореї,

менігококового менінгіту, туберкульозу, лепри, сифілісу, поворотного тифу, віспи,

малярії, лейшманіозу, токсоплазмозу тощо.

Бактеріологічний метод зводиться до посіву матеріалу від хворого на від-

повідні живильні середовища, виділення чистої культури збудника й визначення

його виду, а, отже, і встановлення остаточного діагнозу захворювання. Він має

вирішальне значення при діагностиці черевного тифу, дизентерії, холери, дифте-

рії, чуми та інших хвороб.

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

Серологічний метод базується на виявленні специфічних антитіл у сиро-

ватці крові хворих до певного збудника. Для цього використовують різні імуно-

логічні (серологічні) реакції: аглютинації, преципітації, зв’язування комплементу

тощо. Так, наприклад, при черевному тифі часто ставлять реакцію аглютинації

Відаля, при бруцельозі – реакцію Райта, при хронічній гонореї – реакцію зв’язу-

вання комплементу Борде-Жангу та ін.

Біологічний (експериментальний) метод полягає у зараженні чутливих лабо-

раторних тварин виділеною чистою культурою збудника, досліджуваним матеріа-

лом або введенні бактерійних токсинів і відтворенні типової картини захворювання.

Для цього використовують білих мишей, щурів, гвінейських свинок, кроликів.

Цим методом визначають і вірулентність мікробів. З діагностичною метою біоло-

гічну пробу часто використовують при чумі, сибірці, туляремії, правці, ботулізмі

анаеробній газовій інфекції, кліщовому енцефаліті тощо.

Алергічний метод дає змогу встановити діагноз за допомогою внутрішньо-

шкірних алергічних проб, які виявляють стан підвищеної чутливості до збудника

чи продуктів його життєдіяльності (алергенів). Цим методом широко користуються

при діагностиці туберкульозу (проба Манту), бруцельозу (проба Бюрне), туляремії

та багатьох інших хвороб.

Для глибокого розуміння, засвоєння і логічного застосування бактеріоскопіч-

ного методу діагностики важливе значення має фундаментальне вивчення морфо-

логі й ультраструктури мікробів, методів їх простого й складного забарвлення,

виявлення окремих структур і включень у бактерійній клітині. З цією метою в

лабораторії широко використовують сучасні мікроскопи — високоінформативні

оптичні прилади.

Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, тому побачити їх

неозброєним оком неможливо. У той же час морфологія мікробів, їх розміри, фор-

ма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня

ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою

класифікації. Зважаючи на це, одним з найважливіших методів дослідження будо-

ви мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів до-

слідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як

темнопольна, фазово-контрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна,

люмінесцентна та ін. При вивченні анатомії й ультраструктури вірусів використо-

вують електронну мікроскопію.

Сучасна промисловість випускає багато видів мікроскопів залежно від їх при-

значення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користують-

ся мікроскопами МБР-1, МБР-3 (рис. 1).

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До ме-

ханічної входять штатив, тубус, револьвер, предметний столик, макро- й мікрогвинт,

до оптичної – об’єктиви й окуляри, до освітлювальної – дзеркало й конденсор.

Частина І. Загальна мікробіологія

У верхній частині штатива

є тубус, в який вставляється оку-

ляр, а знизу він має револьвер, в

отвори якого вгвинчені 3-4 об’єк-

тиви. Обертаючи револьвер,

можна встановити будь-який

об’єктив під отвір тубуса. Остан-

ній підіймається і опускається за

допомогою макро- й мікромет-

ричного гвинтів. Для грубого на-

ведення зображення користують-

ся макрогвинтом. Більш точно

це робиться за допомогою мікро-

гвинта. Мікрометричний гвинт є

однією з найбільш тендітних ча-

стин мікроскопа й вимагає обе-

режного поводження з ним.

Предметний столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знахо-

диться отвір, над яким розміщують предметне скло з препаратом (мазком). У більш

досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеці-

альних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикуляр-

них напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох

лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (×8, ×40) та

імерсійні (×90, ×120). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою

яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, у зв’язку з різницею

показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових

променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єкти-

ви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедро-

ва, персикова олія чи “імерсіол”, коефіцієнт заломлення світла яких такий самий,

як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переваж-

но імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна

здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі

роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена

такими явищами, як хроматична й сферична аберації, дифракція та ін. Якщо обидва

види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній сис-

темі і його усунути або принаймі зменшити практично неможливо. Дифракція в

значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вира-

хувати за формулою:

α⋅

sinn

61,0A

Рис.1. Мікроскопи МБР-1 (а) і МБР-3 (б).

аб

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

де А – роздільна здатність; 0,61 – коефіцієнт геометричних величин при ви-

рахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; λ – довжина світло-

вої хвилі; n· sinα – постійна величина для кожного об’єктива, яка називається чис-

ловою або нумеричною апертурою. У сучасних сухих об’єктивах вона не пере-

більшує 0,95, а в імерсійних – від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані

на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх

нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним

об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність

дорівнює:

мкм2,0

60,1

55,0

61,0A ==

Отже, при користуванні навіть найкращими імерсійними об’єктивами немож-

ливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення

об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів.

Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при вико-

ристанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить

від об’єктива, не додаючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими

збільшеннями: ×7, ×10, ×15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається

із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в кон-

денсор, а через нього – в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала увігнутий, дру-

гий – плоский. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише

плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка

променів в одній точці (фокус), яка знаходиться в площині досліджуваного препа-

рату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня

предметного столика, з штучним – опускати доти, поки зображення джерела світла

не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів

конденсор також опускають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діафрагмою, яка

знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно

до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при

відкритій, а незабарвлені – при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується

зображення та розширюються межі видимості. Перше досягнуто випуском мікро-

скопів-бінокулярів, друге – дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний

мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це

створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають

відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночас-

но досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших

клітин оптична промисловість випускає більш досконалі мікроскопи. Одним із них

Частина І. Загальна мікробіологія

є мікроскоп універсальний біологічний дослідницький МБД-15. За його допомогою

можна проводити широкий об’єм мікроскопічних досліджень: візуальне спостере-

ження, використання світлого і темного полів зору в прямому, косому та відбитому

світлі, метод фазових контрастів, люмінесцентну та інтерференційну мікроскопію.

Для мікрофотографування досліджуваних об’єктів мікроскоп оснащений фотоапа-

ратом з автоматичним затвором, фотоекспонометром та імпульсною лампою.

При вивченні динаміки розвитку і розмноження мікроорганізмів, дії на них

різних фізичних і хімічних факторів, утворення L-форм та інших проблем виго-

товляють спеціальні мікроскопи з мікроустановками для цейтраферної (перерив-

частої) мікрокінозйомки, особливо з використанням методу фазових контрастів.

Правила роботи з імерсійною системою:

1. Підняти конденсор Аббе до рівня предметного столика, повністю відкрити

іріс-діафрагму.

2. Користуючись об’єктивом 8, за допомогою плоского дзеркала домогтися

максимального освітлення поля зору.

3. На предметному столику розмістити забарвлений препарат-мазок, нанести

на нього кедрову олію і закріпити клемами.

4. Повертаючи револьвер, встановити над препаратом імерсійний об’єктив

90, під контролем зору занурити його в краплю кедрової олії.

5. Дивлячись в окуляр лівим оком (не закриваючи правого), спочатку за допо-

могою макрогвинта знайти контури зображення, потім, користуючись мікрогвин-

том, досягти максимальної чіткості, вивчити і замалювати препарат.

6. Після закінчення роботи підняти тубус, зняти предметне скло, обережно

витерти імерсійний об’єктив від кедрової олії, повернути його вбік, опустити тубус.

Освітлення за методом Келлера. Найкращі результати мікроскопії при суб’єк-

тивних дослідженнях і мікрофотографуванні можна отримати лише при умові

чіткого центрування всіх оптичних частин мікроскопа, включаючи і систему ос-

вітлення. Цього досягають при використанні методу Келлера.

1. Фабричний освітлювач з “точковим” джерелом світла встановлюють на

віддалі 25-30 см від мікроскопа так, щоб плоске дзеркало відкидало світлову пля-

му діаметром біля 8 мм на закриту діафрагму конденсора. За цим процесом слідку-

ють за допомогою дзеркальця, покладеного на праву ніжку мікроскопа.

2. На предметний столик вміщують препарат, користуючись сухими об’єкти-

вами (×8, ×40), наводять чітке зображення, знімають окуляр і на верхній кінець

тубусу кладуть матове скельце. На ньому видно зображення об’єкта в центрі світло-

вої плями. При необхідності установку коригують. Відкривають до оптимального

діаметра отвір діафрагми конденсора.

3. Встановлюють необхідний об’єктив і окуляр (краще ×10) і приступають до

вивчення або фотографування досліджуваного об’єкта.

Препарати-мазки слід виготовляти на предметних скельцях товщиною не

більше 1,1-1,4 мм.

Темнопольна мікроскопія відрізняється від звичайної імерсійної світлової

способом освітлення препарату. У звичайному мікроскопі об’єкт досліджують при

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

світлі, яке проходить, у темнопольному – при боковому освітленні. Для мікроско-

пії в темному полі використовують замість конденсора Абб е спеціальний парабо-

лоїд-конденсор (кардіоїд-конденсор), в якому бокова поверхня дзеркальна, а цент-

ральна частина нижньої лінзи затемнена, в результаті чого утворюється темне поле

зору. Яскраві бокові промені, відбиваючись від дзеркальної поверхні, фокусуються

в площині об’єкта, але в очі мікроскопіста не потрапляють. В об’єктив проникають

лише ті промені, які відбиваються частинками препарату завдяки заломленню або

дифракції. Отже, на темному полі зору мікробні клітини й інші дрібні частинки

виглядають дуже яскравими. Картина нагадує миготливі зірки на темному небі.

Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02-

0,04 мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому

темнопольний мікроскоп часто називають ультрамікроскопом. Мікроскопію в тем-

ному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення

збудників сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу. Але при цьому не можна доб-

ре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані

видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та лю-

мінесцентна.

Фазово-контрастна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження про-

зорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту

зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи

світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникних променів. У різних ділянках

клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неод-

накові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помічають. Але їх можна

зробити видимими за допомогою спеціально-

го фазово-контрастного пристрою (рис. 2). Він

включає в себе конденсор з набором кільце-

вих діафрагм, які забезпечують освітлення

препарату повним конусом світла, та фазово-

контрастні об’єктиви. Вони відрізняються від

звичайних об’єктивів тим, що в їх головному

фокусі розташовується напівпрозора фазова

пластинка у вигляді кільця. Саме вона викли-

кає здвиг фази світла, що проходить через неї.

Це дозволяє зробити незабарвлені препарати

чітко видимими.

При роботі з фазово-контрастним при-

стрієм клітини можуть виглядати темними (по-

зитивний фазовий контраст) або світлими (не-

гативний контраст) у порівнянні з оточуючим

фоном. Цей вид мікроскопії не збільшує роз-

дільної здатності, але дозволяє виявити нові

деталі внутрішньої структури живих бактерій,

стадії їх розвитку, зміни під впливом антибіо-

Рис.2. Фазово-контрастний пристрій:

а – допоміжний мікроскоп; б – револь-

верний конденсор з діафрагмами;

в – спеціальні об’єктиви-ахромати.

аб

Частина І. Загальна мікробіологія

тиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність

зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні пе-

реваги перед фазово-контрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазово-контрастної, при якій викори-

стовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у

вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько

10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричне-

вим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву

основну частину дифрагованого світла, у той час як темний шар кільця затримує

небажане периферійне дифраговане світло. За рахунок цього в значній мірі усу-

вається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких ма-

локонтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віру-

си. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стерео-

скопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набу-

вають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія базується приблизно на тих же принципах,

що й фазово-контрастна. Але на відміну від останньої вона дає можливість вивча-

ти деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається зав-

дяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку

об’єкта, а другий – поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються та інтерферу-

ють між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим са-

мим масу різних структур у клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентра-

цію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки

про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційну мікроскопію використовують у цитологічних дослідженнях,

при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпрос-

тіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в

мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або

вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих

їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі настає через світіння са-

мого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовими променями.

Метод побудований на використанні явища флуоресценції. Оскільки більшість

хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочат-

ку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які

зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найча-

стіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, кори-

фосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного

тиску, пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією такого опромі-

нення забарвлені флуорохромом бактерії починають світитися червоним, зеленим,

жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифос-

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

фіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном

збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато чутливіший порівняно з іншими

мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збуд-

ника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції диферен-

ціюють окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Вико-

ристання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення,

висока контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів

і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби,

які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінес-

центні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей ме-

тод успішно використовують для експрес-діагностики багатьох бактерійних і вірус-

них захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18,

ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроско-

пами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів,

фотонасадку, дає змогу проводити одночасно комбіновані спостереження: люміне-

сцентне – при освітленні препарату зверху і фазово-контрастне – в проникному

світлі (рис. 3).

Електронна мікроскопія. Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітин-

ному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки

вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний

прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку елект-

ронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис. до

5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі

(растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.

Принципова схема просвічуючого елект-

ронного мікроскопа мало чим відрізняється від

звичайного оптичного. Можливості світлово-

го мікроскопа обмежені не якістю лінз, а вели-

кою довжиною світлових хвиль (0,29-0,8 мкм).

Мала довжина хвилі електронів (0,0002 мкм і

навіть менше) дозволяє значно збільшити роз-

дільну здатність електронного мікроскопа.

Замість світла в ньому використовують потік

електронів, джерелом яких є вольфрамова нит-

ка, що нагрівається електричним струмом

(електронна пушка). Роль лінз оптичного

мікроскопа виконує кругове електромагнітне

поле. Пучки електронів, проходячи через дос-

ліджуваний об’єкт, відхиляються під різними

кутами залежно від неоднакової товщини та

Рис.3. Люмінесцентний мікроскоп.

Частина І. Загальна мікробіологія

щільності різних ділянок препарату і потрапляють в об’єктивну лінзу. В ній появ-

ляється перше корисне збільшення об’єкта.

Після об’єктивної лінзи електрони потрапляють у проміжну лінзу, яка слу-

жить для плавного збільшення зображення. Проекційна лінза створює кінцеве

збільшене зображення об’єкта, яке направляється на флуоресціюючий екран. Зав-

дяки взаємодії швидких електронів з люмінофором екрану виникає видиме зобра-

ження об’єктів. Після наведення чіткості проводять фотографування.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об’єктів досліджен-

ня. Необхідна спеціальна фіксація тканин або бактерій, їх ретельне зневоднення,

заливка в епоксидні смоли, виготовлення ультратонких зрізів. Для підвищення

чіткості зображення використовують методи позитивного й негативного контрас-

тування та відтінення.

Досліджуваний об’єкт спочатку зафіксовують особливими фіксаторами, потім

наносять на надзвичайно тонку колодієву або целюлозну плівку, вміщену на спеці-

альну сіточку-підкладку. При напиленні на поверхню препарату під певним кутом

у вакуумі наносять тонким шаром важкі метали, хром, золото, паладій. Розпоро-

шені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій

або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються

рельєфно й контрастно (позитивне контрастування). Негативне контрастування

зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприк-

лад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осідаючи навколо білкових частинок дос-

ліджуваного об’єкта й заповнюючи всі проміжки

між ними, атоми важких металів “забарвлюють”

фон, на якому виступають найменші деталі бу-

дови мікроорганізмів.

Широко також використовують ультратонкі

зрізи клітин, бактерій, що дає змогу вивчити їх

структуру на субклітинному й молекулярному

рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промис-

ловість випускає багато моделей електронних

мікроскопів (рис. 4), які мають величезні мож-

ливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методи електронної мікроскопії привели до

великих успіхів у розвитку таких наук як цито-

логія, бактеріологія, генетика і, особливо, віру-

сологія. Успішно розвивається імунна електрон-

на мікроскопія, яка дає змогу визначити родову

належність вірусів, що використовується для

експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагнос-

тики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.

Рис. 4. Електронний мікроскоп.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Розділ 3

МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

У даному розділі розглядаються методи дослідження морфологічних особ-

ливостей основних представників різноманітних мікроорганізмів: бактерій, акти-

номіцетів, грибів, найпростіших, рикетсій. Всі вони належать до одноклітинних

організмів, мають різну форму і внутрішню структуру, які досліджують за допо-

могою вищеописаних методів мікроскопії.

Виготовлення мазків і методи їх забарвлення

Бактеріоскопічне дослідження будь-якого клінічного матеріалу, де знаходяться

збудники інфекційних хвороб, є однією з найпоширеніших мікробіологічних ме-

тодик. У лабораторній практиці частіше проводять мікроскопію фіксованих за-

барвлених мазків і рідше нативних препаратів у вигляді стисненої чи висячої кра-

пель. Їх виготовляють на заздалегідь підготовленому і оснащеному робочому місці.

На столі повинні бути лише необхідні матеріали, інструменти і пристрої:

клінічний матеріал (кров, гній, слиз, харкотиння, сеча, випорожнення та ін.), куль-

тури мікроорганізмів у пробірках або чашках Петрі, бактеріологічні петлі, піпет-

ки, пінцети, штативи, предметні скельця, газовий пальник, ізотонічний розчин

хлориду натрію, розчини барвників, лотки з рейками для фарбування мазків, про-

мивалка з водою, фільтрувальний папір, банка з дезрозчином для знезараження

використаних препаратів і піпеток. Доцільно в лабораторії обладнати окремий

столик для забарвлення мазків.

Препарати-мазки виготовляють на предметних скельцях, товщина яких через

оптичні властивості конденсора Аббе не повинна перебільшувати 1-1,2 мм. Скельця

необхідно заздалегідь ретельно знежирити. Для цього протягом доби їх витриму-

ють у концентрованій сірчаній кислоті або кип’ятять у суміші 6 % розчину дво-

хромового калію і сірчаної кислоти, ретельно промивають проточною водою, пе-

реносять у банку з 96° спиртом, де вони зберігаються до використання. Можна

знежирені і витримані в спирті скельця витерти насухо лляною тканиною і зберігати

в герметично закритій скляній банці. Крапля води, нанесена на холодне знежире-

не скло, повинна рівномірно розтікатися, а не збиратись у дрібні крапельки.

Виготовлення препаратів-мазків із щільного (густого) клінічного матері-

алу або з культури на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце про-

водять через полум’я газового пальника і після охолодження кладуть на робоче

місце. Для виготовлення мазка матеріал чи культуру беруть бактеріологічною пет-

лею з платинового або хромонікелевого дроту довжиною 5-6 см. Петлю закріплю-

ють у петлетримачі. Кінець її згинають у вигляді замкнутого кільця розміром 1х1,5

чи 2х3 мм. Для деяких робіт потрібно мати цей інструмент у вигляді голки, коли

кінець не згинають у кільце, а залишають прямим (рис. 5).

Бактеріологічну петлю прожарюють у полум’ї, тримаючи її як олівець верти-

кально у правій руці. Два-три рази проводять через полум’я і нижню третину петле-

Частина І. Загальна мікробіологія

тримача. Не випускаючи петлі, лівою рукою

беруть пробірку з 0,9 % стерильним розчином

натрію хлориду, а 4-им і 5-им пальцями пра-

вої руки затискають ватно-марлеву пробку,

витягують її, і вінця пробірки проносять че-

рез полум’я пальника, тримають на віддалі 15-

20 см від полум’я, не випускаючи пробки.

Петлю вводять у пробірку і охолоджують її,

торкаючись стінки. Занурюючи петлю в ріди-

ну, набирають краплю фізрозчину. Виймають

петлю, проводять пробку і відкритий край

пробірки через полум’я, після чого її закрива-

ють і ставлять у штатив. На центр скельця бак-

теріологічною петлею наносять взяту краплю

ізотонічного розчину.

Петлю знову стерилізують, у ліву руку

беруть пробірку з досліджуваним матеріалом

чи культурою мікроорганізмів. Відкривають пробірку із дотриманням усіх правил,

охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість матеріалу чи культури.

Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив. Взятий матеріал

(або культуру) наносять на скло біля краплі фізрозчину і, поступово розтираючи

його та емульгуючи в краплі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи оваль-

ної форми діаметром 1-1,5 см. Після цього петлю прожарюють і ставлять у штатив.

Виготовлення мазків із рідкого клінічного матеріалу або з культури на

рідкому середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краплю досліджувано-

го матеріалу або культури з рідкого середовища із дотриманням правил стериль-

ності, як вище описано. Взятий матеріал наносять на предметне скельце і роблять

рівномірний тонкий мазок.

Якщо для забору матеріалу використовують стерильну пастерівську піпетку,

її також тримають у правій руці і проводять через полум’я перед внесенням у

пробірку. Тонкий кінчик піпетки після охолодження біля стінки пробірки занурю-

ють у рідкий досліджуваний матеріал чи бульйонну культуру, тримаючи верхній

кінець її відкритим. Після попадання в піпетку досліджуваного матеріалу чи куль-

тури верхній кінець її закривають вказівним пальцем, виймають з пробірки. Ос-

танню закривають і ставлять у штатив. На поверхню предметного скла з піпетки

випускають краплю матеріалу і опускають її в дезрозчин. Простерилізованою бак-

теріологічною петлею роблять мазок.

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. При готуванні мазків із ма-

теріалів, які погано розтираються (гній, харкотиння), використовують два пред-

метних скла. Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею

або пастерівською піпеткою наносять на середину знежиреного предметного скла

і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залиша-

лась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють дослі-

Рис. 5. Бактеріологічна петля (1);

бактеріологічна голка (2); шпатель

Дригальського (3).

12 3

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

джуваний матеріал і за вільні кінці розводять їх у сторони. Таким способом одер-

жують два однакових мазки (рис. 6).

Виготовлення мазків із крові. Скарифікатором роблять прокол пучки 4-го

пальця лівої руки. Після появи краплі крові до неї торкаються поверхнею біля

краю знежиреного стерильного предметного скла, яке швидко кладуть на стіл.

Краєм іншого трохи вужчого і шліфованого скла торкаються краплі і нахиливши

його під кутом 45° швидко і обережно проводять ним у напрямку до дальшого

краю. Внаслідок капілярності кров захоплюється краєм верхнього скла і під час

руху розмазується по нижньому склі (рис. 7). Правильно виготовлений препарат

виходить тонким, дещо просвічується та має жовтувате забарвлення.

Із крові виготовляють також препарат “товстої краплі”. На предметне скло

наносять роздільно 2-3 звичайні краплі крові, злегка змішують їх скляною палич-

кою, петлею або кутом іншого предметного скла так, щоб утворилась плоска кро-

в’яна пляма діаметром біля 1,5 см. Такі препарати виготовляють зокрема для діаг-

ностики малярії, поворотних тифів.

Мазки-відбитки роблять із органів трупів людей і тварин, харчових продуктів

щільної консистенції (сир, м’ясо, шинка, ковбаса, риба та ін.), а також з поверхні

молодих колоній грибів, актиноміцетів, рідше — бактерій. Розжареним у полум’ї

скальпелем припікають поверхню органа або харчового продукту. Потім стериль-

ними ножицями з цієї ділянки вирізають шматочок тканини. Поверхнею зрізу тор-

каються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи мазок-відбиток. Такі ж мазки-

відбитки можна виготовити з ділянки шкіри або слизової оболонки. Притискання

досліджуваного об’єкта до скла повинно бути строго вертикальним тривалістю

1-2 с. Мазки-відбитки з колоній роблять на покрівних скельцях.

Висушування і фіксування препаратів-мазків. Виготовлені мазки висушу-

ють при кімнатній температурі або в термостаті. Тонкі мазки швидко висихають

на повітрі, більш товсті можна висушувати над полум’ям газового пальника. Пред-

метне скло при цьому тримають за ребра 1-им і 2-им пальцями правої руки мазком

догори. Щоб не допустити денатурації білків бактерій і порушення їх внутріш-

ньої структури ступінь нагрівання контролюють середнім пальцем, який знахо-

диться під предметним склом.

Висушені препарати необхідно фіксувати до поверхні скла. Незафіксований ма-

зок є заразним, тому при роботі з ним треба бути дуже обережним, не торкатись до

нього руками. При фіксації одночасно відбувається прикріплення бактерій до скла

та їх знезараження. До того ж вбиті мікроорганізми значно краще забарвлюються.

Рис. 6. Виготовлення мазка з харкотиння. Рис. 7. Виготовлення мазка з крові.

Частина І. Загальна мікробіологія

У лабораторній практиці найпоширенішим методом фіксування мазків є флам-

бування – тобто фіксація в полум’ї газового пальника або спиртівки. При цьому

мазок тримають так само, як при висушуванні і тричі проводять його через полум’я.

Весь процес фіксації триває 5-6 с, а дія жару – 2 с. Більш тривале фіксування

жаром зменшує якість препарату, а недофіксований мазок при наступній обробці

змивається і таїть в собі небезпеку зараження.

При вивченні деяких структур мікробних клітин, а також мазків крові, від-

битків органів використовують такі фіксуючі рідини як етанол (протягом 10-15 хв),

метанол (5 хв), ацетон (5 хв), суміш Никифорова (10-15 хв), пари формаліну або

осмієвої кислоти (декілька секунд). При такому обережному фіксуванні значно

краще зберігаються і виявляються всі структури клітин і бактерій.

Забарвлення препаратів-мазків. Морфологію бактерій вивчають, як правило,

на зафіксованих і забарвлених препаратах. Незабарвлені мікроорганізми, за ви-

нятком грибів, погано видно у світловому мікроскопі через їх малу контрастність.

Для фарбування мазків у бактеріологічних лабораторіях широко вживають анілі-

нові барвники. Вони поділяються на кислі, нейтральні та основні. Останні добре

забарвлюють як ядерний апарат, так і цитоплазматичні структури. Позитивно заря-

джена фарбуюча частина їх молекули швидше і повніше вступає в сполуку з нега-

тивно зарядженою бактерійною клітиною. Кислі ж барвники фарбують мікробів

значно слабіше. Здатність та індивідуальна особливість бактерій фарбуватись тими

чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

У повсякденній лабораторній

практиці найчастіше вживають

такі барвники: червоні – фуксин

основний (діамантфуксин, соля-

нокислий розанілін або парароза-

нілін), фуксин кислий, нейтраль-

ний червоний, сафранін, конго

червоний; фіолетові – генціан-,

кристал- і метил-віолет; сині – ме-

тиленовий і толуїдиновий синій,

трипановий голубий; зелені – ма-

лахітовий, брильянтовий зелений;

жовто-коричневі – везувін, хризо-

їдин та ін.

Для забарвлення мазків необ-

хідно мати набір фарбуючих роз-

чинів у флаконах з піпетками і гу-

мовими балончиками. Їх зручно

розміщувати у дерев’яному шта-

тиві (колодці з гніздами). Змиван-

ня барвників і прополоскування

препаратів роблять за допомогою

спеціальних пристроїв (рис. 8).

Рис 8. Флакони для барвників і пристрій

для промивання забарвлених препаратів.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Запропоновані численні методи забарвлення бактерій. Вони поділяються на

прості й складні.

Прості способи забарвлення бактерій

Простий метод забарвлення дає можливість дослідити загальну морфологію

мікробів, їх розміри, форму, кількість, локалізацію, взаємне розташування клітин

тощо. Але за його допомогою неможливо вивчати внутрішню структуру бактерій

та їх різне відношення до декількох барвників.

Простим забарвленням називають таке, при якому застосовують лише один

барвник. Найчастіше використовують основний розведений фуксин Пфейфера і

лужну метиленову синьку Леффлера. Фуксином фарбують 1-2 хв, а синькою –

3-5 хв. Препарати, що містять, окрім бактерій, тканинні й клітинні елементи

макроорганізму, краще забарвлювати метиленовою синькою, яка фарбує фон пре-

парату порівняно слабко, а бактерії – значно інтенсивніше.

На зафіксований препарат наносять піпеткою таку кількість барвника, щоб

він покривав увесь мазок. Після фарбування препарат промивають водопровід-

ною водою і висушують на повітрі, або притискають фільтрувальним папером,

потім проводять над полум’ям, щоб випарувались залишки води. Якщо на препа-

раті залишиться вода, то, з’єднавшись з імерсійною олією, вона утворить емуль-

сію, яка заважатиме чіткому зображенню.

При висушуванні мазків за допомогою листків фільтрувального паперу по-

трібно кожного разу користуватися новими, оскільки при повторному вживанні

переносяться забарвлені бактерії з одного мазка на інший, що може призвести до

неправильних висновків.

Виготовлення барвників для простого забарвлення

1. Фуксин основний готують у вигляді концентрованого фенолового фуксину Циля.

Він дуже стійкий, може зберігатись протягом декількох місяців. У концентрованому виг-

ляді вживається лише для фарбуваня спор і кислотостійких бактерій. Для простого забар-

влення та за методом Грама його розводять дистильованою водою 1:10, отримуючи так

званий розведений, або водний фуксин Пфейфера. Цей розчин дуже нестійкий і його готу-

ють безпосередньо перед вживанням.

Феноловий фуксин Циля

Основний фуксин 1 г

Етанол 96° 10 мл

Фенол кристалічний 5 г

Гліцерин кілька крапель

Вода дистильована 100 мл

Спочатку фуксин з кристалами фенолу і гліцерином розтирають у ступці до одно-

рідної маси, потроху додаючи спирт, потім, весь час перемішуючи, доливають дистильо-

вану воду. Розчин витримують при кімнатній температурі протягом 48 год і фільтрують. З

нього потім виготовляють водний фуксин.

Частина І. Загальна мікробіологія

Фуксин Пфейфера

Фуксин Циля 1 мл

Вода дистильована 9 мл

2. Метиленова синька. Спочатку готують насичений спиртовий розчин метилено-

вої синьки, який дуже стійкий. При зберіганні його фарбуючі властивості, а також здатність

давати метахроматичне забарвлення нуклеїнових сполук (напр. волютинових зерен) знач-

но підвищується за рахунок утворення азурів.

Насичений спиртовий розчин метиленової синьки

Метиленової синьки 10 г

Етанол 96° 100 мл

Із даного розчину готують лужну метиленову синьку за Леффлером, яку дуже широ-

ко використовують для простого методу забарвлення.

Метиленова синька за Леффлером

Спиртовий розчин метиленової синьки 30 мл

Гідроксид натрію або калію 1 % 1 мл

Дистильована вода 100 мл

Водно-спиртовий розчин метиленової синьки

Спиртовий розчин метиленової синьки 10 мл

Дистильована вода 100 мл

Лужна метиленова синька за Леффлером, як і її водно-спиртовий розчин, можуть

давати забарвлення різної інтенсивності у різних видів бактерій.

До простих методів забарвлення можна віднести і негативний спосіб Буррі. При ньому

за рахунок туші створюють темний фон, а бактерії залишаються незабарвленими. Для ста-

більних і чітких результатів необхідно дуже ретельно підготувати суспензію туші. Виби-

рають найкращі сорти рідкої китайської туші й розводять її дистильованою водою 1:10.

Можна натерти сухої китайської туші й довести її до такої ж густоти. Суспензію туші

довго центрифугують при 3 тис. об/хв. Верхній шар відсмоктують піпеткою і в надавленій

краплі під імерсійним об’єктивом перевіряють її на відсутність грубих частинок. Якщо

суспензія хороша, її натягують у тонкі капіляри по 0,1-0,2 мл, запаюють і стерилізують в

автоклаві.

При дослідженні краплю туші з капіляра випускають на предметне скло, добавляють

крапельку матеріалу (рідину з сифілітичної виразки, культуру капсульних бактерій, леп-

тоспір та ін.) і ретельно перемішують петлею. Шліфованим предметним склом зі зрізани-

ми кутами готують тонкий препарат так само, як мазок крові, висушують, не фіксують.

При мікроскопії тіла бактерій, спірохет, лептоспір виглядають білими, чітко окресленими

на темному димчасто-сірому фоні. Замість туші можна використати 2-10 % розчини опа-

лового синього, конго червоного, нігрозину, коларголу та ін. В такому разі фон буде мати

інший колір.

Необхідно враховувати, що мікроорганізми в таких препаратах не вбиті і можуть

стати джерелом зараження, як і в мазках, обережно фіксованих у полум’ї пальника.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

При вивченні забарвлених препаратів царства прокаріот виділяють чотири

основні форми бактерій:

1) кулясті (сферичні), або кокоподібні; 2) паличкоподібні (циліндричні); 3) спі-

ралеподібні (звивисті); 4) ниткоподібні (трихобактерії).

Кокоподібні бактерії (від гр. kokos – зерно, кісточка) мають правильну куляс-

ту форму діаметром 1,0-1,5 мкм. Деякі з них набувають бобоподібної, ланцетопо-

дібної та еліпсоподібної форми (рис. 9). За способом ділення та взаємного розта-

шування в мазках всі коки поділяють на такі групи:

1.Мікрококи (від лат. мikros – малий). Вони діляться в одній площині, розташо-

вуються поодинці й хаотично; серед них хвороботворних видів для людини немає.

2. Диплококи (від лат.diplos – подвійний). Ділення їх проходить в одній пло-

щині з утворенням подвійних парних клітин, які мають форму квасолі (Neisseria

meningitidis), або вістря ланцета (Streptococcus pneumoniae).

3. Стрептококи (від гр. streptos – ланцюг, намисто). Після поділу в одній

площині мікроби не розходяться, а формують різної довжини ланцюжки, щонагаду-

ють намисто. Частина з них є сапрофітами, представниками нормальної мікро-

флори людини (напр., ротові стрептококи). Інші види (Streptococcus pyogenes) ви-

кликають такі тяжкі захворювання як сепсис, остеомієліт, скарлатину, бешиху,

ревматизм.

4. Стафілококи (від лат. staphyle –

гроно). Вони діляться в декількох пло-

щинах, а утворені клітини розташову-

ються у вигляді скупчень, що нагадують

виноградні грона. Стафілококи спричи-

няють більше 100 різноманітних захво-

рювань у людей і тварин, а один із типо-

вих видів Staphylococcus aureus є найча-

стішим збудником багатьох гнійно-сеп-

тичних процесів.

5. Тетракоки (від лат. tetra – чотири).

Після поділу у двох взаємно перпендику-

лярних площинах клітини не розходять-

ся, а розташовуються тетрадами. Вони, як

правило, непатогенні для людини.

6. Сарцини (від лат. sarcio – зв’я-

зую)– коки, які діляться в трьох взаємно

перпендикулярних площинах і після поді-

лу не розходяться, а розташовуються у

вигляді паків з 8, 16, 32, 64 клітин. Серед

них є умовно-патогенні представники.

Паличкоподібні бактерії не менш

різноманітні за своєю формою і розта-

шуванням у мазках. Середні розміри їх

Рис. 9. Основні форми бактерій:

1-6 – сферичної форми: 1 – стафілококи;

2-3 – диплококи; 4 – стрептококи; 5 – тетра-

коки; 6 – сарцини; 7-9 – паличкоподібні;

10-12 – спіралеподібні форми; 10 – вібріони;

11 – спірили; 12 – спірохети.

Частина І. Загальна мікробіологія

1,0-10 мкм завдовжки і 0,5-2,0 мкм завширшки (рис. 9). Вони поділяються на бак-

терії, бацили і клостридії. Власне бактерії (від гр. bacteria – паличка) – мікроорга-

нізми, що не утворюють спор. Бацили (від лат. bacillus – паличка) мають спори,

які не перебільшують діаметр мікробної клітини. Клостридії (від лат. clostridium –

веретеноподібний) утворюють спори, що перебільшують поперечний розмір кліти-

ни і дещо деформують її.

Форма паличкоподібних бактерій може бути овальна, циліндрична, еліпсо-

подібна, веретеноподібна, у вигляді барабанної палички, тенісної ракетки. Їх кінці

бувають заокруглені, загострені, булавоподібні, рівні, нібито обрублені тощо. Па-

личкоподібні бактерії розмножуються шляхом поперечного поділу.

За аналогією з коками, залежно від взаємного розташування в мазках, палич-

коподібні мікроорганізми поділяють на такі групи:

1. Монобактерії при поділі розташовуються поодинці (Escherichia coli,

Salmonella typhi).

2. Монобацили також розташовані поодиноко, але мають спори (Bacillus

subtilis, Clostridium tetani).

3. Диплобактерії розташовуються в мазках парно (Klebsiеlla pneumoniae).

4. Диплобацили – парне розташування спорових мікроорганізмів.

5. Стрептобактерії – безспорові палички, які розташовані у вигляді лан-

цюжків (Haemophilus ducrey).

6. Стрептобацили – спорові мікроби, що розташовуються ланцюгом (Bacillus

anthracis).

Спіралеподібні (звивисті) бактерії (рис. 9) за кількістю і характером за-

витків, а також за діаметром клітини поділяють на три групи:

1. Вібріони (від гр. vibrio – звиваюсь) мають одну характерну зігнутість, яка

не перебільшує чверті витка спіралі, але може мати і форму прямої палички. При-

кладом хвороботворного виду є Vibrio cholerae.

2. Спірили (від гр. speira – завиток, спіраль) – товсті звивисті мікроорганіз-

ми, які мають малу кількість завитків (2-3), що надає їм форму штопора. Патоген-

на для людини Spirillum minor викликає содоку (хворобу укусу щурів). До цієї

групи мікробів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спри-

чиняти у людини захворювання шлунково-кишкового тракту, сечостатевих органів.

3. Спірoхети (від гр. speira – завиток, haite – волосся) – тонкі штопороподібні

бактерії, які мають велику кількість завитків. Серед них є хвороботворні види

(Treponema pallidum – викликає сифіліс, Borrelia recurrentis – поворотний тиф,

Leptospira interrogans – лептоспіроз).

Ниткоподібні бактерії належать до вільноіснуючих сапрофітних мікроор-

ганізмів (напр. залізо- і сіркобактерії). Для людини вони не патогенні і в медичній

мікробіології не вивчаються.

Окрім того, останнім часом виявлені мікроби, які мають трикутну, квадрат-

ну, зіркоподібну і тарілкоподібну форми. Вони беруть участь у процесах біодегра-

дації різноманітних природних сполук.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Особливості морфології інших груп мікроорганізмів

Спірохети. Особлива група грамнегативних звивистих бактерій, що мають

вигляд довгих тонких, спірально закручених ниток, дістала загальну назву спіро-

хет. Довжина їх коливається в межах 7-50, товщина – 0,3-0,5 мкм. Вони належать

до порядку Spirochaetales, до складу якого входять три патогенних для людини

роди: Treponema, Borrelia, Leptospira. Між собою вони відрізняють рядом ознак.

Центральною структурою спірохет є цитоплазматичний циліндр, що має по-

стійну спіралеподібну форму. Зовні він покритий цитоплазматичною мембраною

і клітинною стінкою. Органом руху спірохет є периплазматичний джгутик (джгу-

тики), розташований між циліндром і цитоплазматичною мембраною. Спірохети

мають різні типи рухів: згинальний, поступальний, обертальний, маятникопо-

дібний.

Число і форма дрібних завитків характерні для кожного виду спірохет. Вони

формують завитки першого порядку. У трепонем є 8-14 таких завитків, однакових

за формою та величиною. Лептоспіри мають 12-18 дуже дрібних первинних за-

витків. На їх кінцях є вторинні завитки, які надають їм S- або С- подібної форми і

роблять їх схожими на гачок (рис. 10).

Патогенними представниками для людини є Treponema pallidum, яка викли-

кає сифіліс, Borrelia recurrentis – збудник епідемічного поворотного тифу, Leptospira

interrogans, що спричиняє лептоспіроз.

Методи виявлення спірохет у досліджуваному матеріалі можуть бути різни-

ми. При діагностиці сифілісу, бореліозу і лептоспірозу найчастіше використову-

ють метод темного поля. На тонких предметних скельцях (1,0-1,2 мм) виготовля-

ють з матеріалу надавлену краплю і вміщують на предметний столик. При дослі-

дженні використовують темнопольний конденсор. Дуже важливо при цьому

досягти точної центровки всіх оптичних систем мікроскопа і встановити освіт-

лення за методом Келлера. На верхню лінзу конденсора необхідно нанести крап-

лю кедрового масла, уникаючи бульбашок повітря. Значно рідше використовують

метод забарвлення за Романовським-Гімзою. При

цьому трепонеми фарбуються в рожевий колір, бо-

релії – в синьо-фіолетовий, лептоспіри – в блідо-ро-

жевий. При серебрінні мазків за методом Морозова

спірохети при мікроскопії мають коричнево-чорний

колір на жовтому фоні.

Актиноміцети. Це одноклітинні грампози-

тивні, прямі або трохи зігнуті, паличкоподібні бак-

терії, які раніше вважали грибами через здатність

клітин галузитись. Вони часто утворюють нитко-

подібні форми довжиною 10-50 мкм. Характерною

особливістю актиноміцетів є здатність утворювати

добре виражений міцелій. У одних видів він довгий

і рідко розгалужується, у інщих – короткий і з вітви-

Рис. 10. Патогенні спірохети:

1 – трепонеми; 2 – борелії;

3 – лептоспіри.

Частина І. Загальна мікробіологія

стістю і брунькуванням. Паличкоподібні форми схожі за будовою до звичайних

бактеріальних клітин, можуть мати цитоплазматичні влкючення. Актиноміцети

належать до родин Actinomycetacae, Nocardiaceae і Streptomycetaceae, які охоплю-

ють понад 400 видів. Переважна їх більщість є сапрофітами. Вони вільно живуть

у грунті, забезпечуючи його родючість і свєрідний запах. Часто зустрічають у воді,

повітрі інших об’єктах зовнішнього середовища. Багато з них є продуцентами

антибіотиків (тетрациклін, стрептоміцин та ін.).

До патогенних представників відносяться Actinomyces israeliі, A.bovis,

A.naeslundii, які викликають у людей актиномікоз, а також Nocardia asteroides, що

спричиняє нокардіоз. Окремі представники роду Streptomyces можуть викликати

у людини міцетому ступні.

Морфологічне дослідження актиноміцетів можливе як у нативних (нефарбо-

ваних) препаратах, так і в мазках, забарвлених за Грамом. У першому випадку

гній чи виділення з нориць обробляють 15% розчином КОН, потім відбирають

окремі шматочки (пісчинки розміром із макові зерна), кладуть їх між двома пред-

метними скельцями й обережно роздавлюють. Отримують два препарати-мазки,

які краще мікроскопувати за допомогою фазово-контрасного чи аноптрального-

мікроскопа. При цьому актиноміцети розташовуються у вигляді друз (своєрідних

скупчень переплетених гіф, які радіально розходяться як промені сонця). Забарв-

ленні мазки мікроскопують як звичайно.

Патогенні гриби. Гриби являють собою особливу групу одноклітинних і

богатоклітинних еукаріотів (понад 100 тис. видів), які широко розповсюдженні в

природі. Біля 400 видів є хвороботворними і спричиняють у людини грибкові хво-

роби (мікози).

Клітини більшості грибів маютиь щільну оболонку, до внутрішнього шару

якої прилягає цитоплазматична мембрана. В цитоплазмі міститься одне або декілька

ядер, вакуолі, мітохондрії, мікросоми, лізосоми, рибосоми, комплекс Гольджі, різно-

манітні влючення. Молоді клітини мають яйцеподібну форму, зрілі стають цилін-

дричними а старі – булаво-, грушо- та веретеноподібними. Основу тіла гриба ста-

новлять особливі трубчасті нитки – гіфи, сукупність яких називають міцелієм. У

гіфів нижчих грибів починають появлятись перегородки, які є характерною озна-

кою у вищих грибів. Кінцеві розгалуження міцелію мають своєрідну форму, за

якою можна диференціювати окре-

мі види. Це органи плодоносіння

грибів, які мають ендо- або екзос-

пори. Прикладом утворення ендос-

пор може бути мукорова пліснява

Mucor mucedo, яка має несептова-

ний міцелій, одноклітинний плодо-

носящий гіф спорангієносець, на

кінці якого знаходисться круглий

спорангій, наповнений ендоспора-

ми (рис. 11, 3). Ектоспори можна

Рис. 11. Нитчасті гриби:

1 – Penicillium; 2 – Acnergillus; 3 – Mucor.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

спостерігати у лійкової плісняви Aspergillus niger, від плодоносящого гіфа якого –

конідієносця – немов би відшнуровуються спори (конідії), що розташовуються

радіально і нагадують струмені води, які розбризкуються із садової лійки (рис.11,2).

У китиценосного гриба Penicillium glaucum міцелій і конідієносець багатоклітин-

ний, плодоносне тіло нагадує пензлик (рис. 11, 1).

Гіфи міцелію дерматофітів можуть нагадувати роги оленів, канделябри, була-

ву, гребінь півня тощо. Будова органів плодоносіння, характер плодових тіл, їх фор-

ма, велечина й морфологічні особливості покладені в основу класифікації грибів.

Виділяють нижчі та вищі гриби. До нижчих належать хітридіоміцети, оомі-

цети, зигоміцети; до вищих – аскоміцети, базидіоміцети та дейтероміцети. Нижчі

гриби, як правило, непатогенні для людини. Однак окремі види мукорової, аспер-

гілової та пеніцилової плісняви можуть уражати шкіру, очі, слухові проходи, ле-

гені, шлунково-кишковий тракт.

Велике значення в медичній практиці мають гриби роду Candida. вони часто

є представниками нормальної мікрофлори людини. Але при нераціональному засто-

суванні антибіотиків, імунодефіцитах та авітамінозах здатні викликати серйозні

захворювання – кандидомікози. Ще більшого значення в грибковій патології лю-

дини набула група недосконалих грибів-дейтероміцетів. Вони можуть викликати

епідермофітію, мікроспорію, трихофітію, фавус та ін.

Однак гриби мають і велике корисне значення. Їх використовують у харчовій,

парфюмерній, хімічній промисловості. Із окремих видів таких родів як Penicillium

і Cephalosporium виготовляють антибіотики (пеніциліни, цефалоспорини).

Мікроскопічне дослідження грибів проводять як у нативному (незабарвле-

ному) стані, так і за допомогою різних методів фарбування. Частинку подрібнено-

го досліджуваного матеріалу наносять на предметне скло, добавляють одну краплю

30 % розчину КОН, злегка підігрівають над полум’ям пальника до появи білого

обідка по периферії краплі. Після цього препарат накривають покрівним скель-

цем і мікроскопують за допомогою сухих об’єктивів при опущеному конденсорі і

звуженій діафрагмі. Ще краще досліджувати нативні препарати під фазово-кон-

трастним або аноптральним мікроскопом.

При дослідженні грибів у забарвленому стані після дії розчину лугу мазок

промивають водою, висушують, фіксують і забарвлюють метиленовим синім або

фуксином.

Рикетсії. До групи рикетсій належать унікальні мікроорганізми, в яких по-

єднані морфологічні властивості бактерій і біологічні властивості вірусів. З пер-

шими їх єднає типова будова клітин, а з вірусами – облігатний внутрішньоклітин-

ний паразитизм.

Рикетсії мають типову для грамнегативних бактерій клітинну стінку, цито-

плазматичну мембрану, ядерний апарат, не обмежений від цитоплазми будь-якою

оболонкою. Вони не утворюють спор і капсул. За Здродовським розрізняють 4

морфологічних типи рикетсій (рис. 12):

1 – дрібні овоїдні кокоподібні клітини розміром біля 0,5 мкм, часто утворю-

ють диплоформи у вигляді гантель;

Частина І. Загальна мікробіологія

2 – паличкоподібні двозернисті форми

(1-1,5 мкм), у яких зерна розташовані на полюсах

і з’єднані слабо забарвленою цитоплазмою;

3 – бацилярні видовжені або зігнуті двозер-

нисті форми (3-4 мкм), інколи мають по 4 зерна,

також розташованих на полюсах клітини;

3 – ниткоподібні багатозернисті клітини (20-

40 мкм), у яких може бути багато зерен.

Відповідно до класифікації Бергі всі рикетсії

об’єднані в порядок Rickettsiales. Більшість із них

непатогенні для людини. Вони паразитують в орга-

нізмі членистоногих. Хвороботворні представни-

ки входять до трьох родів: Rickettsia, Rochalima,

Coxiella. Окремі види з них можуть викликати у

людини такі рикетсіози як висипний тиф, марсельська лихоманка, лихоманка Цуцу-

гамуші, Ку-гарячка та ін. Збудниками цих захворювань відповідно є Rickettsia

prowazekii, R. typhi, R. tsutsugamushi, Coxiella burnetii. Велику роль у передачі та

розповсюдженні рикетсіозів відіграють різні кровососні комахи (воші, блохи, кліщі).

Морфологію рикетсій вивчають під світловим мікроскопом у препаратах за-

барвлених за Романовським-Гімзою, де вони набувають рожево-червоного кольо-

ру. Дуже зручний і простий спосіб їх забарвлення за Здродовським: тонкий зафік-

сований мазок фарбують розведеним карболовим фуксином (10-15 крапель на 10

мл дистильованої води) протягом 5 хв, потім злегка знебарвлюють препарат 0,01%

соляною кислотою і додатково 30 сек фарбують метиленовим синім. Рикетсії ста-

ють рубіново-червоними, цитоплазма клітин макроорганізму голубою, а ядра –

синіми.

Хламідії. До патогенних бактерій роду Chlamidia віднесені грамнегативні

нерухомі мікроорганізми, що не утворюють спор і капсул. Вони є облігатними

внутрішньоклітинними паразитами, не ростуть на штучних середовищах. Протя-

гом свого життєвого циклу хламідії проходять три стадії:

1) дрібні елементарні тільця розміром 0,2-0,5 мкм, які мають компактний

нуклеоїд і тришарову ригідну оболонку;

2) крупні ретикулярні тільця (0,8-1,5 мкм) сферичної форми з фібрилярним

нуклеоїдом і тонкою клітинною стінкою;

3) проміжні тільця, що являють собою перехідні морфологічні форми між

елементарними і ретикулярними тільцями.

Елементарні тільця є інфекційною, а ретикулярні – вегетативною формою

цих бактерій.

Окремі види хламідій (Chlamidia trachomatis, C. psittaci) викликають у людини

трахому, орнітоз, паховий лімфогрануломатоз, уретрити, кон’юнктивіти, поліарт-

рити, менінгоенцефаліти та інші захворювання.

Для мікроскопічного дослідження хламідій в інфікованих клітинах і тканинах

організму виготовлені мазки забарвлюють за методом Романовського-Гімзи. Тільця

Рис. 12. Основні форми

рикетсій: 1 – кокоподібні;

2 – паличкоподібні;

3 – бацилярні; 4 – ниткоподібні.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

хламідій фарбуються в голубий або фіолетовий колір. Їх можна виявити і в натив-

них препаратах (надавлена крапля) за допомогою фазово-контрастної мікроскопії.

Мікоплазми. Патогенні мікоплазми представляють собою групу унікальних

дрібних поліморфних мікроорганізмів, які не мають ригідної клітинної стінки.

Вони виглядають як сферичні або овоїдні тільця діаметром 0,1-0,2 мкм, або як

кулясті форми розміром до 1,5 мкм. Рідше зустічаються нитковидні клітини дов-

жиною до 100-150 мкм, які здатні галузитись.

Клітини мікоплазм не мають типової для бактерій оболонки. Вони оточені

лише тришаровою цитоплазматичною мембраною. У деяких із них зовнішній шар

мембрани значно товстіший і нагадує капсулу. У цитоплазмі містяться нуклеоїд,

рибосоми, кільцеподібні мембрани, які зв’язані з ядерним апаратом. Спор і джгу-

тиків не утворюють, грамнегативні.

Мікоплазми часто знаходяться в грунті, стічних водах, паразитують в організмі

багатьох видів тварин. У людини вони спричинюють пневмонії, бронхіоліти, ангі-

ни, уретрити, простатити, артрити, ендокардити тощо. Найчастіше захворювання

викликають Micoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.

Морфологію мікоплазм досліджують у живому стані в препаратах надавле-

ної краплі під фазово-контрастним мікроскопом або за допомогою електронної

мікроскопії ультратонких зрізів їх клітин. При вивченні мікоплазм у забарвлених

мазках краще користуватись методом Романовського-Гімзи.

Патогенні найпростіші. Протисти, або найпростіші, – це високоорганізовані

одноклітинні еукаріотичні організми тваринного походження. Вони належать до

типу Protozoa і, відповідно, класів саркодових, джгутикових, споровиків та інфузорій.

Будова їх складніша за бактерійну клітину. Їх розміри коливаються від 2 до

150 мкм. Вони мають чітко уособлене ядро або декілька ядер з типовою двокон-

турною оболонкою (каріолемою), пронизаною порами. В цитоплазмі багатьох

найпростіших розрізняють дві частини – більш щільну гомогенну ектоплазму і

більш рідку внутрішню ендоплазму. Досить часто самий поверхневий шар екто-

плазми становиться ще більш ущільненим і утворює периферійну плівку, або пе-

лікулу, яка являє собою особливий вид міцної еластичної мембрани, що надає

клітині постійної форми і виконує захисну функцію. Окрім того у деяких видів є

парні фібрили і мінеральний скелет.

Цитоплазма найпростіших містить велику кількість життєво важливих струк-

тур: ендоплазматичний ретикулюм, мітохондрії, пластинчастий комплекс (аппа-

рат Гольджі), лізосоми, рибосоми, різноманітні вакуолі.

Багато видів найпростіших здатні активно рухатись. У одних форм рух здійс-

нюється за рахунок псевдоподій (амеби), у інших за допомогою джгутиків або війок.

Найпростіші мають складні цикли розвитку. Вони здатні розмножуватись про-

стим (безстатевим) і множинним поділом або іх поєднанням (плазмодії малярії).

При несприятливих умовах деякі види (амеби, лямблії, балантидії) переста-

ють живитися, втрачають органелли, покриваються товстою оболонкою і пере-

творюються в цисти, що є своєрідною захисною реакцією. Саме цисти відіграють

велику роль у розповсюдженні протозойних захворювань.

Частина І. Загальна мікробіологія

Найпростіші широко розповсюдженні в природі. Більшість з них не патогенні

для людини. Однак деякі представники мають високі інфекційні властивості і

можуть викликати амебіаз, трипаносомоз, лейшманіоз, урогенітальний та кишко-

вий трихомоноз, малярію, балантідіаз. Всі ці захворювання характеризуються три-

валим і важким перебігом, ураженням числених органів і систем.

Мікроскопічне дослідження найпростіших направлене на виявлення їх у на-

тивних і забарвлених препаратах-мазках. Найчастіше для фарбування останніх

використовують методи Романовського – Гімзи, Лейшмана, Гейденгайна. В крові

паразитів виявляють шляхом виготовлення й забарвлення товстої краплі і тонких

мазків (плазмодії малярії, трипаносоми, рідше – лейшманії). У фекаліях, дуоде-

нальному вмісті, мазках із статевих органів виявляють амеби, балантидії, лямблії,

трихомонади. Детальніше методи виявлення найпростіших та лабораторна діаг-

ностика протозойних захворювань викладені у 18 розділі.

Складні методи забарвлення бактерій

Складні (диференціюючі) методи забарвлення базуються на фізико-хімічних

особливостях будови мікробних клітин. Суть їх полягає у фарбуванні мазка двома

барвниками, один з яких є основним, другий – доповнюючим (контрастним). Після

дії першого барвника мазок знебарвлюють кислотою, лугом, спиртом або ацето-

ном. Деякі мікроорганізми легко, інші важко знебарвлюються. Одні з них є кислото-

і спиртостійкими, другі тільки кислотостійкими. Спори бактерій дуже важко підда-

ються дії знебарвлюючих речовин, вони водночас є і фарбостійкими об’єктами.

Складні методи забарвлення вживають для детального вивчення структури

бактерійних клітин, а також для характеристики і диференціації одних мікроор-

ганізмів від інших. Отже, вони мають важливе діагностичне значення. У лабора-

торній практиці найчастіше використовують складні методи Грама, Ціля-Нільсе-

на, Нейссера, Буррі-Гінса та ін.

Забарвлення за Грамом

Цей метод розробив Кристіан Грам у 1884 р. Серед складних методів фарбу-

вання він є найбільш універсальним. Він має важливе диференціально-діагнос-

тичне значення, оскільки допомагає визначати таксономічне положення тих чи

інших бактерій.

Особливості забарвлення за методом Грама дозволяють поділити всі мікро-

організми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапля-

ються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризують як грамваріабельні.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних мікробів здатні

утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бак-

терій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнега-

тивних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлю-

ються фуксином у червоний колір.

До грампозитивних відносяться стафілококи, стрептококи, бацили, клостридії,

дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативними є нейсерії (менінго- і го-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

нококи), кишкові палички, сальмонели, шигели, рикетсії, всі звивисті бактерії

(вібріони, спірили, спірохети, лептоспіри).

Механізм забарвлення за Грамом досить складний і ще остаточно не вивче-

ний. Грампозитивні бактерії мають товсту клітинну стінку, яка складається з 5-6

шарів пептидоглікану (муреїну) та полімерів тейхоєвих кислот. Ці структури лег-

ко сприймають і міцно утримують фарбуючий комплекс генціанвіолет + йод і при

дії спирту протягом 30-60 с не знебарвлюються. Грамнегативні бактерії мають

значно тоншу оболонку, що складається з 1-2 шарів петидоглікану, не містить тей-

хоєвих кислот, а, отже, не втримують комплекс основного барвника при знебарв-

ленні спиртом. При додатковій обробці мазка фуксином Пфейфера вони фарбу-

ються в червоний колір. Саме в цьому полягає основний механізм забарвлення за

методом Грама. Окрім того, різне забарвлення мікроорганізмів пов’язане з більш

високою концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнату магнію в клітинах

грампозитивних бактерій, більш кислим значенням рH і різним співвідношенням

РНК:ДНК у цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1).

Виготовлення реактивів для забарвлення за Грамом. Найчастіше в лабораторії

готують такі барвники: 1) феноловий генціанвіолет, 2) розчин Люголя, 3) фуксин Пфейфе-

ра, 4) етанол 96°.

1. Феноловий генціанвіолет

Генціан фіолетовий 1 г

Фенол кристалічний 2 г

Етанол 96° 10 мл

Вода дистильована 100 мл

Феноловий генціанвіолет готують так само, як і феноловий фуксин Циля. Генціан

фіолетовий можна замінити кристалвіолетом, або водним розчином метилвіолету, який є

досить стійким. Його готують за таким прописом:

метиловий фіолетовий 0,2 г

вода дистильована 100 мл

2. Розчин Люголя

Йодид калію 2 г

Йод кристалічний 1 г

Вода дистильована 300 мл

Спочатку йодид калію розчиняють у невеликій кількості води, потім всипають крис-

талічний йод, після розчинення якого добавляють дистильовану воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера готують із концентрованого фенолового розчину цього барв-

ника, розводячи його в 10 разів дистильованою водою. Необхідно використовувати лише

свіжовиготовлений барвник.

Техніка забарвлення. Найбільш поширений, так званий стандартний спосіб

забарвлення за Грамом, проходить у декілька етапів:

1. На фіксований жаром мазок кладуть трохи коротшу і вужчу від предметно-

го скла смужку фільтрувального паперу. Зверху на неї наносять достатню кількість

Частина І. Загальна мікробіологія

розчину генціанвіолету (основний барвник) на 1-2 хв, зливають його і знімають

папірець.

2. Після прополоскування мазка водою наносять розчин Люголя на 1-2 хв (до

сильного потемніння препарату).

3. Зливають розчин Люголя і, не промиваючи мазок, знебарвлюють його 96°

етанолом протягом 30-60 с (до відходження сіро-фіолетових струмочків фарби).

4. Препарат ретельно промивають водою і додатково забарвлюють фуксином

Пфейфера (доповнюючий контрастний барвник) протягом 2 хв.

5. Мазок промивають водою, висушують, наносять краплю кедрової олії,

мікроскопують з імерсійним об’єктивом.

Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні грампозитивні мікро-

організми фарбуються в темно-фіолетовий колір, грамнегативні бактерії, ткани-

ни, клітини органів – у рожевий (див. вкл., рис. 1).

Запропоновано ряд модифікацій цього методу, з яких найпоширенішим є ва-

ріант Синьова. Він полягає в тому, що замість розчину генціанвіолету (метилвіо-

лету, кристалвіолету) використовують смужки фільтрувального паперу заздалегідь

просочені одним із вказаних барвників і висушені. При забарвленні за Синьовим

на мазок наносять декілька крапель води, опускають і притискають пінцетом до

скла просочену фарбою смужку паперу. Через 2 хв її знімають. Наступні етапи

забарвлення такі самі, як і при стандартному методі Грама. Модифікація Синьова

особливо зручна для використання на практичних заняттях та в похідних лабора-

торіях. Вона дає значну економію барвника.

Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збуд-

ники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високо-

молекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони важко фарбуються зви-

чайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим фено-

ловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються

розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії

при такій обробці легко віддають барвник. У зв’язку з цим при додатковому забарв-

ленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків

фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.

Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в

1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:

1. На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку

фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі

підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із

фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають

папірець, промивають водою.

2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи

жовтуватого відтінку (10-30 с) і декілька разів промивають водою.

3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промива-

ють водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі

бактерії виглядають рубіново-червоними (див. вкл., рис. 2).

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують

метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розве-

деним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують

метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприйма-

ють забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-

Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля,

висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у

герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дис-

тильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до

появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним мето-

дом Циля-Нільсена.

Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним із основних і найпоширені-

ших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фар-

буються різні структурні елементи паразитів крові – малярійних плазмодіїв, три-

паносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм,

спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового си-

нього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосе-

редньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою

нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барв-

ника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і вису-

шують на повітрі. Приготований розчин наносять на мазок, а ще краще предметне

скельце з мазком опускають у склянку з барвником. Забарвлення триває від 30 хв

до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник

зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикаль-

ному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних об’єктивів.

Будучи в розчині синьо-фіолетовим, поліхромний барвник Романовського-

Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин, тіла бактерій, їх капсули,

слиз – у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлю-

ються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна – у вишнево-черво-

ний; цитоплазма має рожевий колір.

Забарвлення окремих структур мікробної клітини

З науковими й діагностичними цілями в бактеріологічних лабораторіях дос-

ліджують не тільки форму, розміри, загальні тинкторіальні властивості мікроор-

ганізмів, а й окремі елементи важливих структур: нуклеоїд, цитоплазму, включен-

ня, клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану, капсулу, спори, джгутики тощо.

Нуклеоїд. У прокаріотів ще немає морфологічно оформленого ядра, а є лише

його попередник – нуклеоїд. Він представлений однією або кількома хромосома-

ми, що складаються з ДНК і вільно розташовані в цитоплазмі, не відмежовані від

Частина І. Загальна мікробіологія

неї будь-якою мембраною. Морфологічно дослідити цю структуру під світловим

мікроскопом дуже важко.

Розроблені спеціальні мікрохімічні реакції на виявлення ДНК. Однією з них

є реакція Фельгена. Після легкого гідролізу мазка розчином соляної кислоти при

підігріванні від дезоксірибофосфату відщеплюються пурини й піримідини, які

переходять в альдегіди. Останні реагують з безбарвною фуксинсірчистою кисло-

тою реактиву Шиффа, при цьому нуклеоїд забарвлюється в червоно-фіолетовий,

а цитоплазма в світло-рожевий колір.

Ядерну субстанцію можна виявити за методом Пікарського. Фіксований ме-

тиловим спиртом або сумішшю Никифорова мазок обробляють 1 % розчином со-

ляної кислоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його

забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильованою водою, ви-

сушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбуються в темно-червоний, а ци-

топлазма клітин – у рожевий колір.

Ще краще можна виявити нуклеоїд і дослідити його структуру за допомогою

електронної мікроскопії ультратонких зрізів бактерійних клітин.

Цитоплазма та її включення. Цитоплазма бактерій – складна колоїдна сис-

тема. У молодих клітин вона гомогенна, у старих набуває зернистої або волокни-

стої структури. При забарвленні аніліновими барвниками цитоплазма фарбується

рівномірно й монотонно.

У процесі життєдіяльності бактерій у цитоплазмі з’являються метахроматичні

(волютинові) зерна, краплини нейтральних ліпідів, воску, сірки, гранульози, гліко-

ген, пігмент та ін. Вони є для клітини запасним джерелом енергії.

У лабораторній практиці найбільше значення має виявлення волютинових

зерен. Волютиновими їх назвали тому, що вперше ці включення відкриті у Spirillum

volutans. Їх ще називають метахроматичними, оскільки вони дають явище мета-

хромазії – здатність забарвлюватись у тон, що відрізняється від основного кольо-

ру поліхромного барвника. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім зерна

набувають пурпурово-синього кольору через надзвичайно сильну спорідненість

їх з азурами, які завжди присутні в метиленовому синьому барвнику. Поява пур-

пурового відтінку і обумовлена здатністю давати метахромазію. Ці включення

називають також зернами Бабеша-Ернста за іменами авторів, які вперше описали

їх. Розташовуються вони переважно на полюсах бактерій, рідше – по всій дов-

жині клітини. Волютинові зерна є характерною диференціальною ознакою для

збудника дифтерії – Corynebacterium diphtheriaе.

Для виявлення цих включень використовують методи Леффлера, Нейссера,

П’ю, Мейера, Раскіної та ін.

Метод Леффлера. Фіксований мазок забарвлюють лужним спиртово-вод-

ним розчином метиленового синього протягом 4-5 хв, висушують і мікроскопу-

ють. При цьому волютинові зерна забарвлюютьcя в темно-синій, а цитоплазма – в

блідо-голубий колір (див. вкл., рис. 3).

Метод Нейссера належить до складних методів забарвлення. Він проводиться

за таким алгоритмом:

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

1. На фіксований препарат наносять оцтово-кислу синьку Нейссера і фарбу-

ють протягом 1 хв, зливають барвник і промивають водою.

2. Діють на мазок розчином Люголя протягом 20-30 с.

3. Не промиваючи препарат водою, наносять розчин везувіну (або хризоїди-

ну) і забарвлюють протягом 1-3 хв.

4. Забарвлений мазок промивають водою, висушують і досліджують під

мікроскопом.

Мікроскопічна картина: цитоплазма бактерійних клітин фарбується в світлий

жовто-коричневий відтінок, метахроматичні зерна – в темно-синій, майже чорний

колір (див. вкл., рис. 4).

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером

Метиленовий синій 0,1 г

Етанол 96° 2 мл

Льодяна оцтова кислота 5 мл

Дистильована вода 100 мл

Везувін 12 г

Етанол 96° 60 мл

Дистильована вода 40 мл

Хризоїдин 1 г

Дистильована вода 150 мл

Барвник розчиняють у киплячій воді.

Метод П’ю. Готують спеціальний барвник: до 2 мл етанолу добавляють 0,2 г

толуїдинового синього, потім 100 мл 5 % розчину оцтової кислоти. Барвник стійкий,

зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і

підігрівають до появи парів протягом 1-2 хв, охолоджують, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення.

Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну

кислотостійкість. Саме ця властивість і лежить в основі методу. З досліджуваного

матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на по-

лум’ї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв.

Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % водний розчин сірчаної кислоти, другий – на

такий же час у 4 % розчин калію карбонату. Обидва мазки, не промиваючи водою,

висушують фільтрувальним папером. Перший препарат помічають літерою К (кис-

лота), другий – Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 %

розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється у

світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна – у вишнево-червоний.

У мазку Л цитоплазма виглядає слабо забарвленою, а на місці метахроматичних

зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову при-

роду включень.

Частина І. Загальна мікробіологія

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину

Циля – 4 мл, льодяної оцтової кислоти – 5 мл, етанолу 96° – 95 мл, дистильованої

води – до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на

полум’ї газового пальника до повного випаровування барвника, промивають во-

дою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світло-

червоний колір, а зерна волютину – в чорно-синій.

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної

стінки й капсули.

Цитоплазматична мембрана – м’яка, пластична, тришарова поліфункціо-

нальна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосома-

ми, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

Клітинна стінка – своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає пос-

тійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних та осмотичних сил

і виконує ряд інших важливих функцій, є унікальним структурним компонентом,

властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно стінка складається

з двох шарів: зовнішнього – пластичного і внутрішнього – ригідного, пружного.

Зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру,

яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизо-

вий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі

під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

Капсула – це міцно зв’язаний з клітинною стінкою особливий слизовий шар.

Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники

сибірки, чуми, крупозної пневмонії), в інших – вона завжди є в усіх середовищах

(клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лей-

коносток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виді-

ляють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно зв’язані з клітин-

ною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

При повсякденних діагностичних лабораторних дослідженнях потреба вияв-

ляти клітинну стінку чи цитоплазматичну мембрану майже не виникає. Під світло-

вим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або

плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне

зневоднення, цитоплазма клітин зморщується й відстає від клітинної стінки (плаз-

моліз). Під мікроскопом видно контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо

ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостері-

гається протилежне явище – плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка зго-

дом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх

контури (чохли).

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки.

Найбільш відомими з них є методи Пєшкова, Гутштейна, Кнайзі.

Метод Пєшкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60

мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) протягом 15 хв,

потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлю-

ють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 с. Препарат висушують

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

на повітрі й мікроскопують. Оболонка виглядає як тонкий червоний обідок навко-

ло бактерійної клітини.

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутш-

тейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв

10 % розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 %

водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлюються оболонки в фіолето-

вий колір вже через 5-10 с.

Метод Кнайзі. Зафіксований у полум’ї пальника мазок протравлюють у спеці-

альному розчині (насичений водний розчин калійних галунів – 70 мл, 20 % розчин

таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, на-

кривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка

фарбується в червоний колір.

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять

складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають

гелеподібну консистенцію. При звичайних методах

фарбування вони погано сприймають барвники.

Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і

органів, мазках із гною, харкотиння вони виявля-

ються при будь-якому методі фарбування у вигляді

незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тіла-

ми бактерій і субстратом (рис. 13). Для фарбування

самих капсул запропоновані різні методи.

Спосіб Ребігера. Нефіксований мазок забарв-

люють насиченим розчином генціанового фіолето-

вого у 40% формаліні протягом 15-20 с, швидко промивають водою і висушують.

Капсули фарбуються у червоний, а бактерії – в темно-фіолетовий колір.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за

способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промива-

ють водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним

1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. На

темному димчасто-сірому фоні контрастно виділяються незабарвлені капсули, все-

редині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій (див. вкл., рис. 5).

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі або суміші Никифорова

(але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового

розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім

залишають на 30 с для охолодження. Препарат промивають великою кількістю

розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують.

Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом або сумішшю

Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої

води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують.

Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули – у блідо-рожевий. Метод постійно

дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул менш демонстративні.

Рис. 13. Капсули бактерій.

Частина І. Загальна мікробіологія

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворю-

вати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових куль-

тур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно за-

ломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліно-

вими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus)

або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись

центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової ганг-

рени) або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони

основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують про-

никнення барвників.

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок споронос-

ної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4

рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтру-

вальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за

методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла

бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний (див. вкл., рис. 6).

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не ви-

магає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за

таким алгоритмом:

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового ріжка, або

в спиртовому формаліні.

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до ки-

піння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 с.

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином

нейтрального червоного впродовж 30-40 с. Промивають дистильованою водою,

висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають сині-

ми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний

розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють

за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору,

а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають

5% водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів,

промивають струменем проточної води 30-40 с і додатково забарвлюють 0,5 %

водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій

забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні

органи руху – джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм

у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і

розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник

черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для

певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При

прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’яз-

ково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла

або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають ви-

димими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відно-

сяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надав-

леній краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазово-контрастної та анопт-

ральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з найтонших, складних і вимогливих бактеріоско-

пічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера,

Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Найнадійнішим із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготов-

лення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежи-

рених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і

вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих

пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтяг-

нутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у

воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши

препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл

20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірча-

нокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання,

перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і

профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протя-

гом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави.

Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко-

ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за

методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчи-

ном, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну

10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2 – насичений спиртовий розчин генціана

фіолетового.

Частина І. Загальна мікробіологія

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препа-

рат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають во-

дою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий

колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

Мікроскопічне дослідження живих мікробів

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надав-

леної й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх

ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Пере-

вагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді,

тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супро-

воджується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна

виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користу-

ються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні

видів збудників.

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно руха-

ються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише

загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані

крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку струк-

туру їх клітин краще, ніж у забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо

виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазово-

контрастної та аноптральної мікроскопії.

Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небез-

печна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно

обов’язково занурювати препарати в дезінфікуючий розчин.

Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею

або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури

або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють

фізіологічним розчином, оскільки наявність великої кількості мікробних тіл у полі

зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесе-

ну краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінце-

том, щоб у надавленій краплі не з’являлись бульбашки повітря. Для цього по-

крівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі

і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями.

Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не

виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмок-

тують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого

папір занурюють у дезінфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швид-

ке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла

заздалегідь змащують вазеліном.

Висяча крапля – метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів,

розроблений Р. Кохом в 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмно-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

ження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми,

явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо.

Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпрості-

ших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури,

вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в

центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої сус-

пензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежи-

реного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо зма-

щують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи, щоб крап-

ля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля

повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату

висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну

вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом

довгого часу (рис. 14).

Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій

краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опу-

щеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спо-

чатку при малому збільшенні (×8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в

дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких крап-

линок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По дру-

гий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край

краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший

сухий (×40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (×90). Трохи відкривають

діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії

проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роб-

лячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять мо-

нотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й без-

ладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молеку-

лярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно

коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів

мікробів через кривизну лунки. Для усу-

нення цього недоліку можна користува-

тись камерою Беттхера. Її легко виготови-

ти в будь-якій лабораторії. До звичайного

предметного скла за допомогою воску,

парафіну або відповідного клею при-

кріплюють скляне або пластмасове кільце

з діаметром отвору біля 10 мм і висотою

6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця

змащують вазеліном і на нього наклада-

ють покрівне скельце з живими бактерія-

Рис. 14. Висяча крапля:

а – вид зверху; б – вид збоку.

Частина І. Загальна мікробіологія

ми в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери

можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів.

Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи ви-

сячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього

використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і то-

луїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус

зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину

барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді

дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів

створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них зап-

ропонували Пєшков і Фонбрюн.

Ш-подібна камера Пєшкова. На предметне скло наливають шар розтопле-

ного агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають

дві канавки і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять

методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають

стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного

скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату.

Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розви-

ток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за до-

помогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні

смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з

тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики поперед-

ньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру,

щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають

її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло

заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не

слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

За допомогою камер Пєшкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни

клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйом-

ку особливо при використанні фазово-контрастної й аноптральної мікроскопії.

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгу-

тиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікро-

організмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього дос-

ліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середови-

ща. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають

джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рух-

ливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщині живильного середовища.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Розділ 4

ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів як окремий розділ мікробіології вивчає біохімічні

й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують

відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби. Адже бактерії є

складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні пе-

ретворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів

та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональ-

ної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов

зовнішнього середовища.

Культивування мікроорганізмів

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лаборатор-

них умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання

використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стан-

дартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності

мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови

власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту висту-

пають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче,

риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони.

Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі.

Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і

вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним дже-

релом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові

гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу се-

редовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєч-

ний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і

містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму

складі неорганічні фосфати.

Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і ток-

синоутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо).

Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та

рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів

досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до

20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Основні живильні середовища. Численні потреби мікроорганізмів зумовлю-

ють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існу-

ють спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо

Частина І. Загальна мікробіологія

перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища за-

водського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби

мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використову-

ють згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища ство-

рюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи

інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експеримен-

тального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та

щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно

0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал,

який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %),

білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропеп-

тин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає

середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бак-

терій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіо-

логічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також же-

латин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять

основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп-

тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наяв-

ністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випад-

ках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, си-

роватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду

ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види

бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для

холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група селективні середовища, які завдяки додаванню певних ком-

понентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних

видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. Так, середовище Мюллера

є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для

коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ ро-

бить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група се-

редовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів

і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення

протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, ре-

дукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Все ширше застосування в мікробіологічних лабораторіях знаходять численні

комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготов-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

лені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному

варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети

та висушуються для видалення води. До них належать системи АРІ-20 для іденти-

фікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів,

Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для

ідентифікації ентеробактерій (див.вкл., рис. 29). Непогано зарекомендували себе

тест-системи Roche та інші.

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюю-

чих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені

системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно досліди-

ти широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких

мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих

об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки.

Комп’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оці-

нити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ вхо-

дять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо,

рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готу-

ють спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і

кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат

Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання жи-

вильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні

солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду

натрію складає 5,0 г/л, KH

– 0,2-0,5 г/л, MgSO

·7H

O, інші солі додаються із

розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри,

багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до

0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар,

який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом

середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворю-

ючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С.

Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки,

кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться

при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми

здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача

середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином

застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який

потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів.

Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компо-

ненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’яз-

ково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра,

Частина І. Загальна мікробіологія

або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилі-

зації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують

через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові

фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка

курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, кол-

би, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками.

Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так,

середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при

температурі 112 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Середови-

ща без вуглеводів можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв.

Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як

нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням

через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Кон-

троль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті

протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які

найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути осно-

вою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку по-

передньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шмат-

ки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною

водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному

місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи на-

кип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтру-

вальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного

об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура

120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а

на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при

подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція

середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води

додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за до-

помогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. Бульйон

фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, про-

бірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С про-

тягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають

дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення

агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію

проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці

середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед засто-

суванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додають

Розділ 4. Фізіологія бактерій

стерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тва-

рини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідку-

ючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний

агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за

інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержа-

ти в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість

амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стаб-

ільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру,

порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним

об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить

про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У

рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують

до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попе-

редньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через м’ясорубку.

Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану суміш

ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо

активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недо-

броякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у

великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд

резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок

парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища,

встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температу-

рі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують

рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше

цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За

1-2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка на-

буває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду.

Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою

проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної води). За

наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-

фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амін-

ний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають

у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може

зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до

100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду

натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4-7,6,

розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

Частина І. Загальна мікробіологія

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецепту-

рою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартни-

ми сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промис-

ловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіолог-

ічних досліджень і стандартизувати їх.

Основні методи стерилізації

Головний напрям у боротьбі з інфекційними хворобами – профілактичний. У

зв’язку з цим у діяльності лікувальних закладів велике значення має попереджен-

ня попадання збудників захворювань в організм людини або інші об’єкти. Це про-

водиться добре розробленими й апробованими методами мікробної деконтамінації.

Основні з них – стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне

знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, ма-

теріалах, у живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, перев’язочний і шовний ма-

теріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторі-

ях – живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому

перед стерилізацією необхідно вміти підготувати інструменти, посуд, пробірки,

піпетки, перев’язочний матеріал та інше.

Інструменти обробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують

у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж роз-

чині 0,5-1 хв, прополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у

сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загорта-

ють у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилі-

заційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця за-

тикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали

по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закри-

вають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою

температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою високої температури. Ефек-

тивність такої стерилізації при нагріванні характеризується показником D – часом,

який необхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення

популяції бактерій (на 90 %). Його величина вимірюється, як правило, у хвилинах.

Прожарювання в полум’ї пальника – швидкий й абсолютно надійний спосіб.

Ним стерилізують бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця.

Кип’ятіння протягом 40 хв у спеціальних стерилізаторах використовують

для обробки хірургічних інструментів, шприців, голок, гумових трубок. Для підви-

щення температури кипіння й усунення жорсткості води додають 1 % бікарбонату

Розділ 4. Фізіологія бактерій

натрію. Цей метод не забезпечує повної стерилізації,

оскільки спори деяких видів бацил і клостридій

витримують кип’ятіння протягом декількох годин.

Стерилізацію сухим жаром у сухожаровій

шафі проводять при 160 °С протягом 120-150 хв,

або при 180 °С – 45-60 хв після досягнення заданої

температури (рис. 15). Стерилізують переважно

скляний посуд. Перевага цього методу над іншими

полягає в тому, що не пошкоджується скло, не відбу-

вається корозії металевих інструментів. Його мож-

на використати для стерилізації термостійких по-

рошків та інших речовин. Одним з недоліків дано-

го методу є достатньо тривалий строк стерилізації.

Крім того, при високих температурах може відбу-

тися обвуглювання і загоряння ватних пробок, паперу, в який загорнутий посуд.

Стерилізація парою під тиском – найнадійніший метод повного знищення

бактерій та їх спор. Він досягається дією пари, температура якої під тиском вища,

ніж при кип’ятінні. Таку стерилізацію проводять в автоклаві. Стерилізація парою

під тиском більш ефективна, ніж дія сухого жару.

Існують різноманітні електричні автоклави, які відрізняються між собою за

розмірами, формою, розташуванням (вертикальні та горизонтальні), вони можуть

бути з ручним керуванням, напівавтоматичні й автоматичні.

Конструктивно всі типи автоклавів представляють собою двостінний міцний

металевий котел циліндричної форми з кришкою, яка герметично закривається, що

дозволяє витримати високий тиск (рис. 16). Внутрішня частина автоклаву є стерилі-

заційною камерою (1), в яку вміщують матеріал, що стерилізується. Вона має спеці-

альний кран для виходу повітря (2) і манометр (3) із запобіжним клапаном (4). Ма-

нометр визначає робочий тиск пари в камері, а запобіжний клапан сприяє виходу

надлишку пари з метою запобігання розриву автоклава. Дистильовану воду в водо-

парову камеру заливають через спеціальну лійку (6), стежачи за її рівнем у спеці-

альній водомірній трубці (7). Пара із водопарової камери поступає в стерилізаційну

камеру через спеціальні отвори в її верхній частині. Сучасні автоклави мають мано-

метри і автоматичні регулятори включення і відключення струму, тримаючи заданий

тиск, а отже й задану температуру всередині автоклава. Робота з ним вимагає суво-

рого дотримання правил безпеки, які викладені в інструкції до кожного автоклава.

Основні правила роботи з автоклавом

1. Перед початком роботи слід ретельно оглянути автоклав, його контрольно-

вимірювальну апаратуру, перевірити пружність резинової прокладки, кріплення

кришки стерилізаційної камери.

2. Через спеціальну лійку до рівня відмітки на водомірній трубці в автоклав

заливають дистильовану воду і закривають кран.

3. Необхідний матеріал вміщують у стерилізаційну камеру і закривають гер-

метично кришкою автоклава. Бажано стежити, щоб предмети не розташовувались

Рис. 15. Сухожарова шафа.

Частина І. Загальна мікробіологія

в автоклаві дуже тісно, оскільки між ним повинна проходити пара. В іншому ви-

падку вони можуть залишитись нестерильними через відсутність нагріву до необ-

хідної температури.

4. Відкривають кран, який з’єднує стерилізаційну камеру з оточуючим сере-

довищем, і включають електричний нагрів.

5. Після того, як почався процес утворення пари, необхідно видалити повітря

із стерилізаційної камери. Для цього пару і конденсат відводять у спеціальну по-

судину з водою або в каналізацію. Чисту пару, яка виходить з автоклава з рівном-

ірним шиплячим звуком, протягом 10 хв пропускають через камеру, а потім закри-

вають паровідвідний кран.

6. Доводять тиск пари до рівня, якого вимагає режим стерилізації. Для цього

враховують співвідношення показників тиску манометра і температури кипіння

води (табл. 1).

7. По завершенні циклу стерилізації автоклав відключають. Тиск в автоклаві

поступово падає і зрівнюється з атмосферним. Тоді відкривають випускний кран

і поступово випускають надлишок пари у посудину з водою. Недотримання цих

правил може призвести до різкого зниження тиску, внаслідок чого рідина в про-

бірках, колбах, які стерилізувались, бурхливо закипає, змочуючи ватно-марлеві

пробки і навіть виштовхуючи їх. Така ситуація порушує стерильність матеріалу.

В автоклаві при 120 °С протягом 20 хв стерилізують прості живильні середо-

вища (МПБ, МПА), ізотонічні розчини, білизну, перев’язочний матеріал, а при

134 °С – знешкоджують заразні матеріали, відпрацьовані культури бактерій про-

тягом 40 хв. Середовища з вуглеводами не витримують такої обробки, оскільки

вони карамелізуються, у зв’язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Стерилізація текучою парою (100 °С) проводиться в автоклаві з незагвин-

ченою кришкою. При нагріванні пара проникає між вкладеними об’єктами й сте-

рилізує їх. Таким способом обробляють середовища з вуглеводами. Оскільки од-

Схема автоклава:

1 – стерилізаційна камера;

2 – кран для виходу повітря;

3 – манометр; 4 – запобіжний

клапан; 5 – водопарова камера;

6 – лійка для заливу автоклава

водою; 7 – водомірна трубка;

8 – отвори для поступлення

пари в стерелізаційну камеру;

9 – захисний кожух;

10 – кришка автоклава;

11 – підставка для розміщення

предметів для стерилізації.

Рис. 16. Автоклав.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

норазова дія пари не вбиває спори, застосовують дробну стерилізацію – 3 дні підряд

по 30 хв. Ті спори, які не загинули при першому нагріванні, проростають до на-

ступного дня у вегетативні клітини й гинуть при другій і третій обробці.

Для тих речовин, які не витримують 100 °С (білкові рідини, вітаміни, деякі

ліки), застосовують тиндалізацію – стерилізацію на водяній бані при темпера-

турі 58-60 °С протягом години 5-6 днів підряд. Однак цей метод зараз широко не

застосовується, оскільки вимагає значних затрат часу на його проведення.

Пастеризацією вважають одноразове прогрівання матеріалу до температу-

ри нижче 100 °С, при якій знищуються, в першу чергу, вегетативні форми мікро-

організмів. Цей спосіб вперше запропонував Л. Пастер для знищення безспоро-

вих форм мікробів, переважно патогенних і умовно-патогенних видів. Спори при

цьому залишаються живими, а мікроорганізми, що залишились, стають помітно

ослабленими. Метод широко використовують у харчовій промисловості, коли при

кип’ятінні можуть втратитись органолептичні властивості продуктів. Так прово-

дять термічну обробку молока, пива, вина, різних соків при 70 °С протягом 30 хв

або при 80 °С – 5-10 хв. Пастеризовані продукти зберігаються на холоді.

Згортання (ущільнення) сироватки і яєчних середовищ з одночасною їх сте-

рилізацією проводять у спеціальних згортувачах Коха з електричним підігрівом

(рис. 17). Асептично приготовлені сироватки та

яєчні середовища у нахиленому положенні прогріва-

ють однократно при 80-90 °С одну годину. При

підозрі на мікробну контамінацію їх прогрівають

при тій же температурі три дні підряд.

Механічні методи стерилізації широко вико-

ристовуються в мікробіологічних лабораторіях.

Особливо за тих умов, коли підвищена температура

може зруйнувати субстрати. Це стосується рідких

середовищ і рідин, які містять білки, вітаміни, ан-

тибіотики, вуглеводи, леткі речовини тощо. Метод

можна застосувати для очищення бактеріальних ток-

синів, бактеріофагів від мікроорганізмів. Однак цей

метод вважається менш надійним порівняно із кла-

сичною стерилізацією.

Таблиця 1

Залежність між надлишковим тиском пари, температурою кипіння води

і тривалістю стерилізації

Тиск пари, атм

Температура,

Час стерилізації, хв

0 100 30-60

0,5 112 20-30

1,0 121 15-20

1,5 127 15-20

2,0 134 15

Рис. 17. Апарат для

стерилізації і згортання

(ущільнення) сироватки.

Частина І. Загальна мікробіологія

Механічна (холодна) стерилізація проводиться за допомогою фільтрування

через дрібнопористі антибактеріальні чи антивірусні фільтри. Їх створюють із

спеціальних матеріалів, пронизаних порами, які мають різну форму та йдуть че-

рез фільтр звивисто. Фільтри можна виготовляти із позитивно зарядженого мате-

ріалу, тоді бактерії, що несуть на поверхні негативний заряд ще й взаємодіють з

ним електростатично, а не тільки механічно внаслідок різного діаметру бактерій і

пор. Щоб попередньо перевірити якість фільтрів, використовують дрібні тест-

мікроорганізми (Serratia marcescens або Pseudomоnas aeruginosa). Фільтрат висі-

вають на живильне середовище і витримують при оптимальній температурі про-

тягом 5 днів. При відсутності росту тест-бактерій можна застосовувати фільтр для

стерилізації.

Промисловість різних країн випускає найрізноманітніші фільтри, які різняться

за матеріалом виготовлення й діаметром пор. Мембранні або колоїдні фільтри, які

виготовляють із нітроцелюлози, представляють собою диски діаметром до 35 мм.

Нижче наведено характеристики різних фільтрів (табл. 2).

Таблиця 2

Типи фільтрів

Фільтри країн СНД Фільтри фірми „Мілліпор” Фільтри фірми „Синпор”

номер

фільтра

діаметр пор,

мкм

тип фільтра

діаметр пор,

мкм

тип фільтра

діаметр пор,

мкм

1 0,35 VF 0,01 1 4,0

2 0,5 VM 0,05 2 2,5

3 0,7 VC 0,10 3 1.5

4 0,9 SLGS 0,22 4 0,85

5 1,2 SLHA 0,45 5 0,60

6 3,5 DA 0,65 6 0,40

AA 0,8 7 0.30

RA 1,2 8 0,23

SS 3,0 9 0,17

SM 5,0 10 0,12

У мікробіологічних лабораторіях часто використовують фільтри Зейтца

(рис. 18). Вони представляють собою пластини (диски або квадрати) товщиною

4-6 мм, які виготовляють із суміші азбесту і целюлози.

Однак ці фільтри мають ряд недоліків, які слід враховувати при роботі з ними.

По-перше, можливе забруднення фільтратів сторонніми речовинами, які попада-

ють у нього з фільтра (луги, солі лужних металів, волокна азбесту). По-друге,

азбест внаслідок свого негативного заряду зв’язує деякі речовини з рідини, що

фільтрується. Крім того, слід ретельно перевіряти фільтри перед роботою, щоб не

використовувати ті, які мають механічну деформацію (тріщини, надломи тощо).

Крім азбестових, широко використовуються фарфорові фільтри, вперше зап-

ропоновані Пастером і Шамберланом. Їх інакше називають свічки Шамберлана.

Виготовляють їх із каоліну й кварцового піску та надають форми порожнистого

Розділ 4. Фізіологія бактерій

циліндра, який закритий з одно-

го кінця. Величина пор позна-

чається L

-L

. Фільтри L

-L

антибактеріальними.

Інший тип фільтрів, які ви-

готовляють з інфузорної землі

(діатоміту або кізельгуру), одер-

жав назву свічок Беркефельда.

За своїм зовнішнім виглядом

вони подібні до циліндрів, зам-

кнутих з одного з кінців. Свічки

маркують літерами V, N i W, що

відповідає діаметру пор в межах

відповідно 8-12, 5-7 і 3-4 мкм.

Випускаються ще й стери-

лізуючі фільтри із скла „Пірекс” у вигляді двошарових дисків. Поділяють фільтри

за розміром пор на три основних типи: С, М і Р. Розмір пор у них відповідно ста-

новить понад 1,7, від 1 до 1,7 і менше 1 мкм.

Перед роботою фільтр закріпляють у спеціальному тримачі. Зокрема, азбес-

тові пластинки вміщують між циліндричною й опорною частиною металевого

корпусу апарата Зейтца. Обидві частини з’єднують гвинтами. Зібраний фільтр

вставляють у гумовий корок колби Бунзена з боковим відростком. Повністю вмон-

тований фільтр загортають у папір і стерилізують в автоклаві. Рідину для фільтру-

вання наливають у металевий циліндр, з’єднують боковий відросток колби з ваку-

умним насосом, щоб створити вакуум у колбі й прискорити фільтрування. Фільтрат

у колбі буде стерильним.

Хімічним способом стерилізують вироби з гумових і полімерних матеріалів.

Для цього використовують 6 % розчин перекису водню, в який занурюють вироби

на 6 год при 18 °С і на 3 год при 50 °С. Можна застосувати розчин дексона з

експозицією 45 хв при 18 °С. Після закінчення стерилізації вироби двічі прополі-

скують у стерильній дистильованій воді, кожного разу змінюючи її, та переносять

корнцангом у стерильний бікс.

Інструменти для ендоскопії й автоматичні піпетки можна також стерилізува-

ти спиртом.

Газовий метод стерилізації парами формальдегіду, хлороформу, β-пропіо-

лактону, окисом етилену, окисом пропілену, метилброміду, озоном використову-

ють для знезараження ендоскопічних інструментів, апаратів для штучного крово-

обігу, радіоелектронного обладнання, пластмасових виробів, кетгуту тощо. Ефек-

тивною зарекомендувала себе суміш окису етилену і бромистого метилу в

співвідношенні 1:1,44. Для проведення стерилізації газом використовують спеці-

альні щільні камери, які герметично закриваються. Для кожного діючого фактора

розроблено свої режими стерилізації. Після завершення процедури газова суміш

викачується з камери і замінюється стерильним повітрям. Предметами, які було

Рис. 18. Фільтр Зейтца. Свічки Шамберлана.

Частина І. Загальна мікробіологія

простерилізовано вказаним способом, рекомендується користуватись не раніше,

ніж через 24 год, для того, щоб видалився весь газ.

Одним із методів стерилізації є застосування різних типів опромінення. У

практиці використовуються для цього електрони, гамма-промені, ультрафіоле-

тові промені, радіочастотне опромінення.

Електронні прискорювачі дозволяють фокусувати електрони у вузький спря-

мований пучок високої потужності. Цей метод використовують для стерилізації в

промислових масштабах хірургічного перев’язочного і шовного матеріалів ще на

етапі їх виробництва. Недоліком даного методу стерилізації є низька проникність

променів.

До гамма-опромінення чутливі вегетативні та спорові форми різноманітних

бактерій, грибів, дріжджів, віруси. Опромінення потужністю 2,5 Мрад використо-

вується для знезараження антибіотиків, вітамінів, стероїдних та інших гормонів,

пластмасового одноразового устаткування (чашок Петрі, шприців), хірургічного

перев’язочного та шовного матеріалів тощо.

Стерилізацію за допомогою ультрафіолетового опромінення проводять для

знешкодження бактерій в повітрі операційних, палат, боксів, мікробіологічних

лабораторій тощо. Для цього використовують спеціальні бактерицидні лампи різної

потужності – БУВ-15, БУВ-30 та ін. Однак слід пам’ятати, що мікроби можуть

бути захищені від дії ультрафіолетового опромінення численними органічними

речовинами, пилом та іншими факторами. Вегетативні форми бактерій у 3-10 разів

більш чутливі до УФО, ніж спори.

Методи радіочастотного опромінення на сьогодні починають інтенсивно роз-

роблятись, особливо у харчовій промисловості. Складність їх полягає в небезпеці

для обслуговуючого персоналу (наприклад, перешкоди систем зв’язку, різна час-

тота опромінення, яка застосовується для знешкодження мікроорганізмів).

Для перевірки ефективності стерилізації, надійності роботи автоклавів зас-

тосовують хімічний та біологічний контроль. Відомі хімічні речовини з певною

температурою плавлення: бензонафтол – 110 °С, антипірин – 115 °С, сірка – 119 °С,

бензойна кислота – 120-122 °С, манноза і сечовина – 132-133 °С. Саме при таких

температурах найчастіше здійснюють стерилізацію. Хімічні речовини вміщують

у скляні трубки, додають невелику кількість анілінового барвника (сафранін, фук-

син або метиленовий синій), запаюють і кладуть між об’єктами, що стерилізу-

ються. Рівномірне забарвлення препарату в колір барвника в трубці свідчить про

належну температуру в автоклаві, а отже й надійність стерилізації. Для біологіч-

ного контролю стерилізації в автоклав вміщують спеціальні біотести – смужки

фільтрувального паперу, марлі тощо, на яких знаходяться спори бактерій з відо-

мою термостійкістю, спори відомої чисельності та ін. (табл. 3).

Вони розкладаються в біксах, які підлягають стерилізації. Після завершення

циклу в пробірки з смужками заливають живильне середовище та інкубують при

оптимальній температурі. Відсутність проростання спор бактерій свідчить про

ефективну стерилізацію.

У таблиці 4 наведено основні способи стерилізації різних медичних об’єктів.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Таблиця 3

Спори бактерій, які найчастіше використовують як індикатори

Вид мікробів Метод стерилізації Величина D, хв

Bacillus subtilis

Окис етилену (600 мг/л) при 54

і 50 % відносній вологості

Сухий жар (170

С)

3,0 хв

0,8 хв

Bacillus steatothermophilus

Волога пара (

≥

121

С)

1,5 хв

Clostridium sporogenes

Волога пара (

≤

121

С)

0,2-0,8 хв

Таблиця 4

Способи стерилізації медичних об’єктів

Спосіб стерилізації Об’єкти стерилізації

Сухий жар Скляний посуд, олія, інструменти, голки, порошки

Волога пара Розчини для парентерального введення, інструменти,

середовища, резинові пробки

Фільтрування Живильні середовища, що не витримують нагрівання,

із білками, деякими вітамінами, амінокислотами, гази,

рідини, мазі, олії з низькою в’язкістю

Окис етилену Обладнання для наркозу, катетери, діагностичне

обладнання, протези, лабораторне устаткування, допоміжні

хірургічні матеріали, оптичні інструменти, пластмасові

вироби, пакувальні матеріали

Іонізуюче опромінення Порошки, перев’язочний матеріал, пробірки для забору

крові, щітки, мазі від опіків, центрифужні стакани, шовний

матеріал, хірургічний одяг

Дезінфекція. Дезінфекція – це сукупність заходів для повного, часткового

або селективного знищення потенційно патогенних для людини збудників на різних

об’єктах довкілля з метою попередження передачі збудника від джерела інфекції

до сприйнятливого організму.

Оскільки мікроорганізми мають різну чутливість до дезінфікуючих засобів,

виділяють чотири ступені дезінфекції: A, B, C, D. Дезінфекційні заходи ступеня A

передбачають знищення аспорогенних форм мікробів, рикетсій, мікоплазм, най-

простіших. Заходи ступеня B використовуються для ліквідації грибів, деяких

вірусів, бактерій, що мають підвищену стійкість (стафілококи, мікобактерії). Бо-

ротьба із збудниками особливо небезпечних інфекцій (чуми, холери, висипного

тифу, меліоїдозу, сапу) вимагає заходів ступеня С. Знищення спор мікроорганізмів

і найпростіших – заходів ступеня D.

Заходи дезінфекції, що використовуються в клініках, мікробіологічних, віру-

сологічних та інших лабораторіях досить різноманітні. Їх умовно можна поділити

на 2 групи: фізичні та хімічні.

До першої групи можна віднести спалювання використаного перев’язочного

матеріалу, відходів, сміття, пропалювання в полум’ї пальника, дію сухого жару,

автоклавування за різних режимів, використання ультразвуку. Ефективними захо-

Частина І. Загальна мікробіологія

дами є кип’ятіння предметів особливо з поверхнево активними речовинами, дез-

інфекція повітря за допомогою ультрафіолетового опромінення. Постійно вико-

ристовуються такі елементарні заходи, як вологе прибирання, миття, очищення,

витріпування ко вдр, простирадл тощо. Такі заходи хоча й не знищують мікроор-

ганізмів, однак сприяють суттєвому зниженню їх популяцій на різних об’єктах.

Потужним комплексом дезінфекційних заходів виступають численні хімічні

препарати – дезінфектанти. До них пред’являють певні вимоги: 1) протимікроб-

ний ефект широкого спектра дії; 2) висока розчинність у воді, здатність утворюва-

ти з водою або повітрям активні та стійкі суспензії, емульсії, аерозолі; 3) здатність

не втрачати протимікробних властивостей при наявності в середовищі органіч-

них домішок; 4) низька токсичність; 5) відсутність алергізуючої дії; 6) відсутність

пошкоджуючого ефекту щодо предметів, які ними обробляються; 7) доступність

сировини, з якої виготовляються дезінфектанти, її дешевизна тощо.

Існує декілька сотень дезінфікуючих засобів різних груп. Серед них алко-

голі, альдегіди, четвертинно-амонієві сполуки. Найширше використання знайшли

хлоромісткі препарати. До них належать 0,2-1,0 % хлорне вапно, яке виготовля-

ють ex tempore з 10 % освітлених розчинів цієї речовини; 0,2-1,0 % розчини хло-

раміну В або Т; 5 % водні розчини гіпохлориду кальцію; 0,05-0,1 % розчин

трихлоізоцианурової кислоти (диконіту); 0,1-0,2 % розчин сульфохлорантину.

Окислювачі представлені 1-10 % розчином перекису водню, фенолами та їх по-

хідними – 3-5 % розчинами лізолу, карболової кислоти, фенолу. До групи препа-

ратів із солей важких металів належать мертиолят натрію, сулема. Широке засто-

сування набули 2-3 % розчин формальдегіду, 3-10 % розчин крезолу та інші. Вико-

ристовуються в практиці й газоподібні дезінфектанти – 40 % водний розчин

формальдегіду, суміші окису етилену з вуглекислим газом (1:10) і окису етилену з

бромідметилом (1:1).

На практиці виділяють поточну та заключну дезінфекцію. Поточну дезінфек-

цію проводять для зменшення мікробної контамінації у вогнищах інфекції. Їй підля-

гають ліжка, постільна і натільна білизна, рушники, матраци, подушки, меблі,

килими, посуд, інструменти, прилади, що знаходяться на поверхні різних об’єктів,

повітря, виділення, стічні води тощо.

Зокрема, поверхні столів, вікон, стелі, стіни, меблі дезінфікують протиран-

ням і миттям з допомогою дезінфікуючих розчинів, постільну та іншу білизну

перуть у цих розчинах. Ліжка, матраци, подушки обробляють у спеціальних каме-

рах термохімічними методами, м’які меблі – за допомогою спеціальних аерозолів,

посуд – зануренням у дезінфікуючі розчини. Обробка виділень і стічних вод про-

водиться термічними і хімічними методами. Повітря приміщень можна дезінфіку-

вати пропусканням через спеціальні антибактеріальні фільтри, як це роблять в

палатах гнотобіологічної ізоляції, або опромінюючи його ультрафіолетовими про-

менями. Медичні інструменти, прилади спочатку очищають, дезінфікують, а потім,

у разі потреби, стерилізують відомими способами.

Заключна дезінфекція проводиться з метою знищення збудників інфекцій-

них захворювань у приміщенні, де перебував інфекційний хворий, і предметах, з

Розділ 4. Фізіологія бактерій

якими він був у контакті. Така ситуація складається після виписування його з інфек-

ційного стаціонару, переводу із соматичного відділення в інфекційне тощо.

Для забезпечення догляду за проведенням дезінфікуючих заходів розроблену

спеціальну систему контрою. Вона включає в себе: а) зовнішній і внутрішній кон-

троль відділами дезінфекції санітарно-епідеміологічних станцій та лабораторій

лікувально-профілактичних закладів, який здійснюється візуальним, бактеріоло-

гічним, біологічним, хімічним та іншими методами; б) бактеріологічний контроль

проводять, виявляючи у вогнищах інфекції індикаторних бактерій: при кишкових

захворюваннях – кишкові палички, при крапельних інфекціях, туберкульозі – ста-

філококи, у лікувально-профілактичних закладах – умовно-патогенні мікроорган-

ізми; контроль здійснюється 1 раз у місяць – один раз у квартал залежно від рангу

лабораторії; в) забір контрольних проб (10-30 штук) проводять не раніше, ніж

через 30-45 хвилин після закінчення дезінфекції; площа змивів не повинна бути

меншою, ніж 200 см

; г) змиви беруть стерильними ватними тампонами і засіва-

ють на живильні середовища з дотриманням всіх правил асептики з метою запо-

бігання контамінації сторонньою флорою; для виділення бактерій групи киш-

кової палички і золотистих стафілококів користуються спеціальними наборами

живильних середовищ і схемами ідентифікації, визначених відповідними

інструкціями.

Дезінфікуючі заходи вважаються ефективними, якщо у пробах не визнача-

ються бактерії групи кишкової палички, умовно-патогенні мікроби, золотисті ста-

філококи.

Бактеріологічне дослідження

Бактеріологічний метод дослідження є найважливішим у практичній діяльнос-

ті будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання залежить

визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір

тактики лікування інфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється

тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді

необхідно встановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

Тому перед освоєнням основних принципів і методів виділення чистих куль-

тур необхідно оволодіти технікою посівів і пересівів бактерій в рідкі й на щільні

живильні середовища.

Техніка посівів мікроорганізмів. Посіви проводять як з метою виділення збуд-

ників із досліджуваного матеріалу від хворих, так і для нагромадження чистих

культур з метою подальшого їх вивчення та ідентифікації. Техніка посівів у рідкі

та на щільні живильні середовища має свої особливості (рис. 19).

У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне середовище

(щільне або рідке), в іншій – досліджуваний матеріал. Пробірки затискають вели-

ким та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом

пробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахилени-

ми, і потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби з

Частина І. Загальна мікробіологія

повітря та навколишніх предметів з однієї не по-

трапили в іншу. Корки з пробірок виймають, три-

маючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома інши-

ми пальцями правої руки, як олівець, тримають

бактеріологічну петлю або піпетку, якими розпо-

діляють досліджуваний матеріал.

Спочатку стерилізують петлю у верхній

частині полум’я газового пальника. Пробірки

відкривають і край їх проносять через полум’я

пальника. Петлю опускають у пробірку, де є до-

сліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись

стінки, охолоджують. У подальшому петлю опус-

кають у пробірку і набирають матеріал. Якщо він

знаходиться у рідкому стані, для посіву достат-

ньо краплі рідини, яка затримується в кільці бак-

теріологічної петлі. Коли використовують мікро-

би, що виросли на поверхні середовища, обереж-

но плавним рухом набирають невелику кількість

їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середо-

вище. Петлю повільно виймають з пробірки, не

торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку

з середовищем. Штриховими рухами від однієї

стінки пробірки до іншої, починаючи з нижньої

частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні агару знизу

догори.

Петлю виймають з пробірки, корки і краї пробірок проносять через полум’я і

закривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.

При посіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом за-

нурюють у рідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на

стінці пробірки й омивають середовищем.

Матеріал, який набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, вилива-

ють у живильне середовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку

обережно, щоб не замочити корок, струшують або обертають, затиснувши в долонях.

Для посіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі неве-

лику кількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню

середовища біля краю чашки. Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб

знищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з

місця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню ага-

ру, де було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по

решті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву тривали від краю

до краю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один

до одного. Цим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для

одержання ізольованих колоній.

Рис. 19. Посіви бактерій на

середовище: а – бактеріальною

петлею на скошений агар;

б – уколом в сповпчик агару;

в – шпателем на агар у чашці Петрі.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо нано-

сять на поверхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою.

Стерильний шпатель проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки

чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розпо-

діляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.

При посіві тампоном чашку дещо відкривають однією рукою, тампоном тор-

каються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами

від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища,

не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву

чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до попереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного середовища пробірку з м’ясо-

пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у

праву і роблять укол до дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а

пробірку закривають.

Посів матеріалу в товщу живильного середовища. Перед посівом матері-

ал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають

0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після

цього матеріал заливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50 °С МПА.

Обережно похитуючи чашку, круговими рухами по поверхні стола перемішують в

ній матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку зали-

шають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відділити чис-

ленні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягнути за

допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному і біологічно-

му роз’єднанні бактерій.

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, був одним із

найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів.

Він полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить

мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо

кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість

мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень). Р. Кох

використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару.

Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з

розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на

стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно культивувалось при

оптимальній температурі. У його товщі утворювались ізольовані колонії мікроор-

ганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за до-

помогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод Дригальського є більш досконалим методом, який широко розпов-

сюджений в повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню сере-

Частина І. Загальна мікробіологія

довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За

допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середови-

ще. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб

рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів

матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – в третій. Тільки після цього шпатель

занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На по-

верхні середовища в першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільний ріст бакте-

рій, у другій – густий ріст, а в третій – ріст у вигляді ізольованих колоній (рис. 20).

Метод штрихових посівів сьогодні використовується в мікробіологічних ла-

бораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бак-

теріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю

чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його паралельними штри-

хами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній тем-

пературі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів (рис. 21).

Рис. 20. Ріст бактерій в чашках Петрі при посіві

за методом Дригальського.

Рис. 21. Ізольовані

колонії бактерій при

посіві штрихом.

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів тампоном, яким

проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із

живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають

матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дри-

гальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані

колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище пере-

творюються в чисту культуру

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований по-

шук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед най-

поширеніших методів можна виділити наступні:

1. За типом дихання. Всі мікроорганізми за типом дихання поділяються на

дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae тощо) та

анаеробні (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens та ін.).

Якщо матеріал, з якого слід виділити анаеробні збудники, попередньо прогріти, а

потім культивувати в анаеробних умовах, то виростуть саме ці бактерії.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

2. За спороутворенням. Відомо, що деякі мікроби (бацили і клостридії) здатні

до спороутворення. Серед них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium

perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів зовніш-

нього середовища. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії терміч-

ного фактора, а потім інокулятивно перенесений в живильне середовище. Через

деякий час на ньому виростуть саме ті бактерії, які здатні до спороутворення.

3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідок особливостей їх хімічної будови стійкі

до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, харкотиння при ту-

беркульозі попередньо обробляють рівним об’ємом 10 % розчину сірчаної кисло-

ти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора гине, а мікобак-

терії внаслідок їх резистентності до кислот, виростають.

Холерний вібріон (Vibrio сholerae), навпаки, є галофільною бактерією, тому

для створення оптимальних умов росту його висівають на середовища, які містять

луг (1 % лужна пептонна вода). Вже через 4-6 год на поверхні середовища з’явля-

ються характерні ознаки росту у вигляді ніжної голубуватої плівки.

4. Рухомість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) мають тенденцію до

повзучого росту і здатні швидко розповсюджуватись по поверхні дещо вологого

середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у краплинку конденса-

ційної рідини, яка утворюється при охолодженні стовпчика скошеного агару. Через

16-18 год вони розповсюджуються на всю поверхню середовища. Якщо взяти ма-

теріал з верхньої частини агару, будемо мати чисту культуру збудників.

5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших

протимікробних засобів. Внаслідок особливостей метаболізму бактерій вони

можуь мати різну чутливість до деяких хімічних чинників. Відомо, що стафілоко-

ки, аеробні бацили, що утворюють спори, стійкі до дії 7,5–10 % хлориду натрію.

Ось чому для виділення цих збудників використовують елективні живильні сере-

довища (жовтково-сольовий агар, маніт-сольовий агар), які містять саме цю речо-

вину. Інші бактерії при такій концентрації хлориду натрію практично не ростуть.

6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для гальму-

вання росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, навпаки,

додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє інгібуванню росту бак-

теріальної флори, якщо треба виділити гриби. Додавання фуразолідону в певних

концентраціях до живильного середовища створює селективні умови для росту

коринебактерій і мікрококів.

7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні по-

криви. Деякі патогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої

кількості ферментів агресії здатні проникати через непошкоджену шкіру. Для цього

шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають досліджува-

ний матеріал, який містить збудника і велику кількість стороньої мікрофлори. За

деякий час тварину забивають, а з крові або внутрішніх органів виділяють мікроби.

8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворю-

вань. Окремі тварини проявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів.

Частина І. Загальна мікробіологія

Наприклад, при будь-якому способі введення Streptococcus pneumoniae білим ми-

шам у них розвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна кар-

тина спостерігається при зараженні гвінейських свинок збудниками туберкульозу

(Mycobacterium tuberculosis).

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями як

штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом розуміють мікроби одного

виду, які виділено з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в

різний час. Чиста культура бактерій – це мікроорганізми одного виду, нащадки

однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду

етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба,

флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом,

консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і

досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьо-

му етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища,

на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (засто-

совується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-

марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують

спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С)

на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі

живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного сере-

довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії.

Колонія – це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі

живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї

мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту

бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на

поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і по-

верхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії

під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній дослі-

джують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути

гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю

переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і

лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії

(рис. 22).

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діамет-

ром) їх поділяють на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм),

Розділ 4. Фізіологія бактерій

карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній

може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, не-

правильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають про-

зорими, що пропускають світло, і мутними.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному

розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполо-

подібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі,

плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавле-

ним центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

Поверхня колоній може бути матовою або блиску-

чою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або

шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми

(smooth – гладенький), а шорсткі – R-форми (rough –

шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різно-

манітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою,

шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює без-

барвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак де-

які з них формують кольорові колонії. Їх колір визна-

чається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині,

червоні тощо.

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пасто-

подібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив-

чення морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо-

мість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно

велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із

поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із

живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки

з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватись стандартни-

ми сухими живильними середовищами, які випускає мікробіологічна промис-

ловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіолог-

ічних досліджень і стандартизувати їх.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному,

хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому

може не змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчас-

тіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихто-

подібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середовище над ним може зали-

Рис. 22. Види колоній

мікроорганізмів.

Частина І. Загальна мікробіологія

шатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад

має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило,

анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених

до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюєть-

ся ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на

поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може

бути волога, товста, мати в’язку, слизисту консистенцію та прилипати до петлі,

тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої

залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

У разі потреби виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під

мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного жи-

вильного середовища для одержання ізольованих колоній.

На третій день (ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої куль-

тури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середо-

вищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки куль-

тури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної мор-

фології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роб-

лять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом

та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників.

Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфоло-

гічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознака-

ми називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про

вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони до-

сить різноманітні. Найчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолі-

тичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази,

каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітри-

ти тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікро-

організмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Виз-

начення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохіміч-

ною ідентифікацією.

Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні вла-

стивості) використовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у мо-

лоці виражається розчиненням згустка казеїну, який утворено бактеріями, що згор-

тають молоко.

Середовища із желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону,

0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз про-

являється розрідженням стовпчика середовища. Оскільки деякі види бактерій

відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю ознаку можна врахо-

вувати при їх ідентифікації.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони – продукти не-

повного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засі-

вають мікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів – аміа-

ку, сірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та при-

тискають пробкою червоний лакмусовий папірець. В атмосфері аміаку він набуває

синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату свинцю, який

за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, змочений інди-

катором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоче-

ного 12 % розчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває

рожевого кольору. Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим

методом пробкою пробірки притискають папірець, просякнутий спеціальним інди-

катором (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу

колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий. В іншому варіанті виз-

начення індолу до 48-годинної бульйонної культури бактерій додають 1-2 мл сірча-

ного ефіру, а потім – реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв з’яв-

ляється яскраве малинове кільце.

У мікробіологічній практиці широко використовуються диференційно-діаг-

ностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозволяють виявити розкла-

дання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію

бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення

чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Ці середовища є елективними для

багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються вони у сухому

вигляді, тому їх приготування в лабораторіях не потребує багато часу.

Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та

індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище

має слабке рожеве забарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів,

тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-черво-

ний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмоне-

ли, шигели) на цьому середовищі безбарвні.

До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений

фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має

фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарв-

лення, а лактозонегативні – рожевий відтінок.

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у складі агар із солями

жовчних кислот лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянто-

вий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми,

що розщеплюють лактозу, утворюють колонії рожевого кольору, а ті, що її не фер-

ментують – безбарвні.

У мікробіологічній практиці часто виникає потреба дослідити ферментацію

не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовують сере-

довища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.

Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію хлориду,

1% вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До нього

Частина І. Загальна мікробіологія

додають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). Встановлюють

рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглево-

дами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – запаяну з

одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилі-

зують парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають

появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утво-

рення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. То д і роблять висновок

про утворення газу. Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на

середовише Гісса: мікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь)

або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти

без газу чи кислоти і газу.

Враховуючи, що мікроорганізми по-різному діють на вуглеводи (розклада-

ють або не розкладають), при кінцевому обліку результатів спостерігають про-

бірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строка-

тості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса.

Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середовищ для виз-

начення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На

відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водно-

го голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий

пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви живиль-

ного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором ВР

воно стає синім, а при підлужнюванні – червоним (бромкрезоловий пурпурний

при утворенні кислоти дає дещо фіолетове та лимонно-жовте забарвлення, а бром-

тимоловий синій – зеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають

відповідно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

Випускаються також сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною

Олькеницького.

Середовище Рессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %)

та індикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утво-

рився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею

спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії фер-

ментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього

середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьо-

му випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спосте-

рігають за появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького – більш складне середовище

порівняно з попереднім. Він дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози,

глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До скла-

ду середовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глю-

козу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індика-

тор феноловий червоний. Гото ве середовище має блідо-рожевий колір.

При розщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середовище в жов-

тий колір. Оскільки глюкоза наявна в невеликих концентраціях (0,1 %), в аероб-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

них умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години

росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу.

При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому

червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що

там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середови-

ще в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лак-

този (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще

невичерпані, тому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за

рахунок розщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув

рН у лужну сторону).

Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при ферментації цукрів,

з’являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що

піднімає агар у пробірці.

Сірководень мікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячуючи ферменту

тіосульфатредуктазі. Взаємодіють із сірководнем солі заліза, які, вступаючи з ним

у реакцію, утворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного

кольору в стовпчику.

Уреаза, яку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої

кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності

уреазопозитивних штамів провести облік ферментації цукрів неможливо. В таких

випадках необхідно використовувати інші середовища.

За останні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використо-

вувати спеціальні тест-системи для визначення різноманітних властивостей бак-

терій: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластини та диски індикаторні біохімічні. Вони

зручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноман-

ітних ознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів (див. вкл., рис. 7).

Гемолітична активність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх

вірулентності, тому її визначення стало рутинною процедурою будь-якої спеціалі-

зованої лабораторії. З цією метою використовують кров’яний МПА. Його готу-

ють з розтопленого та охолодженого до 45-50 °С живильного агару, до якого дода-

ють 5-10 % дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з

кров’ю ретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у

чашки Петрі. Якщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів

посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні (див. вкл.,

рис. 8). За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип

гемолізинів (α, β, γ тощо).

Щоб виявити ліполітичні властивості мікробів, до складу живильних сере-

довищ вводять ліпіди або жироподібні субстанції – твіни. Бактерії за таких умов

утворюють райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники

(метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни

кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження редукуючої активності.

Частина І. Загальна мікробіологія

Декарбоксилазну активність бактерій оцінюють на спеціальних середовищах

з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою та ін.) і відповід-

ними індикаторами.

З метою встановлення видової належності бактерій часто вивчають їх анти-

генну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями.

Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Зокрема,

представники родини ентеробактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели) містять обо-

лонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Вони не-

однорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. Їх можна

визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення

виду бактерій носить назву серологічної ідентифікації. Його відносять до одно-

го з головних методів встановлення виду виділеної культури. Найчастіше викори-

стовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне

скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх

антигенів), а потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість

чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації.

Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збуд-

ника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційно-

го агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у

розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять

за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні ток-

сигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації.

Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем,

просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин

чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в

організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод на-

зивають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти – найчастіше

використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до

антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше

користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузій-

ний метод). Для цього на поверхню спеціального щільного живильного середови-

ща в чашках Петрі засівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски,

просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній темпера-

турі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з анти-

біотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих,

помірно резистентних або стійких штамів.

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антиген-

них, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок

про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збуд-

ник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Виділення чистої культури анаеробних бактерій

У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікро-

організмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, часті-

ше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу

кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними склад-

ніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.

Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники від токсичного

впливу атмосферного кисню. Тому матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекоменду-

ється забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу

та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким.

Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні

живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисно-

відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин,

метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зрос-

танні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин за-

барвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голубий. Такі зміни

свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаероб-

них мікробів.

Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не

менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надхо-

дження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не

пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.

Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анае-

робних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни

середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої,

соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон.

Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна

або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекуляр-

ний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умо-

вою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд

методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.

Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його

обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією

метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко

охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають ша-

ром стерильної вазелінової олії або парафіном.

3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо

високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину

до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаероб-

них мікробів.

Частина І. Загальна мікробіологія

4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони

представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна

викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон). Допускається

використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 %

диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання

природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, викори-

стовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використову-

ють хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата.

Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією

метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому вра-

ховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посуди-

ни, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N

розчину гідроксиду натрію.

Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na

). Для зв’язу-

вання кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжо-

го 20 % розчину Na

і 16 мл 50 % гідроксиду калію.

2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаероб-

них бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного

потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіо-

гліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбі-

нову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.

Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів

тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди).

Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють

або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний чер-

воний, феносафранін).

3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють ство-

рити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах

тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”. До її складу

входять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу (таб-

летки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий каталізатор,

який поглинає кисень.

Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого знаходиться

шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” надрізають но-

жицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у мікроанаеро-

статі. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, який виді-

ляється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота продукується при

взаємодії бікарбонату натрію з лимонною кислотою.

Біологічні методи. 1. Метод Фортнера. Метод полягає в спільному культи-

вування на одному середовищі аеробних і анаеробних мікроорганізмів. Спочатку

по діаметру чашки вирізають полоску агару шириною до 0,5-1,0 см. З одного боку

засівають досліджуваний метралі, що містить анаеробні збудники, а з іншого –

мікроби, що є індикатором анаеробних умов (Serratia marcescens або “чудесна па-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

личка”). Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За деякий час на

поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і анаеробних мікробів.

При поглинанні кисню Serratia marcescens дає ріст блідо-рожевих або безбарвних

колоній, а при порушеннях герметичності – яскраво-червоні. На іншій половині

чашки виростають колонії анаеробних мікробів.

2. Метод Хеннеля (“годинникових скелець”). Він є своєрідною модифікацією

попереднього. Матеріал, що містить анаеробні збудники, засівається на поверхню

живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху він покривається “годиннико-

вим склом”, заповненим шаром МПА і засіяним Serratia marcescens. Аеробні мікро-

би, поглинаючи кисень, створюють умови для сприятливого росту анаеробних

збудників.

У високо спеціалізованих лабораторіях користуються спеціальною анаероб-

ною технікою, яка включає використання живильних середовищ без кисню із

відновлювачами, виконання посівів і пересівів в атмосфері інертних газів, вугле-

кислоти тощо.

За останні роки створено стаціонарні анаеробні бокси, які містять все необх-

ідне для створення анаеробних умов культивування, включаючи термостати. Як

правило, такі камери заповнюються трикомпонентною газовою сумішшю. Бакте-

ріолог працює в камері, перебуваючи зовні, застосовуючи гумові рукавиці, вмон-

товані в неї. Таке устаткування має незаперечні переваги, які полягають у тому,

що повністю виключається контакт кисню з досліджуваним матеріалом.

Виділення та ідентифікація анаеробних мікроорганізмів

Враховуючи сучасний розвиток мікробіологічної науки, виділяти та іденти-

фікувати культури анаеробних мікроорганізмів можна аналогічно аеробним бак-

теріям. Обов’язковим при цьому є дотримання на всіх етапах дослідження умов

анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному

співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему “Gas Generating Box”.

Однак збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції можна виді-

ляти та ідентифікувати за іншою схемою.

На першому етапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості

клінічного матеріалу, роблять мазок і забарвлюють його за методом Грама. Після

цього матеріал засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Попередньо

середовище регенерують на киплячій водяній бані протягом 10-20 хв і охолоджу-

ють. Безпосередньо після посіву матеріалу середовище нагрівають на водяній бані

при 80°С протягом 20 хв для знищення вегетативних неспорових форм мікробів.

Середовища ставлять у термостат і при температурі 37 °С культивують 1-3 доби.

На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння,

утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Оскіль-

ки середовище Кітта-Тароцці зверху залите шаром вазелінової олії для запобіган-

ня доступу кисню, в нього занурюють пастерівську піпетку, набирають рідину, з

якої готують мазок, фарбуючи його за методом Грама. Під мікроскопом у мазку

можна бачити великі грампозитивні паличкоподібні бактерії. Після цього прово-

Частина І. Загальна мікробіологія

дять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсс-

лера для одержання ізольованих колоній.

За методом Вейнберга готують декілька вузьких

високих пробірок (3-4) з розтопленим і охолодженим до

42-45 °С цукровим м’ясо-пептонним агаром. Можливе

використання середовища Вільсон-Блера. Матеріал із

середовища Кітта-Тароцці вносять у першу пробірку за

допомогою пастерівської піпетки й ретельно перемішу-

ють, потім переносять у другу, а далі – в третю. Для за-

стигання агару їх швидко охолоджують під струменем

холодної водопровідної води. За рахунок цього живі

мікробні клітини фіксуються в певних ділянка агару.

Після застигання агару пробірки культивують при опти-

мальній температурі протягом 1-2 діб для утворення ізо-

льованих колоній (рис. 23).

Вміст кожної пробірки можна, крім того, всмокта-

ти у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи, щоб не було буль-

башок повітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній

кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді

капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у

термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаероб-

них бактерій. Для того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на пев-

ному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, пере-

носять у відповідне середовище.

Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із сере-

довища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі пастерівською

піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять посів шпателем за

методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають другу чашку, а потім

і третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в

якому створюють анаеробні умови, а потім – у термостат при температурі 37 °С на

2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливо-

стей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджу-

ються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо.

З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсіва-

ють у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубу-

ють певний час при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури

збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять іден-

тифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів

подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та

біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних вла-

стивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лаборатор-

Рис. 23. Ізольовані

за методом Вейнберга

колонії анаеробів.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

них тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроор-

ганізмів.

Таким чином, на підставі вивчення різноманітних властивостей мікроор-

ганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду.

Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів

Середовище Кітта-Тароцці готують на основі бульйону Хоттінгера, до яко-

го додають шматочки бичачої печінки або мяса. Стерилізують його при 1 атмос-

фері протягом 30 хв. Активна реакція середовища – 7,4-7,6. Після посіву матеріа-

лу середовище заливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см.

Анаеробний кров’яний агар готують на основі еритрит-агару. До його складу

входять також спеціальні добавки: середовище 199 (10 %), гемін (10 мкг/мл), твін-

80 (0,1 %), метадіон (10 мкг/мл), цитратна кров (до 5 %) тощо. Після стерилізації

його розливають у чашки Петрі. Використовують не пізніше, як через 2 год після

виготовлення.

Жовтковий агар. У розтоплене і охолоджене до 56-60 °С середовище на ос-

нові еритрит-агару додають суспензію курячого жовтка (20 %), глюкозу (0,2 %),

гемін (10 мкг/мл) і розливають у чашки Петрі. Середовище використовують для

визначення лецитиназної активності збудників, зокрема C. perfringens. При наяв-

ності лецитинази навколо колоній утворюються зони помутніння.

Комерційне середовище для контролю стерильності. Його можна

використовувати як транспортне. Для поліпшення росту анаеробних бактерій до

його складу можна вводити спеціальні добавки, такі як середовище 199, гемін,

твін-80, метадіон, цитратна кров тощо.

Середовище Вільсон-Блера. Його готують на основі розтопленого й охо-

лодженого до 60 °С 1 % цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 мл

10 мл стерильного 20 % розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 % розчину хлориду

заліза. Го т о ве середовище не стерилізують.

Його використовують для прискореної діагностики газової анаеробної

інфекції, викликаної Clostridium рerfringens. Вже через 1-2 год спостерігають зміну

середовища: воно чорніє внаслідок відновлення сульфіту натрію в сульфат, який

взаємодіє з хлоридом заліза, утворюючи сульфід заліза. З’являються також розри-

ви агару внаслідок інтенсивного газоутворення.

Лакмусове молоко. Готують середовище із свіжого молока. Попередньо його

кип’ятять і залишають у прохолодному місці на одну добу. Знімають верхній шар

жиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують, і 10 % розчином бікарбонату

натрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10 % лакму-

сової настойки та ідентичну кількість 10 % розчину бікарбонату натрію, щоб піна

молока набула синьо-фіолетового відтінку. При підлужуванні молока воно стає

синьо-фіолетовим, при підкислюванні – рожевим аж до червоного.

Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою бактеріофагів

Бактеріофаги мають виражену літичну дію на мікроорганізми. Цю особливість

використовують для визначення їх виду. З цією метою у дві пробірки з м’ясо-

Частина І. Загальна мікробіологія

пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з

них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при опти-

мальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в конт-

рольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів

до літичної дії бактеріофагів.

Можна з цією метою використати щільне живильне середовище, на яке газо-

ном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них

бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповід-

ного розведення бактеріофагу, яке вказане на ампулі. Посіви інкубують в термо-

статі при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям,

які свідчать про літичну дію бактеріофагу. Позитивний результат свідчить про

належність бактерій до певного виду.

Фаготипування мікроорганізмів проводять з метою аналізу епідеміологіч-

ної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при

діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для

цього дно чашки з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на

квадрати. Вирощують чотиригодинну бульйонну культуру досліджуваного штаму

і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по

поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті

при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню агару в кожний квадрат капають піпет-

кою бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або зали-

шають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють ре-

зультати. Облік результатів проводять на темному фоні за допомогою лупи. За-

лежно від ступеня чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені

лізису бактерій, який оцінюється за чотириплюсовою системою: від лізису, який

зливається до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фагу є достатньо постійною озна-

кою, порівнюють фаготиии досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який

було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігу роблять висновок

про виявлене джерело інфекції.

Визначення бактеріоциногенності мікроорганізмів

Бактеріоцини є речовинами антибіотичної природи, які продукуються різни-

ми бактеріями. Вони мають досить вузький спектр протимікробної дії, спрямова-

ний проти філогенетично близьких збудників. Цей тест використовують з епідемі-

ологічною метою для виявлення джерела інфекції, а також для ідентифікації пев-

них груп бактерій.

Для визначення бактеріоциноварів на поверхню агару в чашці Петрі у виг-

ляді смужки по діаметру засівають бактеріологічною петлею культуру збудника.

Чашку інкубують у термостаті при оптимальній температурі протягом 24-48 год,

потім мікроорганізми вбивають за допомогою УФВ або парів хлороформу. Куль-

туру обережно знімають з поверхні агару за допомогою шліфувального скла, і до

Розділ 4. Фізіологія бактерій

неї перпендикулярно штрихами бактеріологічною петлею підсівають 4-годинні

бульйонні культури індикаторних штамів. Після 18-24-годинної інкубації при опти-

мальній температурі оцінюють чутливість індикаторних штамів до бактеріоцинів

за величиною зон затримки росту. Такий підхід дозволяє визначити бактеріо-

цинотип досліджуваних мікроорганізмів.

Для визначення чутливості досліджуваного штаму до певних бактеріоцинів

у щільне живильне середовище уколом засівають індикаторні бактерії, які проду-

кують певні типи бактеріоцинів. Після інкубування в термостаті мікроби, які ви-

росли, інактивують за допомогою парів хлороформу або ультрафіолетового опро-

мінення. Потім на поверхню чашки заливають розтоплений і охолоджений до 45°С

МПА, змішаний з 0,2 мл 4-годинної бульйонної культури досліджуваного штаму.

Після того, як агар застигне, чашку знову поміщають у термостат і інкубують при

оптимальній температурі протягом доби. За діаметрами зон затримки росту куль-

тури оцінюють чутливість її до бактеріоцинів.

Молекулярно-генетичні методи

Для виявлення та ідентифікації бактерій, вірусів, грибів і найпростіших

останнім часом почали широко використовувати молекулярно-генетичні методи.

Реакція гібридизації ДНК і РНК (реакція генних зондів). Послідовність нук-

леотидів ДНК і РНК є унікальною для геномів всіх мікроорганізмів. Будь-яку ділян-

ку нуклеїнової кислоти можна визначити за допомогою комплементарної копії

ДНК чи РНК, міченої ферментом або радіоактивною міткою (ДНК- і РНК-зонди).

Такі зонди отримані для більшості патогенних бактерій і вірусів. За їх допомогою

проводять ідентифікацію ДНК або РНК збудників бактеріальних і вірусних

інфекцій у клінічному матеріалі. Реакція молекулярної гібридизації є дуже чутли-

вою і високоспецифічною. Вона дає змогу виявляти ДНК або РНК в дуже малих

кількостях (1-10 пг).

Методика реакції генних зондів зводиться до того, що виділені з патологіч-

ного матеріалу ДНК або РНК збудників денатурують і наносять на спеціальні мем-

брани з нітроцелюлози. Після чого вносять ДНК- або РНК-зонди, витримують

певний час, роблять багаторазову промивку, щоб видалити реагенти, що не проре-

агували. Якщо використовували зонди з радіоактивною міткою, результат визначають

за допомогою γ-лічильника. У випадку, коли зонд мічений ферментом (наприк-

лад, пероксидазою), то до такого зонда додають субстрат (наприклад, ортофеніл-

діамін). Ферментація субстрату призводить до зміни кольору, який можна спосте-

рігати неозброєним оком.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – один із найновіших методів вияв-

лення та ідентифікації бактерій і вірусів у досліджуваних матеріалах. Принцип

реакції базується на багаточисленному копіюванні (селективній ампліфікації) до-

сліджуваної ДНК ферментом ДНК-полімеразою. Утворені копії ДНК ідентифіку-

ють за допомогою методу електрофорезу.

Реакцію проводять в три етапи. На першому етапі при температурі 95 °С про-

ходить денатурація двониткової молекули ДНК, її розплетення і розходження ниток.

Частина І. Загальна мікробіологія

На другому етапі (ренатурація) відбувається гібридизація праймерів, тобто

утворення дволанцюгових комплексів праймер-матриці, які необхідні для ініцію-

вання синтезу ДНК. Температура суміші при цьому знижується до 55 °С.

На етапі синтезу (75 °С) проходить подовження комплементарних ниток ДНК

за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Проводять 15-35 циклів синтезу.

Багаторазове повторення приводить до збагачення ДНК у досліджуваному

матеріалі.

Метод ПЛР дуже чутливий. Його використовують для виявлення будь-якого

інфекційного агента, якщо відома нуклеотидна послідовність гена (або його фрагмен-

та), специфічного виключно до даного збудника. Доцільно використовувати ПЛР у

тих випадках, коли бактерії чи віруси мають високу мінливість і знаходяться у до-

сліджуваному матеріалі в малій кількості (навіть одна молекула геномної ДНК).

Зараз ПЛР належить до високоефективного молекулярно-генетичного методу,

який доступний багатьом лабораторіям. Тривалість дослідження становить 2-3

години. Особливо доцільно використовувати його при визначенні та ідентифікації

збудників туберкульозу, сифілісу, гонореї, мікоплази, вірусів СНІДу, герпесів, ге-

патитів, рота- та ентеровірусів.

Розділ 5

ЕКОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Живий мікросвіт людини і нашого довкілля зазнав великих змін. Продов-

жується інтенсивна мікробна корозія землі, колонізація різних об’єктів зовнішнь-

ого середовища й харчових продуктів зміненими бактеріями, грибами, вірусами.

З року в рік зростають носійство патогенних бактерій серед медичного персоналу

та різноманітні дисбактеріози відносно здорових і хворих людей. Все частіше

виникають шпитальні інфекції, спричинені патогенними й умовно-патогенними

мікроорганізмами. Все це вимагає розробки нових і вдосконалення існуючих ме-

тодів лабораторного дослідження мікрофлори води, повітря, грунту, інших об’єктів

оточуючого середовища, харчових продуктів. Важливого значення набуває визна-

чення дисбактеріозів людини, носійства золотистих стафілококів, менінгококів,

збудників дифтерії, холери, черевного тифу, дизентерії. Лікар будь-якого профілю

повинен знати, як правильно взяти досліджуваний матеріал, доставити його до

профільної лабораторії, провести мікробіологічне дослідження, правильно оці-

нювати його результати.

Мікробіологічне дослідження води

Мета проведення санітарно-мікробіологічного дослідження води може бути

різною:

1. Вибір джерела водопостачання.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

2. Контроль знезараження питної води центрального водопостачання.

3. Визначення придатності для вживання криничної й джерельної води.

4. Перевірка якості і ступеня очищення стічних вод.

5. Розслідування водних спалахів інфекційних хвороб.

6. Контроль знезараження води плавальних басейнів.

7. Спостереження за санітарно-епідеміологічним станом відкритих водоймищ.

Санітарно-мікробіологічне дослідження води, перш за все, повинно вирішу-

вати питання про наявність або відсутнісфть у ній патогенних бактерій, вірусів і

грибів. Але їх безпосереднє виявлення має ряд методичних труднощів. У зв’язку з

цим широкого розповсюдження набули методи непрямої оцінки її епідеміологіч-

ного благополуччя шляхом виявлення так званих санітарно-показових мікроор-

ганізмів і визначення загального мікробного числа (ЗМЧ).

Основним джерелом збудників заразних хвороб є люди й теплокровні твари-

ни, які виділяють їх в оточуюче середовище фекальним або повітряно-краплин-

ним шляхом разом з численними представниками нормальної мікрофлори кишеч-

ника й верхніх дихальних шляхів. Тому санітарно-показові мікроорганізми для

різних об’єктів довкілля відібрані саме з представників нормальної мікрофлори.

Для води такими санітарно-показовими мікроорганізмами в усіх лабораторіях світу

прийняті бактерії групи кишкової палички (БГКП).

До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що об’єднує

роди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові, оксидазо-

негативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37 °С.

Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокров-

них тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому

чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відпо-

відними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній – фе-

кальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44,5 °С. До E. coli

відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником

свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S. fae-

calis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

При повноцінному санітарно-мікробіологічному дослідженні води визнача-

ють ЗМЧ, БГКП, E. coli, ентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (хо-

лерні вібріони, сальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають

500 см

води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевою пробкою, покритою

зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з водопровідних кранів проводять після

обпалювання їх спиртовим факелом і наступного випускання води протягом 10 хв.

Проби хлорованої води беруть у флакони з дехлоратором (на 500 см

води 2 см

1,5 % розчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Якщо дослідження проводять на виявлення не лише індикаторних, а й пато-

генних мікроорганізмів, потрібно брати пробу об’ємом 2500 см

води. Коли виз-

начають ще й індекс коліфагів об’єм проби збільшують до 3500 см

Частина І. Загальна мікробіологія

У відкритих водоймах проби беруть за допомогою бато-

метра. Цей прилад має металевий каркас із масивним дном-

грузилом, всередині якого вміщують стерильний флакон, за-

критий гумовим або скляним притертим корком (рис. 24).

На потрібній глибині корок відкривають, потягнувши за

шнур. Після заповнення флакона його відпускають, завдяки

чому ємність автоматично закривається. Після виймання фла-

кона з батометра притертий корок замінюють ватно-марле-

вою пробкою. Як правило, пробу води беруть на глибині 15 см,

але не ближче як за 10-15 см від дна водойми.

На флакон із відібраною водою наклеюють етикетку, на

якій вказують місце взяття проби, її номер, дату і час, темпе-

ратуру води й повітря, прізвище санітарного лікаря чи його

помічника, мету дослідження й адресу лабораторії, яка буде

проводити аналіз.

Мікробіологічне дослідження води необхідно провести

не пізніше 2 год після її відбору. Якщо це неможливо, вказа-

ний строк може бути продовжений до 6 год, але при умові

транспортування проби при температурі 1-5 °С, що досяга-

ють за допомогою пакетів з теплою водою взимку і льоду –

влітку. Після доставки проб до лабораторії негайно проводять дослідження, яке

включає визначення загального мікробного числа в 1 см

води, числа бактерій

групи кишкових паличок у 1 дм

(індекс БГКП), число термостабільних кишко-

вих паличок (фекальних коліформ – індекс ФК) у 100 см

, число патогенних мікро-

організмів у 1 дм

, число коліфагів у 1 дм

води, що досліджується.

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає

кількість мезофільних, мезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які ви-

ростають на МПА при 37 °С протягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного

бактерійного забруднення воду сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках

виростало від 30 до 300 колоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду

сіють у нерозведеному стані в об’ємі 1 см

. Проби з відкритих водойм, криниць,

джерел і т.п. сіють після попереднього їх розведення від 10

-1

до 10

-3

і більше (особ-

ливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної води, в

першу з них вносять 1 см

досліджуваної води, ретельно перемішують, із цієї про-

бірки переносять 1 см

у другу, потім у третю і всі наступні по 1 см

попереднього

розведення. Для виготовлення кожного розведення необхідно брати нову стериль-

ну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в об’ємі 1 см

вносять, рівномірно розкапую-

чи, на дно стерильної чашки Петрі, потім заливають її 10-12 см

розтопленого й

охолодженого до 45 °С м’ясо-пептонного агару. Обережними круговими рухами

змішують воду з агаром. Як правило, сіють не менше двох розведень і для кожно-

го з них використовують дві чашки. Після застигання середовища посіви вирощу-

ють у термостаті при 37 °С протягом 24 год. Через добу підраховують число коло-

Рис. 24. Батометр:

а – стерильний

флакон; б – пробка;

в – шнур для відкри-

вання флакона; г –

грузило; д – шнур для

опускання приладу.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

ній у двох чашках і знаходять середнє арифметичне. При значній кількості ко-

лоній підрахунки проводять за допомогою спеціального приладу АПК (апарат для

підрахунку колоній). Методика користування ним регламентована спеціальною

інструкцією.

Відповідно до існуючих вимог звичайна водопровідна вода може містити не

більше 100 мікробів. ЗМЧ відкритих водойм і криничної води не повинно переви-

щувати 1000.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок. Цей показник

(індекс БГКП) визначають за допомогою методу мембранних фільтрів і бродиль-

них проб. Мікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембран-

них фільтрів. Він значно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. Суть методу полягає в концентруванні бак-

терій з певного об’єму досліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні

на середовищі Ендо при 37 °С і підрахунку індексу БГКП в 1 дм

води.

При аналізі водопровідної води необхідно фільтрувати не менш як 333 см

При дослідженні води невідомої якості слід фільтрувати менші об’єми: наприк-

лад, 3, 30, 100, 200 см

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні фільтри під 6 номерами:

чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для дослідження води викорис-

товують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до 80°С дистильовану воду і

ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кип’ятять тричі по 15 хв, кожного разу

замінюючи воду. Після останнього кип’ятіння воду не зливають, фільтри залиша-

ють в ній до вживання.

Для фільтрування води використовують апарат Зейтца або прилад Рубльовсь-

кої водопровідної станції (рис. 25).

Прилади обтирають ватним тампоном, змоченим у

спирті, і фламбірують. Після охолодження їх монтують

на колбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик)

кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний

фільтр, притискають його верхньою частиною приладу

(стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаче-

ним конструкцією. У воронку (стакан), дотримуючись

правил асептики, наливають досліджуваний об’єм води

й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у

колбі Бунзена. Після закінчення фільтрування знімають

воронку (стакан), мембранний фільтр беруть обпаленим

на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так,

щоб між агаром і фільтром не було бульбашок повітря. В

одній чашці Петрі можна розмістити 3-4 фільтри. Чашки

з фільтрами на середовищі Ендо поміщають у термостат

догори дном, інкубують при 37 °С протягом 18-24 год.

Облік результатів проводять через добу. При відсут-

ності будь-яких колоній або при рості лише плівчастих,

Рис. 25. Прилади для

фільтрування води:

а – Рубльовської водо-

провідної станції;

б – апарат Зейтца.

Частина І. Загальна мікробіологія

зубчастих та інших колоній, не властивих для ешерихій, видають негативний ре-

зультат. Якщо виростають типові для коліформних бактерій колонії, з них виго-

товляють мазки. У випадках виявлення грамнегативних паличок залишок колонії

пересівають у глюкозо-пептонне середовище й при позитивній бродильній пробі

присутність БГКП вважають доказаною. Дослідження закінчують постановкою

проби на оксидазу. Для цього знімають фільтр і кладуть його колоніями на фільтру-

вальний папір, змочений реактивом на виявлення оксидазної активності. При на-

явності оксидази колонії забарвлюються у синій колір. Коліформні бактерії не

утворюють оксидази.

Результат дослідження виражають у вигляді індексу БГКП, тобто кількості

бактерій групи кишкових паличок у 1 дм

води. Його вираховують так: кількість

колоній БГКП, що виросли після посіву певної кількості води, множать на 1000 і

ділять на даний об’єм води. Наприклад: при посіві 333 см

води не виросло жод-

ної колонії – (1×1000) : 333 = 3, індекс БГКП менше 3; при посіві трьох об’ємів

води по 100 см

на одному фільтрі виросло три колонії коліформних бактерій,

індекс БГКП = (3×1000) : 300 = 10.

Питна вода відповідає вимогам стандарту, якщо індекс БГКП не перевищує 3.

Бродильний метод. Суть методу полягає в посіві певних об’ємів води й підро-

щуванні при 37 °С у середовищі нагромадження з наступним висівом на агар Ендо,

диференціюванні бактерій, що виросли, та визначенні індексу БГКП за таблицями.

При дослідженні водопровідної води сіють три об’єми по 100 см

, три об’єми

по 10 см

і три об’єми по 1 см

. При аналізі на етапах очищення і знезараження

засівають 100, 10, 1,0 і 0,1 см

води. Вказані об’єми вносять у флакони й пробірки

з глюкозо-пептонним або лактозо-пептонним середовищем із поплавками. Посіви

100 і 10 см

води проводять у флакони й пробірки відповідно з 10 і 1,0 см

концен-

трованого середовища (на 1000 см

дистильованої води 100 г пептону, 50 г глюко-

зи, 50 г хлориду натрію, 100 см

індикатора Андреде). Проби по 1,0 і 0,1 см

води

сіють у пробірки, що містять 10 см

середовища нормальної концентрації (на 1000

см

дистильованої води 10 г пептону, 5 г глюкози, 5 г хлориду натрію, 10 см

інди-

катора Андреде). Посіви інкубують 24 год при 37 °С.

Із кожного флакона чи пробірки, де відмічено помутніння, кислоту й газ, або

помутніння й кислоту, роблять висів на середовище Ендо. При відсутності росту

або при наявності плівчастих, губчастих пліснявих та інших колоній, не характер-

них для колоній E.coli, видають негативний результат. Якщо ж на середовищі Ендо

виростають темно-червоні колонії з металевим блиском або без нього, їх належність

до БГКП підтверджують за допомогою мікроскопії, посіву на середовище Ольке-

ницького та проби на оксидазу. Наявність грамнегативних паличок у мазках і не-

гативний оксидазний тест дають право негайно видати відповідь про наявність

бактерій групи кишкових паличок.

Результат аналізу оцінюють у вигляді індексу БГКП і колі-титру за таблиця-

ми 5 і 6.

При виявленні мікробного забруднення вищедопустимих норм потрібно про-

водити повторний відбір проб і досліджувати їх на наявність термостабільних

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Таблиця 5

Визначення індексу БГКП при посіві 333 см

води

Кількість позитивних результатів аналізу води з:

трьох флаконів

по 100 см

трьох пробірок

по 10 см

трьох пробірок

по 1 см

Індекс БГКП

(колі-індекс)

Колі-титр

< 3

120

150

210

240

460

1100

> 1100

> 333

333

250

143

111

0,9

> 0,9

Таблиця 6

Визначення індексу БГКП на етапах очищення

Об’єм досліджуваної води, см

100 10 1,0 0,1

Індекс БГКП

(колі-індекс)

Колі-титр

–

< 9

230

960

2380

> 2380

> 111

111

105

0,4

< 0,4

Частина І. Загальна мікробіологія

кишкових паличок (фекальних коліформ – ФК). Індекс ФК визначають у 100 см

води як методом мембранних фільтрів, так і бродильними пробами.

Для цього через мембранний фільтр пропускають 100 см

води й після інку-

бації при 37 °С типові темно-червоні колонії пересівають у лактозо-пептонне се-

редовище з борною кислотою (3,2 г на 1 дм

). Засіяні пробірки інкубують 24 год

при 43 °С. Наявність помутніння і газу вказує на присутність у воді бактерій –

показників свіжого фекального забруднення. Ознаки росту (помутніння) без утво-

рення газу до уваги не беруть.

Таким же способом визначають свіже фекальне забруднення й бродильним

методом, пересіваючи темно-червоні колонії з агару Ендо в лактозо-пептонне се-

редовище з інгібітором росту сторонньої мікрофлори.

При значному погіршенні санітарно-бактеріологічних показників води, а та-

кож при загрозливій епідеміологічній ситуації проводять дослідження води на

виявлення патогенних мікроорганізмів. Методи таких аналізів викладені у відпо-

відних розділах спеціальної мікробіології.

Дослідження на виявлення фагів кишкових паличок проводять у випадках,

якщо індекси БГКП і ФК перевищують допустимі нормативи або підозрюють за-

бруднення води патогенними ентеровірусами. Коліфаги відповідають вимогам,

що пред’являються до санітарно-показових мікроорганізмів: їх розміри, будова,

властивості, джерело надходження, терміни виживання такі ж як і у патогенних

ентеровірусів. Окрім того, вони не шкідливі для людини.

При дослідженні на коліфаги найчастіше використовують метод агарових

шарів. Напередодні аналізу в стерильні чашки Петрі розливають по 25-30 см

1,5 %

МПА, підсушують під листками стерильного паперу протягом 60 хв, потім закри-

вають кришками й залишають на ніч при кімнатній температурі в перевернутому

вигляді.

До проб води об’ємом 10 см

для звільнення від бактеріальної мікрофлори

додають 1-2 см

хлороформу, струшують і залишають на 15 хв. Для дослідження

беруть воду над хлороформом. Оброблену воду наносять по 1 см

на поверхню

агару в трьох чашках Петрі.

Заздалегідь розлитий у пробірки 0,8 % МПА в кількості 3 см

розплавляють,

охолоджують до 46-48°С, додають 0,1-0,2 см

суспензії 18 год культури E.coli (полі-

лізабельний штам), ретельно перемішують і виливають на агар із пробою води.

Суміш залишають на 30 хв для застигання. Потім чашки в перевернутому вигляді

інкубують 18-24 год при 37 °С.

Облік результатів проводять, підраховуючи число бляшкоутворюючих оди-

ниць (БУО), і перераховують на 1дм

досліджуваної води. Для слабозабруднених

вод використовують метод збагачення або осадження сіллю магнію. Індекс колі-

фагів також вираховують за спеціальною таблицею.

У 1996 р. МОЗ України видало наказ №383 про затвердження державних са-

нітарних правил і норм “Гігієнічні вимоги до якості води централізованого госпо-

дарсько-питного водопостачання”. У ньому визначені основні мікробіологічні

нормативи (табл. 7).

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Дослідження мікрофлори повітря

В атмосферному повітрі можуть знаходитись десятки й сотні видів сапрофіт-

них мікроорганізмів. Серед них регулярно виявляють стафілококи, мікрококи,

сарцини, спороносні палички, актиноміцети, віруси. Вони потрапляють у повітря

з грунту, води, рослин, тварин, харчових продуктів і відходів деяких виробництв.

Мікрофлору атмосферного повітря досліджують рідко, в основному, за несприят-

ливих епідеміологічних ситуацій. У повітрі закритих приміщень, особливо лікар-

няних, поряд із нешкідливими сапрофітами можуть виявляти й патогенні мікро-

організми: збудники дифтерії, скарлатини, менінгіту, коклюшу, туберкульозу, віруси

грипу, парагрипу, кору та ін. Санітарно-показовими бактеріями для повітря закри-

тих приміщень є золотисті стафілококи, альфа- і бета-гемолітичні стрептококи.

Для повсякденної санітарно-гігієнічної оцінки повітря лікарняних приміщень

визначають такі показники:

1. Загальна кількість мікробів у 1 м

повітря.

2. Кількість у 1 м

санітарно-показових бактерій.

За цими показниками визначають ступінь бактерійного забруднення повітря-

ного середовища. Виявлення золотистих стафілококів і гемолітичних стрептококів

вище допустимих нормативів свідчить про епідеміологічне неблагополуччя дослі-

джуваного об’єкта.

Бактеріологічні лабораторії санітарно-епідеміологічних станцій у планово-

му порядку проводять мікробіологічні дослідження таких приміщень як операційні,

реанімаційні й перев’язувальні відділення хірургічних і дитячих стаціонарів, по-

логових будинків, станцій переливання крові, аптек, дитячих садків, ясел, шкіл,

кінотеатрів тощо.

При проведенні мікробіологічних досліджень повітря використовують седи-

ментаційний, аспіраційний і фільтраційний методи.

Седиментаційний метод Коха. Цей метод оснований на принципі осадження

мікробів. Дві чашки Петрі з МПА або спеціальним агаром для гемолітичних стреп-

Таблиця 7

Мікробіологічні показники безпеки питної води

Примітки: КУО – колонієутворюючі одиниці (мікроорганізми);

БУО – бляшкоутворюючі одиниці (віруси).

№ Найменування показників Одиниці виміру Нормативи

1 Число бактерій в 1 см

води (ЗМЧ) КУО / см

не більше 100

2 Число бактерій групи кишкових паличок

в 1 дм

води (індекс БГКП)

КУО / дм

не більше 3

3 Число термостабільних кишкових паличок

в 100 см

води (індекс ФК)

КУО / 100 см

відсутність

4 Число патогенних мікроорганізмів

у 1 дм

води

КУО / дм

відсутність

5 Число коліфагів у 1 дм

води БУО / дм

відсутність

Частина І. Загальна мікробіологія

тококів (середовище Гарро) чи жовтково-сольовим агаром (ЖСА) для золотистих

стафілококів відкривають і встановлюють на горизонтальній поверхні в місці взяття

проби. Залежно від мікробного забруднення повітря експозиція чашок продов-

жується від 5-10 хв, при великій кількості бактерій, до 20-40 хв – при малій. Чаш-

ки закривають, інкубують 24 год при 37 °С і ще добу при кімнатній температурі.

Для визначення загального мікробного числа повітря в 1м

підраховують

кількість всіх колоній на МПА в обох чашках і знаходять середнє арифметичне.

За даними Омелянського на поверхню в 100 см

за 5 хв осідає стільки бактерій,

скільки їх міститься в 10 дм

повітря. Наприклад, на чашці з агаром після 5 хв

експозиції виросло 33 колонії. Площа стандартної чашки Петрі складає біля 66 см

На 100 см

агару виросло б 33 × 100 : 66 = 50 колоній, тобто та кількість мікробів,

що міститься в 10 дм

повітря. Отже, в 1 м

їх буде 50 х 1000 : 10 = 5000.

Ретельна перевірка багатьох показників, вирахуваних за формулою Омелянсь-

кого, виявила, що вони втричі менші від чисел, отриманих більш точними метода-

ми дослідження мікрофлори повітря за допомогою спеціальних апаратів. У зв’яз-

ку з цим метод Коха використовують для орієнтовного визначення мікробного

забруднення, але він дає хороші результати при порівняльному дослідженні мікро-

флори різних лікарняних приміщень.

При перегляді чашок Петрі з елективними середовищами звертають увагу на

колонії, характерні для бактерій, що ростуть саме на даному живильному середо-

вищі. Наприклад, на агарі Гарро підраховують колонії альфа- і бета-гемолітичних

стрептококів, на ЖСА – колонії золотистих стафілококів. Типові колонії мікро-

скопують, виділяють чисті культури, ідентифікують їх до виду і лише після цього

вираховують кількість тих чи інших видів бактерій. Це роблять тоді, коли визна-

чають седіментаційним методом кількість санітарно-показових мікроорганізмів у

1 м

повітря.

Аспіраційний метод Кротова. Він грунтується на ударній дії повітряного

струменя об поверхню живильного середовища й прилипанні до нього бактерій.

Дослідження проводять за допомогою апарата Кротова (рис. 26), який може влов-

лювати високодисперсні фази мікробного

аерозолю.

Апарат складається з пристрою для

відбору проб повітря, ротаметра, який регу-

лює швидкість і кількість всмоктуваного

повітря та електродвигуна. Прилад включа-

ють у електромережу, знімають кришку, на

спеціальний диск закріплюють відкриту

чашку Петрі з живильним середовищем. Ру-

кою надають їй інерційного руху за годин-

никовою стрілкою, закривають кришку апа-

рата і включають двигун. Чашка обертаєть-

ся з постійною швидкістю 60 об/хв. Повітря

із заданою швидкістю втягується через кли-

Рис. 26. Апарат Кротова.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

ноподібну щілину плексигласової пластини, що закриває чашку Петрі з агаром.

При цьому частинки аерозолю з мікроорганізмами рівномірно прилипають до

живильного середовища. При дослідженні загального мікробного числа пропус-

кають, як правило, 100 дм

повітря зі швидкістю 25 дм

/хв. Якщо визначають

кількість індикаторних бактерій (золотисті стафілококи, альфа- і бета-гемолітичні

стрептококи) об’єм досліджуваного повітря збільшують до 300-500 дм

. Після

взяття проби чашку з посівом повітря знімають, закривають її й інкубують 18-24 год

при 37 °С і ще 24 год при кімнатній температурі.

Розрахунок загального мікробного числа проводять за формулою:

1000a

де а – кількість колоній, що виросли в чашці Петрі,

V– об’єм пропущеного через прибор повітря в дм

1000 – заданий об’єм повітря для визначення ЗМЧ.

Приклад розрахунку: через прилад пропущено 100 дм

повітря; число колоній,

що виросли – 370. Отже, кількість мікроорганізмів у 1 м

повітря буде дорівнювати:

3700

100

1000370

X =

= .

Фільтраційний метод. Для його використання запропоновані спеціальні

прилади: Дяконова, Речменського, Кіктенко, ПАБ-1, ПОВ-1 та ін. Принцип їх дії

зводиться до пропускання певного об’єму повітря через рідину в приладі (або

фільтр) з наступним висівом мірної кількості її на живильні середовища. При засто-

суванні фільтрів їх накладають на щільне живильне середовище. Підраховують

число колоній, що виросли, та проводять відповідні перерахунки на весь об’єм

рідини в приладі й визначають число мікроорганізмів у 1 м

повітря.

За допомогою цього методу можна провести дослідження повітря на при-

сутність і тих патогенних мікроорганізмів, які не культивуються на живильних

середовищах. Рідину, що поглинула бактерійні аерозолі повітря, можна викорис-

тати для зараження лабораторних тварин або проведення спеціальних бактеріо-

логічних та вірусологічних досліджень.

Безпосереднє виявлення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів

(стафілококи, стрептококи, псевдомонади, інші грамнегативні бактерії), які вик-

ликають шпитальні інфекції, проводять при аналізі повітря хірургічних, акушерсь-

ко-гінекологічних та інших стаціонарів.

При виникненні внутрішньолікарняних інфекцій, спричинених стафілокока-

ми, проводять дослідження на виявлення джерела й шляхів їх розповсюдження.

При цьому визначають ідентичність культур, виділених із повітря, інших об’єктів

оточуючого середовища, а також від хворих і медичного персоналу за допомогою

фаготипування.

Державні стандарти для оцінки санітарно-бактеріологічних показників по-

вітря ще нерозроблені. Запропоновані лише тимчасові положення про допустиме

нормування мікробного забруднення окремих лікарняних та інших приміщень.

Частина І. Загальна мікробіологія

Так, у повітрі операційних, родильних залів, реанімаційних, перев’язувальних і

процедурних загальна кількість бактерій в 1 м

до роботи не повинна перебільшу-

вати 500, після роботи – 1000; кількість S.aureus не більше 4, а гемолітичних стреп-

тококів взагалі не повинно бути. У повітрі лікарняних палат взимку ЗМЧ не по-

винно перевищувати 3500, S.aureus – до 24, а гемолітичних стрептококів не більше

24. Влітку ці показники не повинні перевищувати відповідно 5000, 52 і 36.

Мікробіологічне дослідження грунту

Грунт є основним вмістилищем мікробного світу й головною ареною його

життєдіяльності. Мікробіоценози цього природного середовища включають сотні

й тисячі видів бактерій, грибів, найпростіших, мікоплазм і вірусів. Вони відігра-

ють велику роль у процесах формування й самоочищення грунтів, а також у кру-

гообізі речовин у природі. Один грам орної землі містить від 1 до 10 млрд бак-

терій. На площі в 1 га в грунті може знаходитись від 1 до 5 т мікробної маси.

Санітарно-показовими мікроорганізмами грунту є бактерії групи кишкової

палички, ентерококи, Clоstridium perfringens і термофільні мікроби.

Представники нормальної мікрофлори людей і тварин, а також патогенні

мікроорганізми, що потрапили в грунт, як правило, довго в ньому не виживають.

У той же час, грунт відіграє основну роль в епідеміології правця, ботулізму та

газової гангрени (особливо під час воєн), оскільки він є основним резервуаром

збудників цих захворювань.

При вирішенні питання про роль грунту в передачі інфекційних хвороб важли-

во знати тривалість зберігання й розмноження в ньому окремих патогенів (табл.8).

Необхідність досліджувати мікрофлору грунту виникає при проведенні пла-

нування й забудови населених пунктів, санаторіїв, дитячих площадок, таборів

відпочинку, пляжів, полів зрошування тощо. Залежно від завдань і мети дослід-

ження проводять короткий або повний санітарно-мікробіологічний аналіз, а та-

кож виявлення патогенних бактерій і вірусів. Вибір місця відбору проб грунту

визначають санітарний лікар і бактеріолог.

При короткому аналізі встановлюють загальну кількість мікробів (ЗМЧ), число

бактерій групи кишкових паличок (титр БГКП), титри ентерококів, C.perfringens і

Таблиця 8

Патогенні мікроорганізми, що виявляються в грунті

Мікроби, що потрапляють у грунт із виділеннями

людей і тварин

Мікроби, для яких

грунт є природним

середовищем

зберігаються довго зберігаються порівняно недовго

Clostridium botulinum

Actinomyces spp

Fungi spp

Bacillus anthracis

Clostridium tetani

Clostridium spp

Salmonella

Shigella, Vibrio

Brucella, Francicella

Mycobacterium

Leptospira, Pseudomonas

Enterovirus

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

термофільних мікроорганізмів. При повному аналізі, крім названих показників,

визначають ще загальне число і процент спор, кількість актиноміцетів, грибів,

аеробних целюльозних і амоніфікуючих бактерій. За певних епідеміологічних

ситуацій необхідно виявляти й патогенні мікроорганізми (табл. 8).

Відбір проб грунту проводять у 4-5 точках вибраної ділянки на глибині

10-15 см. Лопатою викопують ямки глибиною 20 см. Над однією з бокових стінок

ямки за допомогою пропаленого на вогні ножа зрізають верхній шар грунту. В

стерильну банку беруть по 200-300 г із кожної точки, змішують, відбирають наваж-

ку в 30 г і вносять у колбу, що містить 300 см

стерильної води. Суміш ретельно

збовтують протягом 10 хв, потім відстоюють 2-3 хв для осідання грубих частинок.

При необхідності брати пробу з глибших шарів грунту використовують спеці-

альний земляний бур Некрасова, який дає змогу відбирати проби на заданій глибині.

Із отриманої суспензії готують серійні десятикратні розведення від 10

-1

до

-6

і більше. По 1 см

із останніх двох розведень вносять на дно двох стерильних

чашок Петрі й заливають 15 см

розтопленого й охолодженого до 45 °С МПА.

Після застигання середовища чашки інкубують 48 год при 28-30 °С. Із суми коло-

ній, що виросли на двох чашках одного розведення, вираховують середнє арифме-

тичне й визначають ЗМЧ. Наприклад: посіяно 1 см

суспензії грунту з розведення

; на чашці з агаром виросло в середньому 70 колоній; отже, ЗМЧ = 70×10

7×10

бактерій.

При визначенні титру БГКП по 1 см

різних розведень грунту засівають у

9 см

глюкозо-пептонного або лактозо-пептонного середовища. У разі розкладу

вказаних цукрів до кислоти й газу висів роблять на середовище Ендо, темно-чер-

воні колонії, що виросли, мікроскопують, ставлять пробу на оксидазу й вирахову-

ють титр БГКП так само, як і для води.

Титр ентерококів визначають шляхом посіву відповідних розведень на сере-

довище Каліни або ДІФ-3; перфрінгенс-титр вираховують посівом розведень сус-

пензії на середовище Вільсона-Блера; кількість грибів – на середовище Сабуро,

актиноміцетів – на крохмально-аміачний агар. Для визначення титру термофільних

бактерій різні розведення суспензії грунту вносять у чашки Петрі, заливають роз-

топленим і охолодженим МПА. Посіви інкубують 24 год при 60 °С, підраховують

кількість вирослих колоній і роблять перерахунок на 1 г грунту.

Оцінку ступеня забруднення грунту проводять шляхом визначення загально-

го мікробного числа й кількісного аналізу основних індикаторних мікроорганізмів

(табл. 9).

Таблиця 9

Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту

Характеристика грунту ЗМЧ Титр БГКП

Перфрінгенс-

титр

Кількість

термофільних

бактерій в 1 г

Чистий <5 · 10

1,0 і більше 0,01 і більше 10

-10

Помірно забруднений 5 · 10

0,9-0,01 0,009-0,0001 10

-10

Сильно забруднений >5 · 10

0,009 і менше 0,00009 і менше 10

-10

Частина І. Загальна мікробіологія

Мікробіологічні дослідження змивів із рук та предметів

У розповсюдженні бактеріальних і вірусних інфекцій певне значення мають

предмети побутової й виробничої обстановки, а також руки обслуговуючого пер-

соналу. Різноманітні види бактерій та вірусів можуть порівняно довго зберігатись

на поверхні шкіри рук і багатьох предметів (від 1 до 80 днів).

Визначення мікробного обсіменіння вказаних об’єктів проводять для оцінки

санітарно-гігієнічного стану лікувальних, профілактичних, дитячих і торгових

закладів, ресторанів, кафе, їдалень, буфетів тощо, а також встановлення шляхів

розповсюдження інфекційних захворювань.

Дослідження змивів із рук та предметів (столи, іграшки, м’який інвентар,

предмети кухонного вжитку та ін.) роблять за певними епідеміологічними пока-

заннями. У повсякденній роботі рідко проводять аналізи на безпосереднє вияв-

лення патогенних мікроорганізмів, оскільки вони мають ряд труднощів. Значно

частіше виявляють санітарно-показові бактерії: БГКП, стафілококи, ентерококи.

Змив проводять стерильним тампоном, вміщеним у пробірку з МПБ або глю-

козо-пептонним середовищем. Сухий тампон проштовхують до повного змочу-

вання у бульйоні, виймають і роблять змив. Спочатку протирають шкіру лівої,

потім правої руки в такій послідовності: тил кисті, долоня, міжпальцеві проміжки,

нігтьові ложа. Після закінчення змиву тампон знову занурюють у середовище.

Пробка при цьому стає на своє місце й закриває пробірку (рис. 27).

При проведенні змивів із предметів, що мають велику поверхню (столи, стіни,

дошки для обробки м’яса та інших продуктів), досліджувану ділянку обмежують

спеціальною рамкою-трафаретом, що має

площу 25, 50 або 100 см

(рис. 28). Цей

шаблон виготовляють із дроту, перед вжи-

ванням і після змиву його обпалюють на

вогні.

Для визначення загального мікробно-

го обсіменіння із пробірки після ретельно-

го віджимання тампону й перемішування

1 см

рідини вносять у стерильну чашку

Петрі, заливають 15 мл розтопленого й охо-

лодженого агару. Посіви інкубують 24 год

при 37 °С, підраховують число колоній, виз-

начають ЗМЧ. Для порівняльної оцінки

отриманих результатів бажано вести роз-

рахунки на 1 см

поверхні.

Визначення БГКП, стафілококів та

ентерококів (індикаторні мікроорганізми)

проводять шляхом посіву на елективні се-

редовища. Колонії підраховують та іденти-

фікують так само, як і при аналізі води.

Рис. 27. Тампони

для змивів.

Рис. 28. Шаблон

для змивів.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Мікробіологічні дослідження харчових продуктів

Харчові продукти – сприятливе середовище не тільки для збереження, але й

для розмноження сапрофітних, патогенних і умовно-патогенних бактерій. Серед

багатьох продуктів є такі, що містять так звану специфічну мікрофлору (молочно-

кислі бактерії, молочнокислі стрептококи, болгарська паличка, біфідобактерії,

дріжджі, кефірний грибок та ін.). Вона знаходиться в молочнокислих продуктах,

різних напоях і надає їм приємних смакових якостей (простокваша, кефір, кумис,

йогурт, пиво, квас, безалкогольні напої). У процесі бактеріологічного аналізу ця

мікрофлора не досліджується.

Окрім того, в багатьох продуктах можуть міститись аеробні й анаеробні мікро-

організми, або їх спори, що потрапили з навколишнього середовища. Вони скла-

дають неспецифічну мікрофлору, яка псує продукти, робить їх непридатними для

вживання, а часом спричиняє тяжкі захворювання, харчові токсикоінфекції й токси-

кози. Саме ці мікроорганізми та їх токсини виявляють при проведенні бактеріоло-

гічного контролю м’яса й м’ясних продуктів, риби й рибних продуктів, молока й

молочних продуктів, різноманітних консервів, напоїв тощо.

Санітарно-бактеріологічні дослідження харчових продуктів проводять з ме-

тою визначення ступеня мікробного обсіменіння (ЗМЧ), виявлення бактерій гру-

пи кишкових паличок (індекс і титр БГКП), ентерококів, стафілококів, деяких

клостридій та протею. За епідемічними показаннями досліджують і наявність

патогенних мікроорганізмів (сальмонел черевного тифу, паратифів, гострого гаст-

роентериту, шигел, холерних вібріонів, мікобактерій, збудників бруцельозу, боту-

лізму, ентеровірусів та ін.).

Молоко й молочні продукти.Санітарно-бактеріологічний стан молока оці-

нюють за мікробним числом, індексом БГКП, наявністю стафілококів та ентеро-

коків. Для визначення ЗМЧ пастеризованого молока його розводять від 10

-1

до 10

-3

і по 1 см

кожного розведення вносять у стерильні чашки Петрі й заливають розп-

лавленим і охолодженим до 45 °С агаром. Посіви інкубують при 37 °С протягом

доби, підраховують кількість колоній, роблять поправку на розведення й визнача-

ють ЗМЧ. Воно не повинно перевищувати 7,5×10

Для визначення титру БГКП нерозведене пастеризоване молоко засівають у

6 пробірок із середовищем Кесслера або глюкозо-пептонним середовищем за схе-

мою: в три пробірки вносять по 1 см

молока, в інші три – по 0,1 см

(1 см

молока,

розведеного в 10 разів стерильною водою). Посіви інкубують протягом 24 год при

43 °С, після чого з проб, що забродили, роблять висів на агар Ендо. З колоній

темно-червоного кольору виготовляють мазки, ставлять пробу на оксидазу, пере-

сівають у глюкозо-пептонне середовище й інкубують при 43 °С протягом доби.

При оцінці результатів враховують наявність у мазках грамнегативних пали-

чок, що не продукують оксидази, викликають бродіння глюкози до кислоти й газу.

Титр БГКП не повинен перевищувати 3. Аналогічним способом досліджують вер-

шки, молочнокислі продукти, морозиво, креми, дитячі молочні суміші тощо.

Частина І. Загальна мікробіологія

Виявлення стафілококів і ентерококів проводять так само, як і в воді. Пато-

генні бактерії виділяють шляхом посіву молока на відповідні елективні та дифе-

ренціально-діагностичні середовища з наступним виділенням чистих культур та

їх ідентифікації.

М’ясо й м’ясні продукти.Перш за все мікроскопічно визначають інтен-

сивність поверхневого обсіменіння м’яса в мазках-відбитках. Препарати готують

із шматочків м’яса розміром 2×2,5 см, забарвлюють за Грамом і мікроскопують.

М’ясо вважають свіжим, якщо в мазках немає, або в полі зору виявляють не більше

10 паличкоподібних бактерій. При сумнівній свіжості знаходять десятки коків і

до 30 паличок. Якщо в полі зору велика кількість бактерій і переважають палич-

коподібні форми – м’ясо оцінюють як несвіже.

При дослідженні ковбас, м’ясного фаршу, кулінарних виробів (котлети, бит-

ки та ін.) визначають загальне мікробне число, присутність БГКП, сальмонел,

протеїв, анаеробних клостридій.

Зрізану поверхню ковбаси припікають розжареним на вогні скальпелем, плівку

протирають спиртом, обпалюють і знімають. Стерильним скальпелем вирізають

дві наважки по 1-2 г із поверхні та глибини батона. Кожну наважку окремо вміщу-

ють у стерильну фарфорову ступку й емульгують із стерильним піском, добавля-

ючи стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію з таким розрахунком, щоб

отримати 10 % суспензію.

Для визначення ЗМЧ на дно стерильних чашок Петрі вносять по 0,1 см

сус-

пензії, заливають розплавленим і охолодженим до 45 °С МПА, інкубують протя-

гом 48 год при 37 °С. Підрахунок колоній і визначення кількості бактерій в 1 г

продукту проводять загальноприйнятим методом. За існуючими нормативами ЗМЧ

не повинно перевищувати 10

При дослідженні на виявлення БГКП 0,1 см

суспензії сіють на середовище

Ендо, ретельно розтираючи матеріал шпателем по всій поверхні агару, і вирощу-

ють 18-20 год при 37 °С. Підрахунок колоній, ідентифікацію бактерій та визна-

чення індексу БГКП проводять так само, як вище описано. При відсутності росту

колоній на середовищі Ендо відмічають, що при прямому посіві 0,01 г продукту

коліформні бактерії не виявлені.

Бактерії роду Proteus виділяють за методом Шукевича. Для виявлення сальмо-

нел, анаеробних клостридій та інших патогенних мікроорганізмів суспензію сіють

на відповідні елективні середовища, виділяють чисті культури та ідентифікують

їх за допомогою методик, що застосовуються для вивчення цих мікроорганізмів.

Риба і рибні продукти. М’ясо риб і рибні продукти контамінуються багать-

ма видами мікробів, що потрапляють із води, луски, кишок, різних предметів,

палуб та устаткування риболовецьких кораблів, а також із рук персоналу, який

обробляє та готує рибну продукцію. З епідеміологічної точки зору найнебезпеч-

нішими бактеріями є палички ботулізму, які зустрічаються в кишечнику риб, особ-

ливо осетрових, а також холерні й парагемолітичні вібріони та віруси гепатиту А.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Санітарно-бактеріологічні дослідження рибопродуктів проводять, як прави-

ло, при виникненні харчових токсикоінфекцій. Вони спрямовані на виявлення

патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів або їх токсинів.

Методики забору проб, проведення аналізу, виділення чистих культур аероб-

них і анаеробних бактерій та їх ідентифікація подібні до тих, які застосовуються

при дослідженні м’яса й м’ясних продуктів.

Консервовані продукти.Мікробіологічному контролю підлягають м’ясні,

рибні, овочеві та фруктові консерви. Їх досліджують на наявність БГКП, сальмо-

нел, стафілококів, аеробних і анаеробних спороносних мікробів. Найбільш небез-

печними є консерви домашнього виробництва, особливо виготовлені з грибів, які

часто є причиною виникнення ботулізму.

Безпосередньо перед проведенням аналізу для перевірки герметичності бан-

ки занурюють на 3-5 хв у нагріту воду (85 °С). Повітря всередині банок нагрівається,

розширяється і в разі негерметичності виходить назовні у вигляді бульбашок. При

порушенні герметичності консерви мікробіологічному дослідженню не підлягають.

Досліджувану банку миють гарячою водою з милом, витирають насухо, об-

тирають спиртом і верхню кришку обпалюють. Спеціальним пробійником проби-

вають кришку й скляною трубкою набирають матеріал для посіву. Для виділення

аеробних бактерій беруть не менше 1 г вмісту, а для анаеробних – 3-5 г.

Аеробні мікроорганізми виявляють шляхом посіву у 2 пробірки з 1 % цукро-

вим бульйоном, інкубують при 37 °С протягом 5-6 діб. При появі ознак росту ви-

готовляють мазки, пересівають на МПА, середовище Ендо та скошений агар (за

Шукевичем). Ідентифікацію чистих культур БГКП, сальмонел, протею проводять

так само, як і при дослідженні м’яса та м’ясних продуктів.

Для виявлення анаеробних бактерій досліджуваний матеріал сіють у дві про-

бірки з середовищем Кітта-Тароцці, одну з яких прогрівають 20 хв при 80 °С.

Після інкубації в термостаті культури мікроскопують і при виявленні в мазках

грампозитивних паличок зі спорами виділяють чисті культури за методом Вейн-

берга або Цейслера. При відсутності росту посіви витримують у термостаті про-

тягом 10 діб.

При дослідженні на наявність ботулінічного токсину проби консервів фільтру-

ють і з фільтратом ставлять реакцію нейтралізації токсину типовими антиботулі-

новими сироватками А, В, С, D, Е, F, G в біологічній пробі на білих мишах.

Ботулотоксин можна виявити й за допомогою фагоцитарного показника. У

пробірку вносять 1 об’єм 3 % розчину лимоннокислого натрію, 2 об’єми крові

кролика, 1 об’єм досліджуваного матеріалу, 1 об’єм добової культури стафілокока

209 Р, що містить 2 млрд мікробних тіл в 1 см

за оптичним стандартом. Інкубують

20 хв при 37 °С, після чого готують мазки, фіксують їх метиловим спиртом і за-

барвлюють азур-еозином. У мазку підраховують 50 лейкоцитів і число фагоцито-

ваних ними стафілококів, ділять кількість поглинених коків на 50 і вираховують

фагоцитарний показник. При наявності ботулінічного токсину фагоцитарний по-

казник зменшується в порівнянні з контролем, а антиботулінова сироватка певного

Частина І. Загальна мікробіологія

типу нейтралізує пригнічення фагоцитарного індексу. За типом протиботулінової

сироватки визначають тип токсину.

Дослідження мікрофлори людини

Організм людини населяють понад 500 видів бактерій, біля 50 видів вірусів і

понад 20 видів найпростіших. Загальна кількість мікроорганізмів досягає 10

що в 10 разів більше, ніж всіх клітин макроорганізму.

Нормальна мікрофлора людського тіла поділяється на дві групи:

1) постійна (резидентна), специфічна для даного біотопу (автохтонна);

2) тимчасова, занесена з інших біотопів хазяїна (алохтонна), або з оточуючо-

го середовища (заносна).

В різних ділянках тіла вона неоднакова, оскільки кожний біотоп характери-

зується своєрідними умовами для існування мікроорганізмів. Найбільше епідемі-

ологічне значення мають представники мікробних угруповань шкіри, верхніх ди-

хальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, сечо-статевих органів. Методи дос-

лідження мікрофлори різних біотопів значною мірою відрізняються між собою.

Дослідження мікрофлори людини проводять при діагностиці ендогенних інфекцій,

дисбактеріозів, бактеріоносійства, у космонавтів, членів екіпажів підводних човнів

та полярних експедицій для уникнення бактерійної несумісності.

Мікрофлора шкіри. Найбільш характерними мікробами шкіри є коринебак-

терії (Corynebacterium bovis, C.lipophylicum, C.minutissimum, C.pseudodiphthe-

riticum, C.xerosis); пропіонібактерії (Propionibacterium acnes, P.avidum, P.freuden-

reichii, P.granulatum); стафілококи (Staphylococcus epidermidis, S.saprophyticus,

S.capitis, S.cohnii); мікрококи (Micrococcus kristinae, M.luteus, M.varians); сарцини

(Sarcina maxima, S.ventriculi); актиноміцети (Actimomyces bolis, A. israelii); гриби

(Pityrosporum ovale, P.orbiculare). У окремих осіб зустрічаються дріжджоподібні

гриби Candida, Staphylococcus aureus, різні види стрептококів, анаеробні клост-

ридії. З епідеміологічної точки зору важливими біотопами є шкіра обличчя, пах-

винних ямок, промежини, молочних залоз породіль, місця операційних розрізів.

Матеріал для дослідження із здорової чи патологічно зміненої шкіри найчас-

тіше беруть стерильним ватним тампоном (див. змиви з рук). Він дає змогу прове-

сти лише якісний аналіз мікрофлори, що вегетує на поверхні шкіри.

Для більш точного дослідження мікрофлори шкіри використовують метод

змивів-зскрібок Вільямсона і Клігмана в модифікації С.І. Ситника. За допомогою

цього методу можна визначити абсолютне число мікроорганізмів на досліджу-

ваній ділянці шкіри. Для цього на поверхню шкіри прикладають і щільно притис-

кають стандартний стерильний скляний циліндр із шліфованими краями, площа

перерізу якого становить точно 1 см

, а висота 5 см. У нього вносять 1 см

0,1 %

розчину тритону Х-100 в 0,075 М фосфатному буфері рН 7,9. Потім в циліндр

опускають стерильний стальний робочий елемент масою 18 г, який має на торці

дрібні насічки, які роблять зскрібок епітелію і мікрофлори. Робочий елемент обер-

тають руками без натиску протягом 1 хв. Змивну рідину відсмоктують стериль-

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

ною пастерівською піпеткою в пробірку. В циліндр, ще притиснутий до шкіри,

повторно вносять 1 см

розчину тритону і процедуру змиву повторюють. Обидві

змивні рідини змішують і з суміші готують десятикратні розведення (10

-0

, 10

-1

-2

, 10

-3

) в 0,05 % розчині тритону для попередження реагрегації бактерій. По

0,1 см

нерозведеної, а також розведених проб засівають на селективні живильні

середовища (кров’яний агар; ЖСА, фуразолідоно-твіновий агар, середовища Гарро,

Ендо, Сабуро, кров’яний агар ВВL для анаеробів (до стандартного середовища

ВВL додають 5 % дефібринованої крові барана). Посіви інкубують при 37 °С про-

тягом 48-96 год. Підраховують кількість колоній, що виросли, користуючись лу-

пою або приладом ПСБ. Результати виражають числом КУО на 1 см

шкіри за

формулою:

число КУО = 20 × m × n,

де 20 – постійний коефіцієнт при посіві 0,1 см

проби,

m – число колоній, що виросли,

n – розведення (в 10, 100, 1000 разів).

У відповіді для лікаря вказують загальне мікробне обсіменіння досліджува-

ної ділянки: високе – понад 10

, середнє – 10

-10

, низьке – менше 10

КУО/см

;

види виділених мікроорганізмів; стан мікробіоценозу (еубіоз, дисбактеріоз).

Мікрофлора дихальних шляхів. Серед резидентної мікрофлори дихальних

шляхів найчастіше знаходять зеленячі, гемолітичні й негемолітичні стрептококи,

коринебактерії, нейсерії, стафілококи, мікрококи, пептострептококи, бактероїди.

Значно рідше виявляють актиноміцети, мікоплазми, трепонеми, ентеробактерії й

гриби роду Candida. Основна маса мікрофлори припадає на долю Streptococcus viri-

dans (понад 90 % всіх мікроорганізмів). Біля 10 % людей є носіями Staphylococcus

aureus, а серед медпрацівників хірургічних і акушерсько-гінекологічних стаціонарів

цей вид виділяють у 40-90 % обстежених осіб. Слизова оболонка трахеї, бронхів,

бронхіол і альвеол здорової людини, як правило, не містить мікроорганізмів.

Матеріал для дослідження повинен брати спеціаліст, оскільки правильний

забір має вирішальне значення для виявлення епідеміологічно значущих мікро-

організмів.

Слиз (секрет) із носа беруть натще або через 2 год після вживання їжі й до

початку лікування стерильними ватними тампонами, виготовленими краще з не-

гігроскопічної вати. Для кожного носового ходу використовують окремий там-

пон. Матеріал із носоглотки беруть спеціальним задньоглотковим тампоном, який

вводять через зів або носовий отвір у носоглотку. Матеріал із ротоглотки забира-

ють одним тампоном. Спочатку обтирають ним правий мигдалик, потім дужку

піднебіння, язичок, ліву дужку й лівий мигдалик. Важливо слідкувати, щоб там-

пон не торкався слизової щік і язика. В разі виявлення чітко локалізованого пато-

логічного осередку матеріал із нього необхідно взяти окремим тампоном. Зеле-

нячі стрептококи частіше виявляють у слині, яку беруть з-під язикової ямки.

При ураженні нижніх дихальних шляхів і легень досліджують харкотиння.

Останнім часом широко використовують більш точні аспіраційні методи при брон-

хоскопії та пункції трахеї. При бронхоскопії вводять у бронхи 5 см

0,85 % розчину

Частина І. Загальна мікробіологія

хлориду натрію, який потім відсмоктують в кількості 2-3 см

. При використанні

вказаних методів проводять як якісне, так і кількісне визначення мікрофлори.

Взятий матеріал сіють на кров’яний, сироватковий, жовтково-сольовий та

шоколадний агар, середовища Ендо й Сабуро.

Виявлення мікроорганізмів, які не є представниками нормальної мікрофло-

ри, або збільшення кількості будь-якого виду автофлори на фоні хвороби, свідчить

про їх етіологічну роль при даному захворюванні.

Мікрофлора порожнини рота. Мікрофлора ротової порожнини – дуже склад-

ний мікробіоценоз, в якому тісно співіснують аероби й анаероби, грампозитивні й

грамнегативні бактерії, гриби, віруси та найпростіші. Найбільш характерними пред-

ставниками є ротові стрептококи (Streptococcus salivarius, S.mitis, S.mutans, S.sanguis,

S.viridans); анаеробні пептострептококи (Peptostreptococcus anaerobius, P.productus,

P.parvulus, P.lanceolatus, P.micros); стафілококи (Staphylococcus epidermidis, S.sapro-

phyticus, S.hominis, S.hyicus); мікрококи (Micrococcus luteus, M.varians); бактероїди

(Bacteroides fragilis, B.melaninogenicus, B.gingivalis); спірохети (Treponema denticola,

T.macrodentium, T.orale, T.vincentii, Borrelia); нейсерії (Neisseria flava, N.sicca); леп-

тотрихії (Leptotrichia buccalis); вейлонели (Veilonella parvula); лактобацили (Lactoba-

cillus casei, L.acidophilus); фузобактерії (Fusobacterium nucleatum, F.periodenticum,

F.plauti); превотели (Prevotella disiens); кампілобактерії (Сampylobacter sputorum);

гриби родів Actinomyces, Candida; мікоплазми (Mycoplasma orale, M.salivarium).

До випадкових, але досить небезпечних представників ротової мікрофлори

слід віднести Streptococcus pyogenes, S.viridans, S.pneumoniae, Corynebacterium

diphtheriae, Staphylococcus aureus, віруси герпесу, епідемічного паротиту, ВІЛ-

інфекції та ін.

Бактеріологічні дослідження вмісту ротової порожнини проводять з метою

вивчення етіології патологічних процесів слизової, ясен, зубів, діагностики ряду

специфічних захворювань (сифіліс, туберкульоз, ангіна Симановського-Плаута-

Венсана, ВІЛ-інфекція), при виготовленні нових матеріалів для протезів та плом-

бування зубів. Його треба проводити до початку лікування хіміопрепаратами, до

вживання їжі й не раніше, ніж через 4-5 год після місцевого лікування.

Матеріалом для дослідження є полоскальний змив, зубний наліт, біоптати

слизової щік і язика, вміст каріозних зубів і гангренозних пульп. Найчастіше його

беруть ватним тампоном, яким обтирають слизову щік, ясен, язика, мигдалики. У

разі виявлення ясенних карманів чи виразок мазок треба брати ще одним тампо-

ном або платиновою петлею, а при ушкодженні зубних каналів – стоматологічним

зондом, обгорнутим стерильною ватою або окремими ватними чи паперовими

гнотиками. Слину забирають з-під язика. У зв’язку із зростаючим поширенням

СНІДу взяття матеріалів для бактеріологічного чи вірусологічного дослідження

треба проводити з максимальною обережністю, щоб виключити зараження інших

пацієнтів.

При бактеріоскопії мазки забарвлюють за методом Грама або Романовсько-

го-Гімзи. Спірохети виявляють у нативних препаратах за допомогою темного поля,

фазово-контрастного чи аноптрального мікроскопів.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Бактеріологічне дослідження проводять шляхом посіву матеріалу на елек-

тивні та диференціальні середовища для аеробних і анаеробних мікроорганізмів

із врахуванням біологічних особливостей вище вказаних родів і видів бактерій,

грибів і найпростіших. Виділені культури ідентифікують за їх морфологічними,

культуральними, ферментативними та антигенними властивостями.

Висновок про роль того чи іншого збудника у виникненні карієсу, гінгівіту,

пульпіту, парадонтозу та інших патологічних процесів роблять не лише на основі

визначення виду, а й щільності його популяції. Частіше всього вказані захворю-

вання викликає не один вид, а різноманітні асоціації мікроорганізмів.

Мікрофлора шлунково-кишкового тракту. Стравохід у здорових людей не

містить мікроорганізмів, або їх дуже мало (Candida albicans, Actinomyces israelii).

У шлунку прижились дріжджі (C.albicans, C.tropicalis); сарцини (S.ventriculi); кам-

пілобактерії (Сampylobacter fetus, C.pylori); рідко виявляють лактобацили, стафі-

ло- і стрептококи. У тонкому кишечнику знаходять ентерококи (Enterococcus

faecalis, E.faecium, E.durans); біфідобактерії (Bifidobacterium bifidum, B.infantis,

B.longum); лактобацили; E.coli.

Найбільш численна й різноманітна мікрофлора товстого кишечника. Основ-

ну її масу складають анаеробні мікроорганізми: Bifidobacterium spp., Bacteroides

spp. На долю цих двох родів припадає 96-99 % всіх мікробів, що населяють товсті

кишки. Тут вегетує значна кількість Escherichia spp., Enterococcus spp., Lactobacillus

spp. Залишкову мікрофлору товстого кишечника складають численні види родів

Clostridium, Staphylococcus, Proteus, Candida, Enterobacter, Pseudomonas, Veillonella,

Peptococcus, Peptostreptococcus, Actinomyces та ін. Всього описано понад 260 видів

бактерій. У окремих людей у кишечнику знаходять ентеровіруси, які при пору-

шенні опірності організму можуть викликати різноманітні захворювання. В ряді

випадків у випорожненнях можна виявити різні види найпростіших.

Стійкі порушення нормальних мікробіоценозів називають дисбактеріозами.

При цьому відбуваються зміни самого складу автофлори та кількісного співвідно-

шення окремих її представників: значне зменшення видів нормальної мікрофло-

ри аж до повного їх зникнення, або появи у великій кількості тих, які в нормі

рідко зустрічаються. Це, в основному, стафілококи, грамнегативні палички, дріж-

джоподібні гриби Candida та клостридії.

Необхідність досліджувати дисбактеріоз кишечника виникає при довготри-

валих проносах, при яких не виділяють патогенних ентеробактерій, після перене-

сення кишечних інфекцій із довгим періодом реконвалесценції, тривалої антибіо-

тикотерапії, злоякісних пухлинах, перед операціями на органах черевної порож-

нини, у недоношених новонароджених та при захворюваннях, що важко піддаються

лікуванню (ентероколіти, виразкові коліти, холецистити тощо).

Матеріал із шлунка й тонкої кишки беруть за допомогою спеціальних зондів

або капсул, які відкриваються у певному відділі кишечного тракту й закривають-

ся після взяття проби. Останнім часом для цієї мети широко використовують гас-

трофіброскопи та гастродуоденоскопи, які дозволяють брати на аналіз не лише

вміст шлунка чи кишечника, а й біоптати їх слизової оболонки для дослідження

Частина І. Загальна мікробіологія

мукозних бактерій. Матеріал із сигмоподібної та прямої кишок беруть тампоном,

трубкою Цімана, колонофіброскопом чи ректороманоскопом.

При діагностиці дисбактеріозу кишечника досліджують кал. Його вносять у

заздалегідь зважені флакончики в кількості 0,5-1,0 г без консерванта й доставля-

ють до лабораторії не пізніше 2 год після забору. Визначену наважку випорож-

нень розводять спеціальним буферним розчином від 10

-1

до 10

-12

Із розведень 10

-3

-10

-6

по 0,1 см

сіють на середовища ЖСА (для виявлення

стафілококів), кров’яний агар (для ентерококів і виявлення гемолітичних форм),

Сабуро (для грибів), Вільсона-Блера (для клостридій).

Із розведень 10

-5

-10

-8

по 0,1 см

сіють на середовище Ендо (для ентеробак-

терій), МРС-2 і МРС-4 (для лактобактерій), а з розведень 10

-7

-10

по 1,0 см

засі-

вають на середовище Блаурока, яке розливають високим стовпчиком (для біфідо-

бактерій), та спеціальні середовища для бактероїдів.

Для виявлення патогенних ентеробактерій нативний рідкий кал, або з розве-

день 10

-1

, бактеріологічною петлею сіють на середовища Ендо, Плоскирєва та

вісмут-сульфіт агар. По 1-2 см

із розведення 10

-1

сіють на середовища збагачення

(Мюллера, селенітовий чи магнієвий бульйон). Склад і методика виготовлення

всіх живильних середовищ приводиться в інструкції для діагностики дисбак-

теріозів.

Посіви для вирощування факультативно-анаеробних бактерій інкубують при

37 °С протягом 24-48 год, біфідобактерій – 48 год, анаеробів – 4-5 діб в анаероста-

тах, грибів – 96 год при 28-30 °С.

Після ідентифікації виділених культур проводять розрахунки кількості мікро-

організмів тієї чи іншої групи на 1 г випорожнень. Діагностику дисбактеріозу

проводять за відхиленням показників кількісного вмісту бактерій різних таксоно-

мічних груп від нормальних величин, які представлені в таблиці 10.

Мікрофлора сечостатевих органів. Паренхіма нирок, ниркові мисочки, се-

човоди, сечовий міхур, сеча, порожнина матки й маткові труби у здорових людей

вільні від мікробів. У зовнішній частині уретри і статевих органів чоловіків і жінок

зустрічаються Mycobacterium smegmatis, у невеликій кількості стафілококи, стреп-

тококи, пептококи, пептострептококи, коринебактерії, бактероїди, фузобактерії,

гриби родів Candida, Torulopsis, Geotrichum.

У піхві здорових жінок переважають молочнокислі бактерії (палички Додер-

лайна), дифтероїди та грамнегативні Comma variabile. Значно рідше виявляють

стрепто-, стафіло-, пептококи та клостридії. У 15-20 % вагітних жінок зустрічається

Streptococcus agalactiae, дуже небезпечний для новонароджених. Присутність грам-

негативних бактерій є наслідком фекальної контамінації.

Порцію першої ранкової сечі (3-5 см

) беруть у стерильний посуд, починаю-

чи з середини сечовипускання, і не пізніше як через 1 год проводять посів для

кількісного визначення мікрофлори або каліброваною платиновою петлею (діа-

метр 2 мм) на агар в чашці Петрі, або в склянку ємністю 30 см

, на стінках якої є

живильне середовище площею 12,5 см

. Середовище обливають мірною кількістю

сечі, потім її виливають (метод Нейчева). Після інкубації посівів підраховують

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

Таблиця 10

Показники нормоценозу товстого кишечника людини

Примітка.* – зустрічаються у окремих здорових осіб;

** – зустрічаються рідко у дітей після 3 місяців.

Кількість бактерій в 1 г випорожнень

Мікроорганізми

дорослих дітей

Bifidobacterium spp.

Bacteroides spp.

Lactobacillus spp.

Streptococcus lactis

Clostridium spp.

Escherichia:

ті, що ферментують лактозу

лактозодефектні

ті, що не ферментують лактозу

гемолітичні

Proteus spp.

Klebsiella spp.

Інші умовно-патогенні ентеробактерії

Другі грамнегативні бактерії

Staphylococcus aureus

Інші стафілококи:

(S.epidermidis, S.saprophyticus та ін.)

Enterococcus spp.

Candida spp.

Плісняві гриби

Патогенні ентеробактерії

– 10

8**

– 10

–

– 10

3**

– 10

число колоній і визначають кількість бактерій в 1 см

сечі. Критичний (небезпеч-

ний) рівень бактеріурії – 10

і більше.

Матеріал для дослідження мікрофлори піхви і визначення ступеня чистоти

вагінального вмісту беруть ложечкою Фолькмана, шпателем, або жолобоподіб-

ним зондом із заднього склепіння піхви й наносять тонким шаром на предметне

скло. Мазок фіксують 10 хв у суміші Никифорова, забарвлюють за методом Грама

й досліджують під імерсійною системою.

У вагітних жінок визначають чотири ступені чистоти вагінального секрету:

перший – поодинокі клітини злущеного епітелію, багато паличок Додерлай-

на, немає лейкоцитів;

другий – клітини епітелію, палички Додерлайна і Comma variabile, пооди-

нокі лейкоцити;

третій – дуже рідко палички Додерлайна або Сomma variabile, багато лейко-

цитів, наявна кокова флора;

четвертий – відсутні палички Додерлайна і Comma variabile, дуже багато лей-

коцитів, наявна гноєрідна мікрофлора (рис. 29).

Перший і другий ступінь чистоти зустрічається у здорових жінок і вважаєть-

ся нормою; третій і четвертий – характеризує патологічний стан статевих органів

і потребує санації перед пологами.

100

Частина І. Загальна мікробіологія

Рис. 29. Чотири ступені чистоти вагінального секрету.

перша друга третя четверта

Мікрофлора очей і вух. У 47 % здорових людей слизова оболонка очей не

містить мікроорганізмів. У решти на кон’юнктиві знаходять Staphylococcus

epidermidis, S.aureus (5 %), Corynebacterium xerosis, C.hoffmani, нейсерії, стрепто-

коки, гемофільні бактерії, мікоплазми, деякі види вірусів. У окремих випадках

автофлора очей (як і проникнення бактерій ззовні) може викликати кон’юктивіти,

блефарити тощо.

Шкіра зовнішнього слухового проходу заселена стафілококами (S.epidermidis,

S.auricularis) та дифтероїдами (C.xerosis). Рідше тут зустрічаються псевдомонади

й ентеробактерії. Середнє і внутрішнє вухо стерильні. Періодично до них можуть

проникати мікроорганізми з носоглотки, але вони швидко гинуть. За певних умов

при масивному проникненні бактерій в середнє вухо виникає отит.

Матеріал для мікробіологічного дослідження беруть із кон’юнктиви або вуш-

ного проходу стерильним тампоном чи маленьким ватним (марлевим) гнотиком;

із слізного мішка – піпеткою, а з середнього вуха – пункцією. Виготовляють мазки

й роблять посіви на оптимальні живильні середовища. Виділення чистих культур

та їх ідентифікацію проводять загальноприйнятими методами.

Розділ 6

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ІНФЕКЦІЯ. ВИКОРИСТАННЯ

ТВАРИН В ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

Досить часто в мікробіологічних, вірусологічних та імунологічних лабора-

торіях використовують біологічний метод дослідження на різноманітних видах

тварин. Його застосовують для експериментального відтворення інфекційних зах-

ворювань, окремих його симптомів або для вирішення спеціальних задач:

1. Встановлення етіологічного діагнозу інфекційної хвороби, особливо в тих

випадках, коли збудник не можна або важко виявити іншим способом (пневмоко-

ки, туляремійні бактерії, віруси сказу, енцефалітів тощо).

101

Розділ 6. Експериментальна інфекція

2. Виділення та ідентифікації чистої культури, визначення її токсигенності

чи токсичності.

3. Визначення вірулентності мікроорганізмів, встановлення мінімальних смер-

тельних доз мікробів, екзотоксинів та ендотоксинів.

4. При наукових дослідженнях з проблем механізму розвитку інфекційних

хвороб, формування імунітету, специфічного лікування і профілактики.

5. При контролі імуногенності, токсичності, стерильності, нешкідливості,

пірогенності біологічних медичних препаратів (вакцин, анатоксинів, ліків тощо).

6. Для отримання діагностичних імунних сироваток.

Дуже важливим етапом є вибір відповідних тварин для експериментального

зараження. Найчастіше в лабораторній практиці використовують білих мишей,

гвінейських свинок, білих щурів і кроликів. Деякі спеціальні лабораторні дослі-

дження проводять на мавпах, собаках, котах, хом’яках, ховрахах, тхорах, бавовня-

них щурах, мишах-полівках, а також на птахах (голуби, кури, папуги та ін.). Вибір

виду тварин оснований на знанні чутливості їх до тих чи інших мікроорганізмів.

Білі миші високочутливі до пневмококів, клебсієл, деяких видів сальмонел,

збудників сибірки, чуми, туляремії, лістеріозу, меліоїдозу, правця, ботулізму, газо-

вої анаеробної інфекції, коклюшу, орнітозу, висипного тифу, сказу, лейшманіозу,

токсоплазмозу. Новонароджені миші чутливі до арбовірусів, поліовірусів, коксакі-

вірусів. На білих мишах визначають силу екзо- і ендотоксинів.

Гвінейські свинки чутливі до збудників туберкульозу (M.hominis), псевдоту-

беркульозу, дифтерії, чуми, туляремії, бруцельозу, сапу, холери, сибірки, лептоспі-

розу, меліоїдозу, лістеріозу, орнітозу, ботулізму, правця, газової гангрени, кашлюка,

висипного тифу, ящуру.

Білих щурів використовують для експериментального відтворення сказу, со-

доку, амебіазу, меліоїдозу, токсоплазмозу, туберкульозу (M.bovis).

Кролики чутливі до стафілококів, стрептококів, деяких видів сальмонел, збуд-

ників туберкульозу, сибірки, пастерельозу, лістеріозу, ботулізму, правця, сифілісу,

амебіазу, токсоплазмозу, вірусів сказу й простого герпесу.

Мавпи зрідка використовують як експериментальну модель при сифілісі, ту-

беркульозі, дизентерії, лістеріозі, меліоїдозі, цереброспінальному менінгіті, че-

ревному тифі, кашлюку, поліомієліті та ін.

Коти чутливі до збудників амебної дизентерії, сапу, кашлюку, стафілококо-

вих інфекцій, дії ентеротоксинів (кошенята-сисуни).

Сірійських хом’яків використовують для відтворення бруцельозу, сапу, лей-

шманіозу, токсоплазмозу, амебіазу, лептоспірозу, рикетсіозів, сказу, геморагічних

гарячок.

Птахи (голуби, кури, папуги) чутливі до збудників туберкульозу (M.avium),

анаеробної газової інфекції, риносклероми (курчата), ботулінового екзотоксину.

Для отримання високостандартних і легковідтворюючих стабільних резуль-

татів, а також в наукових дослідженнях, особливо вірусологічних, у лабораторній

практиці використовують генетично стандартизованих лінійних (гомозиготних)

тварин. Їх отримують у спеціальних віваріях шляхом багаторазового близькоспорід-

102

Частина І. Загальна мікробіологія

неного схрещування (інбридінга). Уж е виведено біля 700 ліній білих мишей, 170

ліній щурів, 16 ліній гвінейських свинок, біля 70 ліній хом’яків, 7 ліній курчат та ін.

Такі тварини і птахи мають чітко запрограмовані біологічні властивості, такі як

висока чутливість до певних збудників, здатність до імунологічної відповіді тощо.

У лабораторних тварин можуть виникати спонтанні захворювання бактері-

альної чи вірусної природи, латентні інфекції. Вони також мають свою нормальну

мікрофлору. Все це ускладнює виділення чистих культур від заражених тварин і

визначення їх етіологічної ролі. Цього недоліку позбавлені безмікробні лабора-

торні тварини – гнотобіоти, а також тварини, вільні від спеціальних патогенних

збудників (СПЗ-тварини). Їх використовують для проведення важливих експери-

ментів з проблем вивчення ролі нормальної мікрофлори в інфекції, імунітеті, ут-

ворення вітамінів, ферментів та інших біологічно активних речовин.

Способи зараження експериментальних тварин

Для постановки біологічної проби або відтворення інфекційного захворю-

вання у лабораторних тварин використовують різні методи введення мікроор-

ганізмів, їх токсинів або іншого досліджуваного матеріалу: нашкірний, внутріш-

ньошкірний, підшкірний, внутрішньом’язовий, внутрішньовенний, внутрішньоо-

черевинний. Матеріал можна ввести в носові ходи, рот, шлунок, пряму кишку,

серце, мозок, піхву, яєчко, кон’юнктиву, порожнину суглобів. Спосіб зараження

залежить від типу матеріалу, ймовірних збудників чи їх токсинів і виду тварин.

Нашкірний спосіб – втирання матеріалу в депільовану (позбавлену шерсті)

або скарифіковану ділянку шкіри. Втирання проводять тупим кінцем скальпеля

обережно (краще під прикриттям скляної лійки). Тварину фіксують до повного

висихання матеріалу. Цей спосіб використовують рідко, здебільшого для виявлен-

ня збудників, що проникають через неушкоджену шкіру (палички чуми, туляремії,

лептоспіри).

Внутрішньошкірний спосіб часто використовують при введенні екзотоксинів

(стафілококовий, дифтерійний) для виявлення їх дермонекротичної дії, або при

постановці алергічних проб. Матеріал вводять в об’ємі 0,1-0,2 мл тонкою голкою,

користуючись туберкуліновим шприцом. Шкіру, позбавлену шерсті, протирають

спиртом, розтягують великим і вказівним пальцями, голку вводять під гострим

кутом зрізом доверху, матеріал треба вводити повільно. В місці ін’єкції утворюється

характерний пухирець, що нагадує лимонну кірку, але він досить швидко розс-

моктується (рис. 30).

Підшкірний спосіб використовується найчастіше. У місці введення після

депіляції шкіру обробляють спиртом, захоплюють і підіймають двома пальцями

лівої руки і в основу утвореної складки правою рукою вколюють голку шприца.

Пройшовши голкою кілька міліметрів, її відхиляють в один чи другий бік, прохо-

дять глибше і повільно вводять матеріал, що міститься в шприці (рис. 31). Це

робиться для того, щоб введений матеріал не витікав через прокол шкіри назовні.

Складку опускають, на голку кладуть вату, змочену спиртом або розчином йоду і

103

Розділ 6. Експериментальна інфекція

Рис. 30. Внутрішньошкірне зараження

гвінейської свинки.

Рис. 31. Підшкірне зараження гвінейської

свинки.

швидко виймають голку. Найбільш зручне місце для підшкірного введення матер-

іалу в мишей і щурів – на спині біля кореня хвоста, а в гвінейських свинок та

кроликів – у ділянці спини чи живота. Мишам вводять 0,5-1,0 мл матеріалу, щу-

рам і свинкам – 1,0-1,5 мл, кроликам – не більше 3,0 мл.

Внутрішньом’язове зараження проводять у ділянку тіла з найбільш розви-

неним м’язовим шаром. У кроликів, гвінейських свинок, щурів і мишей – це м’я-

зи верхньої третини задньої лапи, у курей і голубів – грудний м’яз. Ділянку шкіри

в місці ін’єкції обробляють так само, як і при підшкірному введенні. Потім вели-

ким і вказівним пальцями лівої руки захоплюють товсту м’язову складку і вводять

голку майже під прямим кутом в глибину м’язів (рис. 32).

Часто цим методом користуються для експериментального відтворення ана-

еробних клостридіальних інфекцій.

Внутрішньоочеревинне зараження. Спочатку вистригають шерсть на жи-

воті в нижній його третині, протирають спиртом або розчином йоду. Для поперед-

ження ушкоджень кишечника тварину тримають вниз головою. З цією ж метою

використовують короткі голки з притупленим кінцем. У кроликів і гвінейських

свинок роблять маленький надріз шкіри (2-3 мм) у нижній третині живота збоку

від середньої лінії. Під гострим кутом вводять голку між шкірою і м’язами, потім

переводять її в перпендикулярне положення до очеревини, буравлячим рухом про-

колюють її, відчуваючи ніби

“провал” у черевну порожни-

ну, і вводять досліджуваний

матеріал. На місце розрізу на-

кладають шов або хірургічну

скрепку. При зараженні ми-

шей і щурів шерсть не голять

і надріз не роблять (рис. 33).

Максимальні дози дослі-

джуваного матеріалу для вве-

дення білим мишам – 1 мл,

Рис. 32. Внутрішньом’язове зараження.

104

Частина І. Загальна мікробіологія

Рис. 34. Бокс для фіксації кроля. Рис. 35. Внутрішньовенне введення.

щурам – 3 мл, гвінейським свинкам – 5 мл і кроликам – 10 мл. Цей метод застосо-

вують для швидкого відтворення інфекційного процесу. Його не слід використо-

вувати, якщо досліджуваний матеріал містить багато сторонніх мікробів (грунт,

вміст кишечника тощо), щоб не викликати смертельний перитоніт.

Внутрішньовенний спосіб введення. У різних видів тварин при цьому кори-

стуються різними венами: кроликів заражають у крайову вену вуха, мишей і щурів

– у вену хвоста, гвінейських свинок – у вену стегна, попередньо надрізавши шкіру

та відсепарувавши її. Для внутрішньовенних ін’єкцій використовують голки з

довгим косим зрізом. Найлегше цей спосіб здійснюється на кроликах завдяки по-

верхневому розташуванню вушних вен. Перед введенням матеріалу тварину фіксу-

ють у спеціальному боксі (рис. 34) або обгортають рушником. Впродовж зовніш-

нього краю вуха вищипують шерсть, злегка вдаряють кінчиками пальців, або зма-

зують ксилолом, щоб вени краще набрякли, протирають 70° спиртом. Помічник

великим пальцем лівої руки натискає на вену біля основи вуха, щоб викликати ще

більший застій крові. Голку вколюють у вену в напрямку від периферії до центру,

тримаючи її майже паралельно до поверхні вуха (рис. 35).

Спочатку вводять невелику кількість матеріалу, щоб перевірити чи правиль-

но вставлена голка. Якщо вона дійсно знаходиться у вені, рідина вводиться легко.

Якщо ж при введенні невеликої кількості матеріалу виникає здуття навколо вени –

голка в неї не потрапила. Тоді її виймають і знову вводять у вену ближче до осно-

ви вуха. Після ін’єкції рідини вену нижче проколу злегка притискають, на місце

Рис. 33. Зараження миші в черевну порожнину: а – фіксація; б – введення.

105

Розділ 6. Експериментальна інфекція

уколу прикладають вату, змочену спиртом, голку виймають. Кровотеча припиняєть-

ся досить швидко.

При внутрішньовенному зараженні щурів і мишей користуються тонкими

короткими (туберкуліновими) голками з косим зрізом. Перед введенням матеріа-

лу хвіст тварини занурюють у теплу воду (50 °С), щоб викликати гіперемію. Корінь

хвоста затискають пальцями, голку

вколюють в одну з бокових вен у

нижній її третині, тримаючи шприц

майже паралельно осі хвоста. Голку

повертають зрізом наверх. Коли вона

введена у вену, перестають натиска-

ти на корінь хвоста і вводять матері-

ал. Цей спосіб дуже часто викорис-

товують при визначенні сили ток-

синів (рис. 36).

У курей і голубів зручно використовувати вени, які розташовані на внутрішній

поверхні крил. Після вищипування пір’я вони стають чітко видимі.

Ентеральне зараження. Найпростіше провести зараження через рот природ-

ним шляхом, добавляючи інфекційний матеріал до корму тварин. Але при цьому

досить важко точно визначити інфікуючу дозу. У зв’язку з цим частіше зараження

проводять примусово. Мишу чи щура тримають вертикально (рис. 37). Культуру

бактерій або інший заразний матеріал вводять за допомогою шприца, голка якого

має незначну кривизну й напаяну на кінці оливу. Рот відкривають пінцетом.

Кількість матеріалу, що вводять у шлунок мишей, становить 0,5-0,7 мл, для щурів –

2-3 мл.

Кроликам і гвінейським свинкам заразний матеріал вводять через рот спеці-

альним катетером або гумовою трубкою довжиною 7-8 см і шириною 0,3-0,5 см.

Перед введенням трубки в рот вставляють дерев’яну планку з отвором посереди-

ні. Через цей отвір обережно вводять у стравохід катетер, змазаний вазеліном.

Щоб полегшити його проходження по стравоходу в рот тварини піпеткою вливають

декілька крапель фізіологічного розчину хлориду натрію. Це викликає ковтальні

Рис. 36. Введення токсину миші.

Рис. 37. Ентеральне зараження миші (а) і кролика (б).

аб

106

Частина І. Загальна мікробіологія

рухи, під час яких трубка легко рухається по стравоходу й потрапляє до шлунка.

Зовнішній кінець катетера приєднують до шприца, наповненого певною дозою

заразного матеріалу. Його повільно вводять безпосередньо у шлунок в об’ємі

2,5-3,5 мл гвінейським свинкам і 3,5-5,0 мл кроликам.

Інтраназальне зараження. Існує декілька способів зараження тварин через

дихальні шляхи, при яких матеріал вводять або за допомогою інгаляції, або спеці-

альними зондами безпосередньо в трахею чи бронхи. Однак їх використовують

рідко. Найпростішим способом, який можна відтворити в будь-якій баклабора-

торії, є закапування заразного матеріалу або культури бактерій в носові ходи тва-

рин під легким ефірним наркозом. За допомогою шприца матеріал вводять крап-

лями в носові ходи мишей на глибину 1,0-1,5 мм, білих щурів – 2-3 мм, кроликів і

гвінейських свинок – 3,5-4,0 мм. Щоб не пошкодити слизову оболонку, викорис-

товують абсолютно тупі голки. За допомогою цього методу можна заражати ми-

шей збудником кашлюку, міксовірусами, гвінейських свинок – рикетсіями та ін.

Максимальний об’єм матеріалу, що вводиться, становить для мишей 0,03-0,05 мл,

для щурів – 0,05-0,1 мл, для кроликів і гвінейських свинок – до 2 мл.

Інтрацеребральне зараження. Кроликам і гвінейським свинкам роблять

трепанацію черепа й заразний матеріал вводять через трепанаційний отвір безпо-

середньо в мозок або під тверду мозкову оболонку (субдурально). Шкіру в місці

трепанації вистригають від шерсті, протирають спиртовим розчином йоду. Потім

її зміщують вбік і роблять розріз довжиною 1-3 см, паралельно осі черепа трохи

вище задньої орбітальної лінії. Спеціальним інструментом – трепаном – роблять

у кістці круглий отвір, через який вставляють голку і легким повільним натиском

на поршень шприца вводять 2-3 краплі матеріалу. Отвір у кістці закривають,

змістивши на місце шкіру, на яку накладають шви.

Зараження щурів і мишей проводять без трепанації за допомогою туберкулі-

нового шприца з тонкою, тупо обрізаною голкою. На останню надівають метале-

ву муфточку, яка обмежує проникнення голки в мозок лише на глибину 1,5-2 мм.

Мишу тримають лівою рукою так, щоб великий і вказівний пальці відтягували

шкіру голови в напрямку до шиї, а між мізинцем і безім’яним пальцями утриму-

вався хвіст. У місці проколу шкіру обробляють спиртовим розчином йоду, потім

повільно вводять матеріал щоб не викликати раптово підвищення внутрішньоче-

репного тиску. Цей спосіб на мишах-сисунках використовують для діагностики

вірусних енцефалітів, геморагічних гарячок, коксакі-інфекції та ін.

При визначенні результатів дослідів тварин, які загинули протягом першої

доби, не враховують, оскільки їх загибель виникла від травматичних ушкоджень.

Зараження в передню камеру ока. При цьому способі матеріал вводять на

кон’юнктиву або в передню камеру ока. Найкраще цю операцію виконати на кро-

ликах. Попередньо в кон’юнктивний мішок закапують 2 % розчин новокаїну. Тва-

рину фіксують спиною доверху. Через 1-2 хв тонким очним пінцетом захоплюють

складку кон’юнктиви зовні від поверхневого краю рогівки. Потім вводять тонку

голку в рогівку біля її краю (лімба) і просувають у центральному напрямку до тих

пір, поки в просвіті голки не появиться рідина з передньої камери ока. Після вито-

107

Розділ 6. Експериментальна інфекція

ку 2-3 крапель рідини на голку насаджують шприц і вводять інфікуючий матеріал

в об’ємі не більше 0,05 мл. Голку швидко виймають, маленька ранка сама закри-

вається. Око промивають стерильною водою або 3 % розчином борної кислоти.

З діагностичною метою часто ставлять так звану кератокон’юнктивну пробу

на гвінейських свинках. З цією метою у кон’юнктивний мішок вводять петлю ага-

рової культури (або краплю бульйонної), не травмуючи рогівку. Одні бактерії (ши-

гели) викликають кератит, інші (сальмонели) – кон’юнктивіт. Поява виразки на

рогівці або її помутніння виникають на 2-5 добу. Пробу використовують для ви-

значення належності культури до роду шигел. Такий спосіб на кролях використо-

вують для відтворення герпетичної інфекції.

Утримання заражених тварин. Після зараження лабораторні тварини на-

зиваються “піддослідними”. Їх утримують в ізольованому приміщенні (віварії),

окремо від розплідника, де розміщені здорові тварини. Приміщення для піддос-

лідних тварин повинно бути теплим (10-15 °С) і сухим. Слід пам’ятати, що кроли-

ки чутливі до вогкості, білі миші – до холоду, а гвінейські свинки і до вогкості, і до

холоду. Дрібних тварин після зараження вміщують у високі скляні банки, які закри-

вають металевими сітками, а кроликів і свинок – у клітках. Банки і клітки повинні

мати етикетки з позначенням дати зараження або номер експерименту, під яким

він записаний в лабораторному журналі. Тварини повинні регулярно отримувати

корм із достатнім вмістом вітамінів, воду або молоко. При спостереженні за ними

відмічають в’ялість, відсутність апетиту, понос, які є ранніми симптомами захво-

рювання. При огляді тварин змушують рухатись, щоб непропустити паралічі. Що-

денне спостереження дає змогу своєчасно відібрати захворілих тварин для розти-

ну і подальших досліджень.

Мікробіологічне дослідження трупа

Розтин і мікробіологічне дослідження загиблих тварин має велике, часом

вирішальне діагностичне значення. Воно проводиться з метою виявлення і визна-

чення локалізації збудника інфекційного захворювання. Трупний матеріал дослі-

джують за допомогою бактеріоскопічних (вірусоскопічних) і бактеріологічних

методів. Досліджуваний матеріал беруть під час розтину трупа, яке проводять,

дотримуючись встановлених правил.

Розтин трупа та його мікробіологічне дослідження потрібно робити якомога

скоріше після смерті. До цього його необхідно зберігати на холоді, оскільки мікро-

флора кишечника при низькій температурі повільніше проникає в кров, тканини й

паренхіматозні органи. Розтин трупа та забір матеріалу необхідно проводити в

умовах, які виключають його забруднення сторонніми мікроорганізмами. Взятий

матеріал до посіву не повинен контактувати з дезінфікуючими речовинами, а після

посіву – знезаражуватись. Результати досліджень обов’язково протоколюються.

Під час розтину трупа та дослідження його матеріалів необхідно абсолютно попе-

редити всіляку можливість інфікування як самих працюючих, так і інших осіб, а

також контамінації оточуючого середовища.

108

Частина І. Загальна мікробіологія

Тварин, що загинули від експериментальної інфекції, також досліджують з

дотриманням правил асептики. При цьому використовують лише стерильні

інструменти. Їх переносять із стерилізатора в склянку зі спиртом і ватою на дні,

перед кожним використанням обпалюють на вогні.

Загиблу тварину захоплюють пінцетом, кладуть спиною донизу на дерев’яну

дощечку, вміщену в металеву клювету з дезрозчином. До дощечки її прикріплюють

булавками або гострими гвіздочками за чотири лапки, широко розтягуючи її. Шкіру

в місці розтину змочують дезінфікуючим розчином, щоб не розліталась шерсть,

яка містить автохтонну мікрофлору. Трупи тварин, які загинули від чуми та інших

особливо небезпечних інфекцій, перед розтином занурюють у керосин для інак-

тивації комах – перенощиків хвороби. Перед першим розрізом шкіру ретельно

протирають дезрозчином, спиртом або обпалюють полум’ям газового пальника.

Розтин і дослідження трупа тварини проводять у певній послідовності: спочат-

ку розрізають і досліджують зовнішні покриви, потім грудну й черевну порожнини.

Розтин зовнішніх покривів починають з розрізу шкіри від нижньої щелепи

до лобка, потім роблять бокові надрізи в напрямку до лапок. Шкіру відсепарову-

ють і відкидають в обидва боки, відкриваючи всю передню поверхню тіла (рис. 38).

В підшкірній клітковині відмічають такі зміни як гіперемію судин, крововиливи,

набряки, стан лімфатичних вузлів. При їх збільшенні або нагноєнні роблять по-

сіви на живильні середовища та мазки-відбитки, притискаючи поверхню розрізу

вузла до предметного скла.

Перед розтином грудної порожнини її

відкриту від шкіри поверхню змочують

спиртом і запалюють. Пінцетом захоплю-

ють мечоподібний відросток, роблять по-

перечний надріз під ним, вставляють но-

жиці і проводять два бокові розрізи в місцях

сполучення ребер із грудною кісткою. Утво-

рений лоскут відкривають доверху й огля-

дають легені та серце, відмічають наявність

ексудату. Обов’язково роблять посів крові

з серця. Для цього розжареним скальпелем

припікають стінку шлуночка або перед-

сердь і в даній ділянці роблять прокол пас-

терівською піпеткою з тонко відтягнутим у

полум’ї пальника кінцем. Кров, що потра-

пила в капіляр, сіють в цукровий бульйон і

на агар, а із залишку роблять мазки. При по-

требі проводять також посіви та роблять

мазки-відбитки з легень, плеври та ексудату.

Розтин і дослідження черевної порож-

нини проводять дуже обережно, щоб не по-

шкодити кишечник. Черевну стінку захоп-

Рис. 38. Послідовні етапи розтину

білої миші.

109

Розділ 6. Експериментальна інфекція

люють і трохи підіймають вверх, ножицями розрізають її від діафрагми до лобка

і по два бокових надрізи в напрямку до лапок. Утворені лоскути відвертають в

обидва боки. Оглядають внутрішні органи, відмічаючи в протоколі величину, колір

і консистенцію печінки, селезінки, нирок, надниркових залоз, лімфатичних вузлів

брижі та наявність ексудату.

В разі потреби роблять посіви тканин вказаних органів та ексудату. Для цьо-

го припікають поверхню органа розжареним скальпелем і в цій ділянці проводять

розріз. Бактеріологічною петлею з поверхні розрізу роблять зскрібок паренхіми і

сіють на живильні середовища. Для виготовлення мазків-відбитків вирізають

шматочок органа й поверхнею розрізу притискають до предметного скла, або роз-

мазують по ньому тонким шаром.

Трупи тварин і залишки органів після бактеріологічного дослідження спа-

люють або стерилізують. Якщо тварини загинули від особливо небезпечних

інфекцій, їх розтини й посіви проводять у спеціальних режимних лабораторіях із

дотриманням особливо пильних заходів безпеки.

Вирощування посівів, виділення чистих культур та визначення видів збуд-

ників проводять за загально прийнятими методами.

Визначення вірулентності мікроорганізмів,

смертельної дії екзотоксинів та ендотоксинів

Майже в усіх бактеріологічних лабораторіях в дослідах на тваринах часто

визначають патогенні й вірулентні властивості збудників інфекційних захворю-

вань. Патогенність – це потенційна здатність певного виду мікроорганізмів вик-

ликати інфекційний процес. Вона не є абсолютною і стабільною. Ступінь або міру

патогенності визначають вірулентністю. Для її кількісного визначення запропо-

новані три умовні одиниці вірулентності.

1. Dosis letalis minima (DLM) – мінімальна смертельна доза, тобто найменша

кількість живих мікроорганізмів або найменша доза токсину, яка здатна виклика-

ти загибель 95 % тварин стандартної маси і віку через певний проміжок часу. Ця

величина відносна й залежить від виду тварин. DLM для мишей, щурів, гвінейсь-

ких свинок і кроликів буде різною.

2. Dosis certa letalis (DCL) – безумовно смертельна доза, яка викликає заги-

бель 100 % взятих у дослід тварин; вона також є відносною.

3. Dosis letalis

(DL

) – кількість мікроорганізмів (або токсину), яка викли-

кає загибель 50 % взятих у дослід тварин. Остання величина є статистично

найбільш достовірною летальною дозою. Вона визначається на основі обробки

конкретних результатів загибелі тварин за методом Ріда і Менча, у якому реалізу-

ються кумулятивні принципи обліку результатів.

Інколи визначають і мінімальну інфікуючу дозу (ІД

), тобто найменшу

кількість мікробів, яка викликає захворювання у 50 % заражених тварин.

Титрування мінімальних смертельних доз, як правило, проводять на білих

мишах як найбільш доступних і дешевих тваринах (рідко на гвінейських свинках

110

Частина І. Загальна мікробіологія

З них Розведення

зависі мікробів

Кількість

заражених тварин

загинуло вижило

% тварин,

що загинули

-4

6 6 0 100

-5

6 4 2 66,7

-6

6 2 4 33,3

-7

6 0 6 0

і кроликах). Мікроби (токсини) вводять внутрішньоочеревинно або внутрішньо-

венно. Щоб отримати стабільні результати використовують тварин стандартної

маси і віку. Мишей відбирають масою 16-18 г, гвінейських свинок – 200-250 г,

кроликів – 1500 г.

Завись бактерій для зараження готують із молодих агарових культур після

18-20 год їх вирощування в термостаті. Для цього в пробірку з культурою на ско-

шеному агарі вносять 5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й ретельно стру-

шують. Частину густого змиву переносять в іншу пробірку такого ж діаметру як і

пробірка зі стандартом мутності. Завись розводять 0,85 % розчином хлориду на-

трію до мутності, яка відповідає вибраному стандартові.

Централізованим шляхом готують такі еталонні стандарти мутності: № 5 –

на п’ять одиниць мутності, що відповідає 500 млн мікробів у 1 мл; № 9 – 900 млн

мікробів у 1 мл; № 10 – 1 млрд мікробів у 1 мл; № 11 – 1,1 млрд мікробів у 1 мл.

Виготовляють також стандарти мутності для коклюшних бактерій на 9, 10 і 11 млрд

мікробів у 1 мл.

При визначенні вірулентності мікроорганізмів, як правило, виготовляють

вихідну завись, в якій знаходиться 1 млрд бактерій в 1 мл. Тоді для введення миші

100 млн мікробів беруть 0,1 мл зависі, для введення 200 млн – 0,2 мл і т.д. Стан-

дартизовані зависі готують так, щоб бажані дози бактерій містились в однакових

об’ємах, а загальної кількості їх повинно вистачити на всю групу тварин (наприк-

лад, по 0,2 мл на 4-6 тварин).

Через 24-48 год після зараження відмічають кількість тварин, що загинули в

кожній групі і вираховують DL

за методом Ріда і Менча.

Наприклад, із наведених в таблиці даних видно, що DL

знаходиться між

розведеннями зависі мікробів 10

-5

і 10

-6

. Для точного підрахунку DL

визначають

величину х, яку додають до логарифму того розведення, яке менше 50 % дози (у

наведеному прикладі 5) за формулою:

50A

−

де А – % тварин, які загинули від розведення менше 50 % (у даному випадку

66,7 %); В – % тварин, що загинули від розведення більше 50 % дози (за даними

таблиці – 33,3 %). Підставивши у формулу отримані числові значення, одержимо

5,0

3,337,66

507,66

X =

−

Таблиця 11

Обчислення DL

за методом Ріда і Менча

111

Розділ 7. Генетика бактерій

Розділ 7

ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ

Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування

генетичних ознак та їх фенотипові прояви. Генетичний апарат прокаріотів побу-

дований із двоспіральної суперспіралізованої ДНК. Сукупність генів нуклеоїду і

позахромосомних факторів зумовлює генотип бактерій, а фенотип – це індивіду-

альний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову, або модифі-

каційну та спадкову, або генотипову. Неспадкова мінливість виникає під впливом

факторів зовнішнього середовища (зміна морфології клітини, поява L-форм тощо).

Модифікаційні зміни нетривалі, після припинення дії агента вони зникають. При

генотиповій мінливості різноманітні ознаки бактерій успадковуються. Ця мін-

ливість виникає внаслідок мутацій, трансформацій, коньюгацій і трансдукцій.

Вивчення модифікаційної мінливості бактерій. Готують 2 чашки Петрі,

одна з яких містить м’ясо-пептонний агар з 0,1 % фенолу, інша – звичайний МПА.

На поверхню чашок засівають культуру Proteus vulgaris. Посіви інкубують у тер-

мостаті при температурі 37 °С протягом доби. Потім вивчають особливості росту

мікробів на поверхні агару, роблять мазки, забарвлюють їх за Грамом і розгляда-

ють під імерсійним об’єктивом. На контрольному середовищі (МПА) вульгарний

протей представлено невеликими грамнегативними паличками, які мають тенден-

цію до повзучого росту по поверхні середовища. На агарі з фенолом спостері-

гається тенденція до утворення ізольованих колоній, в мазках видно ниткоподібні

форми бактерій, часом із колбоподібними потовщеннями на кінцях.

Фенол як фактор модифікаційної мінливості може викликати втрату рухли-

вості протеїв. Для її перевірки добову культуру P. vulgaris засівають у дві про-

бірки: одна з них містить звичайний МПБ (контроль), інша – 0,1 % феноловий

МПБ. Через добу культивування при температурі 37 °С у висячій краплі перевіря-

ють рухливість збудників.

У контрольній пробірці вони зберігають рухливість, у дослідній – мікроби

нерухомі. Для доведення природи модифікаційної мінливості мікроби засівають

на звичайний м’ясо-пептонний агар і після 18-24-годинного культивування пере-

віряють біологічні ознаки, в яких у цьому випадку спостерігається реверсія.

Метод реплік для виявлення мутантів. На чашку Петрі із повноцінним

м’ясо-пептонним агаром за добу до досліду засівають 0,1 мл добової бульйонної

Отже, DL

відповідатиме розведенню зависі 10

-5,5

. Враховуючи, що при се-

рійних розведеннях послідовно з пробірки в пробірку переноситься 0,1 мл матері-

алу (тобто, додається до 0,9 мл ізотонічного розчину), в 1 мл вихідної зависі бак-

терій міститься 10

6,5

112

Частина І. Загальна мікробіологія

культури E. сolі, розведеної до 10

-3

ступеня із розрахунку, щоб виросло 100 ко-

лоній. На наступний день готують мінімальне живильне середовище, яке не містить

ростових факторів для бактерій (глюкозо-сольовий агар), і чашку з повноцінним

середовищем. Для досліду використовують штамп-реплікатор, який представляє

собою дерев’яний або металевий циліндр товщиною до 1 см з діаметром дещо

меншим, ніж чашка Петрі (рис. 39). Його робоча поверхня вкрита оксамитом, вор-

саланом або іншим матеріалом, що має

дрібні ворсинки. Відкривають чашку

Петрі, на якій виросли колонії мікроор-

ганізмів (матрична чашка), і прикладають

до неї штамп-реплікатор. Після цього пе-

реносять колонії, які прикріпились до вор-

синок, на дослідну і контрольну чашки

Петрі (чашки-репліки) із відповідними се-

редовищами. Необхідно звернути увагу на

точне фіксування положення штампа-ре-

плікатора на матричній чашці і чашках-репліках. Після добової інкубації при тем-

пературі 37 °С вивчають колонії, що виросли на чашках і підраховують їх кількість.

Відмічають колонії мікроорганізмів, які не виросли на мінімальному живильному

середовищі. Вони є ауксотрофними мутантами, тому що нездатні синтезувати

відповідні ростові фактори.

Ідентичний експеримент можна поставити для виділення мутантів, які є ре-

зистентними до антибіотиків, не потрапляючи попередньо під їх вплив (селекцій-

на дія).

Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка для виявлення частоти спон-

танних мутацій. Для того, щоб виявити частоту спонтанних мутацій, які зумов-

люють стійкість до стрептоміцину (Str

варіанти), відбирають чутливий до цього

антибіотика штам E.coli. З добової культури бактерій у стерильному ізотонічному

розчині хлориду натрію готують суспензію клітин з концентрацією 1000-10000

клітин в 1 мл. Їх засівають у пробірку з 10 мл МПБ і в 10 пробірок з 1 мл аналогіч-

ного середовища так, щоб концентрація мікробів коливалась у межах 100-1000

клітин в 1 мл. Після добової інкубації при оптимальній температурі (37 °С) з 1-ої

пробірки роблять висів по 0,1 мл на 10 чашок Петрі, які містять по 100 ОД стреп-

томіцину в 1 мл агару. Посів проводять за допомогою шпателя. Вміст інших деся-

ти пробірок також засівають на аналогічні окремі чашки Петрі із стрептоміцином,

кожну в об’ємі 0,1 мл, шпателем. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протя-

гом 18-20 год.

Якщо стрептоміцинорезистентні кишкові палички утворюються тільки після

контакту мікробів із антибіотиком протягом доби, то їх число повинно було б бути

приблизно однаковим на всіх 20 чашках Петрі. В іншому випадку, за умови перед-

існування антибіотикостійких варіантів (мутантних), на чашках виростає неодна-

кова кількість колоній мікроорганізмів. Це є прояв коливань (флуктуацій) кількості

мутантних клітин залежно від часу формування мутацій.

Рис. 39. Метод реплік.

113

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

Висів мікробів із пробірки, де знаходилось 10 мл живильного середовища, не

дає таких флуктуацій мутантів, оскільки клітини рівномірно розподіляються в

живильному середовищі.

Моделювання трансформації в мікроорганізмів. У досліді використовуєть-

ся стрептоміциночутлива сінна паличка (Bac. subtilis Str

) і донорська ДНК анало-

гічного мікроба, яка має гени, що кодують стійкість клітини до антибіотиків.

У стерильну пробірку наливають 0,5 мл бульйонної культури штама-реципі-

єнта Bac. subtilis і додають 0,5 мл донорської ДНК з концентрацією 1 мкг/мл. Суміш

інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-30 хв, потім додають 0,5 мл розчину

хлориду магнію для руйнування ДНК, що не встигла проникнути в клітину-реци-

пієнт. Роблять серійні 10-кратні розведення трансформованої культури у стериль-

ному ізотонічному розчині хлориду натрію до 10

-5

-10

-6

і проводять посіви матеріалу

в об’ємі 0,1 мл за допомогою шпателя паралельно на чашки без антибіотика і з

100 ОД/мл стрептоміцину.

Після інкубації протягом 18-24 год при температурі 37 °С оцінюють резуль-

тати досліду, вираховуючи частоту трансформації.

Наприклад, після посіву штама-реципієнта, який було розведено в 10000 (10

-5

)

разів, на поверхні середовища виросло 120 колоній бацил (1,2·10

/мл). Посів 0,1 мл

нерозведеного рекомбінантного штаму на середовище із стрептоміцином дав ріст

60 колоній (6,0·10

/мл). Отже, частота трансформації (ЧТ) дорівнюватиме :

105

102,1

100,6

ЧТ

−

⋅=

⋅

Таким чином, генетичні феномени знаходять широке практичне застосуван-

ня в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біо-

технології, сільського господарства тощо.

Розділ 8

ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ БАКТЕРІЙ

ДО АНТИБІОТИКІВ

Антибіотики – це речовини мікробного, рослинного або тваринного похо-

дження, їх напівсинтетичні та синтетичні аналоги і похідні, що вибірково при-

гнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також

затримують ріст пухлин.

Антибіотикам притаманна висока біологічна активність. Вони спричиняють

біологічний ефект у дуже малих кількостях (наприклад, пеніцилін викликає вира-

жену бактерицидну дію на бактерії у концентрації 0,000001 г/мл). Антибіотики

мають високу вибіркову специфічність, оскільки проявляють свою дію тільки

114

Частина І. Загальна мікробіологія

відповідно до певних груп організмів, не завдаючи шкоди іншим. Так, бензилпе-

ніцилін затримує ріст грампозитивних бактерій (стафілококів, стрептококів) і прак-

тично не впливає на грамнегативні мікроби, гриби.

Біологічну активність антибіотиків оцінюють в умовних одиницях, які міс-

тяться в 1 мл розчину (ОД/мл) або в 1 мг препарату (ОД/мг). У таких антибіотиків,

як еритроміцин, новобіоцин, ністатин, трихоцетин та ін. одна одиниця активності

еквівалентна 1 мкг препарату. За одиницю антибіотичної активності пеніциліну

приймають мінімальну кількість препарату, здатну затримувати ріст штаму

Staphylococcus aureus 209 у 50 мл поживного бульйону. Активність стрептоміцину

вимірюється мінімальною кількістю антибіотика, який інгібує ріст Escherichia coli

в 1 мл поживного бульйону. Фактично для більшості антибіотиків 1 ОД відповідає

1 мкг хімічно чистого препарату. Однак є антибіотики, для яких існують винятки.

Так, наприклад, для пеніциліну 1 ОД відповідає 0,6 мкг, поліміксину В – 0,1 мкг,

ністатину – 0,333 мкг хімічно чистих антибіотиків.

Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків та вивчення їх фармакокінетики

в організмі хворого є основними лабораторними показниками, які при їх співстав-

ленні дозволяють прогнозувати ефективність антибактеріальної терапії. Крім того,

результати визначення антибіотикочутливості використовують як маркер, що доз-

воляє виявляти та контролювати зміни антибіотикограми збудників у динаміці,

використовувати детермінанти резистентності, які найчастіше зустрічаються, або

їх сполучення як додаткові маркери при діагностиці внутрішньолікарняних інфек-

цій, для виявлення джерел інфікування та шляхів розповсюдження полірезистент-

них штамів. Такі дані, одержані та узагальнені у різних регіонах країни протягом

фіксованих проміжків часу, використовуються при формуванні політики антибак-

теріальної терапії та визначенні номенклатури антибіотиків, які випускаються

в країні.

Найрозповсюдженішими методами визначення антибіотикочутливості збуд-

ників інфекцій є диско-дифузійний (метод дисків) та серійних розведень.

Живильні середовища для визначення чутливості бактерій до антибіотиків

повинні відповідати таким вимогам:

• бути стандартними та забезпечувати оптимальні умови росту мікроорганізмів;

• не містити інгібіторів бактеріального росту і великої кількості стимуляторів;

• не мати речовин, що пригнічують активність препаратів.

На результати дослідження може суттєво впливати значення рН середовища.

Найдоцільніше вибирати нейтральне або дещо лужне середовище (рН 7,0-7,4),

оскільки ці значення придатні для більшості антибіотиків. При визначенні чутли-

вості бактерій використовують бульйон і 1,5-2 % агар на переварі Хоттінгера, зви-

чайний м’ясо-пептонний бульйон і 1,5-2 % агар на ньому, середовище АГВ (агар

Гівенталя-Вєдьміної), агар Mueller-Hinton 2. Вони придатні при визначенні анти-

біотикочутливості стафілококів, ентеробактерій, псевдомонад. Однак стрептоко-

ки та гемофільні бактерії вимагають добавки ростових факторів; дріжджі та ана-

еробні бактерії – спеціальних середовищ і певних умов культивування. На резуль-

тати визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків-аміноглікозидів,

115

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

поліміксинів, тетрациклінів впливає вміст у живильних середовищах катіонів каль-

цію, магнію, що особливо важливо при дослідженні P. aeruginosa. Оптимальний

вміст – 50 мг/л Са

і 25 мг/л Mg

. Більшість середовищ, що випускаються країна-

ми СНД, за цим показником, як правило, не стандартизуються. Це призводить до

суттєвих коливань вмісту двовалентних катіонів у різних серіях середовищ, навіть

якщо вони випускаються одним підприємством, і спотворює результати.

Диско-дифузійний метод визначення антибіотикочутливості є найпростішим

якісним методом і широко використовується для епідеміологічного контролю ре-

зистентності. Достовірність результатів забезпечується шляхом стандартизації

проведення тесту на всіх етапах дослідження: вибір і виготовлення живильних

середовищ із врахуванням всіх властивостей можливих збудників, взяття проб і

умови їх доставки, виготовлення і розливання посівного матеріалу на поверхню

агару, вибір дисків (використання набору дисків у відповідності до виду виділе-

ного збудника та локалізації інфекції).

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків слід визначати тільки у чистій

культурі. Однак у ряді випадків для швидкого одержання орієнтовних даних про

антибіотикограму бактерій використовують безпосередньо патологічний матері-

ал. Щільні субстрати (харкотиння, гній, кал та ін.) розтирають, рідини (сеча, ексу-

дати та ін.) центрифугують, а для посіву використовують осад. Досліджуваний

матеріал наносять на поверхню живильного середовища петлею або ватним там-

поном. Після одержання чистої культури дослідження повторюють.

Для виготовлення інокулюму 5-10 однорідних колоній суспендують у 2 мл

рідкого середовища або фізіологічного розчину. Бактеріальну суспензію (10

-10

КУО/мл залежно від виду мікробів) в об’ємі 1 мл рівномірно розподіляють по

поверхні середовища при похитуванні чашки, надлишок рідини видаляють піпет-

кою. Чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, а потім на

них на однаковій віддалі кладуть диски з антибіотиками.

Рівномірність газону, яка визначається величиною посівної дози, – найголов-

ніший фактор одержання достовірних результатів і підлягає кількісній оцінці та

якісній стандартизації. Ступінь нестандартності результатів дослідження, який

пов’язаний із зміною величини дози інокулюму, варіює залежно від виду збуд-

ників, властивостей антибіотика та інших факторів. При невеликій дозі інокулю-

му при визначенні чутливості до бета-лактамних препаратів пеніциліназо-утво-

рюючих бактерій можна одержати великі розміри зон затримки росту, які створю-

ють уявлення про високу чутливість штамів. І, навпаки, розмір зон різко знижується

при збільшенні щільності інокулюму. Вирішальне значення має його величина

при визначенні чутливості до бета-лактамних антибіотиків метицилінорезистент-

них варіантів стафілококів внаслідок гетерогенності їх саме за показником чутли-

вості. Для виявлення стійкості до метициліну необхідно дотримуватись певних

температурних режимів (30-35 °С). Оскільки ці стафілококи повільніше ростуть

при 37 °С, слід їх культивувати на середовищах з додаванням 5 % хлориду натрію.

Результати враховують через 24 та 48 год (рис. 40). Для контролю стандартності

проведення досліджень у кожному досліді використовують тест-культури з відо-

116

Частина І. Загальна мікробіологія

мою чутливістю до антибіотиків. ВООЗ рекомен-

дує три штами типових культур: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

При визначенні антибіотикочутливості виділених

штамів слід співставляти отримані дані з розмі-

рами зон пригнічення росту навколо дисків з ан-

тибіотиками для контрольних культур (табл. 12).

Їх порівнюють з допустимими контрольними зна-

ченнями.

Якщо діаметри зон пригнічення росту конт-

рольних штамів знаходяться у певних межах, це

свідчить про достатню стандартизацію і точність

проведених експериментів. Не слід розміщати на

чашці Петрі понад 6 дисків, так як при великих

діаметрах зон затримки росту це може бути джерелом помилок і впливати на

кількісну інтерпретацію результатів. Правильний підбір набору дисків є факто-

ром, який визначає коректність досліджень і, без сумніву, інтерпретацію резуль-

Таблиця 12

Граничні межі діаметрів зон затримки росту еталонних штамів

Діаметри зон затримки росту, мм

на середовищах № 1 і № 2 на середовищі АГВ

Антибіотики

S. aureus

ATCC

25923

E. coli

ATCC

25922

P. aeruginosa

ATCC

27853

S. aureus

ATCC

25923

E. coli

ATCC

25922

P. aeruginosa

ATCC

27853

1 2 3 4 5 6 7

Бензилпеніцилін - - - 29-38 - -

Ампіцилін 24-35 13-20 - 30-36 14-20 -

Карбеніцилін (25 мкг) - - - 32-38 19-25 -

Карбеніцилін (100 мкг) - 21-26 20-24 35-42 23-29 18-24

Метицилін - - - 22-30 - -

Оксацилін 27-32 - - 24-30 - -

Цефалотин 24-37 15-22 - 30-40 15-20 -

Стрептоміцин 17-25 14-22 - 20-25 14-19 -

Неоміцин 19-27 18-24 - 20-27 13-17 -

Канаміцин 20-27 18-26 - 20-27 15-19 -

Гентаміцин 20-28 20-27 16-24 22-32 21-30 16-26

Тетрациклін 20-29 19-26 - 22-31 17-26 -

Еритроміцин 23-31 - - 22-31 8-15 -

Олеандоміцин 20-29 - - 22-29 - -

Лінкоміцин 24-32 - - 24-32 - -

Левоміцетин 21-27 26-28 - 19-25 19-27 -

Рифампіцин - - - 26-34 7-11 -

Поліміксин - 12-17 - - 16-20 15-20

Ристоміцин 14-18 - - 12-16 - -

Рис. 40. Визначення антибіотико-

чутливості за допомогою

методу стандартних дисків.

117

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

татів. Орієнтовні дані щодо вибору наборів дисків із врахуванням виду виділено-

го збудника і локалізації інфекції наведено у таблиці 13.

Таблиця 13

Основні набори дисків, які рекомендуються для визначення чутливості

залежно від виду виділеної культури та патологічного матеріалу

Попереднє вивчення

чутливості мікрофлори

Дослідження чистої культури (штами)

Антибіотики

харко-

тиння

гною сечі

стафіло-

коків

стреп-

тококів

ентеро-

бактерій

псевдо-

монад

Бензилпеніцилін + +* +* +*

Метицилін,

Оксацилін

+* +* +* +*

Ампіцилін +* +* +*

Карбеніцилін (25 мг) +* +

Карбеніцилін (100 мг) +* +*

Цефалексин +* +* +* +* +* +*

Цефалотин + + +* +* +*

Еритроміцин +* +* +*

Олеандоміцин + +* +*

Лінкоміцин + +

Ристоміцин +

Фузидин +

Стрептоміцин +

Канаміцин +* + +

Гентаміцин +* + + +*

Тетрациклін +* +* + + +*

Левоміцетин + + + +

Поліміксин + +*

Примітка. * – антибіотики, чутливість до яких визначають у першу чергу.

Оцінку результатів проводять за таблицею 14, яка містить граничні значення

діаметрів зон затримки росту для резистентних, помірно резистентних та чутли-

вих штамів, а також значення мінімальної пригнічуючої (інгібуючої) концентрації

(МПК, МІК) антибіотиків для стійких і чутливих штамів.

Одержані значення діаметрів зон затримки росту порівнюють з контрольни-

ми значеннями таблиці 14 і відносять досліджувані штами до однієї з трьох кате-

горій чутливості.

Метод дифузії за допомогою дисків є якісним методом. Він дозволяє встано-

вити лише факт чутливості або резистентності збудників інфекції. Однак вста-

новлений корелятивний зв’язок розмірів зон пригнічення росту досліджуваних

штамів і значень МІК (мінімальна концентрація препарату, яка інгібує ріст дослі-

джуваного штаму) антибіотиків дозволяє оцінити ступінь чутливості і кількісно,

використовуючи дані, наведені у таблиці 14. За своїм ступенем чутливості до ан-

тибіотиків мікроорганізми поділяються на три групи:

118

Частина І. Загальна мікробіологія

Таблиця 14

Граничні значення діаметрів зон затримки росту і значення МПК антибіотиків для інтерпретації результатів

Діаметри зон для середовища АГВ, мм МПК, мкг/мл

Антибіотики

Вміст

антибіотика

в диску, мкг

Код

диску

стійкі помірно-стійкі чутливі стійкі чутливі

Бензилпеніцилін:

при дослідженні стафілококів

при дослідженні інших мікробів

ПЕН

≤

21-28

11-16

≥

≤

0,1

≤

1,5

Ампіцилін при дослідженні:

стафілококів

грамнегативних бактерій та ентерококів

АМП

≤

21-28

10-13

≥

≥32

≤

0,2

≤

Карбеніцилін при дослідженні:

кишкової палички та протея

синьогнійної палички

100

КАР

≤

15-18

12-14

≥

250

≤

125

Метицилін 10 МЕТ

≤

14-18

≥

≤

Оксацилін 10 ОКС

≤

16-19

≥

≤

Цефалексин 30 ЦФЛ - - -

≥32 ≤10

Цефалотин 30 ЦФТ

≤

15-18

≥

≤

Стрептоміцин 30 СТР

≤

17-19

≥

≤

Неоміцин 30 НЕО

≤12

13-16

≥17

≤10

Канаміцин 30 КАН

≤

15-18

≥

≤

Мономіцин 30 МОН

≤

14-17

≥

≤

Гентаміцин 10 ГЕН

≤15

≥16 ≥6 ≤4

Сизоміцин 10 СИЗ - - -

≥

≤

Тетрациклін 30 ТЕТ

≤

17-21

≥

≤

Доксициклін 10 ДОК - - -

≥12 ≤2

Еритроміцин 15 ЕРИ

≤

18-21

≥

≤

Олеандоміцин 15 ОЛЕ

≤

17-20

≥

≤

Лінкоміцин 15 ЛІН

≤19

20-23

≥24 ≥8 ≤2

Левоміцетин 30 ЛЕВ

≤

16-18

≥

≤

Рифампіцин 5 РІФ

≤

13-15

≥

≤

Фузидин 10 ФУЗ - - -

≥

≤

Поліміксин 300 ОД ПОЛ

≤

12-14

≥

50 ОД/мл

Ристоміцин 30 РІС

≤

10-11

≥

≤

119

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

1 група – чутливі до антибіотиків (збудники знищуються в організмі при ви-

користанні звичайних терапевтичних доз препаратів);

2 група – помірно-резистентні (для них лікувальний ефект може бути досяг-

нутий при використанні максимальних терапевтичних доз препаратів);

3 група – резистентні (бактерицидних концентрацій препаратів в організмі

створити неможливо, тому що вони будуть токсичними).

При визначенні стійкості до антибіотиків, близьких за хімічною будовою і

спектром антибактеріальної дії, можливе використання клас-диска, просякнутого

одним з антибіотиків певної групи. Так, за допомогою диска з бензилпеніциліном

можна визначати чутливість до біцилінів, феноксиметилпеніциліну; цефалекси-

новим – до цефазоліну, цефаклору, цефалотину. Однак, не рекомендується вико-

ристовувати тетрациклінові диски для визначення чутливості до доксицикліну.

Строки та температура зберігання дисків вказані на етикетці упаковок. Дис-

ки з малостабільними антибіотиками (бензилпеніциліном, ампіциліном, карбені-

циліном, метициліном, оксациліном) слід зберігати при 4 °С або 14 °С. Після того,

як флакон із дисками відкрито, його зберігають протягом тижня при 4 °С. Перед

застосуванням його протягом 1 год залишають при кімнатній температурі для по-

передження утворення конденсату на внутрішніх стінках флакона. Диски із про-

строченим терміном зберігання, де сілікагель має рожевий колір, використовува-

ти не можна.

Метод серійних розведень. Показаннями для визначення антибіотикочутли-

вості за методом серійних розведень є необхідність одержання кількісних даних

(переважно при тяжкому перебігу інфекційних процесів) для проведення регульо-

ваної антибіотикотерапії.

Встановлення ступеня чутливості мікробів до антибактеріальних препаратів

впливає на вибір антибіотика (наприклад, відмова від ліків з високою токсичні-

стю при помірному ступені чутливості збудника до них), його дозування (концен-

трація антибіотика в крові повинна в 2-3 рази перевищувати його мінімальну при-

гнічуючу концентрацію по відношенню до збудника) і режим введення. Крім того,

її кількісне визначення необхідне також для встановлення бактерицидної дії об-

раного препарату (як гарантії швидкого терапевтичного ефекту та безрецидивно-

го перебігу) по відношенню до даного збудника.

Існують дві модифікації методу серійних розведень – визначення чутливості

на рідкому та густому живильних середовищах. Метод дає можливість визначити

МПК препарату для виділеного штаму збудника.

Для визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень у

рідкому живильному середовищі готують ряд (8-10 і більше) пробірок з двократ-

ними послідовними розведеннями препарату (табл. 15).

Середовище попередньо розливають у пробірки по 2 мл. У першу додають 2

мл розчину антибіотика певної концентрації, перемішують і переносять до на-

ступної пробірки, продовжуючи розведення до передостанньої, з якої видаляють

2 мл суміші. Остання пробірка служить контролем росту культури. У тому ж бульй-

оні, який використовують для розведення антибіотиків, готують суспензію добо-

120

Частина І. Загальна мікробіологія

Таблиця 15

Схема визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень

Пробірки

Компоненти, мл

Контроль

бактерій

Контроль

анти-

біотика

МПБ 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Пеніцилін, 100 ОД/мл 2,0

→

↑

- 2,0

Концентрація

антибіотика, ОД/мл

50 25 12,5 6,3 3,2 1,6 0,8 0,4 - 50

Суспензія бактерій,

/мл

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -

Інкубація в термостаті при 37

С 18-24 год

Результат

вої агарової або бульйонної культури бактерій з розрахунку 10

-10

мікробних тіл

в 1 мл залежно від виду збудника. Потім до кожної пробірки з розведеннями, а

також до контрольної додають по 0,2 мл виготовленої суспензії. При визначенні

чутливості до пеніцилінів пеніциліназоутворюючих стафілококів рекомендують

використовувати одночасно велике й мале мікробне навантаження (100, 100000 та

вище мікробних тіл в 1 мл). Залежно від величини посівної дози значення МПК

препарату може коливатись: при збільшенні дози чутливість знижується за раху-

нок зростання кількості пеніцилінази, що утворюється в середовищі.

Пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год. Результати

враховують, визначаючи наявність або відсутність росту в середовищі з різними

розведеннями препарату. (рис. 41). Остання пробірка, в якій спостерігають зат-

римку росту культури (прозорий бульйон), відповідає МПК (мінімальній пригнічу-

ючій концентрації) або МБсК (мінімальній бактеріостатичній концентрації) пре-

парату відносно даного мікроба і вказує на ступінь його чутливості. Якщо ознаки

росту з’являються в усіх пробірках, досліджуваний штам резистентий до макси-

мальної концентрації препарату, яку було взято у дослід. Відсутність росту бак-

терій в усіх пробірках, крім контрольної, свідчить, що МПК препарату нижча, ніж

та, що використовується в досліді.

Для визначення бактерицидного ефек-

ту антибіотика з декількох останніх про-

бірок, в яких немає ознак росту, роблять

висів на сектори агару в чашках Петрі. Че-

рез 24-48 год інкубації при оптимальній

температурі відмічають ту найменшу кон-

центрацію препарату в пробірці, посів з якої

не дав росту. Її вважають мінімальною бак-

терицидною концентрацією (МБцК).

Принцип методу серійних розведень у

густому живильному середовищі анало-

Рис. 41. Визначення антибіотикочутли-

вості методом серійних розведень.

121

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

гічний попередньому. Для цього готують серію розведень антибіотика в агарі, до-

даючи один об’єм, який містить певну кількість препарату до 9 об’ємів агару. Для

цього зручно розлити агар у флакони або широкі пробірки по 13,5 мл. Перед по-

становкою агар розплавляють на водяній бані і після охолодження до 60-65 °С у

кожну пробірку додають 1,5 мл відповідного розведення антибіотика (в бульйо-

ні), ретельно перемішують і виливають у чашку Петрі. У контрольну пробірку з

агаром замість розчину антибіотика вносять 1,5 мл дистильованої води. Чашку

поділяють на сектори, на кожний з яких засівають досліджуваний штам. Посіви

роблять бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Для посіву зручно

використати спеціальний штамп-реплікатор, який дозволяє нанести одночасно на

поверхню агару 25-50 досліджуваних культур. Результати враховують після 18-24

год інкубації в термостаті при оптимальній температурі. За МПК антибіотика для

даного штаму приймають ту, при якій відсутні ознаки росту колоній на поверхні

агару (або замість бляшки є ріст поодиноких колоній).

З двох способів визначення антибіотикочутливості мікробів до антибіотиків

(розведень у густому та рідкому середовищах) більш точним є метод серійних

розведень у рідкому середовищі. Результати, які одержують за допомогою розве-

день в агарі, менш постійні. Метод не слід застосовувати при оцінці чутливості

тих мікробів, які дають тонкий, розріджений ріст на поверхні чашки (стрептоко-

ки, пневмококи) або, навпаки, мають тенденцію до повзучого росту (протей).

Недоліком методів серійних розведень є їх висока трудоємність, що обмежує

використання в звичайних бактеріологічних лабораторіях. З метою спрощення було

запропоновано модифікацію методу із заміною ряду з 10 пробірок, що містять

різні кількості препарату, трьома концентраціями антибіотика. Перша з них відпо-

відає максимальній, що знаходиться у крові при введенні терапевтичних доз, дру-

га – рівню, що спостерігається через Т

1/2

(час зниження концентрації антибіотика

на 50 %). Третя є мінімальною, тобто тою, яка дорівнює МПК для високочутливих

штамів. У відповідності до використаних концентрацій антибіотиків досліджу-

вані штами можна віднести за рівнем чутливості до трьох основних груп: резис-

тентні (МПК для яких перевищує значення максимальної концентрації антибіоти-

ка у крові), помірно чутливі (значення МПК наближаються до максимальної або

середньої концентрації) і високочутливі (чутливість яких до антибіотика знахо-

диться на рівні мінімальної концентрації, що використовується у досліді). Такими

концентраціями при визначенні чутливості до бензилпеніциліну є відповідно 0,05-

0,2, 0,5 і 2,0 ОД/мл, до макролідів – 0,1, 0,5-1,0 і 4,0 мкг/мл, до аміноглікозидів –

0,5-1,0, 6,0-8,0 і 15,0-20,0 мкг/мл.

Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіо-

тиків. Використовуючи звичайні методи, відповідь може бути отримана через 18-

20 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури.

Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяж-

кому перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержан-

ня даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базу-

ються, прискорені методи передбачають:

122

Частина І. Загальна мікробіологія

• визначення змін ферментативної активності мікроорганізмів під впливом

антибіотиків;

• визначення кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потен-

ціалу під час росту бактерій у живильному середовищі;

• цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом ан-

тибіотиків.

До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність анти-

біотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що

супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у

диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або

фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості

до дії антибіотика не відбувається розкладання глюкози при культивуванні у сере-

довищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище

забарвлюється у фіолетовий колір внаслідок зсуву рН у лужну сторону. Зміна чер-

воного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кис-

лоти внаслідок росту штаму, резистентного до дії антибіотика. Якщо до середови-

ща додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими

вже через 2-2,5 год від початку дослідження.

Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу сере-

довища в процесі росту мікроорганізмів, про що свідчить зміна кольору резазури-

ну, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які

додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують

через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений

до 50 °С агар засівають досліджуваною культурою бактерій із розрахунку 200 млн.

мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубу-

ють при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикато-

ром і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за

зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % роз-

чин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом

внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічен-

ня росту навколо дисків залишаються безбарвними.

Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж

точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження

зменшується до 3-5 год.

Утворення інволюційних форм бактерій під впливом антибіотиків досліджу-

ють під фазово-контрастним чи антоптральним мікроскопом у спеціальних мікро-

капсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій пре-

парату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистент-

ності досліджуваного штаму на поверхні агару виростають нормальні мікроколонії.

Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової

палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків

збігаються з тими, які дають класичні методи.

123

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

За останні роки розроблено численні модифікації методу серійних розведень

у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в

об’ємі 0,25 мл.

Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з

планшетів з ліофільно висушеними розведеннями антибіотика, куди вноситься по

0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіо-

тикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індика-

тора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної гу-

стини середовища.

Визначати чутливість бактерій до антибіотиків можна й за допомогою автома-

тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2,

Sceptor та ін.). При їх використанні результати отримують вже через 3-10 год. Одна

з їх переваг полягає в тому, що вони дозволяють отримувати результати одночасно

до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних ла-

бораторіях, вони добре корелюють з іншими методиками і за їх допомогою можна

не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епіде-

міологічний контроль резистентності.

Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота вияв-

лення резистентних штамів може бути знижена внаслідок повільного росту стійких

варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівнян-

ня росту (або загибелі) бактеріальних клітин у присутності антибіотиків з контро-

лем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які

гинуть, від тих, що повільно розмножуються.

До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібітор-

них концентрацій препаратів на ультраструктуру бактеріальних клітин. Вони при-

зводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною

оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає не-

правильну інформацію про чутливість збудників.

Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіо-

тикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості.

Усі методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків мають свої перева-

ги і свої недоліки. Тому постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотри-

манням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних.

У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro

збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності по-

яснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трак-

тування одержаних лабораторних даних.

Причиною таких ситуацій може бути використання при посіві не чистої куль-

тури бактерій, а патологічного матеріалу. Тому визначається не чутливість інфек-

ційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки

зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харко-

тиння, виділень з ран, сечі тощо.

124

Частина І. Загальна мікробіологія

Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіо-

тиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що

руйнують препарати. Одним з найдослідженіших ферментів є бета-лактамаза, яка

руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька

методичних прийомів, що дозволяють швидко визначити її активність. Один з них

полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2×2 см, що знаходиться в

чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей

папір наносять петлею агарову культуру мікробів і розтирають її, формуючи бляшку

діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну.

Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній

температурі. При наявності бета-лактамази на темно-синьому фоні спостерігаєть-

ся яскраво виражена чітка зона просвітління навколо бляшки, що містить агарову

культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї

бляшки нечіткі.

Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяж-

ких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати кон-

центрацію антибіотиків у біологічних рідинах, зокрема, сироватці крові, сечі. Для

цього використовують метод серійних розведень (табл. 16) на рідкому середовищі

з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні

розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, вклю-

чаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інку-

бують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де

концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарв-

ним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння

середовища і поява рожевого забарвлення.

Можна використати також фенол-сироваткове середовище з індикатором фено-

ловим червоним. У цьому випадку при відсутності росту мікроорганізмів середо-

вище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває

жовтого кольору.

Виходячи із даних таблиці, розчин стандарту пеніциліну затримує ріст тест-мікро-

бів у концентрації 0,025 ОД/мл, а досліджувана сироватка – в розведенні 1:8. Отже,

вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД/мл×8).

Таблиця 16

Визначення концентрації пеніциліну в сироватці крові

Пробірки 1 2 3 4 5 6

Розведення сироватки 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

Ріст тест-мікробів - - - + + +

Концентрація стандарту

пеніциліну в середовищі,

ОД/мл

0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 0,0063

Ріст тест-мікробів - - - - + +

Примітка: “+” – ріст тест-мікробів, “-” – відсутність росту

Розділ 9

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють іму-

нологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імуно-

компетентними клітинами (лімфоцитами).

Основою імунологічних механізмів є те, що антитіла і лімфоцити, які утво-

рились при попаданні в організм антигену, реагують тільки з ним, а не з іншими

антигенами. Головною функцією антитіл є зв’язування антигену і його подальше

видалення з організму.

Проте такі реакції між антигенами і антитілами можуть відбуватись і поза

організмом (in vitro) у присутності електроліту. Виходячи з їх специфічності, ре-

акції можливі лише тоді, коли антитіло та антиген комплементарні один одному.

Маючи специфічні антитіла проти певного антигена, можна розпізнати і визначи-

ти його серед інших. І, навпаки, можна виявити в сироватці крові антитіла проти

конкретного антигена. На цьому принципі базуються всі імунологічні діагностичні

реакції, які назвали серологічними, тому що антитіла знаходяться в сироватці крові

людей і тварин (serum – сироватка).

Реакція антиген-антитіло in vitro супроводжується виникненням декількох

феноменів – аглютинації, преципітації, лізису. Зовнішній прояв реакції залежить

від фізико-хімічних властивостей антигена, класу антитіл і умов середовища.

Аглютинація і преципітація характеризуються утворенням видимих агрегатів

внаслідок об’єднання багатьох комплексів антиген-антитіло. Лізис зумовлений

зв’язуванням комплементу комплексом антиген-антитіло з наступним руйнуван-

ням клітини.

Антитіла, що беруть участь у реакції, відповідно до кожного феномена нази-

вають аглютинінами, преципітинами, лізинами.

Таким чином, всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою:

1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-

діагностикумів – для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для виз-

начення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартни-

ми сироватками-антитілами – для серологічної ідентифікації збудників. При цьо-

му невідомий компонент визначають за відомим. Наприклад, якщо сироватка

Частина ІІ

ІМУНОЛОГІЯ

126

Частина ІІ. Імунологія

хворого реагує з конкретним мікробним антигеном, це означає, що в сироватці є

антитіла проти даного мікроорганізму. А вид збудника, виділеного із патологічно-

го матеріалу, визначають за допомогою відомої імунної сироватки (антитіла).

Відповідно до цього, в серологічних реакціях завжди використовують один

компонент стандартний, інший, який виявляють, одержують від хворого. Так, для

серологічної діагностики беруть стандартні антигени – діагностикуми: суспензії

інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному

розчині. Для серологічної ідентифікації застосовують стандартні імунні сироват-

ки. Їх одержують шляхом гіперімунізації тварин відповідними бактерійними чи

вірусними антигенами, в результаті якої в крові проти них з’являється значна

кількість антитіл. Одержавши сироватку крові імунізованої тварини і очистивши

від баластних речовин, її використовують як імунну сироватку. При одержанні

такої сироватки визначають її титр – найбільше розведення, в якому ще прояв-

ляється реакція з відповідним антигеном. Набори із різноманітних діагностикумів

та імунних діагностичних сироваток є в кожній бактеріологічній лабораторії.

Усі імунологічні методи, що вживаються для діагностики інфекційних захво-

рювань можна поділити на три групи:

1. Тести, в яких відбувається безпосередня взаємодія антигена з антитілом.

До цієї групи належать: імунофлуоресценція, радіоімунні та імуноензимні тести.

2. Тести, в яких відбуваються різні фізико-хімічні реакції або беруть участь

додаткові елементи (носії, комплемент). До них належать: імунодифузія, імуно-

електрофорез, пряма аглютинація (бактерійна), непряма аглютинація з викорис-

танням еритроцитів (пасивна гемаглютинація), латексу (латексна аглютинація) або

інших часточок, таких як бентоніт, холестерол, деревне вугілля, коаглютинація

(використання білка А Staphylococcus aureus) і реакція зв’язування комплементу.

3. Тести, що базуються на використанні певних біологічних ефектів, наприк-

лад, опсонізація, фагоцитоз, хемотаксис. До них належать: опсонофагоцитарна

проба, хемотаксис, імуноадгезія, клітинна дегрануляція.

Реакція аглютинації (РА)

Аглютинація – це серологічна реакція між антитілами (аглютинінами) і анти-

генами (аглютиногенами), розміщеними на поверхні бактеріальної клітини. Ця

реакція призводить до утворення специфічного комплексу антиген – антитіло

(аглютинат).

Клітини з приєднаними до них аглютинінами з’єднуються в агрегати, внаслі-

док чого рівномірна суспензія клітин, спочатку мутна, склеюється в пластівці, які

зависають у прозорій рідині або осідають на дно. В аглютинації беруть участь

виключно поверхневі антигени, які доступні антитілам. Антигени, розміщені у

внутрішніх структурах клітини, не беруть участі в цій реакції. Механізм аглюти-

нації полягає в тому, що під впливом іонів електроліту зменшується негативний

поверхневий заряд бактерійних клітин, і вони можуть зблизитись на таку відстань,

при якій виникає склеювання бактерій (рис. 42).

127

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Реакцію проводять на склі, пластмасо-

вих пластинках, у пробірках, лунках полі-

стиролових планшет.

Аглютинацію на склі або пластинках

найчастіше використовують для ідентифі-

кації бактерій з допомогою відомих сиро-

ваток; аглютинація в пробірках і планше-

тах – з метою виявлення титру аглютинінів

у сироватці хворого з допомогою відомих

діагностикумів.

Найбільше розведення сироватки, при

якому ще спостерігається аглютинація бак-

терій, приймається за її титр, який характе-

ризує рівень специфічних аглютинінів.

Макроскопічний і мікроскопічний вигляд аглютинації бактерій залежить від

виду поверхневих антигенів, які беруть участь у реакції. Аглютиніни, які реагу-

ють з О-соматичним антигеном, дають дрібнозернисту аглютинацію. Соматична

аглютинація в пробірках завершується через 24 години, при цьому виникають ком-

пактні зерна, крупинки, які важко розбити при струшуванні. При мікроскопії вид-

но, що бактерії склеюються полюсами, утворюючи сітку.

В аглютинації з поверхневими Vi-антигенами спостерігається склеювання

бактерій між собою всією поверхнею, що дає рівномірний осад. У певній мірі

макроскопічно Vi-аглютинація нагадує соматичну.

Сироватки, які містять антитіла проти джгутиків бактерій, аглютинують знач-

но швидше. Вже через 30-40 хв окремі конгломерати бактерій у вигляді пластівців

вільно осідають на дно пробірки. Аглютиніни анти-Н безпосередньо взаємодіють

з джгутиками, знерухомлюючи бактерії. Мікроскопічно можна спостерігати скле-

ювання бактерійних клітин з допомогою джгутиків. Це крупнопластівцева, або

Н-аглютинація (рис. 43).

Постановка РА. Існує дві різновидності постановки реакції: орієнтовна аглю-

тинація на склі й розгорнута аглютинація в пробірках.

Реакція аглютинації на склі. На предметне скло наносять роздільно 2 краплі

специфічної сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. В краплю

Рис. 42. Реакція аглютинації.

Рис. 43. Аглютинація бактерій: а – О-аглютинація (соматична), дрібнозерниста;

б – Vi-аглютинація; в – Н-аглютинація (джгутикова), крупнопластівцева.

абв

128

Частина ІІ. Імунологія

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

0,85 % розчин хлориду

натрію

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - 1,0

ОК-колі сироватка

в розведенні 1:50

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

↓

1,0 -

Розведення

сироватки

1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Cуспензія E.coli

(краплі)

2 2 2 2 2 2 - 2

Термостат 37 °С – 2 год.

Результат

ізотонічного розчину й одну з крапель сироватки бактеріологічною петлею вно-

сять досліджувану культуру й ретельно її емульгують. Після внесення культури в

одну із крапель необхідно простерилізувати петлю, знову набрати культуру і вне-

сти її у другу краплю. Крапля сироватки, куди не вносили культури, є контролем

сироватки.

Реакція проходить досить швидко при кімнатній температурі. Якщо конт-

рольна крапля сироватки залишається прозорою, в краплі ізотонічного розчину –

рівномірне помутніння, а в краплі, де культура змішана з сироваткою, з’являються

зернистість або пластівці, реакція вважається позитивною.

Проте орієнтовна реакція аглютинації дозволяє зробити лише попередній

висновок про виділену культуру, тому що багато бактерій мають спільні антигени.

Щоб остаточно підтвердити або відкинути попередній висновок ставлять

розгорнуту реакцію аглютинації (табл. 17). Діагностичні аглютинуючі сироватки,

які одержані шляхом гіперімунізації тварин, мають високий титр (1:20000-1:40000

і вище).

Таблиця 17

Постановка реакції аглютинації для ідентифікації E. coli

Спочатку готують робоче розведення сироватки (1:50 або 1:100), із якого на-

далі одержують двократні розведення від 1:100 до титру, вказаного на ампулі з

сироваткою. Для цього в ряд пробірок розливають по 1 мл ізотонічного розчину,

потім у першу пробірку вносять такий же об’єм сироватки робочого розведення і

після перемішування 1 мл переносять у другу, звідти в третю і т.д., а в передостан-

ню пробірку додають 1 мл сироватки робочого розведення. В останню пробірку

сироватку не вносять. Потім у всі пробірки додають по дві краплі досліджуваної

культури.

Контрольні пробірки – дві останні. Передостання – контроль сироватки, остан-

ня – контроль антигену. Після струшування штатив із пробірками поміщають у

термостат при 37 °С на дві години і згодом залишають при кімнатній температурі

до наступного дня. Після чого проводять облік результатів. Якщо реакція вияви-

лась позитивною до титру або до половини титру, вона вважається достовірною.

129

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Розгорнуту реакцію аглютинації ставлять і при серологічній діагностиці захво-

рювання. Тільки в цьому випадку роблять ряд послідовних розведень сироватки

хворого (1:100-1:1600) і до кожного розведення додають по дві – три краплі діаг-

ностикуму.

При деяких інфекційних захворюваннях реакції аглютинації, що вживають-

ся з діагностичною метою, мають свої назви: при черевному тифі – реакція Віда-

ля, висипному тифі – реакція Вейгля, при бруцельозі – реакція Райта (табл. 18).

Таблиця 18

Схема постановки реакції аглютинації Райта

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду натрію 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - 1,0

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

↓

1,0 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Бруцельозний

діагностикум (краплі)

3 3 3 3 3 3 3 3

Термостат 37

С 18-20 год

Результат

Реакція непрямої аглютинації (РНГА). За своєю чутливістю значно пере-

вищує пряму реакцію аглютинації і дозволяє виявити мінімальну кількість ан-

титіл і антигенів. Така висока чутливість досягається завдяки адсорбції антигенів

або антитіл на спеціальних інертних частинках (латекс, бентоніт) або клітинах

(еритроцити). Якщо антигени адсорбовані на еритроцитах, така реакція називається

реакцією непрямої (пасивної) гемаглютинації (рис. 44).

Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних

антитіл і випадають у вигляді пухкого осаду з нерівним фестончастим краєм (пе-

ревернутої “парасольки”) на дні пробірок або лунок.

Антигени для РНГА називаються еритроцитарними діагностикумами. Це стан-

дартні препарати, які складаються з антигенів різних бактерій і вірусів, адсорбо-

ваних на поверхні еритроцитів. За допомогою еритроцитарних діагностикумів

можна виявляти в сироватці хворих антитіла до будь-якого збудника.

Рис. 44. Схема реакції непрямої гемаглютинації.

130

Частина ІІ. Імунологія

РНГА можна використовувати й для серологічної ідентифікації збудника. У

цьому випадку як індикатор використовують еритроцити, навантажені відповід-

ними антитілами. При додаванні до них культури збудника виникає феномен гема-

глютинації. На відміну від попередньої реакції, її називають реакцією оберненої

(зворотної) непрямої гемаглютинації (РОНГА).

Недоліком непрямої (пасивної) гемаглютинації є те, що антитіла, які знахо-

дяться на поверхні еритроцитів, можуть не викликати їх склеювання. Частково це

можна пояснити тим, що поверхня еритроцитів має негативний електричний за-

ряд, який заставляє їх триматися на відстані близько 25 нм один від одного. Вони

можуть аглютинуватись у присутності специфічного антигену лише тоді, коли не-

гативний заряд зменшиться настільки, щоб еритроцити могли зблизитись. Цього

можна досягти, додаючи до середовища альбумін (5-30 %), декстран або полівініло-

вий піримідон. Ці сполуки мають позитивний заряд, який нейтралізує негативні

заряди еритроцитів. Зняти негативний заряд можна також, діючи на еритроцити

такими ферментами як трипсин, папаїн та ін. Завдяки цьому, еритроцити зближу-

ються між собою і можуть утворювати зв’язки між антигенами та антитілами.

Реакція непрямої гемаглютинації широко використовується у діагностиці ві-

русних, бактеріальних, грибкових і паразитарних інфекцій. Для навантаження ерит-

роцитів найчастіше використовують полісахаридні антигени бактерій або грибів,

які легко адсорбуються на поверхні свіжих еритроцитів барана і людини групи О

Rh(-). Поверхню еритроцитів можна змодифікувати, використовуючи хімічні спо-

луки (танін, двоазобензидин) і тоді на них можна адсорбувати і білкові антигени.

РНГА відноситься до найбільш чутливих реакцій у порівнянні з аглютина-

цією, преципітацією і зв’язуванням комплементу. З допомогою цієї реакції анти-

тіла в сироватці хворого при деяких захворюваннях виявляють вже з третьої доби

від моменту зараження.

Методика постановки РНГА. У ряд лунок полістиролової планшети нали-

вають по 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, потім у першу лунку вно-

сять 0,5 мл сироватки хворого (1:50) і одержують розведення сироватки 1:100. З

першої лунки переносять 0,5 мл у другу, одержують розведення 1:200, з другої в

третю і т.д., крім останньої. З передостанньої лунки 0,5 мл виливають, потім в усі

лунки додають по 0,25 мл відповідного еритроцитарного діагностикуму (табл. 19).

Планшети поміщають у термостат при 37 °С на 2-3 год.

Результат реакції оцінюють за виглядом осаду еритроцитів, починаючи з кон-

тролю, де вони повинні осісти на дно у вигляді круглого компактного осаду з

рівними краями. У лунках із сироваткою при позитивній реакції осад буде мати

нерівні краї і покриватиме майже всю лунку.

Інтенсивність РНГА оцінюють за чотириплюсовою системою: якщо майже

всі еритроцити аглютинувались і утворився осад, який нагадує перевернуту “па-

расольку”, – реакція позитивна (++++, +++); не всі еритроцити аглютинувались,

мереживоподібний осад меншого розміру (++); більшість еритроцитів не склеїлись

і утворюють у центрі дна лунки компактний диск з нерівними краями – реакція

слабопозитивна (+) (рис. 45).

131

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Реакція аглютинації латекса (РАЛ) за своїм механізмом аналогічна РНГА,

в якій беруть участь еритроцити, сенсибілізовані антигенами або антитілами. Для

постановки РАЛ використовують сенсибілізовані частинки полістиролового ла-

текса діаметром 0,5-1,2 мкм, які в присутності гомологічного імунологічного реа-

генту (антигену або антитіла) склеюються. Ця реакція відбувається досить швид-

ко (2-7 хв), що дозволяє застосовувати її як експрес-метод виявлення антигенів і

антитіл.

Навантажені антитілами часточки латексу широко використовують для вияв-

лення антигенів вірусів і бактерій. Наприклад, антигени стрептококів у мазках із

зіву можна виявити вже через 10-60 хв. Збудників, які викликають запалення моз-

кових оболонок (H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, C. neoformans), мож-

на безпосередньо виявити протягом 15 хв. Латекс-аглютинація широко вживаєть-

ся для ідентифікації антигенів ротавірусів, герпесвірусів тощо. Чутливість цих

тестів сягає понад 90 %, а специфічність – 97-99 %. РА Л використовують також

для ідентифікації деяких бактерій (наприклад групи Streptococcus за Ленсфільд,

групи Salmonella та інші.). Останнім часом у деяких латекс – системах замість

поліклональних сироваток використовують частинки латексу, навантажені моно-

клональними антитілами (наприклад, для виявлення S. agalactiae).

Навантажуючи латекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у си-

роватці хворого. Таку модифікацію РАЛ використовують для виявлення протиг-

рипозних, протикраснушних, протикорових антитіл тощо.

Реакцію аглютинації латексу можна проводити на склі або рівній пластма-

совій пластинці темного кольору, додаючи до 1-2 крапель кожного розведення

сироватки по 1 краплі латексного діагностикуму. Залежно від досліджуваного

матеріалу, величини частинок латексу та активності діагностикуму облік резуль-

татів можна проводити через 1-10 хв після змішування інгредієнтів.

При позитивній ре-

акції частинки латексу

склеюються, утворюючи

аглютинат, який добре

Лунки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду натрію 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

↓

0,5 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Еритроцитарний

діагностикум

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - 0,25

Термостат 37

С – 2-3 год

Результат

Таблиця 19

Схема постановки РНГА

Рис. 45. Результат постановки РНГА.

132

Частина ІІ. Імунологія

помітний неозброєним оком або при використанні лупи з невеликим збільшен-

ням. У випадку негативної реакції суспензія латексу залишається мутною, без

крупинок аглютинату і ділянок просвітління.

Ще простішою є РА Л при використанні комерційних наборів США

“Rubascan”. Одну краплю нерозведеної сироватки наносять на пластинку темного

кольору, яка входить в цей набір, розприділяють її піпеткою або бактеріологічною

петлею в межах визначеного на пластинці кільця і вносять 1 краплю латексового

антигенного діагностикуму. Пластинку кладуть на столик ротатора у вологій ка-

мері і через 8 хв проводять облік результатів.

Для ранньої діагностики вірусних інфекцій використовуєть модифікацію цієї

реакції, яка дозволяє виявити у сироватці хворого специфічні IgM. З цією метою

застосовують частинки латексу, сенсибілізовані вірусним антигеном. Спочатку в

лунки полістиролової пластинки вносять антисироватку проти IgM людини, потім

досліджувану сироватку хворого з підозрою на вірусну інфекцію. IgM – антитіла

сироватки хворого міцно зв’язуються з антитілами проти IgM, які знаходяться в

лунці, на них адсорбуються частинки латексу, які попередньо були навантажені

відповідним вірусним антигеном. У випадку відсутності специфічних противі-

русних IgM у сироватці частинки латексу вільно осідають на дні луночки у виг-

ляді компактного осаду (гудзика) – реакція негативна. Така реакція характери-

зується високою специфічністю і дає такі ж результати, як і значно складніші за

постановкою імуноферментні методи.

Реакція коаглютинації (КОА).Для постановки КОА використовують золо-

тисті стафілококи (штам Cowan 1). У клітинній стінці цих мікроорганізмів містить-

ся білок А, який має значну спорідненість до Fc-фрагмента IgG людини і кролика.

Тому молекули IgG після адсорбції на стафілококах, що мають білок А, орієнто-

вані в оточуюче середовище своїми вільними Fab-фрагментами, в яких знаходить-

ся активний центр антитіла (рис. 46).

Цим стафілококові діагностикуми відрізняються від інших антитільних пре-

паратів, в яких носії (еритроцити, бентоніт, латекс) не мають специфічних рецеп-

торів для Fc-фрагмента IgG. На таких інертних частинках молекули імуноглобулінів

адсорбуються будь-якою ділянкою, без суворої просторової конфігурації.

Для одержання антитільного стафілококового діагностикуму культуру стафі-

локока, яка виросла на рідкому живильному середовищі, центрифугують при 2500-

3000 об/хв протягом 15 хв. Центрифугат двічі промивають ізотонічним розчином

хлориду натрію, готують 10 % суспензію бактерій і фіксують їх 0,5-3,0 % форма-

Рис. 46. Схема реакції коаглютинації.

стафілококовий діагностикум антиген

133

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

ліном протягом 20-120 хв. Після фіксації стафілококи промивають 4 рази ізотоні-

чним розчином хлориду натрію і знову готують 10 % суспензію, яку прогрівають

протягом 1 години при температурі 80 °С. Перед зберіганням до суспензії стафі-

лококів додають мертиолят до кінцевої концентрації 1: 10000.

Для сенсибілізації в 10 % суспензію фіксованих стафілококів вносять рівний

об’єм імунної сироватки кролика або її гамаглобулінової фракції у відповідному

розведенні від 1:10 до 1:20. Стафілококи сенсибілізують імуноглобулінами впро-

довж 15-30 хв при температурі 20-30 °С, після чого промивають ізотонічним роз-

чином. Готують 0,5-5,0 % суспензію, яку консервують азидом натрію і зберігають

у холодильнику при температурі 4 °С.

Зазвичай, реакцію коаглютинації ставлять на скляних пластинках, змішуючи

рівні об’єми (1-2 краплі) досліджуваного матеріалу (кров, сеча, слина, фільтрати

фекалій та ін.) і стафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують і

через 2-5 хв на темному фоні враховують результати. Використання темного фону –

необхідна умова чіткої реєстрації реакції КОА, тому що при спостереженні за її

результатами при звичайному освітленні лише на темному фоні чітко буде прогля-

датись дрібнозерниста аглютинація стафілококів.

Кожен дослід повинен супроводжуватись декількома негативними контролями:

1) стафілококи, сенсибілізовані нормальною сироваткою + досліджуваний

матеріал; 2) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + матеріал, який не

містить збудника; 3) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + фосфатно-

буферний розчин; 4) дослідуваний матеріал + фосфатно-буферний розчин.

Реакція КОА широко використовується для виявлення антигенів різних стреп-

тококів, N. meningitidis i N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, шигел, саль-

монел тощо.

На відміну від бактерій, які часто досліджують у чистій культурі, віруси зав-

жди виявляють в якомусь біологічному матеріалі. Тому, щоб попередити неспе-

цифічні реакції, необхідна адсорбція суспензією стафілокока матеріалу, в якому

можуть міститись IgG (кров, фекалії). Для цього змішують рівні об’єми 10 % за-

висі стафілококового реагенту і досліджуваного вірусного матеріалу. Суміш інку-

бують протягом 30 хв при 37 °С, центрифугують і надосадову рідину використо-

вують для подальшої роботи для виявлення в ній збудників хвороби.

Метод з успіхом використовується для ідентифікації вірусів грипу, параміксо-

вірусів, ротавірусів, вірусів гепатиту В тощо.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) набула широкого розповсю-

дження для діагностики вірусних інфекцій. Її можна застосовувати як для серо-

логічної ідентифікації вірусів, так і для серологічної діагностики. Гемаглютина-

ція – це феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Деякі віруси мають

на своїй оболонці рецептори, комплементарні рецепторам поверхні еритроцитів

певних тварин, і при додаванні до суспензії вірусів еритроцитів, останні склею-

ються. Наприклад, вірус грипу аглютинує еритроцити курей, вірус кліщового

енцефаліту – еритроцити гусей. Таким чином, у випадку гемаглютинації можна

зробити висновок про наявність вірусу в досліджуваному матеріалі. Проте ця

134

Частина ІІ. Імунологія

реакція не імунологічна, тому що в ній не бере участі основна система – антиген

і антитіло.

У той же час реакція гальмування гемаглютинації належить до серологічних

реакцій імунітету. У РГГА специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з віру-

сом і блокуючи поверхневі рецептори, позбавляють його здатності склеювати ерит-

роцити (рис. 47).

Рис. 47. Схема реакції гальмування гемаглютинації.

Лунки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду натрію 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

0,25→ 0,25→ 0,25→ 0,25→ 0,25→ 0,25↓

0,25 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Вірусний діагностикум 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - 0,25

Термостат 37

С – 30 хв

2 % суспензія курячих

еритроцитів

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Результат

Таблиця 20

Постановка РГГА для серологічної діагностики вірусних інфекцій

Для постановки РГГА в лунках полістиролових планшет готують послідовні

розведення сироватки в об’ємі 0,25 мл і змішують їх з аналогічною кількістю віру-

совмістного матеріалу. Суміш ставлять у термостат при 37 °С на 30 хв, після чого

в кожну лунку додають по 0,5 мл 1-2 % зависі еритроцитів (табл. 20).

Обов’язкові два контролі: контроль сироватки і контроль вірусу. Облік про-

водять після повторного 30-хвилинного перебування реагентів у термостаті. Якщо

досліджувана сироватка містить антитіла до даного вірусу, вона його нейтралізує,

і феномен гемаглютинації еритроцитів не настає (позитивна РГГА).

Реакцію нейтралізації (РН) в лабораторній практиці використовують до-

сить часто. Вона має декілька варіантів. З одного боку її все ширше ставлять для

нейтралізації вірусів, з другого – для нейтралізації бактерійних екзотоксинів.

Реакція нейтралізації вірусів. В основі цієї реакції лежить здатність спе-

цифічних антитіл міцно зв’язуватись з вірусами. В результаті віруси не можуть

адсорбуватись на чутливих клітинах і розмножуватись в них.

135

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Для постановки реакції необхідна наявність вірусу, сироватки, яка містить

антитіла, і біологічного об’єкта, який виступає індикатором нейтралізації. Залеж-

но від виду вірусу такими об’єктами можуть бути лабораторні тварини, курячі

ембріони, тканинні культури.

У реакції в якості антигена використовують культуральні рідини, алантоїсну

і амніотичну рідини курячих ембріонів, суспензії органів лабораторних тварин, в

яких репродукувались віруси. Залежно від мети дослідження в якості антитіла

застосовують або сироватки хворого – для встановлення концентрації противі-

русних антитіл, або стандартні противірусні сироватки – для ідентифікації збуд-

ника. У першому випадку використовують сироватки, які були взяті у хворого на

початку хвороби і в період реконвалесценції (метод парних сироваток).

Перед постановкою РН вірус попередньо титрують, визначаючи ту наймен-

шу концентрацію, яка викликає цитопатичну дію або зараження експерименталь-

них тварин чи курячих ембріонів. За титр вірусу приймають 50 % дозу (ЦПД

–

50 % цитопатична доза).

Для розведення вірусної суспензії при проведенні РН на лабораторних твари-

нах або курячих ембріонах використовують фосфатно-буферний розчин (рН 7,0-7,2).

При постановці реакції на культурі клітин вживають те середовище, в якому звичай-

но перебувають дані клітини (розчин Ігла, середовище 199, гемогідролізат тощо).

Реакцію нейтралізації ставлять таким чином. До послідовних розведень дос-

ліджуваних сироваток вносять по 100 ЦПД

вірусу і обидва реагенти інкубують

при температурі 37 °С протягом 1-2 годин.

Після чого до суміші вірусу і сироватки додають суспензію клітин або суміш

вводять в організм лабораторних тварин чи курячі ембріони. Про наявність у си-

роватці хворого віруснейтралізуючих антитіл свідчить відсутність цитопатичної

дії вірусу у культурі клітин або проявів інфікування лабораторних тварин (куря-

чих ембріонів).

Досить часто для діагностики вірусних інфекцій вживається модифікація

реакції нейтралізації – кольорова проба. В основі її лежить той факт, що в процесі

життєдіяльності культури клітин у поживному середовищі накопичуються кислі

продукти метаболізму, які зумовлюють зміну рН середовища і появу жовтого за-

барвлення.

При інфікуванні культури клітин деякими вірусами (ентеровіруси, реовіруси

та ін.) пригнічується клітинний метаболізм і розвивається деструкція клітин – рН

середовища не змінюється і колір середовища залишається рожевим. Нижче на-

водимо орієнтовну схему постановки такої реакції (табл. 21).

Реакція нейтралізації токсину антитоксином. При діагностиці деяких

інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксини, використову-

ють реакцію нейтралізації токсину антитоксином. Для її проведення досліджува-

ний матеріал, в якому передбачають наявність токсину, змішують з відповідною

антитоксичною сироваткою і після інкубації в термостаті вводять лабораторним

тваринам (білі миші, гвінейські свинки). Контрольним тваринам вводять тільки

досліджуваний матеріал. Якщо взята для досліду антитоксична сироватка нейтра-

136

Частина ІІ. Імунологія

Пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

Протидифтерійна антитоксична сироватка 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05

Дифтерійний анатоксин, 60 І.О. 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Водяна баня 45

Результат

лізує токсин, тварини залишаються живими. Контрольні тварини, яким сироватку

не вводили, гинуть від дії екзотоксину. Реакція нейтралізації вживається для вияв-

лення токсинів збудників ботулізму, правця, газової анаеробної інфекції. При бо-

тулізмі таку реакцію можна проводити в пробірках, використовуючи визначення

фагоцитарного показника в присутності токсину і при додаванні до нього анти-

токсичної сироватки. При наявності у досліджуваному матеріалі токсину фагоци-

тарний показник різко знижується, при нейтралізації токсину антитоксином фаго-

цитарний показник буде в межах норми.

Часто для визначення активності імунних антитоксичних сироваток і анаток-

синів вживається реакція нейтралізації за механізмом флокуляції (табл. 22).

Таблиця 22

Визначення активності імунної сироватки

Таблиця 21

Схема постановки реакції нейтралізації (кольорова проба)

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

Фосфатно-буферний

розчин

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

0,25

→

0,25

→

0,25

→

0,25

→

0,25

→

0,25

↓

0,25 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Вірусний діагностикум 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - 0,25

Термостат 37 °С – 30 хв

Суспензія культури

клітин

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Термостат 37

С – 6-8 д

Результат

У 6 пробірок вносять одержану протидифтерійну сироватку, активність якої

потрібно визначити, в зменшуючих кількостях від 0,5 до 0,05 мл. До них додають

відому кількість дифтерійного анатоксину по 180 І.О. і ставлять на водяну баню

при 45 °С. Час від часу виймають пробірки і розглядають їх, відмічаючи ту, в якій

наступила ініціальна флокуляція (помутніння чи пластівці). Визначають титр си-

роватки в антитоксичних одиницях в 1 мл. Приклад: ініціальна флокуляція відміче-

на в пробірці з 0,1 мл сироватки, тобто в 0,1 мл сироватки міститься 180 АО і вони

зв’язали 180 ІО анатоксину. Таким чином, в 1 мл сироватки міститься 180×10=

1800 АО.

137

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Реакція преципітації (РП)

За своєю сутністю реакція преципітації аналогічна реакції аглютинації. В ос-

нові її механізму лежить утворення і випадання в осад комплексів антиген-анти-

тіло. Проте вона відрізняється за характером антигенів: в реакції аглютинації вони

корпускулярні (цілі клітини), а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному

стані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні

речовини.

Феномен преципітації поля-

гає в тому, що антитіла (преципі-

тини), з’єднуючись із розчинними

антигенами (преципітиногенами),

зумовлюють утворення осаду (пре-

ципітату) або помутніння розчину

(рис. 48). За титр реакції прийма-

ють найбільше розведення антиге-

на, яке дає позитивний результат.

Реакція преципітації значно

більш чутлива від реакції аглютинації й дозволяє виявити антиген у дуже малих

кількостях. Її можна проводити в рідкому і щільному середовищах. Обов’язковою

умовою постановки реакції в рідкому середовищі є прозорість компонентів.

Реакція відбувається при змішуванні розчинів антигена й антитіла або наша-

руванні одного компонента на інший. В останньому випадку на межі двох реа-

гентів утворюється преципітат у вигляді кільця. Тому така реакція одержала назву

реакції кільцепреципітації.

Методика постановки реакції кільцепреципітації. У вузенькі преципі-

таційні пробірки наливають 0,5 мл преципітуючої сироватки, а потім обережно

пастерівською піпеткою нашаровують по стінці пробірки відповідний антиген. У

випадку позитивної реакції через 5-30 хв на межі двох рідин з’являється видиме

на темному фоні кільце молочно-білого кольору.

Для аналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципі-

тації в гелі. Розрізняють просту і подвійну дифузію в гелі.

Проста імунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, який містить преци-

пітуючу сироватку, поміщають

у вузькі пробірки і зверху наша-

ровують розчин антигена. Ди-

фундуючи в гель, антиген зв’я-

зується з відповідними анти-

тілами, утворюючи мутні лінії

преципітації (рис. 49, а). Розмі-

щення ліній в агарі визначаєть-

ся концентрацією відповідного

антигена.

Рис. 48. Схема реакції преципітації.

Рис. 49. Реакції імунодифузії.

антиген

преципітат

агар + специфічна

сироватка

антиген

агар

преципітат

агар + специфічна

сироватка

аб

138

Частина ІІ. Імунологія

Подвійна імунодифузія за Оклі і Фулторпом. На відміну від попереднього

методу у подвійній імунодифузії реагенти розділені шаром нейтрального гелю,

який не містить реагентів. На поверхню гелю, змішаного з специфічною сироват-

кою, вносять шар нейтрального гелю, після застигання якого нашаровують анти-

ген. Дифундуючи назустріч один одному, антиген і антитіла зустрічаються в шарі

нейтрального гелю та утворюють лінії преципітації (рис. 49, б).

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який розлитий тон-

ким шаром в чашках Петрі або на предметних скельцях, за допомогою спеціаль-

них штампів роблять круглі лунки на однаковій відстані одна від одної (4-10 мм).

У лунки вносять досліджувану сироватку і роз-

чин антигену в різних розведеннях або різні ан-

тигени. Із лунок антигени й антитіла дифунду-

ють назустріч один одному, і в точці їх оптималь-

ного співвідношення утворюється преципітат у

вигляді тоненьких білих ліній. Якщо в сироватці

є різні антитіла або антигени декількох видів,

з’являються декілька ліній преципітації (рис. 50).

Ухтерлоні розрізняв 4 основні варіанти ре-

акції між антигеном і антитілом (рис. 51):

1) при взаємодії ідентичних антигенів із специфічними антитілами лінії пре-

ципітації зливаються, утворюючи дугу;

2) коли обидва антигени неідентичні – лінії преципітації перехрещуються

при умові, що сироватка містить антитіла проти двох антигенів;

3) при частковій ідентичності лінії преципітації нагадують дугу із шпорою.

Чим більшою є спорідненість антигенів, тим менше виражена шпора і розміщується

ближче до дуги;

4) обидві лінії перехрещуються і одночасно зливаються. Це означає, що обидва

антигени містять як однакові, так і різні детермінанти, які вступають у реакцію з

антитілами поліспецифічної сироватки.

Однією із різновидностей реакції преципітації в гелі є проста радіальна іму-

нодифузія за Манчіні. За її допомогою визначають концентрацію імуноглобулінів

у сироватці крові.

Методика постановки реакції наступна. Розтоплений агар при температурі

56 °С змішують з відповідною антисироваткою (анти IgG, IgM чи IgA) у співвідно-

Рис. 50. Реакція подвійної

імунодифузії в гелі (Ухтерлоні).

Рис. 51. Варіанти результатів реакції імунодифузії за Ухтерлоні.

Антиген А Антиген А Антиген А1 Антиген А Антиген А Антиген В

Сироватка анти А Сироватка анти А Сироватка анти А

Сироватка анти В

139

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Рис. 52. Реакція радіальної імунодифузії за Манчіні.

шенні 3:1 і швидко виливають у чашку Петрі або на скляні пластинки. Після його

застигання з допомогою трафарету роблять лунки. У кожну дослідну лунку вно-

сять по 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні лунки додають у

чотирикратних розведеннях стандартну сироватку з відомим вмістом імуногло-

булінів. Після чого чашки або пластинки поміщають у вологу камеру (ексикатор)

на 24-48 год при 4 °С і оцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець

преципітації навколо лунок. За величиною цих діаметрів кілець преципітації на-

вколо лунок із стандартною сироваткою будують калібрувальну криву. При цьому

враховують, що у певному інтервалі концентрації імуноглобулінів діаметр кільця

прямо пропорційний логарифму концентрації імуноглобулінів (рис. 52).

Феномен преципітації широко використовується в мікробіологічній практиці.

Зокрема, в судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової

належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти

білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить

виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів

(м’ясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспі-

нального менінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція термо-

преципітації Асколі, яку використовують для визначення інфікованості збудником

сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із

досліджуваного матеріалу шляхом кип’ятіння екстрагують сибірковий антиген,

який потім використовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі

яких лежить феномен преципітації. Її використовують для визначення антигенно-

го складу органів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у

складних системах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та

інших захворювань.

Зустрічний імуноелектрофорез. При діагностиці різноманітних бактеріаль-

них і вірусних інфекцій досить часто використовують метод зустрічного електро-

форезу, результати якого можна одержати вже через 1-2 години після надходжен-

ня матеріалу в лабораторію. Будучи порівняно простим у методичному відношенні,

він, як і всі імунодифузійні методи, відзначається дуже високою специфічністю.

Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – електрофорезу в гелі і на-

ступної після нього подвійної імунодифузії.

Зона преципітації Розчин досліджуваної сироватки

Розчин сироватки

анти Ig G

в 1 % гелі

1234

140

Частина ІІ. Імунологія

Для проведення реакції імуноелектрофорезу використовують скляні пластин-

ки, предметні скельця, на які наносять тонкий шар агару або агарози. Спочатку

антигени розміщують у центрі пластинки і розділяють їх в електричному полі.

Потім у канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії розділу антигенів, вносять

специфічну сироватку. Дифундуючи назустріч один одному, антигени і антитіла у

місці контакту утворюють дуги преципітації (рис. 53).

Основні етапи проведення зустрічного лектрофорезу:

1. Наносять розтоплений гель тонким шаром 1,2-1,7 мм на поверхню скляної

пластинки. Після застигання з допомогою спеціального шаблона вирізають в ньо-

му лунки.

2. У лунки вносять досліджуваний матеріал і стандартні реагенти (антиген-

місткий матеріал – ближче до катода, імунну сироватку – ближче до анода).

Якщо процедуру проводять на ацетилцелюлозних мембранах, то наносять по

одній краплі реагентів на поверхню попередньо зволоженої мембрани.

3. Скляні пластинки

розміщують в апараті і

проводять електрофорез

при оптимальній напрузі

і визначеній силі струму

протягом 30-60 хв.

4. Попередній облік

результатів проводять за

кількістю ліній преципі-

тації, їх локалізації, част-

ковою чи повною іден-

тичністю у порівнянні із

стандартними реаген-

тами.

5. Промивають пла-

стинки у відповідному

розчині, фарбують, вису-

шують і проводять заключ-

ний облік результатів.

Реакція лізису

Для реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном мо-

жуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) ви-

користовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того,

проти яких клітин спрямована дія лізинів, вони мають свої назви: проти бактерій –

бактеріолізини, спірохет – спірохетолізини, еритроцитів – гемолізини, проти інших

клітин – цитолізини. Комплемент при утворенні комплексу клітина (антиген) –

антитіло, зв’язується з ним, активується за класичним шляхом і викликає розчи-

Рис. 53. Схема проведення зустрічного імуноелектрофорезу.

141

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

нення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька

реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу. Реакцію бактеріолізу з діагнос-

тичною метою практично не використовують. Частіше ставлять реакції гемолізу

й цитолізу.

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити бара-

на), антитіло (гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської

свинки або стандартний сухий комплемент). Для одержання еритроцитів у барана

беруть кров із яремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергій-

но струшують, щоб нитки фібрину намотались на кульках, і кров не згорнулась.

Потім ізотонічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми.

Для цього кров центрифугують 10 хв при 2000 об/хв. Плазму відсмоктують піпет-

кою, а до осаду еритроцитів знову додають ізотонічний розчин, ретельно пере-

мішують і центрифугують. Таке промивання еритроцитів роблять тричі. Рідину

обережно відсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотоніч-

ному розчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації кроликів

еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої готують

сироватку, де містяться антитіла проти еритроцитів. Для інактивації комплементу,

що знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і визначають титр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у потрійному титрі.

Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до 1:600. Комплемент

беруть у розведенні 1:10 (табл. 23).

Таблиця 23

Схема постановки реакції гемолізу

Пробірки

Компоненти, мл

1 2 3

Гемолізин у потрійному титрі 0.5 0.5 -

3 % суспензія еритроцитів барана 0.5 0.5 0.5

Комплемент 1:10 0.5 - 0.5

0,85 % розчин хлориду натрію - 0.5 0.5

Термостат 37

С – 60 хв

Результат (гемоліз) + - -

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити лізувались. Рідина

червоного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні пробірки немає.

Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осіли на дно, рідина над ними

безбарвна.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь

в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у ви-

гляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює

візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що

142

Частина ІІ. Імунологія

при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди приєднується комп-

лемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент не

зв’язується, залишається вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити

барана – гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, викликає гемоліз

еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповідності антигена

антитілу з ним зв’язується комплемент. Щоб переконатись в цьому, додають ерит-

роцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висно-

вок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна (рис. 54).

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні сироватки

відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку прогріва-

ють при 56 °С протягом 30 хв, для інактивації власного комплементу, а потім готу-

ють ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами мо-

жуть бути бактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні речовини, екст-

ракти органів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою гвінейсь-

кої свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку використовують у потрійно-

му титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині

хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолітичні си-

роватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому

зберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед основним дослі-

дом титрують (табл. 24). У ряді пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні роз-

ведення гемолізину до титру. У кожну пробірку вносять по 0,5 мл 3 % зависі ерит-

роцитів, по 0,5 мл комплементу у розведенні 1:10 і по 0,5 мл фізіологічного розчи-

ну. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину. При відсутності гемолізу

в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за трьохплюсовою систе-

мою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), відсутність гемолізу (–).

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її розведення, яке в

присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть

робочу дозу гемолітичної сироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки

складав 1:1800, то робочою дозою буде 1:600.

Рис. 54. Схема реакції зв’язування комплемента.

Дослідна система

АНТИГЕН

(Бактерія, клітина,

вірус тощо)

КОМПЛЕМЕНТ

АНТИТІЛО

(сироватка)

Комплемент зв’язався з комплексом

антиген-антитіло

Індикаторна гемолітична система

ЕРИТРОЦИТИ БАРАНА

(АНТИГЕН)

ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКА

(АНТИТІЛО)

Комплемента немає – зв’язався з дослідною

системою.

Без комплемента гемоліз еритроцитів

неможливий.

143

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК для визначення

дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб повністю

зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу зали-

шиться незв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, ос-

танні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний

результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом додають 1 мл

ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково розводять 1:10 і використову-

ють як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози комплементу,

починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого об’єму 1,5 мл

додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з рівних об’ємів

3% суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в робочому титрі. Її

витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що необхідно для зв’язування

еритроцитів із гемолізином (табл. 25).

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробірки вно-

сять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 – 0,5 мл ізотонічного розчину.

Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину.

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром комплементу буде

та його найменша кількість, при якій спостерігається повний гемоліз (+++). Робо-

ча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і практично вона

буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій пробірці, де є

повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу приймають 0,25,

ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Таблиця 24

Схема титрування гемолітичної сироватки

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5

компле-

менту

гемолі-

тичної

сиро-

ватки

еритро-

цитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,5

Гемолітична сироватка

в розведенні 1:150

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

↓

- 0,5 -

Розведення сироватки 1:300 1:600 1:1200 1:2400 1:4800 - 1:150 -

3 % суспензія

еритроцитів барана

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Комплемент у

робочому титрі (1:10)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - -

Термостат 37

С – 60 хв

Результат

144

Частина ІІ. Імунологія

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК

запропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з

цією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний

об’єм її становить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній послідовності. Спочатку в

пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають рівні об’єми

антигена і комплементу в робочій дозі. Пробірки ретельно струшують і ставлять у

термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з антитілом, і на

цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в термостаті інкубують гемо-

літичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду додають по 1 мл

гемолітичної системи і знову ставлять у термостат. Через 30-45 хв проводять облік

реакції при умові повного гемолізу в контролях сироватки, антигена і комплемен-

ту (табл. 26).

Таблиця 26

Схема постановки основного досліду РЗК

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5

компле-

менту

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду

натрію

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

↓

0,5 0,5 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:100 1:100 -

Специфічний антиген 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5

Комплемент у робочому

титрі

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 0,5

Термостат 37 °С – 60 хв

Гемолітична система 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Термостат 37 °С – 60 хв

Результат

Таблиця 25

Схема титрування комплементу

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Комплемент у

розведенні 1:10

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,5 -

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1,0 1,0 1,5

Термостат 37 °С – 30 хв

Гемолітична система 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Термостат 37

С – 60 хв

Результат

145

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

РЗК оцінюють за чотириплюсовою системою: різко позитивна реакція (++++,

+++) – повна затримка гемолізу, рідина безколірна або блідо-рожевого кольору,

еритроцити осідають на дно; позитивна реакція (++) – часткова затримка гемолі-

зу, рідина рожевого кольору, компактний осад еритроцитів; сумнівна реакція (+) –

незначна затримка гемолізу, на дні ледь помітний осад, рідина рожевого кольору;

негативна реакція (–) – повний гемоліз, осад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу відзначається більш високою специфічні-

стю ніж реакція аглютинації, проте вона менш чутлива. Антитіла, які зв’язують

комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту захворювання, в той же час

аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох інфекцій-

них захворювань, алергічних станів. Вона використовується для серологічної діаг-

ностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, лептоспірозу, бруцельозу,

туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та ін.), вірусного походження (грипу, паро-

титу, цитомегалії, поліомієліту, лімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), гриб-

кових (кандидозу, асперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

Реакція імунофлуоресценції (РІФ)

Позитивні результати реакцій аглютинації, преципітації, лізису, РЗК й інших

спостерігають тільки при оптимальному співвідношенні реагентів. Якщо ця умова

не виконується, зафіксувати видимий позитивний результат не завжди вдається.

Чутливість імунологічних реакцій значно зростає завдяки використанню міче-

них реагентів, наприклад, антитіл, кон’югованих з флуохромом. При зв’язуванні

таких імуноглобулінів з антигеном в люмінесцентному мікроскопі спостерігають

світіння об’єктів (бактерій, вірусів, клітин), покритих міченими антитілами. Імуно-

флуоресцентним методом можна також визначати антитіла в сироватці хворого,

на поверхні клітин і тканин. У цьому випадку використовують мічені флуоресцеї-

ном сироватки проти глобулінів людини (антиглобулінові), якими обробляють ком-

плекс антиген-антитіло. Внаслідок цього він під дією ультрафіолетових променів

починає світитись зеленим світлом.

У першому випадку говорять про прямий, у другому – про непрямий імуно-

флуоресцентний метод (рис. 55).

Імунофлуоресцентні методи вживаються для виявлення аутоантитіл до тка-

нинних і клітинних антигенів. Використовуючи зрізи тканин, на предметному склі

можна виявити антитіла до декількох різних антигенів.

З допомогою імунофлуоресцентних методів можна ідентифікувати окремі

клітини в суспензії клітин з допомогою виявлення антигенів на поверхні живих

клітин. Для цього суспензію живих клітин, які були попередньо пофарбовані флуо-

ресцентними барвниками, пропускають через спеціальний прилад (цитофлуори-

метр), який заміряє інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектра

і потім розділяє клітини за параметрами світіння.

146

Частина ІІ. Імунологія

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один

з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний

відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і анти-

тіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка

залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону

може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людсь-

ких тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як

пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні

технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці;

особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулю-

ючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діаг-

ностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міче-

ним пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат

(наприклад, Н

, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу,

в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста,

проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з інши-

ми методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утво-

рюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять про-

тиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплек-

сом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсор-

бованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення (рис. 56).

Рис. 55. Реакція імунофлуоресценції (прямий і непрямий методи).

Флуоресцуюче

антитіло

Антитіло

Антиген

фіксований

на слайді

Антиген

фіксований

на слайді

Фіксоване

антитіло

Флуоресцуючий

анти-імуноглобулін

ПРЯМИЙ МЕТОД НЕПРЯМИЙ МЕТОД

147

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші анти-

тіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші

спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості сис-

теми авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінан-

ти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати

для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн

або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали за-

стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може

бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пе-

роксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже

розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні анти-

тіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точні-

шої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпо-

пуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних

антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер-

оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне анти-

тіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюєть-

ся продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим

моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксида-

за, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох

випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в на-

ступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових

планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген

чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану

сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів

людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат

промивка промивка

Рис. 56. Схема імуноферментного методу:

1 – тверда фаза з фіксованим антигеном; 2 – немічене антитіло, зв’язане з антигеном;

3 – антиглобулін, кон’югований з ензимом, зв’язаний з комплексом антиген-антитіло;

4 – внесення субстрату; який розкладається ензимом; 5 – зміна забарвлення в лунці

свідчить про присутність ензиму, а значить, відповідно антитіла.

12 3 4 5

148

Частина ІІ. Імунологія

для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція,

після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас-

тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики спе-

цифічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди-

фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердо-

му носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сиро-

ватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні анти-

тіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном,

мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в

луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних ан-

титіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном,

фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостері-

гається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких засто-

совують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій –

H і йод –

125

J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників γ-проміння, в

яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи анти-

тіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного

зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена,

який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість

досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розмі-

щене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають

антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в

матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом міче-

ний антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У

даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До

утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке

зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості

зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення ан-

тигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді

антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений

антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості дослі-

джуваних антитіл.

149

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergo-

sorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST

(paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (фільтрувальний

папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані анти-

тіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї

реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифіка-

ція цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів,

вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх

виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення

роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню

стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, од-

нак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені

при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах

гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор мат-

риці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методи-

ку, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на

поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким

чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій

фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх

на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток –

блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють

з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично переносять

на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. Фіксовані

блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають

радіоактивно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з

рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться

смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або

антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму

(хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприк-

лад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг.

Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується

гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції анти-

ген-антитіло.

150

Частина ІІ. Імунологія

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у викорис-

танні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка

комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК. Генетичні зонди, що

застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, штучного

синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на відміну

від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділити

дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізо-

топом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою

міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі

якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним аналогом

трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце

тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде

комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи

авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який знаходиться

в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має

чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагу-

ють з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, свідченням чого є зміна

забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфічний субстрат. Зонди з біотином

можна виявити, використовуючи мічені флуорохромом антитіла проти біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропо-

ри і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних,

антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій,

вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В

останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі

дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги

електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою,

на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть

на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх

певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. Смуги

промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулі-

нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобу-

лінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де насту-

пила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовува-

ти мічені ізотопом антитіла (рис. 57).

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, за-

стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’я-

зану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає до-

даткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно

зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної ре-

акції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослі-

дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного

151

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також

анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ на основі ви-

явлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також

при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики

захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum,

B. burgdorferi).

Дослідження імунного статусу організму

Імунологічна система функціонує як багатокомпонентне єдине ціле. Ус і її

параметри взаємозв’язані і перебувають у постійному коливному ритмі. Постійність

імунологічного нагляду організму здійснюється за рахунок балансу між різними

рівнями активності структурних компонентів імунної системи. Але при різноманіт-

них патологічних станах показники імунітету можуть відхилятись від нормаль-

них величин, що має як діагностичне, так і велике прогностичне значення і часто

вимагає імунокорекції. Тому визначенню стану окремих ланок імунної системи

надається велике значення.

Сучасна клінічна імунологія володіє широким арсеналом методів визначен-

ня функціональної активності імунної системи, які в комплексі мають високу інфор-

мативність, діагностичну і прогностичну цінність.

Згідно з існуючими регламентуючими документами, проводити оцінку іму-

нологічного статусу рекомендується в наступних випадках:

1. При необхідності детального обстеження стану здоров’я людини.

2. При генетичних вадах імунної системи (первинні імунодефіцити).

3. При гострих і хронічних бактеріальних, вірусних і паразитарних інфекці-

ях (вірусні гепатити, сепсис, хронічна пневмонія, лейшманіоз), підозрі на СНІД.

4. При автоімунних і алергічних захворюваннях.

5. При злоякісних новоутвореннях.

_ _ _ _

+ + + +

Електрофоретичне Розрізання мембрани Кольорові смуги утворились в

розділення антигенів та інкубація місцях з’єднання антитіл сиро

вірусу із сироваткою хворого ватки хворого з антигенами вірусу

Антиген

Перенос (блот) вірусних

білків на нітроцелюлозну

мембрану

Антиглобулінова

мічена ензимом

сироватка

Субстрат

Рис. 57. Схема постановки імуноблотингу.

152

Частина ІІ. Імунологія

6. При деяких хворобах нервової системи (розсіяний склероз).

7. Обстеження в геронтологічних і ендокринологічних клініках.

8. Обстеження реціпієнтів до і після трансплантації.

9. Для контролю цитостатичної, імунодепресивної та імуностимулюючої терапії.

У даний час на практиці використовується двоетапний принцип оцінки

імунологічного статусу.

На першому етапі виявляють загальні характеристики або грубі дефекти у

системі клітинного і гуморального імунітету та в системі фагоцитозу з допомо-

гою найбільш простих, орієнтовних тестів. Цим вимогам відповідають наступні

тести першого рівня (орієнтовні):

• визначення відносного і абсолютного числа лімфоцитів у периферичній

крові;

• визначення кількості Т- і В-лімфоцитів крові;

• визначення концентрації сироваткових імуноглобулінів основних класів (М,

G, А);

• визначення фагоцитарної активності лейкоцитів.

Інформативність і надійність цих тестів достатньо висока. Результати можна

одержати протягом першої доби.

Більш детальний аналіз імунологічного статусу бажано проводити на друго-

му етапі, якщо мають місце відхилення в орієнтовних тестах або при наявності

спеціальних показань.

Для встановлення рівня і вираженості імунологічного дефекту рекоменду-

ють наступні тести, які називаються аналітичними або тестами другого рівня:

• визначення субпопуляцій регуляторних Т-лімфоцитів ( Т-хелперів і супре-

сорних клітин);

• визначення спонтанної міграції лейкоцитів і тест гальмування міграції лей-

коцитів з використанням ФГА;

• постановка (при відсутності протипоказань) шкірних тестів гіперчутливості

сповільненої і негайної дії на туберкулін, грибкові антигени, алергени;

• дослідження проліферативної активності Т- і В-лімфоцитів в реакції бласт-

трансформації на мітогени, антигени;

• визначення активізаційних маркерів Т-лімфоцитів;

• оцінка синтезу імуноглобулінів в культурі В-лімфоцитів;

• оцінка активності кілерних лімфоцитів (К- і NК клітин);

• визначення компонентів комплементу;

• оцінка різних етапів фагоцитозу.

Оцінка стану В-системи імунітету

1. Визначення концентрації імуноглобулінів у сироватці (метод радіаль-

ної імунодифузії за Манчіні).Принцип полягає в тому, що досліджувану сироватку

вносять у лунки агару, який містить поліклональні антитіла проти IgM, IgG або

IgA у відомій концентрації. Імуноглобуліни дифундують в агар, в місцях їх взає-

153

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

модії з специфічним антитілом утворюються кільця преципітації, розмір яких

залежить від кількості імуноглобулінів в сироватці. Іноді використовують іму-

ноферментні тест – системи і моноклональні антитіла. Визначення IgЕ прово-

дять радіоімунним і імуноферментним методами. Рівень сироваткових імуно-

глобулінів залежить від функціонального стану В-системи імунітету, яка постійно

перебуває в стані спонтанної стимуляції різними мікроорганізмами, харчовими

антигенами та ін.

2. Антитілоутворення після природної або штучної імунізації. Іншим

показником фукціонування В-системи імунітету є дослідження рівня антитіл у

крові досліджуваних без попередньої штучної імунізації: ізогемаглютинінів α і β,

антистрептолізинів, антитіл до E. coli.

При штучній імунізації можуть бути використані такі препарати: АКДП, бак-

теріофаг ϕХ174, фосфат полірибози та інші. Після введення антигену регулярно

(не рідше як 1 раз на тиждень) протягом місяця визначають рівень сироваткових

антитіл.

3. Стимуляція біосинтезу імуноглобулінів В-лімфоцитами in vitro. У зв’яз-

ку з тим, що при імунізації можуть виникати ускладнення, стали визначати здатність

синтезувати антитіла окремими клітинами. Мононуклеари крові культивують in

vitro з поліклональним активатором В-лімфоцитів – мітогеном лаконоса. В ре-

зультаті стимуляції В-лімфоцити, які знаходились в суспензії мононуклеарних

клітин, починають виробляти імуноглобуліни. Максимум їх продукції припадає

на 7-12 день культивування.

Інший спосіб базується на підрахунку бляшкоутворюючих клітин проти ерит-

роцитів барана, оскільки при поліклональній стимуляції індукується продукція

імуноглобулінів всіма клітинами, в тому числі і тими, які виробляють антитіла

проти баранячих еритроцитів.

4. Шкірні проби для виявлення гіперчутливості негайного типу. Результа-

ти оцінюють через 20 хв після введення алергену в шкіру. Позитивною вважаєть-

ся проба, якщо з’являється пухирець діаметром не менше 5-7 мм.

5. Кількісні тести визначенняТ- і В-лімфоцитів. Велике значення для дос-

лідження стану імунної системи має підрахунок Т- і В-лімфоцитів. Лімфоцити

виділяють із периферичної крові за допомогою методу градієнтного центрифугу-

вання. Кров хворого беруть із вени в пробірку з гепарином, розводять ізотонічним

розчином хлориду натрію у співвідношенні 1:2 і обережно нашаровують на роз-

чин фіколу. Для підвищення його щільності додають верографін або тріозил. Між

плазмою і розчином фіколу утворюється ступеневий градієнт щільності. Після

центрифугування еритроцити і гранулоцити проходять через фікол і осідають на

дно, а моноцити і лімфоцити залишаються у вигляді кільця в інтерфазі. Клітини

забирають піпеткою, відмивають і переносять в культуральне середовище.

Для їх підрахунку вживався метод спонтанного розеткоутворення.

Розеткоутворення – це процес взаємодії лімфоцитів і ксеногенних еритро-

цитів з утворенням клітинних конгломератів, які складаються з лімфоцита і при-

єднаних до нього чужорідних еритроцитів. Останні розміщуються навколо лімфо-

154

Частина ІІ. Імунологія

цита, і на вигляд такі конгломерати нагадують розетки. Спонтанне розеткоутво-

рення спостерігається між лімфоцитами і еритроцитами певних видів тварин.

Т-лімфоцити людини, маючи рецептори до баранячих еритроцитів, утворю-

ють з ними розетки. Ось чому метод спонтанного розеткоутворення з еритроцита-

ми барана (метод Е-розеткоутворення, від Е – еритроцити) використовується для

виявлення Т-клітин людини. Ці лімфоцити позначають як Е-РУК (Е-розеткоутво-

рюючі клітини).

В-лімфоцити людини мають на своїй поверхні рецептори до еритроцитів

мишей і формують з ними спонтанні розетки. Цей тест можна використати для

підрахунку В-лімфоцитів. Проте для виявлення В-лімфоцитів більш широко ви-

користовували методи розеткоутворення з урахуванням інших рецепторів, які є

специфічними маркерами. Такими маркерами є рецептори до Fc-фрагменту іму-

ноглобуліну і до С3 компонента комплементу.

При зв’язуванні комплексу антиген-антитіло (еритроцити – антиеритроци-

тарні антитіла) з рецептором до Fc-фрагменту формуються так звані ЕА-розетки.

Коли ж до рецептора С3 приєднується комплекс антиген-антитіло-комплемент

(еритроцити- антиеритроцитарні антитіла – С3) утворюються ЕАС-розетки. Відпо-

відно В-лімфоцити часто позначають як ЕА-РУК або ЕАС-РУК.

Проте останнім часом для підрахунку лімфоцитів вживаються більш сучасні

і специфічні методики.

Однією із таких методик є цитофлуорометричне дослідження.

Одержані клітини обробляють моноклональними антитілами, кон’юговани-

ми з флуорохромами, проти мембранних антигенів лімфоцитів. Якщо одночасно

визначають різні клітини, використовують антитіла, зв’язані з флуорохромами

різного кольору.

Так, наприклад, В-лімфоцити визначають за допомогою поліклональних ан-

титіл до загальних детермінант імуноглобулінів або моноклональних антитіл до

одного з В-клітинних маркерів, найчастіше CD 19, 20 або 72. Для визначення суб-

популяції В

використовують метод подвійної імунофлуоресценції з використан-

ням антитіл до CD 19 і CD 5, мічених різними флуорохромами.

Оцінка клітинного імунітету – стану Т-системи

1. Шкірні проби гіперчутливості сповільненого типу. Показником гіпер-

чутливості сповільненого типу, а відповідно реактивності системи Т-лімфоцитів,

є позитивні проби при внутрішньошкірному введенні певних антигенів. По-пер-

ше, це класична реакція Пірке, яка характеризується почервонінням, а іноді на-

бряком, в місці введення туберкуліну або його очищеного препарату РРD. Можна

вводити правцевий, дифтерійний або стрептококові антигени.

2. Стимуляція лімфоцитів in vitro. У певних ситуаціях лімфоцити крові

після їх стимуляції in vitro збільшуються в розмірах і перетворюються в бластопо-

дібні клітини, які активно синтезують ДНК. Цей феномен називається реакцією

бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ). Для її постановки використовують

155

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

специфічні (антигени) і неспецифічні мітогени (ФГА, конканавалін А, мітоген

лаконосу).

Максимально виражена реакція після антигенної стимуляції спостерігається

на 4-5 добу після культивування, на неспецифічні мітогени – на 3 добу. Порівнян-

ня результатів завжди проводять по відношенню до нестимульованого контролю.

Найкращий спосіб обліку реакції базується на здатності клітин, що діляться, син-

тезувати ДНК. Збільшення мітотичної активності клітин ( Т- і В-лімфоцитів) можна

визначити за зростанням синтезу ДНК, додаючи за 4-6 год до кінця культивування

мічені попередники ДНК (наприклад, Н

- тимідин). Кількість захопленого кліти-

нами ізотопу визначають за допомогою сцинтиляційного лічильника. Відношен-

ня величини включення Н

-тимідину в стимульованих культурах до величин вклю-

чення Н

-тимідину в культурах без стимуляції, відображає вираженість бластоге-

незу і називається індексом або коефіцієнтом стимуляції. Чим вищий цей показник,

тим сильніше виражена РБТЛ. В нормальних умовах у здорових осіб індекс сти-

муляції складає 10-20 і вище.

3. Кількісні тести визначення Т-лімфоцитів. Т-лімфоцити підраховують

за допомогою визначення Е-розеткоутворюючих клітин. Проте, як вже зазнача-

лось, оптимальними сучасними методами є методи, в яких використовують мічені

моноклональні антитіла до основного маркера Т-лімфоцитів – CD3.

4. Визначення субпопуляцій Т-лімфоцитів. Субпопуляції Т-лімфоцитів –

Т-хелпери і Т-кілери визначають цитофлуорометричним способом з використан-

ням мічених специфічних моноклональних антитіл відповідно проти CD4 і CD8.

5.Функціональна оцінка Т-хелперів. Із периферичної крові виділяють чисту

суспензію В-лімфоцитів, культивують її in vitro з додаванням клітин, хелперну

активність яких хочуть визначити. Оцінку хелперного ефекту проводять за вели-

чиною приросту синтезу імуноглобулінів по відношенню до культур, в які не до-

давали лімфоцити із хелперною активністю. Облік синтезу імуноглобулінів ве-

деться радіоімунним або імуноферментним методом.

6. Визначення медіаторів лімфоцитів (лімфокінів). Активація лімфоцитів

антигенами або іншими біологічними стимуляторами (мітогени, АЛС і т.д.) зу-

мовлює синтез лімфоцитами лімфокінів (фактор переносу, фактор, що пригнічує

міграцію макрофагів МІФ, хемотаксичний фактор, лімфотоксин, інтерферони,

інтерлейкіни, фактор некрозу пухлин та інші). Визначення кількості та активності

цих речовин дозволяє робити певні висновки про функціональну здатність лімфо-

цитів, має значення в діагностиці сепсису й визначенні ефективності протипух-

линної терапії.

7. Цитотоксична активність К- і ПК-клітин. Лімфоцити, виділені із крові

здорових донорів, можуть руйнувати клітини-мішені, які покриті (сенсибілізовані)

специфічними антитілами. Цей тип цитотоксичності одержав назву антитілозалеж-

ної клітинно-обумовленої цитотоксичної реакції. Такі лімфоцити були названі К-клі-

тинами (К – кілер). Це великі гранулярні клітини, основним маркером яких є CD16.

Для виявлення активності К-клітин використовують еритроцити, які сенси-

білізують специфічними антитілами. Після такої сенсибілізації еритроцити (кліти-

156

Частина ІІ. Імунологія

ни-мішені) мітять

Сr та інкубують з лімфоцитами. Останні, лізуючи еритроцити,

зумовлюють виділення в середовище радіоактивного хрому. Чим більше ізотопу

вивільняється в середовище, тим вища величина цитотоксичності К-лімфоцитів.

Зміна показників цього тесту може спостерігатися при автоімунних захворюван-

нях, а також при деяких імунодефіцитних станах.

Природні кілери (ПК-клітини) знищують чужорідні клітини без участі ан-

титіл. Специфічним їх маркером є CD56. Їх можна виявити, якщо змішати лімфо-

цити із пухлинними клітинами, міченими радіоактивним хромом. За кількістю

виходу із зруйнованих клітин радіоактивної речовини, роблять висновок про ак-

тивність природних кілерів.

Як К-клітини, так і ПК-клітини також можна визначати за допомогою цито-

флуорометричного методу, використовуючи відповідні моноклональні антимар-

керні антитіла (анти CD16 і CD56).

Слід зауважити, що існує популяція кілерних клітин, яка володіє одночасно

двома вищевказаними антигенними маркерами (CD16 і CD56).

Визначення стану системи фагоцитозу

Існує декілька методів визначення фагоцитарної активності нейтрофілів. Суть

одного з них полягає в тому, що виділені нейтрофіли змішують з рівною кількістю

суспензії грибків кандида в присутності АВ-сироватки. Клітини поміщають в тер-

мостат при 37 °С на 1 годину. Після інкубації лейкоцити руйнують 2,5 % розчином

дезоксихолату натрію і фарбують 0,01 % розчином метиленової синьки. Підрахо-

вують кількість вбитих клітин грибів.

При іншому способі 0,1 мл крові хворого наносять на знежирене покривне

скельце і витримують у вологій камері при 37 °С 45 хв, після чого згусток, що

утворився, видаляють пінцетом. Покривне скельце з фіксованими на ньому ней-

трофілами промивають в розчині Хенкса, наносять визначену кількість культури

стафілокока або кишечної палички і знову інкубують у вологій камері 30 хв. Після

чого скельце промивають у розчині Хенкса, препарат висушують, фіксують і фар-

бують за Романовським–Гімзою. Облік фагоцитарної активності проводять, визна-

чаючи відсоток нейтрофілів із фагоцитованими бактеріями (фагоцитарне число) і

кількість поглинутих мікробів з розрахунку на один нейтрофіл (фагоцитарний

індекс). У кожному препараті підраховують не менше 200 клітин.

Бактерицидна активність фагоцитів в основному обумовлена ферментним

набором клітини. Тому непрямі показники порушення бактерицидної активності

можна одержати шляхом визначення різних клітинних ферментів, які характери-

зують окисні процеси (пероксидаза, кисла і лужна фосфатаза тощо). З цією метою

часто використовують реакцію відновлення нітросинього тетразолію у кольоровій

цитохімічній реакції.

Результати визначення дають можливість оцінити генерацію формазану за

появою синього забарвлення. Аналогічний результат дають люмінесцентні спо-

соби реєстрації утворення метаболічно активних форм кисню і вільних радикалів

методами реєстрації хемолюмінесценції, яка підсилюється люмінофорами.

157

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Існують і інші методи, які дозволяють аналізувати автоматично кількісно в

окремих клітинах відновлення нітросинього тетразолію з допомогою цитофото-

метра, сполученого з мікроскопом, аналізаторів відеозображення тощо.

Рухливість фагоцитів (лейкоцитів або моноцитів) досліджують за величи-

ною спонтанної міграції із капілярів, а також за зміною міграції в присутності

хемотаксичних агентів. Найбільш об’єктивним методом оцінки бактерицидної

активності фагоцитів є використання бактерій, мічених радіоактивними ізотопа-

ми, з наступним радіоактивним обліком зруйнованих бактерій.

Визначають також кількість нейтрофілів, що несуть на собі Fс, С3 рецептори

та ін. (в реакції ЕА і ЕАС-розеткоутворення).

Визначення активності системи комплементу

В десять пробiрок вносять сироватку хворого 1:10 (табл. 27), починаючи з

0,05 мл в першу, збiльшуючи кiлькiсть в кожнiй наступнiй на 0,05 мл i до 0,5 мл.

Вiдповiдно до загального об’єму 1,5 мл додають в кожну пробiрку визначену

кiлькiсть ізотонічного розчину хлориду натрію, а потiм по 1,5 мл попередньо

сенсибiлiзованих еритроцитiв. Пiсля iнкубацiї при 37 °С протягом години пробiрки

охолоджують, еритроцити осаджують центрифугуванням i оцiнюють результати

за гемолiзом.

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Сироватка хворого

(1:10)

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,5 -

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1,0 1,0 1,5

Гемолітична

система

1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Термостат 37

С - 60 хв

Результат

Таблиця 27

Визначення титру комплементу в сироватцi кровi

Окремі компоненти сироваткового комплементу визначають в реакції преципі-

тації з використанням специфічних антисироваток і за допомогою моноклональних

антитіл імуноферментним методом. Це має велике практичне значення – особли-

во для виявлення генетичних дефектів системи комплементу. Том у що, визначаю-

чи гемолітичну активність комплементу, можна мати тільки загальну уяву про стан

комплементу і ні в якому разі не можна зробити висновок про стан імунної систе-

ми особи.

Іноді для дослідження факторів неспецифічної резистентності організму виз-

начають в сироватці людини титр лізоциму і бета-лізинів (табл. 28).

В 5 пробiрок розливають по 0,5 мл фiзiологiчного розчину. В першу пробiрку

вносять 0,5 мл дослiджуваної сироватки (1:5). Починаючи з цiєї пробiрки,

158

Частина ІІ. Імунологія

послiдовно переносять iз пробiрки в пробiрку, закiнчуючи четвертою по 0,5 мл. З

четвертої – 0,5 мл виливають. Потiм в усi пробiрки додають по 0,5 мл 1 млрд.

суспензiї Micrococcus luteus. Пiсля прогрiвання пробiрок при 45 °С протягом 15

хв. враховують результати за максимальним розведенням сироватки, що виклика-

ло розчинення бактерiй.

Титр бета-лізинів визначають аналогічно вище поданому методу, за винят-

ком того, що в якості тест-мікроба використовують культуру B. subtilis.

Нижче наведено орієнтовні показники стану імунної системи здорової люди-

ни (табл. 29).

При інтерпретації результатів імунограм необхідно проводити сукупний ком-

плексний аналіз показників. Тільки значні зсуви показників ±20-40 % і більше від

норми дають реальну інформацію про зміни. Вказані показники завжди потрібно

оцінювати в динаміці і виключати можливість їх коливань у зв’язку з фізичним

навантаженням, харчуванням, часом доби, сезонністю тощо.

А.М. Земсков запропонував універсальний метод виявлення імунних розладів

за наступною формулою:

1001

нормузаприйнятийПоказник

хворогооконкретногПоказник













−

Коли підрахована величина має знак “мінус”, у пацієнта є ознаки імунологіч-

ної недостатності, при знаку “плюс” – гіперфункція імунної системи. Коли визна-

чена величина знаходиться в інтервалі від 10 % до 33 %, це відповідає першому

ступеню імунних розладів, від 34 до 66 % – другому, більше 66 % – третьому.

Запропоновано виділяти легкий ступінь імунодефіциту, який характеризується

нормальним або незначним зниженням кількості Т-, В-клітин, нормальною

спонтанною міграцією лейкоцитів. При середньому ступені відмічається змен-

шення кількості лімфоцитів, Т-клітин, значне зниження міграції лейкоцитів. Важ-

кий ступінь дефекту імунітету проявляється значною лейко- і лімфопенією, змен-

шенням вмісту Т-клітин, пригніченням міграції лейкоцитів.

Останнім часом запропоновано нові підходи до оцінки імунного статусу люди-

ни. Один з них базується на патогенетичному принципі аналізу імунного статусу.

Цей спосіб передбачає оцінку основних етапів імунної відповіді – розпізна-

вання, активацію, проліферацію, диференціацію та імунорегуляцію.

Таблиця 28

Визначення активностi лiзоциму в сироватцi кровi

Пробiрки

Компоненти

1 2 3 4 5

Фiзрозчин, мл 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Сироватка хворого (1:5), мл 0,5

→

↓

Одержане розведення 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

Micrococcus luteus (1 млрд/мл) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Експозицiя

15 хв при 45

Результати

159

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Процес розпізнавання можна вивчати, досліджуючи взаємодію антигенпре-

зентуючих клітин і лімфоцитів, розпізнавання специфічного антигену, імунну

відповідь у змішаній культурі лімфоцитів.

Другий етап – активацію оцінюють за експресією антигенів ГКГ ІІ, рецеп-

торів до ІЛ-2, трансферину тощо.

Третій етап – вивчають проліферацію лімфоцитів під впливом мітогенів (ФГА,

ЛПС, КонА) і антигенів.

Четвертий етап – диференціацію клітин досліджують шляхом лізису клітин-

мішеней Т-лімфоцитами, природними кілерами, макрофагами, а також синтез іму-

ноглобулінів і продукцію цитокінів.

Показники Вміст в 1 мкл (%)

Абсолютне число лейкоцитів 4500-7000 (100%)

У тому числі: нейтрофілів 4000 (65%)

Еозинофілів 200-400 (4%)

Абсолютне число лімфоцитів 1500-2000 (25%)

- CD3 (T-загальні) 800-1200

- CD4 (Т-хелпери) 500-900

- CD8 (Т-кілери) 400-600

- CD16 (NK) 170-400

- CD20 (В-клітини) 200-400

HLA II 340-720

Імуноглобуліни

IgG 8-12 г/л

IgM 0,5-1,9 г/л

IgA 1,4-4,2 г/л

IgE 20-100 КЕ/л

ЦІК, (умов. од.) 20-80

Фагоцитоз

Спонтанний Стимульований Індекс стимуляції

НСТ-тест (од. млн.кл.) 70-120 150-200 1,2-2

Фагоцитоз (%) 48-88

Індекс фагоцитозу 1,3-3

Адгезія (%) 40-55 70-80

Реакція бласттрансформації

ФГА PWM

РБТЛ 20-100 5-20

Комплемент

C1q 100-250

C3 700-1800

C4 200-500

C5a 0,01-0,03

Таблиця 29

Показники імунного статусу людини

160

Частина ІІ. Імунологія

Імунорегуляцію оцінюють за синтезом макрофагами цитокінів і досліджен-

ням субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів.

Центральне місце в патогенетичному принципі вивчення імунного статусу

займає концепція позитивної і негативної клітинної активації.

При позитивному результаті процес активації лімфоцитів, їх проліферація і

диференціація завершуються реалізацією їх безпосередніх функцій. Додатково до

вищенаведених тестів суттєвим є визначення експресії на Т-лімфоцитах молекул

CD2, CD28, CD 40L, на В-лімфоцитах – CD23, молекул ГКГ ІІ, синтез інтерлей-

кіна 13 та ін.

Негативна активація завжди закінчується апоптозом. Тому важливе значення

має визначення апоптозних маркерів на імунокомпетентних клітинах (Fas антиге-

ну і ліганд Fas антигену та ін).

Розділ 10

ІМУНОПРОФІЛАКТИКА ТА ІМУНОТЕРАПІЯ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

Характеристика вакцинних препаратів. Інфекційні хвороби можна попе-

редити шляхом активної або пасивної імунізації. Активна імунізація проводиться

з допомогою вакцинних препаратів.

Вакцини – препарати, одержані з бактерій, вірусів та інших мікроорганізмів,

їх хімічних компонентів, продуктів життєдіяльності або виготовлені штучним

шляхом, які застосовуються для активної імунізації людей і тварин з метою профі-

лактики і лікування інфекційних хвороб.

Усі вакцини за способом одержання й характером антигенів поділяють на

живі, вбиті, хімічні, субклітинні, субодиничні, анатоксини, штучні на основі ре-

комбінантних ДНК, антиідіотипові. За кількістю антигенів розрізняють моно-, ди-

, три-, тетравакцини тощо.

Для забезпечення виробництва нешкідливих, стандартних вакцин існує єди-

на система їх випробування і застосування. Вона передбачає: одержання вакцин-

ного штаму, виготовлення достатньої кількості препарату, експериментальна пе-

ревірка його на стерильність, токсичність, реактогенність, імуногенність на тва-

ринах, оцінка ефективності на обмеженому контингенті людей, вивчення

ефективності при масовому застосуванні.

Живі вакцини – біологічні препарати, виготовлені з живих бактерій або вірусів

із пониженою вірулентністю, але вираженими імуногенними властивостями. Вони

нездатні в звичайних умовах викликати захворювання, але слабкий інфекційний

процес при цьому має місце. Тому живі вакцини, як найбільш ефективні препара-

ти для щеплення, індукують довготривалий і напружений поствакцинальний іму-

161

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

нітет. Досить однократного введення препарату, щоб розвинулась несприйнят-

ливість до збудника.

Для виготовлення живих вакцин використовували методи зниження вірулент-

ності (атенуацію) бактерій, вірусів, створюючи несприятливі умови культивування.

Серед живих вакцин найбільш широко використовується протитуберкульоз-

на вакцина БЦЖ (BCG – Bacterium Calmette, Guerin).

При виготовленні деяких вакцин збудники культивують у курячому ембріоні

(рикетсії висипного тифу, віруси грипу, кору, паротиту), вирощують вакцинні штами

у культурах тканин (вакцини проти кору, жовтої гарячки, поліомієліту, сказу).

Крім атенуації, живі вакцини можна одержувати шляхом селекції (відбору) з

існуючих у природі штамів таких варіантів, які мають найменшу вірулентність

(вакцини проти бруцельозу, туляремії, віспи, поліомієліту).

У той же час, незважаючи на високу ефективність, живі вакцини мають ряд

недоліків. Їх важко зберігати, стандартизувати, контролювати активність. У лю-

дей з імунодефіцитами живі вакцини можуть викликати захворювання.

У даний час знову набуває великого значення метод атенуації. Але докорінно

змінились самі принципи атенуації – зниження вірулентності мікроорганізмів. З

цією метою використовують генетично модифіковані мікроорганізми (бактерії,

віруси). Такі вакцини містять або непатогенні мікроорганізми, які синтезують

антигенні детермінанти певного патогенного збудника, або штами патогенних

бактерій, у яких вилучені гени патогенності.

Наприклад, створено штам холерного вібріону, у якого вилучено ген, який

кодує А1-пептид – відповідальний за синтез ентеротоксину. Ефективність імуні-

зації таким штамом висока.

Інший сучасний спосіб одержання атенуйованих вакцин полягає у вилученні

з геному патогенних бактерій ділянок генів, які відповідають за незалежні життє-

во важливі функції. Вважається, що такі штами будуть мати незначну здатність до

розмноження і продукції факторів патогенності. Одержано протисальмонельозну

вакцину, у бактерії якої внесені зміни в гени, що кодують синтез ароматичних

сполук і метаболізм пуринів.

Сучасні живі атенуйовані вакцини більш ефективні ніж інактивовані чи су-

бодиничні.

Інактивовані (вбиті) вакцини. Виготовлення вбитих вакцин складний і відпо-

відальний процес. Він розпочинається з підбору вакцинного штаму, який повинен

мати виражені вірулентні та імуногенні властивості. Культуру засівають на опти-

мальні живильні середовища для одержання значної кількості біомаси бактерій. Після

цього готують маточні суспензії, які піддають інактивації. Залежно від її способу,

розрізняють гріті вакцини (культуру прогрівають при 56-60 °С протягом 1-2 год);

формолові вакцини, спиртові, ацетонові тощо (при дії на мікроби відповідних

хімічних речовин). На наступному етапі вакцини стандартизують тобто встановлю-

ють певну густоту їх суспензії (1-4 млрд мікробних тіл в 1 мл). Препарати піддають

обов’язковій перевірці на стерильність, антигенність, імуногенність, реактогенність

тощо. Після цього одержані вакцини розливають в ампули й закупорюють.

162

Частина ІІ. Імунологія

Із вбитих вакцин використовують лептоспірозну, гонококову, грипозну, пол-

іомієлітну Солка, японського та кліщового енцефаліту, антирабічну.

Хімічні вакцини. З метою введення в організм очищених антигенних препа-

ратів, вільних від баластних речовин, з бактерій чи вірусів за допомогою хімічних

методів або ультразвуку вилучають окремі антигенні компоненти. Вони й склада-

ють основу хімічної вакцини. Такі очищені антигени можна концентрувати й ад-

сорбувати на різних основах, збільшуючи цим їх імуногенну активність. Такі сор-

бовані вакцини створюють в організмі депо препарату, з якого в кровоток посту-

пово всмоктуються антигени, що забезпечує тривалу імуностимулюючу дію. До

найбільш відомих хімічних вакцин належать черевно-тифозна, пневмококова,

менінгококова.

Субклітинні вакцини – вакцини, які містять окремі фрагменти мікробних

клітин. Наприклад, до складу пневмококової, менінгококової, проти Haemophilus

influenzae вакцин входять капсульні полісахариди цих бактерій; вакцина проти

гепатиту В містить поверхневий антиген вірусу.

Субодиничні вакцини – вакцини, які містять лише окремі білки патогенного

мікроорганізма. Для їх створення успішно використовується технологія рекомбі-

нантних ДНК.

Перевагами таких вакцин є те , що вони містять очищений імуногенний білок,

вони безпечні, не здатні викликати захворювання, стабільні. Їх хімічні власти-

вості відомі, в їх складі відсутні інші білки і нуклеїнові кислоти, які могли би

викликати небажані побічні ефекти в організмі.

Недоліками субодиничних вакцин є те, що очистка специфічного білка кош-

тує дорого, а просторова конфігурація виділеного білка може відрізнятись від ви-

хідного, що може привести до зміни антигенних властивостей.

На сьогодні створені й пройшли апробацію такі субодиничні вакцини:

Таблиця 30

Основні види сучасних субодиничних вакцин

Антивірусні вакцини Антибактеріальні вакцини Антипаразитарні вакцини

1. Вітряної віспи-

оперізуючого герпесу

2. Цитомегаловірусна

3. Гепатиту А

4. Гепатиту В

5. Простого герпесу 2

6. Грипозна А, В

7. Парагрипозна

8. Респіраторно-синцитіальна

9. Антирабічна

10. Ротавірусна

11. Проти ВІЛ

1. Ентеротоксину E. coli

2. Холерна

3. Гонококова

4. Лепрозна

5. Менінгококова

6. Кашлюкова

7. Протитуберкульозна

8. Черевнотифозна

9. Протиправцева

10. Пневмококова

12. Стрептококова груп А, В

1. Лейшманіозна

2. Протималярійна

Анатоксини – препарати, які одержують із бактеріальних білкових токсинів

при дії на них формаліну (0,3-0,5 %) протягом 3-4 тижнів при температурі 39-40 °С.

163

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

Після такої обробки токсин втрачає отруйні властивості, але зберігає антигенні.

Одержані анатоксини очищають, концентрують й адсорбують на гідроокисі алю-

мінію. Мікробіологічна промисловість випускає правцевий, дифтерійний, ботулі-

нові, гангренозні, стафілококовий анатоксини. При імунізації цими препаратами

в організмі виникають антитіла (антитоксини), які здатні нейтралізувати дію відпо-

відних токсинів. Активність анатоксинів визначають за їх здатністю вступати в

реакцію із специфічною антитоксичною сироваткою. Її виражають в одиницях

зв’язування (ОЗ) або флокуляційних одиницях.

Силу анатоксину визначають у реакції флокуляції, яка за механізмом подібна

до реакції преципітації. Флокуляція – феномен утворення каламутної хмаринки

під час взаємодії анатоксину з антитілом. Початкова (ініціальна) флокуляція відбу-

вається при чіткій відповідності кількості антигену й антитіла. Кількість анаток-

сину, яка зумовлює ініціальну флокуляцію з 1 МО (міжнародною одиницею) ан-

титоксичної сироватки, приймають за одиницю флокуляції.

Асоційовані вакцини. Препарати, до складу яких входять декілька антигенів,

одержаних із мікроорганізмів і анатоксинів. Їх переваги в тому, що вони забезпе-

чують імунітет проти декількох інфекцій при одномоментному їх введенні. Ви-

пускають такі асоційовані вакцини: АКДП (містить коклюшні бактерії і два ана-

токсини – дифтерійний і правцевий, які адсорбовані), ДТ-Polio (дифтерійний, прав-

цевий анатоксини та інактивовані віруси поліомієліту), Пентакт-ХІБ (полісахарид

бактерії інфлюенци, правцевий і дифтерійний анатоксини, інактивований збуд-

ник кашлюка, інактивована вакцина поліомієліту І, ІІ, ІІІ) та інші.

Штучні вакцини. Штучне копіювання антигенів і детермінант методами ген-

ної інженерії може сприяти створенню вакцин без баластних домішок. Для отри-

мання антигенів з необхідними детермінантами без сторонніх субстанцій існує

два напрямки: 1) виділення високоочищеного антигену із природнього матеріалу

методами препаративної біохімії або генної інженерії; 2) хімічний синтез анти-

генних детермінант. Як правило, виділяють або конструюють протективні анти-

гени, адгезини, ферменти, протеїни оболонки, токсини. Незабаром будуть ство-

рені вакцини, які забезпечать імунітет до збудників, проти яких поки що надійно-

го захисту немає. Такі препарати можна створити на базі рекомбінантних ДНК,

хімічного синтезу та антиідіотипних антитіл.

Основою таких рекомбінантних вакцин є перенесення в плазміду або вірус

гена, відповідального за продукцію необхідного антигену (рис. 58). Такі препара-

ти поділяють на генно-інженерні вакцини з антигенів, синтезованих в рекомбі-

нантних бактеріальних системах і дріжджах; векторні генно-інженерні живі вак-

цини на основі вірусу вісповакцини та інші.

У прокаріотні системи (кишечна паличка, сінна паличка) внесені плазміди з

генами, які контролюють синтез антигенів менінгококів, гонококів, холерних

вібріонів, малярійних плазмодіїв.

Все більшого значення набуває новий напрям створення штучних вакцин,

який одержав назву – генної імунізації. Імунна відповідь формується без введен-

ня антигену в організм. Методика базується на включенні в клітини мішені гена,

164

Частина ІІ. Імунологія

який кодує антиген. Наприклад,

у плазміду E. coli інтегрували ген

білка-антигена і такий мікроор-

ганізм використали для внутріш-

ньом’язової імунізації. В резуль-

таті, в організмі вироблялись

білки-антигени і в сироватці

відмічали наявність відповідних

антитіл.

Найбільш перспективно ви-

користовувати у таких вакцинах,

особливо вірусних, корові (нук-

леопротеїдні) білки. Ці білки

індукують імунну відповідь

організму, незалежно від зміни

поверхневих антигенів, особли-

во це стосується ВІЛ і вірусу гри-

пу. Такі вакцини поки що вжива-

ються для експериментальної

імунізації тварин (грипозна, ан-

тирабічна, протималярійна, про-

ти гепатиту В).

Векторні вакцини. Век-

торні вакцини найчастіше готуються на основі вірусу вісповакцини. В геном віру-

су одночасно вносять гени, що кодують антигенні детермінанти різних збудників

(вірусів сказу, грипу, ВІЛ, гепатиту В, простого герпесу тощо). Щеплення здійсню-

ють таким модифікованим вірусом вісповакцини. В якості векторів також викори-

стовують аденовіруси, поліовірус, вірус вітрянки. Таким чином, векторні вакцини

дозволяють провести імунізацію одномоментно проти декількох захворювань, інду-

куючи ефективну імунну відповідь.

Досить актуальним є конструювання вакцин, які безпосередньо можна вво-

дити через рот або через ніс, а не парентерально. У той же час такі оральні вакци-

ни повинні бути стійкими до кислого середовища шлунка і дії травних ферментів.

Створені в експерименті вакцини базуються на використанні живих рекомбінант-

них мікроорганізмів-мікроносіїв для білкових антигенів.

Таким чином, крім вірусів в якості вектора необхідних антигенів можна ви-

користовувати і слабо патогенні бактерії. Відомо, що поверхневі антигени бак-

терій є сильними імуногенами. Один із способів створення таких вакцин є розмі-

щення протективного антигена патогенних бактерій на поверхні непатогенної бак-

терії. За допомогою рекомбінантних технологій вбудовуються різні епітопи в один

флагеліновий ген слабопатогенних сальмонел і такі штами використовуються для

пероральної імунізації (табл. 31).

Рис. 58. Схема одержання рекомбінантної

противірусної вакцини.

Вірус гепатиту В

Кишечна паличка

Ген, який кодує

HBs-антиген

Ендонуклеаза

Одержана плазміда

Інтеграція вірусного

гена у плазміду

Вірусний ген

у плазміді

Кишечна паличка

продукує HBs-антиген

165

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

Таблиця 31

Рекомбінантні оральні вакцини

Однак у деяких бактерій антигени не мають білкової структури, що не дозво-

ляє їх одержати генно-інженерним способом. Тому почали створювати так звані

антиідіотипні вакцини. Антиідіотипні вакцини це антитіла (антитіла другого по-

рядку), які несуть справжній внутрішній образ детермінант антигену і виклика-

ють при його відсутності адекватну імунну відповідь (рис. 59).

Вже розроблені такі вакцини проти стрептококів, вірусів гепатиту В. Вони

мають перевагу перед іншими препаратами, оскільки ніколи не зможуть виклика-

ти захворювань.

Відкрито і вивчено новий клас імунопотенціаторів – синтетичних поліелект-

ролітів, які активують клітини імунної системи й зумовлюють при їх введенні

разом з антигенами сильну імунну відповідь навіть у осіб з генетично детерміно-

ваною низькою відповіддю на ці антигени.

У практичній медицині використовується ряд полівакцин для лікування за-

хворювань дихальних шляхів у хворих з хронічними запальними процесами. На-

приклад, вакцина ВП-4, яка містить антигени стафілокока, клебсіели пневмонії,

протея, кишечної палички при введені через рот або через ніс виявилась досить

ефективною.

Вектори Антигени

S. typhi Білок оболонки S. mutans, ліпопротеїн Ps. aeruginosa, фімбрії E. coli,

S. dublin Ліпополісахарид V. cholerae

S. typhi О-антигени шигел S. sonnei, S. flexneri,

S. typhimurium Антигени збудників правця, туляремії, мембранний білок збудника

коклюшу, М-білок, S. pyogenes, білки S. major, Brucella abortus

S. typhimurium Нуклеокапсид вірусу гепатиту В, нуклеопротеїн вірусу грипу А,

поверхневий антиген вирусу Денге 4,

Аденовірус Білки вірусу сказу,

Вірус вакцини Білки вірусу сказу, RSV, HIV,

Поліовірус Білки вірусу HIV

Рис. 59. Схема одержання антиідіотипних вакцин.

Антитіла кролика

Анти-ідиотип має

ту ж саму конфігурацію,

що і АГ (1)

Введення людині

в якості антигена

вакцини

Нові антитіла тотожні

специфічності оригі-

нальних антитіл А

Клон В-лімфоцитів

миші розпізнає

чужорідний ідіотип

Антитіло кролика

Імунізація миші

ідіотипом АТ

Синтез анти-

ідіотипового АТ

(антитіло В)

Ідіотип

АГ

166

Частина ІІ. Імунологія

Створення й широке застосування таких вакцин забезпечить поступовий пе-

рехід від ін’єкційних вакцин до таких препаратів, що в значній мірі полегшить

технічні й психологічні аспекти вакцинації.

Останніми роками одержані вакцини, білки яких синтезуються рослинними

клітинами, в хромосому яких інтегровано гени окремих вірусів і бактерій. Прохо-

дять клінічні випробування такі вакцинні препарати, що містяться в моркві, бана-

нах тощо. Таким чином незабаром зникне необхідність ін’єкційного методу вве-

дення вакцин.

Показання і протипоказання до проведення профілактичних щеплень

Планова імунізація проти багатьох інфекцій проводиться всьому населенню,

яке не має протипоказань до щеплень. Проте, залежно від епідеміологічної ситу-

ації в певних регіонах проводять вакцинацію проти захворювань, які дають епі-

демічні спалахи (дифтерія). Має значення і професійний фактор. Так, на територіях,

де реєструють захворювання на сибірку, лептоспіроз, туляремію, бруцельоз, в пер-

шу чергу вакцинують людей, які можуть заразитись у зв’язку з особливостями їх

роботи.

Планову вакцинацію дітей і дорослих проводять у терміни, передбачені ка-

лендарем щеплень (табл. 32).

Вік Щеплення проти

1 день Гепатиту В

3 день Туберкульозу

1місяць

3 місяці Гепатиту В Дифтерії, кок-

люшу, правця

Поліомієліту

4 місяці Дифтерії, кок-

люшу, правця

Поліомієліту

5 місяців Гепатиту В Дифтерії, кок-

люшу, правця

Поліомієліту

6 місяців

12-15

місяців

Кору, красну-

хи, паротиту

18 місяців Дифтерії, кок-

люшу, правця

Поліомієліту

3 роки Поліомієліту

Кору, красну-

хи, паротиту

6 років Дифтерії,

правця

Поліомієліту

7 років Туберкульозу

11 років Дифтерії,

14 років Туберкульозу Дифтерії,

правця

Поліомієліту

Таблиця 32

Календар профілактичних щеплень

167

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

Протипоказаннями для проведення всіх видів щеплень є гострий гарячко-

вий стан. При імунодефіцитних станах не можна проводити щеплення живими

вакцинами (БЦЖ, коровою, паротитною, поліомієлітною). При хронічних захво-

рювання нервової системи протипоказано вводити живі корову й паротитну вак-

цини, АКДП і ДП. Заборонено щеплення вакциною БЦЖ осіб із тяжкими форма-

ми алергічних захворювань.

Імунізацію населення здійснюють у спеціальних кабінетах профілактичних

щеплень, які розміщуються в поліклініках, дошкільних закладах і школах. У кож-

ному кабінеті повинні бути холодильник для зберігання імунологічних препаратів,

стіл, кушетка, шафа для інструментів, шафа з медикаментами для першої допомо-

ги при виникненні післявакцинальних реакцій.

До проведення щеплень допускаються спеціально підготовлені медичні пра-

цівники, які ознайомлені з інструкціями із застосування вакцин, технікою їх введен-

ня, порядком надання першої допомоги при необхідності. Імунізація проводиться

під керівництвом лікаря. Усі вакцини необхідно вводити в організм із дотриман-

ням правил асептики й антисептики. Дільнична медична сестра щомісячно відби-

рає дітей, яких потрібно імунізувати в наступному місяці, з врахуванням існуючо-

го календаря щеплень.

Серотерапія і серопрофілактика

Часто необхідно терміново попередити розвиток захворювання в людини, яка

була в контакті з джерелом інфекції. Такий захист досягають введенням готових

антитіл (імунних сироваток, імуноглобулінів). Імунні сироватки та імуноглобулі-

ни вживають і для лікування інфекційних захворювань, особливо тих, при яких

вирішальну роль відіграють білкові токсини. Усі лікувально-профілактичні сиро-

ватки поділяють на антитоксичні, антимікробні й антивірусні.

Антитоксичні сироватки (протиправцева, протидифтерійна, протиботулінові,

протигангренозні та ін.) виготовляють у науково-дослідних інститутах шляхом

гіперімунізації коней відповідними анатоксинами (дифтерійним, ботуліновим,

гангренозним тощо). Після кількох циклів гіперімунізації в коней беруть кров і

одержують відповідну антитоксичну сироватку, в якій міститься величезна кіль-

Вік Щеплення проти

15 років Краснухи

(дівчата),

паротиту

(хлопці)

18 років Дифтерії,

правця

Дорослі Гепатиту В Дифтерії,

правця

Продовження табл. 32

168

Частина ІІ. Імунологія

кість специфічних антитіл (антитоксинів). Сироватки очищують від баластних

речовин, перевіряють на стерильність, нешкідливість, апірогенність і активність.

Їх обов’язково титрують, тобто визначають концентрацію антитіл, яку виражають

у антитоксичних одиницях (АО) або в міжнародних одиницях (МО). За одну таку

одиницю приймають найменшу кількість сироватки, яка нейтралізує певну

кількість DLM відповідного токсину. Для кожного виду сироватки є своє визна-

чення АО (МО). Так, за 1 АО протидифтерійної сироватки приймають найменшу

її кількість, яка нейтралізує 100 DLM дифтерійного токсину для гвінейської свин-

ки масою 250 г. На етикетках ампул із сироватками обов’язково вказують кількість

АО (МО), що необхідно для визначення лікувальної чи профілактичної дози.

Антимікробні (антивірусні) сироватки виготовляють шляхом гіперімунізації

тварин відповідними вбитими бактеріями (вірусами) або їх антигенами.

Останнім часом замість нативних антитоксичних і антимікробних (антивірус-

них) сироваток виготовляють відповідні γ-глобуліни, адже саме у цій фракції сиро-

ваткових білків концентруються антитіла. Для них також вказують одиниці актив-

ності, переважно МО.

Пасивну профілактику можна також здійснити за допомогою сироватки лю-

дини, яка перенесла цю хворобу (кір). Взагалі в сироватці людей у невеликій

кількості містяться антитіла проти вірусів поліомієліту, кору, грипу, збудників каш-

люка, скарлатини. Одержуючи із сироватки людський γ-глобулін, мають препарат

із високою концентрацією захисних антитіл. В епідемічному вогнищі цей препа-

рат призначають особам, які були в контакті з джерелом інфекції.

Людські гаммаглобуліни, які містять значну кількість антитіл проти токсинів,

одержують шляхом імунізації донорів відповідними анатоксинами з подальшим

осадженням γ-глобулінової фракції із сироватки.

Розрізняють

γγ

-глобуліни специфічної дії і нормальний

γγ

-глобулін. До γ-гло-

булінів специфічної дії належать: протиправцевий, протидифтерійний, протиста-

філококовий та інші.

Нормальний γ-глобулін одержують із плазми крові декількох тисяч здорових

донорів і використовують для попередження респіраторних інфекцій у дітей, для

профілактики гепатиту А, епідемічного паротиту, кору, вітрянки. Очищаючи

γ-глобуліни від неспецифічних антитіл, отримують імуноглобуліни спрямованої

дії (антистафілококовий, проти синєгнійної палички).

Випускають комплексний імуноглобуліновий препарат для перорального і

ректального введення, який містить ІgM, ІgG, ІgA і характеризується значним

вмістом антитіл до ентеробактерій (шигел, сальмонел, ешерихій).

У даний час широко використовують такі препарати для пасивної профілак-

тики і лікування інфекційних захворювань:

Імуноглобуліни людини: протигрипозний, протикашлюковий, протидифте-

рійний, протиправцевий, проти кліщового енцефаліту, вітряної віспи, гепатиту А,

протистафілококовий, протиботулінові.

Гетерологічні сироватки та імуноглобуліни: протидифтерійна, протиправ-

цева, протиботулінові А, В, Е, протигангренозні – кінські; антирабічний імуно-

169

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

глобулін, протисибірковий імуноглобулін, одержані із сироватки коней, імуногло-

булін проти кліщового енцефаліту.

Захисна дія гамма-глобулінів триває короткий період: 2-3 тижні.

Чужорідні сироватки та γ-глобуліни, одержані при імунізації тварин, при вве-

денні людям можуть часом викликати ускладнення (анафілактичний шок, сиро-

ваткову хворобу тощо). При першому введенні вони обумовлюють розвиток сен-

сибілізації, а при повторному – розвиток алергічних реакцій негайного типу. Такі

реакції у осіб, які були раніше сенсибілізовані продуктами кінського походження,

можуть виникати й після першого введення гетерологічних сироваток.

Найбільш небезпечним ускладненням після застосування сироваток є анафі-

лактичний шок. Симптоми даного ускладення, яке розвивається, як правило, безпо-

середньо після ін’єкції препарату, характеризується розвитком гострої серцево-

судинної недостатності й бронхоспазму.

Перші прояви шоку – неспокій, загальна слабість або збудження, відчуття

страху, запаморочення, шум у вухах, холодний піт, біль за грудиною або у животі,

утруднене дихання. У тяжких випадках, особливо у відсутності екстреної медич-

ної допомоги, через 5-30 хв. може наступити смерть.

При перших ознаках анафілактичного шоку необхідно здійснити такі

заходи:

• Припинити введення препарату.

• Покласти хворого (голова нижче ніг), повернути голову набік, попередити

западання язика.

• Якщо препарат було введено в кінцівку, накласти джгут вище місця ін’єкції

не більше як на 25 хв.

• Обколоти місце ін’єкції 0,3-0,5 мл 0,1 % розчину адреналіну з 4,5 мл 0,9 %

розчину хлориду натрію.

• На місце ін’єкції покласти лід або грілку з холодною водою на 10-15 хв.

• У кінцівку, вільну від джгута, ввести розчини димедролу, допаміну, гідро-

кортизону.

Терміни розвитку сироваткової хвороби після введення гетерологічної сиро-

ватки залежать від часу і частоти введення препарату. Так, після першого введен-

ня симптоми хвороби проявляються в середньому через 7-10 днів, а при повтор-

ному – через більш короткий термін, – від декількох годин до 2-3 днів.Тривалість

хвороби залежить від її тяжкості і складає від декількох днів до 2 тижнів.

Для лікування застосовують протигістамінні препарати, адреналін, препара-

ти кальцію та інші симптоматичні середники.

Для профілактики виникнення анафілактичного шоку перед введенням

будь-якої гетерологічної сироватки необхідно обов’язково поставити внутрішньо-

шкірну пробу з розведеною 1:100 сироваткою коня, яка знаходиться у коробці з

препаратом (ампула маркірована червоним кольором). Розведену сироватку вво-

дять внутрішньошкірно у згинальну поверхню передпліччя в об’ємі 0,1 мл. Облік

реакції проводять через 20 хв. Проба вважається негативною, якщо діаметр на-

170

Частина ІІ. Імунологія

бряку (гіперемії) у місці ін’єкції, менший 1 см. Проба рахується позитивною, якщо

вказані ознаки досягають у діаметрі 1 см і більше.

У випадку негативної шкірної проби нерозведену сироватку (ампула маркі-

рована синім кольором) вводять в об’ємі 0,1 мл підшкірно у ділянку середньої

третини плеча. При відсутності місцевої або загальної реакції через 30-60 хв внут-

рішньом’язово вводять необхідну дозу сироватки, підігріту до температури 36 °С.

Якщо шкірна проба позитивна, а також при розвитку реакції на підшкірну

ін’єкцію 0,1 мл нерозведеної сироватки, препарат застосовують тільки за життє-

вою необхідністю.

Для десенсибілізації сироватку, розведену 1:100, вводять підшкірно послідов-

но в об’ємі 0,5 мл, 2 мл, 5 мл з інтервалом 15-20 хв, потім з такими ж інтервалами

вводять підшкірно 0,1мл і 1,0 мл нерозведеної сироватки. При відсутності реакції

вводять призначену дозу сироватки.

Одночасно з початком десенсибілізації хворому проводиться протишокова

терапія. Завжди напоготові необхідно мати розчин адреналіну 1:1000 або 0,5 %

розчин ефедрину.

Техніка проведення профілактичних щеплень. Для введення в організм

людини препаратів використовують як парентеральні (внутрішньом’язовий,

підшкірний, внутрішньокірний, скарифікаційний), так і непарантеральний (через

рот, у свічках, у клізмах, інтраназально) методи. Практичне застосування того або

іншого методу визначається, з одного боку, біологічними властивостями препара-

ту, з іншого – його призначенням.

Внутрішньом’язове введення. Основним місцем внутрішньом’язового введен-

ня визначено верхній зовнішній квадрант сідниці, а також передньозовнішня ділян-

ка стегна. Деякі препарати вводять також у дельтоподібний м’яз. Саме так вво-

дять сорбовані препарати (АКДП – вакцина, АДП, АДП-М, АП анатоксин), оск-

ільки місцева реакція при цьому виражена в меншій мірі, ніж при підшкірному

введенні. Шкіру в місці ін’єкції препарату до і після введення обробляють 70 %

етиловим спиртом.

Підшкірне введення. Основне місце ін’єкції – підлопаткова ділянка або верх-

ня третина зовнішньої поверхні плеча.

Внутрішньошкірне введення. Таким способом вводять вакцину проти тубер-

кульозу БЦЖ. Місце її введення – межа верхньої і середньої третини зовнішньої

поверхні плеча. Використовують спеціальні однограмові або туберкулінові шпри-

ци й тонкі голки з коротким зрізом. Голку вводять зрізом вверх у поверхневий шар

шкіри, паралельно до її поверхні. При правильному введенні повинна утворитись

папула білого кольору у вигляді “лимонної кірочки” діаметром 7-8 мм, яка зникає

через 15-20 хв.

Внутрішньовенне введення. Цим способом, в основному, вводять імуногло-

буліни людини для внутрішньовенного введення – препарати, які позбавлені ан-

тикомплементарних властивостей. Необхідно суворо витримувати температуру

препарату, що вводиться (36-37 °С), його розведення і швидкість введення. Інші

імуноглобуліни вводити таким способом не можна. Внутрівенний спосіб викори-

171

Розділ 10. Імунопрофілактика та імунотерапія інфекційних захворювань

стовується також при введенні специфічної плазми (антистафілококової, антиси-

нєгнійної, антипротейної), а також за життєвими показниками і гетерологічних

сироваткових препаратів.

Нашкірний (скарифікаційний) метод застосовують для щеплення деякими

живими бактеріальними вакцинами (бруцельозна, Ку-лихоманки, сибіркова, туля-

ремійна, чумна). На шкіру внутрішньої поверхні передпліччя наносять необхідну

кількість крапель вакцини і через них скарифікатором роблять неглибокі надрізи.

Кількість крапель, число надрізів, їх довжина і відстань один від одного визнача-

ються інструкцією по застосуванню конкретного препарату.

Пероральний спосіб вакцинації використовують при щепленні проти поліомі-

єліту, чуми, холери. Ці препарати слід вживати натщесерце.

Гібридоми і моноклональні антитіла. Гібридоми – клітини, одержані в

результаті злиття лімфоцитів від імунізованої певним антигеном миші з гістогене-

тично близькою пухлиною (мієломою). Ці клітини здатні нескінченно ділитись і

продукувати специфічні антитіла. Антитіла, що синтезуються одним клоном

гібридних клітин, одержали назву моноклональних. Вперше здійснили цей про-

цес Г. Келлер і Ц. Мільштейн у 1975 році. До моменту одержання гібридом в

імунології не було препаратів специфічних антитіл такої чистоти.

Гібридоми – не тільки «фабрики» антитіл іn vitro, вони – новий штучно ство-

рений об’єкт, на якому стало можливим проводити різноманітні дослідницькі

роботи, що недавно вважались фантастикою. Клонова гібридома – це самовідтво-

рююче джерело генетично ідентичного матеріалу, яке дозволило виділяти й кло-

нувати гени антигенспецифічних антитіл.

Етапи одержання гібридоми. 1. Імунізація мишей антигеном, проти якого

потрібні антитіла. 2. Виділення клітин селезінки імунізованих тварин. 3. Одержання

клітин мієломи у мишей, уражених цією пухлиною. 4. Злиття клітин селезінки з

клітинами мієломи. 5. Тестування необхідних клітин і їх клонування. 6. Культиву-

вання гібридом в організмі тварин або в культуральних середовищах. 7. Очистка

гібридомних антитіл.

Моноклональні антитіла, які виробляються гібридомами, набули широкого

застосування в біології й медицині. Вони використовуються для ідентифікації і

очистки молекул і клітин, які несуть специфічний антиген, для імуноаналізу біо-

логічних рідин і клітин організму, для лікування і дослідження етіології й патоге-

незу різних захворювань.

Розділ 11

МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА

ОКРЕМИХ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

Стафілококові інфекції

Pід Staphylococcus охоплює кулясті нерухомі аспорогенні грампозитивні фа-

культативно-анаеробні бактерії, що належать до родини Micrococcacеae. У визнач-

нику бактерій Д.Бергі наведені диференціальні ознаки 29 видів стафілококів. Вони

поділяються на дві групи – коагулазопозитивні й коагулазонегативні. До першої

групи належать S. aureus, S. intermedius i S. hyicus. Їх роль в інфекційній патології

нерівнозначна. Найчастіше різноманітні захворювання у людей і тварин викликає

S.aureus, значно рідше – S. hyicus. S. intermedius патогенний тільки для тварин.

Впродовж багатьох років коагулазонегативні стафілококи вважали непатогенни-

ми. Але тепер ця точка зору змінилася. У зв’язку з погіршенням екологічної ситу-

ації в більшості країн та пов’язаним з нею пониженням природного імунітету по-

частішали випадки гнійно-септичних уражень тканин і органів, викликаних коа-

гулазонегативними видами, які зустрічаються на шкірі та слизових оболонках

людини (S. epidermidis, S.auricularis, S.capitis, S.cohnii, S.haemolyticus, S.hominis,

S.lentus, S.saprophyticus, S.schleiferi, S.simulans, S.warneri, S.xylosus та ін.).

Серед епідеміологів, мікробіологів і клініцистів досить поширене переконан-

ня, що сьогодні непатогенних стафілококів не існує. Все частішають випадки виді-

лення з крові, тканин і органів культур стафілококів без будь-яких маркерів патоген-

ності. Однак, при елімінації їх з організму зникають всі симптоми захворювання.

Все це необхідно враховувати при проведенні лабораторної діагностики стафіло-

кокових інфекцій. На жаль, у рутинних бактеріологічних лабораторіях нашої країни

поки що можлива ідентифікація лише S.aureus, S.epidermidis i S.saprophyticus.

Стафілококи найчастіше уражають шкіру, її придатки та підшкірну кліткови-

ну. Вони викликають фурункули, карбункули, панариції, пароніхії, абсцеси, флег-

мони, мастити, лімфаденіти, нагноєння ран, в тому числі й операційних. У дітей

стафілококи є збудниками стафілодермій, епідемічних пухирчаток, імпетиго. Їх

виділяють при плевритах, бронхітах, пневмоніях, перитонітах. Вони можуть спри-

чинити ангіни, тонзиліти, гайморити, отити, кон’юнктивіти, дещо рідше – менін-

гіти, абсцеси мозку, міокардити, ендокардити, артрити, інфекції судинних про-

Частина ІІІ

СПЕЦІАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

173

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

тезів. Дуже небезпечні харчові токсикоінфекції, ентероколіти, холецистити, цис-

тити, пієліти, пієлонефрити. При проникненні в кров або кістковий мозок викли-

кають сепсис, остеомієліт, синдром токсичного шоку. Проте всі захворювання ста-

філококової етіології не розглядаються як гострозаразні.

Взяття матеріалу для дослідження. При стафілококових інфекціях дослі-

джують гній, кров (при сепсисі), виділення слизових оболонок, харкотиння, за-

пальний ексудат, ліквор, рановий вміст, плевральний випіт, жовч, сечу. В разі підоз-

ри на токсикоінфекцію – блювотні маси, промивні води шлунка, випорожнення,

залишки їжі (особливо сир, молоко, тістечка, торти, креми, морозиво та ін.). При

санітарно-бактеріологічних контролях досліджують змиви з рук, столів та інших

предметів. У бактеріоносіїв матеріал забирають тампоном окремо з глотки та но-

сових ходів.

Із відкритих гнійних уражень матеріал беруть стерильним ватним тампоном

після видалення ранового нальоту, в якому може бути сапрофітна мікрофлора з

повітря, шкіри тощо. При закритих гнояках роблять пункцію шприцом. Слиз із

рото- й носоглотки беруть стерильним тампоном. Харкотиння й сечу забирають у

стерильні пробірки, банки. Кров (10 мл), взяту із ліктьової вени, й ліквор – при

пункції спинномозкового каналу, з дотриманням асептики сіють біля ліжка хво-

рого в 100 мл цукрового бульйону. Кров рекомендують швидко (до її згортання)

вносити прямо із шприца у флакон з бульйоном, ретельно перемішати, запобігаю-

чи утворенню згустка. Проби крові не можна заморожувати. У 25 % випадків при

стафілококовому сепсисі кількість бактерій в крові (КУО) може бути менше 1/мл.

При підозрі на такий стан необхідно сіяти 25-30 мл крові.

Бактеріоскопічне дослідження. Майже з усіх досліджуваних матеріалів

(гній, рановий вміст, ексудат, харкотиння, осад сечі тощо) за допомогою бактеріо-

логічної петлі виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Лише

з крові та змивів мазки не роблять оскільки в них мала кількість мікроорганізмів.

У типових випадках стафілококи мають кулясту форму, фіолетовий колір, розта-

шовуються несиметричними гронами, але зустрічаються й одинокі клітини, пари

або тетради (рис. 60).

Останнім часом у зв’язку з широким викорис-

танням антибіотиків морфологія стафілококів зміни-

лась і типового їх розташування в мазках із гною

часто не спостерігають. У зв’язку з цим відрізнити

стафілококи від стрептококів за їх морфологією та

взаємним розташуванням часто практично немож-

ливо. Тому потрібно робити посів, виділяти чисту

культуру та ідентифікувати її.

Але й первинна мікроскопія може дати попе-

редню відповідь в разі виявлення типових грампо-

зитивних коків правильної круглої форми, розташо-

ваних гронами і при великій кількості бактерій у

полі зору. Вона також дає змогу вибрати необхідні

Рис. 60. Стафілокок

(маз ок із чистої культури).

174

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

для посіву елективні середовища, провести пряме визначення чутливості до анти-

біотиків мікрофлори гною ще до виділення чистої культури (див. вкл., рис. 9).

Бактеріологічне дослідження. Матеріал від хворих і бактеріоносіїв засівають

негайно або не пізніше 3-4 год після взяття при умові зберігання його на холоді.

В перший день петлею, шпателем або безпосередньо тампоном роблять по-

сіви на кров’яний агар та елективні для стафілококів середовища (жовтково-со-

льовий (ЖСА) або молочно-жовтково-сольовий агар (МЖСА). Чашки з посівами

інкубують при 37 °С протягом 48 год, або одну добу в термостаті й додатково 24

год при кімнатній температурі при хорошому освітленні. Якщо в досліджуваному

матеріалі бактерій мало (дані мікроскопії) – посів для збагачення роблять ще й у

тіогліколеве середовище.

На другий день проводять висів із цукрового бульйону на вказані елективні

середовища, досліджують масивність росту й характер колоній після посівів інших

матеріалів. На кров’яному агарі стафілококи утворюють непрозорі, злегка опуклі

колонії середніх розмірів з гладенькою, блискучою, немовби полірованою поверх-

нею, чітко окресленим краєм, маслянистої консистенції. Патогенні штами утво-

рюють навколо колоній прозорі зони гемолізу (див. вкл., рис. 8). На елективно-

диференціальних середовищах, як правило, виростають лише колонії стафілококів.

Зокрема, на жовтково-сольовому агарі вони утворюють колонії із зоною помутніння

навколо них і характерним райдужним вінчиком по периферії (лецитовітелазна

реакція). На молочно-жовтково-сольовому агарі виявляють наявність пігменту, який

може бути золотистим, палевим, білим, жовтуватим, оранжевим та ін.

Із всіх типів колоній виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроско-

пують, виявляючи типові грампозитивні стафілококи. Не менше двох типових чи

підозрілих щодо стафілококів колоній пересівають на скошений агар. У першу

чергу відсівають колонії з гемолізом і ті, що дали позитивну лецитовітелазну ре-

акцію. При відсутності таких колоній досліджують не менше двох пігментованих

колоній, при мікроскопії яких виявили типові стафілококи. Пробірки з посівами

вміщують у термостат при 37 °С на 18-20 год.

В наступні дні проводять ідентифікацію виділених чистих культур, для чого

перевіряють їх морфологічні й тинкторіальні властивості (забарвлення за Грамом),

плазмокоагулюючу активність та інші властиві для стафілококів тести.

Плазмокоагулазу виявляють шляхом внесення виділеної культури у пробірку

з цитратною плазмою кролика. Її можна приготувати в будь-якій лабораторії. У

кролика із серця беруть 8 мл крові, вносять у пробірку з 2 мл стерильного 5 %

лимонно-кислого натрію і ставлять у холодильник. Після повного осідання форме-

них елементів плазму відсмоктують у стерильну пробірку. Вона може зберігатись

у холодильнику 8-10 днів. Перед використанням її розводять 1:5 (1 мл плазми і 4

мл ізотонічного розчину хлориду натрію) і розливають в аглютинаційні стерильні

пробірки по 0,5 мл. Повну петлю культури стафілококів емульгують у плазмі і

вміщують у термостат на 3 год, потім залишають при кімнатній температурі на

18-20 год. Попередній облік згортання плазми проводять через 3 год, остаточний –

на другий день. Дуже зручно користуватись стандартною сухою цитратною плаз-

175

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

мою кроля. Перед вживанням в ампулу додають 1 мл ізотонічного розчину хлориду

натрію й після повного розчинення її розводять 1:5. Плазма людини малопридатна

для постановки реакції плазмокоагуляції, оскільки в ній можуть бути консерванти,

лікарські речовини, антитіла, які можуть пригнічувати утворення плазмокоагулази.

Якщо виділена культура викликає гемоліз, коагулює плазму і дає позитивну

лецитовітелазну реакцію, вже на третій день можна видати результат на наявність

S.aureus. Якщо ж культура має лише плазмокоагулазу або тільки вітелазну ак-

тивність, для остаточного встановлення виду стафілокока потрібно визначити до-

даткові критерії патогенності: ферментацію маніту в анаеробних умовах, ДНК-

азну активність, продукцію лізоциму, фосфатази, а також визначити чутливість до

новобіоцину.

Ферментацію маніту в анаеробних умовах можна визначати, використову-

ючи стандартне сухе середовище з манітом й індикатором ВР. Після його виготов-

лення й регенерації в пробірки добавляють по 1 мл стерильного вазелінового мас-

ла і засівають культуру уколом у стовпчик. Посіви інкубують у термостаті протя-

гом 5 діб. При розкладі маніту середовище синіє. Ця проба позитивна у 94-96 %

штамів S.aureus.

Визначення ДНК-ази. До сухого живильного агару додають наважку ДНК із

розрахунку 2 мг на 1 мл середовища, яке потім стерилізують текучою парою 30

хв. Його можна зберігати в холодильнику протягом 2-х місяців. Перед викорис-

танням агар розплавляють, додають хлористий кальцій (0,8 мг на 1 мл). На підсу-

шене середовище в одній чашці можна засіяти смужками до 16-20 культур. Після

інкубації посівів протягом 18-20 год їх заливають 5 мл 1N HCl. Через 7-10 хв кис-

лоту зливають і проводять облік. Соляна кислота, реагуючи з ДНК, утворює не-

прозорий білий преципітат. Якщо культура продукує ДНК-азу, остання деполі-

меризує ДНК і при додаванні соляної кислоти навколо смужок культур виникає

прозора зона, що свідчить про наявність фермента ДНК-ази.

Гіалуронідазну активність визначають, додаючи до 0,5 мл бульйонної куль-

тури стафілокока 0,5 мл препарату гіалуронової кислоти з пупочних канатиків.

Суміш інкубують 30 хв при 37 °С і 10 хв при 4 °С. У пробірку додають 4 краплі

15 % оцтової кислоти, струшують і через 5 хв роблять облік результатів. Відсутність

згустка свідчить про наявність гіалуронідази, наявність згустка – про її відсутність.

Для виготовлення гіалуронової кислоти свіжу пуповину новонароджених под-

рібнюють, заливають подвійною кількістю дистильованої води. Суміш витриму-

ють 24 год у холодильнику, потім нагрівають і кип’ятять до згортання шматочків

пуповини. Отриманий гіалуронат фільтрують через ватно-марлевий фільтр і пере-

віряють на утворення згустка.

Лізоцимну активність стафілококів визначають за допомогою посіву виді-

лених культур у вигляді бляшок на щільний живильний агар, до якого додають

густу завись культури Micrococcus luteus. При виділенні лізоциму навколо бля-

шок виникають зони лізису (просвітління агару).

Визначення фосфатази проводять засівом культур на живильний агар, до

якого заздалегідь додають паранітрофенілфосфат (0,5 мг на 1 мл середовища).

176

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Інкубація протягом 18-20 год при 37 °С. Поява навколо посівів інтенсивного жов-

того забарвлення свідчить про виділення фосфатази.

Стійкість до новобіоцину визначають посівом культури на м’ясо-пептон-

ний агар з новобіоцином (1,6 мкг/мл). Золотисті й епідермальні стафілококи чут-

ливі до цього антибіотика, а S.saprophyticus – стійкий.

Реакція Фогес-Проскауера. Виділену чисту культуру сіють у глюкозо-фос-

фатний бульйон Кларка. Через три дні інкубації при 37 °С до 1 мл культури дода-

ють 0,6 мл альфа-нафтолу та 0,2 мл КОН і струшують. При позитивній реакції

через 3-5 хв з’являється рожеве забарвлення.

Біологічне дослідження. Патогенні стафілококи, що викликають харчові

токсикоінфекції, виділяють та ідентифікують так само, як і стафілококи взагалі.

Вони відрізняються здатністю продукувати ентеротоксини А, В, С1, С2, С3, D, Е,

F, які характеризуються термостабільністю та антигенною специфічністю. Най-

частіше зустрічаються типи А і D. Вказані токсини отримують шляхом посіву

культури в спеціальне напіврідке середовище, інкубують 3-4 доби при 37 °С в

ексикаторах з 20 % СО

. Середовище з токсином пропускають через мембранні

фільтри № 3 і 4. Отриманий фільтрат прогрівають при 100°С 30 хв і вводять коше-

нятам-сисунам внутрішньоочеревинно або через зонд у шлунок. Через 30-60 хв у

тварин виникає блювання, пізніше пронос і загальна прострація. Щоб виявити

ентеротоксини у харчових продуктах, що спричинили токсикоінфекцію, ними го-

дують кошенят. Останнім часом ідентифікацію і типування ентеротоксинів про-

водять за допомогою реакції імунопреципітації в агаровому гелі. Це найпрості-

ший і найчутливіший метод виявлення ентеротоксинів.

Серологічне дослідження при стафілококових інфекціях проводиться лише

тоді, коли збудника виділити не вдається, наприклад, при хронічних процесах (ос-

теомієліт, септикопіємія) особливо якщо вони довго лікуються антибіотиками.

Серед сучасних серологічних реакцій найчастіше використовують РНГА та ІФА,

зокрема для визначення антитіл до рибіттейхоєвої кислоти або інших видоспеци-

фічних антигенів. Але ідентифікація антитіл до тейхоєвої кислоти вирішального

значення не має, а результати часто суперечливі. До того ж, реактиви для їх визна-

чення поки що малодоступні.

Дослідження на бактеріоносійство серед медичного персоналу проводиться

двічі на рік. При планових бактеріологічних обстеженнях обов’язково досліджують

слиз із носа. Дослідження слизу із ротоглотки проводять вибірково, при наявності

запальних процесів у зіві. Матеріал беруть із передніх відділів носа стерильним

ватним тампоном і ним же сіють на ЖСА не пізніше, як через 2 год після взяття.

Виділення та ідентифікацію S.aureus проводять так само, як і при дослідженні

інших матеріалів.

При визначенні масивності обсіменіння стафілококами слизової носа там-

пон із досліджуваним слизом вносять у пробірку з 0,5 мл стерильного ізотонічно-

го розчину хлориду натрію, прополіскують його в рідині струшуванням протягом

10 хв, відтискують об стінки й видаляють. Рідину багаторазово перемішують піпет-

кою. Окремо піпеткою наносять 0,1 мл змиву на чашку із ЖСА і ретельно розтира-

177

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ють шпателем. Чашки з посівами інкубують при 37 °С протягом 48 год, після чого

підраховують кількість колоній. Якщо з 50 колоній S.aureus, що виросли, дві відне-

сені до одного й того ж фаготипу, правомірно вважати, що й всі інші колонії, іден-

тичні за морфологією та пігментом, належать до S.aureus аналогічного фаготипу.

Приклад для розрахунку: після посіву 0,1 мл змиву виросло 50 колоній

S.aureus. Отже, у 0,5 мл буде 50·5 = 250 колоній або 2,5·10

Масивність стафілококового обсіменіння, яке виражається числом 10

мікроб-

них клітин, є помірною, при ній збудник в оточуюче середовище не виділяється.

При виділенні >10

бактерійних клітин рівень обсіменіння визначають як висо-

кий, при якому збудник виділяється у зовнішнє середовище не лише при кашлі та

чханні, а й при спокійному диханні. За таких обставин треба обов’язково прово-

дити санацію бактеріоносіїв.

Визначення фаговарів золотистих стафілококів має важливе значення для

встановлення джерела інфекції. Методика фаготипування наводиться в інструкції

для використання стафілококових бактеріофагів. Штами S.aureus, виділені із сли-

зових оболонок дихальних шляхів медперсоналу хірургічних стаціонарів і поло-

гових будинків, треба фаготипувати в обов’язковому порядку, виділені від хво-

рих – лише за епідпоказаннями. Для визначення фаговарів використовують міжна-

родний набір із 23 помірних фагів, які розділені на 4 групи:

1 група – фаги 29, 52, 52А, 79, 80;

2 група – фаги 3А, 3С, 55, 71;

3 група – фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 84, 85;

4 група – фаги 94, 95, 96;

поза групою – фаги 81, 187.

За допомогою вказаних фагів вдається типувати 60-80 % виділених культур.

Встановлені особливі епідемічні штами S.aureus, які найчастіше циркулюють у

стаціонарі при внутрішньолікарняних інфекціях (напр. фаготипи 77 і 80). Отри-

мані також набори специфічних бактеріофагів для типування S.epidermidis.

У чистих культур стафілококів, виділених від хворих, обов’язково визнача-

ють антибіотикограми з метою застосування адекватних препаратів для лікуван-

ня або інтра- і передопераційної антибіотикопрофілактики. У стафілококових носіїв

визначення чутливості культур до антибіотиків проводять лише за показаннями,

наприклад, при необхідності вибирати препарат для санації. При цьому викори-

стовують дискодифузійний метод або спосіб серійних розведень.

Останнім часом у бактеріологічних лабораторіях широко стали використову-

вати СІБ та ПБДС для швидкої та більш економічної уніфікованої ідентифікації

бактерій.

Стрептококові інфекції

Родина Streptococcaceae об’єднує в своєму складі сім родів: Streptococcus,

Enterococcus, Aerococcus, Pediococcus, Peptostreptococcus, Lactococcus, Leuconostoc.

Серед них в інфекційній патології людини найбільше значення мають стрептоко-

178

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ки та ентерококи. Загальновизнаною є класифікація стрептококів за Ленсфільд.

На основі специфічних полісахаридів і поверхневих білкових антигенів виділяють

20 серологічних груп, які позначаються великими літерами латинського алфавіту

від А до V. Патогенні види належать до серогруп А, В, С і D, значно рідше – до

груп F i J. Їх визначають за допомогою реакції преципітації з відповідними анти-

сироватками. Однак, із-за відсутності преципітуючих сироваток бактеріологічні

лабораторії не мають змоги проводити серологічну ідентифікацію стрептококів.

Тому в сучасних умовах використовують інші критерії їх диференціації (табл. 33).

Таблиця 33

Диференціація найважливіших стрептококів і ентерококів

Ріст у

присутностi

Ферментація

Види

Група

6,5 %

NaCl

40 %

жовчі

β-гемоліз

α-гемоліз

Гідроліз

ексуліну

лак-

тоза

маніт

салі-

цин

сор-

біт

трега-

лоза

Гноєрідні

стрептококи

1. S.pyogenes

2. S.agalactiaе

3. S.equi

–

Ротові

стрептококи

4. S.pneumoniаe

5. S.salivarius

6. S.mutans

–

Анаеробні

стрептококи

7. S.morbillorum

8. S.parvulus

9. S.pleomoрhus

–

Ентерококи

10. S.faecalis

11. S.faecium

12. S.durans

–

Основою лабораторної діагностики захворювань, спричинених стрептокока-

ми, є бактеріологічні та серологічні методи.

Взяття матеріалу для дослідження. При сепсисі, остеомієліті та інших видах

генералізованої стрептококової інфекції беруть кров. При інших захворюваннях за-

бирають гній, виділення слизових оболонок, харкотиння, ліквор, жовч, сечу, випо-

рожнення тощо, залежно від локалізації патологічного процесу. Правила взяття й

доставки матеріалу до лабораторії такі ж самі, що й при стафілококових інфекціях.

Первинна мікроскопія мазків із гною, ранового вмісту, секрету слизової тощо

(окрім крові) проводиться після забарвлення їх за Грамом. Стрептококи мають

фіолетовий колір, виглядають короткими ланцюжками, диплококами чи поодинці

(рис. 61; див. вкл., рис. 10).

179

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Часто за характером розташування клітин у маз-

ку важко або й взагалі неможливо визначити належ-

ність бактерій до стрептококів. Тому необхідно вид-

іляти чисту культуру і встановлювати вид збудника.

Бактеріологічне дослідження. Для встанов-

лення діагнозу при гострих стрептококових інфек-

ціях (за винятком скарлатини з типовою клінічною

картиною) потрібно проводити бактеріологічне дос-

лідження. При підозрі на сепсис сіють біля ліжка

хворого 10-15 мл крові у флакон, що містить 100-

150 мл цукрового бульйону (співвідношення крові і

середовища 1:10). Кращі й надійніші результати да-

ють посіви крові в середовище Кітта-Тароцці з на-

піврідким агаром. У ньому будуть рости й анаеробні

стрептококи. Посіви крові інкубують у термостаті при 37 °С. При рості стрепто-

коків на дні середовища з’являється осад. У середовищі Кітта-Тароцці може утво-

рюватися й газ. У мазках із осаду виявляють грампозитивні стрептококи у вигляді

довгих ланцюжків. Пневмококи розташовуються короткими ланцюжками або пар-

но у вигляді ланцетоподібних клітин, повернутих одна до одної потовщеними кінця-

ми. Для ентерококів властиве парне розташування, рідше тетрадами або купками,

але не гронами. Окремі клітини ентерококів поліморфні (великі й малі).

При відсутності росту посіви витримують у термостаті протягом 3-4 тижнів,

періодично проводячи бактеріоскопію.

Культуру, що виросла, після бактеріоскопії пересівають у чашку з кров’яним

агаром для визначення типу гемолізу. Через 18-20 год виростають типові колонії,

оточені світлою зоною (бета-гемоліз) або зоною позеленіння (альфа-гемоліз). Хоч

здатність до гемолізу не має абсолютного діагностичного значення, все ж при дос-

лідженні стрептококів, виділених від людини, можна відкидати негемолітичні

колонії гамма-стрептококів. За дуже рідким винятком вони не пов’язані з інфек-

ційними захворюваннями.

Щоб краще й точніше ідентифікувати виділені гемокультури стрептококів

колонії з кров’яного агару рекомендують відсівати на простий МПА, молоко з

метиленовим синім, жовчний бульйон (або жовчно-кров’яний агар). Гемолітичні

стрептококи серогрупи А не ростуть на простих і жовчних середовищах, не зне-

барвлюють метиленовий синій у молоці. Ентерококи добре ростуть на агарі з

жовчю. Далі різні види стрептококів можна диференціювати за біохімічними вла-

стивостями (табл. 33). Але біохімічні ознаки стрептококів не є постійними, що до

деякої міри знецінює використання цих тестів.

Гній, рановий вміст, слиз із зіва та носа, зібрані ватними тампонами, а також

харкотиння, ліквор, сечу тощо сіють на кров’яний агар. Матеріал наносять на се-

редовище в невеликій кількості, а потім петлею чи шпателем розсівають його лег-

кими штрихами по всій поверхні. Не рекомендують втирати досліджуваний мате-

ріал в агар.

Рис. 61. Стрептококи

(мазок із бульйонної культури).

180

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Для підвищення частоти висівання стрептококів тампони після посіву на

кров’яний агар ще біля ліжка хворого занурюють у пробірку з середовищем Кітта-

Тароцці, до якого додають напіврідкий агар та 2-3 краплі дефібринованої крові

кролика. Посів інкубують 3-4 год при 37 °С, а потім висівають на чашки з кров’я-

ним агаром, виділяють та ідентифікують за звичайною схемою.

Для швидкої ідентифікації бета-гемолітичних стрептококів серогрупи А ви-

користовують експрес-метод за допомогою реакції імунофлуоресценції. Для цьо-

го мазок із виділеної культури фіксують у 95 % спирті протягом 15 хв, забарвлю-

ють відповідними люмінесцуючими сироватками і розглядають під люмінесцент-

ним мікроскопом. Практично всі гемолітичні стрептококи групи А чутливі до

бацитрацину і дають позитивний ПІР-тест, тобто гідролізують пірролідоніл-бета-

нафтіламід. Ще швидше стрептококи цієї групи визначають у мазках із рото- та

носоглотки, обробляючи їх сучасними комерційними тест-наборами. Групові А-ан-

тигени стрептококів екстрагують за допомогою ферментів або інших хімічних

реагентів і визначають їх в реакціях латекс-аглютинації, коаглютинації або імуно-

ферментним аналізом.

Стрептококи групи В, як правило, нечутливі до дії бацитрацину, розклада-

ють гіппурат і дають позитивний САМР-тест (посилення гемолізу під впливом

дисків, що містять стафілококовий бета-гемолізин).

Подальшу ідентифікацію проводять серотипуванням у реакціях латекс-аглю-

тинації або коаглютинації з комерційними реагентами або міченими моноклональ-

ними антитілами. Стрептококи в мазках із вагіни можна швидко ідентифікувати

за допомогою таких самих тест-систем, як і для стрептококів групи А.

Для визначення вірулентності виділених культур стрептококів використову-

ють біопробу на білих мишах або встановлюють концентрацію поверхневого

М-протеїну, властивого лише для патогенних штамів. Для цього отримують соля-

нокислі екстракти з молодих культур стрептококів і визначають у них вміст М-ан-

тигену.

При визначенні альфа- і бета-гемолітичних стрептококів у повітрі операцій-

них, пологових залів, кімнат для новонароджених, маніпуляційних та інших лікар-

няних приміщень роблять посіви повітря седиментаційним методом або за допо-

могою апарата Кротова на середовище Гарро (до розтопленого МПА додають 5 %

дефібринованої крові та 0,2 % водного 0,1 % розчину ганціанвіолету). Ентероко-

ки та сапрофітна мікрофлора на цьому середовищі не ростуть.

Серологічне дослідження. При хронічних стрептококових інфекціях виді-

лити збудника, як правило, не вдається, особливо при тривалому лікуванні хворих

антибіотиками та іншими протимікробними препаратами. В такому разі прово-

дять серологічні дослідження: визначення стрептококового антигена в сироватці

крові та сечі, титрування антитіл до О-стрептолізину, гіалуронідази і ДНК-ази.

Антиген стрептококів визначають в РЗК. Необхідні для цього антистрепто-

кокові сироватки отримують шляхом гіперімунізації кроликів вбитою культурою

бета-гемолітичних стрептококів серогрупи А. Титром антигену вважають те най-

більше розведення сироватки, яке затримує гемоліз. Кращі результати отримують

181

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

при постановці РЗК на холоді. Останнім часом для виявлення стрептококових ан-

тигенів у сироватці крові досить успішно використовують метод ІФА.

При визначенні стрептококових антигенів у сечі хворих використовують ре-

акцію преципітації. Осад ранкової порції сечі після центрифугування обробляють

протистрептококовою преципітуючою сироваткою. Результат враховують через

годину при кімнатній температурі. Стрептококові антигени в сироватці крові та

сечі часто виявляють при скарлатині, ангінах, ревматизмі.

Визначення антитіл проти О-стрептолізину (антистрептолізину-О) проводять

внесенням робочої дози стандартного препарату О-стрептолізину в ряд пробірок

із кратними розведеннями сироваток (1:25, 1:50, 1:100 і т.д.). Суміш інкубують у

термостаті протягом 15 хв, потім у всі пробірки вносять по 0,2 мл 5 % зависі ерит-

роцитів кроля і знову вміщують у термостат на 60 хв. При наявності антистрепто-

лізину в крові хворих гемолізу не наступає. Пробірка з найбільшим розведенням

сироватки, в якій є виражена затримка гемолізу, містить 0,5 АО (антитоксичних

одиниць) антистрептолізину-О.

Для визначення антитіл проти гіалуронідази (антигіалуронідази) до сироват-

ки хворих у різних розведеннях вносять стандартну дозу гіалуронідази й робочу

дозу гіалуронової кислоти, яку готують із пупкових канатиків новонароджених.

При наявності антигіалуронідази в пробірках утворюється згусток після додаван-

ня оцтової кислоти. Пробірка з найменшою кількістю сироватки, в якій є згусток,

містить 1 АО (антитоксичну одиницю) антигіалуронідази. При ревматизмі та стреп-

тококовому гломерулонефриті в сироватці хворих виявляють >500 АО антистреп-

толізину і >800-1000 АО антистрептогіалуронідази вже з перших днів хвороби.

Саме при цих захворюваннях найчастіше проводять обидві серологічні реакції. В

багатьох країнах використовують комерційні тест-системи для визначення антитіл

до стрептолізину, гіалуронідази, стрептокінази, ДНК-ази та інших екзоферментів

стрептококів.

Пневмококові інфекції. Серед хвороботворних стрептококів S.pneumoniae

(пневмокок) займає особливе місце. Він відіграє дуже важливу роль в інфекційній

патології людини. Цей вид є одним із основних збудників крупозного запалення

легень. За далеко неповними даними щороку в світі нараховують понад 500 тис.

випадків пневмоній, викликаних пневмококами, особливо часто у дітей та людей

похилого віку. Окрім запалення легень цей мікроб викликає менінгіт, ендокардит,

перитоніт, отит, риніт, гайморит, сепсис, повзучу виразку рогівки та ряд інших

захворювань.

Для проведення лабораторної діагностики використовують бактеріоскопіч-

ний, бактеріологічний та біологічний методи. Матеріалом для дослідження є хар-

котиння, гній, кров, спинномозкова рідина, слиз із рото- та носоглотки, виділення

з гайморової пазухи, ока та вуха. Важливо негайно відправляти матеріал до лабо-

раторії й досліджувати дуже швидко, оскільки пневмококи схильні до автолізу.

Бактеріоскопічне дослідження матеріалу (окрім крові) зводиться до виго-

товлення двох мазків. Один із них забарвлюють за Грамом, другий – за Буррі-

Гінсом, що дає змогу виявити капсулу. Пневмококи розташовуються у вигляді лан-

182

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

цетоподібних диплококів, оточених спільною капсулою. Якщо в полі зору виявля-

ють 10 і більше типових диплококів, можна з великою вірогідністю зробити вис-

новок про наявність S.pneumoniae. Однак, первинна мікроскопія не дає права по-

ставити остаточний діагноз, оскільки у мазках можуть бути капсульні непатогенні

диплококи – представники нормальної мікрофлори. Тому потрібно проводити посів

клінічного матеріалу й виділяти чисту культуру.

Бактеріологічне дослідження. При сепсисі біля ліжка хворого сіють 10 мл

крові у флакон, що містить 100 мл сироваткового або цукрового бульйону, інкубу-

ють 18-20 год при 37 °С, потім висівають на кров’яний агар, виділяють та іденти-

фікують чисту культуру. При менінгіті ліквор центрифугують і з осаду роблять

посів на кров’яний агар. На ньому пневмококи ростуть у вигляді маленьких круг-

лих колоній, оточених зеленою зоною, в центрі колонії видно характерне вдавлен-

ня. Посів харкотиння або гною на живильні середовища робити недоцільно, оскіль-

ки присутня сапрофітна мікрофлора пригнічує ріст S.pneumoniae. Краще дослі-

джуваний матеріал ввести в черевну порожнину білих мишей. Постановка

біопроби – швидкий, надійний і точний метод виділення чистої культури пневмо-

коків. Білі миші дуже чутливі до цих бактерій і вже через 10-12 год після заражен-

ня пневмококи проникають у кров і паренхіматозні органи, викликаючи сепсис.

Посів крові з серця або шматочків внутрішніх органів під час розтину тварин дає

змогу виділити чисту культуру збудника.

Для ідентифікації пневмококів використовують такі їх властивості. На відміну

від інших видів стрептококів, S.pneumoniae не росте на середовищі з оптохіном,

ферментує інулін і дуже чутливий до дії жовчі (дезоксіхолатна проба). Швидкий

лізис пневмококів під дією жовчі можна виявити, якщо до 1 мл бульйонної культу-

ри додати 0,5 мл жовчі. Через 15-20 хв перебування в термостаті настає повний

лізис бактерійних клітин.

Для визначення сероварів пневмококів (нині їх нараховують 85) використо-

вують реакцію аглютинації на склі з типовими сироватками або феномен “набря-

кання капсул”. В присутності гомологічної сироватки капсула пневмококів силь-

но набрякає. Ще краще проводити серотипування за допомогою комерційних ре-

агентів у реакціях латекс-аглютинації або коаглютинації, завдяки яким виявляють

капсульні антигени.

Серед стрептококів важливий ще рід Enterococcus, найбільш значущими вида-

ми якого є Е.faecalis, E.faecium i E.durans. Вони досить широко розповсюджені в

природі. Основною їх екологічною нішею є кишечник людей і тварин, але їх вияв-

ляють і в складі нормальної мікрофлори шкіри промежини, сечостатевих органів,

рото- і носоглотки. Вони можуть викликати нагноєння ран, бактеріємії, ураження

урогенітальної системи, особливо у хворих із довго функціонуючими катетерами,

харчові токсикоінфекції, дисбактеріози кишечного тракту, рідше ендокардити.

У мазках із досліджуваного матеріалу ентерококи розташовуються парами,

короткими ланцюжками або у вигляді скупчень, грампозитивні.

Бактеріологічна діагностика ентерококових інфекцій проводиться без будь-

яких труднощів, оскільки ці бактерії добре ростуть на простих середовищах. Се-

183

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

лективним для них є агар ДИФ-3 (до 600 мл 3 % МПА додають 400 мл 40 %

жовчі). Через 24 год інкубації колонії, що виросли, мають розміри 0,4-1,0 мм сіру-

ватого кольору. На кров’яному агарі навколо колоній виникає неповний або пов-

ний гемоліз. На відміну від зеленящих стрептококів ентерококи можуть рости на

МПА з 6,5 % NaCl, редукують молоко з метиленовим синім при 37 °С через 4-6 год.

Ідентифікацію виділених культур проводять за морфологічними, культуральними

та біохімічними ознаками.

Менінгококові інфекції

Збудник менінгококових інфекцій Neisseria meningitidis належить до родини

Neisseriaceae, роду Neisseria. Основним біотопом менінгококів є слизова оболон-

ка носоглотки людини. Окрім N.meningitidis, в цій ділянці часто знаходяться непа-

тогенні нейсерії, що входять до складу резидентної мікрофлори здорових людей.

За полісахаридними антигенами менінгококи поділяють на серогрупи А, В, С, D,

29E, X, Y, Z, W-135 та недавно ідентифіковані H, I, K, L.

Лабораторна діагностика менінгококових інфекцій базується на бактеріоско-

пії досліджуваного матеріалу, виділенні чистої культури збудника, його біохімічної

та серологічної ідентифікації. Залежно від клінічної форми захворювання, матеріа-

лом для дослідження служить спинномозкова рідина (при менінгіті), слиз із носо-

глотки (при назофарингіті та бактеріоносійстві), кров і вміст петехій (при менінгіті).

Забір матеріалу необхідно проводити до початку етіотропної терапії, сіяти його

біля ліжка хворого або негайно направляти до лабораторії, не допускаючи пере-

охолодження, оскільки менінгококи дуже чутливі до температурних коливань.

Бактеріоскопічне дослідження. Якщо спинномозкова рідина гнійна (кала-

мутна), мазки з неї виготовляють без будь-якої обробки, коли ж вона прозора –

мазки готують з осаду після центрифугування. Препарати фарбують метилено-

вою синькою, за Романовським-Гімзою та Грамом. Останній метод дає найменш

чіткі результати, оскільки клітини ліквору дуже змінюються, появляються чисельні

артефакти, що імітують присутність менінгококів. У типових випадках бактерії в

мазках виглядають як грамнегативні диплококи

(рис. 62), що мають вигляд кавових зерен, які роз-

ташовуються парами, тетрадами, або хаотично, ча-

сто всередині лейкоцитів (незавершений фагоци-

тоз). У такому разі, при типовій клінічній картині,

первинна мікроскопія ліквору набуває важливого

значення для встановлення менінгококової етіології

захворювання.

Мікроскопічне дослідження крові при менін-

гококемії зводиться до виготовлення й забарвлення

товстої краплі. Виявлення численних темно-синіх

диплококів, розташованих парами або у вигляді

скупчень, дає змогу швидко поставити діагноз. Од-

Рис. 62. Менінгококи в мазку

з спинномозкової рідини.

184

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

нак, позитивні результати бактеріоскопії мазків крові бувають не завжди, навіть

при типовій формі генералізованої менінгококової інфекції.

Майже постійно й дуже швидко N.meningitidis можна виявити мікроскопічно

в мазках із метастатичних вогнищ інфекції, якими є елементи висипу (екзантеми,

петехії, розеоли, папули). Аспіровані за допомогою голки зі шприцом маленькі

крапельки крові з петехій розмазують на предметному склі й фарбують за Рома-

новським-Гімзою. Мазки із вмісту петехій можна також виготовити у вигляді

відбитків. Для цього стерильною петлею обережно скарифікують поверхню пе-

техії, потім до неї прикладають стерильне предметне скло, фіксують у полум’ї

пальника й забарвлюють. На основі даних мікроскопії можна видати попередню

відповідь. Таким способом менінгококи можна виявити навіть тоді, коли гемо-

культура не виділяється.

При мікроскопії виділень із носоглотки, взятих тампоном із глибоких відділів

слизової позаду м’якого піднебіння, виявлення грамнегативних диплококів має

обмежене значення, оскільки там можуть бути подібні за морфологією непато-

генні види нейсерій.

Інші експрес-методи діагностики зводяться до постановки серологічних ре-

акцій для визначення менінгококових антигенів у крові, спинномозковій та сино-

віальній рідинах. З цією метою використовують реакції коаглютинації, латекс-

аглютинації, зустрічного імуноелектрофорезу, ІФА, вживаючи специфічні групові

антименінгококові сироватки.

Бактеріологічне дослідження. У хворого на епідемічний гнійний менінгіт

зразу ж при госпіталізації беруть 2-5 мл спинномозкової рідини. Стерильною пасте-

рівською піпеткою з дна пробірки (краще після центрифугування) набирають 0,3-

0,5 мл й по 2-3 краплі засівають на поверхню підігрітих середовищ у двох чашках

Петрі, розтираючи матеріал шпателем. В одній чашці міститься сироватковий агар

(до розтопленого й охолодженого до 45 °С МПА добавляють 20 % кінської або би-

чачої сироватки), у другій – “шоколадний” агар (до розтопленого й охолодженого

МПА додають 10 % дефібринованої крові, тричі підігрівають, не доводячи до кипін-

ня). Посіви на асцитичні середовища дають гірші результати. Залишки ліквору ви-

користовують для посіву на середовище збагачення (напіврідкий сироватковий агар)

і одночасно для проведення вище вказаних експрес-методів діагностики. Залишок

матеріалу в пастерівській піпетці використовують для виготовлення мазка.

Посіви вміщують в ексикатор, де створюють підвищену концентрацію вугле-

кислоти, поставивши в нього запалену свічку й герметично закривши кришкою.

Коли свічка погасне, в ексикаторі буде атмосфера з 7-10 % СО

. Після цього посу-

дину із засіяними середовищами ставлять у термостат при 37 °С.

Через 24 год інкубації досліджують культуральні властивості. Колонії менін-

гококів на сироватковому агарі ніжні, гладенькі, безбарвні, в’язкої консистенції,

розміром 2-3 мм. Менінгококові колонії на “шоколадному” агарі мають сіруватий

колір, блискучу поверхню, рівний край, маслянисту консистенцію, розміри 1-3 мм.

Колір середовища навколо колоній не змінюється. Якщо в мазках із таких колоній

виявляють грамнегативні коки, які дають позитивні проби на оксидазу та катала-

185

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

зу, це дає право віднести культури до роду нейсерій і провести диференціацію

видів. З цією метою відсівають колонію на скошений сироватковий агар для виді-

лення чистої культури. В разі відсутності росту на обох чашках, досліджують ріст

у середовищі збагачення.

На третій день дослідження визначають серогрупу виділеної культури в ре-

акції аглютинації на склі з менінгококовими сироватками. Ліофільно висушені

сироватки розчиняють, вносячи в ампулу 1 мл стерильного 0,85 % розчину хлори-

ду натрію. На предметні скельця наносять окремими піпетками краплі діагнос-

тичних сироваток різних серогруп (А, В, С, D і т.д.) і краплю фізіологічного роз-

чину (для контролю культури на спонтанну аглютинацію). Бактеріологічною пет-

лею виділену культуру емульгують у краплі кожної сироватки та краплі

фізіологічного розчину. Через 2-3 хв враховують результат реакції. Висновок про

належність культури до певної серогрупи роблять на основі реакції аглютинації з

відповідною сироваткою. При появі спонтанної аглютинації в краплі фізіологіч-

ного розчину реакцію не враховують.

Визначають дискодифузійним методом чутливість виділеної культури до ан-

тибіотиків і сульфаніламідних препаратів та проводять інші тести для диферен

ціації менінгококів від інших патогенних і непатогенних нейсерій (табл. 34).

Таблиця 34

Диференціальні ознаки нейсерій і брангамел

Ріст на Розклад вуглеводів Редукція

Вид

простому

агарі

сироватко-

вому агарі

Залежність

росту

від СО

в перших

генераціях

Пігмент

Оксидаза

Глюкози

Мальтози

Сахарози

Фруктози

Лактози

N.meningitidis

N.gonorrhoeae

N.flava

N.flavescens

N.subflava

N.perflava

N.lactamica

N.mucosa

N.sicca

B.catarrhalis

–

При генералізованій менінгококовій інфекції (менінгококемії) для виділення

збудника із кров’яного русла за допомогою стерильної венепункції беруть 10 мл

крові й засівають її у флакон із 100 мл напіврідкого середовища. Через 24 год

роблять висів із флакону на чашку з сироватковим (або “шоколадним”) агаром.

Отримавши ізольовані колонії, виділяють та ідентифікують чисту культуру так

само, як із спинномозкової рідини.

Щоб посіяти ексудат із петехій шкіру навколо них обтирають 70 % спиртом.

При некрозі петехій ексудат для посіву можна взяти стерильною бактеріологіч-

186

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ною петлею з некротизованої ділянки. При неушко-

дженій шкірі ексудат беруть тонкою голкою, з’єднаною

з шприцом, в якому міститься 0,2 мл 0,85 % розчину

хлориду натрію. Фізіологічний розчин вводять у товщу

петехії й відсмоктують назад. Взятий ексудат сіють на

сироватковий агар із ристоміцином або лінкоміцином,

які пригнічують мікрофлору шкіри. Виділення та іден-

тифікацію культур проводять за описаною вище схемою.

При діагностиці назофарингіту або менінгококо-

вого носійства слиз із носоглотки беруть натще або че-

рез 3-4 год після вживання їжі спеціальним стерильним

ватним тампоном, закріпленим на зігнутому під кутом

45° дроті. Кінець тампона направляють догори і вво-

дять за м’яке піднебіння, при цьому корінь язика при-

давлюють шпателем (рис. 63).

При вийманні тампона взятий матеріал не пови-

нен торкатися зубів, язика і слизової щік. Матеріал не-

гайно засівають на сироватковий агар із ристоміцином

або лінкоміцином, які пригнічують ріст грампозитивних коків, або тампон зану-

рюють у пробірку з середовищем збагачення. При посіві матеріалу на чашки його

спочатку втирають на невеликій ділянці середовища (1×2 см), перевертаючи там-

пон всіма сторонами, потім тим же тампоном сіють штрихами з відривом на всій

площі агару.

Тепер створені тест-системи на основі полімеразної ланцюгової реакції для

більш надійного виявлення Neisseria meningitidis.

Серологічне дослідження. Для виявлення антитіл в сироватці крові хворих

та перехворілих використовують РНГА з спеціальним діагностикумом, який виго-

товляють шляхом адсорбції групоспецифічних полісахаридних менінгококових

антигенів на еритроцитах. З цією ж метою проводять імуноферментний аналіз.

Необхідно пам’ятати, що цереброспінальний менінгіт можуть викликати й

інші види бактерій: M.tuberculosis, H.influenzae, S.pneumoniae (особливо у людей

похилого віку), значно рідше стафілококи, клебсієли, сальмонели, протей, пасте-

рели, бактероїди, бруцели, лептоспіри, мікроплазми тощо. Методи виділення та

ідентифікації вказаних видів розглядаються у відповідних розділах спеціальної

мікробіології.

Гонококові інфекції

Збудник гонореї і бленореї N.gonorrhoeae (за попередньою класифікацією

гонокок) належить до родини Neisseriaceae, роду Neisseria. У мазках із виділень

хворих гонококи мають форму кавових зерен, грамнегативні, розташовуються

парами як всередині лейкоцитів (незавершений фагоцитоз), так і поза клітинами.

За своїми морфологічними ознаками вони дуже подібні до менінгококів. Для го-

Рис. 63. Забір матеріалу

з носоглотки спеціальним

тампоном:

а – шпатель; б – тампон.

187

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

нококів властивий поліморфізм – зустрічаються дрібніші й більші клітини, рідко

паличкоподібної форми.

До живильних середовищ дуже вибагливі. Краще ростуть на середовищах,

що містять кров, сироватку, асцитичну рідину. Гонококи містять протеїнові й полі-

сахаридні антигени, за якими поділені на 16 сероварів, але в рутинних баклабора-

торіях їх поки що не визначають.

Для мікробіологічної діагностики гонококових інфекцій використовують бак-

теріоскопічний, бактеріологічний, серологічний і алергічний методи.

Взяття матеріалу для дослідження. Щоб надійно і доброякісно провести

бактеріологічну й бактеріоскопічну діагностику, важливо правильно взяти

клінічний матеріал. Його, як правило, повинен проводити лікар.

У чоловіків досліджують виділення сечовипускного каналу, парауретраль-

них ходів, прямої кишки, при показаннях – матеріал із ротоглотки, а також секрет

передміхурової залози після її масажу. Можна також досліджувати осад і “нитки”

сечі, але в них гонококи виявляються значно рідше. Перед взяттям матеріалу з

уретри хворий не повинен помочитися протягом 4-5 год, не вживати антимікробні

препарати і дезінфікуючі розчини. Зовнішній отвір уретри спочатку протирають

стерильним ватним тампоном, змоченим 0,85 % розчином хлориду натрію, потім

сухим тампоном. Мазки виготовляють не з гною, що вільно витікає, а з матеріалу,

взятого шляхом зіскобу з слизової уретри бактеріологічною петлею або спеціаль-

ною ложечкою Фолькмана. При незначних виділеннях необхідно зробити попе-

редній масаж уретри.

У жінок матеріал беруть із уретри, парауретральних ходів, шийки матки, пря-

мої кишки, а за показаннями – і з ротоглотки. Спочатку очищають вагіну від виді-

лень, проводять масаж уретри і шляхом зіскобу бактеріологічною петлею або ло-

жечкою Фолькмана забирають матеріал. Шийку матки спочатку протирають су-

хим стерильним ватним тампоном для видалення слизової пробки. Виділення з

каналу шийки матки беруть бактеріологічною петлею або пінцетом. Матеріал із

дистального відділу прямої кишки беруть за допомогою ложечки Фолькмана

“сліпим методом”, тобто без будь-якої підготовки хворого, або за допомогою рек-

тоскопа чи ректального дзеркала. В цьому випадку досліджуваний матеріал заби-

рають безпосередньо з видимого місця ураження.

При орофарингеальній гонореї слиз із ротоглотки беруть стерильними ват-

ними тампонами на спеціальних тримачах із сталевого дроту. Для діагностики

бленореї виділення кон’юнктиви знімають бактеріологічною петлею. Рідко гоно-

рея ускладнюється гоносепсисом, ендокардитом, артритом. Тоді матеріалом для

дослідження служить кров або синовіальна рідина. Приймаючи до уваги високу

чутливість гонококів до коливань температури, досліджувані матеріали доставля-

ють до лабораторії у спеціальних термосах або сумках із грілкою.

Бактеріоскопічне дослідження є найпоширенішим, хоч і менш чутливим

методом лабораторної діагностики гонореї та бленореї в порівнянні з виділенням

чистих культур. Це особливо стосується хронічного перебігу хвороби, коли в до-

сліджуваному матеріалі міститься незначна кількість гонококів. Однак при пра-

188

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

вильному взятті матеріалу, повторних обстеженнях пацієнтів, застосуванні методів

провокації, кваліфікованій оцінці мазків бактеріоскопічне дослідження досить

часто дає змогу швидко і вірно діагностувати захворювання.

Із досліджуваного матеріалу виготовляють два тонкі рівномірні препарати-

мазки. Один забарвлюють метиленовою синькою, другий – за методом Грама. При

відсутності метиленового синього можна забарвлювати один мазок 1 % водним

розчином кристалічного фіолетового або 0,5 % розчином брильянтового зеленого

протягом 1 хв. Висновок про наявність гонококів роблять, базуючись на таких їх

властивостях: грамнегативне забарвлення, диплоко-

кова структура, форма кавових зерен, розташуван-

ня всередині лейкоцитів (рис. 64; див. вкл., рис. 11).

Під впливом антибіотиків та інших хіміопре-

паратів а також при хронічній гонореї морфологія й

забарвлення гонококів можуть змінюватися. Окремі

клітини набувають різну форму і величину (так звані

форми Аша). Окрім того в досліджуваному матері-

алі можуть знаходитись подібні до гонококів грам-

негативні коки з роду Veillonella. Це до деякої міри

обмежує діагностичну цінність методу первинної

мікроскопії.

Кращі й надійніші результати дає метод іму-

нофлуоресценції. Тонкі мазки із виділень хворих фіксують у полум’ї пальника.

На них наносять мічену ізотіоціанатом флуоресцеїну антигонококову сироватку

на 1 год при 35 °С у вологій камері. Після цього мазки двічі промивають буфер-

ним розчином, наносять забуферений гліцерин і покривають покрівними скельця-

ми. При взаємодії гонококів з міченими антитілами під люмінесцентним мікрос-

копом видно характерне світіння навколо бактерійних клітин.

Бактеріологічне дослідження. Показаннями до виділення чистих культур

гонококів є неодноразові негативні результати бактеріоскопії, наявність підозрі-

лих щодо гонококів, але не ідентифікованих морфологічно мікроорганізмів, а та-

кож для достовірного встановлення вилікованості захворювання. Дуже важливо

негайно помістити посіви в термостат. При неможливості проведення посівів на

місці взяття матеріалу можна зробити висів ватним тампоном у пробірку з транс-

портним середовищем Стюарта, яке забезпечує збереження життєздатності гоно-

коків під час доставки до лабораторії.

Посіви проводять за стандартною схемою в одне із спеціальних живильних

середовищ у пробірках або чашках Петрі (КДС, Бейлі, кров’яний або сироватко-

вий агар, сухе живильне середовище Харківського підприємства “Біолік” з вироб-

ництва бактеріальних та лікарських препаратів). Для діагностичного культиву-

вання гонококів у багатьох країнах використовують ще “шоколадний” агар. Най-

кращими є середовища, виготовлені на основі агару з кролячого м’яса або свіжих

бичачих сердець. Додавання до них 20 ОД/мл поліміксину та 2 мкг/мл лінкоміци-

ну значно підвищує частоту висівання гонококів, оскільки вказані препарати при-

Рис. 64. Гонококи в мазку

з гною.

189

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

гнічують ріст інших бактерій. Усі середовища перед посівом підігрівають у тер-

мостаті протягом 15-20 хв. Чашки й пробірки з посівами вміщують в ексикатори,

де створюють атмосферу з 20 % СО

. Колонії, як правило, виростають через 18-24

год, однак можливий і пізній ріст. Тоді посіви витримують у термостаті (в ексика-

торі!) до 8 діб, щоденно перевіряючи появу росту.

Колонії гонококів, що виросли, мають круглу, злегка опуклу форму, рівні краї,

блискучу поверхню, слизову консистенцію. Вони прозорі, як крапельки роси, майже

безбарвні, хоч можуть траплятись і білуваті варіанти. Отримані колонії досліджу-

ють макро- і мікроскопічно. У мазках гонококи розташовуються парно, тетрада-

ми і скупченнями. Типові колонії пересівають на скошений сироватковий агар

для виділення чистої культури. Остаточну ідентифікацію проводять, враховуючи

морфологічні, культуральні, ферментативні й антигенні властивості. Біохімічно

гонококи мало активні. На сироваткових середовищах із 1,5 % різних вуглеводів

вони розкладають лише глюкозу, але не мальтозу й сахарозу.

Оксидазну активність виділених культур визначають шляхом нанесення на

колонії (після мікроскопії) 1 % розчину діметилпарафенілендіаміну. Оксидазо-

позитивні колонії спочатку червоніють а пізніше чорніють.

Диференціація гонококів від інших видів роду Neisseria має особливе зна-

чення при діагностиці орофарингеальної гонореї. Як відомо, на слизовій мигда-

ликів, рото- та носоглотки постійно знаходиться велика кількість грамнегативних

нейсерій – представників нормальної мікрофлори людини. Надійними методами

ідентифікації гонококів є реакції імунофлуоресценції, латекс- і коаглютинації а

також визначення ферментативних властивостей. Обов’язково проводять якісне

визначення чутливості або резистентності мікроорганізмів до антибіотиків за до-

помогою методу дифузії в агар з використанням дисків.

З метою підвищення частоти знаходження гонококів у мазках при первинній

мікроскопії та більш надійного виділення чистих культур особливо у випадках

в’ялого, хронічного перебігу захворювання вдаються до методів провокації гоно-

реї, тобто штучного загострення патологічного процесу, в результаті чого у виді-

леннях появляється більша кількість гонококів. Основними з цих методів є такі:

а) хімічний – інстиляція в уретру 0,5 % розчину нітрату срібла у чоловіків,

змазування каналу шийки матки 2-5 % розчином нітрату срібла;

б) механічний – введення прямого бужа в уретру на 10 хв, або проведення

передньої уретроскопії;

в) біологічний – внутрішньом’язове введення гоновакцини в кількості 500

млн мікробних тіл, або пірогеналу 200 МПД;

г) аліментарний – вживання солоної, гострої їжі;

д) термічний – прогрівання статевих органів індуктотермічним струмом;

е) фізіологічний – взяття мазків під час менструацій.

Ще краще комбінувати кілька методів провокації, наприклад, хімічний, алі-

ментарний та біологічний.

Останнім часом для більш надійного виявлення збудника гонореї вживають

полімеразну ланцюгову реакцію. Вона дозволяє виявити збудника у випадках хро-

190

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

нічної гонореї, коли бактеріоскопічне і бактеріологічне дослідження не дає пози-

тивних результатів.

Серологічну діагностику гонореї здійснюють порівняно рідко, в основному,

при хронічному її перебігу, коли бактеріоскопічне й бактеріологічні дослідження

не дають позитивних результатів. В сучасних умовах проводять імунофермент-

ний аналіз, РНГА та реакцію Борде-Жангу (РЗК). Антигенами для цих реакцій

служать: вбита нагріванням полівалентна гонококова вакцина, вакцина, інактиво-

вана ультразвуком, протеїнові й полісахаридні фракції гонококів, а також піриди-

новий антиген. ІФА і РНГА є високоспецифічними і достовірними серологічними

реакціями. У порівнянні з минулим РЗК дещо втратила свою роль. Вона не має

практичного значення при діагностиці гострої гонореї, оскільки її виліковують

ще до утворення значної кількості антитіл. Для встановлення достовірності вилі-

кування вона взагалі непридатна. Реакція Борде-Жангу має важливе значення при

серодіагностиці хронічної гонореї, особливо при ускладнених її формах (гоно-

сепсис, метрит, артрит, простатит тощо).

Діагностичне значення алергічних проб дещо знецінюється тим, що вони

позитивні протягом багатьох років після перенесеної гонореї. Для їх постановки

внутрішньошкірно вводять 0,1 мл свіжої гонококової вакцини (100 млн мікробних

клітин в 1 мл). Через 24 год спостерігають гіперемію, інколи з набряком у центрі.

Ешерихіози

Терміном ешерихіози позначають групу інфекційних захворювань, які викли-

кають бактерії роду Escherichia родини Enterobacteriaceaе (див. вкл., рис. 12). Най-

частіше ці захворювання спричиняє E. coli (понад 99 %). Дуже рідко їх можуть

викликати E. blattаe, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris.

Потрібно розрізняти два види ешерихіозів: 1) захворювання, які викликає

умовно-патогенна кишкова паличка, звичайний представник фонової мікрофлори

кишечника; 2) захворювання, що викликають патогенні серовари ешеріхій.

До першого виду захворювань належать колі-сепсиси, септикопіємії, менінгіти

новонароджених, гнійно-запальні процеси жовчевих, сечовивідних та респіратор-

них шляхів тощо. Вони виникають лише при ослабленні резистентності макроор-

ганізму (імунодефіцити, авітамінози, голодування, на фоні інших захворювань).

Вони не передаються від хворої до здорової людини і тим більше не поширюють-

ся епідемічно.

До другого виду захворювань належать колі-ентерити (колі-інфекції), які ура-

жають переважно дітей молодшого віку, передаються від хворого до здорового і

часом реєструються у вигляді епідемічних спалахів. Збудники таких колі-інфекцій

останнім часом поділяють на п’ять типів: ентеротоксичні кишкові палички (ЕТКП),

ентеропатогенні (ЕПКП), ентероінвазивні (ЕІКП), ентерогеморагічні (ЕГКП) і

етероадгезивні (ЕАКП) кишкові палички (табл. 35).

Ентеротоксигенні ешерихії часом викликають холероподібні захворювання,

ентеропатогенні – класичні колі-ентерити, ентероінвазивні – дизентерієподібні

191

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ураження, ентерогеморагічні – діареї з виділенням крові. Останній тип (ентероад-

гезивні кишкові палички) вивчені ще недостатньо. При бактеріємії та інфекції

сечовивідних шляхів часто висівають серогрупи 01, 02, 04, 06, 08, 09, 011, 018 та

ін., при менінгітах – 01, 06, 07, 016, 018, 083.

Мікробіологічна діагностика ешерихіозів має особливо важливе значення,

оскільки їх клінічні прояви характеризуються відсутністю патогномонічних симп-

томів відносно збудника. Провідним залишається бактеріологічний діагноз. Його

особливість полягає в тому, що виділення й ідентифікація збудника базується на

визначенні його антигенної структури, а не на вивченні біохімічних властивостей.

Взяття матеріалу для дослідження. До початку етіотропного лікування у

хворих беруть випорожнення, блювотні маси, дуоденальний вміст, кров, сечу, гній,

спинномозкову рідину, від трупів – кров із серця, вміст кишок, шматочки легень,

печінки, селезінки, нирок. При необхідності досліджують промивні води шлунка,

залишки їжі, змиви з рук обслуговуючого персоналу, повітря палат тощо.

Бактеріоскопічне дослідження. В окремих випадках роблять первинну

мікроскопію крові, сечі, ліквору, гнійних виділень, секретів слизових оболонок у

мазках, забарвлених за Грамом. Виявлення грамнегативних паличок допомагає

бактеріологові вибрати відповідні живильні середовища і наступні етапи лабора-

торної діагностики. Початкова бактеріоскопія випорожнень не проводиться.

Бактеріологічне дослідження. З останніх порцій випорожнень тампоном

беруть частину фекалій у пробірку з транспортним середовищем (30 % гліцерину

Серогрупи

Ураження

О-антиген Н-антинген К-антинген

Кишечника

Ентеротоксигенні

(ЕТКП)

06, 08, 011, 015, 020, 025,

027, 063, 078, 080, 085, 0114,

0115, 0126, 0128, 0139, 0148,

0153, 0159, 0166, 0167

Н4, Н7, Н9, Н11,

Н12, Н19, Н20,

Н21, Н28, Н40

Ентеропатогенні

(ЕПКП)

018, 026, 044, 055, 086, 011,

0112, 0114, 0119, 0125, 0127,

0128, 0142, 0158

Н2, Н6, Н7, Н11,

Н12, Н14, Н18

Ентероінвазивні

(ЕІКП)

028, 029, 0112, 0115, 0124,

0135, 0136, 0143, 0144, 0152,

0164, 0167

Ентерогеморагічні

(ЕГКП)

026, 0111, 0157 Н6, Н7, Н8, Н11

Сечовивідні шляхи 01, 02, 04, 06, 07, 08, 09, 011,

018, 022, 025, 062, 075

К1, К2, К5,

К12, К13

Бактеріємія 01, 02, 04, 06, 07, 08, 09, 011,

018, 022, 025, 075

К1, К2, К5,

К12, К15, К23

Менінгіти 01, 06, 07, 016, 018, 083 К1

Таблиця 35

Класифікація діареєгенних ешерихій

192

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

і 70 % фосфатного буфера) або безпосередньо біля ліжка хворого сіють на середо-

вище Ендо (Левіна, Плоскирєва, Аселя-Лібермана). При цьому невелику кількість

фекалій емульгують у 0,85 % розчині хлориду натрію у співвідношенні 1:10. Через

кілька хвилин після осідання грубих решток 1-2 краплі рідини вносять на поверхню

середовища і скляним шпателем розтирають її на невеликій ділянці. Відірвавши

шпатель від агару, роблять посів на решту поверхні середовища. Якщо виникає

потреба посіяти на другу і третю чашки, матеріал наносять повторно. Кров (10 мл)

засівають у флакон із МПБ. Посів інших матеріалів роблять так само, як і випо-

рожнень.

Після інкубації в термостаті при 37

С протягом доби вивчають характер рос-

ту на елективно-диференціальних середовищах. На агарі Ендо колонії мають дис-

коподібну форму, злегка опуклі з рівними краями, малиново-червоного кольору.

На середовищі Левіна вони забарвлені в темно-синій колір, а на середовищах

Плоскірєва і Аселя-Лібермана – в рожевий. До складу останнього середовища

входить агар, лактоза (або сахароза) та індикатор конго-червоний. Середовище із

сахарозою використовують для індикації тих ентеропатогенних ешерихій, які фер-

ментують цей вуглевод. У зв’язку з тим, що колонії патогенних і непатогенних

кишкових паличок на вказаних середовищах не відрізняються, належність виділе-

них культур до патогенних серогруп визначають за допомогою слайд-аглютинації

з діагностичними полівалентними ОК-сироватками, або адсорбованими О-сиро-

ватками, що містять антитіла до певних О-антигенів. Мікробіологічна промис-

ловість випускає 5 наборів діагностичних ОК-сироваток: ОКА, ОКВ, ОКС, ОКД і

ОКЕ. Основна полівалентна сироватка ОКА містить антитіла до О- і К-антигенів

більше 20 головних серологічних груп. Суміш ОК-сироваток готують так, щоб

кінцеве розведення кожної з них було 1:10. Аглютинують 10 лактозопозитивних

колоній. Матеріал із кожної колонії беруть петлею так, щоб частина її залишилась

для подальшого пересіву. Якщо одна з колоній дала позитивну слайд-аглютинацію,

її залишок пересівають на середовище Олькеницького. Через 18-20 год врахову-

ють ферментацію лактози і глюкози (пожовтіння та розрив стовпчика і скошеної

частини агару), виділення Н

S (утворення чорного кільця на межі стовпчика і ско-

шеної частини). Виділену культуру орієнтовно відносять до певної серогрупи.

Для остаточної ідентифікації збудника необхідно поставити розгорнуту ре-

акцію аглютинації в пробірках для окремого виявлення його О- і К-антигенів. Діаг-

ностичні аглютинуючі сироватки розводять у двох рядах пробірок (у першому –

О-сироватку, у другому – К-сироватку) до титру, що вказаний на етикетках ампул.

Для визначення О-антигену в кожну пробірку першого ряду вносять по 2 краплі

2-х млрд суспензії виділеної культури, прогрітої протягом 2 год при 100

С. При

кип’ятінні інактивується К-антиген, який локалізується поверхнево і затримує

аглютинацію О-антигену. Останній при прогріванні не руйнується. Для виявлен-

ня К-антигену в кожну пробірку другого ряду з розведеною до титру сироваткою

вносять по 2 краплі суспензії живої (не кип’яченої культури). Пробірку вміщують

у термостат при 37

С на 18-20 год. При позитивній реакції розгорнутої аглюти-

нації до титру (або принаймні до половини титру) роблять остаточний висновок

193

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

про виділення відповідного серовару патогенних ешерихій. Негативна слайд-

аглютинація 10 лактозопозитивних колоній ешерихій дає право дати відповідь

про відсутність ентеропатогенних кишкових паличок.

Виділену на середовищі Олькеницького культуру, що дала позитивну розгор-

нуту реакцію аглютинації, сіють на середовища Гісса для вивчення її цукролітич-

них, пептолітичних властивостей і рухливості. Після інкубації посівів протягом

доби враховують результати. Патогенні ешерихії ферментують лактозу, глюкозу,

мальтозу, маніт, сахарозу (окремі штами), арабінозу, ксилозу, трегалозу, утворю-

ють індол, не виділяють H

S (деякі штами утворюють сірководень), не розклада-

ють інозит і сечовину, не дезамінують фенілаланін, дають негативну реакцію

Фогеса-Проскауера і не синтезують ДНК-азу. Для виявлення джерела інфекції

проводять фаго- та коліцинотипування виділених культур.

Ідентифікація діареєгенних серотипів можлива також на основі виявлення

специфічних маркерів. Культури типу ЕТКП продукують два види токсинів: тер-

мостабільний виявляють на мишатах-сисунцях, термолабільний – на культурах

Y1 надниркових залоз. Для швидкої ідентифікації ЕПКП використовують реак-

цію коаглютинації на склі для виявлення білка зовнішньої мембрани. Серотипи

ЕГКП, особливо серовар 0157 : Н7, не ферментують сорбіт. Ентероінвазивні киш-

кові палички (ЕІКП) викликають кон’юнктивіт у гвінейських свинок при внесенні

бактерій у кон’юнктивальний мішок (тест Серені), нерухливі, не ферментують

саліцин. Вони також виділяють шигаподібні токсини SLT-1 і SLT-2, які виявля-

ють у випорожненнях хворих за допомогою ІФА. Адгезивні властивості ешерихій

(ЕАКП) виявляють на культурах Hela і Hep-2.

Найшвидшим і високоспецифічним методом діагностики захворювань, вик-

ликаних ентеропатогенними ешерихіями, є використання специфічних ДНК-зондів.

Вони дають змогу виявити гени плазмід, що кодують патогенність кишкових па-

личок або синтез їх цитотоксинів. Метод грунтується на тому, що одноланцюгова

молекула ДНК може гібридизуватися з комплементарним до неї другим ланцю-

гом ДНК. У більшості патогенних ешерихій гени вірулентності локалізовані у

плазмідах. Отже, зондом для виявлення цих бактерій, можуть бути мічені послідов-

ності, клоновані з таких плазмід.

Серологічне дослідження. Виявлення антиешерихіозних аглютинінів у си-

роватці крові хворих з діагностичною метою в рутинній лабораторній практиці не

знайшло широкого використання. Антитіла якщо й виявляються, то в низьких тит-

рах (не вище 1:100). Для серологічної діагностики колі-інфекцій більш чутливою

і специфічною є реакція непрямої гемаглютинації (РНГА). Специфічний антиген

для цієї реакції виготовляють шляхом сенсибілізації еритроцитів барана суспен-

зією 48 год агарової культури ешерихій, прогрітої 2 год при 100 °С. Отже, за допо-

могою РНГА можна виявити лише О-антитіла, що може бути використано для

диференціації захворювань від бактеріоносійства, особливо, якщо взяти для ре-

акції еритроцитарний діагностикум з автоштамом.

Достовірність серологічної діагностики ешерихіозів зростає при виявленні

окремих класів імуноглуболінів. Зміна підвищеної концентрації IgM на IgG обу-

194

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

мовлена гострим інфекційним процесом. Виявлення в сироватці крові антитіл лише

класу IgG свідчить про бактеріоносійство.

Отже, лабораторна діагностика ешерихіозів основана на виділенні збудника

захворювання і наступній ідентифікації патогенних і непатогенних штамів киш-

кових паличок за допомогою діагностичних ОК-сироваток в орієнтованій і роз-

горнутій реакціях аглютинації.

Захворювання, спричиненні умовно-патогенними

ентеробактеріями

Впродовж останніх років значно зросла роль умовно-патогенних грамнега-

тивних бактерій в патологіі людини. Поряд із гнійно-септичними і опортуністич-

ними інфекціями вони досить часто є причиною внутрішньолікарняних захворю-

вань. 3будниками запальних процесів різних тканин і органів та гастроентероко-

літів часто можуть бути представники таких родів: Proteus, Citrobacter, Enterobacter,

Hafnia, Serratia, Edwardsiella, Providencia.

Мікробіологічну діагностику цих захворювань проводять так само, як і біль-

шості кишкових інфекцій. Основою її є виділення чистих культур та ідентифіка-

ція їх до виду за допомогою визначення біохімічних властивостей та реакції аглю-

тинації з відповідними антисироватками. Матеріалом для дослідження найчасті-

ше служать випорожнення, блювотні маси, кров, гній, ліквор, сеча, жовч,

дуоденальний вміст, секційний матеріал.

Посіви проводять на середовище Ендо, Плоскирєва, Левіна, вісмут-сульфіт-

ний агар з наступною мікроскопією колоній, пересівом їх на середовище Ольке-

ницького та строкатий ряд Гісса, постановкою реакції аглютинації з О- і Н-анти-

сироватками. В ряді випадків застосовують тести, що дають можливість надійно

встановити вид виділеної культури. Дуже важливо проводити й кількісне дослі-

дження, що дозволяє точніше встановити збудника захворювання. При патологіч-

них процесах, викликаних умовно-патогенними бактеріями, концентрація справ-

жнього збудника, як правило, становить 10

-10

клітин в 1 мл досліджуваного ма-

теріалу. Це особливо важливо при виділенні мікробних асоціацій.

Нижче приведені основні властивості окремих видів бактерій та особливості

лабораторної діагностики спричинюваних ними захворювань.

Протейні інфекції. Від хворих на харчові токсикоінфекції, цистити, пієліти,

плеврити, пневмонії, абсцеси, менінгіти, сепсис, гнійні ускладнення ран і опіків

та при дисбактеріозах найчастіше виділяють Proteus vulgaris, P.mirabilis, P.penneri.

У мазках із досліджуваного матеріалу, забарвлених за Грамом, протей має

вигляд грамнегативних поліморфних паличок без спор і капсул, часто утворює

нитковидні форми.

На середовищах Ендо і Плоскирєва виростають прозорі блискучі безбарвні

колонії. На вісмут-сульфітному агарі через 48 годин утворюються сірувато-корич-

неві колонії, під якими формується чорно-коричнева зона. Н-форма (джутикова)

на простому агарі дає характерний повзучий ріст або “феномен роїння”. Культура

195

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

має неприємний гнильний запах. При посіві уколом у стовпчик напіврідкого ага-

ру визначають рухливість. Повзучий характер росту протею використовують для

виділення чистих культур посівом у конденсаційну воду скошеного агару за мето-

дом Шукевича.

Ідентифікація бактерій роду протею дуже проста. Їх легко розпізнати за ха-

рактерним ростом на простому агарі: 85-100 % культур дають “феномен роїння”.

Диференціацію видів проводять за біохімічними ознаками (табл. 36).

Таблиця 36

Диференціальні ознаки бактерій роду Proteus

Ферментація Утворення

Вид

мальтози сахарози ксилози індолу Н

Орнітин-

декарбок-

силаза

Реакція

Фогеса-

Проскауера

Р.vulgaris + + + + + - -

Р. mirabilis - - + - + + ±

Р. myxofaciens + + - - - - +

Р. penneri + + + - ± - -

При наявності діагностичних сироваток види протею ідентифікують в ре-

акції аглютинації. Найважливішою ознакою, яка відрізняє протеїв від інших енте-

робактерій є їх здатність дезамінувати внесений до агару фенілаланін. Розклад

останнього до фенілпіровиноградної кислоти в присутності FеС1

призводить до

забарвлення середовища в зелений колір.

Цитробактер-інфекції. До роду Citrobacter входять 11 видів бактерій, які

виявляють у воді, грунті, харчових продуктах та інших об'єктах оточуючого сере-

довища. Вони постійно живуть у кишечнику здорових людей як представники

нормоценозу. Більшість видів цитробактерів не патогенні для людини. Від хворих

на ентерит, уретрит, холецистит, остеомієліт, отит (особливо у ослаблених паці-

єнтів) найчастіше виділяють Citrobacter freundii, C. koseri, C. amalonaticus. Вони

також можуть викликати ураження дихальних шляхів, септицемії, ендокардити.

C. diversus часом викликає менінгіти й абсцеси мозку.

Лабораторна діагностика основана на виділенні, біохімічній та серологічній

ідентифікації збудника.У мазках із досліджуваних матеріалів виявляють маленькі

прямі грамнегативні палички, розташовані поодинці або парами .

Цитробактери добре ростуть на простих середовищах. Вони здатні утилізу-

вати цитрат. На агарі Ендо штами, що розкладають лактозу, утворюють рожеві

колонії але без металевого блиску. На середовищі Плоскирєва лактопозитивні ко-

лонії мають насичений червоний колір з темним центром, на вісмут-сульфітному

агарі – коричневі або чорні колонії. При підозрінні на цитробактер-інфекцію ре-

комендують робити посіви на агар із цефсулодіном, іргазаном і новобіоцином, на

якому збудники утворюють колонії з червоним центром і прозорою безбарвною

периферією (“бичаче око”).

При посіві в середовища Гісса цитробактери ферментують глюкозу, лактозу,

маніт, мальтозу, рамнозу, сорбіт, арабінозу і ксилозу. Вони виділяють каталазу, не

196

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

продукують оксидазу, дають негативну реакцію Фогеса-Проскауера, ростуть на

агарі Сімонса.

Більш точною і надійною є серологічна ідентифікація. Спочатку виділену

культуру аглютинують полівалентною О-сироваткою. Тепер виготовляють 42 О-си-

роватки. Оскільки в нашій країні найчастіше зустрічаються серогрупи OA, OD,

OF раціонально в першу чергу проводять аглютинацію виділених культур саме з

сироватками СіOA, СіOD, СіOF. Остаточну ідентифікацію проводять за допомо-

гою Н-монорецепторних сироваток.

Ентеробактер-інфекції. До коліподібних рухливих бактерій роду Entero-

bacter входить 13 видів. Від хворих людей найчастіше виділяють Enterobacter

cloacae, E.aerogenes, значно рідше – E.gergovial, E.sakasaki. Ентеробактери рідко

викликають самостійні інфекції. Частіше вони інфікують пацієнтів, яких у стаці-

онарах лікують антибіотиками широкого спектру дії. Як правило, зараження відбу-

вається через руки медичного персоналу. Останнім часом ентеробактери є причи-

ною 15% всіх внутрішньолікарняних інфекцій, з них біля 10% септицемій. Трохи

рідше вони викликають менінгіти, контамінують хірургічні й опікові рани, ура-

жують органи дихальної і сечостатевої систем та шлунково-кишкового тракту.

Досить часто E.cloacae і E.aerogenes контамінують лікарські розчини для внутріш-

ньовенних ін'єкцій.

У зв'язку з відсутністю патогномонічних симптомів при клінічних проявах

захворювань вирішальне значення має лабораторна діагностика ентеробактер-

інфекцій.Вона включає виділення чистих культур збудників та їх біохімічну й се-

рологічну ідентифікацію.

Ентеробактери добре ростуть на простих та диференціально-діагностичних

середовищах Ендо, Левіна, Плоскирєва. Лактозопозитивні штами утворюють сли-

зуваті або неслизисті колонії. На агарі Ендо вони мають малиновий або рожевий

колір з металевим блиском або без нього. На середовищі Плоскирєва вони, як

правило, набувають жовтуватого відтінку. У мазках із колоній видно грамнега-

тивні палички, окремі штами мають капсулу.

Ідентифікацію виділених культур проводять поки що виключно за біохіміч-

ними властивостями. Перважна більшість штамів ферментують глюкозу, лактозу,

мальтозу, маніт, сахарозу, трегалозу, не виділяють індол і сірководень, розріджу-

ють желатин, дають позитивну реакцію Фогеса-Плоскауера. В ряді високорозви-

нутих країн почали використовувати реакції слайд-аглютинації з О- і Н-сироват-

ками.

Гафнія-інфекції. До роду Hafnia належить типовий і єдиний вид Hafnia alvei.

Це грамнегативні рухливі палички, які не утворюють спор і капсул, за своїми мор-

фологічними ознаками подібні до інших ентеробактерій. Їх знаходять у грунті,

воді, харчових продуктах, випорожненннях людей і тварин та деяких видів птахів.

У ослаблених хворих гафнії можуть викликати спорадичні опортуністичні інфекції

(септицемії, гастроентерити, ентероколіти, цистити, уретрити та ін.). Найчастіше

їх виділяють із крові, сечі, випорожнень, ранового вмісту, особливо на фоні інших

захворювань.

197

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Лабораторна діагностика основана на виділенні чистих культур та їх біохі-

мічній і серологічній ідентифікації. На середовищах Ендо і Плоскирєва вони рос-

туть у вигляді напівпрозорих мутнуватих безбарвних колоній або з відтінком

кольору середовища. За своїм видом і розміром нагадують колонії шигел. На се-

редовищі Олькеницького не утворюють газу й сірководню.

Виділені культури ідентифікують за біохімічними й антигенними властивостя-

ми. Гафнії виділяють каталазу і не продукують оксидазу. Вони постійно фермен-

тують арабінозу, гліцерин, ксилозу, мальтозу, маніт, рамнозу і трегалозу, дають

позитивну реакцію Фогеса-Проскауера. При наявності діагностичних сироваток

остаточну ідентифікацію проводять в слайд-аглютинації з О- і Н-антисироватками.

Сераціози. Рід Serratia є одним із найстаріших представників родини ентеро-

бактерій. Тепер виділено 10 видів серацій, але в рутинних баклабораторіях виді-

ляють лише три: Serratia marcescens, S.rubidaea, S.liquefaciens. Раніше їх вважали

сапрофітами і лише останнім часом почали виділяти при госпітальних бактеріемі-

ях, пневмоніях, ентеритах, інфекціях сечовивідних шляхів, нагноєннях хірургіч-

них ран і ураженнях шкіри. Серації часто передаються через руки медперсоналу.

Найбільш часто вони проникають в організм через постійні катетери, інтубаційні

пристрої а також з розчинами для різноманітних ін’єкцій. У наркоманів часто вини-

кають артрити, ендокардити, остеомієліти.

Досліджуваний матеріал у хворих беруть залежно від локалізації патологіч-

них процесів. Найчастіше це кров, гній, сеча, випорожнення, жовч, харкотиння. У

мазках серації виглядають як прямі грамнегативні палички, окремі штами мають

капсулу.

Мікробіологічна діагностика основана на виділенні чистих культур серацій і

визначення їх видової належності за допомогою культуральних властивостей і

біохімічних тестів.

Посіви проводять на кров'яний агар, диференціальні середовища Ендо, Плос-

кирєва і особливо МПА з ДНК-азою, толуїдиновим синім і цефалотином. На кро-

в’яному агарі S.marcescens і S.rubidaea утворюють прозорі сірувато-білі колонії,

гладенькі або дрібнозернисті. Через 24-48 год при кімнатній температурі вони

продукують червоний пігмент. На диференціальних середовищах колонії безбарвні,

гладенькі, злегка опуклі. На агарі з ДНК-азою і толуїдиновим синім серації утво-

рюють колонії з характерним синім обідком, в той час як колонії інших ентеро-

бактерій його не мають.

Ідентифікацію виділених культур проводять виключно за допомогою біохіміч-

них тестів. Серації постійно ферментують гліцерин, мальтозу, маніт, саліцин, са-

харозу і сорбіт. Такі спирти і вуглеводи, як адоніт, інозит, ксилозу і целобіозу

вони розкладають варіабельно, ростуть на цитратних середовищах і дають пози-

тивну реакцію Фогеса-Проскауера. На жаль, до останнього часу не налагоджено

промислове виготовлення діагностичних сироваток, відсутня антигенно-діагнос-

тична схема, що не дає змоги проводити серологічну ідентифікацію серацій.

Едвардсієльоз. Серед трьох видів бактерій, віднесених до роду Edwardsiella,

патогенність для людини має лише Е.tarda. Більша частина захворювань на ед-

198

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

вардсієльоз обумовлена контактом із прісною й солоною водою, а також із твари-

нами, що проживають в них або п’ють їх. Зокрема природним резервуаром Е.tardа

служать риби, рептилії молюски, морські їжаки, птахи, корови, свині, собаки тощо.

Едвардсієли викликають ураження сечовивідних шляхів, септицемію, менінгіт.

Знаходили їх і в інфікованих ранах, а також у хворих на гострий ентероколіт.

Єдиним надійним способом лабораторної діагностики едварсієльозу є виді-

лення чистої культури збудника і його ідентифікація. Матеріалом для досліджен-

ня є випорожнення, кров, блювотні маси, сеча, жовч, спинномозкова рідина, вода.

Їх висівають на середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва та вісмут-сульфітний агар.

Едвардсієли ростуть у вигляді безбарвних напівпрозорих колоній, подібних до

росту патогенних ентеробактерій. Колонії на вісмут-сульфітному агарі не мають

характерного металевого блиску, немає і почорніння агару під ними. При мікро-

скопічному дослідженні культур виявляють рухомі грамнегативні палички, які не

утворюють спор і капсул.

При проведенні біохімічної ідентифікації виділених культур необхідно мати

на увазі, що вони каталазо-позитивні, але оксидазо-негативні, ферментують до

кислоти і газу арабінозу, глюкозу, мальтозу, маніт, манозу і трегалозу. E.tarda виді-

ляє індол і Н

S, відновлює нітрати, не росте на цитратному агарі, не дає позитив-

ної реакції Фогеса-Проскауера, не гідролізує сечовину й не розріджує желатин.

Серологічну ідентифікацію едвардсієл використовують лише у великих ла-

бораторних центрах, але повна схема визначення сероварів ще відсутня, оскільки

не виготовлені сироватки проти всіх антигенних варіантів.

Провіденція-інфекції. До роду Providencia належать 5 видів бактерій. Дов-

гий час їх відносили до роду Proteus, оскільки патогенез уражень, клінічні прояви

і методи діагностики були дуже подібними. Типовий вид Providencia alcalifaciens.

Всі види провіденцій проявляють патогенність і можуть викликати діареї, інфекції

сечовивідних шляхів, септицемії, нагноєння ран і опіків.

Для проведення лабораторної діагностики захворювання до лабораторії на-

правляють кров, сечу, випорожнення, гній тощо. Посіви проводять на диференці-

ально-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва. Колонії, що вироста-

ють на них, безбарвні, майже повністю прозорі, дуже подібні до колоній сальмо-

нел і шигел. До 40 % штамів на простому агарі можуть давати феномен роїння у

вигляді дерев, протуберанців, але не концентричних тіл, як у Proteus vulgaris. Ре-

комендують використовувати середовище з колістином (100 мкг/мл) та інозитом

(1%), на якому провіденції утворюють великі жовті колонії. Останнім часом за-

пропоновано РА М -агар Сеніора, до складу якого входять галактоза, ксилоза і маніт.

Колонії провіденції на цьому середовищі мають червоний колір, в той час як у

всіх інших оксидазо-негативних бактерій вони лимонно-жовті. Для визначення

видів користуються також біохімічними тестами. Серологічну ідентифікацію

виділених культур та визначення титру антитіл методом парних сироваток не

проводять.

199

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Черевний тиф і паратифи

Черевний тиф і паратифи – гострі інфекційні захворювання, які супроводжу-

ються бактеріємією, тривалою постійною гарячкою, ураженням лімфатичних

утворів кишечника, вираженою інтоксикацією, мають фекально-оральний механізм

передачі. Збудниками черевного тифу є Salmonella typhi (див. вкл., рис. 13), пара-

тифу А – S. paratyphi A, паратифу В – S. schottmuelleri, паратифу С – S. paratyphi C.

Черевний тиф і паратиф А – типові антропонози, збудники паратифів В і С, окрім

людини, можуть ще викликати захворювання тварин і птахів. Всі названі бактерії

належать до роду Salmonella, родини Enterobacteriaceaе. Хворі або бактеріоносії

виділяють збудників з випорожненнями, сечею і слиною. За клінічною картиною

розрізнити черевний тиф і паратифи практично неможливо. Остаточний клінічний

діагноз можна встановити лише після виділення та ідентифікації збудника.

Взяття матеріалу для дослідження. Важливе значення для успішного про-

ведення лабораторної діагностики черевного тифу і паратифів має правильний і

своєчасний забір досліджуваного матеріалу залежно від фази патогенезу і строків

черевнотифозного захворювання. Мікробіологічні дослідження при паратифах

проводять так само, як і при черевному тифі. Досліджуваний матеріал для виді-

лення чистої культури збудника, по можливості, слід брати до початку антибіоти-

котерапії. Найчастіше беруть кров, кістковий мозок, дуоденальний вміст (жовч),

ексудат із розеол, випорожнення, сечу, гній, спинномозкову рідину, секційний ма-

теріал при летальних випадках.

Бактеріологічні методи дослідження. Для ранньої діагностики черевного

тифу і паратифів найефективнішим є виділення збудника з крові й кісткового моз-

ку, в меншій мірі з жовчі, сечі, випорожнень та інших досліджуваних матеріалів.

Висів паличок черевного тифу і паратифів із кров’яного русла чи кісткового моз-

ку має абсолютну, 100 % діагностичну цінність.

Метод гемокультури. Ретельно дотримуючись правил асептики, кров хво-

рого в кількості 10 мл беруть за допомогою шприца із ліктьової вени в ранні стро-

ки (починаючи з перших годин захворювання) й біля ліжка хворого сіють у фла-

кон із 100 мл жовчного бульйону або середовища Рапопорт (10 % жовчний буль-

йон із 2 % глюкози, 1 % індикатора Андраде; перед стерилізацією в середовище

поміщають скляний поплавок для вловлювання газу).

В разі неможливого посіву крові біля ліжка хворого, її доставляють до лабора-

торії в пробірці. Сироватку відділяють від згустка і використовують для серологіч-

ного дослідження. Згусток ретельно подрібнюють і засівають на ті ж самі середови-

ща у співвідношенні 1:10. Таке розведення необхідне для усунення бактерицидних

властивостей крові. У більш пізні періоди хвороби при наявності гарячки треба

брати 15-20 мл крові й сіяти на 150-200 мл живильного середовища. Жовчні сере-

довища є елективними для збудників черевного тифу і паратифів. У маленьких

дітей кров для посіву беруть із мочки вуха, п’ятки або пальця і в меншій кількості.

Засіяні флакони інкубують при 37 °С. На другий день вивчають характер рос-

ту. При відсутності росту флакони залишають у термостаті до 10 днів, а при

200

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

підозрінні на L-форми – до 3-4 тижнів. Наступні висіви на диференціальні сере-

довища роблять через 48 і 72 год, на 5 та 10 добу.

Сальмонели черевного тифу викликають почервоніння бульйону Рапопорт

внаслідок ферментації глюкози до кислоти, а збудники паратифів ще й газу, який

нагромаджується у поплавку. Культуру, що виросла у флаконі, висівають на три-

цукрове середовище Олькеницького та Ендо (Плоскирєва, Левіна, вісмут-сульфіт-

агар). Якщо культура чиста (при мікроскопії грамнегативні палички), далі працю-

ють лише з середовищем Олькеницького.

Посіви лише на Ендо (або інші елективні середовища) досліджують у тих

випадках, коли на агарі Олькеницького виростає не чиста культура, що трапляєть-

ся рідко. В такому разі типові ізольовані колонії пересівають на середовище Оль-

кеницького (або скошений МПА), отримують чисту культуру й ідентифікують її.

Колонії всіх трьох збудників на середовищах Ендо, Левіна і Плоскирєва безбарвні,

ніжні, прозорі, на вісмут-сульфітному агарі – чорного кольору.

Метод мієлокультури. У фазі паренхіматозної дифузії збудники черевного

тифу і паратифів можна виділити з кісткового мозку. Методика стернальної пункції

безпечна для хворого, вона розширила можливості бактеріологічної діагностики

цих захворювань. Місце пункції обробляють спиртом, знеболюють новокаїном.

Для забору матеріалу використовують голку Біра з рухливою муфтою, що дозво-

ляє регулювати глибину проникнення голки. Після проколу за допомогою шприца

відсмоктують 0,3-0,5 мл пунктату з грудної кістки і сіють у 5-10 мл жовчного буль-

йону або середовища Рапопорт. Виділення чистої мієлокультури проводять так

само, як і при посіві крові. Метод мієлокультури дає позитивні результати частіше

ніж метод гемокультури. Його особливо рекомендують застосовувати при легких

і стертих клінічних формах захворювань.

Метод білікультури. Для бактеріологічного дослідження жовчі проводять

дуоденальне зондування. Спочатку через тонкий зонд вводять у дванадцятипалу

кишку 30-40 мл 25 % розчину сірчанокислої магнезії. До лабораторії доставляють

пробірки з двома або трьома порціями жовчі (А і В, або А, В, С). Кожну з порцій

можна сіяти окремо або ж суміш усіх трьох разом у кількості 5-10 мл засівають у

флакони з 50-100 мл селенітового бульйону чи середовища Рапопорт. Кислий ду-

оденальний вміст, білуватий його відтінок та наявність пластівців роблять матері-

ал непридатним для бактеріологічного дослідження. Посіви інкубують при 37 °С

протягом 18-20 год, виділяють та ідентифікують чисті культури. Метод заслуго-

вує особливої рекомендації для виявлення бактеріоносіїв та встановлення форму-

вання стійкого бактеріоносійства у реконвалесцентів.

Метод розеолокультури використовують у випадках невиразного перебігу

хвороби, коли методи гемо- та білікультури не дали позитивних результатів, а на

шкірі хворого є типова висипка. Шкіру в місці локалізації розеоли протирають

спиртом, гострим скальпелем скарифікують розеолу до появи крапельок лімфи.

Стерильною піпеткою на них наносять кілька крапель жовчного бульйону, змішу-

ють і швидко втягують суміш у пастерівську піпетку. Посів роблять біля ліжка

хворого у 50 мл селенітового або жовчного бульйону. При необхідності доставля-

ти матеріал до лабораторії кінець піпетки запаюють на вогні.

201

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Метод уринокультури застосовують переважно для діагностики бактеріо-

носійства у реконвалесцентів. Найчастіше бактерії в сечі виявляють на 3-4 тижні

хвороби. Після ретельного туалету зовнішніх статевих органів сечу краще брати

за допомогою катетера в стерильний посуд. У лабораторії 30-50 мл сечі центрифу-

гують і осад сіють в середовище збагачення (селенітове, Мюллера, Кауфмана), а

також на 1-2 чашки з середовищем Ендо (Плоскирєва, вісмут-сульфіт-агар). Виді-

лення й ідентифікацію проводять так само, як і при дослідженні інших матеріалів.

Метод копрокультури для діагностики захворювання використовують рідко,

оскільки бактерії в фекаліях появляються пізно. Частіше його застосовують для

обстеження реконвалесцентів на бактеріоносійство та здорових осіб, які влашто-

вуються на роботу і працюють в системі громадського харчування, водопостачан-

ня та дитячих закладах. Матеріал у хворих і реконвалесцентів беруть без викори-

стання проносного. Здоровим особам за 3-4 год до забору матеріалу дають 30 г

магнезіальної солі. Пробу відбирають з рідкої частини фекалій. При патологічних

домішках у випорожненнях (слиз, гній, кров) їх включають до взятого матеріалу.

Проби фекалій в кількості 5-10 г набирають дерев’яним шпателем у спеціальні

стандартні стерильні пластмасові патрони одноразового використання або скляні

широкогорлі баночки. На них наклеюють етикетку, де вказують дату забору, прізви-

ще та ініціали хворого і мету дослідження. Краще всього посів зробити біля ліжка

хворого. При неможливості швидко доставити матеріал до лабораторії, його вно-

сять у консервант у співвідношенні 1:3. Найчастіше для цього використовують

рідину, що містить 30 % стерильний розчин гліцерину у фосфатному буфері.

У бактеріологічній лабораторії фекалії сіють одночасно двома способами –

прямим на елективне середовище (вісмут-сульфіт-агар, Плоскирєва, Ендо, Леві-

на) і на одне із середовищ збагачення (селенітове, Мюллера, Кауфмана). Вибір

середовищ проводить бактеріолог.

При прямому висіві на відповідне щільне середовище невелику кількість

випорожнень розміщують у пептонній воді або у 0,85 % розчині хлориду натрію і

залишають на 30 хв для осідання крупних частинок. Із поверхні рідини беруть

краплю матеріалу і засівають у чашки з елективним середовищем.

Посів на середовище збагачення (в ньому сальмонели розмножуються краще

і швидше, ніж супутня мікрофлора) одночасно з прямим посівом є обов’язковим

при дослідженні здорових людей на бактеріоносійство, оскільки вони виділяють

невелику кількість бактерій. Однак, у зв’язку з широким вживанням населенням

різноманітних антибіотиків, необхідно використовувати середовища збагачення і

при посівах випорожнень від хворих, особливо при епідемічних показаннях.

При посіві на середовища збагачення шматочок фекалій емульгують у 10 мл

цього ж середовища. Наступний висів із нього на щільне елективне середовище

доцільно робити вже через 5-6 год підрощування в термостаті.

Спинномозкову рідину досліджують при наявності менінгеальних і менінго-

енцефалітичних синдромів. Посіви гною, ексудату, харкотиння, грудного молока

породіль проводять у такому ж порядку, як вище описано. При дослідженні секцій-

ного матеріалу сіють кров із серця, шматочки паренхіматозних органів, вміст тон-

202

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

кого кишечника. В лабораторії матеріал розтирають у ступках із стерильним піском,

переводять у рідку фазу і досліджують так само, як і випорожнення.

Дослідження води на виявлення тифозних і паратифозних мікробів прово-

дять при розслідуванні водних спалахів захворювань та інших епідеміологічних

показаннях. Оскільки збудники у воді знаходяться у невеликій кількості, для їх

надійнішого виявлення застосовують методи, які дозволяють концентрувати бак-

терії з досліджуваного об’єму води. Найкраще це можна зробити за допомогою

мембранних фільтрів. Для цього 2-3 л води пропускають через фільтри № 2 (або

№ 3). Фільтри з адсорбованими на них бактеріями опускають у селенітовий бульйон

або накладають на вісмут-сульфітний агар. Через 8-10 год інкубування в термо-

статі роблять висів із селенітового бульйону на одне з диференціальних щільних

середовищ з метою отримання ізольованих колоній і наступного виділення чис-

тих культур. Із поверхні фільтрів на вісмут- сульфіт-агарі після 24-48 год вирощу-

вання в термостаті пересівають колонії чорного кольору на середовище Ольке-

ницького й ідентифікують виділені культури.

Якщо виявити збудників черевного тифу і паратифів не вдається, можна дослі-

джувати воду на наявність відповідних бактеріофагів. Для цього воду спочатку

фільтрують через фільтр і 1-2 мл фільтрату вносять у стерильну чашку Петрі, залива-

ють 15 мл розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА, ретельно переміщують. На

поверхню застиглого агару засівають секторами культури збудників черевного тифу

і паратифів. Поява негативних колоній свідчить про присутність відповідного фагу.

Ідентифікація чистих культур. Виділені культури ідентифікують за мор-

фологічними, культуральними, біохімічними властивостями, антигенною струк-

турою та фаголізабельністю. При мікроскопії мазків, забарвлених за Грамом, че-

ревнотифозні і паратифозні бактерії мають вигляд паличок червоного кольору із

заокругленими кінцями розміром 0,5-0,8 г 1-3 мкм, активно рухливі у висячій чи

надавленій краплі.

Ріст у МПБ супроводжується помутнінням. На МПА виростають ніжні, круглі,

гладенькі, прозорі або напівпрозорі колонії розміром 2-4 мм. Однак колонії ти-

фозних мікробів, що мають Vi-антиген, каламутні. У S. paratyphi B колонії грубіші,

через кілька днів по периферії колоній утворюється слизовий валик.

На середовищах Ендо, Левіна, Плоскирєва колонії безбарвні, прозорі, часом

рожевуваті (Ендо) або злегка голубуваті (Левіна). На вісмут-сульфітному агарі

черевнотифозні мікроби утворюють колонії чорного кольору, іноді зі світлим обід-

ком. Паратифозні бактерії на цьому середовищі можуть утворювати коричневі або

зеленуваті колонії. Після зняття колонії на середовищі залишається чорний слід.

На середовищі Олькеницького тифозна паличка розкладає глюкозу до кисло-

ти (жовтіє стовпчик агару), не ферментує лактозу і сахарозу (забарвлення скоше-

ної частини не змінюється), виділяє сірководень (почорніння на межі стовпчика і

скошеної частини). Паратифозні бактерії ферментують глюкозу до кислоти і газу

(пожовтіння та розриви стовпчика агару).

Біохімічні ознаки тифозно-паратифозних мікробів вивчають при посіві на

середовища “строкатого” ряду Гісса (табл. 37).

203

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Таблиця 37

Ферментативні властивості ешерихій і тифозно-паратифозних бактерій

Більш надійною є серологічна ідентифікація виділених культур в реакції аг-

лютинації з діагностичними сироватками. Спочатку реакцію ставлять на склі з

адсорбованими аглютинуючими сироватками, які містять антитіла до антигенів

09 (S. typhi), 02 (S. paratyphi A) і 04 (S. schottmuelleri). Якщо виділена культура за

біохімічними властивостями подібна до тифозної, але не аглютинується 09-сиро-

ваткою, її необхідно проаглютинувати з Vi-сироваткою.

Для постановки реакції аглютинації на предметне скло наносять краплю відпо-

відної сироватки і рядом краплю фізіологічного розчину. Бактеріологічною пет-

лею набирають культуру з середовища Олькеницького, емульгують її в краплі фізіо-

логічного розчину і з’єднують із краплею сироватки. При відповідності культури

і сироватки появляється аглютинація, за результатами якої визначають належність

досліджуваної культури до серогрупи. Серовар встановлюють в реакції аглюти-

нації з монорецепторними Н-сироватками.

В разі відсутності в лабораторії адсорбованих монорецепторних сироваток

ставлять розгорнуту реакцію аглютинацію в пробірках (р-ція Грубера) з видовими

тифозними і паратифозними сироватками. Діагностичну сироватку необхідно розво-

дити до титру, вказаного на етикетці ампули. Якщо реакція аглютинації випадає до

титру, або принаймні до половини титру, тоді культура відповідає виду сироватки.

Фаготипування виділених культур. Важливе епідеміологічне значення, особ-

ливо для встановлення джерела інфекції, має фаготипування тифо-паратифозних

мікробів. Збудники черевного тифу з Vi-антигеном лізуються Vi-бактеріофагами.

Їх нараховують 86 типів. Всі вони високоспецифічні. Є набори фагів і для типу-

вання паратифозних сальмонел.

Для фаготипування беруть молоді культури (4-6-годинні) досліджуваних

штамів, набори типових бактеріофагів у тест-розведеннях та стандартне свіжови-

готовлене й добре підсушене середовище. Культуру засівають суцільним газоном,

чашки обов’язково підсушують у термостаті. На поверхню газону пастерівською

піпеткою, штампом-реплікатором або каліброваною петлею наносять типові фаги.

Попередньо дно чашки розмічують на квадрати, в яких вписують номер типового

фагу. Після підсихання крапель чашки інкубують у термостаті 5-6 год і врахову-

ють результати. Фаготип встановлюють за наявністю лізису культури відповід-

ним фагом. Для визначення джерела інфекції проводять також коліцинотипуван-

ня сальмонел.

Останнім часом в добре оснащених мікробіологічних лабораторіях викорис-

товують більш чутливі й специфічні методи лабораторної діагностики черевного

Вид Лактоза Глюкоза Мальтоза Маніт Сахароза Індол H

Escherichia coli

Salmonella typhi

Salmonella paratyphi A

Salmonella schottmuelleri

кг

кг±

204

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

тифу і паратифів. Так, для виявлення О- і Vi-антигенів в крові, випорожненнях та

інших матеріалах застосовують РЗК, реакцію непрямої гемаглютинації з еритро-

цитарними антитільними (О- і Vi) діагностикумами. Перспективне також викори-

стання реакції коаглютинації, агрегат-аглютинації та ІФА. Для прискореної іден-

тифікації збудників черевного тифу і паратифів застосовують ДНК-зонд, що несе

на собі ген Vi -антигена. Результат отримують через 3-4 год.

Серологічне дослідження проводиться як для діагностики захворювання, так

і для встановлення бактеріоносійства. З діагностичною метою ставлять розгорну-

ту об’ємну реакцію Відаля і РНГА з О- і Vi еритроцитарними діагностикумами.

РНГА є більш надійна й специфічна. Останнім часом все ширше використовують

виявлення антитіл за допомогою методу ІФА. Діагностична цінність серологіч-

них реакцій значно підвищується при постановці їх методом парних сироваток.

Реакція Відаля. Аглютиніни до збудників черевного тифу і паратифів вияв-

ляють у сироватці крові, починаючи з 8-10 дня захворювання й пізніше. Динаміка

їх накопичення досить своєрідна: спочатку появляються антитіла до О-антигену,

але їх титр швидко зменшується після видужування. Н- і Vi-антитіла з’являються

пізніше, але роками зберігаються у високих титрах після хвороби, щеплень і у

бактеріоносіїв. У зв’язку з цим для правильної оцінки серологічної реакції важли-

во одночасно виявляти всі типи аглютинінів.

Для постановки реакції аглютинації Відаля необхідно три компоненти: 1) ан-

титіла (сироватка хворого); 2) антиген (бактерійний або еритроцитарний діагнос-

тикум); 3) 0,85 % розчин хлориду натрію (електроліт).

Для одержання сироватки у хворого з вени, пальця або мочки вуха в стериль-

ну пробірку беруть 2-3 мл крові, ставлять її в термостат на 30 хв для згортання.

Утворений згусток обводять пастерівською піпеткою, відділяючи його від стінок

пробірки, вміщують на 30-40 хв у холодильник, відсмоктують сироватку і роблять

її робоче розведення 1:50. Потім у шести паралельних рядах аглютинаційних про-

бірок роблять наступні розведення сироватки від 1:100 до 1:1600 за стандартною

схемою (табл. 38)

Таблиця 38

Схема постановки реакції Відаля

Номери пробірок

Компоненти

1 2 3 4 5 6 Кс 7 Кд

0,85 % розчин хлориду натрію,

мл

1 1 1 1 1 - 1

Сироватка хворого в розведенні

1:50, мл

→

↓

1 -

Одержане розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:100 -

Діагностикум, краплі 2 2 2 2 2 - 2

Інкубація в термостаті при

37 °С –2 год; 18 °С – 18 год

Облік реакції

Примітка: Кс – контроль сироватки, Кд – контроль діагностикумуму.

205

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

В якості антигенів для реакції аглютинації використовують черевнотифозні

монодіагностикуми 09 і Hd, а також паратифозні О- і Н-діагностикуми. Вони є 3-х

млрд зависі вказаних бактерій, вбитих нагріваннями або формаліном. О-діагнос-

тикуми готують кип’ятінням культур або обробляють їх спиртом, Н-діагностику-

ми – обробкою культур формаліном. В кожну пробірку ряду, окрім шостої, (конт-

роль сироватки – КС) добавляють по 2 краплі діагностикуму. Сьома пробірка є

контролем діагностикуму (КД). Штативи з пробірками енергійно струшують і став-

лять на 2 год у термостат, після чого роблять попередній облік результатів реакції.

Остаточний облік проводять через 18-20 год знаходження пробірок при кімнатній

температурі. При позитивній реакції аглютинації утворюється білуватий осад на

дні пробірки із більш-менш прозорою рідиною над ним. При негативній реакції

рідина залишається каламутною, осад на дні пробірки відсутній. Аглютинацію

вважають специфічною, коли в контрольних пробірках (КС і КД) аглютинат не

утворюється. Під час обліку результатів звертають увагу на характер аглютинатів:

О-аглютинація буде дрібнозернистою, а Н-аглютинація – крупнопластівцевою.

При типовій клінічній картині черевного тифу діагностичним титром реакції

Відаля у хворих, що не прищеплювалися, вважають розведення 1:100 і вище, при

атипових чи стертих формах захворювання – не нижче 1:200. Останнім часом ре-

акцію Відаля не вважають дуже специфічною. Вона може бути позитивною і при

інших захворюваннях, що супроводжуються гарячкою, після щеплення або рані-

ше перенесеної хвороби тощо. І все ж висока специфічність реакції може бути

виявлена при її постановці в динаміці методом парних сироваток. Ні анамнес-

тичні, ні прищепні чи групові антитіла не покажуть наростання титру з другою

сироваткою, взятою через 10-12 днів. Всі ці особливості в якійсь мірі обмежили

постановку цієї реакції з діагностичною метою. Особливо це проявляється при

раньому лікуванні хворих антибіотиками. Останні значною мірою інактивують

антигени (збудники), титр антитіл у таких пацієнтів низький і не може вважатись

діагностичним.

Реакція Vi-гемаглютинації. При серологічній діагностиці черевного тифу і

паратифів останнім часом ширше використовують РНГА, особливо для виявлен-

ня Vi -антитіл. Вона ставиться спочатку з комплексним еритроцитарним діагнос-

тикумом АВСДЕ, потім з черевнотифозним еритроцитарним 09- і Hd діагности-

кумом, і, насамкінець, з Vi -еритроцитарним діагностикумом.

Vi-антитіла при черевному тифі не мають значного діагностичного чи про-

гностичного значення. Виявлення цих антитіл має важливе значення для виявлен-

ня осіб, підозрілих на бактеріоносійство.

Реакцію ставлять у пластмасових планшетах з лунками. Кров у хворих чи

бактеріоносіїв беруть так само, як і для реакції Відаля. Сироватку розводять у

лунках від 1:10 до 1:160 в об’ємі 0,5 мл. У кожну лунку потім вносять по 0,25 мл

еритроцитарного діагностикуму. Планшети ставлять у термостат на 2 год, потім

залишають при кімнатній температурі ще на 18-20 год. Результати враховують за

чотириплюсовою системою: ++++ – еритроцити повністю аглютинувались, на дні

лунки пухкий осад у вигляді перекинутої “парасольки”; +++ – “парасолька” менша,

206

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

не всі еритроцити аглютинувались; ++ – аглютинат маленький, є осад неглютино-

ваних еритроцитів; (-) – негативна реакція, на дні лунки щільний осад еритро-

цитів у вигляді “монетного стовпчика”.

Діагностичне значення має реакція в титрі 1:40 і вище. Але для постановки

остаточного діагнозу “бактеріоносійство” потрібно обов’язково виділити чисту

культуру збудника за методом копро- білі- чи уринокультури.

Постановка алергічної проби. Як допоміжний метод діагностики черевного

тифу використовують шкірну алергічну пробу з Vi -тифіном, що містить Vi -алер-

ген, який при взаємодії з Vi-антитілами викликає місцеву алергічну реакцію шкіри

у вигляді почервоніння і набряку через 20-30 хв. Проба з Vi - тифіном стає позитив-

ною в період реконвалесценції й може бути використана для ретроспективної

діагностики.

Сальмонельози (харчові токсикоінфекції)

Гастроентерити сальмонельозної етіології – гострі антропо-зоонозні інфекції,

які викликають численні бактерії з роду Salmonella; характеризуються переваж-

ним ураженням кишкового тракту й інтоксикацією. Всього відомо понад 2200 се-

роварів сальмонел, із них більше 400 є патогенними для людини. Переважна їх

більшість патогенні як для людей, так і для різних видів тварин та птахів. Винят-

ком є сальмонели черевного тифу, паратифу А, які патогенні лише для людини і

викликають зовсім інші клінічні форми захворювань.

Основними збудниками сальмонельозів є S. typhimurium, S. enteritidis, S.

choleraesuis, S. heidelberg, S. anatum, S. haifa, S. derby та ін. Сальмонели мають О-,

Н- і К-антигени. За О-антигеном вони поділяються на 50 серологічних груп, які

позначаються великими літерами латинського алфавіту (A-Z) і цифрами (51-65).

Головним методом лабораторної діагностики сальмонельозів, виявлення бак-

теріоносіїв і контамінації харчових продуктів та інших об’єктів оточуючого сере-

довища є бактеріологічне дослідження.

Взяття досліджуваного матеріалу. Від хворих на сальмонельоз забира-

ють блювотні маси, промивні води шлунка, випорожнення, кров (у перші години

захворювання при підозрі на бактеріємію), кістковий мозок, жовч, сечу, спинно-

мозкову рідину. Для виявлення бактеріоносіїв серед працівників підприємств гро-

мадського харчування, водопостачання та дитячих закладів досліджують фекалії

після прийому проносного. При розтині трупів беруть вміст шлунка і кишок, кров

із серця, шматочки паренхіматозних органів, лімфатичні вузли брижі.

При діагностиці харчових токсикоінфекцій обов’язково беруть також залиш-

ки підозрілої їжі, продукти, з яких її готували, змиви з поверхні столів, кухонних

дощок, рук обслуговуючого персоналу тощо. Досліджуваний матеріал забирають

в стерильний посуд у таких кількостях: випорожнення, блювотні маси – 50 мл;

промивні води – 100 мл; м’ясо і м’ясні продукти – 0,5 кг; креми, масло, морозиво,

молоко, сметану та інші рідкі й напіврідкі продукти – 100-150 г; тушки птахів

направляють цілком.

207

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

До лабораторії матеріали доставляють в упакованому та опечатаному виг-

ляді. При неможливості швидкої доставки їх зберігають при 4-6

С не більше доби.

Перед посівом наважку щільних (густих) матеріалів гомогенізують у сте-

рильній ступці з пептонною водою або 0,85 % розчином хлориду натрію у

співвідношенні 1:5. Блювотні маси та кислі харчові продукти нейтралізують 10%

розчином бікарбонату натрію. Випорожнення розмішують у стерильному фізіоло-

гічному розчині 1:10. Поверхню м’яса, шинки, ковбаси, сиру стерилізують, прикла-

даючи розжарений металевий шпатель, вирізають пробу з глибини, роблять мазки-

відбитки для первинної мікроскопії, потім вносять її у фарфорову ступку, розти-

рають із стерильним піском і добавляють ізотонічний розчин хлориду натрію.

Бактеріологічне дослідження. Посів крові для виділення гемокультури про-

водять так само, як і при черевному тифі у флакон із жовчним бульйоном чи сере-

довищем Рапопорт. Випорожнення, сечу, промивні води, блювотні маси, гній, сек-

ційний матеріал, харчові продукти й змиви обов’язково сіють в середовище нако-

пичення (селенітовий, магнієвий чи жовчний бульйон), а також паралельно на

середовище Плоскирєва або вісмут-сульфітний агар. Крем, масло, морозиво сіють

після їх розтоплення при 43-45 °С (краще з додаванням Твіну-80). Посіви вирощу-

ють при 37 °С. Через 6-8 год із середовища накопичення роблять пересів на агар

Плоскирєва. Наступного дня досліджують ізольовані лактозонегативні колонії

(безбарвні на середовищі Плоскирєва і чорні або зеленкуваті на вісмут-сульфітному

агарі), мікроскопують їх і пересівають на трицукровий агар Олькеницького для

накопичення чистої культури. На третій день виділені культури ідентифікують.

Для вивчення біохімічних властивостей їх сіють у середовища Гісса або дос-

ліджують у стандартних ентеротестах. Більшість сальмонел розкладають глюко-

зу, мальтозу, маніт до кислоти і газу, не ферментують адоніт, лактозу, сахарозу,

саліцин, не продукують індол, виділяють сірководень, не розкладають сечовину,

не розріджують желатин, дають негативну реакцію Фогеса-Проскауера.

Для надійнішої ідентифікації сальмонел використовують реакцію аглютинації

на склі з адсорбованими груповими сироватками А, В, С, Д і Е. Саме серед цих

п’яти серогруп зустрічаються сальмонели, які найчастіше викликають захворю-

вання. При отриманні позитивного результату хоча б із однією груповою сироват-

кою, наступну реакцію аглютинації проводять з адсорбованими О-сироватками,

характерними для даної серогрупи, а потім і з монорецепторними Н-сироватками

(першої, а при необхідності й другої фази). При цьому необхідно користуватись

схемою класифікації сальмонел за Кауффманом і Уайтом (табл. 39).

На основі реакції аглютинації з адсорбованими і монорецепторними сиро-

ватками роблять остаточний висновок про вид і серовар збудника. Можна також

використати реакцію флуоресценції з міченими флуорохромами антитілами і ме-

тод ІФА. Культури, які не аглютинуються сальмонельозними сироватками, іден-

тифікують за морфологічними, культуральними, біохімічними властивостями, а

також за допомогою О-1 бактеріофага, який лізує переважну кількість сальмонел.

Збудники сальмонельозів найчастіше виділяють із фекалій хворих, рідше з

блювотних мас і промивних вод, ще рідше з крові, жовчі та сечі. Ці результати

208

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

мають неоднакову діагностичну значущість. Виділення збудників із крові, кістко-

вого мозку, спинномозкової рідини, блювотних мас і промивних вод є беззапереч-

ним підтвердженням діагнозу. Знаходження сальмонел у випорожненнях, сечі,

жовчі може бути обумовлене бактеріоносійством. Важливим доказом етіологіч-

ного значення сальмонел у виникненні гастроентеритів є наростання титру ан-

титіл у реакції аглютинації з автоштамом.

Таблиця 39

Серологічна класифікація сальмонел (фрагмент)

Н-антиген

Група Вид О-антиген

1 фаза 2 фаза

А S. paratyphi A 1, 2, 12 a -

В S. schottmuelleri

S. aboni

S. typhimurium

S. derby

S. haifa

S. heidelberg

1, 4, 5, 12,

1, 4, 5, 12

f, g

1, 2

e, n, x

1, 2

1,2

1, 2

С S. hirschfeldii

S. choleraesuis

S. thomson

S. newport

S. bonn

6, 7, Vi

6, 7

6, 8

6, 7

e, h

e,v

1, 5

1, 2

e, n, x

Д S. typhi

S. enteritidis

S. dublin

S. rostoc

S. moscow

S. gallinarum

9, 12, Vi

1, 9, 12

g, m

g, p

g, p, u

g, q

1, 7

Е S. london

S. anatum

S. amsterdam

S. zanzibar

3, 10

l, v

e, h

g, m, s

1, 6

1, 5

Постановка біопроби. На відміну від паратифозних мікробів А і С сальмо-

нели, що викликають гастроентерити, патогенні для білих мишей. Цю особливість

можна використати для диференціації вказаних бактерій. Білих мишей на початку

аналізу перорально заражують досліджуваним матеріалом, а після виділення куль-

тури – суспензією бактерій. Через 1-2 доби після зараження тварини гинуть від

септицемії. Із крові чи паренхіматозних органів загиблих мишей виділяють куль-

туру сальмонел. Постановка біологічної проби має допоміжне значенння.

Серологічна діагностика. У тих випадках, коли при наявності клінічних симп-

томів, характерних для сальмонельозної токсикоінфекції, мікробіологічне дослі-

дження не проводилось, або збудник не виділено, ставлять реакцію аглютинації з

сироваткою крові перехворілих. Серологічні дослідження проводять також з ме-

209

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

тою ретроспективного аналізу масових захворювань на підприємствах громадсь-

кого харчування і в організованих колективах.

Сироватку крові беруть у перші дні, а потім через 8-10 днів від початку хво-

роби. Реакцію аглютинації ставлять одночасно з обома сироватками, щоб виявити

наростання титру антитіл в динаміці. Діагностичне значення має підвищення тит-

ру аглютинінів у 4 рази і більше.

Перевагу віддають постановці РНГА з полівалентними еритроцитарними діаг-

ностикумами, що містять антигени серогруп А, В, С, Д, Е. Методика постановки

РНГА така ж сама, як і при черевному тифі. Можливе визначення титру аглю-

тинінів і методом ензиммічених антитіл.

Дизентерія (шигельоз)

Дизентерія – гостра або хронічна інфекційна хвороба, що характеризується

проносом, ураженням слизової оболонки товстої кишки та інтоксикацією організму.

Це одне з найчастіших кишечних захворювань у світі. Його викликають різні види

бактерій роду Shigella: S.dysenteriaе, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei (див. вкл., рис. 14).

У повоєнні роки в промислово розвинених країнах дизентерію найчастіше викли-

кають S.flexneri й S.sonnei.

В Україні користуються міжнародною класифікацією цих бактерій, яка вра-

ховує їх біохімічні властивості та особливості антигенної структури. Всього нара-

ховують 44 серовари шигел (табл. 40).

Таблиця 40

Класифікація бактерій роду Shigella

Підгрупа, вид Серовари Підсеровари

A – S. dysenteriae

B – S. flexneri

C – S. boydii

D – S. sonnei

1-12

1-18

1a, 1b

2a, 2b

3a,3b, 3c

4a, 4b

5a, 5b

Основним методом мікробіологічної діагностики дизентерії є бактеріологіч-

ний. Схема виділення збудника класична: посів матеріалу на середовище збага-

чення та агар Плоскирєва, одержання чистої культури, вивчення її біохімічних

властивостей та ідентифікація за допомогою полівалентних і моновалентних аг-

лютинуючих сироваток.

Взяття матеріалу для дослідження. Позитивний результат мікробіологіч-

ного аналізу значною мірою залежить від своєчасного і правильного забору дослі-

210

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

джуваного матеріалу. У хворих і бактеріоносіїв найчастіше беруть випорожнення,

значно рідше – блювотні маси і промивні води шлунка та кишок. Фекалії (1-2 г)

беруть скляною паличкою із судна або пелюшок, включаючи шматочки слизу і

гною (але не крові). Краще всього для дослідження взяти слиз (гній) із місць ура-

ження слизової оболонки під час колоноскопії. При заборі та посіві матеріалу важ-

ливо суворо дотримуватись певних правил.

Бактеріологічне дослідження по можливості потрібно починати до початку

етіотропного лікування. Посуд до взяття фекалій (судна, горшки, банки) ошпарю-

ють окропом і ні в якому разі не обробляють дезинфікуючими розчинами, до яких

шигели дуже чутливі. Досліджуваний матеріал потрібно швидко (біля ліжка хво-

рого) посіяти в середовище збагачення і паралельно на селективний агар в чашці

Петрі. Брати випорожнення можна, не чекаючи дефекації, за допомогою ватного

тампона або ректальних трубок Цимана.

Взятий матеріал або засіяні середовища треба негайно доставити до лабора-

торії. При неможливості посіву в лікарні і швидкої доставки випорожнення збері-

гають у консерванті (30 % гліцерину + 70 % фосфатного буферу) при 4-6 °С не

більше доби.

Збудники дизентерії дуже рідко проникають в кров і сечу, у зв’язку з чим ці

об’єкти звичайно не сіють. Бактеріологічний аналіз секційного матеріалу необхі-

дно проводити якомога скоріше після смерті (товстий кишечник, мезентеріальні

лімфатичні вузли, шматочки паренхіматозних органів). При спалахах дизентерії

досліджують також харчові продукти, особливо молоко, сир, сметану.

Бактеріологічне дослідження. Посіви випорожнень проводять паралельно

на селективне середовище Плоскирєва для отримання ізольованих колоній і обо-

в’язково в селенітовий бульйон з метою накопичення шигел, якщо їх мало в дослі-

джуваному матеріалі. Бактеріологічною петлею вибирають слизово-гнійні шма-

точки, ретельно прополіскують їх у 2-3-х пробірках з ізотонічним розчином хло-

риду натрію, наносять на середовище Плоскирєва і скляним шпателем втирають

в агар на невеликій ділянці. Потім відривають шпатель від середовища і втирають

ним залишковий матеріал досуха в решту незасіяної поверхні. При посіві в 2-3

чашки на кожну з них наносять нову порцію посівного матеріалу. В селенітовий

бульйон грудочки слизу і гною сіють без прополіскування.

При відсутності слизово-гнійних шматочків фекалії емульгують у 5-10 мл

0,85 % розчину хлориду натрію і 1-2 краплі надосаду засівають на середовище

Плоскирєва. У селенітовий бульйон сіють неемульговані випорожнення у

співвідношенні 1:5. При посіві блювотних мас і промивних вод використовують

селенітовий бульйон подвійної концентрації і забезпечують співвідношення по-

сівного матеріалу до середовища 1:1. Засіяні біля ліжка хворого живильні середо-

вища безпосередньо вміщують у термостат. Всі посіви вирощують при 37 °С про-

тягом 18-20 год.

На другий день неозброєним оком або за допомогою лупи 5×-10× досліджу-

ють характер росту на середовищі Плоскирєва, де шигели утворюють дрібні, про-

зорі, безбарвні колонії. Шигели Зонне можуть давати колонії двох видів: одні плес-

211

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

куваті із зазубреними краями, інші – круглі, опуклі, з вологим блиском. 3-4 колонії

мікроскопують, досліджують на рухливість і пересівають на середовище Ольке-

ницького для виділення чистої культури. Якщо на агарі Плоскирєва росту немає,

або відсутні характерні колонії шигел, роблять висів із селенітового бульйону на

агар Плоскирєва або Ендо. При достатній кількості типових колоній ставлять орі-

єнтовну реакцію аглютинації на склі з сумішшю сироваток Флекснера і Зонне.

На третій день враховують характер росту на середовищі Олькеницького.

Шигели викликають характерні зміни трицукрового агару (жовтіє стовпчик, колір

скошеної частинки не змінюється, почорніння відсутнє). Підозрілу культуру сіють

в середовища Гісса для визначення біохімічних властивостей (табл. 41), або вико-

ристовують ентеротести.

Таблиця 41

Біохімічні властивості шигел

Ферментація вуглеводів

Вид

лактоза глюкоза мальтоза маніт

ульцит сахароза

Індол Каталаза

S. dysenteriaе

S. flexneri

S. boydii

S. sonnei

повільно

Примітка: “+” – ферментація вуглеводів, утворення індолу, каталази; “–” – відсутність ознак

Серологічна ідентифікація виділених культур проводиться за допомогою ре-

акції аглютинації на склі спочатку з сумішшю сироваток проти видів Флекснера і

Зонне, які найчастіше зустрічаються, а потім із моновидовими та монорецептор-

ними сироватками. Останнім часом випускають комерційні як полівалентні, так і

моновалентні сироватки проти всіх видів збудників дизентерії.

Для визначення виду шигел використовують також реакцію коаглютинації.

Вид збудника встановлюють за допомогою позитивної реакції з білком А золоти-

стого стафілокока, на якому адсорбовані специфічні антитіла проти шигел. На

типову колонію наносять краплю сенсибілізованого антитілами протеїну А, похи-

тують чашку й через 15 хв під мікроскопом спостерігають появу аглютинату. Ре-

акцію коаглютинації можна ставити вже на другий день дослідження, якщо на

середовищі є достатня кількість лактозонегативних колоній.

З метою швидкої і надійної ідентифікації шигел ставлять також пряму й не-

пряму реакції імунофлуоресценції та ензиммічених антитіл. Остання при дизен-

терії є високоспецифічною і все частіше використовується при лабораторній діаг-

ностиці захворювання.

Для виявлення антигенів у крові хворих, у тому числі в складі циркулюючих

імунних комплексів, можна використати реакцію агрегат-гемаглютинації та ме-

тод ІФА (діагностична тест-система “Шигелапласт”). Антигени шигел у випорож-

неннях і сечі виявляють за допомогою РНГА, РЗК і коаглютинації. Ці методи ви-

сокоефективні, специфічні й придатні для ранньої діагностики.

212

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Щоб встановити належність виділених культур до роду шигел ставлять та-

кож кератокон’юнктивальну пробу на гвінейських свинках. У кон’юнктивальний

мішок вносять петлю агарової культури або краплю бульйонної. Важливо не трав-

мувати при цьому рогівку. Свіжовиділені шигели викликають виражений кератит

на 2-5 добу після введення культури. Сальмонели також можуть викликати кон’юнк-

тивіт, але вони не уражають рогівку. Однак, слід пам’ятати, що ентероінвазивні

кишкові палички (ЕІКП) особливо серовари 028, 029, 0124, 0143 та ін. також вик-

ликають експериментальний кератокон’юнктивіт у гвінейських свинок.

Бактеріологічний метод діагностики дизентерії є найдостовірнішим, але в

різних лабораторіях (залежно від кваліфікації бактеріологів і лаборантів) він дає

лише 50-70 % позитивних результатів. Окрім діагностики захворювань, бакте-

ріологічне дослідження проводять також для виявлення бактеріоносіїв, особливо

серед працівників продовольчих підприємств, дитячих установ і лікарняних за-

кладів. З метою встановлення джерел інфекції визначають фаговари й коліцино-

вари шигел.

Серологічну діагностику дизентерії проводять рідко. Інфекційний процес

не супроводжується значним антигенним подразненням, тому титри антитіл у си-

роватці хворих і реконвалесцентів невисокі. Їх виявляють на 5-8 добу захворю-

вання. Найбільше антитіл утворюється на 2-3-му тижні.

Об’ємну реакцію аглютинації з мікробними діагностикумами ставлять так

само, як і реакцію Відаля при черевному тифі і паратифах. Сироватку крові розво-

дять від 1:50 до 1:800. Діагностичним титром антитіл до S.flexneri у дорослих

хворих вважають 1:200, до S.dysenteriaе і S.sonnei – 1:100 (у дітей відповідно –

1:100 і 1:50).

Більш достовірні результати отримують при постановці РНГА особливо при

використанні методу парних сироваток. Діагностичне значення має збільшення

титру в 4 і більше разів. Еритроцитарні діагностикуми виготовляють, в основно-

му, з антигенів S.flexneri та S.sonnei.

Допоміжне значення для діагностики має також постановка алергічної внут-

рішньошкірної проби з дизентерином Цуверкалова (розчин білкових фракцій шигел

Флекснера і Зонне). Вона стає позитивною у хворих на дизентерію, починаючи з

4-го дня. Облік реакції проводять через 24 год. При появі гіперемії і набряку шкіри

діаметром 35 мм і більше реакція оцінюється як сильно позитивна, при 20-34 мм –

помірна і при 10-15 мм – сумнівна.

Клебсієльози

Клебсієльози – захворювання, які викликають бактерії роду Klebsiella. Вони

можуть бути гострими і хронічними; гострі викликають Klebsiella pneumoniae,

K.oxytoca, K.planticola, K.terrigena, хронічні – K.ozaenae i K.rhinoscleromatis. Най-

частіше запальні і септичні процеси викликає K.рneumoniae – пневмонії, бронхі-

ти, септицемії, отити, перитоніти, інфекції жовчних і сечовивідних шляхів, хар-

чові токсикоінфекції, госпітальні ранові та опікові інфекції тощо. Значно рідше

213

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

зустрічаються такі хронічні хвороби, як смердючий нежить (озена) і риносклеро-

ма. Останнім часом резистентні до антибіотиків штами клебсієл можуть стати

збудниками внутрішньолікарняних інфекцій.

Основним методом лабораторної діагностики клебсієльозів є бактеріологіч-

не дослідження. Серологічний метод застосовують рідко. Проводять також мікро-

скопію мазків.

Матеріалом для мікробіологічного аналізу може бути харкотиння, слиз із рото-

і носоглотки, промивні води і блювотні маси, гній, кров, ліквор, сеча, жовч, випо-

рожнення, секційний матеріал, інфільтрати слизової при риносклеромі, кірочки

при озені, змиви з предметів тощо.

Бактеріоскопія. У мазках, забарвлених за Грамом, капсульні форми клебсієл

мають вигляд грамнегативних, еліпсоподібних, товстих паличок довжиною 5-8 мкм

і шириною 3-5 мкм (рис. 65). Безкапсульні форми мають менші розміри (0,3-0,6 ×

1-3 мкм), поодиноке, парне або ланцюжкове розташування. У гістологічних зрізах

із склеромних гранулем видно багато гігантських клітин Мікуліча, наповнених

желатиноподібною масою, в якій знаходяться клебсієли, оточені капсулою.

Бактеріологічне дослідження проводять за такою ж схемою, що й при по-

дібних захворюваннях, викликаних іншими видами ентеробактерій. Посів матері-

алу роблять на селективне середовище К-2 (МПА з сечовиною, рафінозою, бром-

тімоловим синім). Через добу на ньому виростають крупні, опуклі, блискучі, сли-

зуваті колонії жовтого, зеленувато-жовтого або голубого кольору. На середовищах

Ендо і Плоскирєва більшість клебсієл утворюють колонії з металевим блиском,

характерні для лактозопозитивних бактерій.

На простому або гліцериновому агарі через 2-4 год вирощування основні види

клебсієл утворюють характерні колонії з різною внутрішньою структурою, що

виявляють при агар-мікроскопії таких молодих колоній. У К. pneumoniаe вони

мають петлеподібну будову, у K. rhinoskleromatis – концентричну, а у K. ozenae –

розсіяно концентричну. Це дає змогу диференціювати названі види клебсієл між

собою.

Зрілі колонії мікроскопують і відсівають на косий агар для виділення чистих

культур. Ідентифікацію останніх проводять по-

сівом в середовища строкатого ряду Гісса, жовч-

ний бульйон, визначають рухливість, наявність

уреази. Клебсієли нерухомі, більшість штамів роз-

кладають глюкозу, лактозу, сахарозу, сечовину, да-

ють позитивну реакцію Фогеса – Проскауера, не

виділяють сірководень (табл. 42).

І все ж основною й надійнішою є серологічна

ідентифікація клебсієл. Для її проведення викори-

стовують дві реакції: капсульну аглютинацію на

склі з живою культурою і О-аглютинацію. При

постановці першої з них на предметне скло нано-

сять діагностичні протиклебсієльозні капсульні

Рис. 65. Клебсієли:

мазок із чистої культури.

214

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

сироватки, а також краплю 0,9 % розчину хлориду натрію (контроль). Біля кра-

пель сироваток та ізотонічного розчину розтирають повну петлю досліджуваної

культури, змішують їх, добиваючись ретельної гомогенізації. При позитивному

результаті утворюється аглютинат у вигляді грубих ниток або тяжів. У контрольній

краплі аглютинації не повинно бути.

Для О-аглютинації виділені культури стерилізують в автоклаві протягом 150 хв

при 2-ох атм. При цьому руйнується капсула, культура не взаємодіє з К-сироватка-

ми і аглютинується О-сироватками. Простерилізовану культуру потрібно двічі

відмити у фізіологічному розчині шляхом центрифугування і з осадом поставити

реакцію аглютинації на склі.

Із додаткових методів ідентифікації клебсієл використовують фаготипуван-

ня. Фаги капсульних бактерій мають чітку видову специфічність. Техніка прове-

дення реакції аглютинації та фаготипування детально викладена в інструкціях до

відповідних препаратів.

Визначають також чутливість виділених культур до антибіотиків за допомо-

гою дискодифузійного методу.

Серологічні дослідження проводять шляхом постановки розгорнутої реакції

аглютинації з сироваткою крові хворих і капсульним та безкапсульним антигена-

ми, а також зв’язування комплементу (титр 1:40 і вище) та більш чутливої і спе-

цифічної реакції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним клебсієльозним діаг-

ностикумом. Для постановки останньої сироватку хворих розводять у лунках полі-

стиролових планшет від 1:20 до 1:320 в об’ємі 0,25 мл і добавляють такий же

об’єм 1% зависі сенсибілізованих еритроцитів. Облік результатів проводять через

2 год експозиції планшет при 37 °С. Діагностичний титр 1:160 і вище. Надійніше

результати отримують при постановці реакції в динаміці, коли виявляють 4-крат-

не наростання титру антитіл.

Холера

Холера – гостра, карантинна, особливо небезпечна інфекційна хвороба з

фекально – оральним механізмом передачі, характеризується рясним поносом,

Ферментація

Вид

Глю-

коза

Лак-

тоза

Саха-

роза

Сечо-

вина

Індол

Реакція

Фогеса-

Проскауера

Утилі-

зація

цитрату

K.pneumoniae + + + + - + +

K.oxytoca + + + + + + +

K.planticola

+ + + +

+ +

K.terrigena

+ + + -

- +

K.ozaenae

+ -

- -

K.rhinoskleromatis

- - -

Таблиця 42

Диференціальні ознаки клебсієл

215

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

блюванням, сильною інтоксикацією та зневодненням організму. Збудниками за-

хворювання є два біовари холерного вібріона Vibrio cholerae і Vibrio eltor. Обидва

відносяться до роду Vibrio родини Vibrionaceae. Окрім цих збудників, до роду Vibrio

відносяться також умовно – патогенні вібріони: V.metschnikovii, V.parahaemolyticus,

V.alginolyticus, V.vulnificus, V.fluvialis. За певних умов вони можуть викликати у

людини гастроентерити.

Узяття і доставка матеріалів. Для мікробіологічного дослідження сте-

рильною ложкою беруть випорожнення, блювотні маси, промивні води хворого в

об’ємі 10-20 мл, переносять їх роздільно у стерильні скляні банки, закривають

скляними чи гумовими пробками і заливають парафіном. Найкращі результати

дає дослідження проб, взятих до початку антимікробної терапії.

Другу порцію випорожнень і блювотних мас в об’ємі 1-2 мл засівають біля

ліжка хворого у 10-50 мл транспортного середовища (1 % пептонна вода рН 7,8 чи

рН 9,3). Якщо випорожнень в момент забору матеріалу немає, вирізають забруд-

нені фекаліями ділянки білизни. Досліджують також жовч, узяту за допомогою

дуоденального зондування.

Під час епідемічного спалаху холери широко практикують ректальний забір.

Для цього стерильний ватний тампон або алюмінієву петлю вводять у пряму киш-

ку на глибину 5-19 см, забирають вміст і вносять у флакон або пробірку з 1%

лужною пептонною водою.

Від трупа беруть невеликі ділянки тонкої кишки з верхнього і нижнього від-

ділу, які перев’язують з обох кінців лігатурами. Забирають також відрізок прямої

кишки довжиною 10-15 см. Жовчний міхур вирізають з частиною паренхіми печінки.

При бактеріологічному обстеженні людей, що були в контакті з хворими або

вібріоносіями, а також реконвалесцентів перед виписуванням із стаціонару доціль-

но заздалегідь дати їм проносне, яке одночасно діяло б і як жовчогінне (напр. 25-

30 г сульфату магнію). Для дослідження відбирають рідку частину випорожнень,

що надійшли з верхнього відділу тонкої кишки і мають вміст жовчного міхура.

За епідеміологічними показниками досліджують воду відкритих водоймищ,

водопровідну воду, стічні води, мул, гідробіонтів (риб, жаб, устриць, молюсків,

рачків тощо), харчові продукти. Змиви з об’єктів навколишнього середовища відби-

рають з площі 0,25 м

ватними тампонами, змоченими 1% лужною пептонною

водою, і в ній транспортують до лабораторії.

На кожну банку, флакон, пробірку наклеюють направлення, в якому вказу-

ють прізвище, ініціали, вік хворого, його домашню і службову адресу, попередній

діагноз, дату і час взяття проб, підпис лікаря, що направив матеріали. Відібрані

проби потрібно доставити до лабораторії протягом 3-х годин. Якщо це неможли-

во, матеріал сіють в 1 % пептонну воду з телуритом калію (1:100000) і на чашки з

лужним м’ясо-пептонним агаром. При великій віддалі до лабораторії всі проби

вміщують у металеві пенали або банки, обмостивши ватою чи стружками. Потім

їх пакують у дерев’яний ящик, пломбують, надписують “верх, обережно!” і з ве-

ликими пересторогами спеціальним транспортом із посланцем доставляють до

лабораторії.

216

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Холера – особливо небезпечне захворювання. Тому бактеріологічне дослід-

ження потрібно проводити в режимних лабораторіях, в яких працює спеціально

підготовлений персонал. Якщо поблизу такої лабораторії немає, досліджуваний

матеріал направляють до найближчої звичайної бактеріологічної лабораторії. То ді

прийом інших аналізів припиняють, встановлюють суворий протиепідемічний ре-

жим, персоналу забороняють працювати натщесерце. Лабораторія повинна пра-

цювати цілодобово.

Бактеріологічне дослідження. Лабораторна діагностика холери має винят-

ково велике значення, оскільки виділення збудника дає право встановити остаточ-

ний діагноз і розгорнути профілактичні заходи для припинення епідемічного роз-

повсюдження захворювання. Окрім того, вона дозволяє виявити вібріоносіїв, оці-

нити контроль за об’єктами оточуючого середовища і ефективність дезінфекції.

Бактеріологічну діагностику проводять поетапно.

Перший етап. Із досліджуваних матеріалів виготовляють мазки, фіксують

спиртом або сумішшю Никифорова, забарвлюють за Грамом і мікроскопують під

імерсійним об’єктивом. Холерні вібріони виглядають трохи зігнутими паличками

червоного кольору, розташованими між тяжами слизу у вигляді своєрідних скуп-

чень, що нагадують “табунці рибок” (рис. 66).

Поряд з типовими вібріонами в мазках часом виявляють кулясті, колбоподібні,

спіралеподібні клітини. Це зменшує діагностичну цінність бактеріоскопічного

методу. На цьому етапі з метою прискорення дослідження доцільно використову-

вати реакцію імунофлуоресценції з міченими діагностичними ОІ холерними си-

роватками та РНГА з антитільним еритроцитарним діагностикумом. Використо-

вують і імунотушовий метод: фіксовані мазки обробляють 2 хв у вологій камері

тушшю, змішаною з протихолерною сироваткою, промивають і мікроскопують.

Холерні вібріони фарбуються в чорний колір.

Для швидкого і надійного виявлення холерних вібріонів у різних об’єктах

навколишнього середовища, особливо тих, що погано або зовсім не культивують-

ся, використовують метод полімеразної ланцюгової реакції.

Одночасно з бактеріоскопією проводять посів досліджуваного матеріалу в

рідкі і на щільні живильні середовища. З рідких

середовищ найчастіше використовують 1 % луж-

ну пептонну воду з телуритом калію і середовище

Монсура, з щільних – лужний МПА, селективні

середовища TCBS, Аронсона, Монсура. Посіви

роблять в 1 % пептонну воду, лужний МПА і на

одне з селективних середовищ (краще всього

TCBS). При доставленні матеріалу в транспортно-

му середовищі з нього роблять висів у 50 мл 1 %

пептонної води pH 9.3 (середовище збагачення).

Середовище Аронсона: МПА, до якого добав-

ляють сахарозу і фуксин, знебарвлений сульфітом

натрію.

Рис. 66. Холерні вібріони

у мазку з випорожнень.

217

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Середовище Монсура: на 1 літр дистильованої води беруть 15 г агар-агару, 1

г желатину, 10 г хлориду натрію, 50 г таурохолату натрію, 30 г карбонату натрію.

Середовище TCBS ( тіосульфат-цитрат-бромтимол сахарозний агар) має стан-

дартний склад, випускається в готовому сухому вигляді. На 1 л дистильованої води

додають 69 г сухого порошку.

Другий етап. Через 5-6 год інкубації посівів у термостаті виготовляють ма-

зок з поверхні рідкого середовища, висячу краплю для визначення рухливості й

проводять орієнтовну реакцію аглютинації на склі з O1 (або RO, O139) діагнос-

тичною сироваткою (“слайд-аглютинація”).

Одночасно роблять висів з 1% пептонної води на лужний МПА або інші се-

лективні середовища з метою отримання ізольованих колоній. При відсутності

видимого росту в першій пептонній воді проводять висів з неї в другу пептонну

воду (в разі первинного посіву в середовище збагачення з pH 9,3 подальший висів

з нього проводять через 14-20 г). Посіви в рідкі і на щільні середовища проводять

великою бактеріологічною петлею діаметром 5 мм. За результатами дослідження

видають попередню відповідь про виявлення холерного вібріона.

Третій етап. Висів із другого середовища збагачення проводять на лужний

МПА (або на одне з елективних щільних середовищ) через 5-6 г при pH 7,8 і через

14-20 год при pH 9,3.

Четвертий етап. Через 16-24 год вирощування посівів на щільних електив-

них середовищах проводять макро- і мікроскопічне дослідження ізольованих ко-

лоній та пересів на двовуглеводне середовище Ресселя (лактозно-сахарозний агар)

або на тривуглеводне середовище Кліглера (глюкозо-лактозо-сахарозний агар) з

метою виділення чистої культури та її ідентифікації.

Колонії холерних вібріонів на лужному МПА в типовій S-формі мають роз-

міри 2-3 мм, круглі, гладенькі, плоскі, голубуваті, прозорі, гомогенні, з рівними

краями, маслянистої консистенції, легко знімаються петлею і емульгуються. При

посіві матеріалів від хворих, що приймали антибіотики, та віброносіїв, можуть

виростати атипові колонії. На агарі Аронсона колонії холерних вібріонів мають

яскраво-червоний колір, на середовищі TCBS вони жовті на зеленому фоні, на

середовищі Монсура колонії без кольору, напівпрозорі, з темним центром. З коло-

ніями на лужному МПА ставлять пробу на оксидазу, а з тими колоніями, що ви-

росли на елективних середовищах, цю пробу ставити недоцільно.

При відборі колоній використовують індикаторні папірці (СІП-1 – набір для

ідентифікації вібріонів). Оксидазопозитивні колонії перевіряють в “слайд аглю-

тинації” з холерною сироваткою О1 (RO,O139) в розведенні 1:100 і варіантоспе-

цифічними сироватками Інаба і Огава (1:50) готують мазки для забарвлення за

Грамом і обробляють люмінесцентною сироваткою. Позитивні результати дають

право видати попередню відповідь про виявлення холерного вібріона.

П’ятий етап. Досліджують характер росту на полівуглеводних середовищах.

Холерний вібріон на агарі Ресселя змінює колір стовпчика при збереженні первіс-

ного кольору скошеної частини без утворення газу. Середовище Кліглера жовтіє

повністю без утворення газу і сірководню. Культури перевіряють за морфологіч-

218

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ними і аглютинабельними властивостями, а в разі потреби визначають групу за

Хейбергом (табл. 43).

Таблиця 43

Біохмічна характеристика за Хейбергом

Г р у п и

Вуглеводи

1 2 3 4 5 6 7 8

Манноза + - + - + - + -

Сахароза + + + + - - - +

Арабіноза - - + + - - + -

Тести V. сholere V. еltor

Гемоліз еритроцитів барана + ±

Аглютинація курячих еритроцитів + ±

Ріст на агарі з поліміксином (30 од/мл) – +

Лізис холерним фагом С + –

Лізис фагом Ельтор-2 – +

Реакція Фогеса-Проскауера – +

–

Ставлять також розгорнуту об’ємну реакцію аглютинації в пробірках за

загальноприйнятою методикою відповідно з інструкцією до діагностичної сиро-

ватки. При відсутності реактивів на оксидазу можна використати пробу “тяжа”.

На предметне скло наносять краплю 0,5% водного розчину дезоксихолату натрію

або 2,5% розчину миючого засобу “Прогрес”, додають повну петлю агарової куль-

тури досліджуваних вібріонів і ретельно перемішують. При позитивній реакції

суспензія негайно втрачає мутність, стає слизовою і в’язкою – тягнеться за пет-

лею у вигляді тяжа, що характерно для вібріонів.

Останнім часом розроблені тести для диференціації класичного варіанту хо-

лерного вібріона від біовару ельтор (табл. 44).

Таблиця 44

Основні відмінності між V. сholere і V. еltor

Чутливість виділених культур холерних вібріонів до антибіотиків та хіміоте-

рапевтичних препаратів визначають за допомогою методу дифузії в агар з викори-

станням стандартних дисків або методом серійних розведень.

Шостий етап. Остаточно враховують результат ідентифікації чистих куль-

тур і видають остаточну відповідь про виділення холерного вібріону серогрупи:

О1, RO (Інаба, Огава, Гікошима) або 0139. Якщо виділені вібріони за більшістю

ознак відносяться до холерних, але не аглютинуються сироватками, видають

відповідь про виділення холерних вібріонів не О1 групи (так званих НАГ-вібріонів).

Обов’язково відмічають гемолітичну активність, чутливість до антибіотиків і лізис

культури відповідним бактеріофагом.

Методи прискореної діагностики. Найкращим є люмінесцентно-серологі-

чний метод, він дає можливість через 1,5-2 год виявити холерних вібріонів у дослі-

джуваному матеріалі, а також у середовищі після підрощування в кількості 10

219

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

мікробних клітин в 1 мл. Методика виготовлення мазків, обробка люмінесцент-

ною сироваткою, мікроскопія та оцінка результатів є загальною для виявлення

всіх видів бактерій. Вона викладена в інструкції, що додається до сироватки.

За допомогою методу іммобілізації вібріонів під впливом специфічної хо-

лерної О1 сироватки можна виявити збудника протягом 15-20 хв при концентрації

його в досліджуваному матеріалі не менше ніж 10

мікр.тіл/мл. На предметне скло

наносять 2 краплі рідких випорожнень, блювотних мас або верхнього шару (плівки)

з середовища накопичення. Першу краплю накривають покривним скельцем (кон-

троль), до другої додають краплю холерної 01 сироватки (1:100), перемішують і

також накривають покривним скельцем. Надавлені краплі досліджують під фазо-

во-контрастним мікроскопом або використовують темнопольний конденсор. При

наявності в пробах холерних вібріонів у першій краплі видно характерний рух, у

другій – іммобілізація мікробних тіл та їх аглютинація.

Для прискореної діагностики застосовують також чутливу реакцію непрямої

гемаглютинації з використанням холерного антитільного еритроцитарного діаг-

ностикуму.

Метод масового дослідження на вібріононосійство проводять під час епі-

демічних спалахів холери. Випорожнення одночасно забирають з прямої кишки

алюмінієвими петлями від 10 чоловік, раціонально згрупованих, і вносять їх в

одну колбу з 200 мл лужної пептонної води і 01 холерною аглютинуючою сироват-

кою, розведеною до половини титру. Інкубацію проводять при 37 °С протягом 3-4

годин. Холерні вібріони, що розмножились, починають аглютинуватись і у ви-

гляді пластівців опадають на дно колби. При позитивному результаті матеріал заби-

рають від кожної з 10 осіб і досліджують роздільно. Такий метод дає значну еко-

номію живильних середовищ і робочого часу бактеріологів.

Серологічні дослідження мають лише допоміжне значення і зводяться до

визначення в сироватці хворих і вібріоносіїв вібріоцидних антитіл, аглютинінів

та антитоксинів. Від хворих потрібно брати парні сироватки з інтервалом у 8-10

днів (першу пробу беруть на 3-5 день хвороби).

Найбільш чутливою є реакція визначення вібріоцидинів. Ці антитіла визна-

чаються з 3-го дня захворювання в титрах 1:100-1:1000 і максимально наростають

до 10-12-го дня. При постановці реакції спочатку ізотонічним розчином хлориду

натрію розводять комплемент 1:20 і розливають його в ряд пробірок по 0,9 мл.

Потім в першу пробірку вносять 0,1 мл сироватки хворого, перемішують і послі-

довно переносять по 0,1 мл до розведення 10

-10

, отримуючи десятикратні розве-

дення в об’ємі 0,9 мл. У кожну пробірку додають по 0,1 мл суспензії культури

холерного вібріона, в якій міститься 1-2 тис. мікробних клітин. Реакцію супро-

воджують відповідними контролями комплементу, сироватки і культури. Пробірки

витримують при 37 °С протягом 60 хв і роблять висіви з них на сектори агару в

чашках Петрі, інкубують у термостаті 18-20 год і підраховують кількість вироще-

них колоній. Титром вібріоцидних антитіл вважають максимальне розведення

сироватки, яке спричиняє загибель не менше 50 % вібріонів у порівнянні з кількістю

колоній, що виросли після висіву з пробірки контролю комплементу.

220

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Протихолерні аглютиніни виявляють за допомогою розгорнутої реакції аг-

лютинації. Досліджувану сироватку розводять 1% лужною пептонною водою в

об’ємі 1 мл від 1:10 до 1:640. Антигеном служить 3-годинна бульйонна культура

холерного вібріона, який виділили в даному вогнищі. У два ряди пробірок з роз-

титрованими парними сироватками вносять по 1 краплі культури і ставлять на

60 хв у термостат при 37 °С, потім до ранку в холодильник, після чого враховують

результати. Реакцію супроводять, як звичайно, контролями сироватки і антигена.

Результат вважають орієнтовно позитивним при аглютинації першою сироваткою

в розведенні 1:40 і вище. Діагностичне значення має не менше ніж 4-кратне наро-

стання титру антитіл у реакції з другою сироваткою.

Більш чутливою і специфічною вважають двокомпонентну реакцію непря-

мої гемаглютинації з еритроцитарним холерним діагностикумом. Необхідні ком-

поненти реакції та методика її постановки в макро- та мікрооб’ємах наведені в

інструкції до діагностикуму. Обов’язково потрібно ставити і цю реакцію методом

парних сироваток. Діагностичне значення має принаймні 4-кратне наростання

титру антитіл у динаміці.

Визначення антитоксинів у сироватці крові проводять за допомогою непря-

мої гемаглютинації. Досліджувану сироватку розводять мікро- або макрооб’єм-

ним способом і додають еритроцитарний холерний ентеротоксичний діагности-

кум. Діагностичним титром вважають розведення сироватки 1:160. Доцільно дос-

ліджувати парні сироватки.

Дослідження матеріалів довкілля. Найчастіше досліджують воду відкри-

тих водоймищ, водопровідну воду, гідробіонтів, харчові продукти, мух, змиви з

різних предметів.

У досліджувану воду (дві проби по 500 мл) додають розчин основного пепто-

ну до 1% концентрації, інкубують 5-8 год при 37 °С і досліджують поверхневу

плівку так само, як і плівку з пептонної води після посіву випорожнень чи блю-

вотних мас. Надійніші результати отримують при використанні методу фільтрації

через мембранні фільтри № 2 або 3, змиви з яких після фільтрування води засіва-

ють у лужну пептонну воду і на селективні середовища. При цьому досліджують

великі кількості води (1,5-2,5 л). Із змиву з фільтрів можна також робити мазки

для забарвлення їх люмінесцентною холерною сироваткою, а також ставити реак-

цію непрямої гемаглютинації.

Від гідробіонтів після їх розтину сіють жовчний міхур, шлунок і кишечник

(після їх гомогенізації) в 1% лужну пептонну воду і на елективний агар. Дафній і

рачків розтирають у ступці і засівають петлею в 1 % пептонну воду.

Тверді харчові продукти подрібнюють, розтирають у ступці з ізотонічним

розчином хлориду натрію і засівають у кількості 10 г у 50-100 мл 1 % пептонної

води та на агарові середовища. Молоко і молочні продукти, змиви з об’єктів дов-

кілля та мух засівають в 1% пептонну воду і досліджують за звичайною схемою.

У різних об’єктах навколишнього середовища можуть знаходитись і інші

представники родини Vibrionaceae, морфологічно подібні до вібріонів. Особливо

це стосується родів Aeromonas, Pseudomonas і Plesiomonas. Відрізнити їх від хо-

221

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

лерних і холероподібних вібріонів можна, в основному, за біохімічними тестами

(табл. 45)

Таблиця 45

Диференціація вібріонів від інших споріднених родів

Ферментація

Рід Оксидаза

Жела-

тиназа

Глюкози Манози Маніту Інозиту

Тест

“тяжа”

Vibrio ++++ + + + + - +

Aeromonas ++++ + + + + - ±

Pseudomonas ++ ± - - - - -

Plesiomonas ++ - - - - + -

Для видової ідентифікації холерних вібріонів провідними тестами є аглюти-

нація культури О1 холерною сироваткою, лізис холерним фагом С ІV або eltor 2.

Кампілобактеріози і гелікобактеріози

Інфекційні захворювання, що спричиняють бактерії роду Campylobacter, діста-

ли загальну назву кампілобактеріози. Вони мають гострий перебіг, супроводжу-

ються гарячкою, ураженням шлунка і кишечника і з кожним роком зустрічаються

все частіше. Серед 13 видів кампілобактерій найголовнішими є: Campylobacter

jejuni, C.coli, C.lari. У 1991 р. виділено окремий вид Helicobacter pylorі. Його ста-

більно виявляють у хворих на виразку шлунка, гастрит і дуоденіт. Цим захворю-

ванням дали загальну назву гелікобактеріози.

Окрім ентеритів і ентероколітів, цих найчастіших кампілобактеріозів, знач-

но рідше зустрічаються септицемії, ендокардити, перикардити, менінгіти, уражен-

ня сечостатевої системи. У вагітних жінок можливі аборти, передчасні роди, інфіку-

вання новонароджених під час пологів.

У зв’язку з тим, що клінічна картина цих захворювань не має характерних

симптомів і подібна до викликаних іншими бактеріями, лабораторні дослідження

набувають важливого значення. Для діагностики широко використовують мікрос-

копічний, бактеріологічний і дещо менше серологічний методи.

Матеріалом для дослідження служить кров, ліквор, випорожнення або вміст

прямої кишки, взятий за допомогою ректальних тампонів, плацентарна і навко-

лоплідна рідина, вміст абсцесів, біоптати слизової оболонки шлунка і 12-палої

кишки. Досліджують також воду, молоко, інші харчові продукти, змиви з пред-

метів тощо.

Бактеріоскопічний метод використовують для швидкої ідентифікації кам-

піло- і гелікобактерій. Тонкі мазки з фекалій або інших клінічних матеріалів фіксу-

ють на вогні, забарвлюють фуксином Пфейфера протягом 10-20 с і промивають

водою. Оскільки для забарвлення інших бактерій потрібно 3-5 хв, то протягом 10-

20 сек встигають зафарбуватись лише кампілобактерії. Особливо чітко їх типові

форми виявляють при забарвленні кристалічним фіолетовим. Під звичайним світло-

вим мікроскопом вони виглядають як тонкі, спірально зігнуті бактерії, що мають

222

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

один повний завиток, С- і S- подібну форму або нага-

дують крила чайки. Helicobacter pylori має дещо

більші розміри. Можна також використати фазово-

контрастну мікроскопію суспензії випорожнень у

бульйоні для культивування бруцел або рідкому сере-

довищі Мюллера-Хінтона (МПБ з крохмалем і казеї-

ном). При цьому виявляють не тільки типові особли-

вості морфології кампілобактерій, а й дуже характер-

ну їх рухливість (рис. 67).

Бактеріологічний метод. Оптимальні результа-

ти отримують, коли матеріал беруть у транспортне

тіогліколеве середовище і в ньому доставляють до лабораторії. Якщо ж посіви

роблять не пізніше 24 год, транспортне середовище не використовують.

Для виділення кампіло- і гелікобактерій найчастіше застосовують середови-

ще Бутцлера (до кров’яного агару додають цефоперазон – 30 мг/л, рифампіцин –

10 мг/л і амфотеріцин В – 2 мг/л). Антибіотики пригнічують ріст супутньої мікро-

флори. Посіви інкубують в атмосфері 10 % СО

при температурі 25 °С, 37 °С і

42 °С протягом 24-72 год.

Кампілобактерії утворюють два типи колоній: 1) правильної круглої форми з

рівними краями діаметром 1-2 мм, блискучою опуклою поверхнею, прозорі, го-

могенні; 2) неправильної округлої форми діаметром 2-8 мм, безбарвні або світло-

сірого кольору, прозорі, нагадують краплі води.

При посіві кількісним методом ріст колоній, як правило, виявляють на третьо-

му і четвертому квадрантах, але потрібно ретельно оглядати всю чашку, оскільки

вони можуть вирости лише на першому квадранті в оточенні колоній супутньої

фекальної мікрофлори.

Ідентифікація колоній кампіло- і гелікобактерій не викликає труднощів для

досвідченого бактеріолога. Типові колонії досліджують мікроскопічно, забарв-

люючи препарати за Грамом. У мазках збудники мають вигляд тонких, зігнутих,

частіше спіралеподібних клітин, можуть мати один і більше витків і досягати в

довжину до 8 мкм. У культур, які вирощували протягом 72 год і довше, клітини

можуть набувати кокоподібної форми, що може привести до помилок в ідентифі-

кації. Потім виділяють чисту культуру, яку ідентифікують за рядом ознак: виді-

лення оксидази, каталази, уреази, ріст при температурі 25 °С, 37 °С і 42 °С, гідроліз

гіппурату, відновлення нітратів, чутливість до цефалотину (табл. 46).

Для серотипування кампіло – і гелікобактерій використовують реакцію аг-

лютинації зі стандартними діагностичними сироватками і суспензією прогрітих

культур. Хороші результати типування отримані також в реакціях коаглютинації,

латекс-аглютинації і непрямої гемаглютинації. Встановлено 50 серотипів C. jejuni

і 20 серотипів C. coli, але їх кількість з року в рік зростає. Ще точніші результати

серотипування отримані при використанні методу імуноферментного аналізу. Зо-

крема, розроблена надійна тест-система для визначення антигенів Н. pylorі в біо-

птатах слизової оболонки шлунка і кишечника.

Рис. 67. Кампілобактерії.

223

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Серологічний метод діагностики захворювань проводять значно рідше. Він

відіграє важливу роль при масових епідеміологічних обстеженнях в ряді країн

американського і африканського континентів. В Україні такі дослідження поки

що не проводились.

Для виявлення антитіл можна використовувати практично всі серологічні

тести. Але перевагу віддають реакції непрямої імунофлуоресценції та методу іму-

ноферментного аналізу. Можна застосовувати і реакції звичайної аглютинації,

латекс-аглютинації та непрямої гемаглютинації. Є повідомлення про використан-

ня імуноблотінгу та радіоімунного методу для визначення антитіл до С.jejuni і

H.pylorі. Вони мають винятково високу чутливість, але досить дорогі і широкого

вжитку не набудуть.

Чума

Чума – гостра, зоонозна особливо небезпечна, карантинна інфекційна хворо-

ба з ураженнями шкіри, лімфатичних вузлів, легень, геморагічною септицемією й

інтоксикацією. Збудник чуми – Yersinia pestis – належить до роду Yersinia родини

Enterobacteriaceae. До цього роду входять ще два патогенних для людини види

ієрсиній: Y. рseudotuberculosis, Y. еnterocolitica. Крім трьох основних збудників

ієрсиніозів виділяють ще 8 видів, які в інфекційній патології людини значення не

мають, правда, окремі з них можуть зрідка викликати опортуністичні інфекції.

Джерелом чуми в природі є різні види диких і домашніх тварин, гризунів, а

перенощиками – їх блохи. Проникаючи в людську спільноту, чумна інфекція може

стати антропонозом, який розповсюджується у вигляді епідемій і пандемій.

Збудник чуми має кілька антигенів, із них найбільш вивчені D-, F1-, T-, V-,

W. Але серологічне його типування розроблено ще недостатньо і в рутинній лабо-

раторній практиці не використовується.

Мікробіологічне дослідження проводиться з метою діагностики захворюван-

ня, виявлення інфікування тварин і перенощиків в ендемічних осередках та вста-

новлення контамінації ієрсиніями різних об’єктів оточуючого середовища. При

цьому використовують бактеріоскопічний, бактеріологічний, біологічний і серо-

логічний методи, а також алергічну пробу з пестином для ретроспективної діагнос-

Примітка: “+” – позитивна ознака; “–” – негативна ознака; Р – резистентні; Ч – чутливі

Ріст при

Вид Оксидаза Каталаза Уреаза

25 °С 37 °С 42 °С

Гіппурат-

Цефа-

лотин

C.jejuni

C.fetus

C.coli

C.lari

Н.pylori

Таблиця 46

Диференціальні ознаки кампілобактерій і гелікобактерій

224

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

тики. Перший випадок захворювання на чуму у людини повинен бути обов’язково

підтверджений виділенням збудника.

Взяття матеріалу для дослідження як і всі етапи виділення збудника та

роботи з гризунами чи лабораторними тваринами проводять у протичумних кос-

тюмах першого типу. В лабораторії потрібно створити суворий протиепідемічний

і дезінфекційний режими, які регламентовані спеціальними інструкціями. Залеж-

но від клінічної форми чуми, від хворого беруть такі матеріали: виділення з ви-

разки або карбункула (шкірна форма); пунктат із бубону (бубонна форма), кров

(при всіх формах), фекалії та спинномозкову рідину (при ураженнях кишечника

або мозкових оболонок). Матеріал важливо взяти до початку антибіотикотерапії.

При направленні секційного матеріалу беруть кров, кістковий мозок, шматочки

паренхіматозних органів. Крім того, до лабораторії доставляють живих і загиблих

гризунів, бліх, харчові продукти, воду. В окремих випадках досліджують повітря,

змиви з поверхні об’єктів.

Взятий матеріал вміщують у скляні банки з притертими пробками, обгорта-

ють вощаним папером, зовні їх обтирають 5 % розчином лізолу, наклеюють ети-

кетку, на якій вказують дату, місце, характер матеріалу, прізвище хворого, діагноз.

Банки щільно вкладають у герметичну тару, надписують “верх” і направляють

службовим транспортом із довіреною особою до найближчої протичумної уста-

нови або лабораторії для діагностики особливо небезпечних інфекцій. Персонал,

що проводив забір матеріалу, підлягає повній санітарній обробці.

Бактеріоскопія. З досліджуваного матеріалу в лабораторії виготовляють 5-6

мазків, фіксують їх етанолом або сумішшю спирту й ефіру протягом 15-20 хв.

Один мазок забарвлюють за Грамом, другий – метиленовою синькою, третій –

міченою люмінесцентною сироваткою проти Y. pestis (пряма РІФ), 2-3 мазки зали-

шають у резерві. Виявлення в мазках характерних, біполярно забарвлених, овоїд-

них, грамнегативних бактерій (рис. 68; див. вкл., рис. 15), які дають до того ж

специфічне люмінесцентне світіння у вигляді яскравого зеленуватого ореолу на-

вколо клітин, при характерних клінічних симптомах та врахуванні епідеміологіч-

ної ситуації, дає право поставити попередній діагноз чуми.

Бактеріологічне дослідження. Незважаючи

на характерну клінічну картину захворювання, бак-

теріологічну діагностику треба проводити обов’яз-

ково в усіх випадках. Для посівів використовують

високопоживні середовища з додаванням стимуля-

торів росту, хоч палички чуми невибагливі до жи-

вильних середовищ. Досліджувані матеріали, не

контаміновані сторонньою мікрофлорою (кров, пун-

ктат бубонів, ліквор), сіють у флакони, що містять

50-100 мл МПБ і паралельно в чашки з МПА або

агаром Хотінгера. Матеріал, забруднений супут-

ньою флорою, висівають на МПА з сульфітом на-

трію, середовища Туманського (МПА з 1 % гемо-

Рис. 68. Збудник чуми у мазку

з бубону.

225

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

лізованої крові та генціановим фіолетовим в концентрації 1:100000-1:400000) або

Коробкової (0,15 % напіврідкий агар з 0,3 % гемолізованої крові та генціановим

фіолетовим 1:200000). Для інактивації чумного фагу на поверхню щільних сере-

довищ наносять і рівномірно розподіляють 0,1 мл антифагової сироватки. Посіви

вирощують при 28 °С і 37 °С.

Через 18-20 год на рідких середовищах появляється плівка із спущеними до-

низу ниткоподібними утвореннями, подібними до сталактитів, на дні утворюєть-

ся пухкий осад. Розвиток колоній на щільних середовищах проходить три стадії.

Через 10-12 год під мікроскопом ріст нагадує скупчення безбарвних пластинок

(стадія “битого скла”). Пізніше (18-20 год) утворюються колонії з опуклим кала-

мутно-білим центром, оточеним фестончастою каймою (стадія “мереживної хус-

тинки”). Через 40-48 год наступає фаза “дорослих колоній” із буруватим центром

і зазубреною периферичною зоною (рис. 69).

Із типових колоній готують мазки, забарвлюють за Грамом і метиленовим

синім, роблять пересів на скошений агар (або бульйон) для виділення чистої куль-

тури. Наступного дня, переконавшись що культура чиста, приступають до її іден-

тифікації. Для цього проводять реакцію аглютинації і преципітації з діагностич-

ними антисироватками проти соматичного і капсульного антигенів, ставлять РНГА

з ліофілізованими еритроцитарними антитільними діагностикумами, пробу на лізис

чумним бактеріофагом і заражають чистою культурою гвінейських свинок. Обо-

в’язково визначають антибіотикочутливість дискодифузійним методом на агарі або

методом серійних розведень у бульйоні.

Чисту культуру засівають в середовища Гісса для визначення ферментатив-

них властивостей. Збудник чуми розкладає до кислоти глюкозу, маніт, галактозу,

левульозу, ксилозу, окремі штами ферментують арабінозу і гліцерин.

Свіжовиділені штами не розкладають адоніт, рамнозу і сахарозу, не виділя-

ють оксидазу, уреазу, але мають фермент каталазу, не згортають молоко, не утво-

рюють індол. Необхідно провести диференціацію Y. pestis від інших ієрсиній

(табл. 47).

Визначальнми ознаками при ідентифікації збудника чуми є аглютинація куль-

тури антисироватками, лізис чумним бактеріофагом

і позитивна біопроба.

Біологічне дослідження при діагностиці чуми

є обов’язковим. Біологічну пробу ставлять як із пер-

винним матеріалом, так і з виділеною чистою куль-

турою. Для зараження використовують гвінейських

свинок, рідше – білих мишей. Якщо матеріал не кон-

тамінований супутньою мікрофлорою (кров, пунк-

тат бубону), його вводять підшкірно або внутрішнь-

оочеревинно. При забрудненні матеріалу сторонньою

флорою зараження проводять шляхом втирання

емульгованого матеріалу в депільовану і скарифіко-

вану шкіру живота гвінейської свинки. При пози-

Рис. 69. Колонії Y. pestis.

226

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

тивній біопробі тварини гинуть через 2-3 дні при зараженні в черевну порожнину,

або через 5-7 днів – при нанесенні матеріалу на шкіру. Роблять розтин загиблих

свинок, вивчають патологоанатомічні зміни: гіперемія судин, збільшення печін-

ки, селезінки, лімфатичних вузлів, наявність на їх поверхні та на розрізі некро-

тичних ділянок. Із крові і паранхіматозних органів роблять мазки і мазки-відбит-

ки, проводять висіви на живильні середовища. У мазках виявляють величезну

кількість біполярно забарвлених грамнегативних овоїдних паличок. Виділені від

тварин чисті культури ідентифікують так само, як і культури після бактеріологіч-

ного дослідження. Трупи гвінейських свинок, як і досліджуваних диких гризунів,

занурюють у 5 % розчин лізолу, а потім спалюють.

Серологічна діагностика чуми не набула широкого використання. Останнім

часом проводять постановку РНГА з еритроцитарним діагностикумом, на якому

адсорбований капсульний антиген Y. p еstis. Діагностичним титром вважають роз-

ведення сироватки 1:40. Взагалі ж серологічні реакції проводять здебільшого з

метою ретроспективної діагностики та при масових епізоотичних обстеженнях

гризунів в ендемічних осередках чуми.

Прискорені методи діагностики. Запропоновані експресні методи виявлення

збудника чуми за допомогою флуоресцуючих антитіл, в РНГА з використанням

антитільних еритроцитарних діагностикумів. Вони дають змогу виявити Y. pеstis

у досліджуваному матеріалі через 2 год.

До прискорених методів діагностики відносять також реакцію преципітації в

стандартних агарових пластинках з протичумною сироваткою та метод швидкого

росту збудника чуми на елективному середовищі з використанням бактеріофага.

Для цього 0,2-0,3 мл матеріалу сіють в 4 пробірки з середовищем Коробкової і

0,1 мл на агар в чашці Петрі. В одну з пробірок вносять 0,2-0,3 мл чумного фага.

Посіви інкубують при 28 °С протягом трьох годин. Із пробірок, в яких видно ріст,

готують 2 мазки, забарвлюють за Грамом і метиленовим синім. При позитивному

результаті в мазках видно ланцюжки грамнегативних овоїдних паличок, забар-

влених біполярно. У пробірці з фагом росту немає. Із пробірки з ростом по 0,4 мл

Таблиця 47

Диференціація збудників чуми, псевдотуберкульозу і кишкового ієрсиніозу

Ознаки

Yersinia

pestis

Yersinia

pseudotuberculosis

Yersinia

enterocolitica

Рухливість

Ферментація адоніту

Ферментація рамнози

Ферментація сахарози

Лізис чумним фагом

Утворення H

Плазмокоагулаза

Каталаза

Уреаза

Колонії на цитратному

дезоксихолевому агарі

–

червоні

–

жовті

–

жовті

227

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

матеріалу вводять у черевну порожнину декількох мишей. Через 8-10 год прогля-

дають чашки з агаром для виявлення росту збудника чуми.

Через 10-12 год забивають мишей, від них сіють ексудат і матеріал із парен-

хіматозних органів у пробірки з напіврідким агаром і досліджують так само, як

вище описано. Отже, попередній результат отримують через 4 год, а остаточний –

через 18-20 год.

Для ретроспективної діагностики чуми часом використовують алергічну пробу

з пестином.

Псевдотуберкульоз

Псевдотуберкульоз – гостра інфекційна хвороба з групи бактерійних зоонозів,

характеризується гарячкою, поліморфним висипом, гепатолієнальним синдромом,

ураженнями травного каналу, суглобів, лімфатичної системи. Збудник – Yersinia

pseudotuberculosis. Псевдотуберкульозні бактерії мають соматичні О-антигени і

джгутикові Н-антигени, поділяються на 13 сероварів і підсероварів. Захворюван-

ня у людей найчастіше викликають ієрсинії сероварів І, ІІІ, IV. Основним резерву-

аром і джерелом інфекції для людини є дикі і синантропні гризуни, з виділеннями

яких ієрсінії потрапляють на різноманітні продукти харчування. Основний шлях

передачі збудників псевдотуберкульозу аліментарний, хоч не можна виключити і

респіраторне інфікування. Зараження відбувається після вживання контамінових

ієрсиніями продуктів, що зберігалися при низьких температурах (4-12 °С) в холо-

дильниках і овочесховищах. В силу своєї психрофільності при таких умовах бак-

терії можуть розмножуватись і нагромаджуватись у харчових субстратах.

При лабораторній діагностиці псевдотуберкульозу використовують бактері-

ологічний, серологічний, біологічний і алергічний методи. Матеріалом для дослі-

дження служить кров, пунктат із лімфатичних вузлів, змиви з носоглотки, харко-

тиння, блювотні маси, кал, сеча, жовч.

Бактеріологічне дослідження. Первинну бактеріоскопію можна використа-

ти лише при дослідженні пунктатів лімфовузлів або органів від трупа. Мазки-

відбитки краще забарвлювати за методом Грама і Романовського-Гімзи. Цей ме-

тод самостійного діагностичного значення не має і є допоміжним. Він орієнтує

бактеріолога на вибір живильних середовищ.

Посіви досліджуваних матеріалів роблять на середовище Ендо та Сєрова

(100 мл 1 % ПВ, 1 мл індикатора фенолрот, 0,75 г глюкози, рН 7,4-7,6) інкубують

при 37 °С 48-72 год. Посіви на середовище Сєрова витримують 15-20 діб у холо-

дильнику з наступним висівом на диференціальні середовища. Підозрілі колонії

дрібні, круглі, опуклі, безбарвні досліджують мікроскопічно й пересівають на сере-

довище Олькеницького. Колонії Y. pseudotuberculosis у R-формі майже такі самі,

як у збудника чуми, але в своєму розвитку не мають стадії “битого скла”. Іденти-

фікують культури за звичайною схемою (посів на середовище Гісса, фаголізис,

визначення серотипів за допомогою діагностичних аглютинуючих сироваток). Ди-

ференціацію з іншими ієрсиніями проводять за додатковими тестами (табл. 47).

228

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Для серологічної діагностики псевдотуберкульозу ставлять розгорнуту об’єм-

ну реакцію аглютинації (подібно до реакції Відаля) з відповідними діагностику-

мами. Антитіла в крові хворих накопичуються на другому тижні хвороби. Діагно-

стичний титр 1:200 і вище. Ще кращі результати дає постановка РНГА з антиген-

ним еритроцитарним діагностикумом. Позитивною цю реакцію вважають при титрі

антитіл 1:400 і вище. Розроблена також схема постановки реакції ензиммічених

антитіл з використанням полістирилових планшет з адсорбованим на твердій фазі

антигеном.

Біологічну пробу краще проводити на гвінейських свинках, оскільки ієрсинії,

виділені від людини, мало патогенні для мишей. Заражені свинки гинуть через 4-

12 днів. У тварин досліджують мазки – відбитки з органів і роблять посіви на

живильні середовища з наступною ідентифікацією виділених культур.

Алергічну пробу ставлять, починаючи з другого тижня захворювання. Стан

сенсибілізації розвивається з 7-20-го дня і зберігається протягом 2-5 років. Алер-

ген вводять внутрішньошкірно в об’ємі 0,1 мл. Облік реакції проводять через 48 год.

При позитивній пробі виникає почервоніння й інфільтрат, які часом сверблять і

болючі.

Кишечний ієрсиніоз

Ієрсиніоз кишечника викликає Yersinia enterocolitica. Захворювання характе-

ризується гарячкою, переважним ураженням травного каналу, токсико-алергічни-

ми проявами, різноманітністю клінічних форм. Зараження людини настає алімен-

тарним шляхом через харчові продукти і воду, контаміновані виділеннями хворих

тварин. Джерелом інфекції для людини є хворі на ієрсиніоз гризуни і синатропні

тварини (корови, свині, кози, телята, коні). Це захворювання має місце у більшості

країн світу, але найчастіше зустрічається у скандинавських країнах. В Україні спо-

стерігаються спорадичні випадки.

Антигенна структура Y. enterocolitica складна. За характером О-антигену роз-

різняють 34 серовари. Переважна більшість культур, виділених від хворих людей,

відносяться до сероварів 03, 05, 08, 09.

Мікробіологічна діагностика кишечного ієрсиніозу багато в чому подібна до

бактеріологічних досліджень при псевдотуберкульозі. При підозрінні на це захво-

рювання обов’язково досліджують кров, випорожнення, блювотні маси, дуоденаль-

ний вміст, сечу, ліквор. При оперативних видаленнях червоподібного відростка та

лімфатичних вузлів посіви роблять з цих емульгованих органів. Якщо на початку

хвороби є запалення глотки і мигдаликів, досліджують слиз із носоглотки.

Посіви роблять на щільні диференціально-діагностичні агари Ендо або Плос-

кирєва та середовище збагачення (селенітовий бульйон). Для виділення

Y.enterocolitica із фекалій зарубіжні фірми пропонують щільні селективні середо-

вища, що містять цефсулодин, іргазан і новобіоцин (CIN-агар) та агар Мак Конкі.

Оптимальна температура для культивування 28-30 °С. На цих середовищах

колонії дрібні, блискучі, часто опуклі, мають голубуватий відтінок. На агарі Ендо

229

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Туляремія

Туляремія – гостра інфекційна хвороба з природною вогнищевістю, характе-

ризується гарячкою, ураженням лімфатичних вузлів, шкіри, мигдаликів, легень,

очей та інших органів. Збудник захворювання Francisella tularensis. Туляремійні

бактерії в S-формі мають два антигени – О і Vi (капсульний). О-антиген виявляє

спорідненість до антигенів бруцел. Розрізняють три підвиди збудника туляремії:

голарктичний (для країн північного регіону), неарктичний (американський) і се-

редньоазіатський. Резервуаром і джерелом інфекції є різні види диких і домашніх

гризунів (ондатри, водяні пацюки, зайці, миші, хом’яки та ін.), а також свійські

тварини (свині, вівці, корови). Людина заражується тільки від тварин, від людини

до людини збудник не передається.

Зараження відбувається контактно-побутовим шляхом (при контакті з хвори-

ми тваринами і їх виділеннями); аліметарним (при вживанні інфікованих продуктів

харчування і води); повітряно-пиловим (під час обмолоту зернових, обробки фу-

ражу тощо); трансмісивним (через укуси кровосисних комах). Для людини

мінімальна інфікуюча доза – одна мікробна клітина.

При проведенні діагностики туляремії використовують бактеріологічний, біо-

логічний, серологічний і алергічний методи. Перевагу надають серологічним ре-

акціям і алергічним пробам, які можна провести в будь-яких клінічних і мікробі-

ологічних лабораторіях. Зараження лабораторних тварин і виділення чистих куль-

тур можливе тільки в лабораторіях для діагностики особливо небезпечних інфекцій.

Залежно від клінічної форми туляремії, у хворих беруть такі матеріали для

дослідження: слиз із ротоглотки, пунктат бубону, харкотиння, кров, гній із кон’юнк-

тиви, вміст пустул і виразок. Досліджують також органи загиблих гризунів, воду,

повітря, кровосисних комах, харчові продукти, контаміновані виділеннями тва-

рин і гризунів. Взяття матеріалу та його доставка до лабораторії здійснюється при

суворому дотриманні правил роботи із збудниками особливо небезпечних інфекцій.

Біологічне і бактеріологічне дослідження. Бактеріологічний метод діагно-

стики туляремії має важливу особливість – виділити збудник в перших генераціях

безпосередньо від хворого майже ніколи не вдається. Тому досліджуваним матері-

мають слабо рожевеве забарвлення. R-форми колоній для цього виду ієрсиній не

характерні.

Ізольовані колонії досліджують мікроскопічно, на рухливість при 25 °С, від-

сівають на середовище Олькеницького й ідентифікують так само, як і Y. ente-

rocolitica.

Для серологічної діагностики кишечного єрсиніозу використовують реакцію

об’ємної аглютинації, РНГА, метод ІФА. Важливо ставити ці реакції з парними

сироватками. Наростання титру антитіл в 4 рази і більше свідчить про специ-

фічність інфекційного процесу.

Можлива також постановка алергічної проби з діагностичною метою і експе-

риментальне зараження лабораторних тварин.

230

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

алом спочатку заражають гвінейських свинок (краще) або білих мишей, а потім

від них виділяють та ідентифікують чисту культуру. Цей метод є самим чутливим

для виявлення туляремійних бактерій у будь-якому матеріалі. DLM для цих тва-

рин – одна мікробна клітина.

Заражають дві гвінейські свинки або 3-5 білих мишей. Тварини гинуть на

5-14 добу. Якщо вони залишаються живими, їх забивають, роблять розтин; кров,

кістковий мозок, емульговані лімфатичні вузли і паренхіматозні органи сіють на

згорнуте жовткове середовище Мак-Коя і Чепіна або глюкозо-цистиновий кров’я-

ний агар Френсіса. При необхідності до середовищ додають 100 ОД пеніциліну

для пригнічення росту сторонньої мікрофлори. Запропоновано також рідке елек-

тивне середовище з амінокислотами, вітамінами, мікроелементами. На простих

середовищах збудник туляремії не росте. Туляремійні бактерії можна також виділи-

ти шляхом зараження в жовтковий мішок курячих ембріонів, де їх легко виявити

за допомогою методу імунної флуоресценції. Посіви вирощують у термостаті про-

тягом 3-5 днів при температурі 37

С. Паралельно з посівами з тих же матеріалів

загиблих тварин готують мазки-відбитки й забарвлюють їх за методом Романовсь-

кого-Гімзи. Збудники туляремії мають вигляд маленьких (0,2-0,7 мкм) кокоподіб-

них або паличкоподібних бактерій. У мазках із органів вони мають ніжну капсулу.

На середовищі Мак-Коя і Чепіна туляремійні бактерії ростуть у вигляді ніжних

маленьких колоній, що нагадують крапельки роси. На агарі Френсіса колонії круглі

з гладенькою поверхнею, молочного кольору, слизуваті, оточені зеленим ореолом.

Рідке середовище мутніє, на дні утворюється слизовий осад.

Типові колонії досліджують мікроскопічно, пересівають у напіврідке елек-

тивне середовище в пробірці; культури, що виросли, ідентифікують за морфоло-

гічними (дуже дрібні грамнегативні кокобактерії), культуральними ознаками (не

ростуть на простих середовищах), біохімічними властивостями (розкладають глю-

козу, мальтозу, левульозу, виділяють сірководень, не утворюють індолу) та в ре-

акції аглютинації із специфічною аглютинуючою сироваткою. Остання реакція і

позитивна біопроба є вирішальними при визначенні збудника туляремії.

Для виділення туляремійних мікробів із води 1 л її попередньо фільтрують

через мембранні фільтри або центрифугують. Ресуспензованим осадом із мемб-

рани або з дна центрифужної пробірки заражають білих мишей. Змиви з різних

об’єктів та харчові продукти досліджують на наявність збудників туляремії також

методом біопроби.

Серологічна діагностика. У звичайних клінічних умовах для діагностики

туляремії проводять тільки серологічні реакції й алергічну пробу з тулярином.

Починаючи з 10-12 дня хвороби ставлять об’ємну реакцію аглютинації, яка за

методикою не відрізняється від реакції Райта. У хворого беруть 2-3 мл крові з

ліктьової вени або пальця, отримують сироватку, яка повинна бути абсолютно

прозорою. Реакцію ставлять із розведеннями сироватки від 1:50 до 1:800, супро-

воджуючи її відповідними контролями (табл. 48).

Антигеном в реакції аглютинації служить туляремійний діагностикум, в 1 мл

якого міститься 10 млрд мікробних тіл. Перед вживанням його розводять у 10 разів.

231

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Таблиця 47

Схема постановки об’ємної реакції аглютинації

Номери пробірок

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 КС 7 КД

0,85 % розчин хлориду натрію

Сироватка хворого, 1:25

Діагностикум туляремійний

Розведення сироватки

–

0,5

1:50

0,5

1:100

0,5

1:200

0,5

1:400

0,5

1:800

0,5

–

1:50

0,5

–

0,5

–

Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.

Пробірки струшують і ставлять у термостат на 2 год, потім витримують 18-

20 год при кімнатній температурі і аналізують результати. Діагностичне значення

має титр 1:100. Така концентрація антитіл настає в кінці 2-го тижня, після чого

титр аглютинів наростає у 4-8 разів, в той час як у перехворілих раніше він зали-

шається практично незмінним.

Кров’яно-крапельну реакцію аглютинації вживають як прискорений орієн-

товний метод діагностики туляремії, особливо при масових обстеженнях. На ре-

тельно знежирене скло беруть товсту краплю крові з пальця хворого. До неї дода-

ють такий же об’єм дистильованої води, щоб викликати гемоліз. Поряд наносять

краплю туляремійного діагностикуму (5 млрд мікробних тіл у 1 мл). Обидві краплі

змішують скляною паличкою. При наявності у хворих титру антитіл 1:100 і вище

аглютинація на склі наступає негайно, при більш низьких титрах – через 2-3 хв. У

всіх хворих із позитивною кров’яно-крапельною пробою ставлять об’ємну реак-

цію аглютинації.

Дуже чутливим методом серологічної діагностики туляремії є реакція непря-

мої гемаглютинації. Вона ефективна як при ранній, так і при ретроспективній

діагностиці, а також для визначення рівня антитіл після вакцинації. Антигеном

для РНГА служить туляремійний еритроцитарний діагностикум (консервовані

формаліном баранячі еритроцити, сенсибілізовані туляремійним антигеном). Ме-

тодика постановки РНГА при туляремії така сама, як і при бруцельозі. Гемаглюти-

наційні титри сироваток у хворих досягають 1:1280-1:2560 і вище.

Високочутлива і специфічна непряма реакція імунофлуоресценції. Діагнос-

тикум для РІФ є завись вакцинного штаму туляремійних бактерій в концентрації

500 млн/мл. Сироватку розводять від 1:5 до 1:640. Діагностичним титром вважа-

ють розведення 1:40 і більше, яке дає яскраве світіння поверхні мікробних клітин.

Позитивна РІФ буває також у перехворілих раніше і вакцинованих.

Для ранньої діагностики туляремії використовують також РЗК на холоді. Кров

у хворого беруть в кінці 1-го тижня захворювання, антигеном служить діагностикум.

У природних осередках туляремії для контролю за розвитком епізоотій серед

гризунів використовують РНГА та ІФА з метою виялення антигенів у тушках гри-

зунів і птахів.

Алергічні проби віднесені до ранніх і високоспецифічних методів діагности-

ки туляремії. Вони стають позитивними вже з 3-5-го дня хвороби. Для постановки

232

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

проб використовують 2 препарати тулярину. Перший містить 500 млн бактерій в

1 мл, другий – 10 млрд. Відповідно використовують внутрішньошкірний метод

введення тулярину з меншою концентрацією мікробних тіл і нашкірний – для більш

концентрованого препарату.

Для постановки внутрішньошкірної проби 0,1 мл тулярину вводять у шкіру

передпліччя. При постановці нашкірної проби на зовнішню поверхню плеча на-

носять краплю тулярину і через неї роблять 2 паралельні насічки довжиною 8-

10 мм, плоским боком пера втирають препарат в насічки. Реакцію враховують через

24 і 48 год. За позитивну пробу вважають розвиток інфільтрату діаметром 5 мм

і більше. Позитивна проба протягом кількох років залишається у перехворілих і

вакцинованих осіб.

Бруцельоз

Бруцельоз – хронічна або гостро-хронічна зоонозна інфекційна хвороба з

рецидивним довготривалим перебігом, ундулюючою гарячкою, переважним ура-

женням опорно-рухових органів, нервової та сечостатевої системи. Збудниками

його є декілька видів бактерій, об’єднаних у рід Brucella: B.melitensis, B.abortus,

B.suis, B.ovis, B.сanis, B.neotomae.

Із всіх видів найбільш патогенною для людини є B.melitensis. Вона викликає

95-97 % всіх випадків бруцельозу, на долю B.abortus припадає 1-3 %, ще рідше за-

хворювання викликає B.suis (менше 1 %). Пізніше від баранів, хворих на епідиди-

міт, виділили B.ovis, від чагарникових щурів – B.neotomae, від гончих собак – B.canis.

Брецели мають добре виражені антигенні властивості. Вони містять поверх-

невий Vi -антиген і видоспецифічні соматичні А і М, кількісне співвідношення

яких неоднакове у різних видів. У B.melitensis переважає М-антиген, у B.abortus і

B.suis – антиген А. Для ідентифікації бруцел використовують монорецепторні

сироватки.

Основними носіями бруцел є кози, вівці (B.melitensis), велика рогата хвороба

(B.abortus), свині (B.suis) і північні олені (B.rangiferis). Від хворих тварин збудник

виділяється з молоком, сечею, випорожненнями і особливо з навколоплідними

водами під час окотів і отелів. Людина заражується від тварин контактно-побуто-

вим шляхом або через сире молоко і молочні продукти. Захворювання носить про-

фесійний характер. Найчастіше хворіють пастухи, доярки, ветеринарні працівни-

ки, скотарі.

Лабораторну діагностику бруцельозу проводять за допомогою бактеріологіч-

них і серологічних досліджень, біологічної та алергічної проб, а також методу

ДНК/ДНК гібридизації.

Матеріалом для дослідження може бути кров, кістковий мозок, фекалії, жовч,

сеча, ліквор, харкотиння, пунктат лімфатичних вузлів, у тварин – викидні, навко-

лоплідні води, а також молоко і молочні продукти.

У зв’язку з частими лабораторними зараженнями бруцельозом виділення

чистих культур і зараження гвінейських свинок дозволяють проводити лише у

233

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

спеціальних режимних відділах санепідемстанції. Серологічні дослідження ви-

конують у звичайних бактеріологічних лабораторіях.

Бактеріологічне дослідження. Для виділення гемокультури з ліктьової вени

беруть 10-20 мл крові й порівно засівають у два флакони з печінковим, сироватко-

вим декстрозним бульйоном або МПБ із глюкозою, гліцерином і антифаговою

сироваткою для пригнічення бруцельозного бактеріофагу. Один флакон інкубу-

ють у звичайних аеробних умовах, другий – в атмосфері 10 % CО

(для росту

B.abortus). Особливістю бруцел є дуже повільний ріст на середовищах при виді-

ленні від хворих, тому посіви слід витримувати в термостаті до 4-5 тижнів, робля-

чи висіви на елективні агари кожні 4-5 днів. Найкращим середовищем для виро-

щування бруцел є сироватковий декстрозний агар (МПА, 5 % сироватки, 1 % дек-

стрози). Для прискорення дослідження посіви крові проводять у два прямокутних

флакони за методом Кастанєди. Флакони містять, крім бульйону, ще й шар агару

на одній або обох стінках. Починаючи з 4-го дня після посіву, флакони періодично

похитують для того, щоб зросити бульйоном поверхню агару. У випадку позитив-

ного результату на агарі виростають колонії бруцел, які відсівають на елективні

середовища й проводять ідентифікацію. Якщо протягом місяця колонії не рос-

туть, роблять висів із бульйону на щільне середовище.

Отримання гемокультури є одним із основних методів бактеріологічної діаг-

ностики бруцельозу у людей. Якщо хворобу викликає B. melitensis, гемокультура

висівається у 65-90 % випадків, при зараженні B. abortus – у 5-15 %. Інколи гемо-

культура виростає вже з перших днів гарячки.

Хороші результати в гострій і хронічній стадіях хвороби дають посіви пунк-

татів кісткового мозку. Мієлокультуру вдається виділити в 2 рази частіше, ніж гемо-

культуру. Кілька крапель аспірату кісткового мозку засівають у дві пробірки з тим

же середовищем. Сечу для виділення уринокультури і жовч для виділення білікуль-

тури, а також молоко спочатку центрифугують. Із осаду або вершків роблять висів

по 0,1-0,2 мл на чашки з агаром “Д”, (або печінковим), до якого додають генціано-

вий фіолетовий у розведенні 1:200 тис. для затримання росту супутньої мікрофлори.

Дуже ефективні посіви матеріалу в жовток курячих жирових (незаплідне-

них) яєць або в жовтковий мішок курячого ембріону. Кров хворого або аспірат

кісткового мозку розводять бульйоном 1:3 і по 0,1-0,2 мл інокулюють у декілька

яєць. Заражені яйця інкубують при 37

С 5 днів і по 0,5 мл їх вмісту висівають на

рідкі й щільні середовища. Ріст бруцел спостерігається вже через 2-3 дні.

Якщо посівний матеріал (фекалії, сеча, харкотиння, гній тощо) контамінові

сторонніми мікробами, його спочатку центрифугують, осад розводять генціано-

вим фіолетовим у 3-5 разів і по 0,2 мл вносять у яйця чи ембріони з наступним

висівом на елективний агар.

Колонії бруцел на агарі дрібні (0,1-0,5 мм), круглі, опуклі, гомогенні з перла-

мутровим відтінком. Бруцели можуть утворювати як S-, так і R-форми колоній

(особливо B. ovis, B. suis і B. canis). Із помутнілого бульйону і типових колоній

виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і відсівають на скошений агар для

виділення чистої культури.

234

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Ідентифікація культур проводиться за морфологічними, культуральними, біо-

хімічними властивостями і на основі реакції аглютинації видовими і монорецеп-

торними сироватками. Тепер є надійні тести для диференціації основних видів і

біоварів бруцел (табл. 49).

Таблиця 49

Диференціація основних видів і біоварів бруцел

Ріст на агарі з

барвниками

Аглютинація

моноспецифічними

сироватками

Вид

Біо-

вар

Потре-

ба СО

Виді-

лення

Тіонін Фуксин

Brucella

abortus

Brucella

melitensis

Лізис

фагом

Brucella

melitensis

–

Brucella

abortus

–

Brucella

suis

–

Біологічна проба. Найбільш чутливими лабораторними тваринами є

гвінейські свинки і білі миші. До зараження тварин вдаються тоді, коли досліджу-

ваний матеріал сильно забруднений сторонньою мікрофлорою і висіяти з нього

чисту культуру важко. Кров хворих, ліквор, ексудат із суглобів вводять у черевну

порожнину (гвінейським свинкам 2-3 мл, мишам – 0,5-1,0 мл). Осад сечі, навко-

лоплідних вод, молока вводять підшкірно в пахвинній ділянці. Через 20-30 днів

після зараження проводять розтин тварин, сіють кров із серця та емульговані па-

ренхіматозні органи і лімфатичні вузли на рідкі й щільні елективні середовища.

Перед посівом у свинок беруть кров із серця для постановки реакції аглютинації з

метою виявлення антитіл. Позитивною біопробу вважають тоді, коли виділяють

бруцели будь-якого виду, або при позитивній реакції аглютинації в розведенні

сироватки 1:20 і більше.

Для виявлення бруцельозних антигенів у сироватці крові, які можуть бути

вільними або у вигляді циркулюючих імунних комплексів, застосовують РНГА в

разі використання еритроцитарних діагностикумів з моноклональними антитіла-

ми до родоспецифічних антигенів бруцел. Використовують також реакцію коа-

глютинації та преципітації, а також метод імуноферментного аналізу.

235

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Серологічні дослідження при бруцельозі включають реакцію аглютинації

Райта, прискорені пластинчасті реакції на склі: Хеддлсона, роз-бенгал, латекс-

аглютинації, непряму реакцію гемолізу. Із об’ємних серологічних реакцій вико-

ристовують РЗК, реакцію Кумбса (для виявлення неповних антитіл), РНГА, ІФА,

РІФ, опсонофагоцитарну пробу. З них найчастіше використовують реакції Райта,

Хеддлсона і РНГА.

Реакція Райта – один із основних офіційних методів діагностики бруцельо-

зу в усіх країнах. Вона проста за технікою постановки, досить чутлива і специфіч-

на, виявляється на початку захворювання, досягає діагностичного титру на друго-

му тижні й зберігається позитивною протягом 1-4-х років. Отже, її можна викори-

стовувати як для діагностики гострого періоду хвороби, так і для встановлення

ретроспективного діагнозу. Реакцію ставлять за класичною схемою в пробірках

методом однакових об’ємів (табл. 50).

Таблиця 50

Схема постановки реакції аглютинації Райта

Номери пробірок

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 КС 7 КД

0,85 % карболізований

розчин хлориду натрію

– 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Сироватка хворого 1:25 0,5 0,5 0,5 –

Бруцельозний

діагностикум 1:10

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 – 0,5

Розведення сироватки 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:50 –

Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.

Сироватку хворого і діагностикум розводять ізотонічним розчином хлориду

натрію, до якого заздалегідь додають 0,5 % фенолу (карболізований ізотонічний

розчин). При постановці реакції Райта і Хеддлсона використовують єдиний бру-

цельозний діагностикум, який є 10 млрд зависсю убитих нагріванням і фенолом

бруцел, забарвлених аніліновим барвником у синій колір. Перед постановкою ре-

акції його розводять у 10 разів.

Пробірки струшують і ставлять у термостат на 18-20 год, потім ще витриму-

ють 2 год при кімнатній температурі й враховують результати звичайним спосо-

бом або по 50 % аглютинації (2+). Серійні розведення 50 % аглютинації 1:50,

1:100-1:800 свідчить про те, що 1 мл сироватки хворого містить відповідно 50,

100 ... 800 МО антитіл. Інтенсивність реакції оцінюють за такою схемою: 50 МО –

реакція сумнівна, 100-200 МО – позитивна, 400-800 МО – різко позитивна. Реак-

ція Райта може бути позитивною у перехворілих раніше і у щеплених осіб, тому з

розвитком хвороби її ставлять повторно і враховують наростання титру антитіл.

Часто використовують мікрометод реакції аглютинації на склі – пластинчас-

ту реакцію Хеддлсона, особливо при масових обстеженнях на бруцельоз. Для цього

добре знежирену скляну пластину 8×12 см розділяють восковим олівцем на 6 од-

накових квадратів. Нерозведену сироватку хворого і бруцельозний діагности-

236

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

кум наносять за допомогою піпеток згідно з схемою (табл. 51). Краплі сироватки

і антигену змішують обережним похитуванням пластини або скляною паличкою,

злегка підігрівають над полум’ям газового пальника. Максимальний строк спос-

тереження 8 хв. При позитивній реакції в змішаних краплях появляються пластівці,

а рідина стає більш-менш прозорою. Аглютинація в усіх 4-ох квадратах оцінюєть-

ся як різко позитивна, в 3-й і 4-й дозах – позитивна, в 2-й дозі – слабко позитивна

і лише в дозі 0,8 мл – сумнівна. Відсутність аглютинації з усіма дозами сироваток

оцінюють як негативну реакцію.

Таблиця 51

Схема постановки пластинчастої реакції Хеддлсона

Номери квадратів

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 КС 6 КД

Ізотонічний розчин Na Cl

Сироватка хворого

Діагностикум

–

0,08

0,03

–

0,04

0,03

–

0,02

0,03

–

0,01

0,03

0,02

–

0,03

–

0,03

Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.

Для прискореної діагностики бруцельозу вживають також реакцію аглюти-

нації бенгальського рожевого з кислим антигеном. Антиген готують із густої за-

висі бруцел, убитих нагріванням, з використанням буферного розчину (рН 3,6-

3,8) і барвника бенгальського рожевого. На скляну пластинку наносять 0,03 мл

нерозведеної сироватки і 0,03 мл антигену, змішують їх круговим рухом скляної

палички. Результат реакції враховують через 4 хв. Поява крупно- або дрібнозер-

нистого аглютинату свідчить про позитивну реакцію.

Реакція зв’язування комплементу ставиться за звичайною схемою. Вона стає

позитивною з 20-25-го дня захворювання й довго зберігається.

Постановку опсоно-фагоцитарної проби останнім часом проводять рідко.

Натомість стали широко використовувати РНГА.

Реакція непрямої гемаглютинації при бруцельозі є специфічною і високо-

чутливою. Для її проведення використовують еритроцитарний бруцельозний полі-

сахаридний діагностикум. Частіше РНГА ставлять у полістирилових прозорих

планшетах із лунками (можна і в пробірках).

Досліджувану сироватку (а також завідомо позитивну і негативну для конт-

ролю) інактивують при температурі 56

С протягом 30 хв. Для її серійного розве-

дення використовують нормальну сироватку кролика, заздалегідь розведену 1:100.

Реакцію ставлять за такою схемою (табл. 52).

Реакція наступає через 1-2 год при кімнатній температурі. Облік її проводять

через 2 год. Якщо гемаглютинація настає з розведенням сироватки 1:50 – реакція

сумнівна; 1:100 і вище – позитивна.

Реакція Кумбса при бруцельозі також специфічна і високочутлива. Вона є

цінним діагностичним тестом особливо при хронічних формах захворювання у

людей і тварин.

237

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Таблиця 52

Схема постановки РНГА

Номери лунок

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 КС 8 КД

Сироватка кролика 1:100

Сироватка хворого 1:50

Розведення сироватки

Діагностикум

–

0,5

1:50

0,05

0,5

1:100

0,05

0,5

1:200

0,05

0,5

1:400

0,05

0,5

1:800

0,05

0,5

1:1600

0,05

–

0,5

1:50

–

0,5

–

0,05

Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму

Алергічна проба Бюрне використовуєтся для діагностики бруцельозу, особ-

ливо при негативних бактеріологічних і серологічних дослідженнях. Пробу став-

лять, починаючи з 15-20-го дня захворювання. У середній третині передпліччя

внутрішньошкірно вводять 0,1 мл бруцеліну (мелітину, абортину). Він є протеїно-

вим екстрактом із культури бруцел. Позитивною реакцією вважають інфільтрат,

почервоніння розміром 2×3 см і більше, які виникають через 24-48 год. Алергічна

проба буває позитивною після перенесеного захворювання, а також у щеплених.

Це знижує діагностичну цінність проби Бюрне.

Сап і меліоїдоз

Сап – особливо небезпечна інфекційна хвороба, яка має гострий і хронічний

септикопіємічний перебіг з утворенням пустул, виразок, абсцесів у тканинах і

органах. Збудник – Pseudomonas mallei.

Джерелом інфекції є хворі коні, рідше віслюки, мули. Захворювання носить

чітко виражений професійний характер. Найчастіше хворіють конюхи, їздові, ко-

валі, ветеринарні і зоотехнічні працівники. Шлях передачі – контактний, внаслі-

док попадання гною чи слизу від хворих тварин на шкіру або слизову оболонку,

рідше – аліментарний, через воду. В Україні сап уже довго не реєструється, хоч

можливе завезення хвороби з країн Африки, Азії та Середнього Сходу.

Матеріалом для мікробіологічної діагностики можуть бути гній, виділення з

виразок, носоглотки, кон’юнктиви, харкотиння, кров, сеча, фекалії. Забір матеріа-

лу і його дослідження проводять в умовах, необхідних для роботи із збудниками

особливо небезпечних інфекцій.

Первинна бактеріоскопія має обмежене значення, оскільки досліджуваний

матеріал сильно контаміновий сторонньою мікрофлорою, а характерних морфо-

логічних ознак у збудника сапу немає (грамнегативні поліморфні, часом зернисті

палички без джгутиків і спор). Лише при використанні РІФ можна отримати пози-

тивні результати.

Для проведення бактеріологічних досліджень з метою виділення чистої куль-

тури патологічний матеріал сіють на гліцериновий бульйон і агар або картопляно-

гліцериновий агар, до яких можна додавати пеніцилін чи бактеріостатичні барв-

ники для пригнічення росту сторонньої мікрофлори. Виділення гемокультури про-

238

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

водять шляхом посіву 10 мл крові в 250 мл МПБ. У гліцериновому бульйоні па-

личка сапу викликає помутніння з утворенням пристінкової плівки, від якої вниз

спускаються ниткоподібні утвори. На гліцериновому агарі при 37 °С через 18-20

год появляються плоскі напівпрозорі колонії, які, зливаючись, утворюють густі

нальоти слизової маси янтарного кольору. На картопляно-гліцериновому агарі ви-

ростають ніжні напівпрозорі колонії, які через кілька днів утворюють наліт жов-

то-бурого кольору, подібний до меду.

Колонії досліджують мікроскопічно, перевіряють на рухливість, відсівають

на скошений агар для виділення чистої культури. Ідентифікацію збудника прово-

дять на основі характерних культуральних і біохімічних властивостей та реакції

аглютинації на склі специфічною діагностичною сироваткою. При неможливості

виділити чисту культуру виявляють антигени збудника в досліджуваному матеріалі

за допомогою постановки РНГА з еритроцитарним антитільним діагностикумом.

Дуже ефективним, але й небезпечним методом діагностики сапу є внутріш-

ньоочеревинне зараження самців гвінейських свинок або золотистих хом’ячків. У

тварин через 2-3 дні розвивається перитоніт і гнійний орхіт (феномен Штрауса).

Важливо пам’ятати, що скротальний феномен можуть також викликати Pseudo-

monas aeruginosa і P. рseudomallei. Є й додаткові диференціальні ознаки збудника

сапу: відсутність рухливості, росту при 42

С і розрідження желатину.

Із серологічних методів діагностики сапу застосовують реакції аглютинації,

зв’язування комплекту і непрямої гемаглютинації. РЗК є найбільш чутливою се-

рологічною реакцією. Діагностичний титр її становить 1:20 і вище.

Важливим методом діагностики захворювання є постановка алергічної про-

би з малеїном. Він є основним тестом у ветеринарній практиці при розпізнаванні

сапу у тварин. Препарат вводять у кон’юнктивальний мішок. У людей пробу з

малеїном треба ставити обережно, оскільки можливе загострення хвороби. На

внутрішній поверхні передпліччя строго внутрішньошкірно вводять 0,1 мл малеїну,

розведеного 1:1000. У зв’язку з цим розроблено більш безпечний варіант поста-

новки алергічної проби – введення малеїну на скарифіковану шкіру. Результати

реакції враховують через 24 і 48 год.

Меліоїдоз – сапоподібне особливо небезпечне захворювання людини, диких

і домашніх тварин. Збудником його є Pseudomonas pseudomallei. Хвороба реєст-

рується переважно в країнах Азії, Австралії і Карибського регіону. Можливе заве-

зення меліоїдозу із названих країн до нашої держави.

Джерелом інфекції в природі є дикі гризуни (щури, миші), домашні тварини

(коти, собаки, корови, вівці, свині, коні), кенгуру. В оточуюче середовище збудник

потрапляє з сечею, випорожненнями, гнійними виділеннями з носоглотки й очей

хворих тварин. Основний механізм передачі меліоїдозу – контактний, рідше – алі-

метарний і ще рідше – аспіраційний або трансмісивний.

Матеріалом для мікробіологічної діагностики меліоїдозу служить гній, виді-

лення з носоглотки, виразок, харкотиння, кров, сеча, випорожнення. Взяття мате-

ріалу, його транспортування і бактеріологічне дослідження проводять із такими ж

пересторогами, як і при інших особливо небезпечних інфекціях.

239

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Лабораторна діагностика меліоїдозу грунтується на тих самих принципах,

що й дослідження при сапі. Посіви матеріалу проводять на кров’яний агар і гліце-

ринові середовища з додаванням антибіотиків (неоміцин) і бактеріостатичних

барвників. Найбільш характерними ознаками для ідентифікації збудника меліої-

дозу є наступні: біполярність забарвлення, складчасті колонії і зморшкувата плівка

на бульйоні, гемоліз на 2 % кров’яному агарі, рухливість, позитивна РІФ. Досить

чутливим методом є постановка біологічної проби на гвінейських свинках і золо-

тистих хом’ячках (скротальний феномен).

Серологічна діагностика меліоїдозу має лише допоміжне значення. Викори-

стовують реакції аглютинації (діагностичний титр 1:640 і більше), зв’язування

комплементу (діагностичний титр 1:20 і вище) та РНГА.

Шкірну алергічну пробу з меліоїдином використовують лише у ветеринарній

практиці.

Сибірка (злоякісний карбункул)

Сибірка – гостре особливо небезпечне інфекційне захворювання домашніх і

диких тварин, від яких заражуються і люди шляхом прямого контакту з хворими

тваринами та різноманітною сировиною. Виділяють шкірну, легеневу й кишечну

форми хвороби.

Збудник сибірки – Bacillus anthracis – належить до роду Bacillus родини

Bacillaceae. Рід Bacillus об’єднує ще декілька видів бацил, з якими необхідно ди-

ференціювати виділені культури сибіркових паличок. Найголовніші з них –

B.сereus,B. anthracoides, B. subtilis, B. megaterium.

Взяття матеріалу і відсилка проб. При проведенні лабораторної діагнос-

тики сибірки у людини досліджують різні матеріали залежно від клінічної форми

захворювання: при шкірній формі – вміст везикул, карбункулів; при кишечній –

випорожнення; легеневій – харкотиння. Кров досліджують при всіх клінічних

формах. Від трупа беруть кров, шматочки паренхіматозних органів. Якщо негай-

но засіяти матеріал від трупа неможливо, з крові, пунктатів кісткового мозку і

селезінки на предметних скельцях готують товсті мазки і висушують.

Всі проби вміщують у скляні банки, флакони, пробірки. Висушені мазки кла-

дуть у чашки Петрі, обгортають вощаним або пергаментним папером, пакет над-

писують “Обережно, мазки нефіксовані!” Весь відібраний матеріал ретельно вкла-

дають у металевий або дерев’яний ящик, пломбують або опечатують сургучем, на

кришці пишуть “Верх, обережно!” Оформляють супровідний документ, у якому

вказують який матеріал, місце і час забору, від кого взято, і нарочним негайно

відправляють до спеціальної (режимної) лабораторії.

Розтин тварин, що загинули від сибірки, не проводять, оскільки це сприяє

споруляції і розсіюванню збудника. При необхідності дозволяється брати лише

вухо, його поміщають у банку, а місце розрізу припікають паяльною лампою або

концентрованим розчином карболової кислоти. Беруть також взірці шкір, шерсті,

вовни, щетини. У ряді випадків досліджують харчові продукти (м’ясо), воду, грунт.

240

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Лабораторна діагностика сибірки складається із декількох етапів: бактеріо-

скопії мазків, виділення та ідентифікації чистої культури збудника, постановки

біопроби, реакції термокільцепреципітації Асколі, постановки алергічної проби.

Бактеріоскопічний метод. Із крові, вмісту везикул, харкотиння виготовля-

ють по 4 мазки з кожної проби, забарвлюють їх за Грамом, Романовським-Гімзою,

сибірковою люмінесцентною сироваткою, розчином Ребігера, який одночасно

фіксує і забарвлює препарат. Із різних способів виявлення капсул метод Ребігера є

найпростішим і найдемонстративнішим (рис. 70). Беруть 15-20 г генціану фіоле-

тового і розчиняють у 100 мл 40 % формаліну. Розчин витримують при кімнатній

температурі кілька годин, потім фільтрують. Не-

фіксований мазок забарвлюють 15-20 секунд, про-

мивають, висушують. Тіло бацил забарвлюється в

темно-фіолетовий, а капсули – в червоно-фіолетовий

колір, за Романовським-Гімзою – тіло клітин набу-

ває голубого, а капсула – світло-рожевого кольору.

При обробці мазка флуоресцентною сироваткою ба-

цили сибірки під люмінесцентним мікроскопом ви-

глядають як великі палички, що оточені яскраво-

світлим зеленуватим обідком. Наявність у мазках ти-

пових бацил, що розташовуються ланцюжками,

оточеними капсулами, дають специфічну флуорес-

ценцію, обумовлює можливість поставити попе-

редній діагноз сибірки.

Бактеріологічне і біологічне дослідження. Остаточний діагноз сибірки мож-

на поставити лише після виділення чистої культури і позитивної біопроби на тва-

ринах. Досліджуваний матеріал сіють у МПБ, чашки з МПА і кров’яним агаром.

Посіви інкубують при температурі 37 °С протягом 18-20 год. Одночасно з посіва-

ми емульгованим дослідним матеріалом заражують підшкірно лабораторних тва-

рин. Білим мишам його вводять біля кореня хвоста – 0,1 мл, гвінейським свинкам

під шкіру живота – 0,2 мл, кроликам – 0,5-3,0 мл.

У бульйоні спостерігається ріст у вигляді жмутка вати, при мікроскопії якого

видно типове розташування мікробів у вигляді довгих ланцюжків (стрептобаци-

ли). На поверхні МПА виростають великі шорсткі

матові R-форми колоній з нерівним, волокнистим,

кучерявим краєм (“голова медузи”, “левова грива”).

Такі колонії необхідно вивчати під малим збільшен-

ням мікроскопа у прохідному світлі (рис. 71). На кро-

в’яному агарі колонії мають S- або SM-форму без

гемолізу, в той час як навкруги колоній антракоїдів

виникає велика зона просвітлення середовища.

На МПА і МПБ B. anthracis при звичайних

аеробних умовах росте без утворення капсул, що не

дає змоги визначити одну з найважливіших її ознак.

Рис. 70. Капсули B.anthracis

у мазку з селезінки.

Рис. 71. Колонія B. anthracis.

241

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Для виявлення капсулоутворення кращими способами є зараження білих мишей з

наступним забарвленням мазків-відбитків із органів та посіви на спеціальний елек-

тивний агар Буза (Венгрія) і Томова (Болгарія) або на середовище, що містить

розчин Хенкса і 40 % стерильної бичачої сироватки. Посіви вирощують в атмос-

фері 20-40 % CO

. Наступного дня 2-3 підозрілі колонії після мікроскопії відсіва-

ють на скошений МПА для виділення чистої культури.

Тварини гинуть через 24-36 год від гострої септицемії, проводять їх розтин,

роблять посіви із крові, селезінки та досліджують мазки-відбитки як вище описано.

На 3-й день дослідження знову заражають білих мишей, але вже чистою

культурою, проводять додаткові посіви і виконують тести для її остаточної іденти-

фікації та диференціації від антракоїдів і деяких бацил грунту. При цьому врахо-

вують головні й додаткові ознаки. До головних критеріїв відносять специфічну

патогенність, капсулоутворення, тест “перлинного намиста” на середовищі з пеніци-

ліном, лізис специфічним фагом, люмінесцентно-серологічний тест. Додатковими

ознаками є лецитиназна активність, відсутність рухливості та гемолізу (табл. 53)

Таблиця 53

Диференціальні ознаки збудника сибірки і грунтових бацил

Вид

Наяв-

ність

капсули

Пато-

ген-

ність

Лізис

специ-

фічним

фагом

Тест

"перлин-

ного

намиста"

Люмінес-

центно-

серологіч-

ний тест

Рухли-

вість

Гемо-

ліз

Леци-

тиназа

Фос-

фатаза

B. anthracis

B. anthracoides

B. subtilis

B. megaterium

B. cereus

–

Специфічну патогенність визначають введенням білим мишам 0,2 мл сус-

пензії культури. Виявлення у мазках-відбитках із органів загиблих тварин круп-

них паличок, оточених капсулою, свідчить про наявність у мікробів специфічної

патогенності (див. вкл., рис. 16). При зараженні мишей занадто великими дозами

культур грунтових бацил у тварин інколи наступає захворювання, але феномен

капсулоутворення відсутній.

Тест “перлинного намиста” проводять так. До бульйону Хоттінгера з кінською

сироваткою (30 %) добавляють пеніцилін у кількості 0,5 ОД/мл і сіють 2 краплі

молодої виділеної культури. Через 3 год росту в термостаті виготовляють мазки,

забарвлюють метиленовим синім і мікроскопують. Сибіркові бацили розташову-

ються у вигляді ланцюжків із кулястих форм, що нагадують намисто з перлин.

Сапрофітні грунтові бацили, нечутливі до пеніциліну, ростуть як звичайно, і в

мазках виявляють паличкоподібні ланцюжки.

Для виявлення фаголізабельності виділених штамів на підсушений МПА в

чашці Петрі з розкресленим на квадрати дном бактеріологічною петлею діамет-

ром 5 мм на кожен квадрат наносять велику краплю 5-6 – годинної культури. Чаш-

ку знову підсушують 30 хв і потім на центр кожної бляшки культури петлею діа-

242

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

метром 2 мм наносять маленьку краплю специфічного сибіркового бактеріофагу.

Облік результатів проводять через 5-6 год інкубації при 37 °С. Якщо культура на-

лежить до B. athracis, у місці нанесення на неї фагу видно лізис у вигляді стериль-

ної плямки. Жоден вид сапрофітних бацил нечутливий до дії специфічного фагу.

Швидко ідентифікувати виділену культуру можна також за допомогою діаг-

ностичної сибіркової сироватки, міченої флуоресцеїном (родаміном). Мазок із

капсульної культури фіксують метанолом, потім протягом 20 хв обробляють люмі-

несцентною сироваткою, промивають буферним розчином, висушують і мікро-

скопують під люмінесцентним мікроскопом. У мазках навколо клітин із капсулою

спостерігається специфічне світіння у вигляді яскраво-зелених обідків. Тепер ча-

стіше використовують непрямий варіант РІФ.

Відсутність рухливості виявляють методом надавленої (висячої) краплі або

посівом уколом у пробірку з напіврідким агаром, а відсутність гемолізу встанов-

люють після посіву на кров’яний агар. Проби на лецитиназу і фосфатазу прово-

дять за допомогою загальноприйнятих методик.

Отже, великі грампозитивні нерухливі палички з капсулами, що ростуть у

вигляді характерних R-форм колоній, високопатогенні для експериментальних

тварин, дають тест “перлинного намиста”, яскраво світяться при обробці сибірко-

вою люмінесцентною сироваткою, ідентифікують як B. anthracis.

У тих випадках, коли виділити збудника з досліджуваного матеріалу дуже

важко або взагалі неможливо (трупи тварин, шкіра, хутро, шерсть, вовна), а також

при контролі тваринної сировини на деяких виробництвах, широко використовують

дуже чутливу й специфічну реакцію термокільцепреципітації Асколі. Вона дає

змогу виявляти в матеріалі навіть незначну кількість антигена сибіркових бацил.

Термостабільний антиген із досліджуваних матеріалів екстрагують кип’яті-

нням або “холодним” способом. Спочатку матеріал подрібнюють, потім залива-

ють 10-кратним об’ємом 0,85 % розчину хлориду натрію, кип’ятять 10-15 хв,

фільтрують через азбестову вату. У деяких випадках матеріал заливають потрійним

об’ємом 0,5 % розчину оцтової кислоти. При цьому проходить більш повноцінне

екстрагування антигену.

“Холодний” метод частіше застосовують при масовому обстежені шкір та

іншої сировини. Проби матеріалу стерилізують у автоклаві, подрібнюють, залива-

ють 10-кратним об’ємом ізотонічного розчину і залишають при температурі 6-16 °С

на 20-24 год, фільтрують так само. У всіх випадках антиген має бути максимально

прозорим.

Другий компонент реакції – преципітуючу сироватку – отримують шляхом

гіперімунізації коней вакциною СТІ або вбитою культурою B. anthracis.

У преципітаційні пробірки вносять 0,2-0,3 мл преципітуючої сироватки, а

потім обережно нашаровують 0,3 мл термоекстракту. На межі двох рідин утво-

рюється через 2-5 хв тонке кільце преципітату білуватого кольору (помутніння

рідини). Появу осаду через 10 хв вважають неспецифічною реакцією. Паралельно

ставлять декілька контролів: преципітуюча сироватка + позитивний естракт; пре-

ципітуюча сироватка + естракт із несибіркового матеріалу; преципітуюча сиро-

243

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ватка + ізотонічний розчин; нормальна сироватка + термоестракт та ін. Перший

контроль має бути завжди позитивний, всі інші – негативними.

Серологічна діагностика сибірки проводиться рідко, переважно в таких

випадках, коли збудника хвороби виділити не вдається. Для виявлення антитіл у

сироватці крові хворих використовують такі високочутливі методи, як РНГА, ІФА,

реакція коаглютинації з протективним сибірковим антигеном.

Алергічний метод. Організм хворої і перехворілої на сибірку людини, а та-

кож після вакцинації реагує місцевою алергічною реакцією на внутрішньошкірне

введення алергену. Стан сенсибілізації виникає вже на 4-5 день хвороби і збері-

гається дуже довго. Алергеном для постановки проби служить антраксин – білко-

во-полісахаридний комплекс, отриманий шляхом гідролізу вегетативних форм

сибіркових бацил. Препарат вводять внутрішньошкірно на долонній поверхні пе-

редпліччя в об’ємі 0,1 мл. Результат враховують через 24 і 48 год. Пробу вважають

позитивною при виникненні гіперемії та інфільтрату діаметром понад 15 мм.

Мікробіологічна діагностика анаеробних інфекцій

До першої групи патогенних анаеробних мікроорганізмів належать збудники

правця, ботулізму, анаеробної газової інфекції, псевдомембранозного коліту та ін.

Це великі грампозитивні паличкоподібні бацили, що утворюють термінальні або

субтермінальні спори і виділяють сильні екзотоксини. Всі вони входять до роду

Clostridium родини Bacillaceae. Захворювання, які вони викликають, називають

тепер загальною назвою клостридіози.

Другу групу строгих анаеробів складають безспорові бактерії родів Bacte-

roides, Fusobacterium, Propionibacterium, Veillonella, Peptococcus і Peptostrepto-

coccus. Вони здатні викликати у людини гнійно-запальні і некротичні процеси

різноманітної локалізації.

Ботулізм

Ботулізм – тяжка, часто фатальна токсикоінфекція, яка виникає внаслідок

вживання продуктів, що містять токсини Clostridium botulinum, супроводжується

специфічними ураженнями нервової системи, переважно ядер язиково-гортанних

і окуломоторних нервів. Інколи хвороба розвивається після інфікування ран клос-

тридіями ботулізму.

C. botulinum продукує 8 типів сильних токсинів: А, В, С

, С

, D, Е, F, G, які

відрізняються антигенною специфічністю, що необхідно враховувати при прове-

денні лабораторної діагностики і лікуванні. Ботулізм у людей викликають типи А,

В, Е і F, типи С і D – у ссавців і птахів. Патогенність типу G для людини і тварин

не доведена.

Основним резервуаром і джерелом інфекції в природі є теплокровні травоїдні

тварини, в кишечнику яких клостридії розмножуються і з фекаліями у великій

кількості потрапляють у грунт і воду. Тут вони перетворюються в спори і дуже

244

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

довго зберігаються. Захворювання виникає при споживанні в їжу м’ясних, риб-

них та інших, переважно консервованих продуктів, у яких нагромаджуються кло-

стридії ботулізму та їх токсини. Небезпечними є консервовані продукти домашньо-

го приготування, особливо гриби.

Лабораторна діагностика ботулізму спрямована на виявлення токсину в ма-

теріалах, взятих у хворих, а також харчових продуктах, що спричинили отруєння.

Токсин визначають шляхом постановки біопроби і встановлення його типу в ре-

акції нейтралізації. Значно рідше виділяють чисту культуру збудника і проводять

серологічні дослідження.

Взяття матеріалу. В усіх випадках захворювань із симптомами ботулізму

у хворих обов’язково беруть промивні води шлунка, блювотні маси, кров, фекалії,

сечу; від трупа – вміст шлунка і кишок, лімфатичні вузли, шматочки печінки, го-

ловного і спинного мозку. Необхідно досліджувати і залишки підозрілої їжі.

Кров у хворого в кількості 10 мл беруть до введення ботулінових лікуваль-

них сироваток у пробірку з лимоннокислим натрієм у співвідношенні 3:1. Про-

мивні води шлунка, блювотні маси (100-200 мл) та випорожнення (50-60 г) вміщу-

ють у скляні банки з гумовими корками. Консервуючі речовини добавляти не мож-

на. При взятті секційного матеріалу 50-60 г кожного органу вміщують у окрему

банку. Залишки їжі відбирають по 200-300 г.

Щільні матеріали спочатку розтирають у ступках, вносять подвійний об’єм

ізотонічного або желатино-фосфатного розчину і залишають при кімнатній тем-

пературі на 2 год для екстрагування токсину. Екстракт центрифугують, рідину над

осадом використовують для поставки біологічної проби. Кров вводять без будь-

якої обробки.

Проби, що доставлені до лабораторії, досліджують одночасно у двох напрям-

ках: 1) для виявлення ботулотоксинів; 2) з метою виділення C. botulinum. Одно-

часно в тих же пробах вияляють і C. perfringens.

Виявлення ботулінових токсинів. Наявність ботулінового токсину в дослі-

джуваному матеріалі і визначення його типу проводять за допомогою реакції ней-

тралізації на білих мишах. Для цього відбирають 5 пар мишей вагою 16-18 г на

кожну пробу. В реакції використовують діагностичні (не лікувальні!) антитоксичні

ботулінові сироватки типів A, B, E, F, які розводять 0,85 % розчином хлориду

натрію до 100-200 МО/мл, що забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в

досліджуваній пробі.

Центрифугат доставлених матеріалів або кров хворого розливають по 1,4 мл у

5 пробірок. У перші чотири з них вносять по 0,6 мл (200 МО/мл) антитоксичних

протиботулінових сироваток відповідно типів A, B, E і F. У останню пробірку до-

бавляють 0,6 мл нормальної сироватки. Всі пробірки витримують 40 хв при

кімнатній температурі для нейтралізації токсину. По 1-му мл суміші з кожної пробір-

ки вводять п’яти парам мишей (центрифугат + сироватки – підшкірно, кров + сиро-

ватки – в черевну порожнину). За тваринами спостерігають протягом 3-4-х днів.

При наявності в досліджуваному матеріалі ботулінового токсину гинуть чоти-

ри пари мишей, окрім двох, яким була введена суміш матеріалу з тим типом сироват-

245

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ки, що нейтралізувала дію гомологічного типу токсину. При загибелі всіх мишей

пробу треба повторити з розведеним в 10, 20, 100 разів біологічним матеріалом.

Постановка реакції нейтралізації з визначенням типу ботулотоксину має важ-

ливе значення при виборі відповідної сироватки для специфічного лікування бо-

тулізму. Тому при видачі відповіді про виявлення ботулінового токсину лаборато-

рія повинна обов’язково вказувати його тип.

Якщо бактеріологічна лабораторія має типові антитоксичні ботулінові ерит-

роцитарні діагностикуми, серотип токсину краще визначати за допомогою реакції

непрямої гемаглютинації. Вона високоспецифічна, чутлива, значно економічніша,

швидше дає результат, ніж реакція нейтралізації in vivo. Для виявлення збудника

ботулізму чи його токсину можна також застосовувати метод ІФА та імуноелектро-

форезу.

Професор С.М. Мінервін і його співробітники у 1959 р. розробили прискоре-

ний метод діагностики ботулізму за допомогою визначення фагоцитарного показ-

ника. Він грунтується на тому, що ботулотоксини різко пригнічують фагоцитарну

функцію лейкоцитів. Гомологічна антитоксична ботулінова сироватка нейтралі-

зує лейкотоксичну дію екзотоксину, чого немає при дії гетерологічних сироваток.

Дослід ставлять із використанням мікродоз компонентів. У 5 маленьких про-

бірок вносять піпеткою Панченкова по одному об’єму лимоннокислого натрію

(

поділок піпетки до мітки 75) і по два об’єми крові хворого. Потім у пробірку

№ 1 добавляють один об’єм 0,85 % розчину хлориду натрію, а в пробірки № 2, 3,

4 і 5 – відповідні діагностичні ботулінові сироватки типів A, B, E, F у тому ж

об’ємі. Після перемішування всіх компонентів пробірки ставлять у термостат на

30 хв для нейтралізації можливого токсину в крові хворого гомологічною сиро-

ваткою і в усі пробірки вносять по одному об’єму 1 млрд зависі культури золоти-

стого стафілокока і знову вміщують у термостат на 20 хв для завершення процесу

фагоцитозу. Із вмісту кожної пробірки готують мазки, фарбують за Романовсь-

ким-Гімзою і визначають фагоцитарний показник. Для цього підраховують

кількість поглинених коків у 50 полінуклерах і ділять отримане число на 50. Якщо

в крові хворого є токсин, то фагоцитарні показники в усіх пробах крові будуть

низькі, за винятком показника в тій пробірці, де тип токсину і сироватки гомо-

логічні. У тяжких випадках ботулізму фагоцитарний показник може падати до

нуля. Гомологічна сироватка, нейтралізуючи токсин, відновлює цей показник до

норми. Метод не можна використовувати для виявлення ботулотоксину в харчо-

вих продуктах і секційному матеріалі.

Виділення культур C. botulinum. До посіву досліджуваний матеріал емуль-

гують у фарфорових ступках як вище вказано. По 10 мл матеріалу сіють у 4 фла-

кони з 75-150 мл свіжорегенерованого рідкого середовища (Кітта-Тароцці, Хоттін-

гера, казеїново-грибного). Два флакони прогрівають: один при 60 °С протягом

15 хв (для селекції C. botulinum типу Е), другий – 20 хв при 80 °С. Два флакони

інкубують при 28 °С (для типів E і F) решту – при 35 °С в анаеростаті або під

шаром вазелінового масла товщиною 0,5 см. На 2, 4, 6 і 10-й день із флаконів, де є

ріст, виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Збудник боту-

246

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

лізму має вигляд крупних грампозитивних паличок

із овальною субтермінальною спорою, що нагаду-

ють тенісні ракетки (рис. 72).

Щоб визначити тип ботулотоксину з флакона

відбирають 10-15 мл культуральної рідини, центри-

фугують її і ставлять реакцію нейтралізації на білих

мишах або РНГА з типовими ботуліновими сироват-

ками, як вище описано.

Для отримання ізольованих колоній з метою

виділення чистої культури краплю культуральної

рідини з флакона вносять на поверхню анаеробного

кров’яного або печінкового агару і втирають скля-

ним шпателем в агар послідовно в трьох чашках. Посіви вирощують в анаероста-

тах. Через 48 год інкубації вивчають характер колоній. На кров’яному агарі ко-

лонії можуть бути неправильної форми з фестончастими краями, або гладенькі,

круглі, із зонами гемолізу навколо них. Різні типи C. botulinum можуть утворюва-

ти неоднакові колонії. При посіві уколом у високий стовпчик цукрового агару ко-

лонії мають вигляд чечевичок або жмуточків вати.

Після мікроскопування типових колоній їх відсівають на середовище Кітта-

Тароцці, отримують чисту культуру та ідентифікують її за морфологічними, куль-

туральними, токсигенними та біохімічними властивостями шляхом посіву в сере-

довища Гісса. Палички ботулізму ферментують глюкозу, галактозу, гліцерин, маль-

тозу, сахарозу, фруктозу до кислоти і газу, розріджують желатин, виділяють H

не утворюють індол. Для диференціації C. botulinum від інших анаеробів викори-

стовують і інші тести (табл. 54).

Таблиця 54

Диференціальна характеристика анаеробних мікроорганізмів

Ферментація

Вид

Рухли-

вість

Леци-

тіназа

Ліпаза

Глюкоза Лактоза Маніт

Індол

С. botulinum

C. difficile

C. histolyticum

C. novyi

C. perfringens

C. septicum

C. sordellii

C. sporogens

C. tetani

Визначення сероварів збудника ботулізму здійснюють за допомогою реакції

нейтралізації токсину in vivo, методом ІФА або в РНГА.

Методика виділення C. perfingens при харчових отруєннях викладена в розділі

анаеробної газової інфекції.

Рис 72. C. botulinum.

247

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Правець

Правець (стовбняк) – гостра ранова інфекція людей і тварин, що розвиваєть-

ся в результаті ураження токсином нейромоторних клітин спинного і головного

мозку, проявляється розвитком тонічних і тетанічних скорочень м’язів. Збудник –

Clostridium tetani – тонкий, довгий, рухливий мікроб із термінальною круглою

спорою, яка надає йому вигляд барабанної палички. Вона має О- і Н-антигени, за

характером яких збудник правця поділяють на 10 серотипів, але всі вони виділя-

ють однаковий, тотожний токсин.

Джерелом правцевих клостридій є тварини (вівці, коні, кози, корови, свині),

у кишечнику яких вони постійно знаходяться у складі нормальної мікрофлори. Із

фекаліями тварин мікроби потрапляють у грунт, переходять у спорову форму і

зберігаються роками. Хвороба розвивається лише тоді, коли збудник проникає в

організм через ушкоджену шкіру, м’язи, слизову оболонку при пораненнях,

ін’єкціях, опіках, обмороженнях, пролежнях тощо.

Мікробіологічні дослідження з метою діагностики правця проводять рідко.

Клінічна картина хвороби настільки характерна, що необхідність вдаватись до

бактеріологічної діагностики просто відпадає. Лише у випадках нетипового або

летального її перебігу, при розвитку правця після підпільних абортів чи пологів у

домашніх умовах, а також коли виникає правець новонароджених, такі дослідження

необхідно рекомендувати. Значно частіше проводять виявлення C. tetani у шов-

них і перев’язувальних матеріалах, лікарських препаратах для парентерального

введення, у пробах грунтів тих регіонів, де реєструється висока захворюваність

на стовбняк.

Взяття матеріалу. Від хворих на дослідження беруть гній, рановий вміст,

ексудат, шматочки некротизованих тканин, тампони з рани, сторонні тіла; від по-

мерлих – кров, рановий вміст, старі рубці, селезінку. У випадках виникнення правця

після абортів і пологів досліджують виділення та біоптати з вагіни і матки; при

захворюванні новонароджених – виділення з пупка. Всі матеріали негайно на-

правляють до бактеріологічної лабораторії краще в спеціальних транспортних се-

редовищах, захистивши їх від згубної дії кисню повітря.

Первинна бактеріоскопія. Із патологічного або секційного матеріалів виго-

товляють декілька мазків та препаратів-відбитків, забарвлюють за Грамом, Ожешко

(для виявлення спор) і мікроскопують під імерсійною системою. Наявність у маз-

ках довгих грампозитивних паличок з круглими термінальними спорами при

відповідній клінічній картині дає змогу запідозрити присутність C. tetani (рис. 73).

Але на основі лише мікроскопічного дослідження не можна робити висно-

вок, оскільки в матеріалі можуть бути подібні за морфологією непатогенні мікро-

організми (C. pseudotetanicum, C. tetanomorphum).

Бактеріологічне і біологічне дослідження. Отриманий в лабораторії матері-

ал розтирають у стерильних ступках із піском, добавляючи середовище для конт-

ролю стерильності до отримання 10 % суспензії. Рідку фазу матеріалу розділяють

на дві рівні частини, одну з яких прогрівають при 80 °С протягом 20 хв. Це при-

248

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

зводить до загибелі вегетативних клітин бактерій і

значно підвищує шанси на виділення C. tetani. Далі

грітий і негрітий матеріал досліджують паралельно.

Для нагромадження анаеробних клостридій

обидві порції висівають у дві пробірки з середови-

щем Кітта-Тароцці (або тіогліколевим бульйоном).

Одночасно для отримання ізольованих колоній роб-

лять посів на чашку з анаеробним кров’яним агаром

такого складу: до еритрит-агару добавляють 10 %

середовища 199, 10 мкг/мл метадіону, 10 мкг/мл ге-

міну, 10 мг/мл цистину, 0,1 % твіну – 80 і 5 % дефіб-

ринованої крові барана або кролика. При сильному

забрудненні проб сторонньою мікрофлорою до агару ще додають неоміцин, ген-

таміцин або налідиксову кислоту в кількості 40-50 мкг/мл.

Посіви інкубують в анаеробних умовах при температурі 37 °С протягом

48-72 год. Колонії C. tetani на кров’яному агарі плоскі, напівпрозорі, з нерівними

краями, нерідко у вигляді переплетених ниток, що нагадують павучків. Навколо

колоній виникає зона гемолізу (рис. 74). Якщо колонії відсутні, роблять висів із

середовищ накопичення на кров’яний агар. При посіві уколом у високий стовпчик

цукрового агару колонії C. tetani нагадують хмаринки або жмуточки вати.

Виділену чисту культуру ідентифікують за морфологічними, культуральни-

ми ознаками і обов’язково шляхом визначення токсигенності, яка є вирішальним

тестом при діагностиці правця. Для виявлення токсичної дії культури або первин-

ного досліджуваного матеріалу ставлять біологічну пробу нейтралізації токсину

правцевою сироваткою на тваринах.

Правцевий токсин отримують шляхом вирощування культури в середовищі

Кітта-Тароцці протягом 2-3 діб з наступною фільтрацією або центрифугуванням

бульйону. Двом білим мишам внутрішньом’язево (біля кореня хвоста) вводять по

0,5 мл суміші фільтрату з правцевою антитоксичною сироваткою (200 МО). Суміш

попередньо витримують у термостаті 40-60 хв. Спостереження за мишами прово-

дять протягом 4-5 діб. Якщо у фільтраті містився правцевий екзотоксин, заражені

миші гинуть при явищах висхідного правця. Конт-

рольні тварини залишаються живими. Аналогічно

біопробу ставлять і з досліджуваним матеріалом (роз-

терті в ізотонічному розчині шматочки тканин, гній,

ексудат тощо). Виникає така ж сама клінічна карти-

на правця, як і після введення токсину, а антисиро-

ватка нейтралізує присутній токсин.

Для виявлення правцевого токсину в середови-

щах накопичення, а також для ідентифікації виділе-

ної чистої культури C. tetani використовують

високоспецифічну й більш економічну реакцію не-

прямої гемаглютинації. У ряді лунок полістироло-

Рис.74. Колонії C. tetani.

Рис. 73. C. tetani.

249

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

вої пластини роблять розведення культуральної рідини в буферному розчині з кро-

лячою інактивованою сироваткою від 1:10 до 1:1280. Потім у кожну лунку вно-

сять по 0,1 мл правцевого еритроцитарного антитільного діагностикуму (суспен-

зія еритроцитів барана, сенсибілізованих правцевою антитоксичною сироваткою).

Пластини з лунками вміщують у термостат на 60 хв, потім залишають при кімнатній

температурі. Попередній результат враховують через 3 год, остаточний – через 18

год. При наявності правцевого токсину в ряді лунок появляється феномен гема-

глютинації.

Для ідентифікації C. tetani в різних об’єктах можна використовувати люмінес-

центно-серологічний метод, застосувавши протиправцеву антимікробну сироват-

ку, мічену ізотіоціанатом флуоресцеїну, а також метод імуноферментного аналізу.

Спеціально для виділення чистої культури збудника правця Філдс запропо-

нував оригінальний спосіб: кілька крапель прогрітого при 60 °С протягом 90 хв

досліджуваного матеріалу або культури із рідкого середовища накопичення сіють

у конденсаційну рідину на дні пробірки зі скошеним кров’яним чи сироватковим

агаром. Посів вирощують 18-24 год в умовах строгого анаеробіозу. Збудник прав-

ця завдяки своєму повзучому росту, обумовленому джгутиками, росте у вигляді

тоненької плівки по всій поверхні середовища. З верхньої частини плівки роблять

3-5 таких пересівів до отримання чистої культури.

Серологічний метод діагностики правця практично не використовується.

Лише для контролю ефективності вакцинації правцевим анатоксином (визначен-

ня рівня антитоксину в крові) вибірково проводять постановку реакції нейтралі-

зації, РНГА, ІФА.

Ранова анаеробна газова інфекція

Анаеробна газова інфекція (клостридіальний міозит, газова гангрена) – гостра,

тяжка, поліетіологічна ранова інфекція, яку викликають бактерії роду Clostridium

в асоціації між собою і умовно-патогенними мікроорганізмами. Основними збуд-

никами захворювання є Clostridium perfrigens, C. novyi (oedematiens), C. septicum

(див. вкл., рис. 17). Значно рідше зустрічаються C. histolyticum, C.sordellіi, C. fallax.

Із аеробних бактерій у рановому вмісті виявляють протей, стафілококи, кишкові

палички та ін. C. perfrigens може викликати харчові токсикоінфекції.

В якості досліджуваного матеріалу беруть шматочки уражених тканин, рано-

вий вміст, eкcудат, випіт при набряках; при харчових токсикоінфеціях – блювотні

маси, промивні води шлунка, випорожнення, кров, залишки підозрілої їжі. В разі

необхідності досліджують перев’язувальний та шовний матеріал (шовк, кетгут),

одяг, грунт, секційний матеріал (шматочки некротизованих тканин, печінки, селе-

зінки). З метою попередження шкідливої дії кисню повітря на анаеробну мікро-

флору тверді матеріали для дослідження краще брати у короткі пробірки, що гер-

метично закриваються. Рідкі досліджувані матеріали можна набирати у шприц,

на голку насадити гумовий корок і в такому вигляді транспортувати до лабо-

раторії.

250

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Мікробіологічна діагностика газової гангрени зводиться до виділення чис-

тих культур збудників, їх ідентифікації на основі морфологічних, культуральних і

біохімічних властивостей та визначення типів токсинів.

Бактеріоскопія є необхідним етапом для орієнтації в характері ранової

мікрофлори. Для цього готують мазки-відбитки з уражених тканин, ексудату чи

випоту, забарвлюють за Грамом або метиленовою синькою. Наявність у мазках

великої кількості крупних грампозитивних паличок зі спорами чи капсулами

(C. perfringens) або без них може служити ознакою можливого розвитку газової

гангрени (рис. 75).

Рис. 75. C. Perfringens: 1 – вегетативні форми; 2 – капсули; 3 – спори.

1 2 3

З метою орієнтовної ідентифікації клостридій можна використати люмінес-

центно-серологічний метод, коли мазки обробляють діагностичними флуоресцен-

тними сироватками. За видом сироватки, яка викликає специфічне світіння навколо

оболонок бактерій під люмінесцентним мікроскопом, визначають вид збудника.

Бактеріологічне дослідження. Рідкі досліджувані матеріали сіють у натив-

ному вигляді. Шматочки уражених тканин та інші щільні матеріали спочатку го-

могенізують у фарфорових ступках з піском, добавляючи рівний об’єм ізотоніч-

ного розчину хлориду натрію. Будь-який матеріал розділяють на 2 частини; одну з

них прогрівають 20 хв при 80 °С, другу не піддають термічній обробці. Обидві

проби паралельно висівають на спеціальні сердовища для культивування анае-

робних мікроорганізмів.

Для первинного накопичення анаеробів широко використовують середови-

ще Кітта-Тароцці. На ньому C. perfringens росте з інтенсивним помутнінням і бурх-

ливим газоутворенням. Інші види утворюють помутніння і менше виділення газу

або без нього (C. histolyticum). При посіві на стерильне знежирене лакмусове молоко

C. perfringens вже через 4-5 год викликає його звудження з утворенням цегляного

кольору губчастого згустка, який газ підіймає на поверхню пептонізованої рідини.

Класичним середовищем для отримання ізольованих колоній є кров’яний

цукровий агар Цейслера (до МПА додають 1,5 % дефібринованої крові і 2 % глю-

кози). Чашки з посівами вирощують в анаеростаті. На цьому агарі колонії основ-

них збудників мають гладеньку дископодібну форму сіруватого кольору з рівними

або бахромчастими краями і піднятим центром, оточені зоною гемолізу (рис. 76).

251

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

На середовищі Вілліса-Хоббса (МПА з лакто-

зою, індикатором нейтральним червоним, яєчним

жовтком і знежиреним молоком) колонії C. perf-

ringens червоного кольору і зоною опалесценції;

колонії C. novyi безбарвні (не розкладають лакто-

зи), але із зоною опалесценції; колонії С. septicum

червоні; навколо колоній C. histolyticum є зона про-

світлення.

Колонії C. histolyiticum, С. sordellii безбарвні,

а ореол опалесценції мають лише колонії C. sor-

dellii. На кров’яному агарі з бензидином колонії

C. novyi чорніють після перебування на повітрі.

При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через 3-4

години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Характерні особли-

вості росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експрес-

діагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.

Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікро-

скопують, пересівають на середовище Кітта-Тароцці, отримують чисту культуру

й ідентифікують її за морфологічними, культуральними і біохімічними властиво-

стями. Важливе значення має визначення типів екзотоксинів.

При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних

умов ізольовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву

різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом

Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолоджено-

му до 45 °С цукровому агарі, розлитому в пробірки по 10 мл. Із кожного розведен-

ня агар натягують у трубки, а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інку-

бації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними

колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії пет-

лею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й іден-

тифікують їх.

У ряді розвинутих країн оранізовані спеціальні лабораторії, в яких викорис-

товують сучасні апарати і тест-системи для культивування й ідентифікації ана-

еробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при

повній відсутності кисню повітря.

Однак у рутинних бактеріологічних лабораторіях виділення і повну ідентифі-

кацію чистих культур проводять рідко, оскільки весь процес займає багато часу,

вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів. У

зв’язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору

відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів

екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.

Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використову-

ють видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) буль-

йонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл

Рис. 76. Зони гемолізу навколо

колоній C. perfringens.

252

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до

основних видів збудників (табл. 55). У 6-у пробірку вносять 0,6 мл ізотонічного

розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом

40 хв і кожну з них в об’ємі 0,5 мл вводять внутрішньовенно двом мишам. Видову

належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі

тварин контрольної та інших дослідних груп.

У лабораторіях, де є можливості працювати з культурами тканин, реакцію ней-

тралізації ставлять на трипсинізованих клітинах 10-12 денних курячих ембріонів.

Токсигенність можна визначити ще на етапі росту ізольованих колоній. Для

цього колонію емульгують на склі у краплі акридинового оранжевого, накрива-

ють покривним скельцем і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. На-

явність тільки зелених паличок свідчить про їх токсигенність. Червоні або зелені

з червоними фрагментами бактерії виявляють при слабкій продукції токсинів або

при повній їх відсутності.

Можна встановити вид і тип токсину в реакції преципітації на склі у агарово-

му гелі з фільтратом та відповідними антисироватками в реакції гальмування in

vitro специфічними антитілами лецитиназної чи лейкотоксичної активності

фільтратів або ранових ексудатів.

Ще швидше і точніше встановлюють види збудників газової гангрени за до-

помогою газової хроматографії, яка дозволяє визначати їх за якісним і кількісним

вмістом насичених і ненасичених жирних кислот.

Діагностику харчових токсикоінфекцій, викликаних C. perfringens типів А і

С, проводять за допомогою бактеріологічного дослідження з метою виділення збуд-

ника, визначення масивності контамінації ним харчових продуктів і типу токсинів.

Виділення чистих культур проводять так само, як і при анаеробній газовій

інфекції (висів матеріалу на середовища Цейслера, Вілліса-Хобса або в трубки

Віньяль-Вейона, отримання ізольованих колоній, чистих культур, ідентифікація).

Таблиця 55

Схема постановки реакцій нейтралізації на білих мишах

Антитоксичні сироватки

№

пробірок

Центри-

фугат

культури,

мл

C.perf-

ringens

C.novyi C.septicum C.sordellii

C.histo-

lyticum

0,85%

розчин

NaCl

1 0,9

0,6 мл

50МО

2 0,9

0,6 мл

50МО

3 0,9

0,6 мл

100МО

4 0,9

0,6 мл

100МО

5 0,9

0,6 мл

100МО

6 0,9 0,6 мл

253

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

При цьому обов’язково сіють10 мл крові хворого в 150-200 мл середовища Кітта-

Тароцці з метою виділення C. perfringens. Із фільтратом культури важливо поста-

вити реакцію нейтралізації на мишах для визначення типу екзотоксину.

Важливо провести і кількісний мікробіологічний аналіз. Для цього дослі-

джуваний матеріал розводять у пептонній воді від 10

-1

до 10

-10

і по 1 мл кожного

розведення засівають у розтоплене і охолоджене до 45 °С середовище Вільсона-

Блера. Через 6-8 год інкубації при температурі 45-46 °С (або 20 год при 37 °С)

відбирають ті проби, в яких виросло 10-30 колоній, і обчислюють кількість бак-

терій в 1 мл посівного матеріалу, враховуючи ступінь розведення і посівну дозу.

Для швидкого виявлення C. perfringens досліджуваний матеріал сіють у про-

бірку з лакмусовим молоком. Через 4-5 год відбувається характерне утворення

губчастого згустка і просвітлення сироватки.

Діагноз харчової токсикоінфекції встановлюють тоді, коли виявляють значне

обсіменіння (10

і більше в 1 г) тих продуктів, що спричинили захворювання, виді-

ляють C. pergringens типів А і С і відповідні екзотоксини, або ж висівають з крові

хворого C. perfringens будь-якого серотипу ( A, B, C, D, E, F).

Діагностика псевдомембранозного коліту. C. difficile є частим нозокоміаль-

ним патогеном, який у 90-100 % випадків викликає це захворювання на фоні нераці-

ональної терапії антибіотиками (ампіцилін, кліндаміцин, цефалоспорини). Вказані

препарати викликають глибокий дисбаланс мікрофлори кишечника і колонізацію

слизової C. difficile. Бактерії продукують 2 види токсинів – ентеротоксин (токсин

А) і цитотоксин (токсин В).

Лабораторний діагноз псевдомембранозного коліту потребує взяття псевдо-

мембран при колоноскопії і виділення збудника з біоптатів слизової оболонки сліпої

кишки або випорожнень. C. difficile висівається майже від усіх хворих за допомо-

гою тих же методів, що і при інших анаеробних інфекціях. “Золотим стандартом”

є цитотоксичний тест: фільтрат фекалій або культури вносять у флакон з моноша-

ром культури клітин, в результаті цього виникає цитопатична дія, що нейтралі-

зується специфічною антисироваткою. На жаль, він досить громіздкий і забирає

багато часу.

Швидка латекс-аглютинація застосовується часто, але вона не є високо-спе-

цифічною і часто дає хибно-позитивні і хибно-негативні результати. Більш точним

і високоспецифічним є імуноферментний аналіз, який дає змогу надійно виявляти

цитотоксин і ентеротоксин C. difficile.

Бактероїдози

Анаеробні інфекції можуть викликати не лише клостридії, а й грамнегативні

поліморфні аспорогенні бактерії з родини Bacteroidaceae. Найчастіше гнійно-сеп-

тичні процеси спричиняють представники родів: Bacteroides (B. fragilis); Prevotella

(P. melaninogenicus та ін.); Fusobacterium (F. nucleatum, F. necrophorum); Veillonella

(V. atipica, V. parvula). Захворювання, що вони викликають, дістали назву бакте-

роїдозів, фузобактеріозів, вейлонельозів. Це можуть бути септицемії, апендици-

254

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ти, перитоніти, менінгіти, абсцеси, гангрени органів, виразки шкіри, ураження

дихальних і сечостатевих шляхів тощо. Часто вони виникають як ускладнення

після оперативних втручань на товстому кишечнику, сечових шляхах, матці, в ро-

товій порожнині.

Діагностика бактероїдозів. Єдиним ефективним методом розпізнавання

захворювань, викликаних бактероїдами, є бактеріологічний. Принцип взяття і

транспортування досліджуваних матеріалів (кров, ліквор, гній, харкотиння, сеча,

кал, шматочки уражених тканин та ін.) такі самі, як і при анаеробній газовій

інфекції. Слід уникати контакту проб з атмосферним повітрям. Найбільш опти-

мальним є взяття аспіратів і доставка їх у шприцах з видаленим повітрям.

Після первинної мікроскопії матеріалу його сіють на спеціальні живильні

середовища (кров’яний, сироватковий, тіогліколевий агар з додаванням екстрактів

з мозкової тканини, геміну, вітаміну К). Культивують у строгих анаеробних умо-

вах в атмосфері 10 % CO

при 37 °С.

У мазках, забарвлених за Грамом, B. fragilis мають вигляд прямих або трохи

зігнутих грамнегативних паличок, без спор і капсул, розташованих поодинці, па-

рами або короткими ланцюжками з 3-4 клітин (див. вкл., рис. 18). При забарв-

ленні метиленовим синім часто фарбуються біполярно.

Бактероїди ростуть повільно (5-7 днів). Колонії B. fragilis дрібні (до 1 мм),

трохи вгнуті, сірувато-білі, без зон гемолізу. B. melaninogenicus на кров’яних

середовищах утворює гладенькі або шорсткі колонії діаметром 1-3 мм чорного

кольору, інколи із зоною гемолізу навколо них.

Виділені чисті культури ідентифікують за морфологічними, культуральними

і біохімічними властивостями. Штами B. fragilis розкладають глюкозу, лактозу,

сахарозу, не ферментують рамнозу, не утворюють індолу, але виділяють сірково-

день. Ключові ознаки для ідентифікації виду – ріст на середовищі з 20 % жовчних

солей, резистентність до канаміцину (100 мкг), ванкоміцину (5 мкг) і колістину

(10 мкг), яку визначають методом дисків.

Культури B. melaninogenicus розкладають глюкозу, лактозу і сахарозу, не фер-

ментують маніт, гідролізують крохмаль і глікоген. Ключовими ознаками виду є

утворення пігменту, відсутність росту на жовчних середовищах, чутливість до

колістину, стійкість до ванкоміцину і канаміцину.

Слід пам’ятати, що бактероїдози є класичними поліінфекціями. У зв’язку з

цим монокультури виділяються рідко, а частіше у вигляді асоціацій із клостриді-

ями, фузобактеріями, вейлонелами. Це значною мірою ускладнює проведення

мікробіологічної діагностики. Монокультури бактероїдів легко виділити при по-

сівах крові та спинномозкової рідини.

При септицеміях, тяжких запальних і гангренозних процесах у крові хворих

швидко і в значних кількостях виробляються антитіла. Це дає можливість провес-

ти серологічні дослідження. Високі титри антитіл визначають за допомогою ре-

акцій аглютинації, преципітації в гелі і непрямої гемаглютинації.

Діагностика фузобактеріозів. Гнійні і гангренозні процеси, особливо в ро-

товій порожнині, в верхніх дихальних шляхах і сечостатевих органах можуть спри-

255

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Рис. 77. F. nectophorum (1)

i T. vincetii (2).

чинити і фузобактерії. Лабораторну діагностику захворювань проводять за тими

ж методами, що і при інших анаеробних інфекціях. Використовують мікроскопіч-

ний, бактеріологічний і біологічний методи.

Бактеріоскопічні дослідження проводять при діагностиці уражень шкіри

і слизових оболонок. Матеріал для виготовлення мазків беруть на межі здорової і

ураженої тканини. Для забарвлення використовують метод Грама або Лефлера.

При мікроскопії F. nucleatum і F. necrophorum виглядають як довгі грамнегативні

бактерії веретеноподібної форми із загостреними кінцями, інколи з гранулами в

середині клітин. Вони не мають ні спор, ні капсул.

Для бактеріологічного дослідження беруть гній із виразок або порожнин при

ураженні внутрішніх органів. Посіви роблять на сироваткові і кров’яні середови-

ща. Асцитична рідина, цистеїн, екстракт із дріжджів і вуглекислий газ стимулю-

ють ріст фузобактерій. Вони ростуть у присутності генціанового фіолетового та

інших барвників, що використовують для виготовлення селективних середовищ.

На печінковому або серцево-мозковому бульйоні з глюкозою під вазеліновим мас-

лом фузобактерії утворюють гранулярний і слизовий осад та помутніння з харак-

терним запахом сиру. На сироватковому агарі в строго анаеробних умовах вони

ростуть у вигляді маленьких (1-2 мм), круглих, опуклих, непрозорих колоній із

жовтуватим центром. На кров’яному агарі навколо них виникають зони гемолізу.

В разі отримання чистих культур їх ідентифікують за морфологічними, куль-

туральними і біохімічними ознаками. Ріст фузобактерій пригнічують жовчні кис-

лоти, колістин і канаміцин, але не ванкоміцин. Вони утворюють велику кількість

масляної кислоти.

Практичне значення має виявлення симбіозу Fusobacterium necrophorum і

Treponema vincentii при ерозивно-некротичній ангіні Симановського-Плаута-Вен-

сана, а також при ерозивно-некротичних ураженнях чоловічих і рідше жіночих

статевих органів.

Мікробіологічна діагностика цих захворювань часто обмежується мікроско-

пічним дослідженням патологічного матеріалу (рис. 77).

Біологічний метод частіше використовують при роботі з сильно забрудненим

сторонньою мікрофлорою матеріалом, який вво-

дять білим мишам підшкірно біля кореня хвоста.

Після загибелі тварин у місці некрозу на межі здо-

рової і ураженої тканини легко виявляють збудни-

ка мікроскопічно або виділяють його чисту куль-

туру при некротичній ангіні.

Діагностика вейлонельозу. Дрібні, грамнега-

тивні аспорогенні анаеробні коки (вейлонели) по-

стійно знаходяться в ротовій порожнині, дихаль-

них шляхах і кишечному тракті як представники

фонового мікробіоценозу. Самостійно вони рідко

спричиняють розвиток патологічних процесів. Ча-

стіше в асоціації з іншими патогенними анаероба-

256

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ми і аеробами здатні викликати абсцеси м’яких тканин, ранові інфекції і навіть

септичні стани.

При лабораторній діагностиці вейлонельозу патологічний матеріал досліджу-

ють мікроскопічно і бактеріологічно. У мазках, забарвлених за Грамом, V. atipica

і V. parvula мають вигляд кокоподібних бактерій діаметром 0,3-0,5 мкм, що розта-

шовуються парами, короткими ланцюжками або хаотичними скупченнями.

На молочному агарі в анаеробних умовах основні види вейлонел утворюють

непрозорі, ромбо- або зіркоподібні колонії розміром 1-3 мм. Вони не виділяють

каталазу, не розкладають вуглеводів, не розріджують желатин, не утворюють індол,

стійкі до ванкоміцину (500 мкг). Виділено декілька сероварів кожного виду, але

серологічна ідентифікація вейлонел у звичайних бактеріологічних лабораторіях

не проводиться.

Пептококові і пептострептококові анаеробні інфекції. В окремих випад-

ках гнійні і гнійно-септичні захворювання (плеврит, тонзиліт, пієліт, цистит, апен-

дицит, післяпологовий сепсис, нагноєння ран та ін.) викликають грампозитивні

коки родини Peptоcoccaceae. Ці умовно-патогенні мікроорганізми належать до

двох родів: Peptococcus (основні види – P. niger, P. activus) і Peptostreptococcus

(P. anaerobius, P. productus, P. prevotii). Вони належать до фонової мікрофлори сли-

зових оболонок і порожнин здорових людей. Від хворих виділяються переважно в

асоціаціях з іншими бактеріями і дуже рідко як монозбудники.

Матеріалом для дослідження служить гній, слиз, кров, сеча, випорожнення,

рановий вміст тощо. Лабораторна діагностика включає мікроскопію клінічного

матеріалу і посіви з метою виділення чистих культур чи їх асоціацій.

У мазках, забарвлених за Грамом, пептококи дуже нагадують стафілококів. Вони

розташовуються групками, парами, тетрадами. Петострептококи мають кулясту або

овоїдну форми, розташовуються у вигляді ланцюжків, рідше парами.

Для посівів найчастіше використовують кров’яний агар (краще з додаванням

геміну, вітаміну К, неоміцину), рідше – агар на основі настою серця бика і тканини

мозку, середовище для вирощування бруцел, тіогліколевий бульйон. На кров’яних

середовищах в анаеробних умовах через 48 год колонії пептококів і пепто-

стрептококів дрібні, круглі, опуклі, як правило, прозорі. Колонії Peptostreptococcus

anaerobius дещо більші за розміром, каламутні, мають характерний солодкуватий

запах. Штами Peptococcus niger утворюють чорні колонії. Культури анаеробних коків

не чутливі до дії неоміцину, який пригнічує ріст грамнегативних бактерій, особливо

протею, що полегшує виділення культур із матеріалів, густо контамінованих супут-

ньою мікрофлорою. Peptostreptococcus anaerobius дуже чутливий до атенолсульфа-

ту натрію, що використовують для диференціальної діагностики методом дисків.

Виділені культури анаеробних коків ідентифікують за морфологічними, куль-

туральними і біохімічними ознаками. Пептококи не розкладають вуглеводів, не

розріджують желатин, але виділяють сірководень. Peptostreptococcus anaerobius

ферментує лише глюкозу, а Peptostreptococcus productus – глюкозу, лактозу, маль-

тозу, маніт і ксилозу, звурджує молоко.

Серологічні методи діагностики поки що тільки розробляються.

257

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Дифтерія

Дифтерія – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка проявляється

характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника та сильною

інтоксикацією організму дифтерійним екзотоксином. Збудником її є Coryne-

bacterium diphtheriaе, що належить до роду коринебактерій. До цього роду вхо-

дить ще біля 20 видів бактерій, патогенних для людей, тварин і рослин. З них

найбільше значення для практичної медицини мають наступні:

1. C. ulcerans – може викликати фарингіти, ураження шкіри; її виявляють і в

здорових людей, у молочних продуктах і тарі для їх перевезення; деякі штами

токсигенні.

2. C. jeikeium (раніше коринебактерії JK) – спричиняє пневмонію, ендокар-

дит, перитоніт, інфікує рани, шкіру.

3. C. cistitidis (раніше коринебактерії групи D2) – ініціює утворення камінців

у сечовивідних шляхах та пневмонію.

4. C. minutissimum – викликає еритразми, абсцеси легень, ендокардити.

5. C. haemolyticum – може викликати тонзиліти, целюліти, абсцеси мозку,

остеомієліти, хронічні дерматити.

6. С. xerosis – раніше вважали збудником ксерозу (хронічного кон’юнктиві-

ту), тепер її відносять до сапрофітів.

7. C. pseudodiphtheriticum – сапрофіт, проживає на слизовій оболонці носо-

глотки людини.

Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для досліджен-

ня є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше

виділення з ока, вуха, рани, піхви, ураженої ділянки шкіри. На вимогу епідеміоло-

га досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (мо-

локо, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікуван-

ня натще або через 2 год після прийому їжі.

Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені

5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. До-

сліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами,

намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними руха-

ми, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпа-

телем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки

та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії

рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

Якщо необхідно провести первинну бактеріоскопію на вимогу лікаря, матеріал

беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки,

ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких над-

писують номер, дату і час відбору, прізвище лікаря. Вони повинні бути доставлені

до лабораторії не пізніше 3-х год після взяття матеріалу. Якщо схема забору перед-

бачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направля-

258

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють через 20-23 год, в хо-

лодну пору в сумках із грілками.

Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на

вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановсько-

го-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які

при звичайних методах культивування не ростуть).

Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен во-

лютину, забарвлених за методами Леффлера і Нейссера, було основою лаборатор-

ної діагностики дифтерії та виявлення бактеріоносійства. Тепер, у зв’язку з мінли-

вістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія

досліджуваного матеріалу не рекомендується.

Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипо-

вих колоній на кров’яно-телуритових середовищах та при перевірці чистоти виді-

лених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна

також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім

або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.

Дифтерійні палички в мазках розташовуються під кутом, у вигляді латинсь-

ких літер V, X, Y, або утворюють скупчення, що нагадують купку розкиданих

сірників. Волютинові зерна розташовуються, як правило, на полюсах мікробних

клітин. (див. вкл., рис. 17 і 18). Псевдодифтерійні бактерії та дифтероїди розмі-

щуються паралельно (у вигляді “частоколу”) і, звичайно, не мають зерен волюти-

ну. Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної

мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжево-

червоного кольору на фоні жовто-зелених тіл бактерійних клітин.

Бактеріологічне дослідження. Клінічний матеріал засівають на кров’яний

агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки

Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори.

Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до дії телуриту калію, тому їх ріст на

телуритових середовищах може пригнічуватись. Для виявлення дифтерійного бак-

теріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в

посівному матеріалі може міститись невелика кількість дифтерійних паличок, ріст

яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою.

При цьому допускається використання і транспортного середовища.

Кров’яно-телуриновий агар. До 100 мл 2 % розплавленого й охолодженого до 50 °С

живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину

телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі ша-

ром, товщиною 3-4 мм.

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й

охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової

суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцеринову суміш готують шляхом додавання 20 мл

стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холо-

дильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34

мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

259

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Транспортне напіврідке середовище. До 100 мл перевару Хоттінгера або м’ясо-пеп-

тонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, сте-

рилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 %

телуриту калію. Середовище розливають у пробірки по 5 мл. При можливості використову-

ють і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

Посів від одного хворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому

одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка),

а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із

шкіри, ока, вуха та інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засіва-

ти матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігріва-

ють у термостаті 15-20 хв.

При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в

окрему ділянку кров’яного агару площею 2×1 см, потім аналогічно на кров’яно-

телуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час по-

вертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами

засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Така техніка посіву доз-

воляє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосе-

редньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засі-

яні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при

37 °С протягом 20-24 год.

На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують ха-

рактер колоній. Якщо ріст відсутній на обох середовищах, роблять повторний забір

матеріалу.

Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для

подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих ко-

лоній можна і не проводити.

Колонії дифтерійних паличок на кров’яному агарі білуватого або жовтуватого

кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно

вони мають маслянисту консистенцію, хоч деякі можуть утворювати крихкі шорсткі

R-колонії.

На кров’яно-телуритових середовищах колонії C.diphtheriae через 24 год росту

мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають

темно-сірого або чорного кольору з металевим блиском, рівними або злегка фестон-

частими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-фор-

ми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею.

За структурою 48-годинних колоній на телуритових середовищах і деякими

ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культураль-

но-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Біовар gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі колонії, крихкі,

плоскі, гладенькі, діаметром 1,5-2 мм, із радіально посмугованою поверхнею; він

високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген.

Біовари mitis та belfanti ростуть у вигляді сірих або чорних, круглих гладень-

ких опуклих колоній з рівними краями, діаметром 1-1,5 мм; ці варіанти менш ток-

сичні, викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген.

260

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Біовар intermedius утворює дрібні, сірі, прозорі колонії, діаметром 0,5-1 мм,

із плоскою гладенькою поверхнею; він слаботоксичний, не розщеплює крохмалю

і глікогену (див. вкл., рис. 19 і 20).

Якщо типовий ріст відсутній, з інших, сумнівних колоній готують мазки. При

виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджів та ін., дослідження на дифте-

рію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що диф-

терійні бактерії, які утворили нетипові колонії на середовищах з інгібіторами росту

(телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм

та характерне розташування.

При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсиген-

ності та ідентифікації. Токсигенні властивості досліджують не менше як у 2-х

ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середови-

ще для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а

другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури

та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці

виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C. diphtheriaе, необ-

хідно при множинному рості підозрілих колоній дослідити токсигенні властивості

біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише

однієї колонії, її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не про-

жарюючи петлю, – у пробірку із середовищем Пізу.

Якщо застосовували транспортне середовище, висів із нього роблять на щільні

кров’яно-телуритові середовища.

На третій день, при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й

позитивній пробі на цистиназу, виділену культуру визначають як токсигенну

С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще

протягом доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший

вид коринебактерій.

Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглевод-

неві середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби

на виявлення уреази, піразинамідази та нітратредуктази.

На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргумен-

тований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токси-

ну з антитоксином в агаровому гелі. В місцях оптимального кількісного співвідно-

шення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких

ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном

називають Елек-тестом.

Пробу на токсигенність, як правило, проводять із чистими культурами. Мож-

на визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на

добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її

повторюють з виділеною чистою культурою.

Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеці-

альне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних

261

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

мікробів (ВТДМ) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною проти-

дифтерійною сироваткою і висушені.

На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові

диски з антитоксином (не більше чотирьох на одну чашку). На відстані 0,5 см від

диска навколо нього засівають культури у вигляді “бляшок” діаметром 7-8 мм,

чередуючи “бляшки” досліджуваної культури і контрольного штаму.

Результати враховують через 18-24 і 48 год. Критерієм специфічності преци-

пітатів є злиття ліній преципітації досліджуваної культури з лініями токсигенного

штаму (рис. 78). В такому разі виділену культуру вважають токсигенною.

При відсутності стандартних паперових дисків можна використати смужки

фільтрувального паперу, просочені дифтерійним антитоксином. Їх виготовляють

безпосередньо в лабораторії. Нарізані за вказаними розмірами і простерилізовані

в автоклаві при 121°С протягом 30 хв паперові смужки змочують 0,25 мл очище-

ного дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 мл. В такому разі на

чашку з відповідним середовищем накладають змочену антитоксином смужку па-

перу, підсушують, відкривши чашку на 15-20 хв у термостаті й перевернувши її

догори дном. Після цього з обох боків смужки засівають культури “бляшками”,

чередуючи досліджувані і контрольні штами.

Для визначення токсигенності збудника дифтерії можна використати також і

інші середовища (АГВ, мартенівський агар тощо), рецепти виготовлення яких

наведені в “Інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії”, Київ (1999).

Впродовж багатьох років токсигенність дифтерійних бактерій визначали

підшкірним або внутрішньошкірним введенням культури двом гвінейським свин-

кам, одній з яких напередодні вводять 100-1000 МО антитоксичної протидифте-

рійної сироватки. Тепер цей метод бактеріологічні лабораторії практично майже

не використовують через дорожнечу та значну затримку відповіді.

Останнім часом розроблено дуже чутливий і високоспецифічний метод виз-

начення гена дифтерійного токсину шляхом поліме-

ризації ланцюгової реакції. Він базується на визна-

ченні ділянки ДНК C. diphtheriaе, де локалізований

ген дифтерійного токсину, за допомогою специфіч-

них праймерів. Метод має переваги перед традицій-

ним визначенням токсигенності: високу чутливість,

швидкість отримання результатів (4-6 год), не потре-

бує виділення чистої культури. Але для його прове-

дення необхідні спеціальна апаратура, дорогі реак-

тиви й відповідне приміщення, а тому може бути про-

ведений лише в спеціалізованій лабораторії. Всі

нетоксигенні штами дифтерійних бактерій, які виді-

лені від хворих та бактеріоносіїв, необхідно направ-

ляти до Українського центру держсанепіднагляду (де

є така лабораторія) для остаточного визначення ток-

сигенних властивостей C. diphtheriaе.

Рис. 78. Визначення токсиген-

ності C.diphthtriae:

А – диски з антитоксином;

К – контрольні штами;

1, 2, 3 – досліджувані культури;

ЛП – лінії преципітації.

262

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Визначення цистинази (проба Пізу). C. diphtheriaе, C. ulcerans виділяють

фермент цистиназу, псевдодифтерійні бактерії та інші дифтероїди його не проду-

кують.

Виділену культуру засівають уколом в середовище з цистином, розлите сто-

впчиком у вузькі пробірки. Цистиназопозитивні бактерії розщеплюють цистин із

виділенням сірководню, який із оцтовокислим свинцем, що входить до середови-

ща, утворює сірчанокислий свинець, в результаті чого середовище забарвлюється

в темно-коричневий колір. C. diphtheriaе викликає не лише потемніння середови-

ща за ходом вколювання, а й утворює навколо нього “хмаринку” темно-коричне-

вого кольору на відстані 1 см від поверхні. Результати враховують через 20-24 год

інкубування в термостаті.

Визначення уреази (проба Заксе). Дифтерійні бактерії цього ферменту не

утворюють. Позитивну пробу на уреазу дають лише деякі інші види коринебак-

терій (табл. 56). Для постановки проби виділену культуру сіють на бульйон із се-

човиною. Уреаза розкладає сечовину, змінює рН середовища, що супроводжуєть-

ся його почервонінням. Якщо фермент не виділяється, зміни забарвлення бульйо-

ну не відбувається.

Визначення піразинамідази проводять шляхом гідролізу піразинаміду до

піразинової кислоти та амонію. Для цього в стерильну пробірку вливають 0,25 мл

стерильної дистильованої води, в якій готують густу завись виділеної культури,

потім вносять одну діагностичну таблетку Rosko 598-21. Інкубують протягом 4-х

год при 37 °С, після чого добавляють одну краплю щойно приготовленого 5 %

водного розчину сульфату амонійного заліза. При наявності ферменту суспензія

набуває червоного або оранжевого кольору. Патогенні коринебактерії не виділя-

ють піразинамідазу, а отже, й не змінюють кольору суспензії.

Цукролітичні ферменти визначають шляхом посіву повної петлі виділеної

культури в кожну пробірку вкороченого строкатого ряду Гісса (глюкоза, сахароза,

розчинний крохмаль). Результати враховують через 24 год інкубування в термо-

статі. Розщеплення крохмалю може затримуватись до 48 год. Диференціація різних

видів коринебактерій за основними біохімічними властивостями подана в таб-

лиці 56.

Визначення нітратредуктази є додатковим тестом для ідентифікації

С. belfanti i C. ulcerans, які не утворюють цього ферменту. У пробірку з бульйо-

ном, до якого додають 0,1 % KNO

, засівають досліджувану культуру, інкубують в

термостаті протягом доби. Обов’язково ставлять контроль з незасіяним середови-

щем. В разі наявності нітратредуктази при додаванні до засіяного бульйону 3-х

крапель реактиву Касаткіна виникає червоне забарвлення. Середовище в конт-

рольній пробірці кольору не змінює.

Для ідентифікації коринебактерій останнім часом використовують паперові

індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем із набору “Б”

для ідентифікації ентеробактерій (фірма “ІмБіо”, м.Нижній Новгород). У 4-х про-

бірках готують густу завись досліджуваної культури і в кожну з них занурюють

диск із відповідним вуглеводом чи іншим реактивом. Після інкубування в термо-

263

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

статі облік виділення уреази проводять через 40-120 хв, а визначення цукролітич-

ної активності – через 5-24 год. При наявності уреази білий диск із сечовиною

стає рожево-малиновим, при відсутності – залишається білим. Диски з глюкозою

та сахарозою при наявності відповідних ферментів вже через 5-6 год змінюють

колір з червоного на жовтий. При визначенні амілази в пробірку з відповідним

субстратом додають індикаторний диск з йодом. Якщо ферменту немає – з’яв-

ляється темно-синє забарвлення, якщо є – колір розчину залишається без змін.

Коклюш і паракоклюш

Коклюш (кашлюк) – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка вик-

ликається Bordetella pertussis, характеризується повітряно-краплинним механіз-

мом передачі, катаральним запаленням дихальних шляхів і нападами спазматич-

ного кашлю з репризами. Bordetella parapertussis і Bordetella bronсhiseptica спри-

чиняють подібні до коклюшу, але з легшим перебігом захворювання. Всі три види

бордетел подібні між собою і належать до одного роду. Це дрібні грамнегативні

овоїдні палички, які часто забарвлюються біполярно.

Збудники виділяються зі слизом і харкотинням переважно в катаральний і

рідше в спазматичний періоди. У зв’язку з наявністю стертих і атипових форм,

схожістю симптомів вирішальне значення для їх діагностики мають лабораторні

методи дослідження. Мікробіологічний аналіз проводять одночасно на виділення

всіх трьох збудників.

Взяття досліджуваного матеріалу. Слиз із задньої стінки глотки беруть

стерильним задньоглотковим ватним тампоном бажано під час нападу кашлю з

обов’язковим використанням шпателя. При використанні тампонів на тонкій (напр.

ніхромовій) дротинці забирати матеріал можна і через нижні носові ходи.

Таблиця 56

Біохімічні ознаки коринебактерій

Розщеплення

Вид

Токси-

генність

саха-

рози

крох-

малю

цис-

тину

піразин-

аміду

сечо-

вини

Нітрат-

редуктаза

C.diphtheriae v.gravis

C.diphtheriae v.mitis

C.diphtheriae v.belfanti

C.diphtheriae v. interm

C.ulcerans

C.jeikeium

C.cistitidis

C.minutissimum

C.haemolyticum

C.bovis

C.pseudotuberculosis

C.pseudodiphtheriticum

C.xerosis

–

264

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

При негайному посіві використовують сухий тампон. Якщо це неможливо –

тампон попередньо змочують розчином алгінату кальцію або ізотонічним розчи-

ном хлориду натрію, оскільки вата пригнічує ріст Bordetella pertussis. Взятий ма-

теріал потрібно доставити до лабораторії протягом 2-4-ох год, оберігати його від

переохолодження.

Ще краще взяти матеріал від хворого за допомогою “кашльових пластинок”.

Для цього під час кашлю відкривають чашку Петрі з живильним середовищем і

тримають її на відстані 4-8 см перед ротом і носом хворого протягом 6-8 кашльо-

вих поштовхів.

Для дослідження також можна брати харкотиння (слиз), відсмоктуючи його

шприцом з гумовою трубкою з надгортанної зони.

Основними методами лабораторної діагностики коклюшу є бактеріологічний

і серологічний. Для експрес-діагностики, особливо в ранній період хвороби, вико-

ристовують реакцію імунофлуоресценції. Для цього мазки з досліджуваного ма-

теріалу обробляють спеціальними флуоресцентними сироватками і досліджують

під люмінесцентним мікроскопом. Розглядають 50 полів зору. Позитивним результат

вважають тоді, коли в полі зору виявляють 2-3 бактеріальні клітини, що світяться.

Бактеріологічне дослідження. Для виділення збудника використовують такі

традиційні середовища: картопляно-гліцериновий агар з кров’ю кролика (Борде-

Жангу), комерційний селективно-вугільний агар (КВА) або молочно-кров’яний

агар. Для пригнічення росту грампозитивної мікрофлори дихальних шляхів до

середовищ рекомендують додавати пеніцилін. При посіві методом “кашльових

пластинок” антибіотик наносять на поверхню агару в об’ємі 0,1 мл (10 ОД) і рівномір-

но втирають шпателем. При посіві тампоном роблять спочатку штрих у вигляді цен-

тральної доріжки, а потім через неї перпендикулярними штрихами петлею. Для

збільшення частоти виділення збудника посіви проводять одночасно на 2 чашки

(одна без пеніциліну). Вирощування проводять при 37 °С протягом трьох-п’яти діб.

Колонії на середовищі досліджують під стереоскопічним мікроскопом або за

допомогою лупи. Вони дрібні, опуклі, блискучі, сіруватого кольору, нагадують

краплини ртуті або перламутр. На середовищі Борде-Жангу навколо колоній ви-

никає невелика зона гемолізу. Колонії Bordetella parapertussis трохи більших роз-

мірів коричневого кольору. З типових колоній виготовляють мазки, забарвлюють

за Грамом і мікроскопують. Одночасно ставлять реакцію аглютинації на склі з

коклюшними і паракоклюшними сироватками в розведенні 1:10. При позитивно-

му результаті виділяють чисту культуру бордетел і проводять її ідентифікацію за

рядом ознак (табл. 57).

Бордетели не ферментують вуглеводів, не утворюють індолу, нітрати віднов-

лює лише Bordetella bronсhiseptica. Основне значення при ідентифікації мають

особливості росту і реакції аглютинації з видовими неадсорбованими і, при мож-

ливості, з адсорбованими монорецепторними сироватками до антигенів 1, 12, 14.

З метою ідентифікації виділених культур (навіть на етапі утворення колоній) можна

застосувати реакцію непрямої гемаглютинації з еритроцитарним антитільним діаг-

ностикумом.

265

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Серологічне дослідження проводять в основному для ретроспективної діаг-

ностики або в тих випадках, коли культура бордетел не виділена. Антитіла до

збудників утворюються на третьому тижні хвороби й пізніше. Для їх виявлення

використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу і особливо непря-

мої гемаглютинації. У зв’язку з масовими щепленнями дітей проти коклюшу, всі

серологічні реакції необхідно ставити методом парних сироваток. Діагноз підтвер-

джують лише при 4-кратному наростанні титру антитіл в динаміці. У дітей пер-

ших двох років життя серологічні реакції часто бувають негативними.

Алергічні проби шляхом введення внутрішньошкірно 0,1мл аглютиногена

(10 ОД) проводять найчастіше при масових епідеміологічних обстеженнях.

Псевдомонадні інфекції

Псевдомонадні (синьогнійні) інфекції – гнійно-септичні захворювання, що

викликаються Pseudomonas aeruginosa. Цю поліморфну рухливу грамнегативну

бактерію протягом довгого часу відносили до групи умовно-патогенних мікроор-

ганізмів. Але в останні 15-20 років на фоні широкого використання антибіотиків

синьогнійна паличка стала значно частіше викликати різноманітні запальні про-

цеси, включаючи і генералізовані форми: менінгіт, пневмонію, плеврит, остеомієліт,

септицемію, уросепсис, отит, кератит, гнійні ускладнення травматичних, операцій-

них і, особливо, опікових ран. Переважна більшість їх – типові внутрішньолікар-

няні інфекції. У багатьох стаціонарах сформувались госпітальні ековари псевдо-

монад, що мають виражений поліморфізм, множинну резистентність до лікарських

препаратів, підвищену вірулентність.

Матеріал для лабораторного аналізу може бути дуже різноманітний, але най-

частіше – це гній, рановий вміст, ексудат, сеча, жовч, ліквор, кров, випорожнення,

лікарські препарати, виготовлені в лікарнях, різні об’єкти довкілля.

Найефективнішим і по суті єдиним методом лабораторної діагностики псевдо-

монадних інфекцій є бактеріологічний. Для успішного виділення чистих культур

синьогнійних паличок важливе значення має спосіб взяття матеріалу. Його необ-

хідно забирати до початку антибактеріальної терапії, а якщо її вже розпочали – то

лише після виведення препарату з організму.

Ознаки

Bordetella

pertussis

Bordetella

parapertussis

Bordetella

bronсhiseptica

Швидкість росту колонії (дні) 3-4 2-3 1-2

Ріст на простому МПА - + +

Рухливість - - +

Коричневий пігмент - + -

Уреаза - + +

Оксидаза + - +

Наявність специфічних антигенів 1,2,3 14 12

Таблиця 57

Диференціація патогенних бордетел

266

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Псевдомонади добре ростуть на простих і диференціально-діагностичних

середовищах (МПБ, МПА, пептонна вода, Ендо, Плоскирєва та ін.) в аеробних

умовах при 30-37 °С, також при 42 °С, що можна використовувати як диференці-

ально-діагностичну ознаку. Середовищем вибору слід вважати МПА з фурагіном

і 0,1 % центрамідом. Для визначення пігменту матеріал сіють у МПБ.

Характерною культуральною особливістю цих бактерій є утворення слизу,

що надає характерної в’язкості бульйонним культурам і колоніям мукоїдних штамів.

У зв’язку з цим на рідких середовищах утворюється особлива сірувато-срібляста

плівка. При старінні культур виникає каламуть з наступним випаданням слизово-

го осаду. Переважна більшість штамів синьогнійних паличок продукує пігмент

піоціанін, що має синій колір у лужному і нейтральному середовищі і червоний –

у кислому. Для визначення пігменту в підлужену до рН 8 бульйонну культуру вно-

сять декілька крапель хлороформу і струшують. Синє забарвлення хлороформу

свідчить про наявність піоціаніну. Псевдомонади інших видів (P.putida, P.fluo-

rescens) можуть утворювати пігменти інших кольорів: червоний (піорубін) і ко-

ричнево-чорний (піомеланін).

На МПА через 24 години виростають досить крупні напівпрозорі слизуваті

колонії синьо-зеленого кольору з перламутровим відтінком. Через день-два забар-

влюється і само середовище. Культури часто мають специфічний запах фіалок або

жасмину.

Дуже важливо знати, що при посіві на щільні середовища більшість культур

P. аeruginosa дають феномен райдужного лізису під впливом спонтанного бактері-

офагу. У відбитому світлі колонії нагадують різнобарвні плівки окисів на поверхні

кольорових металів, напр., міді. Цей феномен утворюють лише синьогнійні па-

лички, отже, його можна розглядати як таксономічну ознаку.

На агарі Плоскирєва спочатку виростають колонії інтенсивного жовтого ко-

льору, які через 48 год стають коричневими, в’язкими, важко знімаються пет-

лею. Середовище Олькеницького чи Ресселя при рості псевдомонад не зазнає

ніяких змін.

Ідентифікують виділені культури за вище вказаними морфологічними і куль-

туральними властивостямя, а також за їх біохімічною активністю. Синьогнійні

палички мають слабку цукролітичну активність. Вони розкладають до кислоти

лише глюкозу. Значно вища їх протеолітична дія: вони розріджують желатин і

згорнуту сироватку крові, гідролізують казеїн, звурджують молоко і розріджують

його згусток. Відновлюють нітрати до нітритів, виділяють оксидазу, не утворю-

ють індол і сірководень, дають негативну реакцію Фогеса-Проскауера. Важливи-

ми диференціальними ознаками P.aeruginosa є визначення флуоресцуючого пігмен-

ту піоціаніну, хороший ріст при 42 °С, феномен спонтанного райдужного лізису,

гемоліз на кров’яному агарі.

Серологічну ідентифікацію культур і визначення серовару можна провести

(при наявності відповідних типів сироваток) в реакції аглютинації з визначенням

групоспецифічного О-антигену і моноспецифічних Н-антигенів. Однак схема іден-

тифікації псевдомонад ще потребує подальшого вдосконалення.

267

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Інфекції, викликані гемофільними бактеріями

Часто збудником менінгіту, септицемії, пневмонії, бронхіту, отиту, ендокар-

диту, гострих респіраторних та вторинних інфекцій може бути Haemophilus

influenzae. Найбільш чутливими до гемофільних бактерій є діти від 3-ох місяців

до 6 років. За структурою капсульних антигенів H.influenzae поділяють на 6 серо-

варів (a, b, c, d, e, f). Тяжкі форми захворювань, особливо менінгіту, як правило,

викликає серовар b. Другим патогенним представником роду гемофілів є H. ducrey –

збудник м’якого шанкеру. Решта 14 видів для людини не патогенні.

Матеріалом для дослідження при менінгіті служить ліквор, при септицемії –

кров, при пневмонії – харкотиння, при інших процесах – гній і слиз з носоглотки,

які забирають від хворих за допомогою ватних тампонів.

Мікроскопічні дослідження. Виготовлені й зафіксовані мазки забарвлюють

за Грамом або водним фуксином протягом 5 хв. При мікроскопії видно дрібні палич-

коподібні грамнегативні бактерії, які не утворюють спор, але мають капсули, розта-

шовуються поодинці, рідше у вигляді ланцюжків. При великій кількості збудника

в досліджуваному матеріалі (спинномозкова рідина, гній, слиз, харкотиння) його

легко й швидко можна виявити за допомогою феномену набухання капсул або

реакції імунофлуоресценції, якщо використати відповідні діагностичні сироватки.

Бактеріологічні дослідження. Чисті культури гемофільних бактерій виді-

ляють шляхом негайного посіву досліджуваного матеріалу на спеціальні живильні

середовища (кров’яний, шоколадний або серцево-мозковий агари, середовища

Левінталя чи Файлдса). Для пригнічення кокової флори до середовищ додають

15–25 ОД/мл пеніциліну. На простих середовищах гемофільні бактерії не ростуть.

Спинномозкову рідину і серозні випоти спочатку центрифугують і осад сіють

петлею на одне з щільних середовищ. При септицемії сіють 10 мл крові в 100 мл

рідкого середовища Файлдса. Через 24 години роблять висів на агар, де через добу

виростають маленькі опуклі прозорі колонії. На шоколадному агарі колонії появ-

ляються через 36-48 год, вони трохи більші за розмірами і напівпрозорі. На кро-

в’яному агарі з додаванням серцево-мозкового екстракту через добу виростають

дрібні опуклі колонії з райдужними переливами. Колонії безкапсульних варіантів

гемофіл не мають такого райдужного розцвіту. З типових колоній готують мазки й

забарвлюють за Грамом. При виявленні маленьких грамнегативних паличок по-

відомляють лікареві попередні результати. H.influenzae у перших генераціях може

бути в капсульній і безкапсульній формі.

Для остаточної ідентифікації виділених культур проводять реакцію набухан-

ня капсул, досліджують потреби для росту X- і Y-факторів, каталазну, оксидазну,

уреазну, в-галактозидазну і гемолітичну активність, ферментацію вуглеводів, ви-

ділення індолу і сірководню.

H.influenzae продукує каталазу, уреазу, в-галактозидазу, нітратредуктазу, виді-

ляє індол, постійно ферментує глюкозу й сахарозу. Інші з перелічених біохімічних

тестів негативні. Основне значення для ідентифікації мають феномен набухання

капсул і дослідження потреби для росту X- і Y-факторів. Для виявлення такої

268

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

потреби досліджуваний матеріал засівають на середовище, на поверхню якого

потім кладуть стандартні смужки паперу, просочені X- і Y-факторами. Інтенсив-

ний ріст бактерій навколо смужок (а не в інших ділянках агару) підтверджує на-

явність H.influenzae.

Серологічну ідентифікацію культур, ще на етапі отримання ізольованих ко-

лоній, можна провести за допомогою реакції аглютинації на склі з капсульним

антигеном (a, b, c, d, e, f) з відповідними полі- і монорецепторними діагностични-

ми сироватками. Виділені культури необхідно диференціювати від збудників кок-

люшу і паракоклюшу.

Для діагностики менінгіту, викликаного гемофільними бактеріями, викорис-

товують також метод зустрічного імуноелектрофорезу. Утворення ліній преципі-

тації виявляє полісахаридні антигени гемофіл, що доводить етіологічну роль

H.influenzae у виникненні захворювання.

М’який шанкер (шанкроїд) – венерична хвороба, яку викликає Haemophilus

ducreyі, характеризується утворенням на статевих органах болючої виразки з

м’яким дном, підритими краями і жовтуватим сальним вмістом. У ряді випадків

утворюються декілька виразок, які зливаються між собою. Часто розвивається і

регіональний лімфаденіт. Останнім часом кількість захворювань на м’який шан-

кер зростає.

Лабораторна діагностика не викликає будь-яких труднощів. Вона включає

декілька етапів: 1) бактеріоскопію мазків із глибоких шарів виразки або з пунк-

татів лімфатичних вузлів; 2) виділення чистих культур на тих же середовищах, на

яких культивують H.influenzae (кров’яний, шоколадний агар, середовище Левін-

таля та ін.); 3) постановку алергічної проби.

Мікроскопія мазків. Для виготовлення препаратів – мазків матеріал беруть

ложечкою Фолькмана з-під навислих країв виразки після її ретельного очищення

ватним тампоном, змоченим ізотонічним розчином хлориду натрію. Під час забо-

ру намагаються схопити шматочки (клапті) тканин. Саме в такому матеріалі збуд-

ника виявляють найчастіше. Одночасно проводять мікроскопічне дослідження на

виявлення збудника сифілісу в темному полі зору. Мазки фіксують у суміші Ники-

форова й забарвлюють за Грамом, фуксином Циля або метиленовим синім. Під

мікроскопом H.ducreyі має вигляд овоїдних паличок, розташованих паралельни-

ми ланцюжками (“залізничні колії”) або парами чи групками. Вони не мають спор

і капсул, часто інтенсивніше фарбуються на полюсах.

Бактеріологічне дослідження проводять рідше. Патологічний матеріал об-

робляють ванкоміцином (3 мкг/мл), що значно підвищує частоту виділення збуд-

ника. Посіви вирощують при 35 °С в атмосфері 8-10 % CO

На щільних кров’яних середовищах через 24-48 год палички Дюкрея вирос-

тають у вигляді дрібних (1-2 мм) кулястих блискучих колоній, які нагадують ріст

стрептококів. У типових випадках колонії забарвлені в жовтувато-сірий колір, ото-

чені невеликою зоною гемолізу, яка краще виявляється пізніше.

У рідких середовищах палички Дюкрея ростуть у вигляді пухких пластівців

або зерен на стінках пробірок, чи вільно плаваючих у бульйоні. В мазках із чистих

269

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

культур або окремих колоній бактерії розташовані хаотично, без утворення довгих

ланцюжків. Виділені культури ідентифікують за біохімічними й антигенними вла-

стивостями. Палички Дюкрея ферментують глюкозу, лактозу, маніт, сахарозу, не

мають протеолітичних властивостей. Надійнішою є серологічна ідентифікація в

реакції аглютинації на склі з відповідною діагностичною сироваткою. При визна-

ченні потреб X- і Y-факторів для росту культур важливо пам’ятати, що H. ducreyi

потребує лише фактора Х (а не Y). Цей тест використовують для диференціації

збудника м’якого шанкеру від H. influenzae.

У зв’язку з відсутністю імунітету після перенесення хвороби, серологічні

реакції для діагностики м’якого шанкеру не використовують, хоч в організмі по-

являються комплементзв’язуючі антитіла, але в малих титрах і не у всіх хворих.

Алергічну пробу з антигеном із бактерій м’якого шанкеру проводять, почина-

ючи з 8-го дня. Внутрішньошкірно вводять 0,1 мл алергену або вакцини H. ducreyі.

Облік результатів проводять через 24-48 год. Вона виявляється позитивною в 90-

98 % випадків.

Легіонельози

Легіонельози – групові або спорадичні захворювання людей, що спричиня-

ються легіонелами – грамнегативними паличками родини Legionellaceae, яка на-

раховує біля 30 видів. Найчастіше хворобу викликає Legionella pneumophila. Роз-

різняють 12 серогруп цього виду, домінує серед них 1 серогрупа.

Збудники знаходяться у воді систем кондиціонування повітря, душових уста-

новок, ванн для бальнеопроцедур та відкритих водоймищ. Механізм передачі хво-

роби – аспіраційний.

Відомі три клінічні форми: хвороба легіонерів (тяжка пневмонія), гарячка

Понтіак (респіраторне захворювання без пневмонії), гарячка Форт-Брагг (гостре

захворювання з екзантемою). На гарячку Понтіак припадає 90-95 % всіх форм

хвороби. Легіонельози зареєстровані у багатьох країнах світу. Спорадичні випад-

ки виявлені і в Україні.

Матеріалом для специфічної діагностики є кров, харкотиння, плевральна ріди-

на, легенева тканина, сеча, біоптати внутрішніх органів тощо. Використовують

бактеріологічний і серологічний методи.

Бактеріологічне дослідження. Виділення чистих культур легіонел поки що

доступне лише для спеціалізованих лабораторій. Збудника практично неможливо

виділити з крові та харкотиння; більше шансів отримати культуру при посівах

біопсійних матеріалів.

Досліджуваний матеріал не можна вміщувати в транспортні середовища або

буферні розчини. Посіви на спеціальні середовища необхідно робити не пізніше

години після його взяття. Найоптимальнішим середовищем для культивування

легіонел є вугільно-дріжджовий агар. На ньому вже через 3 доби виростають сірі

склоподібні колонії. Для виділення чистої культури із дуже забруднених матері-

алів до агару додають поліміксин В і ванкоміцин. Можна виділити збудника і шля-

270

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

хом зараження гвінейських свинок з наступним введенням гомогенатів печінки і

селезінки в курячий ембріон.

Виділені чисті культури досліджують за морфологічними, культуральними,

біохімічними і антигенними властивостями. Легіонели, як правило, виділяють

каталазу, утилізують крохмаль, розріджують желатин, не продукують уреазу і

нітратредуктазу, не ферментують вуглеводи. Важливе значення має використання

флуоресцентних сироваток, особливо 1-ої серогрупи.

Для експрес-діагностики легіонельозу використовують мікроскопію імпрег-

нованих сріблом мазків, виготовлених з харкотиння або біоптатів. Збудник має

вигляд тонких паличок довжиною 2-3 мкм і шириною 0,5-0,7 мкм. Люмінесцент-

на мікроскопія мазків, оброблених міченими флуоресцеїном сироватками, дає

позитивні результати лише у 50% випадків. Кращі наслідки дає імуноферментний

метод виявлення антигенів легіонел у сечі хворих.

Серологічний метод діагностики використовують частіше, він дає надійніші

і стабільніші результати. Широко застосовують реакцію непрямої імунофлуорес-

ценції. Діагностичним вважають титр 1:128 і вище при використанні однієї сиро-

ватки. При постановці реакції методом парних сироваток діагноз хвороби вважа-

ють серологічно підтвердженим в разі наростання титру антитіл принаймні у 4

рази. Використовують також реакції непрямої гемаглютинації, зв’язування комп-

лементу та імуноферментний метод.

Лістеріоз

Лістеріоз – гостра або хронічна септична хвороба людей і тварин з переваж-

но аліментарним і контактним шляхами зараження, що характеризується уражен-

ням полінуклеарних фагоцитів, центральної нервової системи, печінки, селезінки

та інших органів. Найчастіше проявляється у вигляді ангіни, кон’юнктивіту, сеп-

сису, менінгоенцефаліту.

Збудник – Listeria monocytogenes з родини Corynebacteriaceae, дрібна, полі-

морфна, грампозитивна паличка, має 8 сероварів. Найчастіше зустрічається 1-й і

4-й серовари. Джерелом інфекції є миші-полівки, хатні миші, водяні щури, рідше

зайці, лисиці, білки, свійські тварини і птахи.

Матеріалом для мікробіологічного дослідження найчастіше служить слиз із

носоглотки і кон’юнктиви, кров, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, секційний

матеріал. Окрім того, досліджують м’ясо, молоко й інші харчові продукти, а при

підозрі також трупи домашніх і диких тварин. Взяття матеріалу необхідно прово-

дити дуже обережно, оскільки людина надзвичайно чутлива до лістерій.

Основу лабораторної діагностики лістеріозу складає бактеріологічне і серо-

логічне дослідження, постановка біологічної та алергічної проб. Бактеріоскопія

проводиться рідко, в основному, при дослідженні органів загиблих тварин, а та-

кож меконія новонароджених, що загинули від лістеріозного сепсису.

Бактеріологічне дослідження. У перші 7-10 днів захворювання кров (10 мл)

і ліквор (3-5 мл) засівають у 100-200 мл глюкозного, глюкозно-печінкового або

271

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

глюкозно-гліцеринового бульйону. Матеріал щільної консистенції емульгують в

ізотонічному розчині хлориду натрію і сіють на гліцериновий чи кров’яний агар з

телуритом калію або поліміксином (1-5 мкг/мл). Якщо досліджуваний матеріал

дуже забруднений сторонньою мікрофлорою, краще спочатку ввести його білим

мишам або гвінейським свинкам і після їх загибелі з печінки і селезінки зробити

мазки-відбитки та посіви. Засіяні середовища інкубують при 37 °С протягом 7 діб,

щоденно контролюючи наявність росту шляхом бактеріоскопії.

У рідких середовищах через добу настає помутніння і утворюється складча-

ста плівка. На триптозному або гліцериновому агарі при дослідженні в косому

освітленні колонії 24-годинного віку мають голубувато-зелений колір. У мазках із

бульйонних і агарових культур лістерії виглядають як короткі, товстуваті кокобак-

терії, які не мають ні спор, ні капсул, розташовуються поодинці або невеликими

групками. Серовари виділених штамів визначають за допомогою реакції аглю-

тинації з антилістеріозними сироватками, в першу чергу 1-го та 4-го сероварів.

Позитивним вважають результат, якщо аглютинація відбулася в розведенні не мен-

ше 1/4 титру.

Ідентифікацію виділених культур здійснюють за морфологічними, тінкторі-

альними, культуральними, біохімічними і антигенними властивостями. Лістерії

слаборухливі, каталазопозитивні, ферментують до кислоти глюкозу, мальтозу, са-

ліцин, не розкладають маніт і гліцерин. Свіжі культури дають позитивну кон’юн-

ктивальну пробу у гвінейських свинок. Через 2 години після внесення краплі буль-

йонної культури лістерій у кон’юнктивальний мішок розвивається гнійне запа-

лення кон’юнктиви.

Серологічне дослідження. Починаючи з другого тижня захворювання вико-

ристовують реакцію аглютинації (титр 1:320-1:5000). При низькому титрі антитіл

цю реакцію слід повторити. Більш достовірною і специфічною є реакція непрямої

гемаглютинації (титр 1:80 і вище). Вона дає позитивні результати у 85-90 % хво-

рих на лістеріоз після 10-13-го дня захворювання. Її застосовують і для виявлення

хронічного лістеріозу. Реакція зв’язування комплементу стає позитивною у більш

віддалені строки, її діагностичний титр 1:10 і вище. З діагностичною метою вико-

ристовують реакцію імунофлуоресценції і рідко – реакцію преципітації.

Біологічна проба. Досліджуваний матеріал, особливо при забрудненні його

супутньою мікрофлорою, вводять підшкірно білим мишам. Через три тижні при

позитивному результаті у тварин виникають паралічі задніх кінцівок і порушення

координації рухів. Із печінки та селезінки тварин, що загинули, роблять мазки-

відбитки та посіви на живильні середовища.

Алергічну пробу із стандартним корпускулярним антигеном, або антигеном,

отриманим шляхом кислотного гідролізу культури лістерій, ставлять на 6-9-й день

захворювання. Його вводять внутрішньошкірно в об’ємі 0,1 мл. Результат врахо-

вують через 24-48 год. Пробу вважають позитивною, якщо виникає гіперемія шкіри

та інфільтрат діаметром 1-2 см.

272

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Туберкульоз

Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку

викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють

туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і сугло-

бів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду

характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і

поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних

препаратів.

В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium

tuberculosis і M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняє M. avium. В країнах

Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання

викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsasii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін.

Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобак-

терій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів міко-

бактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведен-

ня мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і по-

становки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збуд-

ника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать

харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномоз-

кова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, пунктати, рідше

кров та ін. Хворий збирає харкотиння в баночку або кишенькову плювальницю.

Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12-

24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклею-

ють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету

дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважа-

ють потенційно патогенним.

Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отри-

мують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки.

Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомо-

гою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину пред-

метного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між

скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину

відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібрину

обережно розправляють на предметному склі. Сечу центрифугують і мазки виго-

товляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом

для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходи-

тися у сечі здорових людей.

Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсе-

на або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих

за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок

273

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно

поза клітинами (див. вкл., рис. 2).

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім

промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно

промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію,

потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити

водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульоз-

ні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми

використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення

L-форм мікобактерій застосовують переважно фазово-контрастну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку

після перегляду не менше 100 полів зору, обов’язково вказуючи кількість бактерій

у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити

діагноз туберкульозу.

Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: міко-

бактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в

1 мл патологічного матеріалу. Окрім того, за цим методом неможливо відрізнити

збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до

хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульо-

зу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи зба-

гачення – гомогенізації та флотації.

Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавля-

ють рівний об’єм 1 % розчину NaOH, щільно закривають гумовою пробкою і стру-

шують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану ріди-

ну центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують

2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують

мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

Метод флотації. Порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують, як вище опи-

сано. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять на водяну баню

при 55 °С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу),

струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобак-

теріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дисти-

льовану воду, щоб цей шар піднявся у горлечко колбочки чи флакона. Стерильною

пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло,

яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі

60 °С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріа-

лу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар

перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим

жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та

флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в дослі-

джуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння

знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою

гомогенізації або флотації.

274

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріо-

скопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу 20-100 і більше

мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й

для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості міко-

бактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення

змінених варіантів, особливо L-форм.

Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз (окрім крові,

спинномозкової рідини) містять супутню мікрофлору. Тому виділити чисту куль-

туру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення сторонніх

мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють

20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кисло-

ти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 °С протягом 18-20 год. Потім

оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізу-

ють, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від

кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середови-

щем Левенштейна-Йенсена (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною

суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попе-

реднє, але в ньому аспарагін замінено на глютамінат натрію. Ці середовища реко-

мендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування

мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших

потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петра-

ньяні, Павловського, Сотона.

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне

середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця

пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим пара-

фіном для попередження висихання середовища.

Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 3-4 тижнів. Ті

пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню

агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою,

пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім верти-

кально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторон-

ньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до

5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто

негативну відповідь щодо туберкульозу.

Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але

бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі,

шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений

центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної

капусти або бородавки.

Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам. S-форма колоній

жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів міко-

бактерій. Але під впливом антибактеріальних препаратів M. tuberculosis також

275

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

може утворювати м’які, вологі, пігментовані S-форми колоній. Необхідно відмічати

швидкість і рясність росту.

Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі

середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище

Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд

ніжної плівки, яка з часом потовщується, грубішає, стає крихкою і випадає в осад.

Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що

збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу, досліджуваний

матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікро-

флору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При

цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування,

швидше виростають колонії.

Прискорені методи культивування. Щоб значно швидше отримати ріст міко-

бактерій туберкульозу, запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової.

Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та

інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець

(звичайні скельця розрізають навпіл по довжині). Висушені мазки беруть стериль-

ним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кисло-

ти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видален-

ня кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким сере-

довищем Сотона або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись

живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може

інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють

10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 °С. Через 3-4 доби

скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем-

Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препара-

тах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора.

Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день (див. вкл., рис. 21).

Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школь-

нікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною

кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощу-

вання культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за мето-

дом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють

типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів.

Щоб виявити L-форми мікобактерій туберкульозу, посів матеріалу після відпо-

відної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите

в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 °С протягом 1-2 міс. Ріст L-форм

нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи.

Виготовлені мазки досліджують під фазово-контрастним мікроскопом, за допо-

могою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх мож-

на виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомо-

гою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені

антитіла проти антигенів L-форм.

276

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації

їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є

вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уре-

ази, нікотинамідази, нітратредуктази (табл. 58).

Таблиця 58

Властивості мікобактерій, що використовуються для їх ідентифікації

Вид

Час росту,

дні

Каталаза,

Уреаза

Нікотин-

амідаза

Ніаци-

наза

Нітратре-

дуктаза

Піг-

мент

M. tuberсulosis

M. bovis

M. africanum

M. kansasii

M. avium

M. smegmatis

12-25

24-40

31-42

10-20

10-12

3-5

Найважливіша ознака M. tuberсulosis – ніациновий тест – здатність синтезу-

вати значну кількість нікотинової кислоти (ніацину). Каталазна активність відносно

слабка і втрачається при 68 °С. Для швидкої диференціації збудників туберкульозу

людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і

1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на

цьому середовищі не ростуть.

Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних

проб і виявленні корд-фактора. Останній визначають методом мікрокультур Прайса,

а також на основі міцного зв’язування таких барвників, як нейтральний червоний

або нільський голубий. При нанесені на мазок розчину NaOH туберкульозні палич-

ки зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють

відповідне забарвлення.

Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені

прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних ма-

теріалах, як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст

шлунка, тканини тощо. Ці об’єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необ-

межений час і в будь-який момент можуть бути досліджені. Серед них найбільшої

уваги заслуговує молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції.

Він грунтується на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть

якщо в матеріалі знаходиться всього 5-10 мікробних клітин, за допомогою оліго-

нуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у цик-

лотермостаті, які потім можна ідентифікувати методом гельелектрофорезу. Резуль-

тати досліджень отримують через 3-4 години.

Специфічні антигени в тих же матеріалах можна також швидко виявити і за

допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла, адсорбо-

вані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську

стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед

277

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Стійкі при рості на середовищах, що містять препарат, мгк/мл

Препарат

щільних рідких

Стрептоміцин

Тубазид

ПАСК

Циклосерин

Канаміцин

Етіонамід

Біоміцин

початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберку-

льозних паличок через кожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур

на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий.

При прямому способі безпосередньо сіють відповідно оброблений матеріал на

середовища з різними концентраціями антибіотиків чи інших хіміопрепаратів. Він

ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявля-

ють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на

середовище з протитуберкульозними препаратами сіють попередньо виділені куль-

тури мікобактерій. В обох випадках обов’язковий контроль – посів на таке саме

середовище без туберкулостатиків.

У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської

стійкості мікобактерій:

1) культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

2) мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

3) глибинні посіви в напівсинтетичні середовища.

У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну

(без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних

тіл в 1 мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло

менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній,

культуру вважають стійкою. Резистентність даного штаму виражають тією макси-

мальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається

ріст, наближений до росту в контролі (табл. 59)

Таблиця 59

Шкала оцінки резистентності мікобактерій до лікарських засобів

Біологічний метод діагностики туберкульозу – зараження гвінейських сви-

нок – є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих тварин складає всього

декілька бактерійних клітин. Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином

сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі

відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотоніч-

ного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом

гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій

кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Та-

кий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках,

278

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніа-

зиду та інших хіміопрепаратів.

Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільше-

них лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів.

Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину

гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних резуль-

татах тварин умертвляють через 3-4 міс, гістологічно досліджують паренхіматозні

органи і роблять посіви на елективні середовища.

Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій

туберкульозу. В таких випадках потрібно зробити декілька послідовних заражень,

оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякіс-

ний перебіг туберкульозу, який при реверсії L-форм може перейти в генералізова-

ний процес.

Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, зара-

жаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тва-

ринах – це своєрідний “золотий стандарт” при діагностиці туберкульозу.

Серологічна діагностика. Для виявлення протитуберкульозних антитіл спо-

чатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комп-

лементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати

реакцію непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізо-

вані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із ту-

беркульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів

додають 20 мл екстракту мікобактерій, витримують при 37 °С протягом 2-ох год і

відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигену. Перед поста-

новкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усу-

нення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1:2 до 1:272.

Діагностичним титром вважають розведення 1:8. При туберкульозі РНГА буває

позитивною у 70-90 % випадків.

Хороші результати дає також імуноферментний аналіз, імуноблотинг і реакція

агрегат-гемаглютинації для визначення циркулюючих імунних комплексів. Ще точ-

нішим є радіоімунний метод, але через високу вартість діагностикумів і відсутність

радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налаго-

дити випуск моноклональних антитіл до різних антигенів мікобактерій. З їх допо-

могою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій, а також відповідні їм

антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специ-

фічним діагностичним тестом. Його використовують для визначення інфікованості

населення туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків,

відбору осіб, яким потрібно проводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність,

а також із метою діагностики туберкульозу та визначення активності процесу. Для

постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропону-

вав перший препарат, так званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або

279

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

АТК). Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого

типів, вирощених у гліцериновому бульйоні протягом 5-6 тижнів. Культуру стери-

лізують текучою парою 30 хв, випарюють при 70 °С до 1/10

первинного об’єму,

фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха

містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починаючи з

1934 р., для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений

препарат туберкуліну, який назвали РРD-S (Purified protein derivative – Seibert).

Через 5 років М.А. Ліннікова виготовила очищений туберкулін під назвою ППД-Л.

Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого

препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухий очищений туберкулін по

50000 ТО в ампулі і ППД-Л у стандартному розведенні в ампулах по 3 мл. У 0,1 мл

розчину міститься одна доза (2 ТО).

Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шпри-

цом в об’ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя. Перед ін’єкцією шкіру проти-

рають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх вводять у поверхневий

шар шкіри під кутом 15° до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: нега-

тивна проба – повна відсутність папули; сумнівна – папула розміром 2-4 мм або

лише гіперемія будь-якого розміру; позитивна – папула діаметром 5 мм і більше;

гіперергічна – у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих –

21 мм і більше.

Лепра (проказа)

Лепра – первинно-хронічна генералізована інфекційна хвороба людини, яка

характеризується специфічними ураженнями шкіри, слизових оболонок, перифе-

ричних нервів і внутрішніх органів. Збудник захворювання – Mycobacterium leprae.

Окрім того, у щурів лепру викликає M. lepraemurium, морфологічно і тинкторі-

ально дуже подібна до палички прокази людини.

Розрізняють дві основні клінічні форми хвороби: туберкулоїдну і лепрома-

тозну. Остання має більш тяжкий прогресуючий перебіг. Прокажений виділяє збуд-

ника при кашлі, чханні і розмові, оскільки він у великій кількості знаходиться у

слизовій оболонці носоглотки. Зараження людей відбувається частіше повітряно-

краплинним шляхом при тісному контакті з хворими на проказу.

При лабораторній діагностиці лепри використовують переважно бактеріо-

скопічний метод дослідження, значно рідше біопробу на мишах і броненосцях-

армадилах та алергічну пробу з лепроміном.

Матеріалом для дослідження служать зскрібки слизової оболонки носа, ска-

рифікати з уражених ділянок шкіри, особливо з надбрівних дуг, мочок вушних

раковин, підборіддя, а також біоптати лепром і ліфматичних вузлів.

Зіскоб слизової оболонки з обох боків носової перегородки проводять метале-

вою ложечкою до появи краплі крові. Для взяття скарифікату шкіру в місці уражен-

ня затискають двома пальцями в складку,здовж якої скальпелем роблять невеликий

280

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

розріз глибиною 1-2 мм. Зскріб зі стінок надрізу переносять на предметне скло.

Виготовлені мазки забарвлюють за Цілем-Нільсеном або за методом Семеновича-

Марциновського. При проведенні гістологічних досліджень біоптатів частину зрізів

також фарбують одним із вказаних методів для виявлення мікобактерій.

У мазках лепрозні бактерії мають вигляд рубіново-червоних прямих або ледь

зігнутих паличок з округленими кінцями. При мікроскопії гістологічних зрізів

видно їх скупчення всередині клітин, де палички розташовуються паралельно,

нагадуючи пачки сигар. Це дає змогу диференціювати їх від мікобактерій тубер-

кульозу, які за своїми морфологічними і тинкторіальними властивостями подібні

до збудника лепри (див. вкл., рис. 22).

При посівах лепрозних матеріалів на елективні для мікобактерій середовища

ріст відсутній. Гвінейські свинки не чутливі до M. lepraе.

Біологічну пробу ставлять на мишах (особливо чутлива японська танцююча

миша). Гомогенат досліджуваного матеріалу вводять у подушечку задньої лапки

тварин, імунологічну реактивність яких понижують введенням Т-імунодепресантів.

У позитивних випадках на місці інокуляції матеріалу через декілька місяців вини-

кає інфільтрат, що містить гранулеми із розташованими всередині клітин міко-

бактеріями. При зараженні броненосців (армадил) у них розвиваються типові

множинні вузли (лепроми) в тканинах і органах, де мікроскопічно виявляють ба-

гато лепрозних бактерій.

Алергічну пробу з лепроміном використовують, в основному, для диферен-

ціації лепроматозної від туберкулоїдної форм прокази. Алерген готують із про-

стерилізованих в автоклаві гомогенатів уражених тканин, що містять величезну

кількість мікобактерій. Лепромін вводять внутрішньошкірно в середній третині

передпліччя в об’ємі 0,1 мл.

Через 48 год у позитивних випадках розвивається пляма гіперемії або папула

(реакція Фернандеса). Значно пізніше (1-2 міс.) може утворитися горбик, часто з

некрозом (реакція Міцуди). У хворих на лепроматозну форму алергічна проба буде

негативна, а у хворих на туберкулоїдну форму та у здорових людей – позитивна.

Отже лепромінова проба діагностичного значення не має, її використовують лише

для визначення клінічної форми хвороби і прогнозу.

Мікобактеріози

У навколишньому середовищі існує багато атипових потенційно патогенних

мікобактерій. Частина з них виділяється від людей і тварин при різноманітних

захворюваннях легень, шкіри, лімфатичних вузлів, інших тканин і органів. Вони

отримали загальну назву мікобактеріози. Роль умовно-патогенних мікобактерій в

інфекційній патології людини зростає з кожним роком. У цю групу захворювань

не входять туберкульоз і проказа, хоч деякі з них мають подібний перебіг. Існуючі

методи лікування туберкульозу і мікобактеріозів різні, у зв’язку з чим мікробіоло-

гічна ідентифікація збудників набуває особливого значення.

281

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

За класифікацією Раньйона атипові мікобактерії поділяються на 4 групи:

фотохромогенні, скотохромогенні, нефотохромогенні та швидкоростучі.

До фотохромогенних мікобактерій належать Mycobacterium kansasii, M. mari-

num, M. ulcerans, M. simiaе, M. szulgai. Всі вони кислотостійкі, утворюють жовто-

оранжевий пігмент на світлі, викликають туберкульозоподібні захворювання

легень, лімфаденіти, ураження шкіри і підшкірної клітковини. M. ulcerans, на-

приклад, спричиняє виразку Бурулі.

Скотохромогенні мікобактерії (M. scrofulaceum, M. aquaе, M. flavescens та ін.)

утворюють жовто-оранжевий пігмент у темноті, викликають шийні лімфаденіти

у дітей, рідше патологічні процеси в легенях.

Нефотохромогенні види – M. avium, M. intracellulare, M. xenopi – мають дуже

слабку пігментацію колоній, або вони зовсім не забарвлені, викликають туберку-

льозоподібні захворювання легень, шкіри, нирок, кісток і суглобів, небезпечні для

хворих з імунодефіцитами, особливо при ВІЛ-інфекції. Вони викликають тубер-

кульоз у птахів і рідко у людини (M. avium).

До групи швидкоростучих мікобактерій віднесені M. fortuitum, M. friеdmanii,

M. malmoense, M. smegmatis, M. phlei. Вони причетні до виникнення абсцесів після

ін’єкцій у наркоманів, запалення навколо імплантованих об’єктів (наприклад, про-

тезів серцевих клапанів). Ураження легень і лімфаденіти у дітей викликає M. mal-

moense. Практичне значення в плані диференціації різних видів мікобактерій має

M. smegmatis, особливо при лабораторній діагностиці захворювань сечостатевої

системи.

Мікробіологічна діагностика. Матеріалом для дослідження служить харко-

тиння, вміст виразок та інших уражень шкіри, пунктати лімфатичних вузлів, про-

мивні води бронхів, сеча та ін. Лабораторні дослідження проводять за тими ж

принципами і методами, що й при туберкульозі.

Після первинної мікроскопії матеріал сіють на середовища Левенштейна-

Йенсена, Фінна і обов’язково на середовище з саліцилатом натрію. Перед посівом

патологічний матеріал обробляють 15-20 хв 2-5 % розчином сірчаної кислоти або

10 % розчином фосфату натрію протягом 18-20 год при 37 °С. Атипові мікобак-

терії більш чутливі до такої обробки, ніж палички туберкульозу. Якщо обробляти

харкотиння малахітовим зеленим або генціановим фіолетовим – виділення збуд-

ників мікобактеріозів збільшується в 3-4 рази.

Для ідентифікації атипових мікобактерій запропоновано багато тестів. Однак

у бактеріологічних лабораторіях практичних медичних установ використати їх про-

сто неможливо. Найчастіше для встановлення виду збудника враховують колір ко-

лоній, швидкість росту субкультур, ріст при різних температурах і особливо на

середовищі з саліцилатом натрію, визначення каталази, синтезу ніацину та ін. Прак-

тично всі види атипових мікобактерій дають ріст на середовищі з саліцилатом на-

трію, в той час як збудники туберкульозу на ньому не ростуть. Ніацин синтезує

лише M.tuberculosis, а збудники мікобактеріозів не утворюють нікотинової кислоти.

Розроблені методи ідентифікації атипових мікобактерій в реакціях преципі-

тації і фаголізису. Серологічні реакції для діагностики мікобактеріозів, особливо

282

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

такі як РЗК, РІФ, РНГА, можна буде використовувати при умові виготовлення спе-

цифічних тест-систем. Великі можливості для визначення збудників цих захво-

рювань відкриває впровадження полімеразної ланцюгової реакції.

Актиномікоз

Актиномікоз – хронічне гранулематозне гнійне захворювання різних тканин

і органів, що викликається актиноміцетами. Воно супроводжується інфільтрацією

тканин, абсцесами, норицями, утворенням щільних зерен (друз). Основні збудни-

ки – Actinomyces israelii і A.bovis.

Матеріалом для лабораторної діагностики служить гній, харкотиння, сеча,

випорожнення, спинномозкова рідина, пунктати і біоптати уражених тканин. Най-

кращі результати дають мікроскопічні й бактеріологічні методи дослідження.

Бактеріоскопію проводять для виявлення друз. Для цього у тонкому шарі

рідкого або розрідженого матеріалу в чашці Петрі відбирають під лупою гнійні

шматочки або зерна, переносять їх на предметне скло в краплю 10-20 % розчину

NaOH, трохи підігрівають, накривають покривним скельцем і досліджують під

мікроскопом (×40). Друзи виглядають як повстяноподібні скупчення міцелію, від

яких на периферію радіально (подібно до променів сонця) відходять гіфи з потов-

щенням на кінцях (рис. 79).

Мікроскопічно досліджують і забарвлені препарати друз. З цією метою зер-

на або гнійні шматочки промивають водою, вміщують на предметне скло, покри-

вають другим склом, обережно натискують, рознімають, отримуючи два рівномі-

рних мазки. Забарвлюють їх за Грамом і Цілем-Нільсеном. При імерсійній мікро-

скопії виявляють клітини міцелію (рис. 79, 1), паличкоподібні та кокоподібні

утвори, а також спори. За Грамом спори фарбуються у темно-фіолетовий, а дру-

зи – у рожевий колір. При забарвленні за Цілем-Нільсеном міцелій має синій, а

спори рожевий колір. Якщо друзи не виявляють, із досліджуваного матеріалу го-

тують звичайні мазки і забарвлюють їх за Грамом. При цьому під мікроскопом

виявляють пучки міцелію або окремі нитки фіолетового кольору. Виявлення друз

або тонкого несептованого міцелію та спор підтверджує діагноз актиномікозу.

Рис. 79. Actinomyces israelii: 1 – міцелій; 2 – друзи.

283

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Ферментація

Вид

рибози ксилози рафінози крохмалю

Чутливість до

хлорамфеніколу

Actinomyces israelii + + + + +

Actinomyces bovis

−

Бактеріологічне дослідження. Патологічний матеріал від хворих, як прави-

ло, забруднений сторонньою мікрофлорою. Для позбавлення від неї матеріал цен-

трифугують у розчині пеніциліну і стрептоміцину, потім відмивають від антибіо-

тиків 0,85 % розчином NaCl. Для звільнення від супутньої флори можна також

внести у пробірку 50 % розчин гліцерину і витримати 2-3 доби при 37 °С.

Оброблений таким способом матеріал висівають на середовище Сабуро,

кров’яний або сироватковий агар. Посіви інкубують при 37 °С протягом 3-5 днів.

A. israelii на сироватковому агарі утворює безбарвні пастоподібні бугристі

колонії. Повітряний міцелій утворюється слабко. У мазках із колоній видно па-

лички, кулясті і колбоподібні елементи. Старі колонії стають пухнастими, ніби

припорошені борошном.

A. bovis росте в анаеробних умовах, утворюючи безбарвні пастоподібні ко-

лонії, які рано покриваються білим повітряним міцелієм. Колонії міцно спаюють-

ся з агаром і не знімаються петлею. У мазках із колоній видно несептований міцелій,

що розпадається на паличкоподібні й кокоподібні утворення .

Ідентифікацію виділених культур проводять за рядом ознак (табл. 60) Обид-

ва види не звуджують молоко, не розріджують желатин, не відновлюють нітрати.

Таблиця 60

Диференціація основних видів актиноміцетів

Cерологічна діагностика проводиться рідко. Використовують реакції зв’язу-

вання комплементу і непрямої гемаглютинації. Антигеном служить актинолізат.

Але обидві реакції можуть давати позитивні результати й при інших захворюван-

нях (рак легень, тяжкі гнійні процеси).

Дещо більше діагностичне значення мають імунологічні тести: реакція галь-

мування міграції лейкоцитів та алергічна проба з актинолізатом, а також кількісне

визначення імунокомпетентних клітин. Внутрішньошкірна проба при вісцераль-

ному актиномікозі часто буває негативна.

Нокардіоз

Нетиповий актиномікоз або нокардіоз – хронічне захворювання внутрішніх

органів, в основному, легень, рідко шкіри і слизових оболонок; можливий розви-

ток міцетоми стопи. Найчастішими збудниками є Nocardia asteroides і Nocardia

brasiliensis із родини Nocardiaceae. Мікробіологічна діагностика проводиться так

само, як і при актиномікозах. Матеріал для дослідження – харкотиння, гній із аб-

сцесів і нориць, біоптати тканин.

Бактеріоскопія. Препарати-мазки забарвлюють за методом Грама і Ціля-Ніль-

сена. При мікроскопії виявляють бацилярні і кокоподібні структури або скупчен-

ня паличок, що галузяться, забарвлюються за Грамом у фіолетовий колір (рис. 80).

284

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

При гістологічному дослідженні уражених тканин друз не знаходять. Для

експрес-діагностики можна використати реакцію імунофлуоресценції.

Бактеріологічне дослідження. Нокардії вирощують в аеробних умовах.

Клінічний матеріал сіють на середовище Сабуро, кров’яний і звичайний МПА. На

2-3 добу виростають дрібні воскоподібні колонії. Чисті культури ідентифікують

за морфологічними особливостями, характером росту і біохімічними ознаками.

Можна поставити біологічну пробу на мишах і гвінейських свинках здебіль-

шого при інтрацеребральному і внутрішньовенному способах зараження.

При необхідності провести серологічні дослідження ставлять реакції аглю-

тинації, преципітації в гелі, зв’язування комплементу. Для діагностики міцетоми

стопи використовують і реакцію імуноелектрофорезу.

Сифіліс та інші трепонематози

Сифіліс – хронічна інфекційна венерична хвороба людини, що має цикліч-

ний прогресуючий перебіг, уражає шкіру, слизові оболонки, внутрішні органи і

нервову систему. Збудником захворювання є Treponema pallidum.

Розрізняють три основні періоди розвитку сифілісу, методи лабораторної діаг-

ностики яких мають свої особливості. У ранній період хвороби матеріалом для

лабораторної діагностики служить виділення з твердого шанкеру, пунктат із лімфа-

тичних вузлів, зскрібки з розеол, сифілід тощо. При вторинному і третинному

періодах досліджують сироватку крові і ліквор.

У зв’язку з тим, що виділення чистих культур трепонем у звичайних бактеріо-

логічних лабораторіях неможливе, під час первинного періоду хвороби (рідко

пізніше) проводять бактеріоскопічний метод діагностики. Починаючи з вторин-

ного періоду, використовують, в основному, серологічні методи.

Бактеріоскопічне дослідження. Перед взяттям патологічного матеріалу спо-

чатку сифілітичну виразку протирають ватним тампоном, для видалення сально-

го нальоту і контамінуючої мікрофлори. Потім дно твердого шанкеру подразню-

ють скальпелем чи металевою лопаточкою або енергійно стискають виразку з боків

пальцями в гумовій рукавичці до виділення ранового ексудату. При невеликій

Рис. 80. N.asteroides: колонії (1), ланцюжки і конідії в мазку (2).

285

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

кількості прозорої рідини її можна внести у краплю 0,85 % розчину хлориду на-

трію. При неможливості взяти матеріал із дна шанкеру (фімоз, рубцювання вираз-

ки тощо) проводять пункцію регіонарних лімфатичних вузлів.

Краплю рідини з виразки або пунктату наносять на тонке предметне скло

(1,1-1,2 мм), накривають покривним скельцем і досліджують у темному полі зору

(краще!), або за допомогою фазово-контрастного чи аноптрального мікроскопа.

Бліда трепонема у темному полі зору має вигляд злегка блискучої тонкої ніжної

спіралі з крутими рівномірними округлими первинними завитками (рис. 81). Рухи

її плавні, часом вона згинається під кутом. Та особливо характерні для неї маят-

никоподібні коливання.

Збудник сифілісу необхідно відрізняти від

Treponema refringens (що колонізує зовнішні ста-

теві органи), яка товстіша, грубіша, з нерівномір-

ними крупнішими завитками і має активні без-

ладні рухи, але не згинається. Трепонеми фузосп-

ірохетозного симбіозу відрізняються тонким

рисунком, пологими завитками і безладним рухом.

При діагностиці ротового сифілісу бліду тре-

понему слід диференціювати і від зубних трепо-

нем, особливо T. dentium, а також від T. buccalis.

Першу з них взагалі важко відрізнити від сифілі-

тичної. Вона, правда, коротша, має 4-8 гострих за-

витків, маятникоподібний рух відсутній. T. buccalis товстіша, має грубі первинні

завитки і безладний рух.

При будь-яких сумнівах потрібно враховувати, що всі сапрофітні трепонеми,

на відміну від блідої, добре фарбуються аніліновими барвниками. Вони не прони-

кають у лімфатичні вузли, тому дослідження пунктатів має більшу діагностичну

цінність. Виявлення у пунктаті лімфатичних вузлів типових трепонем беззапереч-

но підтверджує діагноз сифілісу.

Отже, темнопольне дослідження надавленої краплі є найкращим методом

виявлення збудника сифілісу. Його переваги полягають у тому, що матеріал дослі-

джують швидко, а морфологія трепонем у живому стані найбільш характерна.

Тушові мазки за методом Буррі тепер не використовують.

В разі неможливості провести дослідження в темному полі зору можна вико-

ристати різні методи фарбування. Бліда трепонема погано сприймає анілінові

барвники. Із багатьох запропонованих способів забарвлення кращі результати отри-

мують при використанні фарбування за Романовським-Гімзою. Виготовлені мазки

фіксують метиловим спиртом або в суміші Никифорова. Чіткіші результати отри-

мують тоді, коли фарбу Романовського-Гімзи наливають під препарат. Для цього в

чашку Петрі кладуть уламки сірників, на них вміщують предметне скло мазком

донизу і наливають барвник до тих пір, поки він змочить мазок. Час забарвлення

при цьому подвоюють. При мікроскопії бліді трепонеми мають ніжно-рожевий

колір, а інші види трепонем забарвлюються в синій або синьо-фіолетовий колір.

Рис. 81. T. pallidum

у темному полі зору.

286

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Можна використовувати і метод сріблення за Морозовим. Трепонеми повністю

зберігають свої морфологічні особливості і виглядають під мікроскопом коричне-

вими або майже чорними. Але посріблені препарати довго не зберігаються. Ос-

таннім часом методи фарбування трепонем застосовують рідко.

Якщо розпочато лікування сифілісу хіміопрепаратами, виявити збудник у

патологічних матеріалах навіть за допомогою темного поля зору практично не

вдається. При отриманні негативного аналізу його необхідно повторити.

Серологічна діагностика сифілісу. При проведенні серологічних реакцій

тепер використовують такі уніфіковані в Україні методи досліджень: реакції зв’я-

зування комплементу (РЗК), імунофлуоресценції (РІФ), іммобілізації трепонем

(РІТ), мікрореакцію преципітації (МПР) та імуноферментний аналіз (ІФА).

Впродовж багатьох років основною й найбільш поширеною реакцією вважа-

лась реакція зв’язування комплементу або реакція Вассермана (РВ, RW). Для її

постановки використовують сироватку крові хворого на сифіліс і спинномозкову

рідину при ураженні нервової системи.

Методика постановки реакції Вассермана не відрізняється від техніки прове-

дення РЗК. Різниця лише в тім, що для РВ використовують не лише специфічний

трепонемний, а й неспецифічний кардіоліпіновий антиген.

Взяття 5-10 мл крові з ліктьової вени проводять натщесерце або не раніше 6

год після прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною температу-

рою, після вживання алкоголю і жирної їжі, у вагітних жінок за 10 днів до пологів

і породіль. Добуту з крові сироватку прогрівають при температурі 56 °С протягом

30 хв для інактивації власного комплементу. РВ обов’язково ставлять із двома ан-

тигенами: специфічним і неспецифічним.

Специфічний ультраозвучений трепонемний антиген готують із культур блідих

трепонем (штам Рейтера), вирощених у пробірках і підданих дії ультразвуку. Його

випускають у вигляді ліофільно висушеного порошку. Неспецифічний кардіоліпі-

новий антиген готують шляхом спиртового екстрагування ліпідів із бичачого сер-

ця і очищення від баластових сумішей, розфасовують в ампули по 2 мл. Для вве-

дення антигену в РВ його титрують згідно з даною інструкцією. Безпосередньо

перед постановкою РВ проводять титрування комплементу і гемолітичної сиро-

ватки за такою ж схемою, як і в РЗК. Реакцію Вассермана ставлять як якісним, так

і кількісним методом. Якісну реакцію проводять у трьох пробірках із двома анти-

генами за звичайною схемою (табл. 61).

Результати реакції оцінюють за 4 плюсовою системою: позитивна реакція –

коли є повна або значна затримка гемолізу (4+, 3+); слабопозитивна реакція – част-

кова затримка гемолізу (2+); сумнівна реакція – незначна затримка гемолізу (1+).

В разі виникнення повного гемолізу РВ вважають негативною (див. вкл., рис.23).

Кожну сироватку, що дала позитивну якісну реакцію, необхідно дослідити і

кількісним методом з послідовним її розведенням від 1:10 до 1:640 (табл. 62).

Титром досліджуваної сироватки (титр реагінів) вважають те максимальне її

розведення, при якому настає повна (4+) або значна (3+) затримка гемолізу.

Кількісний метод постановки РВ має важливе значення для оцінки ефективності

287

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Номер пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Сироватка хворого, 1:5,

інактивована

0,25

→

→ → → → → ↓

Розведення сироватки 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 -

Кардіоліпіновий антиген

у робочій дозі

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Комплемент у робочому

титрі

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Експозиція в термостаті 45 хв при 37 °С

Гемолітична система 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

Експозиція в термостаті 60 хв при 37 °С

Можливий результат 4+ 4+ 4+ 3+ - - - -

У даному випадку титр сироватки 1:80

Таблиця 62

Схема кількісного методу реакції Вассермана

Номер пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 (контр.)

Інактивована сироватка хворого 1:5 0,25 0,25 0,25

Антиген трепонемний в робочій дозі 0,25 - -

Антиген кардіоліпіновий в робочій дозі - 0,25 -

Ізотонічний розчин хлориду натрію - - 0,25

Комплемент у робочому титрі 0,25 0,25 0,25

Струсити, поставити на 45 хв у термостат при 37 °С

Гемолітична система 0,5 0,5 0,5

Струсити, поставити на 45-60 хв у термостат при 37 °С

лікування сифілісу. Швидке зниження титру реагінів вказує на успішну терапію.

Якщо ж титр сироватки довго не знижується, це свідчить про відсутність ефек-

тивності застосованих препаратів і необхідність змінити тактику лікування.

При підозрі на серонегативний первинний сифіліс або прихований, третин-

ний чи вроджений, рекомендують ставити реакцію Вассермана на холоді за тією

ж схемою. В разі підозріння на нейросифіліс РВ проводять із спинномозковою

рідиною, яку не інактивують, оскільки вона не містить власного комплементу. В

реакцію вводять нерозведений ліквор і в розведеннях 1:2 і 1:5.

Реакція Вассермана стає позитивною через 2-3 тижні після появи твердого

шанкру. При вторинному сифілісі вона випадає позитивною в 100 % випадків, у

третинному – в 75 %.

Окрім того, в комплексі серологічних реакцій (КСР) як скринінг-тест викорис-

товують мікрореакцію преципітації з плазмою крові або інактивованою сироваткою.

Таблиця 61

Схема постановки якісної реакції Вассермана

288

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Мікрореакцію преципітації ставлять із кардіоліпіновим антигеном. Прин-

цип реакції полягає в тому, що при додаванні до плазми або сироватки крові хво-

рого на сифіліс емульсії кардіоліпінового антигену утворюється преципітат (ком-

плекс антиген-антитіло), який осідає у вигляді пластівців білого кольору. Корис-

туються такою методикою: у лунку пластини вносять піпеткою три краплі плазми

(або інактивованої сироватки), потім додають одну краплю емульсії стандартного

кардіоліпінового антигену. Компоненти реакції змішують струшуванням пласти-

ни протягом 5 хв, після чого додають три краплі 0,9 % розчину хлориду натрію і

залишають при кімнатній температурі ще на 5 хв. Обов’язково ставлять контроль

із слабопозитивною сироваткою крові. Результати оцінюють неозброєним оком

над штучним джерелом освітлення. При появі в лунці великих пластівців реакцію

вважають позитивною (4+, 3+), середніх і дрібних – як слабопозитивну (2+, 1+).

При негативному результаті преципітат не утворюється.

Мікрореакцію преципітації можна проводити і кількісним методом для вста-

новлення титру преципітуючих антитіл і оцінки на цій основі ефективності ліку-

вання. Більш високі титри МРП отримують з плазмою, ніж із сироваткою. За кор-

доном аналогом МРП із сироваткою хворого є VDRL (Veneral disease research

laboratory), а з плазмою – RPR (Rapid plasma reagin).

Реакція імунофлуоресценції (РІФ). До групи специфічних реакцій, які ши-

роко вживаються для серологічної діагностики сифілісу, відноситься непряма ре-

акція імунофлуоресценції. Як антиген, в ній використовують завись патогенних

блідих трепонем штаму Нікольса із паренхіми яєчок кролика на 7-ий день після

зараження. Реакцію ставлять у двох модифікаціях: РІФ-АБС і РІФ-200. У першо-

му варіанті використовують сорбент антитіл (сонікат) – ультраозвучений трепо-

немний антиген для РЗК. Його випускає Каунаське підприємство з виробництва

бактерійних препаратів (Литва). При варіанті РІФ-200 сироватку хворого розво-

дять у 200 разів з метою зняти вплив групових протитрепонемних антитіл.

Постановку РІФ-АБС проводять на тонких, добре знежирених предметних

скельцях. На зворотному боці скелець склорізом позначено 10 кружечків, діамет-

ром 0,7 см. У межах кружка на скло наносять антиген – завись блідих трепонем –

у такій кількості, щоб у полі зору їх було 50-60. Мазки висушують на повітрі,

фіксують над полум’ям і 10 хв в ацетоні. В окрему пробірку вносять 0,2 мл сор-

бенту (сонікату) і 0,5 мл сироватки крові хворого, добре перемішують. Суміш на-

носять на мазок (антиген) так, щоб рівномірно його покрити, витримують 30 хв у

вологій камері при 37 °С (І фаза реакції). Після цього мазок промивають фосфат-

ним буфером, висушують і наносять на нього антиглобулінову флуоресцуючу си-

роватку на 30 хв, ставлять у вологу камеру при 37 °С (ІІ фаза). Препарат знову

промивають фосфатним буфером, висушують і досліджують під люмінесцентним

мікроскопом.

При позитивній реакції бліді трепонеми випромінюють золотаво-зелене сяй-

во, при негативній – не світяться.

Техніка постановки РІФ-200 така сама, як і РІФ-АБС, тільки сироватку крові

хворого попередньо розводять у 200 разів фосфатним буфером. При проведенні

289

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Номер пробірки

дослід контроль компонентів

Компоненти, мл

(дослідна)

(контрольна)

2 3 4 5

Досліджувана сироватка 0,05 0,05 - - - - -

Комплемент активний 0,15 - 0,15 0,15 0,15 - -

Комплемент інактивований - 0,15 - - - 0,15 -

Антиген 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35

Позитивна сироватка - - 0,05 0,05 - - -

Негативна сироватка - - - - 0,05 0,05 -

реакції імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною хворого на сифіліс нерво-

вої системи використовують РІФ-ц і РІФ-10, тобто ліквор вводять у реакцію не-

інактивованим і нерозведеним, або розведеним 1:10.

Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ) грунтується на феномені втра-

ти їх рухливості у присутності іммобілізуючих протитрепонемних антитіл сиро-

ватки хворого і комплементу в умовах анаеробіозу. Як антиген в реакції викорис-

товують завись блідих трепонем із тестикулярної тканини кролика, зараженого

лабораторним штамом Нікольса. Завись розводять стерильним 0,85 % розчином

хлориду натрію так, щоб у полі зору було 10-15 спірохет.

Для проведення реакції в стерильній пробірці змішують 0,05 мл сироватки

крові хворого, 0,35 мл антигену і 0,15 мл комплементу. Дослід супроводжують

контролями сироватки, антигену і комплементу (табл. 63). Пробірки вміщують в

анаеростат, створюють анаробні умови і витримують у термостаті 18-20 год при

температурі 35 °С. Потім із кожної пробірки готують препарат надавленої краплі,

підраховують не менше 25 трепонем і відмічають, скільки з них рухливих і скільки

нерухливих. Відсоток специфічної іммобілізації блідих трепонем підраховують

за такою формулою:

,100

ВА

Х ⋅

−

де Х – відсоток іммобілізації, А – число рухливих трепонем в контрольній

пробірці, В – число рухливих трепонем у дослідній пробірці. Реакція вважається

позитивною, коли відсоток іммобілізації становить 50 і більше, слабопозитивною –

від 30 до 50, сумнівною – від 20 до 30 і негативною – від 0 до 20.

Приклад позитивної РІТ:

Таблиця 63

Постановка реакції іммобілізації трепонем (мікроанаеростатна методика)

У практичних лабораторіях використовують більш простий меланжерний

метод РІТ за М.М. Овчинниковим. Анаеробні умови досліду створюються вміщен-

ням реагуючої суміші (сироватки, антиген, комплемент) у меланжер, обидва кінці

якого закривають гумовим кільцем. Меланжерна методика дозволяє обходитись

без складного обладнання та апаратури для створення анаеробіозу, але дає такі

результати, які не поступаються класичній мікроанаеростатній методиці.

290

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Реакції іммобілізації трепонем та імунофлуоресценції вважають найбільш

специфічними в серологічній діагностиці сифілісу. І все ж таки, РІТ, незважаючи

на її специфічність, не рекомендують для використання в широкій практиці через

трудомісткість постановки.

Імуноферментний аналіз (ІФА) проводять як із кадріоліпіновим антигеном

(неспецифічна, відбіркова реакція), так і з трепонемним (специфічна реакція), яка

підтверджує діагноз сифілісу.

Принцип непрямого методу ІФА полягає в тому, що до антигена, адсорбова-

ного на твердій фазі в лунках планшети, вносять досліджувану сироватку. Якщо

вона містить антитіла проти трепонем, утворюється комплекс антиген-антитіло (І

фаза). Після відмивання незв’язаних неспецифічних антитіл у лунки вносять ан-

тиглобулінову сироватку, кон’юговану з ферментом (частіше всього з пероксида-

зою хріну). Кон’югат міцно приєднується до комплексу антиген-антитіло (ІІ фаза).

Після відмивання незв’язаного кон’югату в лунки додають забарвлюючий

субстрат ОФД – ортофенілендіамін (ІІІ фаза). Пероксидазну реакцію зупиняють,

додаючи сірчану кислоту. Для контролю ставлять такі ж проби з позитивною та

завідомо негативною сироватками.

Облік результатів аналізу проводять за допомогою фотометра, який визначає

оптичну густину в двохвильовому режимі (492 нм і 620 нм). Для постановки ре-

акції ензиммічених антитіл, окрім фотометра, потрібні одно- та восьмиканальні

автоматичні піпетки з поліпропіленовим наконечником і відповідні набори діаг-

ностичних тест-систем.

Метод ІФА знаходить широке використання в серологічній діагностиці сифі-

лісу. Він однаково ефективний для виявлення хвороби в інкубаційному періоді

(через 1-2 тижні після інфікування), при клінічних проявах хвороби і прихованих

її формах. Дуже часто ІФА використовують при скринінгових обстеженнях насе-

лення, особливо на станціях переливання крові.

У лабораторній практиці інколи застосовують також реакцію імунного при-

липання (РІП) та реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА). Перша з них грун-

тується на тому, що патогенні тестикулярні трепонеми штаму Нікольса при змі-

шуванні з сироваткою хворого в присутності комплементу і еритроцитів людини

прилипають до поверхні червоних кров’яних тілець. РНГА досить широко вико-

ристовується для діагностики сифілісу завдяки своїй методичній простоті. Вона

стає позитивною вже через три тижні після зараження. Позитивний результат ре-

акції залишається впродовж років після видужання. Аналогом цієї реакції за кор-

доном є ТРНА (Treponema pallidum haemoagglutination).

Ендемічні побутові трепонематози

В ряді країн Африки, Південної Америки, Азії зустрічаються хронічні трепоне-

матози – фрамбезія, пінта, беджель, які передаються переважно побутовим шляхом.

Фрамбезія (тропічна гранулема) – захворювання, що має хронічний реци-

дивуючий характер, характеризується ураженням шкіри, слизових оболонок, кісток

291

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

і суглобів, частіше зустрічається у дітей і підлітків, що проживають у країнах із

вологим тропічним кліматом. Збудником хвороби є Treponеma pertenue, яка за свої-

ми морфологічними, тинкторіальними і культуральними властивостями подібна

до блідої трепонеми.

Матеріалом для лабораторної діагностики фрамбезії служать виділення або

біоптати з папул і папілом (фрамбезидів), а також пунктати лімфатичних вузлів,

які досліджують методом надавленої краплі в темному полі зору. У свіжих папу-

лах за цим методом трепонеми фрамбезії виявляють у 80-100 % випадків. Однак

відрізнити їх від блідої трепонеми в темному полі зору, а також за допомогою

сріблення чи інших методів забарвлення практично неможливо. На відміну від

T.pallidum збудник фрамбезії зникає з регіонарних лімфатичних вузлів зразу ж

після загоювання фрамбезидом.

Серологічна діагностика захворювання базується на виявленні антитіл у си-

роватці крові за допомогою реакції Вассермана, мікропреципітації, іммобілізації

трепонем, РІФ, РНГА, ІФА.

Пінта (карате, плямиста хвороба) – первинно-хронічний генералізований

трепонематоз, що характеризується появою на шкірі поодиноких, а пізніше мно-

жинних плям червоного або синьо-фіолетового кольору і гіперкератозу. На ураже-

них ділянках настає депігментація типу вітіліго. Пізніше виникає поліаденіт, ура-

ження кісток, внутрішніх органів і нервової системи. Частіше хворіють темношкірі

люди всіх вікових категорій. Збудник – Treponema carateum. У морфологічному,

культуральному і антигенному відношенні вона подібна до блідої та інших видів

трепонем. При експериментальному зараженні кроликів, гвінейських свинок і

хом’ячків у них не виникає специфічних уражень шкіри.

Для лабораторної діагностики карате від хворих беруть зскрібки або біопта-

ти уражених ділянок шкіри і сироватку крові.

Бактеріоскопічна діагностика грунтується на виявленні трепонем у дослі-

джуваному матеріалі за допомогою темнопольного мікроскопа, а також при за-

барвленні мазків за Романовським-Гімзою.

Для серологічної діагностики пінти цілком придатні всі методи виявлення

антитіл у сироватці крові, які використовують при розпізнаванні сифілісу. Особ-

ливо це стосується таких реакцій як РЗК, РІФ, РІТ, РНГА, ІФА та ін. Оскільки

T. carateum дуже подібна до збудників сифілісу і фрамбезії, діагностична цінність

серологічних реакцій невелика і використання їх для диференціації вказаних за-

хворювань важливого значення не має.

Беджель (ендемічний сифіліс) – хронічний генералізований трепонематоз,

широко розповсюджений в Африці, Турції, Індії, Пакистані, Австралії і на Бал-

канах. Захворювання характеризується висипанням на шкірі й слизових оболон-

ках, які нагадують ураження при вторинному сифілісі. Через 1-3 роки появля-

ються ураження підшкірної клітковини, кісток і суглобів, подібні до гумозного

сифілісу. Але уражень внутрішніх органів, серцево-судинної й нервової системи

не спостерігається. Основний спосіб передачі хвороби – контактний, через шкірні

покриви.

292

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Збудником беджелю є Treponemа endemicum (T. bejel). За морфологічними і

біологічними властивостями вона не відрізняється від блідої трепонеми. Ряд авторів

розглядають її як різновид T. pallidum, а захворювання – як окрему форму сифілі-

су. Але при беджелі ніколи не розвивається первинна сифілома (твердий шанкр).

Матеріал для лабораторного дослідження – зскрібки з елементів висипу, пун-

ктати лімфатичних вузлів, біоптати гумових уражень, сироватка крові.

Методика бактеріоскопічної діагностики (виготовлення надавленої краплі і

дослідження її в темному полі зору, забарвлення мазків за Романовським-Гімзою,

сріблення за Левадіті чи Морозовим) така сама, як і при сифілісі.

Для проведення серологічних досліджень у хворих на беджель придатні всі

ті реакції, що використовуються при сифілісі, але антитіла виявляють у значно

нижчих титрах. Тому діагностику захворювання в більшості випадків проводять

на основі клінічних симптомів.

Лептоспіроз

Лептоспіроз (водна гарячка) – гостра зоонозна природно-вогнищева інфек-

ційна хвороба, що викликається лептоспірами і супроводжується гарячкою, ура-

женнями нирок, печінки, серцево-судинної і нервової систем, у тяжких випадках

жовтяницею і геморагіями.

Всі патогенні лептоспіри об’єднані в один вид Leptospira interrogans, а сап-

рофітні – в L. biflexa. Тепер відомо понад 200 сероварів лептоспір, які складають

38 серогруп. На території України виділяють 13 сероварів, з яких захворювання

найчастіше викликають Leptospira incterohaemorrhagiaе, L. grippotyphosa,

L. hebdomadis, L. canicova, L. pomona.

Резервуаром і джерелом збудника в природі є дикі гризуни (миші, полівки,

ондатри) та домашні тварини (свині, корови, кози, коні, собаки). Зараження лю-

дей відбувається через воду, контаміновану сечею хворих тварин та носіїв, або

при догляді за хворою худобою.

Для лабораторної діагностики лептоспірозу використовують мікроскопічний,

бактеріологічний, біологічний і серологічний методи дослідження.

Взяття і доставка досліджуваного матеріалу. Від хворого беруть кров,

сечу, бронхоальвеолярні змиви, спинномозкову рідину (при наявності менінгеаль-

них симптомів); від трупів – кров, ліквор, гомогенати внутрішніх органів. За епі-

деміологічними показаннями досліджують воду, харчові продукти, гризунів на

лептоспіроносійство, сечу домашніх тварин.

У перші дні захворювання, коли є гарячковий період, для посіву, постановки

біопроби і первинної бактеріоскопії беруть кров; на 10-16-ий день хвороби – сечу

і ліквор; на 5-15-ий день – досліджують сироватку крові на виявлення протилеп-

тоспірозних антитіл. Виділення чистих культур і зараження тварин проводять у

режимних лабораторіях, куди матеріали доставляють із великими пересторогами

спеціальним нарочним. У звичайних мікробіологічних лабораторіях проводять

лише бактеріоскопічні й серологічні дослідження.

293

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Мікроскопічний метод. Лептоспіри погано забарвлюються аніліновими фар-

бами, тому досліджують живі мікроорганізми в препаратах “надавленої краплі”

за допомогою темнопольного мікроскопа з використанням сухого об’єктива (40×).

Венозну кров в об’ємі 2 мл змішують із 2-ма мл 2 % розчину цитрату натрію.

Отриману плазму центрифугують 30 хв при 3000 об/хв. Сечу, спинномозкову рідину

і завись паренхіматозних органів центрифугують протягом 2-х год при 4000 об/хв.

Пастерівською піпеткою або бактеріологічною петлею наносять краплю осаду на

тонке предметне скло (1-1,1 мм), накривають покрівним скельцем. На верхню лінзу

темнопольного конденсора наносять краплю дистильованої води, на яку кладуть

препарат “надавленої краплі”.

При мікроскопії виявляють тонкі рухливі лептоспіри з багатьма дрібними

завитками і характерними заворотами на кінцях, що надає їм вигляду літери S

(рис. 82). Щоб запобігти діагностичним помилкам, необхідно пам’ятати, що деякі

артефакти (нитки фібрину, оболонки еритроцитів), які нагадують лептоспіри, не

мають самостійного руху. Виявити збудників лептоспірозу за допомогою мікро-

скопії можна лише у свіжому досліджуваному матеріалі.

Чутливість бактеріоскопічного методу – 10

клітин/мл. Кількість мікроор-

ганізмів у крові хворих під час лептоспіремії не перевищує 10

-10

клітин/мл, тому

діагностична цінність цього методу недостатня для виявлення збудників на ранніх

стадіях хвороби. Надійніші результати дає метод імунофлуоресценції з викорис-

танням специфічних люмінесцентних сироваток.

Якщо неможливо застосувати метод прямої мікроскопії нативних матеріалів,

можна вдатися до забарвлення фіксованих мазків за Романовським-Гімзою або

негативного контрастування конго червоним. Однак після такої обробки морфо-

логія лептоспір змінюється, що може призвести до помилкових оцінок.

Бактеріологічний метод. Класичний метод виділення чистих культур леп-

тоспір потребує складних живильних середовищ і багато часу – до 1-2-х місяців.

Використовують рідкі середовища Фервольта-Вольфа, Уленгута, Терських, основ-

ним компонентом яких є інактивована кроляча сироватка.

Кров, сечу, спинномозкову рідину сіють по 10-20 крапель у 3-5 пробірок із

середовищем. Посіви інкубують при температурі 28-

30 °С. Лептоспіри розмножуються дуже повільно і

не викликають помутніння середовища. Тому для ви-

явлення їх росту через 7-10 днів інкубації з кожної

пробірки виготовляють препарат “надавленої краплі”

і мікроскопують у темному полі. Якщо ріст лептоспір

не виявляють, посіви продовжують вирощувати в

термостаті й мікроскопують через кожні 7-10 днів.

При відсутності росту протягом 3-х місяців видають

негативний результат.

При виявленні лептоспір у будь-якій пробірці

необхідно зробити пересів на свіже середовище для

збереження культури з метою її ідентифікації.

Рис. 82. Лептоспіри в темному

полі зору.

294

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Встановлення виду і серовару лептоспір проводять за допомогою реакції аг-

лютинації і лізису з типовими діагностичними сироватками. Частота виділення

культур коливається від 29 до 48 %.

Сучасна методика полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яка грунтується

на високій специфічності множення in vitro послідовності селективної ДНК, вияв-

ляє лептоспір у перші дні хвороби, навіть якщо їх кількість незначна (1-10 клі-

тин/мл). Постановка ПЛР із застосуванням довільних праймерів дозволяє дифе-

ренціювати збудників на внутрішньовидовому і субсероварному рівнях. Для іден-

тифікації лептоспір за цією методикою потрібно всього 10-12 год. Особливо

показана реакція для виявлення збудників в сечі. ПЛР виявилась позитивною в

94,4 % випадків.

Лептоспіри в досліджуваному матеріалі можна виявити за допомогою мето-

ду прямого імуноферментного аналізу. Тепер для ІФА розроблено і впроваджено

в практику високоефективний родоспецифічний діагностикум – пероксидазний

анти – Pаtos 1-кон’югат. Чутливість методу – 1,5·10

клітин/мл. Результат видають

через 24 год від початку дослідження.

Біологічний метод. У випадках забруднення досліджуваного матеріалу сто-

ронньою мікрофлорою (сеча, вода, грунт, харчові продукти тощо) проводять зара-

ження гвінейських свинок і золотистих хом’ячків. Матеріал вводять внутрішньо-

очеревинно або в скарифіковану шкіру подушечок задніх лапок. До L. іcterohae-

morrhagiaе особливо чутливі гвінейські свинки. Через 5-7 днів після зараження у

них виникає гарячка, жовтяничне забарвлення склер і слизових оболонок, крово-

виливи в органи і тканини. Лептоспіри виявляють у нирках, печінці, легенях ме-

тодом темнопольної мікроскопії.

Для зараження іншими сероварами лептоспір найбільш придатні золотисті

хом’ячки, яким матеріал вводять підшкірно, внутрішньошкірно, в черевну порож-

нину або у вену. Після загибелі тварин від них виділяють чисту культуру та іден-

тифікують її за допомогою реакції аглютинації і лізису.

При відсутності золотистих хом’ячків заражають молодих цуценят, у яких

розвивається хронічний процес, що триває декілька місяців. Лептоспіри легко

виявити в сечі тварин.

Серологічні дослідження. У практичних лабораторіях найчастіше застосовують

реакцію мікроаглютинації і лізису лептоспір (РМАЛ). Для її постановки викорис-

товують живі культури лептоспір 5-12-денного вирощування зі щільністю 50-100

клітин у полі зору. Лептоспіри повинні рухатись без спонтанної аглютинації. Для

постановки РМАЛ рекомендовані ВООЗ стандартні культури 13 серогруп, окрім то-

го, беруть і діагностичні штами українського походження. Реакцію ставлять в аглю-

тинаційних пробірках або в лунках планшет за стандартною методикою (табл. 64).

Облік реакції аглютинації проводять шляхом виготовлення з кожної пробірки

препарату “надавленої краплі” й дослідженні її під мікроскопом у темному полі

зору. При цьому слід розрізняти феномени лізису і аглютинації, які настають од-

ночасно. Лізис характеризується набряком, зернистістю лептоспір і втратою рух-

ливості. Зернисті лептоспіри склеюються по 3-8 особин, які тут же розпадаються

295

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Таблиця 64

Схема постановки реакції аглютинації і лізису лептоспір

Номер пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 (контр.)

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Сироватка хворого 1:25

0,2

→

→ → → → ↓

Розведення сироватки 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 -

Культура живих лептоспір 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Експозиція 60 хв при 37 °С або при 25 °С

на окремі зерна, які пізніше лізуються повністю. Лізис відбувається в перших про-

бірках із меншими розведеннями сироватки. Феномен аглютинації виглядає в полі

зору як утворення клубків (“павучків”), тобто склеювання лептоспір між собою.

Він спостерігається в наступних пробірках із більшими розведеннями сироватки.

Діагностичний титр реакції становить 1:100 і більше для лізису, 1:400-1:1600 і

більше для аглютинації. Реакцію необхідно ставити повторно методом парних

сироваток для визначення наростання титру антитіл.

Для визначення специфічних антитіл використовують також хімічно стабільні

мікрокапсули з адсорбованими на еритроцитах барана антигенами лептоспір.

Показники мікрокапсульного аглютинаційного тесту у 5-8 разів вищі, ніж в РМАЛ.

Антитіла за допомогою цього високоспецифічного тесту можна виявити на 1-3-й

дні хвороби.

Почали широко використовувати і реакцію непрямої гемаглютинації з відпо-

відними родоспецифічними і серогрупоспецифічними еритроцитарними діагнос-

тикумами.

Останнім часом запропоновано реакцію латекс-аглютинації з ліпополісаха-

ридним стандартним латексним Ротопа-діагностикумом.

Більш чутливий метод непрямого імуноферментного аналізу. За його допо-

могою протилептоспірозні антитіла в діагностичному титрі виявляються на 5-й

день хвороби. Виготовлені діагностичні тест-системи для визначення антитіл, де

як фермент використані пеніциліназа або каталаза, які мають перевагу порівняно

з пероксидазою хрону.

Можна використати як скринінг на антитіла до багатьох сероварів лептоспір

метод зустрічного імуноелектрофорезу.

Для визначення протилептоспірозних антитіл застосовують і РЗК. Вона ви-

сокоспецифічна, чутлива, антитіла в ній виявляються раніше, ніж в реакції мікро-

аглютинації і лізису. Антигеном є метанолові екстракти з L. interrogans, сероварів

icterohaemorrhagiae, canicola та L. biflexa.

Бореліози

До бореліозів відноситься ряд самостійних нозологічних форм захворюван-

ня, що викликаються спірохетами роду Borrelia: поворотний тиф, кліщова пово-

ротна гарячка і хвороба Лайма.

296

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Епідемічний поворотний тиф

Поворотний тиф (епідемічний, вошивий) – гостра трансмісивна рецидиву-

юча інфекційна хвороба, яку викликає Borrelia recurrentis, характеризується за-

гальною інтоксикацією, поворотною гарячкою, ураженнями печінки, селезінки,

мозкових оболонок та інших органів. При високій вошивості серед населення може

мати епідемічне розповсюдження. Переносником хвороби є воші: Pediculus

vestimenti, P. сapitis.

Основний метод лабораторної діагностики поворотного тифу – мікроскопіч-

не дослідження крові хворого в препараті товстої краплі і звичайному мазку. Для

диференціації вошивого і кліщового поворотних тифів використовують біологіч-

ну пробу на гвінейських свинках.

Бактеріоскопічне дослідження. У хворого беруть кров із пальця під час

нападу гарячки до початку або в перерві антибіотикотерапії, виготовляють препа-

рат товстої краплі й мазок. У період ремісії можна брати для дослідження кістко-

вий мозок. Висушену товсту краплю не фіксують, а безпосередньо забарвлюють

за методом Романовського-Гімзи. Можна також фарбувати метиленовим синім або

фуксином. На товсту краплю наносять барвник Романовського спочатку на 5 хв

для того, щоб пройшов гемоліз, потім його замінюють на свіжий і витримують ще

40 хв. Препарат обережно промивають водою, висушують і мікроскопують під

імерсійним об’єктивом. Борелії поворотного тифу забарвлюються в синьо-фіоле-

товий колір і мають вигляд тонких довгих ниток із 3-5-ма нерівномірними завит-

ками і загостреними кінцями, які розташовані позаклітинно. Величина їх у кілька

разів перевищує діаметр лейкоцитів (рис. 83; див. вкл., рис. 24).

Якщо в товстій краплі знаходяться великі скупчення борелій, їх важко

відрізнити від ниток фібрину. В таких випадках забарвлюють звичайний мазок

крові, який перед цим обов’язково фіксують етанолом або сумішшю Никифорова.

При мікроскопії мазка досить чітко видно борелії

з їх характерними нерівномірними вторинними за-

витками. Якщо в товстій краплі борелії не виявле-

но, мазок не досліджують.

Збудник поворотного тифу легко виявляють

за допомогою методу висячої краплі в темному

полі зору, де борелії розпізнають за їх безладним

рухом. Можна виготовляти з крові і тушеві препа-

рати за Буррі, при мікроскопуванні яких борелії

виглядають як сріблясті нитки на темному полі.

У період апірексії за допомогою мікроскопіч-

них методів виявити борелії не вдається. В таких

випадках вживають метод збагачення. У хворого беруть 8-10 мл крові, отримуюють

сироватку, яку центрифугують протягом 60 хв при 3-4-х тис. об/хв. Із осаду виго-

товляють надавлену краплю, яку досліджують у темному полі. З осаду можна виго-

товляти мазки, які забарвлюють за Романовським-Гімзою або фуксином Пфейфера.

Рис. 83. Борелії в мазку крові.

297

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Бактеріологічне дослідження. Культури борелій можна виділити від хворо-

го шляхом посіву досліджуваного матеріалу на рідкі живильні середовища з кров’ю,

сироваткою, шматочками тканин і вирощування в анаеробних умовах при темпе-

ратурі 28-30 °С. Ще краще вдається виростити їх на хоріоналантоїсній оболонці

курячих ембріонів або шляхом зараження платяних вошей. Однак виділення куль-

тур борелій на живильних середовищах малоефективне. Практичні лабораторії

цими методами не користуються.

Біологічний метод. Як додатковий метод діагностики епідемічного пово-

ротного тифу застосовують зараження кров’ю хворих молодих білих щурів або

білих мишей. Останнім вводять 0,5 мл крові внутрішньоочеревинно, а білим щу-

рам – 3-5 мл. Через 2-4 дні у заражених тварин досліджують кров із хвостових

вен, де борелії виявляють мікроскопічним методом. Гвінейські свинки нечутливі

до B. recurrentis, але чутливі до збудників кліщових борелій.

Серологічне дослідження. Поворотний епідемічний бореліоз супроводжуєть-

ся наростанням антитіл у високих титрах, але у зв’язку з постійною зміною спе-

цифічності поверхневих антигенів із кожним наступним гарячковим приступом

серологічні реакції не набули широкого застосування.

Інколи використовували імунологічну реакцію Рікенберга-Брусіна. Це реак-

ція навантаження борелій тромбоцитами. Сироватку крові хворого змішували з

цитратною плазмою крові гвінейських свинок в однакових об’ємах. До цієї суміші

додавали культуру борелій, ретельно перемішували, інкубували 15 хв у термо-

статі, а потім виготовляли препарат “надавленої краплі” й досліджували в темному

полі зору з імерсійним об’єктивом. У присутності специфічних антитіл тромбоцити

гвінейської свинки обліплювали тіла борелій і останні переставали рухатись.

Отже, виявлення борелій методом товстої краплі та звичайних мазків крові в

період нападу гарячки є швидким і вирішальним методом лабораторної діагнос-

тики епідемічного поворотного тифу.

Ендемічний поворотний тиф

Поворотна кліщова гарячка – трансмісивна рецидивуюча інфекційна хворо-

ба, яка викликається бореліями і передається кліщами. Залежно від резервуару,

географічного регіону і переносника розрізняють біля 20 самостійних нозологіч-

них форм ендемічного поворотного тифу, кожна з яких має свого збудника. Найча-

стіше ці захворювання викликають Borrelia caucasica, B. persica, B. duttoni, B. his-

pаnica, B. hermsii, B. latyschewii та ін. Вони є своєрідними ековарами збудника

хвороби. За своєю морфологією всі вони схожі на борелії епідемічного поворот-

ного тифу. Клінічна картина цих захворювань теж подібна. Люди заражаються

при укусі кліщів. Останні паразитують на хворих гризунах і тваринах-носіях, за-

ражаються від них бореліями і самі стають джерелом збудника в природі.

Матеріалом для мікробіологічної діагностики ендемічного поворотного тифу

служить кров хворих. Для виявлення борелій проводять бактеріоскопію товстої

краплі і звичайних тонких мазків крові, забарвлених за Романовським-Гімзою,

298

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

метиленовим синім чи фуксином. Необхідно пам’ятати, що при цьому захворю-

ванні спірохетемія досить помірна або навіть слабка (1-2 борелії в декількох крап-

лях), але вона має місце і між нападами. Суттєва морфологічна особливість бо-

релій ендемічного поворотного тифу та, що при дослідженні їх у темному полі

зору вони мають два контури, а B. recurrentis – один.

Досить суттєву допомогу при розпізнаванні ендемічного поворотного тифу

може надати зараження гвінейських свинок. Кров хворого в кількості 3-5 мл вво-

дять у черевну порожнину, або 1-2 краплі – у кон’юнктиву ока чи слизову оболон-

ку носа. Через 3-5 діб у крові і паренхіматозних органах тварин мікроскопічно

виявляють велику кількість борелій. Біологічна проба одночасно дозволяє дифе-

ренціювати вошивий і кліщовий поворотні тифи. B. recurrentis для гвінейських

свинок непатогенна.

Бореліоз Лайма

Хвороба Лайма (хронічна мігруюча еритема, лаймобореліоз) – хронічна або

рецидивуюча трансмісивна природно-вогнищева інфекція, що вражає нервову,

серцево-судинну системи, шкіру й суглоби, супроводжується гарячкою, ознобом,

головним болем. У половини захворілих спостерігаються вторинні висипи. Хво-

роба передається через укуси іксодових кліщів, що паразитують на диких і до-

машніх тваринах.

Серед борелій, що викликають хворобу Лайма, на основі аналізу їх ДНК ос-

таннім часом ідентифіковані три самостійні види: Borrelia burgdorferi, B. garinii,

B. afzelii. Всі вони можуть довгий час персистувати в організмі людини.

Мікробіологічна діагностика. Борелії, що викликають хворобу Лайма, дуже

вибагливі до живильних середовищ та умов культивування. Лише останнім часом

створене середовище BSK-II, придатне для їх вирощування та виділення в чистій

культурі.

Матеріалом для лабораторного дослідження служить ексудат із уражень

шкіри, спинномозкова рідина, кров. У зв’язку з відсутністю борелій у перифе-

ричній крові виділити гемокультуру практично не вдається. Але вже є спроби

виділити та ідентифікувати чисті культури збудників з уражень шкіри і ліквору.

Частіше виявляють борелій у цих же матеріалах мікроскопічним методом за до-

помогою темного поля або в забарвлених азур-еозином мазках. B. burgdorferi є

однією з найкрупніших борелій.

Для виявлення борелій в тканинах і рідинах організму використовують полі-

меразну ланцюгову реакцію. Вже розроблені і впроваджені в практику специфічні

тест-системи для цієї реакції.

І все ж основу лабораторної діагностики лаймобореліозу складають серо-

логічні реакції. Зокрема досить широко використовують реакцію непрямої іму-

нофлуоресценції та імуноферментний аналіз із специфічним антигеном, адсорбо-

ваним на лунках полістиролових планшет. Великі перспективи має широке впро-

вадження методу вестерн блоту, за допомогою якого можна виявити антитіла до

унікального білка B. burgdorferi.

299

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Рикетсіози

Група гострих трансмісивних інфекційних хвороб, що викликаються рикет-

сіями, отримала загальну назву рикетсіози. Ці захворювання характеризуються

гарячкою, генералізованим васкулітом, висипанням на шкірі, ураженням централь-

ної нервової системи. Розрізняють антропонозні й зоонозні рикетсіози.

Патогенні рикетсії належать до родини Rickettsiaceае і поділені на три роди:

Rickettsia, Coxiella, Rochalima. Залежно від біологічних властивостей збудників,

клінічної картини хвороб та їх епідеміологічних особливостей виділяють 5 груп

рикетсіозів: група висипного тифу, гарячка цуцугамуші, група кліщових плямис-

тих гарячок, пневморикетсіоз (Ку-гарячка) і пароксизмальний рикетсіоз (волинська

п’ятиденна гарячка). Всі види рикетсій адаптовані до існування в організмі во-

шей, бліх і кліщів, які є переносниками захворювань.

Епідемічний висипний тиф

Збудником висипного тифу є Rickettsia prowazekii. Захворювання характери-

зується раптовим початком, високою температурою, сильною інтоксикацією, ура-

женням прекапілярних розгалужень артерій і розеольозно-петехіальним висипом.

Будь-які маніпуляції з рикетсіями Провачека дуже небезпечні. Тому виділен-

ня збудника з крові хворих або іншого досліджуваного матеріалу, а також зара-

ження тварин, курячих ембріонів і культур клітин проводять лише при наукових

дослідженнях у спеціальних режимних лабораторіях.

Широкі можливості для виявлення рикетсій в досліджуваному матеріалі

відкриває полімеразна ланцюгова реакція. Вже виготовлені праймери для родо-

специфічної і видоспецифічної діагностики рикетсій з чутливістю 1-10 клітин на

пробу. Метод ПЛР дає змогу рано і швидко поставити діагноз висипного тифу.

При цьому можна використати не тільки свіжий нативний чи заморожений матері-

ал, а й фіксований формаліном або метанолом.

Для виявлення рикетсій у досліджуваному матеріалі, в організмі заражених

тварин, курячому ембріоні або в тілі вошей, бліх і кліщів використовують мікроско-

пію. Метод забарвлення мазків повинен чітко й контрастно виявити як позаклі-

тинні, так і внутрішньоклітинні (в тому числі й внутрішньоядерні) форми рикетсій.

Для цієї мети найчастіше вживають методи Романовського-Гімзи і Здродовського.

При фарбуванні азур-еозином протягом 18-20 год рикетсії набувають різних

відтінків голубого кольору. Мазки при цьому необхідно фіксувати метанолом або

сумішшю Никифорова.

Швидше виявляють рикетсії при забарвленні за способом Здродовського.

Матеріал наносять тонким шаром на предметне скло, фіксують на полум’ї, нали-

вають на 5 хв розведений карболовий фуксин (10-15 крапель барвника на 10 мл

дистильованої води). Препарат знебарвлюють 0,15 % розчином оцтової або соля-

ної кислоти, промивають водою і протягом 10 с дофарбовують 0,5 % водним роз-

чином метиленового синього. Рикетсії забарвлюються в рубіново-червоний, ци-

топлазма клітин – в голубий, а ядра – в синій колір (див. вкл., рис. 25).

300

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Надійніші результати виявлення рикетсій у досліджуваному матеріалі дають

прямий і особливо непрямий методи флуоресценції. Прямий метод полягає в тому,

що виготовлений і висушений мазок крові, препарат-відбиток або тонкий зріз

органів тварин, вошей тощо обробляють специфічною флуоресцентною сироват-

кою і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. При наявності рикетсій

видно специфічне золотаво-зелене світіння.

Більш прогресивний непрямий метод пов’язаний із попередньою обробкою

мазків чи препаратів звичайною імунною (нелюмінесцентною) сироваткою, а потім

міченою антиглобуліновою сироваткою проти глобулінів того виду тварин, на яких

отримували звичайну імунну діагностичну сироватку. Можливе також викорис-

тання антикомплементарної флуоресцентної сироватки. В обох випадках при по-

зитивному результаті видно характерне люмінесцентне світіння.

А поки що для діагностики епідемічного висипного тифу використовують, в

основному, серологічні реакції, особливо такі, як аглютинації, зв’язування комп-

лементу, непрямої гемаглютинації, непрямого гемолізу та імуноферментний аналіз.

Серологічна діагностика. Для макроскопічної реакції аглютинації Вейгля

використовують корпускулярний рикетсіозний антиген (500 млн клітин/мл). Си-

роватку хворого розводять від 1:40 до 1:1280 в об’ємі 0,25 мл і в кожну пробірку

добавляють по 0,25 мл антигену (табл. 65). При цьому необхідно враховувати, що

після внесення антигену розведення сироватки подвоюється.

Облік реакції проводять неозброєним оком або за допомогою аглютиноскопа

через 2 год після того, як пробірки вийняли з термостата. Аглютинат рикетсій

виглядає як ніжний, дрібнозернистий осад на дні пробірки, інтенсивність якого

позначають за чотириплюсовою системою. Реакцію Вейгля вважають високоспе-

цифічною. Вона випадає в діагностичному титрі 1:40-1:80 і більше майже у 100 %

хворих на висипний тиф вже на 4-5-й день хвороби. Ще більш достовірні резуль-

тати отримують при постановці реакції методом парних сироваток.

Таблиця 65

Схема постановки реакції аглютинації Вейгля

Номер пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 (контр.)

Ізотонічний розчин хлориду

натрію

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Сироватка хворого 1:10

0,25

→

↓

Антиген рикетсій Провачека 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Остаточне розведення

сироватки

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 -

Експозиція в термостаті 18 год при 37 °С

Широко вживану в минулому неспецифічну реакцію аглютинації Вейля-Фе-

лікса з діагностикумом Proteus vulgaris ОХ

тепер не використовують.

Досить чутливим і високоспецифічним методом серологічної діагностики

висипного тифу є постановка реакції зв’язування комплементу. Комплементзв’я-

зуючі антитіла появляються в сироватці крові на 5-6-й день хвороби і досягають

301

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

максимальних титрів на 15-16-й день. Через 1-2 місяці титр їх починає падати, але

ці антитіла зберігаються в організмі протягом багатьох років. РЗК особливо часто

використовують для диференціальної діагностики між епідемічним і ендемічним

висипним тифом, а також з рецидивною хворобою Брілля-Цінссера.

Сироватку крові хворого розводять від 1:10 до 1:250. Антигенами для РЗК

можуть бути як корпускулярні, так і розчинні. Пробірки ретельно струшують після

додавання кожного компоненту. Першу фазу реакції проводять або при низькій

температурі в холодильнику протягом 18-20 год, або при 37 °С впродовж 60 хв.

Другу фазу реакції після додавання гемолітичної системи проводять у термостаті

протягом 30-45 хв.

Облік РЗК роблять через 1-2 год після того, як пробірки вийняли з термостату,

за класичною чотириплюсовою системою. Реакцію вважають позитивною при титрі

сироватки 1:60 під час захворювання і 1:10 – при ретроспективній діагностиці.

Ще більш чутливою є реакція непрямої гемаглютинації, яка стає позитивною

з 3-4-го дня захворювання. Вже в початковий період хвороби діагностичний титр

РНГА може досягати 1:1000, а через 2-3 тижні – 1:4000-1:64000. У зв’язку з цим

інактивовану сироватку хворого розводять у пробірках чи лунках полістиролових

планшет від 1:250 до 1:64000 в об’ємі 0,4 мл. У кожну пробірку (лунку) добавля-

ють по 0,1 мл антигена, тобто 1 % зависі еритроцитів із адсорбованим на них

рикетсіозним антигеном. Пробірки (пластини) ретельно струшують і вміщують у

термостат на 45 хв при температурі 37 °С. Результат реакції враховують за наяв-

ністю або відсутністю гемаглютинації. Обов’язково ставлять контроль сенсибілі-

зованих еритроцитів на відсутність спонтанної аглютинації.

Високу чутливість і специфічність має також реакція непрямого гемолізу, яку

використовують як експрес-метод діагностики в ранній період хвороби. Для її

постановки рикетсіозний антиген адсорбують на еритроцитах барана, а методика

така сама, як і для РНГА, за винятком того, що після додавання антигена до різних

розведень сироватки в кожну пробірку вносять по 0,1 мл комплементу в розве-

денні 1:10. Пробірки вміщують у термостат на 60 хв. При позитивному результаті

настає гемоліз еритроцитів. У контрольних пробірках гемоліз відсутній. Попе-

редній облік цієї реакції можна проводити вже через 30 хв, а остаточний – через

годину.

Для серологічної діагностики висипного тифу запропоновано імунофермен-

тний метод у модифікації “захвату” антитіл IgM, які нагромаджуються при пер-

винному захворюванні, що дозволяє диференціювати його від рецидивної форми

Брілля-Цінссера.

Є спроба діагностувати епідемічний вошивий висипний тиф за допомого внут-

рішньошкірної алергічної проби, яка виявляє гіперчутливість сповільненого типу.

Ендемічний висипний тиф

Ендемічний (блошиний, щурячий) висипний тиф – гостра природно-вогни-

щева зоонозна інфекційна хвороба, характеризується гарячкою, головним болем,

302

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

розеольозно-папульозним висипом і відносно доброякісним перебігом. Людина

заражається від гризунів аліментарним шляхом, або хвороба передається блоха-

ми, значно рідше кліщами.

Збудник – Rickettsia typhi – за своїми розмірами, морфологією і антигенними

властивостями дуже подібний до рикетсій Провачка. R. typhi добре розмножуєть-

ся в жовтковому мішку курячих ембріонів, викликаючи їх загибель через 6-8 діб

після зараження, патогенна для гвінейських свинок і білих мишей. Зараження ос-

танніх через ніс викликає смертельну пневмонію з нагромадженням великої

кількості збудника в легеневій тканині, що легко виявити за допомогою бактері-

оскопії.

У зв’язку з тим, що клінічна картина щурячого висипного тифу дуже подібна

до легких форм епідемічного вошивого тифу, основне значення в лабораторній

діагностиці й диференціації обох нозологічних форм мають серологічні реакції.

Серологічна діагностика. Надійне розмежування ендемічного й епідеміч-

ного висипного тифів найчастіше проводять за допомогою реакцій аглютинації,

зв’язування комплементу, непрямої гемаглютинації та імуноферментного аналізу.

Кожну з цих серологічних реакцій проводять паралельно з антигенами рикетсій

щурячого тифу і рикетсій Провачека. У випадку ендемічного висипного тифу діаг-

ностичний титр сироватки хворого буде у 3-4 рази більшим із R. typhi, ніж із ри-

кетсіями Провачека, і навпаки. Якщо різниця між титрами антитіл у реакціях із

рикетсіями Провачека і рикетсіями ендемічного тифу незначна, проводять біоло-

гічне дослідження.

Біологічна проба. Гвінейських свинок-самців заражують внутрішньоочере-

винно кров’ю хворого. Поява у тварин гарячки і рикетсіозного періорхіту (скро-

тального феномену) безумовно підтверджує діагноз ендемічного висипного тифу,

особливо якщо в зскрібках з оболонок уражених яєчок мікроскопічно виявляють

велику кількість рикетсій.

Ку-гарячка

Ку-гарячка (пневморикетсіоз) – гостра природно-вогнищева зоонозна інфекцій-

на хвороба, що характеризується гарячкою, поліморфною клінічною картиною і

частим запаленням легень. Від інших рикетсіозів відрізняється відсутністю висипу.

Збудник – Coxiella burnetii – строгий внутрішньоклітинний паразит, добре

розмножується в жовтковому мішку курячого ембріона і в культурах фібробластів

курки, мишачих клітин L та ін. Серед лабораторних тварин найбільш чутливі до

рикетсій Бернета гвінейські свинки.

Люди заражуються від великої і малої рогатої худоби, смугастих щурів, інших

гризунів і птахів різними способами: водним, аерогенним, аліментарним (молоко

і м’ясо), значно рідше через укуси кліщів.

Клінічна діагностика Ку-гарячки утруднюється різноманітністю проявів хво-

роби, тому лабораторні дослідження особливо перших випадків мають вирішаль-

не значення.

303

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Матеріалом для дослідження служить кров, харкотиння, сеча, спинномозко-

ва рідина. Для виділення збудника проводять внутрішньоочеревинне зараження

гвінейських свинок, білих мишей або курячих ембріонів чи культур клітин. Ри-

кетсії Бернета потім виявляють мікроскопічним методом при забарвленні мазків

за Романовським-Гімзою або за Здродовським. Для їх ідентифікації використову-

ють специфічні сироватки. Виділення збудника забезпечує найбільш точну діаг-

ностику Ку-гарячки. Для виявлення рикетсій Бернета в організмі людей, тварин

та інших біологічних об’єктах останнім часом створені діагностичні тест-систе-

ми на основі імуноферментного аналізу.

Серологічна діагностика зводиться до постановки реакцій зв’язування ком-

плементу, аглютинації й непрямої гемаглютинації. Найчастіше використовують

РЗК. Комплементзв’язуючі антитіла появляються в крові вже наприкінці першого

тижня хвороби, досягають найвищої концентрації через 3-4 тижні. Діагностич-

ним титром РЗК вважають 1:8-1:16, а через місяць від початку хвороби він

підіймається до 1:128-1:256 і зберігається дуже довго.

Реакція аглютинації рикетсій Бернета менш чутлива. Аглютиніни в діагнос-

тичному титрі (1:20 і вище) з’являються на 10-20-й день хвороби. Важливо стави-

ти реакцію методом парних сироваток для виявлення кратності наростання титру

антитіл у динаміці.

Реакція непрямої гемаглютинації значно чутливіша від попередніх. Методи-

ка її постановки така сама, як при висипному тифі, тільки замість еритроцитарно-

го діагностикуму з рикетсій Провачека використовують еритроцити з адсорбова-

ним на їх поверхні антигеном із рикетсій Бернета.

Алергічна проба. З діагностичною метою, а також при проведенні епідеміо-

логічних обстежень ставлять алергічну внутрішньошкірну пробу. Реакція стає

позитивною вже з 3-8-го дня хвороби. Корпускулярний або розчинний алерген із

рикетсій Бернета вводять внутрішньошкірно в дозі 0,1 мл на внутрішньому боці

передпліччя. При позитивному результаті через 24-48 год виникає характерна гіпе-

ремія, набряк розміром більше 1 см із центрально розташованим щільним

інфільтратом. Позитивна алергічна реакція зберігається у перехворілих протягом

багатьох років.

Північноазіатський рикетсіоз

Кліщовий висипний тиф сибіру – гостра природно-вогнищева зоонозна інфек-

ційна хвороба, яку викликає Rickettsia sibirica. Вона характеризується гарячкою,

наявністю первинного афекту, регіонарного лімфаденіту, рясного поліморфного

розеольозно-папульозного висипу. Перебіг захворювання доброякісний; передаєть-

ся воно іксодовими кліщами. Збудник містить антиген, спільний з антигеном про-

тея ОХ

Для лабораторної діагностики цього рикетсіозу використовують біологічні й

серологічні дослідження.

304

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Біологічна діагностика. R. sibirica патогенна для мавп, кролів, гвінейських

свинок, пацюків і білих мишей. Для виділення збудника від хворого у спеціаль-

них лабораторіях заражують внутрішньоочеревинно самців гвінейських свинок

кров’ю хворих, узятою в ранній період захворювання. У заражених тварин вини-

кає гарячка і запалення яєчок (скротальний феномен) із нагромадженням великої

кількості рикетсій у мезотелії їх оболонок. Можна культивувати збудника за мето-

дом Кокса в 4-5 добових курячих ембріонах при температурі 32-34 °С або в куль-

турах клітин. Рикетсії добре забарвлюються за методом Здродовського і, як пра-

вило, локалізуються в ядрах клітин.

Серологічна діагностика. Найчастіше ставлять реакції зв’язування компле-

менту та непрямої гемаглютинації. Обидві реакції проводять як з гомологічним

антигеном (R. sibirica), так і з гетерологічними (R. conori, R. prowazekii, R. akari)

для диференціації сибірського рикетсіозу від марсельської гарячки, висипного тифу

і везикульозного рикетсіозу. Як РЗК, так і РНГА є досить чутливими і високоспе-

цифічними реакціями, стають позитивними з 5-го дня хвороби, а після 10-го дня

виявляються майже в 100 % випадків. Діагностичні титри РЗК – 1:20-1:60, РНГА –

1:200-1:3200.

Як додаткову в діагностиці захворювання можна використати реакцію Вей-

ля-Фелікса з протейним діагностикумом ОХ

, яка випадає позитивною у 75-90 %

хворих.

Для ранньої діагностики запропонована реакція непрямого гемолізу, яка по-

лягає в тім, що еритроцити барана, сенсибілізовані рикетсіозним діагностикумом,

лізуються в присутності

специфічної сироватки і комплементу. Ця реакція вияви-

лась високоспецифічною і чутливішою ніж РЗК. За її допомогою антитіла в сиро-

ватці крові хворого виявляють на 4-6-й день хвороби. Реакцію непрямого гемолі-

зу можна використати як експрес-метод діагностики, адже вона дає відповідь че-

рез 1-1,5 год від початку дослідження. Окрім того, вона відрізняється простою

методикою і мінімальною затратою компонентів.

Останнім часом важливого діагностичного значення набула реакція імуно-

флуоресценції. Вона поєднує в собі серологічний та морфологічний методи і доз-

воляє швидко (протягом 1-2-х год) виявити й ідентифікувати рикетсії, їх антигени

й антитіла.

Гарячка цуцугамуші

Японська річкова хвороба (цуцугамуші) – гостра природно-вогнищева інфек-

ція, характеризується наявністю гарячки, первинного афекту, лімфаденіту, рясного

макуло-папульозного висипу, ураженням нервової і судинної систем. За клінічною

картиною подібна до висипного тифу.

Збудник – Rickettsia tsutsugamushi – мало чим відрізняються від інших ри-

кетсій кліщової групи, погано фарбується фуксином, оскільки легко знебарвлюєть-

ся кислотою. При забарвленні за Романовським-Гімзою мають пурпурний колір і

розташовуються в цитоплазмі мононуклеарних клітин. Існує 5 сероварів рикетсій

305

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

цуцугамуші, які відрізняються за вірулентністю. Людина заражується від гризунів

через укуси червонотілкових кліщів.

Для лабораторної діагностики захворювання використовують біологічні й

серологічні дослідження.

Біологічна діагностика. Найточнішим методом розпізнавання японської

річкової гарячки є виділення від хворих збудника цієї хвороби. Як безумовно й

абсолютно достовірний цей метод вкрай необхідний для діагностики цього ри-

кетсіозу в регіоні, де його виявляють уперше. Для цього декілька білих мишей

(рідше хом’ячків, бавовняних щурів) заражають внутрішньоочеревинно, вводячи

їм по 0,1-0,2 мл крові хворих, взятої під час гарячки. Ще кращі результати дає

зараження тварин 0,2-0,3 мл 10 % емульсії кров’яних згустків. Через 6-14 днів

після зараження миші гинуть. При розтині у них виявляють перитоніт із наявні-

стю рикетсій в клітинах ексудату або в зскрібках із очеревини. Мазки або препа-

рати-відбитки забарвлюють за методом Романовського-Гімзи.

R. tsutsugamushi легко виділити і шляхом зараження кров’ю хворих 6-7-ден-

них курячих ембріонів у жовтковий мішок та інкубування їх при 35 °С протягом

4-5 діб. Виявлення рикетсій проводять ще в живих ембріонах, оскільки мікроби

швидко лізуються після загибелі курячих зародків. У добре оснащених лаборато-

ріях можна виділити рикетсії цуцугамуші й на культурах первинно-трипсинізова-

них фібробластів, а також на перещеплюваних культурах клітин L.

Виявити рикетсії в досліджуваному матеріалі можна й за допомогою реакції

імунофлуоресценції. Але для цього потрібно мати відповідні типові люмінесцентні

діагностичні сироватки.

Серологічна діагностика. Широко використовують постановку реакції аг-

лютинації з протейним діагностикумом ОX

, оскільки даний серовар протею має

спільний антиген із рикетсіями цуцугамуші. Діагностичний титр 1:160 і більше.

Реакція Вейля-Фелікса з антигенами протеїв ОХ

і ОХ

у хворих на японську га-

рячку дає негативні результати. Реакція аглютинації з використанням специфіч-

ного рикетсіозного антигена випадає в мінімальному діагностичному титрі 1:100.

Але вона менш придатна для діагностики, оскільки антигенна структура рикетсій

цуцугамуші в різних регіонах неоднакова, та й до того ж вона стає позитивною

лише з другого тижня хвороби.

Більш специфічною є реакція зв’язування комплементу з набором різних

штамів збудника. Вона стає позитивною вже на першому тижні хвороби. Діагнос-

тичним вважається титр 1:10-1:20. Серологічні реакції необхідно ставити мето-

дом парних сироваток.

Є спроба діагностувати японську гарячку за допомогою реакції непрямої іму-

нофлуоресценції, непрямої гемаглютинації та імуноферментного аналізу.

Пароксизмальний рикетсіоз

Волинська (окопна, п’ятиденна, пароксизмальна) гарячка – гостра трансмісив-

на інфекційна хвороба, що викликається Rochalima quintana, передається одеж-

306

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ними вошами, характеризується повторними 5-денними нападами гарячки, розео-

льозним висипом, болями в кістках і м’язах, особливо в гомілкових.

Збудник має вигляд коротких паличок, дещо крупніших від збудника висип-

ного тифу. На відміну від інших рикетсій R. quintana може рости на сироватково-

кров’яному агарі, утворюючи круглі, напівпрозорі, слизові колонії, які появляються

через 12-14 днів після посіву. Ніколи не виявляються внутрішньоклітинно. В ан-

тигенному відношенні однорідні. Спільні антигени з іншими рикетсіями і про-

теєм не виявлені. Гвінейські свинки і білі миші до збудника волинської гарячки

нечутливі.

Для мікробіологічної діагностики захворювання використовують біологічні

й серологічні дослідження.

Біологічна діагностика пароксизмального рикетсіозу грунтується на виді-

ленні рикетсій із крові хворого шляхом зараження платтяних вошей з наступним

виявленням збудника в кишечнику цих комах, забарвленням мазків за методом

Романовського-Гімзи. Але такий спосіб можна здійснити лише в спеціально осна-

щених лабораторіях досвідченими співробітниками. У звичайних практичних ла-

бораторіях він не використовується. Замість цього можна посіяти досліджуваний

матеріал на живильні середовища і виділити чисту культуру. В перших генераціях

рикетсії ростуть повільно. Наступні субкультури виростають через 3-5 днів.

Серологічна діагностика. Більш простим і поширеним методом лаборатор-

ного дослідження при п’ятиденній гарячці є постановка реакції зв’язування комп-

лементу і непрямої гемаглютинації. РЗК ставлять із специфічним рикетсіозним

антигеном. Реакція стає позитивною на 15-20-й день захворювання, діагностичні

титри 1:32-1:256. Більш чутливою є реакція непрямої гемаглютинації. Широке

використання цих реакцій обмежене відсутністю або слабкою якістю антигенних

препаратів. Реакція аглютинації Вейля-Фелікса з усіма протейними антигенами

(ОХ

, ОХ

) дає негативні результати.

Хламідіози

Інфекційні захворювання, що викликаються хламідіями, дістали загальну

назву хламідіози. До них належить трахома, орнітоз (пситакоз), респіраторний та

урогенітальний хламідіоз. З кожним роком ці захворювання зустрічаються все

частіше. Рід Chlamydia містить три патогенних для людини види: C. trachomatis,

C. psittaci, C. pneumoniaе.

Трахома

Трахома – хронічна інфекційна хвороба очей, що характеризується запален-

ням кон’юнктиви й рогівки з утворенням специфічних фолікулів і наступним їх

рубцюванням. Хламідії трахоми мають 15 сероварів, 4 з них викликають трахому,

8 – кон’юнктивіт із включеннями (або бленорея з включеннями), решта – запален-

ня сечостатевих органів і венеричний лімфогранулематоз.

307

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Зараження трахомою відбувається від хворої людини через забруднені руки,

рушники, платки, посуд тощо. Бленорея новонароджених із включеннями пере-

дається дитині під час пологів від матері, у якої C. trachomatis зберігається в сли-

зовій сечостатевих органів.

Для лабораторної діагностики трахоми після анестезії ока ватним тампоном

видаляють слиз і гній, тупим кінцем скальпеля зіскрібують епітелій кон’юнктиви.

Основні стандартні методи діагностики такі: мікроскопічний (виявлення тілець

Провачека-Хальберштедтера в уражених клітинах), флуоресцентний (виявлення

антигенів хламідій за допомогою РІФ), бактеріологічний (виділення збудника за-

раженням курячих ембріонів або культур клітин), серологічний (визначення спе-

цифічних антитіл у сироватці крові). Останнім часом створені й успішно викори-

стовуються тест-системи для проведення полімеразної ланцюгової реакції з ме-

тою виявлення збудника.

Бактеріоскопічне дослідження. Зскрібки (не мазки!) із кон’юнктиви нано-

сять на предметні скельця, фіксують рідкими фіксаторами, забарвлюють за Рома-

новським-Гімзою протягом 3-4-х год і мікроскопують. В епітеліальних клітинах

видно кокоподібні включення розміром до 10 мкм. Можна досліджувати й нативні

препарати під фазово-контрастним чи аноптральним мікроскопом. Ще краще вико-

ристати метод прямої або непрямої імунофлуоресценції. Для цього мазки із зскрібок

фіксують у холодному ацетоні протягом 15 хв, обробляють флуоресцентними анти-

тілами й досліджують під люмінесцентним мікроскопом. При наявності хламідій

трахоми видно острівці специфічного світіння в цитоплазмі клітин.

Бактеріологічне дослідження. Культивування збудника трахоми є золотим

стандартом лабораторної діагностики захворювання в більшості країн світу. Для

виділення хламідій досліджуваним матеріалом заражують курячі ембріони або

культури клітин L-929, McCoy, Hela. При інфікуванні культур клітин використо-

вують спосіб “примусової адсорбції” шляхом низькошвидкісного центрифугування

матеріалу в пробірках з моношарами культур клітин. Матеріал попередньо оброб-

ляють гентаміцином, стрептоміцином і канаміцином. Заражені ембріони або куль-

тури клітин інкубують 5-6 днів при 35-36 °С. Розвиток хламідій виявляють за до-

помогою фазово-контрастної мікроскопії або імунофлуоресценції, ставлять про-

бу на глікоген та ідентифікують в РЗК. Диференціацію різних видів хламідій

проводять за спеціальними тестами (табл. 66).

Бактеріологічний метод діагностики трахоми досить трудомісткий, дорогий

і вимагає підготовки кваліфікованих спеціалістів. Він можливий лише в спеціалі-

зованих лабораторіях.

Більші можливості дає застосування імуноферментного аналізу. За його до-

помогою виявляють ліпополісахаридні антигени хламідій, які взаємодіють із спе-

цифічними моноклональними антитілами. Чутливість методу – 90 %.

Ще більшу ефективність при діагностиці трахоми, як і інших хламідіозів,

дає використання полімеразної ланцюгової реакції. Цей метод дає позитивні ре-

зультати в 90-100 % випадків, в той час як культуральні дослідження – в 60-80 %,

а пряма імунофлуоресценція – в 55-75 %.

308

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Серологічна діагностика. Імуноферментний аналіз є високоспецифічним і

доступним методом серологічної діагностики трахоми. При наявності специфіч-

них хламідійних антигенів, адсорбованих на поверхні лунок полістиролових план-

шет, ІФА можна використовувати в будь-якій мікробіологічній лабораторії.

Реакція непрямої гемаглютинації також має високу чутливість. Вона проста

за технікою постановки, але еритроцитарний хламідійний діагностикум може ре-

агувати і з антитілами проти рикетсій Провачека. При тяжкій і середньої тяжкості

формах захворювання РНГА випадає у високих титрах.

Реакція зв’язування комплементу практично майже не використовується, ос-

кільки часто дає псевдопозитивні результати.

Орнітоз

Орнітоз (пситакоз) – гостра інфекційна хвороба птахів, тварин і людей, що

спричиняється Chlamydia psittaci, характеризується розвитком пневмонії, грипо-

або тифоподібної гарячки, м’язового болю, рідше короподібного висипу. Зараження

людини відбувається при вдиханні висушеного посліду, пуху від птахів, а також

при розробці туш.

Мікробіологічна діагностика зводиться до виділення збудника з крові або

харкотиння (1-й тиждень хвороби), виявлення наростання титру антитіл (2-4-й

тиждень), постановки алергічної проби.

Бактеріологічне дослідження. Для виявлення хламідій у хворого беруть 8-

10 мл крові в перші 2 тижні захворювання. З харкотиння збудника можна виділи-

ти до 25-го дня. Нативною кров’ю без попередньої її обробки заражають курячі

ембріони в хоріоналантоїсну оболонку, порожнину алантоїсу або жовтковий мішок.

Харкотиння перед введенням в ембріон обробляють антибіотиками. Заражені ем-

бріони інкубують у термостаті при 35-36 °С протягом 3-4-х діб. У мазках-відбит-

ках з алантоїсної оболонки або в алантоїсній рідині виявляють елементарні тільця

після забарвлення акридином оранжевим або за Романовським-Гімзою. При мікро-

C. trachomatis C. psittaci C. pneumoniaе

1. Елементарні тільця мають

сферичну форму

2. Включення хламідій в

клітині компактні, вони

синтезують глікоген,

який виявляють йодною

пробою

3. Сульфадіазин пригнічує

розмноження хламідій в

курячому ембріоні

1. Елементарні тільця мають

сферичну форму

2. Мікроколонії в клітині

менш компактні, хламідії

розташовуються по всій

цитоплазмі, глікоген

відсутній

3. Сульфадіазин не

пригнічує хламідій у

курячому ембріоні

1. Форма елементарних

тілець грушоподібна

2. Мікроколонії в клітині

менш компактні, хламідії

часто розташовуються по

всій цитоплазмі, не

синтезується глікоген

3. У курячому ембріоні

ростуть погано, не

чутливі до сульфадіазину

Таблиця 66

Диференціальні ознаки патогенних хламідій

309

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

скопуванні у цитоплазмі клітин видно спеціальні включення, які мають яскраво-

зелене світіння. Азур-еозин забарвлює молоді хламідії у червоно-фіолетовий колір,

а зрілі форми – у синьо-фіолетовий.

Досліджуваним матеріалом заражують також культури епітеліальних клітин

первинних або перещеплюваних ліній різного походження: L-929, Hela, HЕp-2,

курячі фібробласти. Після культивування протягом 48 год у цитоплазмі клітин

виявляють специфічні включення за вище описаними способами. Найкращим із

них є метод ідентифікації за допомогою прямої імунофлуоресценції.

Біологічне дослідження. Для виявлення хламідій орнітозу використовують

біологічний метод – досліджуваним матеріалом заражають інтрацеребрально,

інтраназально або в черевну порожнину білих мишей-сисунків. Через 3-5 днів

вони гинуть від пневмонії. При мікроскопічному дослідженні мазків-відбитків ви-

являють мікроколонії хламідій в цитоплазмі мононуклеарних клітин.

Серологічне дослідження. Основним методом серологічної діагностики хво-

роби є постановка реакції зв’язування комплементу, гальмування гемаглютинації

та ІФА зі стандартним орнітозним діагностикумом. Комплементзв’язуючі та й інші

антитіла з’являються в крові хворих через 5-8 днів у невеликій кількості, потім їх

титр наростає. Тому серологічні реакції краще ставити методом парних сирова-

ток. Діагноз підтверджується при наростанні титру антитіл у 4 рази і більше. Хо-

роші результати дає також реакція непрямої імунофлуоресценції.

Алергічна проба з орнітином (інактивована алантоїсна культура C. psittaci)

ставиться як для ранньої (2-9-й день хвороби), так і ретроспективної діагностики.

Облік реакції проводять через 24-48 год. Гіперемію та інфільтрат діаметром до

1 см розцінюють як слабопозитивну реакцію, до 2 см – позитивну, більше 2 см –

різко позитивну. Висока специфічність алергічної проби залежить від ступеня

специфічності алергену, оскільки можуть бути перехресні реакції за рахунок гру-

пових хламідійних антигенів.

Респіраторний хламідіоз

Хламідійна пневмонія – інфекційна хвороба, яка характеризується запален-

ням легень, катаром верхніх дихальних шляхів, загальною інтоксикацією. Збуд-

ник – Chlamydia pneumoniae. Від інших хламідій вона відрізняється грушоподіб-

ною формою елементарних тілець. Джерело інфекції – хворі люди. Збудник виді-

ляється з носоглотки, механізм зараження – повітряно-крапельний.

У зв’язку з тим, що C. pneumoniae погано розмножується в курячих ембріо-

нах і культурах клітин, методи бактеріологічної діагностики не використовують-

ся. Практичні лабораторії не мають реагентів і для серологічної діагностики

респіраторного хламідіозу. Для виявлення та ідентифікації хламідій пневмонії в

досліджуваному матеріалі використовують лише реакцію імунофлуоресценції

із застосуванням моноклональних антитіл до високоспецифічного антигена

збудника.

310

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Сечостатевий хламідіоз

Патогенні хламідії, особливо C. trachomatis, досить часто викликають гострі

або хронічні запалення уретри, вагіни, шийки матки. Урогенітальний хламідіоз

впродовж останнього десятиріччя зустрічається частіше, ніж сифіліс і гонорея.

Основний шлях передачі захворювань – статевий, значно рідше – побутовий.

Матеріалом для лабораторного дослідження служать зскрібки зі слизової

уретри у чоловіків і жінок та зскрібки із шийки матки у жінок. Український НДІ

дерматології та венерології розробив уніфіковані методи діагностики сечостате-

вих хламідіозів. Серед них важливе значення мають експрес-методи, виявлення

морфологічних структур та антигенів хламідій у досліджуваному матеріалі, виді-

лення хламідій в культурах клітин, виявлення хламідійних антитіл за допомогою

серологічних реакцій та полімеразна ланцюгова реакція.

Експрес-методи. Ряд фірм США та Франції розробили спеціальні діагнос-

тичні тести для проведення імунохроматографічних експрес-методів, які можуть

видати результат через 10-30 хв. Однак їх чутливість і специфічність значно мен-

ша, ніж при проведенні повномасштабних досліджень.

Мікроскопічні методи. Досліджуваний матеріал беруть у хворих, які

протягом місяця не повинні приймати антибіотики. Зскрібки роблять одноразо-

вим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана, жолобкуватим зондом). Інфекцій-

ний матеріал наносять на поверхню 8 мм ямки спеціального предметного скла.

Мазок висушують 20-30 хв і фіксують у холодному ацетоні протягом 5-10 хв, за-

барвлюють за методом Романовського-Гімзи 35-40 хв, обробляють підкисленим

етанолом (3-5 крапель льодяної оцтової кислоти на 15-20 мл спирту) протягом 5-

10 с, промивають водою, висушують і мікроскопують. Ретикулярні тільця забарв-

люються в синьо-фіолетовий колір, а елементарні тільця – в рожево-червоний.

Зернисті структури хламідій розміщуються поблизу ядра. Виявлення 5-10 типо-

вих включень має діагностичне значення.

Антигени хламідій в інфекційному матеріалі виявляють за допомогою пря-

мої і непрямої реакції імунофлуоресценції. Суть прямого методу полягає у з’єднанні

мічених флуорохромом антитіл із хламідійним антигеном і виявленні специфіч-

ного світіння при люмінесцентній мікроскопії. Люмінесцентна антихламідійна

сироватка виготовляється в Харкові. Є багато закордонних діагностичних систем

для проведення цього методу.

Суть непрямого методу полягає у з’єднанні комплексу антиген + немічені

хламідійні антитіла з видовою (антиглобуліновою) міченою флуоресцеїном сиро-

ваткою.

Окрім мікроскопічних методів, антигени хламідій в інфекційному матеріалі

можна виявити за допомогою імуноферментного аналізу. Принцип методу поля-

гає у взаємодії моноклональних хламідійних антитіл, адсорбованих на твердій

фазі, з антигеном хламідій, що знаходиться у досліджуваному матеріалі, й утво-

ренні імунних комплексів. Матеріалом для аналізу можуть бути зскрібки зі слизо-

вих оболонок, центрифугати сечі, секрети, біоптати тощо.

311

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Вже розроблено й впроваджено в практику багато діагностичних тест-сис-

тем для ІФА. Досліджуваний матеріал вносять на адсорбовані в лунках планшети

антитіла. Оцінка результатів проводиться за допомогою імуноферментного аналі-

затора згідно з інструкцією до кожної тест-системи. Чутливість ІФА для виявлен-

ня хламідій коливається в межах 50-70 % у чоловіків і 88-100 % у жінок.

Виділення хламідій в культурах клітин. Найбільш точним і доказовим ме-

тодом діагностики хламідіозу є виділення збудника на культурі клітин (золотий

стандарт). Найчастіше використовують культури клітин L-929, McСoy, Hela,

BHK-21. У стерильні плоскодонні пробірки діаметром 14 мм вносять на дно

покрівні скельця, додають по 1 мл клітинної суспензії в живильному середовищі

(1·10

клітин/мл) і ставлять на 24-48 год у термостат при 37 °С для утворення

моношару клітин на покрівних скельцях. Потім середовище виливають, вносять

інфекційний матеріал, оброблений антибіотиками, центрифугований протягом

години при 3000 об/хв, інкубують у термостаті 2 год при 37 °С. Досліджуваний

матеріал виливають, замінюють його свіжим живильним середовищем, інкубу-

ють у термостаті 48-72 год. Покрівні скельця з моношаром клітин виймають, фіксу-

ють 10 хв метанолом, промивають фосфатним буфером і забарвлюють за методом

Романовського-Гімзи. Покрівні скельця монтують на предметному склі моноша-

ром клітин донизу в канадському бальзамі.

Під імерсійним об’єктивом виявляють наявність цитоплазматичних включень.

Елементарні тільця хламідій забарвлюються у червоний, а ретикулярні тільця – у

синій колір.

При обробці препаратів флуоресцентними антитілами моношар клітин також

монтують на предметному склі в гліцерині й досліджують за допомогою люмінес-

центного мікроскопа. Метод високоспецифічний (100 %) і чутливий (75 %), але

досить складний, дорогий, результат отримують через 72-96 год. Окрім того, є вели-

кий ризик зараження персоналу. Для практичних лабораторій він ще малодоступний.

Імунологічна діагностика. У сучасній практиці серологічних досліджень

сечостатевих хламідіозів використовують 4 імунологічні реакції: непрямої іму-

нофлуоресценції, непрямої гемаглютинації, зв’язування комплементу та метод

імуноферментного аналізу. Матеріалом для дослідження в усіх 4-ох реакціях є

сироватка крові хворих, секрети статевих залоз.

З метою виявлення хламідійних антитіл у реакції непрямої імунофлуорес-

ценції застосовують специфічний хламідійний антиген, який забезпечує реакції з

антитілами до всіх варіантів C. trachomatis.

При постановці цієї реакції на предметному склі готують слайд-антигени.

Скло вміщують на трафарет із зазначенням зон нанесення антигенів (контрольно-

го і специфічного). Слайди висушують 15-20 хв і фіксують в охолодженому аце-

тоні. Потім на слайд-антигени наносять відповідні розведення сироватки, інку-

бують 40 хв при 37 °С у вологій камері. Після цього препарат тричі промивають

фосфатним буферним розчином, додають антивидову люмінуючу сироватку, ще

раз витримують 40 хв у вологій камері й знову тричі промивають. Висушені

слайди досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Техніку постановки ре-

312

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

акції виконують згідно з інструкцією, що додається до кожної діагностичної тест-

системи.

Оцінку результатів проводять за ступенем специфічної флуоресценції комп-

лексів елементарних і ретикулярних тілець з антитілами, використовуючи кла-

сичну чотириплюсову систему. Титром хламідійних антитіл сироватки хворого

вважають те найбільше її розведення, при якому спостерігається чітке яскраво-

зелене світіння не менше, ніж на 2+. При хламідійному ураженні сечостатевої

системи він дорівнює 1:64 і вище. Постановка РІФ методом парних сироваток

повинна виявити наростання титру антитіл у 4 рази від початкового рівня.

Рекцію непрямої гемаглютинації використовують, в основному, для діагности-

ки зоонозних хламідіозів і первинного серологічного скринінгу захворювань у людей.

Реакція зв’язування комплементу дає змогу виявити антитіла до родоспеци-

фічного антигену хламідій. Ставлять її за звичайною схемою. Діагноз вважають

позитивним при титрі комплементзв’язуючих антитіл 1:64 і вище. РЗК мало підхо-

дить для діагностики хламідійних інфекцій генітальної системи.

Виявлення хламідійних антитіл імуноферментним методом базується на взає-

модії антигену з хламідій на поверхні лунок полістирилових планшет з IgM і IgG у

сироватках хворих людей. Уже виготовлена велика кількість діагностичних наборів.

Спочатку сироватку хворого розводять у допоміжному ряді пробірок, потім

проводять сорбцію антитіл у лунках мікротитрувального планшета. Детальна ме-

тодика постановки ІФА викладена в інструкції, що додається до діагностичної

тест-системи. ІФА рекомендують ставити за допомогою парних сироваток. Оцін-

ку результатів здійснюють за допомогою імуноферментного аналізатора за вели-

чиною оптичної щільності розчинів у лунках полістирилового планшета.

Мікоплазмози

Мікоплазмози – інфекційні захворювання людини, які викликають різні види

мікоплазм, представники родів Mycoplasma і Ureaplasma з родини Mycoplasma-

taceae. Розрізняють респіраторний мікоплазмоз (пневмонія, фарингіт, трахеоброн-

хіт, бронхіт), урогенітальний мікоплазмоз (уретрит, цистит, простатит, пієлонеф-

рит; у жінок – вагініт, кольпіт, цервіцит, ендометрит) і ураження суглобів (арт-

рит). Більшість мікоплазмозів мають глобальне розповсюдження й переважно

хронічний перебіг. У окремих випадках мікоплазми причетні до виникнення ендо-

кардитів, патології вагітності й ураження плода.

Респіраторний мікоплазмоз найчастіше викликає Mycoplasma pneumoniaе,

значно рідше M. hominis. Матеріалом для виділення збудника служить харкотин-

ня, слиз із носоглотки, плевральний ексудат, біоптати легеневої тканини, лаваж

(змиви з поверхні бронхіол і альвеол, отримані при бронхоскопії); для серологіч-

ної діагностики беруть кров.

Досліджуваний матеріал можна зберігати при температурі 4 °С у середовищі

нагромадження (триптиказний соєвий бульйон з бичачою сироваткою). Посіви

роблять на щільні середовища (наприклад, серцево-мозковий агар), що містять

313

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Виділення ферментів Ферментація

Вид

уреази аргінази фосфа-

тази

глюкози манози

Відношення

до еритро-

міцину

M. pneumoniaе

M. hominis

M. arthritidis

M. fermentans

U. urealyticum

чутливі

стійкі

чутливі

всі компоненти, необхідні для росту мікоплазм, та на двофазне середовище (корот-

кий стовпчик селективного агару з налитим поверх нього сироватко-глюкозним

бульйоном). Виділити збудника найчастіше вдається саме на двофазному середо-

вищі. Для пригнічення росту супутньої мікрофлори до середовищ попередньо

добавляють пеніцилін і ацетат талію, до яких мікоплазми пневмонії стійкі.

Ознаки росту (ферментація глюкози і зміна кольору рідкої частини двофаз-

ного середовища та ріст дуже дрібних колоній на щільному агарі) появляються у

строки від одного до семи тижнів. Колонії мікоплазм діаметром 0,1-0,2 мм мають

щільний зернистий центр, який вростає в агар, та розпливчасту прозору перифе-

ричну зону (у вигляді “випускної яєшні”) (див. вкл., рис. 26).

Довготривалість росту мікоплазм на щільних середовищах обумовила роз-

робку швидкого методу їх ідентифікації на чашках без додаткових пересівів для

виділення чистих культур. Найпоширенішим методом ідентифікації колоній є тест

епіфлуоресценції. Він полягає в тім, що на поверхню колонії наносять люмінуючі

мікоплазменні антитіла й виявляють специфічне їх світіння при мікроскопії в уль-

трафіолетових променях.

Розроблено також метод вирощування мікоплазм пневмонії в органній куль-

турі трахеї курчат, який дає позитивні результати вже через 3-5 днів.

Остаточну ідентифікацію культур проводять на основі морфологічних, куль-

туральних властивостей та деяких інших ознак (табл. 67).

Таблиця 67

Диференціальні ознаки патогенних для людини мікоплазм

Значно швидше можна виявити мікоплазми пневмонії або їх антигени в дослі-

джуваному матеріалі за допомогою реакцій імунофлуоресценції, непрямої гема-

глютинації, агрегат-аглютинації та ІФА. Однак, широке їх використання обмежене

відсутністю або недостатньою кількістю відповідних діагностичних тест-систем.

Дуже ефективним методом діагностики респіраторного мікоплазмозу є ме-

тод гібридизації ДНК за допомогою спеціальних зондів, які є природними плазмі-

дами мікоплазм або штучно синтезованими олігонуклеотидами.

Одним із перспективних і найчутливіших методів діагностики мікоплазмозів

є полімеразна ланцюгова реакція. Для виявлення M. pneumoniaе розроблена і впро-

ваджена тест-система, яка дозволяє виявити поодинокі мікоплазми, які іншими

способами виділити неможливо.

У практичних лабораторіях діагностику респіраторного мікоплазмозу найча-

стіше проводять на основі результатів серологічних досліджень. Найбільш широ-

314

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ко використовують реакції зв’язування комплементу, непрямої гемаглютинації,

непрямої імунофлуоресценції та метод ІФА з використанням гліколіпідних анти-

генів M. pneumoniaе зарубіжних фірм.

Серед усіх серологічних методів найбільш стандартизована постановка РЗК.

Високі титри комплементзв’язуючих антитіл виявляють впродовж 3-7-го тижнів

після видужування. Підвищення титру антитіл за допомогою РНГА виявляють

раніше, ніж в РЗК. Ще чутливішим методом є діагностика за допомогою імуно-

ферментного аналізу з використанням стандартного антигену, адсорбованого в

лунках мікротитраційних полістирилових планшет. Діагностичним титром сиро-

ватки вважають 1:64.

Мікоплазменний артрит найчастіше викликає M. arthritidis, рідше M. fer-

mentans, M. pneumoniaе, і U. urealyticum. Джерелом збудників, що уражають су-

глоби, є хворі люди або безсимптомні носії мікоплазм. Матеріалом для лабора-

торних досліджень є синовіальна рідина, кров, тканини суглобових хрящів.

Мікробіологічна діагностика зводиться до посіву досліджуваних матеріалів

на щільні і двофазові середовища, виділення та ідентифікації чистих культур

(табл. 67). Збудники або антигени можна виявити в клінічному матеріалі за допо-

могою тих же методів, що використовуються для діагностики респіраторних міко-

плазмозів.

При проведенні серологічних досліджень найчастіше вживають реакції зв’я-

зування комплементу, агрегат-аглютинації та імуноферментний аналіз.

Уреаплазмози – гострі або хронічні запальні процеси сечостатевих органів,

викликані Ureaplasma urealyticum. Ці захворювання значно рідше може спричи-

няти і M. hominis. Під час вагітності уреаплазменна інфекція активізується й може

стати причиною передчасних пологів та спонтанних абортів, а при внутрішньоут-

робному зараженні може викликати загибель плода. У зв’язку з неможливістю

відрізнити за клінічною картиною уреаплазмоз від торпідної чи хронічної гонореї

особливого значення набуває етіологічна діагностика, тобто виділення збудника.

Лабораторні дослідження мають вирішальне значення в розпізнаванні уроге-

нітальних запальних процесів, тим більше, що серед людей досить часто зустрі-

чається безсимптомне носійство мікоплазм і уреаплазм. Найчастіше використову-

ють бактеріологічний та серологічний методи діагностики, а також мікроскопіч-

не виявлення уреаплазм у препаратах сперми. Переваги надають культуральним

методам.

Дуже важливо правильно взяти досліджуваний матеріал. У чоловіків його

беруть з уретри не раніше як за 4-6 год до сечовипускання. Зовнішній отвір урет-

ри ретельно очищають ватним тампоном, змоченим стерильною дистильованою

водою. Перші краплини вільно витікаючих виділень при надавленні на уретру

відкидають, а наступні використовують для посівів на рідкі та щільні середови-

ща. При відсутності або незначних виділеннях проводять масаж уретри, а потім

роблять зскрібок зі слизової оболонки ложечкою Фолькмана чи жолобкуватим

зондом на глибині 2-3 см. Для посіву можна також використовувати секрет про-

стати, сперму, осад із 10 мл першої ранкової порції сечі після її центрифугування.

315

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

У жінок матеріал для посіву беруть із уретри, каналу шийки матки і заднього

склепіння вагіни перед чи відразу після менструацій.

Для культивування уреаплазм використовують стандартні рідкі й щільні сере-

довища, що виробляють в Українському НДІ дерматології та венерології (м. Хар-

ків). Посіви проводять відповідно до інструкції, що додаються до середовищ.

Пробірки і чашки з посівами вміщують у термостат не пізніше 30-60 хв після

взяття і посіву клінічного матеріалу. Облік результатів посівів у рідке середовище

проводять через 24-48 год. Посіви на щільне середовище інкубують при 37 °С в

атмосфері підвищеного вмісту СО

протягом 5 діб, проводячи щоденний контроль

за ростом колоній.

При посіві в рідке середовище уреаплазми змінюють його колір від початко-

вого жовтого до рожевого при відсутності каламуті. Сумнівним вважають резуль-

тат при зміні кольору середовища та наявності каламуті. Якщо колір середовища

не змінився, результат оцінюють як негативний. На щільному середовищі уреап-

лазми утворюють характерні дуже дрібні колонії (0,1-0,2 мм) округлої форми із

зубчастим краєм і зморщеною поверхнею. Їх досліджують під мікроскопом при

малому збільшенні з використанням об’єктива 40×.

Ідентифікацію виділених культур проводять на основі їх морфології, харак-

теру росту та інших ознак. Від інших видів мікоплазм U. urealyticum відрізняється

здатністю гідролізувати сечовину, оскільки вона єдина продукує уреазу. Отже,

метод визначення уреазної активності є основним при діагностиці уреаплазмозу.

Мікроскопічне визначення уреаплазм у препаратах сперми базується на ви-

явленні ДНК збудника при забарвленні флуорохромом олівоміцином. Для цього

використовують тест-систему, що виробляється в Українському НДІ дерматології

та венерології.

Краплю сперми наносять на предметне скло, розподіляють її до розмірів по-

крівного скельця, висушують і фіксують протягом 3 хв у холодному 70° спирті. На

мазок наносять робочий розчин олівоміцину на 30 хв, промивають дистильова-

ною водою, додають краплю забуференого гліцерину і накривають покрівним

скельцем. При мікроскопії під люмінесцентним мікроскопом уреплазми мають

вигляд яскраво-зеленої зернистості на темному фоні препарату. Інші види бак-

терій також яскраво світяться, але вони легко відрізняються від уреаплазм за роз-

мірами і формою. Інтенсивність зараження сперми уреаплазмами оцінюють за

чотириплюсовою системою: 4+ – максимальна кількість уреаплазм у вигляді скуп-

чень на більшості сперматозоїдів; 3+ – окремі уреаплазми і їх скупчення у двох-

трьох полях зору; 2+ – невеликі скупчення уреаплазм на окремих сперматозоїдах;

1+ – поодинокі уреаплазми в препараті.

Для серологічної діагностики можна використати постановку реакцій зв’я-

зування комплементу, непрямої імунофлуоресценції, непрямої гемаглютинації,

агрегат-аглютинації та метод імуноферментного аналізу. Однак реактиви для цих

реакцій поки що мало доступні для практичних лабораторій і є лише у профільних

науково-дослідних центрах.

Розділ 12

БУДОВА І КЛАСИФІКАЦІЯ ВІРУСІВ

Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин,

бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як

фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносни-

ками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні

відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації

ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінча-

лося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розумін-

ня функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип,

інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ,

поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розм-

ірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а та-

кож облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

За ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи. До

першої групи належать збудники гарячки Ебола, Ласса, Марбурга, Мачупо, нату-

ральної віспи, до другої входять арбо- і аренавіруси, віруси сказу, гепатитів А і В,

ВІЛ. До третьої групи належать віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту,

вісповакцини. Четверта група представлена адено-, корона-, герпес-, рео- та онко-

вірусами. Цей поділ певною мірою умовний, так як внаслідок генетичної мінли-

вості можуть з’являтися штами вірусів з підвищеною вірулентністю.

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала назву віріон. Він скла-

дається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футля-

ра, що її оточує, – капсида. Разом вони формують нуклеокапсид. Капсиди утво-

рені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх

кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна

ознака. Віруси з таким типом будови називають простими. До них належать

найдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, аденовіруси, паповавіруси.

Проте більшість вірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, яка містить

ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками-глікопротеїдами, які на по-

верхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віру-

си називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкап-

Частина ІV

ВІРУСОЛОГІЯ

317

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

сидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, енце-

фалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від спо-

собу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навко-

ло неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи

симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багато-

гранник (найчастіше ікосаедр – 20-гранник). Ус і відомі ДНК-геномні віруси мають

складні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси,

що містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена

разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної

хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких бактеріофагів. При цьо-

му головка бактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений

у хвості, укладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси мо-

заїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, па-

піломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна

(бактеріофаги), ниткоподібна (віруси Ебола, віруси бактерій). На рис 85 і 86 пред-

ставлені основні форми і структури найпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів лежать озна-

ки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості реп-

родукції, антигенні властивості тощо. За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді-

ляють на ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20

родин містять віруси, патогенні для людини (табл. 68).

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти

(ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять

інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10

-15

мг,

що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число нуклеотид-

них пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи).

Віруси характеризуються надзвичайним розмаїттям форм геному. Він може бути

представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути

лінійним, циркулярним або фрагментованим.

Рис. 85. Форма, розміри і структура деяких ДНК-геномних вірусів:

1 – Poxviridae; 2 – Herpesviridae; 3 – Adenoviridae; 4 – Papovaviridae; 5 – Parvoviridae.

318

Частина ІV. Вірусологія

Рис. 86. Форма, розміри і структура деяких РНК-геномних вірусів:

1 – Paramyxoviridae; 2 –Orthomyxoviridae; 3 – Coronaviridae; 4 – Arenaviridae; 5 – Retroviridae;

6 – Reoviridae; 7 – Picornaviridae; 8 – Rhabdoviridae; 9 – Orbiviridae; 10 – Togaviridae;

11 – Bunyaviridae.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) поділяються на структурні та неструк-

турні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклі-

тинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову

кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих

клітин, і забезпечують проникнення вірусу в клітину, мають РНК- і ДНК-поліме-

разну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів,

однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експ-

ресії вірусного геному, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати

клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на

капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїно-

вою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної обо-

лонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболон-

ку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зов-

нішнього середовища. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – комплекс

вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких віруси набу-

вають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи

3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних моле-

кул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього

середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку.

Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на по-

верхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості

декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового оп-

319

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Таблиця 68

Класифікація вірусів

Родина, рід

Наявність

суперкап-

сиду

Тип

симетрії

Розміри

(нм)

Структура

РНК

Віруси,

патогенні

для людини

1 2 3 4 5 6

РНК-геномні віруси

Picornaviridae Ні Кубічний 28 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

Поліовіруси,

Коксаки-,

ЕСНО-, рино-

віруси, віруси

ящура, віруси

гепатиту А

Caliciviridae Ні Кубічний 38 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

Вірус Норвoлк,

вірус гепатиту Е

Astroviridae Ні Кубічний 28-30 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

Астровіруси

людини

Togaviridae Так Кубічний 60 Однониткова,

лінійна,

несегментована,

“плюс”

Віруси Синдбіс,

Чикунгунья,

віруси східного

американського,

західного

американського і

везикулярного

енцефаломієлітів

коней, віруси

краснухи

Flaviviridae Так Кубічний 45-60 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

Віруси кліщо-

вого та японсь-

кого енцефалітів,

жовтої гарячки,

гарячки

Західного Нілу,

гепатиту С

Coronaviridae Так Спіраль-

ний

80-220 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

Коронавіруси

Paramyxoviridae Так Спіраль-

ний

120-150 Однониткова,

лінійна,

несегментована,

“мінус”

Віруси пара-

грипу, кору,

паротиту, респі-

раторно-синци-

тіальний вірус

Rhabdoviridae Так Спіраль-

ний

75-180 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “мінус”

Вірус сказу,

везикулярного

стоматиту

320

Частина ІV. Вірусологія

Продовження табл. 68

1 2 3 4 5 6

Filoviridae Так Спіраль-

ний

80-14000 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “мінус”

Віруси Ебола і

Марбург

Orthomyxo-

viridae

Так Спіраль-

ний

80-120 Однониткова,

лінійна, 8 сегментів,

“мінус”

Віруси грипу

Bunyaviridae Так Спіраль-

ний

80-120 Однониткова,

циркулярна, 3

сегменти, “мінус”

Хантавіруси,

вірус Кримської-

Конго гарячки,

вірус каліфор-

нійського

енцефаліту

Arenaviridae Так Спіраль-

ний

110-130 Однониткова,

циркулярна, 2

сегменти, “мінус”

Вірус

лімфоцитарного

хоріоменінгіту,

віруси гарячки

Ласса, Мочупо

Reoviridae Ні Кубічний 70-80 Двониткова, 10-11

сегментів

Реовіруси,

орбівіруси,

ротавіруси

Retroviridae Так Кубічний 80-100 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “плюс”

ВІЛ, вірус Т-

клітинної

лейкемії людини

Некласифіковані РНК-геномні віруси

Bornaviridae Так Кубічний До 100 Однониткова,

лінійна, несегмен-

тована, “мінус”

Віруси хвороби

Борна

Deltavirus Так Невідомо 37 Однониткова,

циркулярна, кільце,

“мінус”

Вірус гепатиту

Дельта

ДНК-геномні віруси

Hepadnaviridae Так Кубічний 40-48 Частково

двониткова,

циркулярна

Вірус гепатиту В

Parvoviridae Ні Кубічний 18-26 Однониткова,

лінійна

Віруси

ревматоїдного

артриту,

інфекційної

еритеми,

гемолітичної

анемії

Papovaviridae Ні Кубічний 45-55 Двониткова,

циркулярна

Віруси папіломи,

поліоми

Adenoviridae Ні Кубічний 85-110 Двониткова,

лінійна

Аденовіруси

321

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

ромінення залежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резис-

тентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чут-

ливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і

детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів.

Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які

викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віру-

си поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні

дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія вірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При про-

дуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція

відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому

утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні

віріони не утворюються, такий тип взаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси (СНІДу,

лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у

вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивос-

тей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які вимагають своєрід-

них прийомів для роботи з ними, не подібних до мікробіологічних. Вірусологічні

дослідження проводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома

основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх ком-

понентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – ви-

1 2 3 4 5 6

Herpesviridae Так Кубічний 150-200 Двониткова,

лінійна

Віруси простого і

оперізуючого

герпесу, итомега-

ловірус, вірус

Епштейна-Барр,

віруси герпесу

6, 7, 8

Poxviridae Так Змішаний 220-450 у

довжину

140-260 у

товщину

140-260

у висоту

Двониткова,

лінійна

Вірус нату-

ральної віспи,

вірус вакцини

Продовження табл. 68

322

Частина ІV. Вірусологія

явлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діаг-

ностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в

організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність

має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції став-

ляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захво-

рювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практич-

но підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною

діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються

з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний

і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання

цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабо-

раторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дос-

лідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швид-

ке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи

(курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захво-

рювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного

дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути

кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова

рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі-

дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал не-

обхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати

(заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна викори-

стати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров,

плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використа-

ний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буфер-

ним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по-

дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфат-

ний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при

1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото-

глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшо-

му зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх

загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в дос-

тавлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніци-

ліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів –

ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних

фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому ви-

падку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому

ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

323

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зруч-

ною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження

їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий

(рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально

немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відміча-

ють межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком об-

робляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шка-

ралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зара-

ження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і

герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також

обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір

у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст-

кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним розплавленим

парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналан-

тоїсну оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок

тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над

повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкара-

лупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невели-

кий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїс-

ної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого

віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому

після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють

стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вво-

дять матеріал з вірусами. При закритому способі

вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-

25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до

тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис-

товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт-

ковий мішок займає значну частину порожнини

яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті

протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до тем-

ператури 4 °С протягом однієї доби для макси-

мального звуження судин. Розтинають ембріони

в стерильних умовах, попередньо обробивши

шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порож-

нин ембріона відсмоктують стерильним шпри-

Рис. 83. Курячий ембріон:

1 – хоріоналантоїсна оболонка;

2 – порожнина алантоїса; 3 –

порожнина амніона; 4 – жовтковий

мішок; 5 – повітряний мішок;

6 – підшкаралупна оболонка.

324

Частина ІV. Вірусологія

цом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання

поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа-

тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан-

тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів

можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому

без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію

гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на

мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні

визначають за титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при

якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при

культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні

лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходить-

ся неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розве-

дення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пла-

стинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі

35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через

деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів

у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко

використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання

специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патоге-

незу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх

профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно-

і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових

щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів,

клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити

через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкір-

но, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішнь-

овенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньо-

серцево, на скарифіковану рогівку, у передню

камеру ока, у мозок.

Для виділення вірусів простого герпесу,

натуральної віспи використовують зараження

лабораторних тварин (кроликів) на скарифіко-

вану рогівку ока. При дослідженні вірусів ге-

патиту А вводять досліджуваний матеріал че-

рез рот. При виділенні вірусів з нейротропни-

ми властивостями, таких як арбовіруси, віруси

сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей

(1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього ма-

Рис. 84. Утворення бляшок на

хоріоналантоїсній оболонці після

зараження вірусом вісповакцини.

325

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

теріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій.

Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріа-

лу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після

введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок трав-

матичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак

захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікова-

ними тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використову-

ють для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка

методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних

середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічен-

ня розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній

лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів,

здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані куль-

тури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів

людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин

тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цьо-

го отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25

% розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна

проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугу-

ють, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визна-

чають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин

або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні сере-

довища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин,

продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 %

гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає ство-

рити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недо-

ліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний

склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний

склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові роз-

чини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних

розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і

перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір

амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин),

середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин

Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмиван-

ня клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторі-

ях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденові-

русів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору,

326

Частина ІV. Вірусологія

паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліо-

вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різно-

манітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденові-

русів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил

асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, гри-

бами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу

або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект

вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобі-

гання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчи-

ни антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміци-

ну (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибко-

вих препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є немож-

ливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні

витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють

собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження.

Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тка-

нин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній

практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чут-

ливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріп-

лених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найча-

стіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp-2

(карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (раб-

доміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи),

СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфо-

логію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури

клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при

цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отри-

мання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідни-

ми вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної

активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, че-

рез що їх рідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій.

Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона

людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одер-

жують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному

середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10

в 1 мл. Для стабілізації

клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отри-

327

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

ману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожу-

ють до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при

температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин

не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко роз-

морожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури органів. Вони

представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які

протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих

умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові культури. З цією

метою культури клітини вирощують у флаконах, пробірках, матрацах, які розташо-

вуються горизонтально, щоб клітини могли прикріпитись до скла. Перед заражен-

ням їх проглядають під мікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований

моношар клітин. Для зараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість

зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють живиль-

не середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у кожну

пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а потім інкубують у термостаті при тем-

пературі 37 °С протягом 1-2 год для адсорбції вірусів на поверхні клітин. Після

цього видаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для вида-

лення неприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середо-

вище (середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої

худоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у термостаті при 37 °С

протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи результати.

Внаслідок розмноження вірусів у культурі клітин у них виникають дегенера-

тивні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). Ступінь їх вира-

ження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особли-

востями клітин тощо. В одних випадках ці зміни виникають через декілька днів

після зараження (віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька

тижнів і навіть місяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження найчас-

тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД

(ЦПД

–

така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок,

що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення.

Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним

покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матер-

іалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх

відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке

містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат

натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої

мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин

молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується

тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вог-

нищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок (див. вкл., рис. 97).

328

Частина ІV. Вірусологія

Рис. 85. Цитопатична дія аденовірусів на клітини амніона людини:

1 – моношар клітин до зараження; 2 – початкова фаза дегенерації;

3 – кінцева фаза дегенерації.

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів

прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагнос-

тику захворювання (рис. 85).

При повній дегенерації клітинного моношару спостерігаються зміни в пере-

важній більшості клітин. Вони гинуть, відокремлюються від скла. Окремі кліти-

ни, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз

ядра і цитоплазми. Такий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам поліомі-

єліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне відокремлення всіх

клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, респіраторно-синци-

тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому вини-

кають багатоядерні гігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви-

кликають утворення скупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круг-

локлітинна дегенерація). При репродукції риновірусів утворюються округлі

клітини, які мають відростки, а при розмноженні герпесвірусів спостерігається

формування подібних клітин однакового розміру, які розкидано по всьому моно-

шарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний

тип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної гарячки) не здатні

викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для

їх виявлення використовують феномен інтерференції, при якому клітинні культу-

ри паралельно заражають іншими вірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за чотири-плюсовою сис-

темою: (4+) – означає, що відбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх,

(2+) – у 50 %, (+) – до 25 % клітин, (

+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклі-

тинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в ци-

топлазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеї-

нових кислот є важливим моментом при проведенні вірусологічної діагностики

захворювань. Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), на-

туральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденові-

руси, віруси грипу та інші.

1 2 3

329

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за до-

помогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку

вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слю-

ди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним ма-

теріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції.

При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками,

кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентно-

го мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести на-

явність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії,

яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних

включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гісто-

логічні зрізи із тканин загиблих.

Методи ідентифікації вірусів

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є

виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає вико-

ристання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності

блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл.

У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може

бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячо-

му ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних анти-

генів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використову-

ють забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові

птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі проми-

вають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 %

суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формалі-

ном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, про-

гріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних

інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом,

каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з

луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антиге-

на, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу ан-

тигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – макси-

мальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію ерит-

роцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з

нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про не-

330

Частина ІV. Вірусологія

гативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на

дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглю-

тинації утворюється осад у вигляді кільця (див. вкл., рис. 27).

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його анти-

генів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки

(вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл

(4-8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі

4°С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об’єм зависі

еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій

температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вва-

жають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко вико-

ристовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ

адс

). Принцип реакції базується на

явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності ад-

сорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи

в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з по-

верхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі-

док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в

якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше,

0,4-1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита

фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які вико-

ристовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецеп-

тори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних

інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких

є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ

адс

полягає в тому, що її можна

ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубу-

ють протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль викори-

стовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом

з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних

речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл

розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вно-

сять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують

нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній

температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 %

зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цьо-

го пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування ерит-

роцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під

малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність ад-

сорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ

адс

еритроцити вільно

плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на кліти-

331

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

нах. РГГ

адс

використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, рес-

піраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфіч-

них антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації остан-

нього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопа-

тичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшко-

утворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі

системи – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компо-

нентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дез-

інтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні

середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура

клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних власти-

востей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок

мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні

розведення від 10

-1

до 10

-8

. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в

яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замі-

нюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культу-

рою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культу-

ри клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С про-

тягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної

дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД

), тобто

найбільше

розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної си-

роватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД

), а після інку-

бації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури

клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують на-

явність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію віру-

су, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою

реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин

останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не

змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при

відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин.

Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого

утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в

кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного

(лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст-

кого матеріалу, який містить 100 ТЦД

, з різними розведеннями специфічної про-

тивірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі

37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолро-

332

Частина ІV. Вірусологія

том і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками.

Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім

читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають

зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значен-

ня рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто вико-

ристовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоут-

ворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла

специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню

числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах

наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубо-

вані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару

клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідни-

ми компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені

клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом

5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бенто-

нітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеро-

вірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імун-

ної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середо-

вищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні

культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через

2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на

молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та вели-

чини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем

без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок

або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим

титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають ней-

тралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних

тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної

сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи

тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів

або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою

активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу,

парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у віру-

сологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до

непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взає-

модії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок цього

не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

333

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироват-

ка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважа-

ючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного

досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал,

специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї

першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сиро-

ваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від-

повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироват-

кою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання ге-

молітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується

лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетеро-

логічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами

барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію

оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозо-

ра рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду ерит-

роцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її мож-

на ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – антитіло –

комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також

використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не

0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

У реакціях імунодифузії використовують принцип дифундування антигенів

і антитіл назустріч один одному в напіврідкому середовищі, наприклад, агарово-

му гелі. У зоні оптимальних співвідношень антигенів та антитіл утворюються лінії

преципітації. Їх число залежить від кількості антигенів, які відрізняються своїми

епітопами, так як кожна лінія відповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке покривають 1 % ага-

розою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну лунку вносять спе-

цифічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який

містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява

ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного

імуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу ге-

патиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього

методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після

застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які роз-

ташовані ближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. Після цього пласти-

ни кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Вірусні ан-

тигени з негативним зарядом рухаються в напрямку до аноду, а антитіла сироватки –

до катоду. Через 24 год в агаровому гелі спостерігають появу ліній преципітації, які

утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

334

Частина ІV. Вірусологія

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити комплек-

си, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із специфічними ан-

титілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш ефективним, ніж ви-

користання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації методу матеріал,

який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом 1 год

при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з антитілами

осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього дода-

ють 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють відповід-

не значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають під елек-

тронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених

антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту

А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у

вірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. Існують

численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати

віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після попереднього

зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії

антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який

дає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію,

який зумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). Метод

непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для ідентифі-

кації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка розташовується

моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним ма-

теріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом

декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них спе-

цифічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С

протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуо-

ресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають

для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінесцент-

ним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

При реакції радіального гемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів,

які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами,

що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні

імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У присутності комплементу спостері-

гається лізис еритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок.

Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті

діаметр зони гемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсут-

ності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як негативну.

Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується у вірусо-

логічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її поля-

гає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними проти-

335

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Рис. 86. Схема будови

бактеріофага:

а – головка; б – ДНК;

в – стержень; г – чохол;

д – базальна пластинка;

е – шипи; є – хвостові

фібрили; ж – комірець.

вірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого

вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції є еритроцити, оброблені таніновою кис-

лотою з адсорбованими на них молекулами противірусних антитіл (сенсибілізо-

вані еритроцити), вірусні антигени і розчин електроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також

мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) розводять дво-

кратно електролітом, після чого додають такий самий об’єм еритроцитарного анти-

тільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом 30 хв при температурі

37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглюти-

націю еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розпо-

діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – “перевернута парасоль-

ка”. При негативному результаті – щільний, компактний осад з рівними краями.

Крім цих реакцій для виявлення та типування вірусів широко використовують

РЕМА, РІА, полімеразну ланцюгову реакцію та інші, викладені у попередніх розділах.

Виділення та титрування бактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бактерій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальні-

ше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом дослі-

див канадський мікробіолог Ф. д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріо-

фагом. На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі

проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бактеріофаги виявились основною

моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного коду,

впливу радіації на спадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда.

Вони складаються з гексагональної головки, в якій міститься

ДНК, хвостового відростка (стержня, оточеного білковим

чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами.

Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утворена

капсомерами, які оточують одну щільно скручену молекулу

ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм слу-

жить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та

її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою

базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість

морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з ана-

логом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка,

що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується

(рис. 86).

Хімічний склад фагів, як інших вірусів, представлений

нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю

336

Частина ІV. Вірусологія

ліпідів у оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК.

За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних струк-

тур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість “внут-

рішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент

лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в

бактеріальну клітину.

У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфекційні хвороби”, і вик-

ликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характери-

зується строгою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофіт-

них мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє

лише на “свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки

на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для

ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає

епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні

шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають

монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близь-

ких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокре-

ма, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та

рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони

швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезінфікуючих розчинів та

ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних

живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, до-

дати декілька крапель відповідного бактеріофага, то через певний час відбувається

просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису

клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорга-

нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону

бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круг-

лу форму і виникають внаслідок літичної дії бакте-

ріофагів. Їх називають негативними колоніями

або бляшками бактеріофагів (рис. 87).

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бакте-

ріальною клітиною, вони поділяються на віру-

лентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всереди-

ну клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з

клітиною складається з ряду етапів, притаманних

практично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактер-

іофаги, частина клітин залишається неушкодженою

ними, тому що спостерігається явище лізогенії –

інтеграції генома бактеріофага в геном клітини.

Рис. 87. Стерильні плями

(“бляшки”) на бактеріальному

газоні після зараження

бактеріофагом.

337

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікро-

організми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких фак-

торів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні

до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має ве-

лике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під

впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бак-

терій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість пере-

творення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізоген-

ізації їх помірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони

забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена

роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафі-

лококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріо-

фагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі-

онів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують

як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-

інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони зустрічаються в будь-

яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм

види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин,

птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють

бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та

паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з

навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Для цьо-

го досліджуваний матеріал центрифугують, для осадження твердих частинок, а

надосадову рідину в об’ємі 1 мл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який

попередньо засіяний 1 мл 6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інку-

бації при температурі 37 °С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, розво-

дять у 10

-1

, 10

-2

, 10

-3

, 10

-4

разів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та

інкубують протягом доби при оптимальній температурі. Як контроль використо-

вують культуру бактерій без бактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріо-

фаг, середовище залишається прозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той

час як у контрольній пробірці відбувається ріст бактерій (середовище стає

мутним).

Для визначення наявності інфекційних бактеріофагів використовують метод

Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в тому, що попередньо матеріал, який

містить бактеріофаг, розводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10

-1

, 10

-2

, 10

-3

, 10

-4

Після цього по 1 мл кожного розведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 %

м’ясо-пептонного агару, додають 0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно

перемішують і виливають у чашки Петрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 %

м’ясо-пептонного агару. Чашки залишають на 30 хв при кімнатній температурі

для застигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

338

Частина ІV. Вірусологія

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих стерильних плям –

“негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом Граціа, після добової інкубації підраховують

число “негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає кількості

фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число фагових

корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній множать

на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10

-4

з’явилось 50 колоній,

отже, титр фагів дорівнює: 50×10

-4

або 5×10

-5

в 1 мл.

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд

пробірок із м’ясо-пептонним бульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг

(табл. 69).

Таблиця 69

Титрування бактеріофагів за методом Аппельмана

Пробірки Контроль

Компоненти

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

куль-

тури

фага

М’ясо-пептонний

бульйон

4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Досліджуваний

фаг

0,5

→

↑

– 0,5

Розведення 10

-1

-2

-3

-4

-5

-6

-7

-8

-9

-10

– –

Суспензія

мікроорганізмів

0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 –

Облік результатів

Після цього в них додають по 0,05 мл індикаторних мікроорганізмів. Пара-

лельно готують контрольні пробірки: одну – з культурою бактерій без фага, а дру-

гу – з бактеріофагом без мікробів. Посіви інкубують при 37 °С протягом 18-24 год

і спостерігають за лізисом мікроорганізмів. Титром бактеріофага вважають найб-

ільше його розведення, яке викликає повний лізис бактерій.

Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, їх можна

використовувати для фагоіндикації – визначення виду відповідних бактерій в

інфекційному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища.

Для цього у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджу-

вану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикатор-

ного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год.

Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять вис-

новок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.

З цією ж метою на щільне живильне середовище газоном засівають дослід-

жувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною

петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення

бактеріофага, яке вказано на ампулі. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С

протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про

339

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

літичну дію бактеріофага. Позитивний результат вказує на належність бактерій

до певного виду.

Фаготипування бактерій проводять з метою аналізу епідеміологічної ситу-

ації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагнос-

тиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. Цей метод грунтується на ви-

користанні специфічної чутливості бактерій до своїх бактеріофагів, яка свідчить

про спільне (тотожнє) походження бактерій, що мають однаковий фаготип.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для

цього чашку з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квад-

рати. Вирощують 4 годинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її

засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні

середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С

протягом 30-40 хв і на поверхню засіяного газону в кожний квадрат капають піпет-

кою певні бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або

залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють

результати за допомогою лупи. Залежно від чутливості культури до бактеріофагів

виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюють за чотири-плюсовою сис-

темою: від лізису, який зливається, до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фага є постійною ознакою, порівню-

ють фаготипи досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено

від вірогідного джерела інфекції. При їх збігові роблять висновок про виявлене

джерело інфекції.

Розділ 13

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ

Грип

Грип – гостре респіраторне захворювання людини, яке має тенденцію до епі-

демічного поширення. Характеризується катаральним запаленням верхніх дихаль-

них шляхів, гарячкою, вираженою загальною інтоксикацією. Часто грип супро-

воджується виникненням тяжких ускладнень – вторинних бактеріальних пнев-

моній, загостренням хронічних захворювань легень.

Збудники грипу належать до родини Orthomyxoviridae. Вона включає три роди

вірусів – А, В, С.

Вірус грипу має сферичну форму, його розміри 80-120 нм (рис. 88; див. вкл.,

рис. 29). Деколи утворюються ниткоподібні віріони. Геном утворений однонитко-

вою мінус-ниткою РНК, яка складається з восьми фрагментів, і оточений білко-

вим капсидом. РНК асоційована з 4 внутрішніми білками: нуклеопротеїдом (NP) і

340

Частина ІV. Вірусологія

високомолекулярними білками Р1, Р2, Р3, які беруть

участь у транскрипції геному та реплікації вірусу.

Нуклеокапсид має спіральний тип симетрії. Над кап-

сидною оболонкою знаходиться шар матриксного

білка (М протеїн). На зовнішній, суперкапсидній обо-

лонці у вигляді шипиків розміщені гемаглютинін (Н)

і нейрамінідаза (N). Обидва глікопротеїни (N i H)

мають виражені антигенні властивості. У вірусів гри-

пу знайдено 13 різних антигенних типів гемаглютині-

ну (H1-13) та 10 варіантів нейрамінідази (N1-10).

За внутрішнім нуклеопротеїдним антигеном роз-

різняють три типи вірусів грипу – А, В, С, які можна

визначити в РЗК. У вірусів типу А, які вражають людину, є три різновидності гема-

глютиніну (Н1, Н2, Н3) і дві – нейрамінідази (N1, N2). Залежно від їх комбінацій,

виділяють варіанти вірусів грипу А – H1N1, H2N2, H3N2. Їх визначають у реакції

гальмування гемаглютинації з відповідними сироватками.

Віруси грипу легко культивуються в курячих ембріонах і різноманітних куль-

турах клітин. Максимальне нагромадження вірусів відбувається через 2-3 дні. У

зовнішньому середовищі вірус швидко втрачає інфекційність через висушування.

При низькій температурі в холодильнику зберігається протягом тижня, при -70 °С –

значно довше. Нагрівання призводить до його інактивації через кілька хвилин.

Під впливом ефіру, фенолу, формаліну швидко руйнується.

Вірусологічний метод діагностики. Матеріалом для дослідження є змиви з

носоглотки, виділення з носа, які беруть сухими або вологими стерильними ват-

ними тампонами в перші дні захворювання, харкотиння. Віруси можна також знай-

ти в крові, спинномозковій рідині. При летальних випадках забирають шматочки

уражених тканин верхніх і нижніх дихальних шляхів, головного мозку тощо.

Носоглоткові змиви беруть натщесерце. Хворий повинен тричі прополоскати

горло стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію (10-15 мл), який збира-

ють у стерильну банку з широким горлом. Після цього шматочком стерильної вати

протирають задню стінку глотки, носові ходи, потім її занурюють у банку із змивом.

Можна взяти матеріал стерильним, зволоженим в розчині хлориду натрію

тампоном, яким ретельно протирають задню стінку глотки. Після забору матеріа-

лу тампон занурюють у пробірку з ізотонічним розчином, до якого добавлено 5 %

інактивованої сироватки тварин. У лабораторії тампони полощуть у рідині, віджи-

мають біля стінки пробірки і видаляють. Змив витримують у холодильнику для

відстоювання, потім відбирають середню частину рідини в стерильні пробірки.

До матеріалу додають антибіотики пеніцилін (200-1000 ОД/мл), стрептоміцин (200-

500 мкг/мл), ністатин (100-1000 ОД/мл) для знищення супутньої мікрофлори, вит-

римують 30 хв при кімнатній температурі і використовують для виділення вірусів,

попередньо перевіривши його на стерильність.

Найчутливішим методом виділення вірусів є зараження 10-11-денних куря-

чих ембріонів. Матеріал в об’ємі 0,1-0,2 мл вводять в амніотичну або алантоїсну

Рис. 88. Вірус грипу.

341

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Досліджувані пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

– 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Вірусмісткий матеріал,

попередньо розведений

в 10 разів

0,2 0,2

→

↓

–

Розведення 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 –

1 % завись еритроцитів

курки

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Інкубація при температурі 18-20

C протягом 30 хвилин

Результат

Таблиця 70

Схема титрування вірусів за допомогою РГА

порожнини. Заражають, як правило, 3-5 ембріонів. Ембріони інкубують при опти-

мальній температурі 33-34 °С протягом 72 год. З метою збільшення кількості

віріонів у досліджуваному матеріалі його попередньо концентрують. Для цього

використовують методи адсорбції вірусів на курячих еритроцитах, обробку 0,2 %

розчином трипсину з метою підсилення інфекційних властивостей вірусів або

осаджують їх за спеціальними методиками.

Після інкубації курячі ембріони охолоджують при температурі 4 °С протягом

2-4 год, потім відсмоктують стерильними піпетками або шприцем алантоїсну чи

амніотичну рідину. У ній за допомогою РГА визначають наявність інфекційного

вірусу. Для цього змішують рівні об’єми (0,2 мл) вірусмісткого матеріалу і 1 %

зависі еритроцитів курей. Про позитивну реакцію (наявність вірусу в матеріалі)

свідчить осідання еритроцитів у вигляді парасольки.

За умови наявності в матеріалі вірусу, який має гемаглютинуючі властивості,

його титрують за допомогою розгорнутої РГА, визначаючи титр гемаглютинуючої

активності (табл. 70).

За допомогою цієї реакції визначають титр гемаглютинуючого вірусу – най-

більше розведення матеріалу, яке ще дає реакцію гемаглютинації. Цю кількість

вірусу приймають за одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО ).

Ідентифікують віруси грипу за допомогою РГГА (табл. 71). Для цього спо-

чатку готують робоче розведення вірусного матеріалу, яке містить 4 ГАО вірусу в

певному об’ємі.

Облік реакції проводять після утворення осаду еритроцитів в контрольних

лунках. Про позитивну реакцію свідчить затримка гемаглютинації в досліджува-

них лунках.

Виділяти віруси грипу можна, використовуючи різноманітні лінії культур

клітин – ембріону людини, нирок мавп, перещеплювані лінії клітин нирок собаки

(MDCK) тощо. У клітинних культурах проявляється цитопатична дія вірусів (по-

ява клітин з фестончастими краями, вакуолями, формування внутрішньоядерних

і цитоплазматичних включень), яка завершується дегенерацією моношару клітин.

342

Частина ІV. Вірусологія

Для ідентифікації виділених вірусів використовують РГГА (за умови, якщо титр

гемаглютинінів становить у культуральній рідині не менше 1:8). Крім цієї реакції,

можна використати РГГ

адс

, однак вона є менш чутливою і вимагає титру імунної

сироватки не менше, ніж 1:160

а також

РЗК, РН, РЕМА тощо.

Серологічне дослідження використовують для підтвердження діагнозу гри-

пу. Воно грунтується на визначенні чотирикратного зростання титру антитіл у

сироватці хворого.

Першу сироватку отримують на початку хвороби в гострому періоді (2-5-й

день хвороби), другу – після 10-14-го дня захворювання. Оскільки сироватки дослі-

джують одночасно, першу з них зберігають у холодильнику при температурі -20 °С.

Найчастіше використовують РГГА, РЗК, РНГА. Ці реакції ставлять із спеці-

альними наборами стандартних вірусних діагностикумів (еталонні штами вірусів

грипу різних серологічних типів). Оскільки сироватки хворих можуть містити

неспецифічні інгібітори гемаглютинації, їх спочатку прогрівають при темпера-

турі 56 °С, а також обробляють спеціальним ферментом (наприклад, нейрамініда-

зою) або розчинами перйодату калію, риванолу, хлориду марганця, суспензією

білої глини тощо за спеціальними схемами.

Реакцію гальмування гемаглютинації можна ставити в пробірках (макроме-

тод) або в спеціальних планшетах для імунологічних досліджень (мікрометод).

Схема постановки РГГА наведена в таблиці 72.

Таблиця 71

Схема типування вірусів грипу в РГГА

Досліджувані лунки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7

Контроль

сироватки

Контроль

еритроцитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

– 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,2

Діагностичні

сироватки (1:10)

H1N1 (1-ий ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

H2N2 (2-ий ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

H3N2 (3-ій ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

Досліджувані віруси

(4 ГАО в 0,2 мл)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 – –

Розведення 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 – –

Інкубація при 18-20

C протягом 30 хв

1 % суспензія

еритроцитів курки

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0.4

Інкубація при 18-20

C протягом 1 год

Результат

Сироватки: H1N1

H2N2

H3N2

343

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Таблиця 72

Схема РГГА для серологічної діагностики грипу

Досліджувані лунки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7

Контроль

сироватки 1:5

Контроль

діагностикуму

Контроль

еритроцитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Сироватки хворого

(1:5):

І (1-ий ряд) 0,2

→

↓

0,2 – –

ІІ (2-ий ряд)

0,2

→ → → → → ↓

0,2 – –

Вірусний

діагностикум

(4 ГАО в 0,2 мл)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 – 0,2 –

Розведення

сироваток

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 – – –

Інкубація при 18-20

C протягом 30 хв

1 % суспензія

еритроцитів курей

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0.4

Інкубація при 18-20 °C протягом 1 год

Результат

Сироватки: І

ІІ

Реакція вважається позитивною при утворенні компактного, щільного осаду

еритроцитів з рівними краями.

Експрес-діагностика. Метод базується на виявленні в досліджуваному ма-

теріалі специфічних вірусних антигенів за допомогою імунофлуоресценції в прямій

або непрямій РІФ. Слиз отримують із носових ходів або задньої стінки глотки,

центрифугують і з осаду клітин циліндричного епітелію слизової оболонки готу-

ють мазки на предметних скельцях. Їх обробляють імунофлуоресцентними сиро-

ватками, кон’югованими з флуорохромами, наприклад, ФІТЦ (флуоресцеїнізоті-

оцианат). При дослідженні препаратів за допомогою люмінесцентного мікроско-

па спостерігають характерне зелено-жовтувате світіння вірусів грипу, які

локалізуються на початку хвороби в ядрах епітеліальних клітин.

Останнім часом пропонується використовувати для індикації специфічних

вірусних антигенів ІФА, РЗНГА, ПЛР.

344

Частина ІV. Вірусологія

Параміксовірусні інфекції

До родини Paramyxoviridae (para – біля, myxa – слиз) належать віруси пара-

грипу, епідемічного паротиту, кору та респіраторно-синцитіальний вірус.

Парагрип

Віруси парагрипу за формою та ультраструктурою подібні до грипозних, але

значно більші за розмірами. Діаметр сферичних форм – 150-300 нм. Зустрічають-

ся також грушеподібні й гіллясті форми. Віруси містять однониткову лінійну не-

фрагментовану “мінус” нитку РНК. Суперкапсидна оболонка має гемаглютинін і

нейрамінідазу. Віруси містять 6-8 структурних білків, серед яких білки нуклео-

капсиду – HN, P, L. Особливий білок М локалізується між нуклеокапсидом і су-

перкапсидною оболонкою.

Віруси здатні аглютинувати еритроцити гвінейських свинок, курей, мавп і

людини. Культивуються в перещеплюваних і первинних культурах клітин людини

й мавп (HeLa, BHK-21, Vero, HЕp-2, СМЦ), але погано розвиваються в курячих

ембріонах. За антигенною будовою розрізняють 5 серотипів, які спричиняють різні

респіраторні захворювання: гострі фарингіти, ларингіти, трахеобронхіти, пнев-

монію, круп. Особливо тяжкий перебіг захворювань у дітей першого року життя.

Для вірусологічної діагностики парагрипозної інфекції досліджують слиз

із задньої стінки глотки, нижніх носових ходів, автопсійний матеріал (тканини

трахеї, бронхів, легень). Як правило, матеріал забирають у перші дні хвороби, що

пов’язано з високою концентрацією віріонів у ньому. Забір проводять одночасно

за допомогою 2-3 стерильних ватних тампонів, які пізніше занурюють в одну про-

бірку з 5 мл розчину Хенкса та 5 % бичачого сироваткового альбуміну або грітої

бичачої сироватки крові. Перед наступним виділенням вірусів тампони віджима-

ють і видаляють з пробірки, і після відстоювання відбирають середню порцію

рідини для подальшого дослідження. Присутню мікрофлору знищують додаван-

ням по 500 ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину, виримуючи пробірки протягом 30

хвилин при кімнатній температурі, і заражають моношари культур клітин. Матері-

ал, який залишився, зберігають певний час при температурі -18 °С для повторно-

го, у разі потреби, дослідження.

Довести наявність вірусів у культурах клітин можна через 2-4 дні за цитопа-

тичною дією. При цьому спостерігається утворення симпластів з численними яд-

рами, заокруглені контури клітин, культура набуває вигляду твердого сиру (ділян-

ки відсутності клітин). З цією метою також широко використовується реакція ге-

мадсорбції (РГ

адс

.), яку ставлять з еритроцитами гвінейських свинок. Починаючи

з 6-8 дня культивування вірусів для індикації їх в культурі клітин можна викорис-

тати РГА з еритроцитами гвінейських свинок.

Для типування парагрипозних вірусів використовують РН, РГГА, РЗК, РГГ

адс

та інші. У реакції гальмування гемаглютинації використовують 0,7 % завись ерит-

роцитів гвінейських свинок або людини. Слід звернути увагу, що чутливість ре-

345

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

акції підвищується, якщо систему „вірусмісткий матеріал – противірусна діагно-

стична сироватка” інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 год або 18

год при 4 °С. Після додавання відповідних еритроцитів реакцію ще витримують

при 22 °С протягом 1 год і оцінюють результати. Оскільки різні серотипи вірусів

парагрипу мають спільні антигени імунологічні реакції ставлять, попередньо зро-

бивши розведення діагностичних сироваток. Серологічний тип вірусу визначають

за найбільшим титром діагностичної сироватки, яка дала позитивний результат.

Значного поширення набула для ідентифікації вірусів парагрипу РН, в якій

результати оцінюють за гемадсорбцією. При її постановці спочатку витримують

суміш інактивованих прогріванням при 56 °С 30 хв типоспецифічних діагностич-

них сироваток з виділеним вірусом протягом 2 год при кімнатній температурі.

Потім заражають культури клітин, інкубуючи їх при 35 °С 4-5 днів, і додають

завись еритроцитів гвінейських свинок. Після інкубації протягом 20 хв при тем-

пературі 37 °С читають результати. При нейтралізації сироваткою вірусів пара-

грипу не спостерігається адсорбції еритроцитів на поверхні клітин.

Серологічна діагностика проводиться з парними сироватками хворого, які

одержують відповідно на початку захворювання і двома тижнями пізніше. Протя-

гом цього часу першу сироватку зберігають у холодильнику в замороженому стані.

Чотирикратний приріст титру антитіл визначають паралельно у двох рядах про-

бірок, використовуючи стандартні методики постановки РГГА і РЗК.

Експрес-діагностика є достатньо інформативним методом, який дозволяє

визначити віруси в досліджуваному матеріалі. З цією метою частину матеріалу,

який було отримано для вірусологічної діагностики, центрифугують 5-7 хв при

1000 об/хв. Отриманий осад ресуспензують у 3-5 краплях надосадової рідини і

готують з нього мазки. Їх обробляють імунофлуоресцентними сироватками і до-

сліджують у люмінесцентному мікроскопі.

Спостерігаються циліндричні або полігональні клітини і заокругленої фор-

ми лейкоцити. За умови наявності вірусів у клітинах з’являється характерне зеле-

не світіння цитоплазми окремих клітин, у той час як клітини, що не містять вірусів,

мають цегляно-червоний колір. Оцінити достовірність результатів дозволяє вив-

чення контрольних препаратів.

До супернатанту, що залишився, додають пеніцилін і стрептоміцин в концен-

трації 500 ОД/мл. Через 30 хв інкубації при температурі 18-20 °С матеріалом зара-

жають культури клітин, які вирощуються заздалегідь на стерильних предметних

скельцях, вміщених у пробірки. Культивують віруси у такому стані 24-72 год при

температурі 35 °С, а потім скельця з культурою клітин промивають стерильним

буферним розчином і висушують. Для фіксування використовують охолоджений

до -20 °С ацетон (10-20 хв при кімнатній температурі), пізніше скельця висушу-

ють і обробляють специфічними імунофлуоресцентними сироватками (пряма або

непряма реакція імунофлуоресценції).

Визначити незначну кількість вірусів у будь-якому досліджуваному матері-

алі можна, використовуючи методи генетичної діагностики, і, зокрема, полімераз-

ну ланцюгову реакцію.

346

Частина ІV. Вірусологія

Епідемічний паротит

Під електронним мікроскопом паротитний віріон має неправильну куполо-

подібну форму діаметром 150-170 нм. Збудник паротиту добре культивується в

курячих ембріонах, а також у клітинах HeLa та ниркового епітелію ембріона лю-

дини. Віруси мають виражені гемаглютинуючі, нейрамінідазні й гемолітичні вла-

стивості. Вони нестійкі до дії фізичних і хімічних факторів, швидко інактивують-

ся ефіром, трипсином, формаліном, ультрафіолетовими променями. Резистентні

до висушування, не втрачають інфекційних властивостей при 4°С протягом 2 міс.,

при кімнатній температурі – 4 дні. При 55 °С гинуть через 20 хв.

Вірусологічна діагностика. Для дослідження від хворого беруть слину,

спинномозкову рідину (при підозрі на менінгіт, менінгоенцефаліт), сечу. Забір ма-

теріалу краще проводити в перші дні захворювання. Для знищення сторонньої

мікрофлори отриманий матеріал обробляють сумішшю пеніциліну і стрептоміци-

ну в концентрації 500-1000 ОД/мл. Спочатку його центрифугують при 1500 об/хв,

потім супернатант підлягає повторному центрифугуванню при 40000 об/хв протя-

гом 1,5 год. Для подальших досліджень використовують осад, попередньо ресус-

пензований в розчині Хенкса.

Щоб виділити з нього вірус, осад вводять в амніотичну порожнину 7-8-ден-

них курячих ембріонів. Ембріони інкубують при температурі 35 °С протягом 6-7

днів. Щоб довести наявність вірусу в матеріалі, використовують РГА з 1 % сус-

пензією еритроцитів курей. Можна використати як досліджуваний об’єкт освіт-

лену 20 % суспензію амніотичних оболонок, оскільки при декількох пасажах

вірусів у алантоїсній рідині їх гемаглютинуючий титр зростає.

Іншим методом виділення вірусів є зараження культур клітин. Найчастіше

використовують клітини нирок мавп, ембріону людини, перещеплювані лінії Vero,

BHK-21. Довести наяність вірусів можна за допомогою оцінки цитопатичної дії,

РГА та РГА

адс

. Для постановки останньої до інфікованої культури клітин додають

0,4 % суспензію еритроцитів курей або гвінейських свинок. Систему витримують

до 5 хв при температурі 18-20 °С, відмивають вільні еритроцити і спостерігають

під мікроскопом явище адсорбції останніх на поверхні заражених клітин.

Для ідентифікації збудників використовують РЗК, РГГА, а при використанні

культур клітин – РН. Можна використати з цією метою метод антитіл, які флуо-

ресцують. Як діагностичні препарати використовують сироватки імунізованих

тварин або людей, які перехворіли на епідемічний паротит.

Серологічна діагностика. З цією метою досліджують парні сироватки для

виявлення приросту титру антитіл проти вірусів епідемічного паротиту в РГГА,

РЗК, РН, РГГ

адс

. Як антиген використовують стандартний діагностикум із збуд-

ників або антигени, які одержують із амніотичної чи алантоїсної рідини зараже-

них курячих ембріонів. Діагностичним вважається чотирикратний приріст титру

антитіл у другій сироватці в порівнянні з першою. Як правило, титри антитіл у

другій сироватці при використанні РГГА сягають 1:320, а при РЗК – 1:64.

347

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Експрес-діагностика. Довести наявність вірусів у слині, сечі чи спинномоз-

ковій рідині можна при використанні методу антитіл, які флуоресцують. Найчас-

тіше використовують метод непрямої імунофлуоресценції.

Останнім часом у спеціалізованих вірусологічних лабораторіях використо-

вують полімеразну ланцюгову реакцію для виявлення вірусної нуклеотидної кис-

лоти у досліджуваному матеріалі.

Кір

Зрілий віріон кору має овальну форму діаметром 120-250 нм. У середині містить

однониткову “мінус”-нитку несегментованої РНК. Суперкапсидна оболонка має

вирости (шипики). Вірусні структурні компоненти представлено гемаглютиніном,

F1- і F2-білками, нуклеокапсидним та М-протеїном, а також білком полімеразного

комплексу. На відміну від інших парамікосвірусів, не містить нейрамінідази, однак

має гемаглютинін, який спричиняє аглютинацію еритроцитів мавп. Репродукується

в первинно-трипсинізованих культурах клітин ниркового епітелію, HeLа, HЕp-2, Vero,

погано культивується в курячих ембріонах. У культурах клітин викликає цитопатичну

дію у вигляді симпластів. Існує лише один антигенний тип вірусу. Він нестійкий до

дії факторів зовнішнього середовища, при кімнатній температурі гине через кілька

годин, але вірулентність втрачає через 30 хв. Чутливий до дії високих температур,

ультрафіолетового опромінення, добре зберігається в замороженому стані.

Вірусологічна діагностика. Найчастіше кір діагностують на підставі клінічної

симптоматики, спостерігаючи етапи появи висипань, появу плям Бельського-Філа-

това-Копліка на слизовій оболонці щік тощо.

Лабораторна діагностика проводиться рідко. Методи виділення та ідентифі-

кації вірусів у звичайній лабораторній практиці не застосовують, хоча знайти вірус

у досліджуваному матеріалі можна за 2-3 дні до появи висипань. Проте, як дослі-

джуваний матеріал для виділення вірусів, можуть бути використані змиви з носо-

вої частини глотки, виділення з кон’юнктиви, сеча, кров, спинномозкова рідина, а

також секційний матеріал. Після відповідної підготовки (додавання пеніциліну і

стрептоміцину, в разі потреби центрифугування тощо) матеріалом заражають пер-

винно-трипсинізовані культури клітин ембріона людини, нирок мавп або пере-

щеплювані лінії Hela, HЕp-2 та інші. Культури клітин підлягають спостереженню

протягом 30 діб. Одним з критеріїв наявності вірусів у матеріалі є поява цитопа-

тичної дії, що проявляється утворенням синцитіїв і злиттям клітин. Типувати віруси

можна, використовуючи метод імунофлуоресценції, РГГ

адс

, РН у культурі клітин

за феноменом гемадсорбції, ІФА.

Серологічна діагностика кору використовується в лабораторній практиці

значно частіше. Дослідженню підлягають парні сироватки хворих. Віруснейтралі-

зуючі, антигемаглютинуючі та комплементзв’язуючі антитіла виявляють в крові

досить рано. Часто вони досягають високих титрів разом з появою висипань. Пер-

шу сироватку беруть у перші дні захворювання, другу – через 12-14 днів. Став-

лять реакції паралельно в двох рядах пробірок.

348

Частина ІV. Вірусологія

Для спостереження за динамікою зростання титру антитіл використовують

РН, РГГА, РНГА, РЗК. Для постановки РГГА використовують еритроцити при-

матів. РНГА є однією з найдоступніших у лабораторній практиці. Позитивними

вважають ті реакції, які довели чотирикратне зростання титру антитіл.

Експрес-діагностика. Як і при більшості інших вірусних захворювань, ме-

тод флуоресцуючих антитіл дозволяє швидко визначити вірус в епітеліальних клі-

тинах носоглоткових змивів, осаді сечі, лейкоцитах крові, секційному матеріалі

(мозок) тощо. Антигени, що локалізуються в цитоплазмі, світяться в ультрафіоле-

тових променях люмінесцентного мікроскопа при обробці специфічними сиро-

ватками, міченими флуорохромами.

Полімеразна ланцюгова реакція надає можливість швидко визначити нуклеї-

нову кислоту віріонів кору безпосередньо в досліджуваному матеріалі.

Респіраторно-синцитіальні інфекції

РС-віруси належать до роду Pneumovirus. У центрі віріона розташована од-

нониткова “мінус”-нитка несегментованої РНК. Вона вкрита капсидною та супер-

капсидною оболонками. На поверхні вірусу розташовується F-білок (білок злит-

тя), який забезпечує проникнення вірусів у чутливі клітини. Поверхня віріонів

вкрита особливими виростами (шипиками), які складаються з глюкопротеїдів.

Структурні білки вірусів представлено 8 поліпептидами: N, P, L, M, M2, F, G, SH4.

Віруси не мають гемаглютинуючої та нейрамінідазної, проте проявляють частково

гемолітичну та гемадсорбуючу активність. Виділяють два підтипи респіраторно-

синцитіальних вірусів, які диференціюються за допомогою серологічних реакцій.

Віруси культивують у культурах клітин, одержаних із тканин мавп, великої

рогатої худоби, людини, перещеплюваних клітинах Vero, HЕp-2 та ін.

РС-віруси мають досить високу чутливість до дії факторів зовнішнього сере-

довища, таких як температура, ультрафіолетове опромінення, різноманітні жиро-

розчинники, детергенти, дезінфектанти тощо. Тривалий час може зберігатись при

температурі -70 °С.

Вірусологічна діагностика. Досліджуваним матеріалом для виділення вірусів

є виділення з носоглотки, слиз з ділянки голосової щілини, мазки із порожнини

носа, ротоглотки, біоптати, секційний матеріал (шматочки трахеї, бронхів) та ін.

Враховуючи, що вірус надзвичайно чутливий до дії факторів довкілля, бажано

проводити зараження культур клітин біля ліжка хворого або матеріал перед транс-

портуванням у вірусологічну лабораторію заморожується до -70 °С.

Використовуються 3-4-денні перещеплювані лінії культур HeLa, HЕp-2, KB,

Vero та ін. Через 3-7 днів визначають наявність вірусів у клітинах і проводять їх

ідентифікацію. Візуально під мікроскопом можна виявити багатоядерні клітини

(синцитій) з цитоплазматичними включеннями. За декілька днів спостерігають їх

деструкцію та відшарування від скла. Ідентифікують віруси за допомогою РН,

РЗК, методу імунофлуоресценції, ІФА.

349

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Серологічна діагностика. З цією метою досліджують парні сироватки хво-

рого на наявність антитіл. Діагноз підтверджує чотирикратне зростання титру

антитіл у другій сироватці порівняно з першою. РН і РЗК, РНГА, ІФА найчастіше

використовують для ретроспективної діагностики. РЗК ставлять на холоді. Запро-

поновано також нові варіанти РН – у присутності комплементу, мікрометод, реак-

ція пригнічення бляшкоутворення під агаровим покриттям. Діагностикум для цих

реакцій готують, заражаючи респіраторно-синцитіальним вірусом стандартні куль-

тури клітин. У пробірки вносять, як правило, по 100 ЦПД

Експрес-діагностика. Віруси (специфічний антиген) можна знайти в епітелі-

альних клітинах носових ходів, ротоглотки тощо. Після обробки його імунофлуо-

ресцентною сироваткою спостерігають характерне світіння поліморфних вклю-

чень у цитоплазмі або всієї цитоплазми клітини. Може бути використаний непря-

мий метод ензиммічених антитіл, РІА, РЗНГА, а також генетичні методи

діагностики.

Ентеровірусні інфекції

Ентеровіруси людини входять до родини Picornaviridae, яка нараховує понад

70 представників: 3 серотипи поліовірусу, 29 серотипів вірусів Коксакі, 32 серо-

типи вірусів ЕСНО і 4 ентеровіруси 68-71-го серотипів. Сюди віднесено також і

вірус гепатиту А, який часто називають ентеровірусом 72-го серотипу.

Для лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій використовують віру-

сологічні, серологічні та експрес-методи. Останнім часом різко знизилась захво-

рюваність на поліомієліт і зросла кількість поліомієлітоподібних захворювань,

які викликають віруси Коксакі, ЕСНО. Отже, вірусологічні дослідження необхід-

но проводити одночасно на виявлення всіх ентеровірусів.

Матеріалом для дослідження служать випорожнення хворих протягом пер-

шого тижня, змиви з носоглотки не пізніше третього дня, кров, ліквор, сеча не

пізніше п’ятого дня, сироватка крові в перший і 14 дні; в разі смерті – шматочки

мозку, внутрішніх органів, лімфовузли.

Випорожнення беруть у пеніцилінові флакони, емульгують у розчині Хенкса,

центрифугують і додають ефір та антибіотики. Змиви з носоглотки отримують

шляхом двократного полоскання горла стерильним ізотонічним розчином хлориду

натрію, освітлюють центрифугуванням і обробляють ефіром та антибіотиками.

Середню порцію сечі (10 мл) також обробляють пеніциліном і стрептоміцином.

Кров та ліквор використовують для вірусологічних досліджень без поперед-

ньої обробки. Секційний матеріал емульгують у стерильних ступках з піском, го-

тують 20 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують і додають антибіотики

Вірусологічні дослідження. Виділення та ідентифікація ентеровірусів є ос-

новним методом лабораторної діагностики. Для цього використовують різноманітні

культури клітин та лабораторних тварин. Оброблений, як вище зазначено, клінічний

матеріал інокулюють у 2-3 види перещеплюваних і первинних культур клітин.

Наприклад, для виділення всіх 3-ох типів вірусу поліомієліту використовують пер-

350

Частина ІV. Вірусологія

винні культури клітин нирок мавп і перещеплювані клітини HeLa, Vero, HЕp-2.

Віруси Коксакі В, ЕСНО успішно виділяють на клітинах ниркового епітелію мавп

та на багатьох клітинах людського походження (RH, HeLa, HЕp-2 та інші). Виді-

лення вірусів Коксаки А здійснюється на культурі клітин RD.

При розмноженні ентеровірусів у культурі клітин мікроскопічно виявляють

цитопатичну дію. Інфіковані клітини зморщуються, стають маленькими, кругли-

ми, в їх ядрах виникає пікноз. Пізніше клітини повністю руйнуються і відпадають

від стінки флакона. Такі зміни викликає вірус поліомієліту, більшість серотипів

вірусів Коксакі В, ЕСНО, деякі серотипи вірусів Коксакі А. В клітинах амніону

людини, епітелію нирок, диплоїдних клітинах W1-38 та RD добре репродукують-

ся віруси Коксакі А та окремі серотипи вірусів ЕСНО.

Віруси Коксакі А і В успішно виділяють із досліджуваного матеріалу шля-

хом зараження одноденних мишей-сисунців у мозок (0,01 мл), під шкіру (0,03 мл)

або в черевну порожнину (0,05 мл). За інфікованими мишами ведуть спостере-

ження протягом 14 днів. При наявності в матеріалі вірусів Коксакі А на 2-5 день у

тварин появляються збудження, тремор, парези і паралічі м’язів спини і кінцівок.

При Коксакі В-інфекції на 4-9 день у новонароджених мишей виникають спас-

тичні паралічі. З тканин і органів тварин, що загинули, готують вірусвмістку сус-

пензію для подальших досліджень. При гістологічному дослідженні виявляють

дегенератині зміни в ЦНС, печінці, підшлунковій залозі та міокарді.

Індикацію ентеровірусів проводять також за цитопатичною дією в культурі

клітин або за бляшкоутворенням під агаровим чи бентонітовим покриттям, а та-

кож за розвитком паралічу і загибеллю тварин.

Для їх ідентифікації використовують імуноферментний аналіз, реакцію галь-

мування гемаглютинації, імунофлуоресценції та РЗК. Реакцію нейтралізації на

моделі клітин проводять як вище описано.

Необхідно враховувати, що при масовій імунізації дітей живою поліомієліт-

ною вакциною можливе виділення вакцинних штамів. Отже, необхідно встанов-

лювати походження виділених вірусів.

Виявлення ентеровірусів і визначення видів та серотипів найефективніше і

найшвидше можна провести за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Серологічні дослідження. Методом парних сироваток ставлять кольорову

пробу, реакцію нейтралізації з пригніченням цитопатичної дії, бляшкоутворення,

РЗК, РНГА з еритроцитарними діагностикумами. Кольорову реакцію раніше час-

то ставили при серологічній діагностиці поліомієліту. Вона базується на здатності

вірусу пригнічувати обмінні процеси в інфікованих культурах клітин в результаті

чого зберігається вихідний колір середовища (малиновий).

Антитіла сироватки крові хворих нейтралізують вірус і метаболізм клітин

продовжується. Це призводить до нагромадження кислих продуктів у системі, які

змінюють РН середовища і воно набуває жовтого кольору. Наводимо схему поста-

новки кольорової реакції при серологічній діагностиці поліомієліту (табл. 73).

Результати реакції враховують візуально на 5-7 добу шляхом порівняння ко-

льору середовища в дослідних і контрольних пробірках. Титром сироватки вва-

351

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Пробірки

Компоненти

1 2 3 4 5 6 7

Живильне середовище, мл 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5

Сироватка хворого 1:5, мл:

І (1-ий ряд) 0, 5

→

↓

– 0, 5

ІІ (2-ий ряд) 0, 5

→ → → ↓

– 0, 5

Розведення сироваток 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 – –

Поліовірус певного типу,

100 ЦПД

/мл

0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 –

Інкубування 30 хв при 18-20 °С

Завись клітин HeLa з

індикатором, 40000 кл/мл

0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5

Інкубування 5-7 діб при 37 °С

Результати:

перша сироватка

друга сироватка

жають її найбільше розведення, при якому відбулась нейтралізація вірусу (остан-

ня пробірка з культурою клітин, де середовище жовтого кольору). Діагностичне

значення має наростання титру антитіл у другій сироватці не менше, ніж у 4 рази

в порівнянні з першою сироваткою.

Експрес-методи лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій не знай-

шли широкого застосування із-за особливостей їх патогенезу. Можливе викорис-

тання реакції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним поліовірусним діагнос-

тикумом та непрямої реакції імунофлуоресценції. Для постановки останньої

використовують імунну діагностичну антивидову сироватку, виснажену гомоло-

гічними клітинами крові, амніону, фібробластами. Така сироватка реагує лише з

вірусним антигеном, що знаходиться всередині клітин досліджуваного матеріалу.

Останнім часом для експрес-діагностики використовують каріологічний

аналіз, оснований на виявленні характерних змін в структурі ядер клітин клінічного

матеріалу, взятого у перші дні захворювання. Мікроскопують мазки з осаду після

центрифугування змивів з носоглотки і сечі та мазки-відбитки з органів, які взяті

при автопсії. Їх фіксують у холодному ацетоні, забарвлюють гематоксиліном. Спе-

цифічним для ентеровірусних інфекцій є виявлення в препаратах зміщення хро-

матину до периферії ядра і утворення яскраво-фіолетових тілець, що нагадують

півмісяць. Це дає змогу дати попередню відповідь про репродукцію ентеровірусів

у досліджуваному матеріалі.

Диференціацію даних та атенуйованих поліовірусних штамів здійснюють за

допомогою ПЛР, ІФА, РН з моноклональними антитілами. Для поліовірусів І типу

використовується бентонітовий тест (вірулентні поліовіруси мають характерис-

тики А

бент

–, а авірулентні – А

бент

+).

Таблиця 73

Схема титрування антитіл за допомогою кольорової проби

352

Частина ІV. Вірусологія

Ротавірусні гастроентерити

У високорозвинених країнах понад 60 % гострих гастроентеритів виклика-

ють віруси з родини Reoviridae. Серед них домінують ротавіруси. Рід Rotavirus

включає ротавіруси людини і віруси, що викликають діареї у тварин. Останні для

людини непатогенні. Ротавіруси людини викликають, в основному, гастроентери-

ти у дітей до трьох років і людей похилого віку. Збудник передається фекально-

оральним способом при побутових контактах. Висока стійкість вірусів у зовніш-

ньому середовищі сприяє розвитку спалахів гастроентеритів особливо в зимовий

період (до 90 %). За білковими антигенами ротавіруси поділяють на 4 сероваріанти.

Матеріалом для лабораторної діагностики служать випорожнення і кров.

Проби калу беруть у перші години і дні хвороби у стерильні пеніцилінові флакони

і направляють до вірусологічної лабораторії в контейнерах із льодом. Готують 10-

20 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують 30 хв при 3000 об/хв. Центри-

фугат переносять у стерильний флакон, додають фреон 113 або 1000 ОД/мл пені-

циліну і 500 ОД/мл стрептоміцину, вміщують у холодильник на 10-12 год. Кров

для серологічних реакцій беруть у перші 2-3 дні хвороби і через 12-14 днів.

Лабораторна діагностика ротавірусних діарей ґрунтується на швидкому

виявленні вірусів у випорожненнях за допомогою електронної та імунної елект-

ронної мікроскопії, реакції непрямої гемаглютинації з антитільним еритроцитар-

ним ротавірусним діагностикумом. Використовують також імуноферментний

аналіз у твердофазному варіанті, реакцію коаглютинації, метод клонованих РНК-

зондів і полімеразну ланцюгову реакцію.

У перші дні хвороби вміст ротавірусів у копроматеріалах досягає 10

-10

1 г, тому їх виявлення при прямій електронній мікроскопії можливе без додатко-

вої концентрації. Краплю досліджуваного матеріалу наносять на спеціальні плівки

з нітроцелюлози і мікроскопують при збільшенні 50000.

Метод чутливий і надійний, дає змогу швидко виявити вірус і дослідити його

морфологію. При виявленні 5-6 віріонів практично у кожному полі зору можна

достовірно підтвердити діагноз ротавірусного гастроентериту.

Ще більше діагностичне значення має метод імуное-

лектронної мікроскопії. Принцип її полягає в тому, що імун-

ну противірусну сироватку додають до освітленої низько-

швидкісним центрифугуванням суспензії фекалій, витри-

мують 60 хв при кімнатній температурі і ще 12 год при 4°С,

потім центрифугують при 15000 об/хв для осадження вірус-

них частинок та імунних комплексів. Осад ресуспензують

у 2-3 краплях дистильованої води, контрастують у фосфор-

но-вольфрамовій кислоті і досліджують під електронним

мікроскопом. У препаратах виявляють характерні скупчен-

ня ротавірусів (рис. 89). Висока ефективність методу прак-

тично не залежить від вихідної концентрації вірусів у дослі-

джуваних пробах.

Рис. 89. Ротавіруси

у фекаліях хворого.

353

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Вірусологічні дослідження з метою виділення ротавірусів у культурах клітин

або на лабораторних тваринах у рутинних вірусологічних лабораторіях не проводять.

Найбільш широко в діагностиці ротавірусних гастроентеритів використову-

ють імуноферментний аналіз. Принцип його полягає в тому, що лунки полістиро-

лових планшет спочатку сенсибілізують антитілами проти ротавірусів, а потім

додають у них освітлену суспензію фекалій, інкубують 1 год в термостаті. Утво-

рений в лунках комплекс антиген-антитіло після трикратного промивання фос-

фатним буфером виявляють внесенням антиглобулінової сироватки, кон’югова-

ної з ферментом. Після інкубації в термостаті додають хромогенний субстрат до

появи забарвленого продукту реакції. Облік результатів проводять за допомогою

імуноферментного аналізатора.

У невеликих лабораторіях досить часто проводять реакцію оберненої непря-

мої гемаглютинації з використанням антитільного ротавірусного еритроцитарно-

го діагностикуму. Вона проста за методикою постановки, хоч і менш чутлива в

порівнянні з реакцією ензиммічених антитіл.

У практику лабораторної діагностики ротавірусних інфекцій впроваджують

також тест коаглютинації для індикації ротавірусного антигену у випорожненнях

хворих. На предметне скло наносять краплю зависі стафілококів (штам Cowan 1),

сенсибілізованих ротавірусною сироваткою, і додають краплю освітленого цент-

рифугуванням копроматеріалу. При наявності ротавірусів через 30-60 с виникає

аглютинація навантажених антитілами стафілококів.

Дуже чутливим способом швидкої діагностики ротавірусних гастроентеритів

є метод виявлення вірусоспецифічної РНК за допомогою молекулярної гібриди-

зації. Він заснований на гібридизації мічених РНК-зондів, фіксованих на нітроце-

люльозних фільтрах. Мічення здійснюють біотином або ферментом, що значно

спрощує і здешевлює метод у порівнянні з радіоізотопними мітками.

Аналіз ротавірусної РНК, не зважаючи на його дорожнечу, все ширше впро-

ваджується в практику, особливо після розробки методу полімеразної ланцюгової

реакції. Остання є найчутливішим і специфічним методом діагностики, який, бе-

зумовно, є діагностичним тестом нового покоління, так званим “золотим стандар-

том”. Однак постановка цієї реакції все ще вимагає високої кваліфікації дослід-

ника, дорогих реактивів і складної апаратури.

Серологічна діагностика спрямована на виявлення специфічних антитіл у

парних сироватках, взятих з двотижневим інтервалом. Для цієї мети використову-

ють різноманітні нейтралізаційні або преципітаційні тести та непряму реакцію

імунофлуоресценції. Але останнім часом найширше застосовують імунофермен-

тний аналіз.

Раніше для серодіагностики широко ставили РЗК з використанням в якості

антигену заздалегідь відібрані фекалії хворих на гастроентерит або ротавіруси

телят. Але за своєю чутливістю і специфічністю вона значно поступається методу

імуноферментного аналізу. Для виявлення специфічних антитіл до ротавірусів

ставлять також реакцію гальмування непрямої гемаглютинації з парними си-

роватками.

354

Частина ІV. Вірусологія

Гастроентерити у дітей можуть також викликати каліцівіруси, астровіруси і

віруси Норволк. Всі вони виділяються з випорожненнями в перші 2-3 дні захво-

рювання, не розмножуються в культурах клітин або слабко репродукуються без

цитопатичної дії. Для лабораторної діагностики гастроенетеритів, викликаних

даними вірусами, використовують, в основному, метод імунної електронної мікро-

скопії. Інших методів діагностики, доступних для вірусологічних лабораторій, поки

що немає.

Герпесвірусні інфекції

Віруси родини Herpesviridae поділяються на три підродини: Alphaherpesvirinae

(викликають простий оперізуючий герпес та вітряну віспу), Betaherpesvirinae (спри-

чиняє цитомегалію), Gammaherpesvirinae (асоціюється з лімфомою Беркітта, на-

зофарінгеальною карциномою). Всього в родині нараховують біля 50 вірусів.

Простий герпес

Захворювання має декілька клінічних форм, але найчастіше вірус персистує

в організмі, і хвороба має безсимптомний перебіг. Звичайні клінічні прояви – ве-

зикулярна висипка на шкірі і слизових оболонках, рідко виникає менінгоенце-

фаліт, кератит і генералізована форма у новонароджених. Вірус герпесу 1-го типу

проникає в організм ще в ранньому дитинстві й постійно персистує у 70-90 %

дорослих людей. Передається контактним шляхом через слину, посуд, побутові

речі. Вірус 2-го типу передається статевим шляхом і викликає генітальний герпес.

Лабораторна діагностика включає проведення вірусоскопічних, прискоре-

них, вірусологічних і серологічних методів. Залежно від клінічних проявів матер-

іалом для дослідження служать слина, вміст пухирців, кірочки, ліквор, мазки з

виразок на слизовій оболонці рота, статевих органів, рогівки; при автопсії – шма-

точки головного і спинного мозку та паренхіматозних органів. Взятий матеріал

найкраще зберігати в 10 % сироватці при температурі – 70 °С.

Мікроскопія. Зскрібки, мазки, пухирцевий вміст після негайної фіксації в

суміші Никифорова забарвлюють за методом Романовського-Гімзи і досліджують

під імерсійним об’єктивом на наявність гігантських багатоядерних клітин з ха-

рактерними внутрішньоядерними включеннями (тільця Каудрі).

Для експрес-діагностики використовують електронну мікроскопію, реакцію

імунофлуоресценції, імуноферментний аналіз, генетичну діагностику. Під елект-

ронним мікроскопом досліджують вміст пухирців, рідку фракцію кірок після їх

гомогенізації в дистильованій воді, змиви з елементів висипу. Виявлення 2-3

віріонів з типовою морфологією цілком достатньо для встановлення діагнозу

(рис. 90). Швидке виявлення герпетичного антигену можливе в реакції імунофлуо-

ресценції. Мазки з пухирцевої рідини, виразок на рогівці або осаду з ліквору фіксу-

ють і обробляють протигерпетичною флуоресцентною сироваткою. Антиген зна-

ходять у цитоплазмі та ядрах уражених клітин за характерним золотаво-зеленим

355

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

світінням. Вірусспецифічний антиген у досліджува-

ному матеріалі легко виявляють за допомогою іму-

ноферментного аналізу, чутливість і специфічність

якого може сягати 95-96 %.

Виділення герпесвірусів. Ізоляцію вірусів про-

водять шляхом інокуляції досліджуваного матеріа-

лу в культури клітин ниркового епітелію кроля, ку-

рячого ембріона, амніона людини, HeLa та ін., або

зараженням мишей-сисунців, хом’ячків, кроликів,

курячих ембріонів.

Репродукція вірусів у культурах клітин настає

через 4-7 днів. Вона супроводжується розвитком

цитопатичних змін, утворенням гігантських багато-

ядерних клітин та синцитію.

У мишей виникають паралічі і смерть, у кроликів через 2-5 днів спостеріга-

ють кератит, у хом’ячків захворювання закінчується летально. На хоріоналантоїсній

оболонці курячих ембріонів через 48 годин з’являються опуклі непрозорі бляшки.

Виділені штами вірусів ідентифікують за допомогою стандартних протигер-

петичних сироваток у тестах нейтралізації на культурах клітин, лабораторних тва-

ринах або курячих ембріонах.

Серологічну діагностику проводять шляхом постановки реакції непрямої

гемаглютинації, імунофлуоресценції та імуноферментного аналізу обов’язково

методом парних сироваток. Діагностичне значення має наростання титру антитіл

у 4 рази і більше. Серологічна діагностика простого герпесу значною мірою утруд-

нена із-за широкої циркуляції вірусів серед населення і наявністю спільних анти-

генів у 1-го і 2-го сероваріантів герпетичних вірусів. При первинному захворю-

ванні на простий герпес певне діагностичне значення має постановка РЗК для

виявлення комплементзв’язуючих антитіл. Особливо важливе значення при цьому

набуває визначення Іg M.

Вітряна віспа – оперізуючий герпес

Збудник вітряної віспи й оперізуючого герпесу належить до роду Varicellovirus

і є двома варіантами одного і того самого вірусу. За морфологічними, біологічни-

ми властивостями вони ідентичні до вірусів простого герпесу, але не репродуку-

ються в організмі лабораторних тварин. Той самий вірус у дітей до 10 років ви-

кликає вітряну віспу – сильнозаразне, але легке захворювання. У дорослих (і дуже

рідко у дітей) він викликає оперізуючий герпес (герпес зостер). Розпізнавання цих

захворювань, як правило, проводять на основі характерних клінічних симптомів

та епідеміологічних даних. Значно рідше використовують вірусологічні або серо-

логічні дослідження.

Лабораторна діагностика. Найбільш цінним матеріалом для виділення

вірусів є вміст пухирців (везикул). Забирають також зскрібки з папул, кірочки,

Рис. 90. Вірус герпесу.

356

Частина ІV. Вірусологія

виділення з носоглотки, кров для постановки серологічних реакцій. Лабораторні

дослідження проводять так само, як і при простому герпесі, але необхідно врахо-

вувати, що віруси вітряної віспи і оперізуючого герпесу не вражають клітин куря-

чого ембріону, нервових клітин мишей, рогівки кролів. У культурах клітин вони

розвиваються значно повільніше (3-5 днів) у порівнянні з вірусом простого герпе-

су (18-24 год).

Експрес-методи базуються на виявлені вірусспецифічних антигенів у мазках

і відбитках за допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції. Використовують

антивидову сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ФІТЦ. Специфічне

світіння проявляється в цитоплазмі і ядрах уражених клітин. Герпесвірусні анти-

гени можна виявити і за допомогою імунодифузії в гелі з відповідними преципі-

туючими сироватками. При наявності діагностичних тест-систем і відповідної

апаратури можна використати полімеразну ланцюгову реакцію.

Виділення вірусів проводять на первинних і перещеплюваних культурах

клітин щитоподібної залози людини, фібробластів, ниркового епітелію, амніона

людини тощо. Цитопатична дія носить острівковий характер, розвивається по-

вільно і супроводжується утворенням багатоядерних клітин з характерними вклю-

ченнями.

Ідентифікацію виділених вірусів проводять в реакціях нейтралізації, зв’язу-

вання комплементу і непрямої імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика проводиться на основі постановки реакції зв’язу-

вання комплементу, нейтралізації, непрямої імунофлуоресценції з парними сиро-

ватками хворих. Необхідною умовою для постановки діагнозу є 4-кратне збільшен-

ня титру антитіл. Останнім часом для серологічної діагностики частіше викорис-

товують імуноферментний аналіз.

Цитомегалія

Цитомегаловірус подібний до інших видів герпесвірусів, але відрізняється

більш тривалою репродукцією всередині клітини. Він викликає захворювання,

що характеризується ураженням слинних залоз та інших органів з утворенням в їх

тканинах гігантських клітин з крупними внутрішньоядерними включеннями.

Діагноз цитомегалії встановлюють на основі проведення цитологічних,

вірусологічних і серологічних досліджень. Матеріалом для дослідження служать

слина, осад сечі, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, печінки, а також лейкоци-

ти крові. Найхарактерніша ознака цитомегалії – поява гігантських клітин з ядер-

ними включеннями розміром від 8 до 20 мкм.

Виділення вірусів проводять шляхом інокуляції досліджуваного матеріалу в

первинну культуру фібробластів шкіри та легеневих клітин ембріона людини.

Цитопатична дія виявляється через 2-3 тижні особливо у вторинних і третинних

субкультурах у вигляді появи гігантських клітин, що мають внутрішньоядерні

включення. При генералізованій формі хвороби цитомегаловірус проникає в лей-

коцити крові, тому для його виділення краще брати лейкоцитарні культури клітин.

357

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Ідентифікацію виділених вірусів, а також їх антигенні варіанти визначають у

реакції нейтралізації з відповідними антисироватками. Титр вірусу встановлю-

ють за допомогою бляшкоутворення або підрахунків фокусів уражених клітин

методом імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика. Для визначення титру сироваткових антитіл на

початку захворювання і в період реконвалесценції використовують реакції зв’язу-

вання комплементу і нейтралізації цитопатичної дії вірусу або феномену бляшко-

утворення. Метод флуоресцуючих антитіл застосовують як для визначення 4-крат-

ного наростання титру антитіл, так і для виявлення концентрації lg M. Для серо-

логічної діагностики цитомегаловірусної інфекції більшість лабораторій починає

широко застосовувати імуноферментний аналіз.

Аденовірусні інфекції

Родина Adenoviridae поділяється на два роди: Mastadenovirus – аденовіруси

ссавців, у тому числі понад 40 сероваріантів, що викликають захворювання у лю-

дей, і Aviadenovirus – 14 сероваріантів, що спричиняють захворювання у птахів.

Окремі серотипи (12, 18, 31) мають онкогенні властивості для деяких видів гри-

зунів (сирійські хом’ячки). По відношенню до людини онкогенні властивості аде-

новірусів не проявляються.

Аденовірусні інфекції виникають переважно у дітей від 6 місяців до 5 років,

особливо у холодні пори року. Для них характерний розвиток респіраторного,

кон’юнктивального і кишечного синдромів. Найчастіше виникають тонзиліти, фа-

рингіти, бронхіти, атипові пневмонії, риніти, катаральні і плівчасті кон’юнктиві-

ти. Основні механізми зараження – повітряно-краплинний, контактно-побутовий,

рідше – фекально-оральний.

Лабораторна діагностика. Більшість клінічних симптомів при аденовірус-

них інфекціях подібні до інших респіраторних захворювань як вірусної, так і бак-

теріальної етіології. У зв’язку з цим методи лабораторної діагностики мають ви-

нятково велике значення.

Залежно від клінічних проявів захворювання матеріалом для дослідження

служать мазки і змиви з носоглотки, харкотиння, зіскрібки з кон’юнктиви, кров,

ліквор, випорожнення. Матеріал потрібно взяти у перший тиждень хвороби, пе-

ресилати і зберігати у замороженому стані. Досліджують і секційний матеріал –

шматочки трахеї, бронхів, легень, кишечника, лімфовузлів.

Експрес-діагностику здійснюють за допомогою реакцій імунофлуоресценції

та ензиммічених антитіл з метою індикації групових антигенів аденовірусів у епіте-

ліальних клітинах носоглотки та кон’юнктиви. При цьому виявляють характерні

дрібнозернисті включення зелено-жовтого кольору в центральній частині ядер.

Кишкові аденовіруси, що викликають гастроентерити, виявляють у випорож-

неннях хворих за допомогою прямої та імунної електронної мікроскопії (рис. 91),

імуноферментного аналізу, ДНК-зондів і полімеразної ланцюгової реакції.

358

Частина ІV. Вірусологія

Виділення вірусів проводять на первинно-

трипсинізованих і перещеплюваних культурах

клітин (Hela, HЕp-2, KB та ін.), які чутливі до всіх

сероваріантів аденовірусів. У звичайних умовах

курячі ембріони і лабораторні тварини практич-

но нечутливі до аденовірусів людини, тому біо-

логічну модель виділення вірусів для діагности-

ки не використовують.

У культурах клітин віруси виявляють за їх

цитопатичною дією під світловим мікроскопом.

Уражені клітини округлюються, скупчуються у вигляді грон, в їх цитоплазмі вини-

кає зернистість. Більш точним методом виявлення цитопатичної дії є досліджен-

ня за допомогою люмінесцентного мікроскопа специфічних внутрішньоядерних

включень у клітинах на покривних скельцях, забарвлених акридиновим оранжевим.

Цей метод дозволяє через 1-2 доби виявити навіть поодинокі інфіковані клітини.

Ідентифікацію та типування виділених аденовірусів проводять за допомогою

реакції нейтралізації в культурах клітин спочатку із сумішшю типоспецифічних

сироваток, а потім і з кожною сироваткою тієї суміші, яка нейтралізувала цитопа-

тичну дію. Останнім часом для типування аденовірусів широко застосовують ре-

акцію гальмування гемаглютинації.

За здатністю аглютинувати еритроцити мавп і білих щурів аденовіруси поді-

лили на 3 групи. До першої групи увійшли 9 сероваріантів (3, 7, 11, 14, 16, 20, 21,

25, 28), які аглютинують лише еритроцити мавп, до другої – 14 сероваріантів (8, 9,

10, 13, 15, 17, 19, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 30), що викликають повну аглютинацію

еритроцитів щурів, до третьої – 6 сероварів (1, 2, 4, 5, 6, 12), здатних лише частко-

во аглютинувати еритроцити щурів. Спочатку за допомогою тесту гемаглютинації

виділений аденовірус відносять до однієї з трьох груп, а потім в реакції гальму-

вання гемаглютинації з типоспецифічними сироватками визначають серотип.

Серологічна діагностика аденовірусних інфекцій проводиться методом пар-

них сироваток за допомогою РЗК та імуноферментного аналізу з будь-яким типом

вірусів. Другу сироватку беруть на 18-20-й день захворювання. Діагностичне зна-

чення має наростання антитіл в 4 рази і більше. При оцінці результатів реакцій

потрібно враховувати можливість наявності антитіл в результаті широкої цирку-

ляції аденовірусів серед людей. У сироватці крові, взятій у перші дні захворюван-

ня, титр РЗК з аденовірусним антигеном складає 1:16. Особливо важливе значен-

ня має раннє виявлення в сироватці хворих IgM, що свідчить про гострий перебіг

хвороби. Тепер це найчастіше проводять за допомогою імуноферментного аналізу.

Коронавірусні інфекції

До родини Coronaviridaе входить 13 видів вірусів, два з яких – респіраторний

і ентеральний коронавіруси людини – мають високу вірулентність і здатні викли-

кати захворювання.

Рис. 91. Аденовіруси.

359

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Коронавіруси є дуже частими збудниками респіраторних захворювань у до-

рослих: профузного риніту, ринофарингіту, часто навіть без підвищення темпера-

тури. У дітей основними симптомами є профузний нежить, кашель, гарячка, го-

ловний біль. Часто хвороба ускладнюється пневмонією. Клінічно коронавірусну

інфекцію важко відрізнити від інших захворювань респіраторного тракту, тому

лабораторні дослідження мають вирішальне значення.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження служить слиз із носа

і глотки, зібраний сухими ватними тампонами, які занурюють в ізотонічний роз-

чин хлориду натрію з антибіотиками. Секційний матеріал (шматочки трахеї,

бронхів, легень) збирають у фосфатний буфер з гліцерином. У разі виникнення

гастроентериту досліджують випорожнення. Для серологічних реакцій викорис-

товують парні сироватки крові.

Експрес-методи діагностики проводять за допомогою реакції імунофлуо-

ресценції. У цитоплазмі епітеліальних клітин із осаду змивів з носоглотки, оброб-

лених люмінесцентними антисироватками, виявляють специфічні включення. При

можливості використовують пряму та імунну електронну мікроскопію, за допо-

могою яких виявляють поодинокі віріони або їх скупчення з типовою для корона-

вірусів морфологією (віруси зовні покриті виступами грушоподібної форми, що

нагадують корону сонця під час його затемнення). У препаратах з випорожнень

коронавіруси знаходять за допомогою електронної мікроскопії та полімеразної

ланцюгової реакції (рис. 92).

Виділення вірусів з діагностичною метою

проводять дуже рідко, оскільки коронавіруси лю-

дини практично не репродукуються в курячих

ембріонах і перещеплюваних культурах клітин.

Найбільш чутливою системою для їх виділення є

органна культура клітин трахеї ембріона людини.

У пробірки з культурою вносять 0,1-0,2 мл дослі-

джуваного матеріалу, обробленого антибіотиками.

Рідко ставлять біологічну пробу на мишах-сисун-

цях. При інтрацеребральному зараженні у тварин

виникає енцефаліт, від якого вони гинуть. У до-

рослих мишей коронавіруси спричиняють безсимп-

томну інфекцію.

Ідентифікують віруси шляхом визначення в інфікованих клітинах коронаві-

русного антигену методом імунофлуоресценції, імуноферментного аналізу або РЗК.

Можна виявити типові за морфологією віріони і при електронній мікроскопії.

Серологічна діагностика коронавірусних інфекцій до сьогодні залишається

основним методом їх розпізнавання. Для цього використовують визначення при-

росту антитіл у парних сироватках за допомогою реакцій гальмування гемаглю-

тинації, зв’язування комплементу та імуноферментного аналізу.

Рис. 92. Коронавіруси.

360

Частина ІV. Вірусологія

Сказ

Вірус сказу належить до роду Lyssavirus родини Rhabdoviridae, має характер-

ну кулеподібну форму з одним плоским і другим заокругленим кінцем (рис. 92).

Існують два варіанти вірусу – вуличний (дикий), що циркулює в природі серед

тварин, і атенуйований – Virus fixe, отриманий Л. Пастером шляхом багатократ-

них пасажів через мозок кроликів.

На сказ найчастіше хворіють собаки, вовки, лисиці, шакали, коти, рідше ко-

рови, скунси, койоти, кажани. Заражен-

ня людини відбувається через укуси хво-

рих тварин і навіть при ослиненні ними

подряпин шкіри чи слизових оболонок.

Захворювання у людини завжди закін-

чується летально, основні методи діагно-

стики сказу є посмертними, хоч розроб-

лені й деякі прижиттєві тести.

Лабораторна діагностика базується на використанні вірусоскопічного, біо-

логічного і серологічного методів. Матеріалом для дослідження служить мозок

тварин і загиблих людей, слина, тканина слинних залоз, які направляють до лабо-

раторії в стерильному посуді з гліцерином і обкладені льодом.

Метод флуоресцуючих антитіл – найбільш швидкий і точний метод лабо-

раторної діагностики сказу. Для виявлення вірусного антигену в мазках-відбитках

мозку, слинних залоз і рогівки ока (прижиттєвий тест) використовують пряму і

непряму реакцію імунофлуоресценції. Мазки фіксують у холодному ацетоні про-

тягом 8-10 год при температурі 4 °С і обробляють у вологій камері 30 хв антира-

бічним імуноглобуліном, міченим ФІТЦ, промивають фосфатним буфером, вису-

шують і досліджують в люмінесцентному мікроскопі. Антигени вірусу спостері-

гають у вигляді зелених гранул різної форми і величини.

Виявлення тілець Бабеша-Негрі у мазках-відбитках, гістологічних зрізах

мозку і тканини слинних залоз є також швидким методом діагностики сказу. З

мозку загиблої людини чи тварини стерильними ножицями нарізають у попереч-

ному напрямку шматочки товщиною 3-4 мм з довгастого мозку, амонового рогу і

мозочка. Предметне скло притискають до поверхні зрізу щоб отримати відбиток

тканини. В препаратах, забарвлених за Муромцевим або Селлером, тільця мають

різну величину (4-10 мм) округлої або овальної форми пурпурно-червоні, а цито-

плазма і ядра нервових клітин мають синій колір. Гістологічні зрізи забарвлюють

за Романовським-Гімзою, Манном або Туревичем. В одній клітині може бути одне

або декілька тілець. Вони оточені чітко окресленою оболонкою і мають внутріш-

ню структуру у вигляді базофільної зернистості, частіше розташовуються біля ядра

(рис. 93).

Метод виявлення включень Бабеша-Негрі є досить специфічним для сказу,

хоч він і менш чутливий, ніж метод флуоресцуючих антитіл. У тканині мозку со-

бак тільця знаходять у 90-95 % випадків, а в людей, померлих від сказу – в 70 %.

Рис. 92. Вірус сказу.

361

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Отже, відсутність тілець Бабеша-Негрі

не виключає діагнозу сказу. У таких ви-

падках необхідно використати й інші ме-

тоди дослідження.

Біопроба на мишах. Біологічний

метод застосовують для виділення віру-

су сказу із тканин мозку, слинних залоз

трупів та слини хворих людей і тварин

(прижиттєвий тест). Найбільш придат-

ними для зараження є миші-сисунці. Для

постановки біопроби використовують

15-20 тварин. Зараження проводять під наркозом шляхом інтрацеребрального вве-

дення 0,03 мл суспензії досліджуваного матеріалу. Можна поставити біологічну

пробу і на сірійських хом’ячках, заражуючи їх матеріалом внутрішньом’язово.

При наявності в досліджуваному матеріалі вірусу сказу у мишей виникає тремор

м’язів, паралічі. У більшості випадків тварини гинуть протягом п’яти днів. Наявність

рабічних вірусів у заражених і загиблих мишей необхідно підтвердити за допомо-

гою прямої реакції імунофлуоресценції або виявлення тілець Бабеша-Негрі.

Ідентифікацію виявленого вірусу сказу проводять також за допомогою ре-

акції нейтралізації на білих мишах.

Серологічні дослідження проводять для визначення поствакцинального іму-

нітету. Антитіла проти вірусу сказу виявляють в реакціях нейтралізації, зв’язуван-

ня комплементу, імунофлуоресценції. Найчутливішими є імуносорбентні реакції

(радіоімунний та імуноферментний аналізи).

Гарячки Марбург і Ебола

Збудники цих захворювань входять до роду Filovirus родини Filoviridae. Віруси

мають ниткоподібну або циліндричну форму, часом нагадують рабдовіруси. Внут-

рішньоклітинні включення при репродукції цих вірусів дещо подібні до вклю-

чень при сказі, тому раніше їх відносили до рабдовірусів.

Обидві хвороби ендемічні для деяких африканських країн (ЮАР, Кенія, Зим-

бабве), але останнім часом почали з’являтись і на території інших континентів.

Початок захворювань гострий з гарячкою, висипом, ураженням печінки, нирко-

вою недостатністю, профузним поносом. Летальність досягає 50-90 %.

Лабораторна діагностика гарячок Марбург і Ебола полягає в проведенні

вірусологічних досліджень у добре оснащених лабораторіях з додержанням суво-

рого режиму. Віруси виявляють у крові, сечі, геморагічному ексудаті зараженням

досліджуваним матеріалом гвінейських свинок або культур клітин мавп. Крім того,

проводять і пряму електронну мікроскопію патологічного матеріалу для виявлен-

ня вірусів. Розроблені і впроваджуються в практику імуноферментний метод і

реакція імунофлуоресценції. В більш пізніших стадіях захворювання і в період

реконвалесценції застосовують РЗК для виявлення комплементзв’язуючих антитіл.

Рис. 93. Тільця Бабеша-Негрі:

1 – в нервових клітинах; 2 – ядра клітин.

362

Частина ІV. Вірусологія

Арбовірусні інфекції

Арбовіруси – особлива група вірусів, що включає декілька родин: Togaviridae,

Flaviviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Rhabdoviridae i Reoviridae. Вони здатні

розмножуватись в організмі членистоногих (комарів, кліщів, москітів тощо) і пе-

редаватись хребетним через укус.

Всі арбовіруси мають складну структуру віріона: містять РНК, капсид, зовніш-

ню суперкапсидну ліпідомістку оболонку, а тому чутливі до дії органічних розчин-

ників. Віруси нестійкі в середовищі і швидко втрачають свої патогенні властивос-

ті при підвищеній температурі, дії ультрафіолетового випромінювання. Вони мають

виражені гемаглютинуючі властивості, особливо відносно гусячих еритроцитів.

Арбовіруси здатні зумовлювати в організмі патологічні процеси, що прояв-

ляються у вигляді гарячкових станів з болями в м’язах і суглобах або важких ура-

жень мозкових оболонок і мозку – менінгоенцефалітів, чи у вигляді геморагічних

гарячок з системним ураженням судин.

Природним резервуаром більшості арбовірусів є дрібні гризуни, дикі твари-

ни і птахи, кліщі і комарі. Людина є випадковим господарем вірусу і лише на

короткий проміжок часу потрапляє в ланцюг природної циркуляції вірусу.

Серед арбовірусних інфекцій в Україні найчастіше зустрічаються і найтяжче

перебігають кліщовий енцефаліт і гарячка Західного Нілу. Досить часто зустріча-

ються геморагічна гарячка з нирковим синдромом і Кримська-Конго геморагічна

гарячка.

Весняно-літній кліщовий енцефаліт

Вірус російського весняно-літнього енцефаліту має типову будову, властиву

родині Flaviviridae. Віріони сферичної форми, діаметром 40-50 нм, містять одно-

ниткову нефрагментовану РНК, яка заключена в капсиді ікосаедричного типу си-

метрії. Капсид оточений суперкапсидною ліпідною оболонкою, на поверхні якої

розміщені гемаглютиніни. До цієї родини входять також віруси японського енце-

фаліту, омської геморагічної гарячки, гарячок Денге і Західного Нілу та жовтої

гарячки.

Природним резервуаром і переносником вірусу російського весняно-літньо-

го енцефаліту є іксодові кліщі, в яких збудник передається трансоваріально. Інфіко-

вані кліщі, паразитуючи на гризунах, диких і свійських тваринах, заражують їх і

включають у природний ланцюг циркуляції вірусу.

Людина заражується, потрапляючи у природне вогнище знаходження збуд-

ника. Зараження відбувається після укусів інфікованих кліщів або вживання сиро-

го козячого чи коров’ячого молока.

Інкубаційний період триває від 2-х до 14 діб, іноді – до місяця. Вірус розпов-

сюджується гематогенним і лімфогенним шляхами, проникаючи у центральну

нервову систему, уражує рухливі нейрони передніх рогів шийного відділу спин-

ного мозку, мозочок і мієлінову оболонку головного мозку.

363

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика. Враховуючи значну небезпеку при роботі з вірус-

ним матеріалом, вірусологічні дослідження проводять виключно у спеціалізова-

них вірусологічних лабораторіях.

Матеріалом для вірусологічного дослідження в перші дні хвороби служить кров,

спинномозкова рідина. Від трупів беруть тканину мозку і внутрішніх органів. Вірус

також можна виділити з кліщів, мозку, паренхіматозних органів інфікованих тварин.

Для виявлення вірусу проводять внутрішньомозкове зараження вірусним ма-

теріалом новонароджених мишенят, які гинуть через 6-7 днів, або заражають ку-

рячі ембріони. Крім того, для виділення вірусу використовують інфікування куль-

тур клітин Vero, KB, HЕp-2, клітин нирок ембріона свині. Про наявність вірусу в

клітинах свідчить цитопатичний ефект.

Вірус російського весняно-літнього енцефаліту ідентифікують у РН, латекс-

аглютинації, РЗК, РГГА, дифузійної преципітації в гелі.

Останнім часом набули вирішального значення методи гібридизації і поліме-

разна ланцюгова реакція, які дозволяють безпосередньо виявити вірус у кліщів і

матеріалі від хворого.

Серологічна діагностика базується на дослідженні парних сироваток, взятих

з інтервалом 2-3 тижні, за допомогою РН, РЗК, РНГА. Необхідно відзначити, що

високою специфічністю відзначається РН на білих мишах або культурах клітин.

Рівень антитіл у сироватці хворого корелює зі ступенем пригнічення цитопатич-

ного ефекту або бляшкоутворення. Діагностичним титром вважається 1:10 і вище,

що можна зареєструвати вже з 7-10 доби хвороби.

Значну діагностичну цінність має імуноферментний метод, який порівняно

простий у виконанні, але дозволяє швидко одержати надійні результати.

Японський енцефаліт

Резервуаром вірусу японського енцефаліту в природі є дикі птахи, велика

рогата худоба, коні, свині, гризуни. Переносник – комарі роду Culex. Захворюван-

ня розповсюджене на сході азіатського континенту: в Японії, Китаї, Кореї, Індії,

Приморському краї Росії тощо.

Людина заражується через укус інфікованого комара. Проникнувши в організм

людини, вірус розмножується в нейронах центральної нервової системи, а також в

клітинах паренхіматозних органів. При цьому досить часто уражуються ядра гіпо-

таламуса, стовбурової ділянки головного мозку і шийний відділ спинного мозку.

Лабораторна діагностика. При вірусологічному дослідженні збудник мож-

на виділяти з крові впродовж першого тижня хвороби, протягом двох тижнів із

спинномозкової рідини, а також із мозку загиблих.

Інфікованим матеріалом заражують новонароджених мишенят, курячі ембрі-

они і культури клітин: первинні – курячі, гусячі фібробласти, клітини ембріона

свині; перещеплювані – ВНК-21, Vero. При зараженні клітин ВНК-21 спостері-

гається характерний цитопатичний ефект – поява на 3-4 добу багатоядерних клітин,

що нагадують симпласт.

364

Частина ІV. Вірусологія

Ідентифікацію вірусу проводять в РН або РГГА. Вірусоспецифічний антиген

можна теж виявити за допомогою імуноферментного методу і РЗНГА. Вірусну

нуклеїнову кислоту ідентифікують в реакції гібридизації і полімеразній ланцю-

говій реакції.

Серологічна діагностика здійснюється за допомогою РН, РЗК, РГГА, РНГА,

імуноферментного методу. При цьому потрібно враховувати зростання титру про-

тивірусних антитіл у парних сироватках.

Гарячка Західного Нілу

Вірус гарячки Західного Нілу за своїми розмірами дещо менший від попе-

редніх флавівірусів, його діаметр – 20-30 нм. Структура вірусу типова для даної

родини. Збудник чутливий до підвищеної температури і при 56 °С гине протягом

30 хв. Кип’ятіння інактивує його протягом 2-3 хв. Органічні розчинники і детер-

генти, руйнуючи ліпіди суперкапсидної оболонки, знешкоджують вірус.

Резервуаром вірусу Західного Нілу в природі є дрібні гризуни і птахи, в тому

числі водоплаваючі. Інфікована людина теж може бути джерелом інфекції. Пере-

носниками вірусу є комарі і кліщі.

Людина заражується через укус комара. Вірус розповсюджується в організмі

гематогенним шляхом і зумовлює ураження лімфоїдної тканини, рідше оболонок

мозку і самого мозку. Вірус має виражений тропізм до ендотелію судин і ней-

ронів. Після нетривалого інкубаційного періоду (2-8 днів) захворювання розпочи-

нається лихоманкою, появою геморагічної висипки, жовтяницею, болем у сугло-

бах. Можливий розвиток менінгіту і менінгоенцефаліту.

Лабораторна діагностика. Основним матеріалом для вірусологічної діагнос-

тики служить кров і спинномозкова рідина, а від осіб, які загинули, лімфоїдна і

мозкова тканини. Вірусним матеріалом заражують культури клітин МК-21 і внутріш-

ньомозково лабораторних мишей. Ідентифікацію вірусу Західного Нілу проводять

за допомогою прямої імунофлуоресценції, а також полімеразної ланцюгової реакції.

Для серологічної діагностики використовують парні сироватки хворого з на-

ступним дослідженням титру противірусних антитіл в РЗК, РГГА, РН та ІФА.

Жовта гарячка

Вірус жовтої гарячки – типовий флавівірус, нестійкий у зовнішньому середо-

вищі, швидко втрачає свою активність при підвищеній температурі (60 °С), кис-

лому середовищі, при дії ультрафіолетового проміння, детергентів і органічних

розчинників, а також хлормістких дезінфектантів.

Для культивування вірусу використовують мишей, курячі ембріони і різно-

манітні культури клітин: Детройт-6, BHK-21, HeLa, KB, фібробласти курячих ем-

бріонів.

Жовта гарячка – особливо небезпечна, карантинна хвороба, яка може розпов-

сюджуватися серед людей у вигляді епідемій. Ареалом вірусу є тропічні райони

365

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Африки, Південної і Центральної Америки, зустрічаються випадки захворювань

в країнах Середземноморського регіону: Італії, Іспанії, Португалії, Франції. Існу-

ють дві епідемічні форми жовтої гарячки – джунглева і міська. Природним вогни-

щем вірусу в природі є мавпи, переносником – комарі. При міській формі хвороби

джерелом інфекції є хворі люди, а переносником комарі.

При укусі комара віруси по лімфатичних судинах потрапляють у лімфатичні

вузли, де розмножуються, і звідти проникають у кров і гематогенним шляхом роз-

повсюджуються по всьому організму, уражуючи печінку, селезінку, нирки, кістко-

вий мозок. Інкубаційний період в середньому триває 3-7 діб. Хвороба розвиваєть-

ся швидко, з гарячкою, сильним головним болем, світлобоязню, болем у м’язах,

нудотою та блюванням. Характерно виражена гіперемія обличчя, верхньої части-

ни тулуба, ін’єкція склер і кон’юнктиви. На 3-4 добу може розвиватись жовтяни-

ця. Як правило, хворі гинуть в результаті розвитку геморагічного синдрому і пе-

чінково-ниркової недостатності.

Діагностика. Вірусологічна діагностика жовтої гарячки проводиться тільки

в лабораторіях закритого типу, що мають право працювати із збудниками особли-

во небезпечних інфекцій.

Матеріалом для виділення вірусу служить кров, яку забирають в перші 5 днів

захворювання, а також суспензії шматочків печінки і мозку, взятих від померлих.

З цією метою досліджуваний матеріал вводять у мозок мишам або заражують ку-

рячі ембріони чи чутливі культури клітин. У заражених дорослих мишей через

два тижні розвивається смертельний енцефаліт, а мишенята-сисунці гинуть на 5-

6-ий день після зараження з попереднім розвитком атаксії і паралічів.

Ідентифікацію вірусів проводять за допомогою РГГА, РЗК, РН. Проте найча-

стіше використовують реакцію нейтралізації на білих мишах. У даний час набули

застосування ІФА і ПЛР.

Серологічну діагностику здійснюють з використанням ІФА, РЗК, РН з пар-

ними сироватками хворого.

Геморагічні гарячки

Основною ознакою цих захворювань є розвиток геморагічного синдрому, що

характеризується висипкою і крововиливами на шкірі і слизових оболонках, а також

кровотечами різної локалізації (шлунково-кишкові, ниркові, носові тощо). Цей

синдром тісно пов’язаний з тропізмом збудників до ендотелію судин. Найчастіше

джерелом інфекції є дрібні гризуни.

Кримська-Конго геморагічна гарячка

Вірус належить до родини Bunyaviridae і має характерну будову: фрагменто-

вану РНК, упаковану в 3 нуклеокапсиди спірального типу симетрії, які оточені

зовнішньою суперкапсидною оболонкою.

366

Частина ІV. Вірусологія

Вірус не відзначається резистентністю в зовнішньому середовищі, легко руй-

нується під дією хімічних і фізичних факторів, чутливий до органічних розчин-

ників ефіру і дезоксихолату натрію. При кип’ятінні гине миттєво. У той же час він

здатний тривалий час зберігати свою активність у замороженому стані.

Основним джерелом і переносником вірусу в природі є різноманітні пасо-

вищні кліщі. Існування вірусу у вогнищі забезпечують їжаки і зайці, а також

свійські тварини – корови і вівці.

Після укусу кліща або при контакті з інфікованою твариною вірус через мікро-

ушкодження шкіри і слизових оболонок, а також повітряно-краплинним шляхом

проникає в кров і розмножується в ендотеліоцитах.

Інкубаційний період хвороби в середньому становить 3-7 діб. Основні симп-

томи, пов’язані з гарячковим станом і геморагічним синдромом. Під час лихоман-

ки вірус знаходиться в крові в значній концентрації, тому існує велика ймовірність

зараження осіб, які надають допомогу хворому при кровотечі.

Лабораторна діагностика. У зв’язку з високою небезпекою зараження всі

вірусологічні дослідження повинні проводитись тільки в спеціальних, оснаще-

них необхідним устаткуванням, лабораторіях.

Основним матеріалом, з якого можна виділити вірус, є кров, яку у хворого

забирають на висоті гарячкового стану з дотриманням всіх правил санітарної без-

пеки. Від осіб, які загинули, беруть головний або спинний мозок, внутрішні органи.

Для швидкого нагромадження вірусу матеріал вводять у мозок мишенятам-

сисунцям і через 4-5 днів суспензією мозку цих тварин заражують інших мише-

нят, щурів або культуру клітин ембріона свиней.

Ідентифікують вірус за допомогою РЗК, РОНГА, ІФА, РІА. Використовуючи

метод імунофлуоресценції, можна виявити вірус у мазках-відбитках печінки ми-

шенят, які загинули, а також у культурах клітин.

Серологічна діагностика проводиться за допомогою РЗК, РНГА, РГГА, РН,

ІФА. Комплементзв’язуючі антитіла можна виявити в сироватці крові вже на 6-10

добу, максимальний титр яких спостерігається через 60 днів і зберігається до

6 місяців.

Геморагічна гарячка з нирковим синдромом

Вірус відноситься до родини Bunyaviridae, роду Hantavirus. Його будова ха-

рактерна для представників цієї родини. Вірус чутливий до дезоксихолату натрію,

ефіру, хлороформу, ультрафіолетового проміння, інактивується при рН 5,0 і тем-

пературі, вищій 37 °С. При низьких температурах може зберігатись тривалий час.

Вірус добре культивується на клітинах Vero E6 без видимого цитопатичного

ефекту, іноді використовують для культивування вірусу 6-7-денні курячі ембріо-

ни, заражуючи їх в алантоїсну порожнину або жовтковий мішок.

Геморагічна гарячка з нирковим синдромом – природновогнищева хвороба,

осередки якої розповсюджені в лісистій місцевості. Резервуаром збудника в на-

вколишньому середовищі є мишоподібні гризуни, в яких вірус виділяється з се-

367

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

чею і фекаліями. Людина заражується від хворих тварин респіраторним, контакт-

ним і аліментарним шляхами найчастіше через предмети, продукти, забруднені

виділеннями гризунів.

Проникнувши в організм, вірус розмножується в ендотелії судин, клітинах

селезінки, нирок, легень. Головними клінічними симптомами є гарячка, інтокси-

кація, геморагічний і нирковий синдроми. У патогенезі хвороби значне місце зай-

мають імунопатологічні процеси в результаті утворення імунних комплексів.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є кров і сеча, від

осіб, що загинули – шматочки тканин нирок, легень. Вірус виділяють шляхом за-

раження культури клітин Vero E6. Віруси у цих клітинах нагромаджуються у знач-

них титрах без видимого цитопатичного ефекту. Їх виявляють за допомогою не-

прямої імунофлуоресценції і методу інтерференції.

Суть методу інтерференції полягає в наступному. Після зараження вірусним

матеріалом, культури клітин через 3-4 доби повторно заражують вірусом Ньюкас-

ла. Через 48 годин визначають титр гемаглютинінів у культуральній рідині і ступінь

розвитку цитопатичного ефекту, порівнюючи ці показники з контролем (культури

клітин, заражені тільки вірусом хвороби Ньюкасла). Вірус геморагічної гарячки,

взаємодіючи з вірусом хвороби Ньюкасла, в значній мірі пригнічує синтез гемаг-

лютинінів у досліді і сповільнює розвиток цитопатичного ефекту.

Ідентифікацію вірусу можна здійснити за допомогою РОНГА, ІФА, РІА, РІФ.

Як прискорений метод індикації вірусних антигенів, використовують імунну елек-

тронну мікроскопію і молекулярно-генетичний метод – ПЛР.

Для серологічної діагностики успішно застосовують метод непрямої імуно-

флуоресценції. Зрізи легеневої тканини мишей, інфікованих вірусом геморагічної

гарячки з нирковим синдромом, обробляють різними розведеннями парних сиро-

ваток хворого. Після відмивання надлишку сироватки на препарат наносять флуо-

ресцуючі антитіла до глобуліну людини. Присутність антитіл у досліджуваній

сироватці встановлюють за наявністю специфічної флуоресценції в інфікованих

клітинах. Крім того, для виявлення приросту титру антитіл у парних сироватках

застосовують РГНГА, ІФА і РІА.

Краснуха

Збудником хвороби є вірус краснухи, який належить до роду Rubivirus роди-

ни Togaviridae і не є арбовірусом, тому що його існування не пов’язане з членис-

тоногими.

Віріон має сферичну форму, діаметром 60-70 нм. У центрі віріону розташо-

ваний ікосаедричний капсид, у середині якого міститься однонитчаста + РНК, зовні

капсид вкритий суперкапсидною оболонкою з двома типами глікопротеїнів Е1 і

Е2, які утворюють шипики. Встановлено наявність двох антигенів – внутрішньо-

го і зовнішнього. Внутрішній (нуклеокапсидний) виявляється в РЗК, зовнішній

(суперкапсидний) – в РГГА, реакції затримки гемолізу та РН. Вірус має гемаглю-

тинуючу, гемолітичну та слабовиражену нейрамінідазну активність.

368

Частина ІV. Вірусологія

Вірус краснухи порівняно нестійкий до дії хімічних і фізичних факторів, не

зберігається тривалий час у зовнішньому середовищі. Швидко руйнується під дією

органічних розчинників, формаліну, ультрафіолетового проміння.

Вірус культивується у великій кількості різноманітних культур клітин, однак

у більшості з них не викликає цитопатичного ефекту. Цитопатичну дію вірусу

можна спостерігати на перещеплюваних культурах ВНК-21, Vero, RK-21, а також

в первинних культурах клітин, одержаних із тканин ембріона людини.

Джерелом інфекції є хворі люди та особи з безсимптомними формами інфекції.

Основний механізм зараження – повітряно-краплинний, хоча відомі випадки пе-

редачі збудника через інфіковані предмети.

Проникнувши в організм, вірус уражує епітелій слизової оболонки рота, зго-

дом епітелій верхніх дихальних шляхів, потрапляє в лімфатичні вузли, а звідти в

кров. Вірусемія закінчується через 2-3 тижні після зараження при появі в крові

специфічних антитіл і висипу на тілі хворого.

Характерним симптомом хвороби є поява висипу, який спочатку виникає на

шиї та обличчі, в той же день розповсюджується на тулуб, розгинальні поверхні

рук, сідниці, стегна. Його поява супроводжується підвищенням температури до

38 °С. Через 2-3 дні висип блідне й зникає.

Вірус краснухи має ембріотоксичну активність, викликаючи вади розвитку

плода (глухоту, катаракту, серцеві аномалії). Тому особливо небезпечним є інфіку-

вання вірусом краснухи вагітних у перші 4 тижні вагітності, проте небезпека роз-

витку таких явищ існує до 16-17 тижня вагітності.

Лабораторна діагностика. Для виділення вірусу в перші дні хвороби вико-

ристовують змиви із слизової носоглотки, кров і сечу, якими заражують перещеп-

лювані культури клітин ВНК-21, Vero, RK-21, первинні клітини ембріона людини

або кроля. При репродукції вірусу в цих клітинах спостерігається характерний

цитопатичний ефект. На поверхні моношару появляються клітини з посиленим

світлозаломленням, згодом виникають окремі вогнища змінених вакуолізованих

клітин, які відпадають від поверхні скла. При зараженні інших культур клітин

цитопатична дія вірусу не спостерігається. У такому випадку для індикації вірусу

використовують феномен інтерференції, суть якого полягає в тому, що уражені

вірусом краснухи клітини не заражуються іншими вірусами, наприклад, ЕСНО-

11, вірусом везикулярного стоматиту. Останні віруси завжди спричиняють цито-

патичний ефект в інфікованих ними клітинах, за винятком того випадку, коли в

цих клітинах знаходиться вірус краснухи. Ідентифікацію вірусу проводять з вико-

ристанням специфічної сироватки в РГГА, РН, РІФ. Набуває широкого викорис-

тання ПЛР, яка дозволяє безпосередньо виявити нуклеїнову кислоту вірусу.

До прискорених методів виявлення вірусу краснухи відносяться латекс-аг-

лютинація, ІФА, РІФ.

У практичних лабораторіях значно частіше використовують серологічні ме-

тоди. Вивлення приросту титру антитіл у парних сироватках проводять у РГГА,

РЗК, РН, ІФА. Віруснейтралізуючі антитіла та антигемаглютиніни визначають вже

на 4-7 день після появи висипу, комплементзв’язуючі – пізніше (через 2-3 тижні).

369

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Діагностичне значення набуває виявлення в сироватці специфічних IgM, наявність

яких вказує про недавно перенесену хворобу або інфекцію в момент дослідження.

Знаходження в сироватці крові немовлят специфічних IgM свідчить про перене-

сену внутрішньоутробну інфекцію краснухи.

Лімфоцитарний хоріоменінгіт

Вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту належить до родини Arenaviridae, яка

відзначається певними особливостями будови віріону. Віріони сферичної форми,

їх діаметр становить 110-140 нм. На поверхні суперкапсиду розміщені великі шипи.

Під суперкапсидом знаходяться 2 кільцеподібні нуклеокапсиди, які нагадують

намисто і складаються з –РНК і капсомерів. Поряд з нуклеокапсидами чітко про-

слідковуються гранули – комплекси вірусних протеїнів з рибосомами клітини

господаря.

Значна кількість первинних і перещеплюваних культур клітин чутливі до віру-

су, проте рідко можна помітити в них деструктивні зміни. Найчастіше для культи-

вування вірусу використовують перещеплювані клітини Vero, ВНК-21 і первинні

культури курячих фібробластів.

Збудник хоріоменінгіту широко поширений в навколишньому середовищі.

Основним резервуаром вірусу є сірі будинкові миші. Основні шляхи зараження

людини – повітряно-краплинний та аліментарний при вживанні харчових про-

дуктів, інфікованих виділеннями мишей. Не є винятком можливість проникнення

збудника в організм через шкіру, а також трансплацентарна передача.

В оргнізмі вірус уражує оболонки головного мозку і клітини ретикулоендо-

теліальної системи, викликаючи їх апоптоз.

У людини перебіг хвороби нагадує грип – підвищення температури, голов-

ний біль, біль у м’язах, рідше розвиваються симптоми асептичного менінгіту і

менінгоенцефаліту. При вродженому лімфоцитарному хоріоменінгіті розвиваються

гідроцефалія, дитячий церебральний параліч, хоріоретиніт.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є кров, спинномоз-

кова рідина, мозкова тканина осіб, що загинули. Виділення вірусу проводять шля-

хом зараження в мозок молодих білих мишей або культури клітин. Ідентифікацію

вірусу проводять за допомогою РЗК, РОНГА, РН, ІФА, РІА. Як антиген можна

використати культуральну рідину заражених клітин або 10 % суспензію мозкової

тканини заражених мишей. Методом імунофлуоресценції досліджують культури

клітин або зрізи мозку інфікованих мишей.

Противірусні антитіла можна виявити як у сироватці крові, так і в спинно-

мозковій рідині. З цією метою використовують РЗК, РН, РНГА, ІФА, РІФ, РІА.

Вірусні гепатити

Вірусні гепатити – група інфекційних захворювань, які існують як самостійні

нозологічні форми і спричиняються вірусами. Вони характеризуються ураження-

370

Частина ІV. Вірусологія

ми печінки людини, мають жовтяничний або безжовтяничний перебіг і загально-

токсичні прояви. Збудниками їх є віруси гепатитів A, B, C, D, E, F, G та інші.

Гепатит А

Збудник епідемічного гепатиту А належать до родини Picornaviridae, роду

Hepatovirus, типу 72. Він має сферичну форму, кубічний тип симетрії, діаметр

зрілого віріона – 27-32 нм. У центрі віріона міститься однониткова лінійна плюс-

нитка РНК. Поверхня капсиду створюється 32 окремими капсомерами, поверх-

невих виступів немає (рис. 94). Віруси мають чотири структурних білки – VР1,

VР2, VР3, VP4.

Від інших ентеровірусів вірус гепатиту А відрізняється більш високою рези-

стентністю до дії факторів зовнішнього середовища. Зокрема, він частково збері-

гає свою інфекційність у культурі клітин при 60 °С протягом 4-12 год, тижнями

при кімнатній температурі, протягом кількох місяців при 4 °С. Ультрафіолетове

випромінювання знищує його за 1 хв, при автоклавуванні (121 °С) – за 20 хв, дія

сухого жару (180 °С) – за одну годину. Вірус чутливий до формаліну, хлораміну,

хлорного вапна.

З метою лабораторної діагностики використовують вірусологічні, серологічні

та експрес-методи.

Вірусологічна діагностика грунтується на виявленні самого збудника, або

його антигенів після нагромадження його в спеціальних тест-системах. Матеріа-

лом для такого дослідження є фекалії хворого, які можна використати, починаючи

з другого тижня інкубаційного періоду, і протягом 14-21 дня жовтяничного періо-

ду. Їх піддають попередній підготовці, яка полягає в одержанні гомогенізованого

у фосфатному буфері 10-40 % фекального екстракту. Під час цього процесу віруси

концентрують, використовуючи фільтрування матеріалу через сефарозу, а також

центрифугування за градієнтом щільності хлориду цезію.

Одержаним матеріалом заражують культури клітин нирок ембріону макак-

резус (FrhK-4, FrhK-6), первинної гепатоцелюлярної карциноми, лімфобластів

людини та інші. Слід відзначити, що вірусам гепатиту А притаманний довгий цикл

репродукції, який триває 4-10 тижнів без по-

мітної цитопатичної дії.

У заражених клітинах віруси або їх анти-

гени можна виявити за допомогою імунної

електронної мікроскопії (ІЕМ), РІФ, РІА, ІФА.

Імунна електронна мікроскопія передба-

чає змішування суспензії вірусів з відповідною

антисироваткою, відділення імунних комп-

лексів з наступним дослідженням останніх під

електронним мікроскопом. В умовах негатив-

ного контрастування можна виявити агрегати

вірусів при концентрації менше 10

у 1 г

Рис. 94. Вірус гепатиту А

(за Хіллеманом).

371

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

матеріалу. Однак у зв’язку з великою трудоємністю, цей метод у практичних лабо-

раторіях не використовується.

Реакцію імунофлуоресценції можна використати і при дослідженні біоптатів

печінки. При прямій імунофлуоресценції користуються міченим флуоресцеїнізо-

тіоцианатом IgG, виділеним із сироваток реконвалесцентів. Цінність методу по-

лягає в тому, що він дозволяє знайти окремі клітини, які містять антиген.

Радіоімунний та імуноферментний аналізи в твердій фазі. Ці методи

найрозповсюдженіші в діагностиці, мають однакову високу чутливість і спе-

цифічність. Вони мають один і той же принцип постановки з тією різницею, що

в РІА використовують специфічні імуноглобуліни (IgG), мічені

125

І, а в ІФА –

ферментом пероксидазою.

Наявність вірусів у фекаліях є 100 % підтвердженням діагнозу, однак від-

сутність їх за даними серологічних реакцій не виключає гепатит А.

У окремих випадках матеріалом від хворого можна заражати лабораторних

тварин. Найчастіше у високоспеціалізованих лабораторіях використовують мавп

шимпанзе, мармозет, павіанів та інших.

Пізніше в матеріалі від тварин виявляють віруси гепатиту А або його антиге-

ни вищеописаними способами.

Експрес-діагностика гепатиту А спрямована на безпосереднє визначення

вірусів у випорожненнях хворого. З цією метою використовують сучасні методи

імунної електронної мікроскопії, радіоімунний аналіз, реакцію ензиммічених ан-

титіл. Останній є достатньо чутливим і ефективним. Генетичний аналіз базується

на ПЛР.

Серологічне дослідження. Одним із способів доказу етіологічної належності

виділеного від хворих вірусу є виявлення в парних сироватках крові зростання

титру специфічних антитіл. При захворюванні антитіла з’являються рано, їх син-

тез починається ще в інкубаційному періоді, а титр різко зростає. У зв’язку з пізнім

поступленням хворих у стаціонар чотирикратне діагностичне збільшення титру

антитіл виявити практично неможливо. Тому цей метод діагностики не знайшов

широкого застосування.

Антитіла проти вірусу гепатиту А в інкубаційному періоді й на початку гос-

трої фази захворювання представлені класом IgM. Поступово знижуючись у титрі,

вони циркулюють протягом 6-8, а деколи й 12-18 місяців. Анти-ВГА IgM синтезу-

ються у всіх хворих, незалежно від форми інфекції. Знаходження їх – ранній тест

діагностики, який дозволяє не тільки підтвердити або заперечити клінічний діаг-

ноз, але й виявити стерті, безсимптомні форми хвороби, що має вирішальне зна-

чення в епідеміологічих дослідженнях. У подальшому їх заміщує IgG. Імуногло-

буліни класу М можна знаходити в крові протягом 3-6 місяців після перенесеного

захворювання, в той час як IgG – протягом усього життя. Антитіла виявляють за

допомогою РІА або ІФА.

Крім визначення анти-ВГА IgM, для діагностики в гострому періоді захво-

рювання в сироватці виявляють анти-ВГА IgA, які також є ранніми антитілами і

372

Частина ІV. Вірусологія

зростають паралельно з IgM, проте зниження їх титру відбувається значно швид-

ше. Секреторні анти-ВГА IgA знайдено також у фекаліях.

Найчастіше для визначення титру антитіл використовують ІФА, РІА, деко-

ли – РЗК.

Гепатит В

Вірус гепатиту В (ВГВ) належить до родини Hepadnaviridae. Він представ-

ляє собою сферичної форми складнорганізований вірус діаметром до 42 нм (див.

вкл., рис. 30). Зовні вірус вкритий білково-ліпідною суперкапсидною оболонкою.

Капсид побудований за кубічним типом симетрії, складається з 180 капсомерів.

Серцевина вірусу містить ДНК, що складається з 3200 нуклеотидних основ, кова-

лентно пов’язану з поліпептидом, ДНК-полімеразу, протеїнкіназу. ДНК має фор-

му кільця, один з ланцюгів якої дефектний. У процесі репродукції вірусів ДНК-

полімераза добудовує дефектну ДНК.

ВГВ має декілька антигенів. Поверхневий антиген (HBsAg) високостійкий

до дії фізико-хімічних факторів. Його виявляють практично в усіх біологічних

рідинах хворих. Серцевинний антиген (НBcAg) входить до складу нуклеокапсиду

ВГВ. Цей антиген присутній в ядрах гепатоцитів хворих людей. HBeAg міститься

між HBcAg і НВsAg. Його можна виявити в цитоплазмі та ядрах гепатоцитів лю-

дей, які інфіковані вірусом. Деякі дослідники висловлюють припущення про існу-

вання ще одного антигену – HВxAg, який може мати відношення до ракової транс-

формації гепатоцитів.

Віруси гепатиту В мають високу резистентність до дії різноманітних фак-

торів зовнішнього середовища. Зокрема, вони витримують кип’ятіння протягом

15-20 хв, а при 60 °С – до декількох годин. Автоклавування при 121 °С інактивує

вірус протягом 30 хв, сухий жар (160 °С) – за 60 хв, а при 180 °С – за 40 хв.

У зв’язку з тим, що вірус гепатиту В не репродукується ні в культурах тка-

нин, ні в курячих ембріонах, можна виділити два основних напрямки лаборатор-

них досліджень – серологічну та експрес-діагностику.

Експрес-діагностика спрямована на виявлення у крові хворого антигенів

вірусу гепатиту – HBsAg, HBcAg і HBeAg. У рутинній лабораторній практиці най-

частіше визначають HBsAg. Він з’являється в крові хворих ще протягом інкубацій-

ного періоду, за декілька тижнів до появи основних клінічних симптомів хвороби

і зростання активності печінкових ферментів трансаміназ. Як правило, у сиро-

ватці крові поверхневих антигенів у декілька сотень або тисяч разів більше, ніж

самих вірусів. Розроблено декілька методів, що дозволяють виявити в сироватці

хворої людини або вірусоносія ці антигени: реакція преципітації в гелі, реакція

зворотної непрямої гемаглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, РІА, ІФА.

Останні дві реакції за своєю чутливістю значно перевищують попередні. HBeAg

можна виявити за допомогою ІФА, РНГА, РНЗГА, РЗК, а HBcAg – ІФА, РІА та

інших.

Серологічні дослідження. З цією метою досліджують сироватку крові хво-

рих на наявність антитіл проти різних антигенів вірусів гепатиту В. Сучасні серо-

373

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

логічні методи дозволяють визначити в крові антитіла проти різноманітних вірус-

них антигенів: анти-HBs, анти-HBc і анти-HBe.

Найзручніші методи, що використовуються, – ІФА, РІА. Однак антитіла про-

ти HBsAg можна знайти ще за допомогою реакції преципітації в гелі, реакції не-

прямої гемаглютинації тощо.

Визначення взаємозв’язку між вірусними антигенами, що з’являються в крові

хворих або вірусоносіїв, та відповідними антитілами IgM i IgG, які нагромаджу-

ються в сироватці крові, є вкрай важливим з діагностичної точки зору, оскільки

дозволяє слідкувати за динамікою хвороби та прогнозувати її перебіг. Ці антигени

і антитіла названі маркерами вірусного гепатиту В. До них, таким чином, нале-

жать у першу чергу HBsAg, HBсAg, HBeAg, анти-HBs, анти-HBe, анти-HBs IgM і

сумарний пул антитіл проти цього антигену.

HBsAg можна знайти в організмі людини приблизно через 3-5 тижнів після

зараження. Про видужання після гострого гепатиту В свідчить повне зникнення

HBsAg та поява антитіл (анти-HBs) у сироватці крові. Останні можуть зберігатись

протягом всього життя. Однак антитіла проти поверхневого HBsAg з’являються

не відразу після його зникнення, а через деякий проміжок часу (від 2-4 тижнів до

1 року). У цей період маркером гепатиту виступають антитіла до HBсAg і, зокре-

ма, IgM, а сам цей період називається корівським вікном (від англ. core – серцеви-

на). Ці антитіла існують у сироватці не тільки при гострій формі гепатиту, але й

при хронічній. Не менш важливим маркером є анти-НВс антитіла, які належать до

класу IgG. Ці імуноглобуліни вторинної імунної відповіді можуть бути знайдені в

крові людини протягом всього життя.

Іншим діагностичним маркером гострого періоду хвороби є наявність HBеAg,

який може циркулювати у крові до 7 тижнів. Його вважають маркером реплікації

ДНК вірусу гепатиту В або антигеном інфекційності, тому що знаходять його най-

частіше разом з ДНК-полімеразою і ДНК вірусу гепатиту В. Хоча концентрація

цих антигенів у крові нижча, ніж HBsAg, вони є майже у всіх хворих.

При гострому гепатиті В HBeAg можна виявити в крові протягом 6-8 тижнів.

Пізніше там нагромаджуються антитіла проти них (анти-HBе), а вони самі

зникають. Якщо при відповідних дослідженнях у хворого виявляють HBeAg після

9-10 тижня від початку захворювання, це може розглядатись як свідчення хроні-

зації процесу. У таких випадках цей ензимний антиген циркулює в крові протягом

декількох років.

Ретельне вивчення антигенної будови вірусу гепатиту В та системи генів, які

його кодують, привернуло увагу до вірусних поліпептидів (антигенів), які коду-

ються геном env, зокрема, його зонами пре-S1 та пре-S2. Вважають, що наявність

пре-S2 антигену в крові свідчить про її високі інфекційні властивості. У той же

час у хворих, які одужали, в крові присутні антитіла до цього антигену. Пре-S1

антигени також засвідчують інфекційність крові, реплікацію вірусів в організмі, а

також достатньо високий ризик можливості вертикальної передачі вірусу гепати-

ту В від матері до дитини.

374

Частина ІV. Вірусологія

Гепатит С, Д, Е, G

Вірус гепатиту С належать до родини Flaviviridae. Його відносять до склад-

них вірусів. Віріон має діаметр 30-60 нм. У центрі міститься одноланцюгова плюс-

РНК, що складається з майже з 9500 нуклеотидних основ. Зверху вірус вкритий

суперкапсидною білково-ліпідною оболонкою. Віруси чутливі до ефіру, дезокси-

холату натрію, УФ-опромінення, здатні витримувати нагрівання до 50 °С.

Лабораторна діагностика спрямована на виявлення анти-ВГС IgM і IgG за

допомогою імуноферментного аналізу. Ці антитіла з’являються в крові приблизно

через 1 місяць після інфікування. У той же час розроблені тест-системи для іму-

ноферментного аналізу 1-3-го поколінь з використанням рекомбінантних антигенів

вірусів, дозволяють визначати антитіла безпосередньо до антигенів.

Дослідити наявність вірусної РНК у крові хворої людини можна за допомо-

гою полімеразної ланцюгової реакції.

Вірус гепатиту D належить до роду Deltavirus. Він круглої форми, діамет-

ром 35-37 нм. У центрі віріона міститься кільцева однониткова РНК, розташована

на HDAg. Вірус оточений суперкапсидною оболонкою, представленою HBsAg.

Вірус гепатиту D є дефектним, оскільки його реплікація відбувається за рахунок

геному ВГВ.

Вірус гепатиту D стійкий до високих температур, ферментів нуклеаз, однак

легко руйнується лугами і протеазами.

З метою лабораторної діагностики вірусного гепатиту D проводять визна-

чення таких його маркерів як HDAg, анти-HD IgM і IgG за допомогою РІА та ІФА.

Підтверджує діагноз гепатиту D безпосереднє виявлення ВГD у сироватці

крові або в гепатоцитах. HDAg з’являється в ядрах гепатоцитів у кінці інкубацій-

ного періоду і зберігається протягом гострої фази захворювання. Однак методи

його концентрування і отримання досить складні, тому доступні тільки для висо-

коспеціалізованих лабораторій.

Серологічна діагностика використовується для визначення у сироватці крові

антитіл IgM і IgG проти HDAg. Анти-HD IgM з’являються вже через 2 тижні після

інфікування, а пізніше починає зростати титр анти-HD IgG.

Вірус гепатиту Е не знайшов ще свого остаточного положення в класифі-

каційній системі. Вважалось, що він є представником родини Caliciviridae. Збуд-

ник має сферичну форму, його діаметр становить 32-34 нм. Геном вірусу пред-

ставлено однонитковою РНК, оточеною капсидом. Його поверхня має специфічні

виступи та невеликі западини.

Достатньо ефективних методів діагностики цієї форми гепатиту ще немає. Є

спроби виявити інфекційні агенти у фекаліях хворих за допомогою імунної електрон-

ної мікроскопії, ПЛР. Серологічна діагностика спрямована на визначення сумарної

кількості антитіл, які можна знайти, використовуючи відповідні системи для ІФА.

Вірус гепатиту G описано зовсім недавно (1995 р.). Це складний вірус, ге-

ном якого представлено однонитковою плюс-РНК. Зовні він оточений капсидною

та суперкапсидною оболонками.

375

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Основний матеріал для дослідження – кров хворих. У ній можна виявити або

вірусну РНК за допомогою ПЛР, або дослідити навність загального пулу імуно-

глобулінів проти інфекційного агента. З цією метою можна використати ІФА.

ВІЛ-інфекція

Віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) входять до родини Retroviridae, роду

Lentivirus. Виділяють два види збудників синдрому набутого імунодефіциту – ВІЛ-І

і ВІЛ-ІІ.

ВІЛ-1 має округлу форму, його розміри – 100-120 нм (рис. 94). Геном скла-

дається з двох ідентичних „плюс”-ниток РНК, асоційованих з ревертазою та внут-

рішніми білками. У геномі міститься 9 генів (3 структурних: gag, pol, env, і 6 не-

структурних: tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, які кодують внутрішні білки вірусу, реверта-

зу, ендонуклеазу, протеазу і специфічні білки зовнішньої оболонки). Серцевина

віріона оточена білками капсиду й набуває конусоподібної форми. З нею асоційо-

вані білки р7, р9, р24. Вона відділена від зовнішньої оболонки ще одним шаром

білків – матриксним (р17). На зовнішній ліпідній оболонці розміщені глікопротеї-

нові шипики, які складаються з двох субодиниць глікопротеїду (gp 41 i gp 120). У

сукупності їх позначають як gp 160. У зв’язку з особливостями структури генома,

ВІЛ має значну антигенну мінливість.

При нагріванні до 56 °С протягом 30 хв вірус інактивується. Він чутливий до

дії спирту, ефіру, ацетону, іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання.

ВІЛ-2 за своєю будовою принципово не відрізняється від ВІЛ-1, однак має

певні відмінності в складі геному, білків тощо.

Діагностика СНІДу – складна і відповідальна. Вона ґрунтується на основних

клінічних проявах захво-

рювання, а також результа-

тах вірусологічних, серо-

логічних та інших методів

дослідження, і вимагає їх

комплексної оцінки.

Серологічна діагно-

стика. Сьогодні в Україні

розроблена двоетапна си-

стема лабораторної діаг-

ностики захворювання,

яка включає дослідження

сироватки крові людини

на наявність антитіл про-

ти ВІЛ. Сироватка крові

осіб з підозрою на ВІЛ-но-

сійство обстежується за

допомогою ІФА. Це відбу-

Рис. 94. Вірус імунодефіциту людини (схема).

Ліпідна

мембрана

Ревертаза

gp120

gp41

p17

p24

Серцевина

РНК і

білки р9, р7

376

Частина ІV. Вірусологія

вається в спеціалізованих лабораторіях з діагностики СНІДу, які розгортаються

на базах санепідстанцій, станцій переливання крові, поліклінік, диспансерів, інфек-

ційних лікарень тощо.

Основним матеріалом для дослідження є кров. Її забирають із ліктьової вени

в об’ємі 5 мл. Отриману пізніше сироватку можна зберігати при температурі 4 °С

протягом 7 днів. Запропоновано також використання способу “сухої краплини”.

Він полягає в тому, що за допомогою стерильної голки проколюють палець і дек-

ілька крапель крові наносять на стерильний диск, виготовлений з фільтрувально-

го паперу. Висушені диски можуть зберігатись тривалий час (до 6 місяців) у полі-

етиленових пакетах. У разі потреби за допомогою фосфатного сольового розчину

імуноглобуліни переводять у рідкий стан і досліджують.

Доведено, що антитіла проти ВІЛ можна виявити в сльозах, слині, грудному

молоці (IgA), спинномозковій рідині (в осіб з енцефалопатіями або неврологіч-

ною симптоматикою), навіть у сечі. Допустимим вважається дослідження на на-

явність антитіл рідини склоподібного тіла в трупів.

ІФА (в основному, непрямий) дозволяє визначити антитіла у будь-якому дос-

лідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом, що використовується у

будь-яких лабораторіях світу. Антигени для цих тест-систем одержують або із за-

ражених тканинних культур, або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні

використовують тест-системи “Антиген”, “Рекомбінант-ВІЛ”, “Скрин-ВІЛ”,

“Комбі-ВІЛ”, фірми “Аbbott” та інші.

Слід відзначити, що антитіла у крові з’являються не зразу після попадання

ВІЛ в організм, а не менш, ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше (5-8 міс.), тому

слід пам’ятати, що ІФА є малопридатною для діагностики вірусоносійства саме в

серонегативний період. Одноразовий позитивний результат виявлення антитіл в

крові не дає можливості підтвердити діагноз набутого імунодефіциту. Цю реак-

цію рекомендують повторити тричі. Діагностичними вважаються два позитивних

результати в трьох повторах. Така схема постановки реакцій зумовлюється тим,

що сучасні тест-системи все ж таки можуть давати як псевдопозитивні, так і псев-

донегативні результати.

Зразки крові, які дали два позитивних результати з трьох повторів, направля-

ють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвер-

дження наявності ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердофазного імунофер-

ментного аналізу – вестернблоту або імуноблоту (від англ. blott – пляма), реакції

непрямої імунофлуоресценціїї або радіоімунної преципітації. Ці методи дозволя-

ють виявити антитіла до певних вірусних білків.

Метод вестернблоту передбачає попереднє електрофоретичне розділення

вірусних білків у поліакриламідному гелі з наступним переносом їх на спеціальні

нітроцелюльозні мембрани. Після цього на фільтрах розганяються досліджувані

зразки крові з подальшою ідентифікацією їх білків (антитіла проти певних струк-

турних вірусних білків) за допомогою антивидових мічених сироваток. На нітро-

целюльозних фільтрах з’являються кольорові смуги, що відповідають комплек-

сам, утвореним вірусними структурними білками та антитілами сироватки віру-

377

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

соносія. Про позитивний результат реакції може свідчити наявність антитіл проти

вірусних білків р24, p31, gp41, gp120/160.

При негативних результатах на фільтрах не видно характерних зон забар-

влення.

Одним із ефективних способів визначення наявності антитіл проти ВІЛ у

сироватці крові людини є використання реакції мікроаглютинації. Вона подібна

до реакції непрямої гемаглютинації, однак замість еритроцитів, сенсибілізованих

відповідним антигеном, тут використовують як основу частинки желатину або

латексу. У випадку позитивного результату спостерігають за появою специфічного

осаду в лунках планшет. Дана реакція дає подібні результати до ІФА, проте значно

простіша за методикою постановки, швидше виконується, дає менше псевдопози-

тивних результатів.

Іншим методом виявлення антитіл проти ВІЛ є реакція непрямої імунофлуо-

ресценції. Для постановки цієї реакції використовують антиген, який одержують

з перещеплюваних ліній лімфоцитів, заражених вірусами імунодефіциту. З них

готують препарати фіксованих клітин, які можна зберігати протягом 2 місяців при

температурі -20 °С. У разі необхідності скельця з нанесеним антигеном обробля-

ють розведеними досліджуваними сироватками (1:10, 1:100, 1:1000 тощо), а потім

люмінесцентною антисироваткою проти імуноглобулінів людини. Препарати до-

датково контрастують синькою Еванса і вивчають у люмінесцентному мікроскопі.

Більш чутливим є метод радіоімунопреципітації. Як і при будь-якій імуно-

логічній реакції в його основі лежить взаємодія антигенів ВІЛ з антитілами проти

них. У цій реакції як антигени використовують білки ВІЛ, мічені радіоактивними

ізотопами

125

I або

Реакцію проводять у рідкій фазі, змішуючи гомологічні антигени (вірусні біл-

ки gp120, gp41, p24, p17, p9 та інші) й антитіла (сироватка вірусоносія), внаслідок

чого утворюються імунні комплекси. Вони взаємодіють із спеціальною системою,

яка складається з білка А S. аureus, з’єднаного із сефарозою, внаслідок чого відбу-

вається преципітація. Утворений комплекс за допомогою ультрацентрифугування

осаджують у пробірках, видаляють надосадову рідину, залишаючи тільки субстрат

антиген-антитіло-білок А-сефароза. На наступному етапі дослідження виклика-

ють дисоціацію комплексів додецилсульфатом натрію, піддають їх електрофоре-

зу в поліакриламідному гелі і за допомогою авторадіографії визначають молеку-

лярну масу мічених ізотопами білків. Це дозволяє встановити, які саме вірусні

білки знаходяться в імунних комплексах, отже, до яких вірусних білків утворю-

ються антитіла. Цей метод є чутливішим, ніж імуноблот, проте вимагає спеціаль-

ного обладнання, тому не використовується широко в лабораторній практиці.

Підсумовуючи вищевикладене, можна таким чином підійти до підтверджен-

ня діагнозу ВІЛ-носійства. Одноразовий негативний результат на наявність ан-

титіл, одержаний за допомогою ІФА, дозволяє зробити висновок про відсутність

ВІЛ-інфікування. Два позитивних результати з трьох повторних досліджень сиро-

ваток не дають змоги встановити діагноз вірусоносійства. Це можна зробити тільки

після одержання позитивних результатів про наявність антитіл проти певних вірус-

378

Частина ІV. Вірусологія

них структурних білків за допомогою імуноблотингу або інших методів, що його

замінюють.

Вірусологічна діагностика. Матеріалом для дослідження може бути кров,

спинномозкова рідина, грудне молоко, сперма, біоптати при автопсії тощо. Для

виявлення вірусу використовують електронну мікроскопію, зараження культур

Т-лімфоцитів (CD

-клітини). Для ідентифікації вірусів можливе використання ви-

сокочутливих тест-систем ІФА, реакції непрямої імунофлуоресценції, характер-

ної цитопатичної дії тощо.

Важливим для діагностики СНІДу є визначення провірусу в лімфоцитах, або

вірусних нуклеїнових кислот у патологічному матеріалі. З цією метою широко

використовують методи молекулярної гібридизації. Використання цього методу

набуває важливого значення особливо через те, що серонегативний період при

СНІДі може тривати декілька місяців. Висока чутливість запропонованого методу

дозволяє виявити навіть поодинокі вірусні частинки в крові (0,1-1,0 нг нуклеїно-

вих кислот). Принцип його полягає в тому, що в умовах in vitro викликається про-

цес гібридизації між вірусною нуклеїновою кислотою (ДНК, РНК) та спеціальним

зондом, який мічений радіоактивним фосфором

Р. Утворений комплекс достат-

ньо легко можна ідентифікувати за допомогою авторадіографії. Однак викорис-

тання

Р-зондів у певній мірі ускладнює цей метод, оскільки вони мають корот-

кий (2 тижні) період напіврозпаду, вимагають дотримання суворих правил техні-

ки безпеки при роботі з радіоактивними ізотопами тощо. Враховуючи це,

перспективним напрямком є використання зондів, які можна виявити за допомо-

гою кольорових ферментативних реакцій. Такою міткою є біотин (біотиновий зонд).

Існують різноманітні варіанти молекулярної гібридизації, серед яких найча-

стіше застосовуються точкова гібридизація, блот-гібридизація, сандвіч-гібриди-

зація, гібридизація in situ (в заражених тканинах).

Одним з варіантів молекулярної гібридизації розглядається полімеразно-лан-

цюгова реакція, в основі якої лежить ампліфікація генів. Використання ДНК-полі-

мерази, наприклад, з Thermophylus aquaticus дозволяє за кілька циклів ампліфі-

кації значно збільшити кількість досліджуваних нуклеїнових кислот, внаслідок

чого їх можна виявити будь-якими відомими методами – ІФА, електрофорез у полі-

акриламідному гелі тощо. Ця реакція суттєво перевищує чутливість попередньо-

го методу (на декілька порядків), тому може бути використана при дослідженні

мікрооб’ємів матеріалу або таких тест-об’єктів, де іншими методами віруси іму-

нодефіциту не виявляються, наприклад, змиви з носоглотки, слина.

Крім описаних методів діагностики, допустимим визнається виявлення ан-

тигенемії, яка зумовлена білком р24. Цей р24-антиген можна визначити за допо-

могою модифікованих методів ІФА.

Одержання позитивного результату при застосуванні одного з наведених ме-

тодів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу ВІЛ-

інфекції.

Вірусологічна діагностика СНІДу – достатньо складний процес, доступний

для виконання тільки у високоспеціалізованих лабораторіях, де створюються всі

379

Розділ 14. Шпитальні інфекції

необхідні умови для роботи (захист персоналу від зараження під час культивуван-

ня, очищення та концентрування ВІЛ) і є висококваліфіковані фахівці.

Таким чином, при наявності ВІЛ-інфекції у вірусоносіїв або хворих на СНІД

можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, безпосередньо

інфекційний вірус, провірус у ДНК уражених імуноцитів, вірусний антиген у си-

роватці крові та інфікованих клітинах-мішенях.

Розділ 14

ШПИТАЛЬНІ ІНФЕКЦІЇ

Захворювання мікробної етіології, що виникають у госпіталізованих хворих

під час перебування їх у стаціонарах або у медичних працівників під час роботи в

них, називаються нозокоміальними або внутрішньолікарняними (шпитальни-

ми) інфекціями.

Зустрічаються вони в усіх країнах світу і є серйозною проблемою для ліку-

вально-профілактичних закладів охорони здоров'я. Вони, як правило, приєдну-

ються до основного захворювання або вперше виникають у новонароджених

Розрізняють такі основні групи нозокоміальних інфекцій: бактеріємії й сеп-

тицемії, гнійно-запальні ускладнення ран і опіків, гострі кишкові, респіраторні,

урогенітальні, посттрансфузійні інфекції та захворювання, обумовлені довготри-

валим лікуванням антибіотиками.

Збудниками цих захворювань можуть бути найрізноманітніші види бактерій,

вірусів, грибів і найпростіших. Однак провідна роль належить представникам

кокової групи, бактероїдам, клостридіям та численним грамнегатавним паличкам

Питома вага грамнегативних бактерій у виникненні шпитальних інфекцій з року

в рік зростає.

Мікробіологічна діагностика внутрішньолікарняних інфекцій має свої особ-

ливості і труднощі У зв'язку з великою різноманітністю збудників потрібно засто-

совувати різні методи дослідження При бактеріологічній діагностиці гнійно-за-

пальних захворювань часто виділяють мікробні асоціації (стафілококи і грамне-

гативні бактерії, декілька видів ентеробактерій тощо) Коли ж виділяють

умовно-патогенні мікроорганізми, важливо визначати їх кількість у досліджува-

ному матеріалі. Критична концентрація складає 10

-10

клітин в 1 мл. Але кількість

мікробів у досліджуваному матеріалі може дуже різнитися. Тому важливо прово-

дити і видову ідентифікацію бактерій та визначати їх потенційні патогенні влас-

тивості. Необхідно також ставити відповідні серологічні реакції для виявлення

специфічних антигенів у крові хворого, визначати антитіла (особливо наростання

їх титру) до автоштамів, і тим самим обгрунтовано підтверджувати діагноз.

380

Частина ІV. Вірусологія

Нижче наведені основні методичні прийоми мікробіологічної діагностики

окремих госпітальних інфекцій, які найчастіше зустрічаються в лікарняних зак-

ладах.

Бактеріємії й септицемії, як одні з тяжких форм назокоміальних інфекцій,

можуть спричинити практично майже всі види патогенних мікроорганізмів. Грам-

позитивні бактеріємії найчастіше викликають золотисті й епідермальні стафіло-

коки та стрептококи, а грамнегативні бактеріємії – ешерихії, клебсієли, псевдомо-

нади, протей, серації, нейсерії. Збудниками септицемій найчастіше є бактероїди

та клостридії.

Точний діагноз цих форм нозокоміальних інфекцій можна встановити лише

після виділення гемокультури. Для проведення мікробіологічного аналізу беруть

лише венозну кров (по можливості до прийому або через 12-24 год після останнього

прийому антибактеріальних препаратів). При цьому необхідно дотримуватись, жор-

стких правил асептики В місці венепункції шкіру обробляють 70 % спиртом, потім

одним із антисептиків (йодоформ, хлоргексидин) і знову спиртом. Оброблена поверх-

ня повинна висохнути і лише через 1-2 хв беруть 10-20 мл крові (у дітей 3-5 мл).

Посіви проводять у 2 флакони (по 5-10 мл) із збагаченими живильними сере-

довищами у співвідношенні 1:10 і швидко надсилають до лабораторії, не допус-

каючи заморожування Один флакон інкубують у звичайних аеробних умовах, дру-

гий – заливають вазеліновим маслом, щоб забезпечити ріст анаеробів Для виді-

лення аеробних бактерій використовують “подвійне середовище” (скошений агар

і цукровий бульйон у одному флаконі: посів крові проводять у бульйон і при інку-

бації періодично зрошують ним скошену частину агару, на якому потім вироста-

ють ізольовані колонії). Для анаеробних бактерій використовують тіогліколевий

бульйон та середовище Кітта-Тароцці, для грибів – рідке середовище Сабуро.

Мікроскопічне дослідження крові, зазвичай, не проводять, оскільки виявити

бактерії у мазках вдається дуже рідко.

Засіяні середовища у флаконах витримують у термостаті при 37 °С впродовж

7 днів, контролюючи наявність росту макро- і мікроскопічно кожного дня, роб-

лять висіви на відповідні щільні середовища з метою виділення та ідентифікації

чистих культур, вивчення їх біологічних властивостей і чутливості до антибіо-

тиків. При відсутності росту протягом тижня проводять повторне дослідження на

14-ий день. Якщо росту немає протягом двох тижнів, результат вважають негатив-

ним. При виділенні бактероїдів дослідження може тривати три і більше тижнів.

Для підвищення частоти виявлення бактерій рекомендують брати кров для

виділення гемокультури тричі впродовж доби.

Захворювання дихальних шляхів (риніти, фарингіти, бронхіти, пневмонії,

абсцеси і гангрени легень та ін.) викликають паличка інфлуенци, пневмококи,

мікоплазми, пневмоцисти, а також орто- і параміксовіруси, рино- і коронавіруси,

адено- і респіраторно-синцитіальні віруси. Внутрішньолікарняні інфекції дихаль-

них шляхів (особливо пневмонії) домінують серед всіх інших захворювань.

Основним матеріалом для дослідження є мазки з носа, рото- і носоглотки,

харкотиння та промивні води бронхів. Порівняно рідко досліджують біоптати ле-

381

Розділ 14. Шпитальні інфекції

гень, аспірати трахеї. Мазки беруть тампонами натще до чищення зубів, полос-

кання рота, носа і глотки. Синтетичну гігроскопічну вату для виготовлення там-

понів використовувати не слід, оскільки вона містить альгінат натрію, який згуб-

но впливає на мікрофлору. Для кожної ніздрі беруть окремий тампон. При заборі

матеріалу з ротоглотки не можна торкатись тампоном до слизової рота і язика.

Матеріал із носоглотки беруть спеціальним задньоглотковим тампоном.

Ранкову порцію харкотиння збирають у стерильну банку. Перед цим хворий

чистить зуби і прополіскує рот кип'яченою водою для видалення залишків їжі,

епітеліальних клітин та мікрофлори ротової порожнини.

Досліджуваний матеріал спочатку мікроскопують у мазках, забарвлених за

Грамом, й одночасно проводять посів. Мікроскопія є важливим орієнтиром для

вибору оптимальних живильних середовищ.

При перегляді мазків оцінюють загальну картину мікрофлори наявність ста-

філо-, мікро- і стрептококів, нейсерій, капсульних пневмококів і клебсієл, грамне-

гативних паличок, міцелію і бластоспор грибів При гострій інфекції в харкотинні

виявляють бактерії, розміщені поблизу лейкоцитів. Мікроорганізми з ротової по-

рожнини розташовуються навколо епітеліальних клітин, їх до уваги не беруть

Скоріше всього вони свідчать про порушення техніки забору В таких випадках

взяття матеріалу необхідно повторити.

Посіви проводять на кров'яний і шоколадний агар, ЖСА, середовища Ендо і

Сабуро, які попередньо підігрівають у термостаті. При посіві тампоном матеріал

спочатку втирають в середовище на невеликій ділянці (2-3 см

), а потім штрихами

по всій поверхні середовища,

Перед посівом харкотиння спочатку виливають у чашку Петрі, вибирають

2-3 гнійні грудочки, тричі відмивають їх від супутньої мікрофлори в стерильному

Схема бактеріологічного дослідження при захворюваннях

дихальних шляхів

Досліджуваний матеріал

(мазки з носа, зіва, харкотиння, промивні води бронхів)

ЖСА Шоколадний

агар

Кров’яний

агар

Середовище

Ендо

Агар

Сабуро

Триптиказо-

соєвий агар

Тіогліколеве

середовище

Мікроскопія підозрілих колоній

Посів на середовища для одержання чистих культур

Мікроскопічне дослідження

виділених чистих культур

Ідентифікація Визначення чутливості

до антибіотиків

Мікроскопія

382

Частина ІV. Вірусологія

ізотонічному розчині хлориду натрію і наносять на середовище. Посів проводять

стерильним скляним шпателем, рівномірно розтираючи матеріал по поверхні сере-

довища. Через 18-24 год інкубації в термостаті підраховують кількість колоній,

виділяють чисті культури та проводять їх ідентифікацію загальноприйнятими

методами. Обов'язково визначають їх чутливість до антибактеріальних препаратів

Як додатковий використовують і кількісний метод визначення бактерій у хар-

котинні. Для цього 1 мл харкотиння гомогенізують в 9 мл бульйону чи пептонної

води за допомогою скляних бусинок у колбі протягом 20 хв, або в ступках із сте-

рильним кварцевим піском. Потім із гомогенізованого матеріалу готують серійні

розведення від 10

-1

до 10

-7

і по 0,1 мл із останніх трьох розведень висівають на

кров’яний агар. На середовища Ендо і Сабуро сіють 0,1 мл початкового розведен-

ня (1:10) Через 24 год інкубації в термостаті підраховують кількість колоній кож-

ного виду мікроорганізмів. Діагностично значущим є виявлення S.рпеитоniае і

Н.influenzae в концентрації 10

і більше бактерій в 1 мл. Для умовно-патогенних

мікроорганізмів така концентрація має значення при 2-3-кратному їх виявленні з

інтервалом у 3-5 днів.

Важливе значення має кількісна оцінка колоній і при первинному посіві на

щільні середовища. При цьому використовують такі критерії (ступені): перший –

ріст поодиноких колоній (до 10); другий – ріст від 10 до 25 колоній; третій – ріст

50 і більше колоній; четвертий – суцільний ріст, колонії не можна підрахувати.

Третій-четвертий ступінь, як правило, свідчить про етіологічну роль даного

мікроорганізму, перший і другий – про носійство або контамінацію.

При підозрі на вірусні інфекції дихальних шляхів досліджуваний матеріал

направляють до вірусологічної лабораторії, де проводять відповідні вірусологічні

дослідження.

Гнійно-запальні, ранові та опікові інфекції. Збудниками ранових і гнійних

післяопераційних ускладнень є стафіло- і стрептококи, грамнегативні бактерії,

клостридії, бактероїди, фузобактерії та ін. Остеомієліти, мастити, омфаліти, оти-

ти найчастіше викликають золотистий і епідермальний стафілококи, апендицити

і перитоніти – ешерихії, протей, бактероїди, ентерококи, клебсієли, часто в асоці-

аціях зі стафілококами. Опікові інфекції спричиняють стафілококи, псевдомона-

ди та інші грамнегативні бактерії, представники нормальної мікрофлори шкіри та

слизових оболонок.

Матеріал із рани або поверхні опіків беруть двома стерильними тампонами

(один – для виготовлення мазків, другий – для посіву). Гній, шматочки видале-

них тканин, промивну рідину з дренажів забирають у стерильні пробірки при

дотриманні правил асептики і протягом години доставляють до лабораторії. При

ураженні зовнішнього вуха проводять спочатку обробку шкіри 70 % спиртом,

потім беруть матеріал стерильним ватним тампоном. Якщо запальний процес

локалізується в середньому або внутрішньому вусі, досліджують пунктат і ма-

теріал, взятий під час операцій. Матеріал із кон’юнктиви, рогівки і повік беруть

бактеріологічною петлею (або маленьким тампоном). Забір матеріалу проводить

лікар-окуліст.

383

Розділ 14. Шпитальні інфекції

Виготовлені для мікроскопії мазки фарбують за Грамом (в разі потреби за

Романовським-Гімзою або Цілем-Нільсеном). При виявленні мікроорганізмів опи-

сують їх морфологічну характеристику і густину обсіменіння За результатами

мікроскопії вибирають живильні середовища і вносять корективи в хід мікробіо-

логічного дослідження.

Посіви матеріалу роблять на 5 % кров’яний агар, цукровий бульйон та сере-

довище для контролю стерильності. Посів на щільні середовища проводять за

методом “тампон-петля”. Спочатку тампоном проводять доріжку по діаметру чаш-

ки, потім другою стороною тампона засівають ще одну “доріжку” паралельну

першій. Після цього матеріал розсівають петлею штрихами, перпендикулярними

до “доріжок”. Такий посів дає можливість виділити бактерії у вигляді окремих

колоній навіть із мікробних асоціацій.

Посіви на щільні та в рідкі середовища інкубують при 37 °С протягом доби.

При виявленні росту окремі колонії відсівають на елективні середовища з метою

їх ідентифікації. Обов'язково відмічають чи мікроби ростуть у вигляді монокуль-

тури, чи в асоціації. При наявності асоціацій відмічають переважний ріст того чи

іншого представника асоціації. В ряді випадків рекомендують проводити і кількісні

дослідження, визначаючи концентрацію мікробів в 1 мл гною, ексудату чи в 1 г

видаленої тканини.

При підозрі на наявність у досліджуваному матеріалі грибів, посів додатково

проводять ще й на середовище Сабуро і вирощування здійснюють при темпера-

турі 22-25 °С протягом 5 діб. При підозрі на виділення нейсерій посіви проводять

на сироватковий агар і тіогліколевий бульйон. Інкубацію проводять при 37 °С в

ексикаторі при 5-10 % СО

Виділені чисті культури ідентифікують за морфологічними, культуральни-

ми, біохімічними та антигенними їх властивостями, як це описано у відповідних

розділах спеціальної мікробіології.

Урогенітальні інфекції. Цистити, уретрити, пієлонефрити, уросепсис та ін.

можуть викликати стафіло- і стрептококи, протей, ешерихії, псевдомонади, клеб-

сієли, мікоплазми. При бактеріологічному дослідженні важливо правильно взяти

пробу, провести якісне і кількісне визначення мікроорганізмів в 1 мл сечі ще до

початку антимікробної терапії.

Безпосередньо перед забором сечі необхідно обмити з милом зовнішні ста-

теві органи. У стерильний посуд беруть 3-5 мл середньої порції сечі і засівають

біля ліжка хворого або доставляють до лабораторії протягом 30 хв. У разі немож-

ливого негайного дослідження сечу зберігають у холодильнику не більше 24 год.

Для посіву сечі біля ліжка хворого рекомендують метод “предметного скла”.

Стерильне предметне скло покривають шаром розтопленого агару і після засти-

гання середовища занурюють у стаканчик із сечею, виймають, дають сечі стекти,

інкубують скельце в чашці Петрі 18-24 год при 37 °С. Ізольовані колонії ідентифі-

кують.

З метою кількісного мікробіологічного дослідження сечі найчастіше викори-

стовують метод каліброваної петлі, якою проводять секторні посіви (рис. 95).

384

Частина ІV. Вірусологія

Платиновою петлею, діаметром 2 мм (ємність

0,005 мл), проводять посів сечі (30-40 штрихів) на

агар в секторі А. Петлю стерилізують у полум'ї

пальника і проводять нею 4 штрихових посіви з

сектора А в сектор 1, із сектору 1 у сектор 2, із сек-

тору 2 в сектор 3. Чашки інкубують протягом доби

при 37 °С, після чого підраховують кількість ко-

лоній, що виросли в різних секторах. Ступінь бак-

теріурії визначають за методом Гоулда (табл. 74).

Метод секторних посівів дає можливість не

тільки визначати ступінь бактеріурії, а й виділяти

збудника в чистій культурі.

В 1 мл сечі здорової людини міститься не

більше 10

бактерій (критичне число 10

мікробів) При виявленні 10

-10

і більше

бактерій в 1 мл сечі наявність інфікування сечовивідних шляхів вважають без-

сумнівним.

Для визначення локалізації інфекційного процесу в нирках чи сечовому міхурі

проводять катетеризацію останнього. За допомогою катетера випускають всю сечу

і промивають сечовий міхур розчином антибіотика (неоміцин), потім тричі з інтер-

валом 10 хв беруть проби сечі для бактеріологічного дослідження. Якщо інфек-

ційний процес уражує нирки, в усіх трьох пробах сечі будуть знаходитись бактерії,

кількість яких зростає в кожній наступній порції. При інфекції тільки сечового

міхура сеча залишається стерильною.

Гнійно-запальні процеси жіночих статевих органів (уретрити, вульвовагіні-

ти, цервіцити, ендометрити, бартолініти та ін.) можуть викликати як облігатні

Таблиця 74

Визначення інтенсивності бактеріурії за Гоулдом

Кількість колоній в секторах

А 1 2 3

Кількість бактерій

в 1 мл сечі

1-6 - <1000

8-20 - - - 3000

21-30 - - - 5000

31-60 - - - 10000

70-80 - - - 50000

100-150 5-10 - - 100000

He підраховуються 20-30 - - 500000

-“- 40-60 - - 1 млн

-“- 100-140 10-20 - 5 млн

-“-

не підрахо-

вується

30-40 - 10 млн

-“- -“- 60-80

поодинокі

колонії

100 млн

Рис. 95. Схема повторних

посівів каліброваною петлею.

385

Розділ 14. Шпитальні інфекції

анаероби (бактероїди, пептострептококи, трепонеми, клостридії, гарднерели), так

і факультативні анаероби (ентерококи, стафілококи, ешерихії, клебсієли, протей,

псевдомонади, гриби кандида та ін.).

Основою мікробіологічної діагностики цих захворювань є виділення та іден-

тифікація мікроорганізмів і встановлення їх етіологічної ролі. Бактеріологічні

дослідження мікрофлори жіночих статевих органів мають певні труднощі, оскільки

вона часто змінюється в різні періоди життя жінки. Лише порожнина і придатки

матки в нормі стерильні.

Взяття матеріалу для дослідження проводить акушер-гінеколог. Взірці мате-

ріалу з уретри беруть ранком до сечовипускання бактеріологічною петлею або

ложечкою Фолькмана. З вульви, піхви і шийки матки матеріал забирають ватним

тампоном до проведення мануального дослідження. Для взяття матеріалу з по-

рожнини матки використовують пристрої, що можуть розкриватись і закриватись

на певній глибині (напр. шприц-аспіратор). При запаленні придатків матки мате-

ріал беруть за допомогою пункції або при оперативному втручанні. Слід пам'ята-

ти, що більшість збудників швидко гине в зовнішньому середовищі. У зв'язку з

цим посіви необхідно проводити негайно або вносити проби в тіогліколеве чи

гліцеринове середовище.

Одночасно із взяттям матеріалу для посіву готують окремими тампонами 2-3

мазки для мікроскопії, обережно розподіляючи матеріал на стерильних скельцях

м’якими рухами, не вживаючи грубого втирання, висушують при кімнатній тем-

пературі. Мазки направляють до лабораторії в чашках Петрі або покривають чис-

тими предметними скельцями. При такій техніці виготовлення мазків зберігаєть-

ся справжній розподіл і кількісне співвідношення компонентів досліджуваного

матеріалу, дає можливість виявляти внутрішньоклітинне розташування бактерій

(нейсерії).

Мазки фарбують за Грамом і мікроскопують під імерсійним об'єктивом.

Відмічають кількість епітеліальних клітин, лейкоцитів, характер мікрофлори та

визначають ступені чистоти вагінального секрету. Виявлення в мазках трихомо-

над, мікоплазм, уреаплазм, міцелію або бластоспор грибів має важливе діагнос-

тичне значення.

Для виділення факультативних анаеробів посіви проводять тампоном за до-

помогою штрихового методу на кров'яний агар і середовище Ендо, потім сіють

тим же тампоном у цукровий бульйон. При підозрі на наявність анаеробів посіви

проводять у тіогліколевий бульйон та середовище Кітта-Тароцці. В разі виявлен-

ня міцелію або бластоспор грибів, посіви роблять на агар Сабуро. При досліджен-

ні шматочків тканин їх спочатку розтирають у ступці з піском, добавляють бульйон

або 0,85 % розчин хлориду натрію. По 0,1 мл гомогенату засівають на щільні се-

редовища, а також у цукровий бульйон.

Посіви вирощують у термостаті при 37 °С (на агарі Сабуро при 22-25 °С),

щодня перевіряючи наявність росту. Підраховують кількість різних видів колоній

та їх співвідношення. При помутнінні бульйону виготовляють мазки й за резуль-

татами мікроскопії роблять висіви на щільні середовища (кров'яний агар, Ендо,

386

Частина ІV. Вірусологія

ЖСА) Потім виділяють чисті культури, ідентифікують їх і визначають чутливість

до антибіотиків.

При дослідженні матеріалу з ділянок, де в нормі вегетує своя мікрофлора,

важливе значення має кількісна оцінка різних видів бактерій при первинному

посіві. При цьому використовують такі критерії (ступені):

І – дуже слабкий ріст – ріст тільки в рідких середовищах, на щільних середо-

вищах росту немає.

II – слабкий ріст – на щільному агарі ріст до 10 колоній.

III – помірний ріст – на щільному агарі ріст більше 100 колоній.

IV – дуже густий (суцільний) ріст.

Перший і другий ступені росту вказують частіше на стороннє забруднення,

третій і четвертий – на етіологічну роль даного мікроорганізму.

Негативний результат дослідження видають при відсутності росту на всіх

середовищах протягом 72 год (на агарі Сабуро – впродовж 5 діб).

Гострі кишечні інфекції. Збудниками харчових інтоксикацій є ентеротокси-

генні стафілококи, палички ботулізму та інші види клостридій. Харчові токсико-

інфекції здатні викликати численні види ентеробактерій, псевдомонад, вібріонів,

бацил, кампілобактерії та ін. Особливо часто виникають внутрішньолікарняні

випадки сальмонельозів. Окрім того, їх можуть викликати ротавіруси та криптос-

поридії.

Для виявлення збудників захворювань в різних ділянках кишечного тракту

використовують переважно бактеріологічний метод дослідження. При ураженні

шлунка найоптимальнішим вважають забір біоптатів під час фіброгастроскопії.

Взяті проби вміщують у стерильний ізотонічний розчин і направляють до лабора-

Схема бактеріологічного дослідження при кишечних інфекціях

Досліджуваний матеріал

(біоптати, фекалії, блювотні маси, промивні вода шлунка, жовч)

Середовище

збагачення

ЖСА Середовище

Ендо

Кров’яний

МПА

Тіогліколеве

середовище

Мікроскопія підозрілих колоній

Мікроскопія

Визначення

чутливості до

антибіотиків

Ідентифікація

Середовище

для

анаеробів

Агар

Цейслера

Середовище

Ендо

Середовище Олькеницького

Мікроскопія

387

Розділ 14. Шпитальні інфекції

торії. Але найчастіше в якості досліджуваного матеріалу для діагностики кишко-

вих інфекцій забирають фекалії, блювотні маси і промивні води шлунка.

Бактеріологічне дослідження потрібно розпочинати не пізніше 0,5-1 год після

взяття матеріалу. Якщо це неможливо, проби слід заморозити і дослідити не пізніше

24 год. Іноді для транспортування доцільно вживати консервуючі рідини (30 %

гліцерин, селенітовий бульйон тощо). Промивні води необхідно досліджувати не-

гайно. При великій кількості їх краще процентрифугувати і дослідити осад. Жовч

беруть за допомогою зондування окремими порціями (А, В, С) у три стерильні

пробірки. Взяті проби направляють до лабораторії не пізніше 1-2 год. Матеріал із

тонкої кишки відбирають за допомогою фібродуоденоскопіі або спеціальним зон-

дом, що відкривається і закривається в заданому місці. Мікроорганізми товстої

кишки вивчають при дослідженні фекалій. Мазок із прямої кишки беруть тампо-

ном або трубкою Цімана. При ураженні нижніх відділів товстого кишечника мож-

на взяти матеріал безпосередньо з місця ураження за допомогою ректороманоско-

па, але цей метод останнім часом використовують рідко. Частіше для цього засто-

совують фіброколоноскопію.

Посіви досліджуваного матеріалу проводять на щільні та рідкі елективні се-

редовища, виділяють чисті культури, визначають їх чутливість до антибіотиків.

При оцінці результатів бактеріологічного дослідження необхідно звертати

увагу не тільки на видовий склад мікробіоценозу кишечника у даного хворого, а й

кількісне співвідношення окремих його співчленів.

Якщо з випорожнень виділяють патогенні ентеробактерії, гемолітичні еше-

рихії та гемолітичні стафілококи, які у здорових людей відсутні, це має важливе

діагностичне значення. Для визнання етіологічної ролі представників нормально-

го мікробіоценозу важливо порівнювати їх титр з концентрацією відповідних мікро-

організмів у здорових дітей і дорослих. При ураженнях, викликаних іншими ви-

дами, необхідно проводити дослідження у відповідності з методикою виділення

кожного збудника.

Захворювання, що викликаються патогенними та умовно-патогенними гри-

бами, називаються мікозами. Для людини хвороботворними є біля ста видів грибів,

які входять до семи класів: хітрідіоміцетів, гіфохітрідіоміцетів, ооміцетів, зигомі-

цетів, аскоміцетів, базидіоміцетів і дейтероміцетів. Розрізняють такі основні гру-

пи грибкових захворювань людини:

1. Поверхневі мікози або сапрофітії, при яких уражається роговий шар епі-

дермісу і поверхні волосяних стержнів.

2. Дерматомікози – ураження шкіри, її придатків, волосся і нігтів.

3. Підшкірні мікози – патологічний процес первинно локалізується в ткани-

нах під шкірою, рідко у м’язах, кістках і суглобах.

4. Системні (респіраторні) мікози – первинне вогнище розмноження грибів у

легенях, рідше зустрічаються диссеміновані форми з ураженням будь -яких внут-

рішніх органів (глибокі мікози).

5. Опортуністичні мікози (аспергільози, пеніцильози, кандидози) – виника-

ють у осіб з імунодефіцитами.

Розділ 15

МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ МІКОЗІВ

Для мікробіологічної діагностики мікозів використовують мікроскопічні,

мікологічні (культуральні), імунологічні (серологічні, алергічні та ін.), біологічні

та гістологічні методи дослідження. При мікозах уражуються різні тканини і орга-

ни: шкіра і слизові оболонки, органи дихання і кишечного тракту, серцево-судин-

на і нервова системи, органи кровотворення, селезінка й печінка, лімфатична і

сечостатева системи та ін. Залежно від клінічних проявів патологічного процесу

матеріалом для дослідження може бути гній, харкотиння, зскрібки зі шкіри і нігтів,

пунктати лімфовузлів і кісткового мозку, уражене волосся, кров, ліквор, шлунко-

вий сік, жовч, сеча, випорожнення, біоптати тканин та ін.

Забір патологічного матеріалу. Успіх лабораторного дослідження залежить

від правильного взяття матеріалу. При ураженні шкіри лусочки з периферії свіжого

вогнища ураження беруть скальпелем, а пушкові волоски – пінцетом. При висипках

на ступнях і кистях їх верхівки зрізають ножицями чи бритвою. Зскрібки з поверх-

невих уражень нігтів проводять скальпелем, а стовщені їх ділянки зрізають мані-

кюрними кусачками. Гній із відкритих уражень та виразок беруть ложечкою Фольк-

Частина V

МІКОЗИ

389

Розділ 15. Методи лабораторної діагностики мікозів

мана, жолобкуватим зондом, пастерівською піпеткою; із закритих вогнищ, порожнин,

абсцесів, лімфатичних вузлів – шприцом. Проби харкотиння, жовчі, випорожнень

вміщують у стерильні баночки з притертими пробками. Спинномозкову рідину

беруть шляхом пункції шприцом, сечу – катетером при дотриманні правил асеп-

тики. Кров беруть із ліктьової вени у кількості 10 мл і вносять у флакони із рідким

живильним середовищем. Біоптати вміщують у стерильну чашку Петрі.

Досліджуваний матеріал беруть з таким розрахунком, щоб його вистачило

для виготовлення нативних і забарвлених препаратів, посіву в живильні середо-

вища, постановки біопроби та гістологічного дослідження. У направленні до ла-

бораторії вказують прізвище та ініціали хворого, його вік, попередній діагноз,

локалізацію уражень, дату. При підозрінні на гістоплазмоз і кокцидіоїдоз матері-

ал направляють до спеціальних лабораторій.

Мікроскопічне дослідження. Доставлені до лабораторії проби можна вивча-

ти як у нативних (нефарбованих), так і в забарвлених препаратах.

Нативні препарати, виготовлені з лусочок шкіри, зскрібок із нігтів, волосся

попередньо просвітлюють у 10-30 % КОН або Na OH, лактофенолі та інших розчи-

нах, бажано з підігріванням над полум’ям пальника. Оброблений таким способом

матеріал наносять на предметне скло в краплю гліцерину, накривають покрівним

скельцем і досліджують під звичайним світловим мікроскопом, використовуючи

сухі об’єктиви (8×, 40×). Кращі результати отримують при фазово-контрастній

або аноптральній мікроскопії. При дослідженні гною, харкотиння, осаду спинно-

мозкової рідини, жовчі та сечі виготовляють препарат надавленої краплі в ізото-

нічному розчині хлориду натрію. Дослідження нативних препаратів дає змогу виз-

начити характер розташування спор грибів у волосках, міцелію в уражених шкірних

лусочках і зскрібках із нігтів, у деяких випадках навіть родову належність збудни-

ка. Остаточне визначення виду грибів можливе лише після виділення та ідентифі-

кації чистих культур.

Виготовлення забарвлених препаратів необхідно при дослідженні виразко-

вого вмісту, виділень із нориць, грануляцій тощо. Такий в’язкий і рідкий матеріал

розмазують на предметному склі тонким шаром. Зскрібки із грануляцій поперед-

ньо розділяють препарувальними голками. Потім мазки фіксують формаліном,

сумішшю Никифорова або Карнуа чи 5 % розчином хромової кислоти, висушу-

ють на повітрі й забарвлюють одним із рекомендованих способів залежно від мети

дослідження і гаданої форми. Найчастіше використовують методи Грама-Вель-

ша, Романовського-Гімзи, Мак-Мануса, Аравійського, Адамсона та ін. Вони де-

тально описані у спеціальних монографіях і посібниках (див. список літератури в

кінці книги). У забарвлених мазках краще виявляють окремі елементи грибів та їх

тонкі структури, ніж у нативних препаратах.

У ряді випадків проводять і електронно-мікроскопічні дослідження, особли-

во коли необхідно дослідити ультраструктуру грибів або механізм дії протигриб-

кових препаратів.

Мікологічні (культуральні) дослідження спрямовані на виділення чистих

культур грибів при посівах патологічного матеріалу на живильні середовища, вив-

390

Частина V. Мікози

чення їх макро- і мікроскопічної будови та родової і видової ідентифікації. Взятий

матеріал необхідно якомога швидше посіяти, щоб попередити розвиток у ньому

сторонньої мікрофлори. Виключення становлять шкірні лусочки, які краще сіяти

через 1-2 дні, коли кокова флора відмирає на їх поверхні. Однак звільнити матері-

ал від сапрофітних грибів практично неможливо. Для цього необхідно використа-

ти спеціальні елективні і селективні середовища.

Найчастіше посіви проводять на рідкі (пробне середовище Сабуро, пивне

сусло, м’ясо-пептонний глюкозний бульйон) та щільні середовища (агар Сабуро,

сусло-агар, глюкозо-кров’яний агар, картопляний і кукурудзяний агар, середови-

ща Чапека і Френсіса).

Додавання до середовищ антибіотиків (пеніцилін, стрептоміцин, хлорамфе-

нікол по 50-100 ОД/мл) та протигрибкових препаратів дезертоміцину і циклогек-

саміду (відповідно 0,1 і 0,5 мг/мл) робить вказані середовища селективними і є

надійним захистом первинних посівів від проростання бактеріями і пліснявою.

Лусочки шкіри, частинки нігтів і волосків при посіві розташовують на агарі

в пробірці трьома точками; харкотиння, гній та інший рідкий матеріал сіють точ-

кою або штрихом у пробірках та чашках Петрі. Дуже часто результати посівів

залежать від кількості засіяного матеріалу. Як правило, з однієї проби сіють мате-

ріал в 3-4 пробірки або 2 чашки Петрі. Вирощування (інкубацію) посівів прово-

дять у термостаті при порівняно низьких температурах (22-28 °С) протягом 2-3

тижнів.

На рідких середовищах багато видів грибів ростуть у вигляді повстяноподіб-

ного утворення спочатку на дні, а потім на стінках пробірки або ж у вигляді су-

цільної плівки на поверхні бульйону. На щільних середовищах окремі види утво-

рюють різноманітні колонії: блискучі, гладенькі, щільної консистенції, пухнасті,

ватоподібні, що погано знімаються петлею, оксамитово-ворсинчасті, гіпсо- та бо-

рошноподібні, крупнобугристі, що вростають у товщу агару тощо.

Виділені культури грибів ідентифікують за зовнішнім виглядом і формою

колоній, їх консистенцією, кольором та мікроструктурою, тобто характером міце-

лію, розташуванням конідієносців, спор та іншими ознаками. У деяких видів грибів

вивчають і їх ферментативні властивості.

Недавно запропоновано новий метод ідентифікації патогенних грибів, особ-

ливо збудників таких системних мікозів як бласто-, крипто-, кокцидіоїдозів, гісто-

плазмозу шляхом визначення нуклеїнових кислот. Із культури екстрагують РНК і

вносять одноланцюгові молекули ДНК, мічені флуоресцеїном. При наявності в

культурі одного із вказаних грибів проходить гібридизація відповідної ДНК із РНК

збудника з утворенням комплексу, що легко виявляється. Цей метод можна вико-

ристати в ранні строки культивування грибів (4-5 діб).

Хороші перспективи для швидкого виявлення грибів або їх антигенів у дослі-

джуваному матеріалі відкриває метод полімеразної ланцюгової реакції.

Імунологічні дослідження. У сироватці крові хворих на мікози утворюють-

ся аглютиніни, преципітини, комплементзв’язуючі антитіла, гемаглютиніни, реа-

гіни, які виявляють за допомогою реакцій аглютинації, преципітації, зв’язування

391

Розділ 15. Методи лабораторної діагностики мікозів

комплементу, гемаглютинації та постановки алергічних проб. Імунологічні реакції

мають особливо важливе значення у випадках ураження пацієнтів двома і більше

видами мікозів. Окрім того, серологічне дослідження виявляється цінним при кан-

дидозах і аспергільозах, коли мікологічний метод може лише виявити кандиди і

аспергіли, але неспроможний доказати їх етіологічну роль. Адже ці гриби часто

виділяють і у здорових людей. Однак слід пам’ятати, що результати імунологіч-

них реакцій часто можуть бути сумнівними внаслідок перехресного реагування

антитіл з антигенами різних видів грибів. У зв’язку з цим жодна із серологічних

реакцій не має вирішального значення при діагностиці відповідних мікозів. Вияв-

лення високих титрів антитіл в сироватці крові, особливо методом парних сирова-

ток, дозволяє раніше поставити діагноз, ще до отримання результатів культиву-

вання грибів.

Найчастіше використовують реакції латекс-аглютинації, імунофлуоресценції,

преципітації (за методом Оухтерлоні або зустрічного імуноелектрофорезу), зв’я-

зування комплементу, непрямої гемаглютинації та імуноферментний аналіз. Ме-

тодика постановки цих реакцій така сама, як і при діагностиці бактеріальних

інфекцій.

Для виявлення мікотичної алергії проводять постановку епікутанних, скари-

фікаційних і внутрішньошкірних проб з відповідними алергенами (убиті культу-

ри грибів, їх фільтрати, білкові або полісахаридні фракції з клітин чи оболонок

відповідних збудників). Результати проб враховують через 20 хв (негайні) і через

24-48 год (уповільнені). Вони проявляються у вигляді почервоніння, набряку,

рідше – некротизації у місці введення алергену. У окремих осіб можуть виникати

нездужання, незначне підвищення температури, зміни з боку крові. Позитивна

проба на кокцидіоїдин і гістоплазмін у регіонах, ендемічних відносно кокцидіої-

домікозу, вказує на давно минулу або недавню інфекцію. Однак у країнах, де такі

мікози зустрічаються дуже рідко, позитивна алергічна реакція має певну діагнос-

тичну цінність.

Алергізацію організму негайного типу до грибів можна виявити і за допомо-

гою імунологічних тестів in vitro: реакції дегрануляції тканинних базофілів, базо-

фільний тест Шеллі та ін. Для виявлення гіперчутливості уповільненого типу став-

лять реакції бласттрансформації лімфоцитів і гальмування міграції фагоцитів.

Біологічний метод використовується при глибоких і особливо небезпечних

мікозах для виділення культури збудника, визначення його патогенності, іденти-

фікації тканинних форм грибів. При зараженні тварин використовують як патоло-

гічний матеріал від хворого, так і виділену культуру. Найбільш придатними тва-

ринами є лінійні білі миші та золотисті хом’ячки. Окрім них, біопроби можна

ставити на гвінейських свинках, щурах, кроликах, собаках і котах. Досліджуваний

матеріал вводять нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово,

внутрішньоочеревинно, інтраназально, інтратрахеально, інтрацеребрально, через

рот. Внутрішньошкірне зараження найчастіше проводять дерматофітами, інтра-

назальне і внутрішньоочеревинне – особливо небезпечними грибами, інтрацереб-

ральне – при криптококозах, кладоспоріозах, кандидозах. Розроблені також спе-

392

Частина V. Мікози

ціальні експериментальні моделі при легеневих, кишкових, ниркових, септичних

ураженнях, оніхімікозах тощо. Результати перебігу мікозів у лабораторних тварин

враховують за характером утворення тканинних форм грибів, властивостями виді-

леної культури, даними гістологічних та серологічних досліджень.

Біологічний метод використовують також для виявлення зараженості різних

об’єктів зовнішнього середовища грибами та їх спорами.

Гістологічні дослідження дають можливість не тільки виявити збудників

мікозів у тканинах, вивчити особливості їх будови, а й оцінити особливості та

інтенсивність патологічного процесу. Матеріал для таких досліджень беруть під

час оперативних втручань, при біопсіях і автопсіях. Шматочки об’ємом 2-3 см

фіксують формаліном, заливають у парафін або целоїдин. Гістологічні зрізи за-

барвлюють генціановим крезиловим фіолетовим, за методом Грама-Вейгерта,

Гоморі-Грокотта та ін. Послідовність етапів такого дослідження і особливості струк-

тури грибів викладені при описанні лабораторної діагностики окремих мікозів.

Розділ 16

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ МІКОЗІВ

Кандидоз

Кандидоз (кандидомікоз) – опортуністична інфекційна хвороба шкіри, сли-

зових оболонок і внутрішніх органів, яку викликають дріжджоподібні гриби роду

Candida родини Cryptococcaceaе класу дейтероміцетів. Основним збудником є

Candida albicans, значно рідше – C. tropicales, C. krusei, C. guillermondii,

C. lusitaniae. Від інших грибів вони відрізняються відсутністю справжнього міце-

лію. Часом утворюють псевдоміцелій – подовжені клітини, що об’єднуються в

ланцюжки, які можуть мати термінальні хламідоспори.

Кандидоз зустрічається повсюдно, найчастіше як ускладнення після багатьох

інфекційних захворювань, при довготривалому нераціональному лікуванні анти-

біотиками і антисептиками, які пригнічують нормальну мікрофлору організму,

при первинних і вторинних імунодефіцитах. Виділяють чотири основні форми

кандидозів:

1. Локальні – ураження шкіри, нігтів, нігтьових валиків, слизових оболонок

рота, глотки, вагіни, вульви.

2. Системні – ураження дихальних шляхів, кишечника, сечостатевої та цент-

ральної нервової систем.

3. Генералізовані – хронічний гранульоматозний кандидоз, септикопіємія.

4. Вторинні (алергічні) кандидози – на фоні сенсибілізації організму виника-

ють нові вогнища запалення, в яких збудник відсутній.

393

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

Мікробіологічна діагностика кандидозів включає мікроскопію патологічно-

го матеріалу, виділення чистих культур грибів, проведення серологічних реакцій і

постановку алергічних проб. При локальних і системних формах захворювання

матеріал для дослідження беруть з уражених ділянок – лусочки шкіри, зскрібки з

нігтів, слиз, гній, харкотиння, сечу, жовч, ліквор, випорожнення; при генералізо-

ваних – кров, пунктати абсцесів, біопсійний матеріал; від трупів – кров із серця,

шматочки паренхіматозних органів.

Мікроскопічне дослідження. Під звичайним світловим, фазово-контрастним

або аноптральним мікроскопом вивчають нативні (незабарвлені) препарати чи

мазки. Щільний патологічний матеріал (шкірні лусочки, зскрібки з нігтів, некро-

тизовані тканини тощо) вносять у краплю 10 % розчину гідроксиду калію або

натрію на предметному склі, обережно підігрівають над полум’ям газового паль-

ника протягом 1 хв і накривають покривним скельцем. Матеріал рідкої консис-

тенції досліджують у суміші спирту з гліцерином і водою у співвідношені 2:1:2,

або в розчині Люголю подвійної концентрації в препаратах надавленої краплі без

підігрівання. Мікроскопування проводять спочатку за допомогою об’єктиву 8×, а

потім 40х. При наявності в досліджуваному матеріалі кандид у нативних препара-

тах виявляють круглі або овальні дріжджові клітини, що брунькуються, і псевдо-

міцелій (рис. 96).

12 3

Рис. 96. C. albicans: 1 – мазок із матеріалу; 2 – колонії; 3 – псевдоміцелій і хламідоспори

(за П.Н. Кашкіним і В.В. Лісіним, 1983).

Гриби кандиди зустрічаються на шкірі, слизових оболонках і у здорових лю-

дей, але, як правило, в невеликій кількості. Том у для більш достовірної діагности-

ки кандидозу важливе кількісне визначення кандид у досліджуваному матеріалі.

Виявлення великої їх кількості в патологічних виділеннях (особливо при значних

розведеннях) вказує на можливість кандидозу.

Кращі результати дає дослідження забарвлених препаратів. Висушений тонкий

мазок на предметному склі фіксують метиловим спиртом або в суміші Никифоро-

ва й забарвлюють метиленовим синім (1-3 хв), генціановим фіолетовим (2-3 хв),

фуксином Пфейфера (1-2 хв). Ще краще фарбувати мазки складними методами.

При забарвленні за Грамом кандиди мають темно-фіолетовий колір, за Цілем-

394

Частина V. Мікози

Нільсеном – синій із рожево-жовтуватими включеннями ліпідів, за Романовським-

Гімзою – рожево-жовтий із фіолетовими включеннями волютину.

Кандиди можна виявити й при гістологічному дослідженні зрізів із ураже-

них тканин, забарвлених за методом Грама-Вейгерта або Шабадаша. При ранніх

строках ураження можна застосувати прямий метод флуоресценції при обробці

мазків ізотіоціанатом флуоресцеїну, який дає яскраве золотаво-зелене світіння.

Більш надійно діагноз кандидозу встановлюють за допомогою виділення

чистої культури C. albicans.

Мікологічне дослідження. Будь-який патологічний матеріал сіють кількісним

методом на щільне середовище Сабуро або сусло-агар, а також у глюкозний МПБ.

До стерильних середовищ перед посівом добавляють пеніцилін і стрептоміцин

для пригнічення росту супутньої бактеріальної флори. Посіви вирощують при

температурі 30 °С. При рості більше 1000 типових колоній з розрахунку на 1 г

досліджуваного матеріалу роблять висновок, що кандиди є етіологічним агентом

захворювання.

Ізольовані колонії C. albicans на агарі Сабуро круглі, білувато-кремові, блис-

кучі, гладенькі, з рівними краями, нагадують краплі майонезу. Вони глибоко вро-

стають у середовище. Для виявлення псевдоміцелію колонії відсівають у одне з

рідких середовищ – глюкозний МПБ, картопляну воду або моркв’яно-рисовий

відвар. Спочатку з’являється каламуть або осад, рідше – плівка на поверхні сере-

довища. Псевдоміцелій виявляють на 3-5 день або пізніше при мікроскопічному

дослідженні надавленої краплі, користуючись об’єктивом 8×.

Диференціально-діагностичні ознаки C. albicans мають важливе значення для

ідентифікації, оскільки цей вид є основним збудником кандидозу. На терміналь-

них нитках псевдоміцелію C. albicans утворюються хламідоспори – двоконтурні

круглі структури діаметром 10-20 мкм, бластоспори з’являються в результаті брунь-

кування, розташовуються нерегулярно з обох боків псевдоміцелію.

При культивуванні в сироватці або яєчному білкові при 37 °С через 2-4 год бла-

стоспори утворюють характерні “ростові трубки” або RB – фактор. Ті штами, які

за такий короткий строк не набувають “ростових трубок”, як правило, не вірулентні.

Для ідентифікації видів грибів роду Candіda використовують також їх фермен-

тативну активність. C. albicans розкладає глюкозу, мальтозу і галактозу до кисло-

ти й газу, С. tropicales – розкладає ті ж вуглеводи і додаткову сахарозу, а C. krusei –

лише лактозу.

Серологічна діагностика проводиться здебільшого при вісцеральних фор-

мах кандидозів. При цьому використовують реакції аглютинації, зв’язування ком-

плементу, преципітації, непрямої гемаглютинації, зустрічного імуноелектрофо-

резу та метод ІФА з парними сироватками з використанням загальноприйнятих

методик. Результати вважають позитивними при наростанні титру відповідних

антитіл у 4 і більше разів. Для постановки реакції аглютинації, преципітації та

зв’язування комплементу краще використовувати антигени з культур, виділених

від даного хворого (автоштами). Для більш надійної серологічної діагностики

кандидозу краще використовувати не одну з названих реакцій, а дві-три.

395

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

Біологічна проба використовується при необхідності визначити патогенність

і вірулентність C. albicans. Виділену від хворого культуру вводять внутрішньо-

венно білим мишам або кроликам. Патогенними визнають ті культури, які в дозі

1 млн клітин викликають загибель мишей протягом п’яти діб, а кроликів – через

дев’ять діб.

Шкірні алергічні проби проводять шляхом внутрішньошкірного введення

кандида-алергену. В якості алергену можна використовувати полівалентну вакци-

ну, що містить 200 млн клітин в 1 мл. Після нагрівання вакцини при 80 °С протя-

гом 2-х год її вводять в об’ємі 0,1 мл внутрішньошкірно. Позитивну реакцію (гіпе-

ремія, набряк, папула) враховують через 24-48 год. Алергічна проба при кандидо-

зах малоспецифічна, оскільки сенсибілізація до грибкових антигенів зустрічається

дуже часто й повсюдно.

Дерматомікози

Грибкові захворювання шкіри, її придатків і підшкірної клітковини мають

загальну назву дерматомікози (дерматофітії). Залежно від роду і виду збудників та

реакції організму на їх проникнення розрізняють такі види дерматомікозів: епі-

дермофітія, руброфітія, трихофітія, мікроспорія і фавус (парша).

Епідермофітія. За клінічною картиною і найчастішою локалізацією патоло-

гічного процесу виділяють дві форми цього захворювання: пахвинна епідермофі-

тія і епідермофітія стопи. Пахвинну форму викликає Epidermophyton floccosum

(син. E. inguinalе). Збудником епідермофітії стоп є Epidermophyton interdigitalе

(син. Trychophyton mentagotophytes). Обидві форми захворювання зустрічаються

лише у людей і поширені в усіх країнах світу.

При пахвинній епідермофітії уражається шкіра пахвинних, міжсідничних і

пахвових складок, ділянки шкіри під молочними залозами, інколи й нігтьові пла-

стинки. При епідермофітії стоп у міжпальцевих проміжках злущується епітелій,

часто приєднується ураження нігтів.

Лабораторна діагностика обох форм епідермофітії подібна. Залежно від ло-

калізації патологічного процесу для дослідження беруть шкірні лусочки, клапті

мацерованого епідермісу, кришечки пухирців, зскрібки з нігтьових пластинок.

Для мікроскопічного дослідження патологічний матеріал подрібнюють, вно-

сять у краплю 10 % розчину КОН або NaOH на предметному склі, підігрівають до

появи парів і залишають на 15 хв, а зскрібки з нігтів – на 1-2 год. При мікроскопії

надавленої краплі виявляють короткий (2-4 мкм) переплетений розгалужений

міцелій і артроспори прямокутної форми, які розташовані у вигляді ланцюжків.

Мікологічне дослідження дає можливість виділити чисту культуру і визначи-

ти рід та вид збудників. Для цього подрібнений патологічний матеріал сіють на

щільне середовище Сабуро з антибіотиками в пробірках. На поверхню агару на-

носять 4-5 шматочків матеріалу в кожну пробірку. Оптимальна температура для

культивування становить 27 °С, але хороший, хоч і повільний ріст грибів можли-

вий і при кімнатній температурі.

396

Частина V. Мікози

Колонії E. floccosum мають округлу форму, трохи вдавлені в центрі, часто з

радіальними складками. Поверхня їх пухнаста, ніби густо припорошена борош-

ном, колір білувато-сірий або жовтувато-зелений. При мікроскопії таких колоній

видно септований міцелій з 4-5 – кінцевими веретоподібними структурами, що

нагадують грона бананів (рис. 97

Колонії E. interdigitale ростуть швидше, центр їх куполоподібний, складчас-

тий або бугристий, білого кольору, рідше – жовтуватого, рожевого, коричневого;

поверхня їх ніби припорошена борошном. При мікроскопії колоній виявляють дов-

гий, розгалужений, септова-

тий міцелій, на кінцях якого

є завитки та спіралі. Кінцеві

розгалуження можуть мати

гроноподібні структури.

Вид збудників епідер-

мофітії визначають на основі

структури колоній і даних їх

мікроскопії.

Серологічні, біологічні і

алергологічні дослідження

при поверхневих епідермофі-

тіях не проводять.

Руброфітія (рубромікоз) – хронічне грибкове захворювання з переважним

ураженням шкіри стоп і кистей, нігтів, великих складок, пушкових волосків,

рідше – шкіри кінцівок і всього тулуба. Збудник – Trichophyton rubrum. Уражені

ділянки шкіри лущаться, борозняться, розвивається гіперкератоз стоп і долонь,

нігті товстішають, кришаться. Хронічний процес загострюється в теплі пори року

і може перейти в генералізовану форму.

Для постановки діагнозу важливе значення мають результати мікроскопічно-

го і мікологічного дослідженння патологічного матеріалу – шкірних лусочок, пуш-

кових волосків, зскрібків нігтьових пластинок.

На агарі Сабуро виростають спочатку білі пухнасті колонії. Через 1-2 тижні

їх основа і пушок забарвлюються у вишнево-червоний колір; пігмент забарвлює і

середовище. При мікроскопії колоній видно тонкий білий септований міцелій із

грушоподібними, овальними або паличкоподібними мікроконідіями. У старих

культурах зустрічаються хламідоспори.

Трихофітія (стригучий лишай) – дерматомікоз, що спричиняється грибами

роду Trichophyton. Найважливішими з них є антропофіли Trichophyton tonsurans і

T. violaceum. При поверхневій трихофітії уражується шкіра і волосиста частина

голови. Волосся при цьому стає коротким (1-2 мм), білуватим, ломким, сухим,

інколи виглядає як чорні цяточки. Такі зміни є головною ознакою стригучого ли-

Цей і наступні рисунки запозичені з посібника П.Н. Кашкина і В.В. Лисина Практическое

руководство по медицинской микологии.– М.: Медицина, 1983.

Рис. 97. Epidermophyton floccosum:

1 – колонія, 2 – схема мікроморфології.

397

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

шая. Хронічні форми трихофітії супроводжуються ураженням нігтів, глибоких

шарів шкіри і навіть внутрішніх органів.

У лусочках шкіри і нігтьових пластинках збудник знаходиться у вигляді гілля-

стого міцелію, у волоссі розташовується за типом “ендотрикс”. Спори однакові,

крупні, овальні, рідко квадратні, знаходяться всередині волосини у вигляді довга-

стих ланцюжків.

При посіві на агар Сабуро T. violaceum починає рости на 4-5 день у вигляді

білого або ледь жовтуватого горбика. Дозріла колонія щільна, суха, порошкопо-

дібна зі складками і тріщи-

нами. У препараті надавле-

ної краплі, виготовленої з

колонії, видно прямий тон-

кий міцелій із багатьма

мікроконідіями овальної

та паличкоподібної форми,

які часто нагадують гілоч-

ки листяних дерев. У ста-

рих культурах можуть ут-

ворюватись хламідоспори

(рис. 98).

T. violaceum у патоло-

гічному матеріалі виглядає

під мікроскопом як і попередній вид. При посіві на середовище Сабуро зрілі колонії

появляються через 25-30 днів. Поверхня їх складчаста, матова або масляниста, з

чітко окресленими краями блідо-бузкового або фіолетового кольору, рідко безбарв-

ні. При мікроскопії колонії методом надавленої краплі виявляють тонкий, малосеп-

тований міцелій з боковими розгалуженнями. Видно також малі й крупні кінцеві та

вільні хламідоспори.

Мікроспорія – хронічне захворювання шкіри і волосся, яке викликають дер-

матофіти роду Microsporum. Дуже рідко уражуються нігті. Найчастішими збудни-

ками є антропофільні гриби Microsporum audouinii, M. ferrugineum і зоофільний –

M. canis. Всі вони характеризуються високою контагіозністю і викликають захво-

рювання переважно у дітей ясельного та дитсадкового віку, а також у школярів. У

місці проникнення збудника на шкірі появляються чітко окреслені запальні плями

округлої або овальної форми з характерним висівкоподібним злущуванням. При

ураженні волосистої частини голови виникають 1-2 осередки ушкодження, де во-

лосини обламані до 5-8 мм над шкірою і вкриті білим чохлом із спор грибів.

Для лабораторної діагностики мікроспорії використовують мікроскопічні й

мікологічні дослідження. При вивчені шкірних лусочок із ураженої ділянки шкіри

під мікроскопом гриби мають вигляд тонких розгалужених гіфів з невелекою

кількістю чітко окреслених перетинок (септ). Можна зустріти ланцюжки міцелію,

що розпадаються на спори. При мікроскопії ураженого волосся видно велику

кількість круглих спор, які оточують волосину суцільним шаром. У фолікулярній

Рис. 98. Trichophyton tonsurans:

1-колонії, 2 - схе ма мікроморфології.

1 2

398

Частина V. Мікози

частині волосини можна виявити септоватий міцелій. Уражені пушкові волоски

мають спори лише всередині.

При посіві патологічного матеріалу (лусочки, волосся) на агар Сабуро спос-

терігають повільний ріст круглих, плоских, пухнастих, сіруватих або кремуватих

колоній з радіальними бо-

розенками. При мікроско-

пії колоній міцелій тонкий,

світлий, довгий, розгалу-

жений, септований. Мікро-

конідії овальні і грушопо-

дібні; хламідоспори, як

правило, кінцеві (рис. 99).

Характерною ознакою

мікроспорії є голубувато-

зелене світіння уражених

волосин при люмінесцен-

тному їх освітленні (лампа

Вуда) у темній кімнаті.

Фавус (парша) – хронічне грибкове захворювання шкіри, волосся і нігтів.

Зустрічається в усіх країнах світу, в Україні останнім часом реєструється дуже

рідко. У переважній більшості випадків збудником є антропофіл Trichophyton

schonleini (Achorion schonleini). Найхарактернішою ознакою фавуса є утворення

скутул (фавозних щитків) – круглих, плоских або блюдцеподібних структур діа-

метром 2-3 см, спаяних зі шкірою. Вони мають жовтий колір, крихку консистен-

цію, складаються з уражених епітеліальних клітин і елементів грибів. Уражені

волосини міцно з’єднані в товщі скутули, але залишаються довгими і сухими, на-

бувають сірого кольору.

При мікроскопії лусочок з уражених ділянок шкіри видно розгалужений сеп-

тований міцелій, часто з артроспорами. Елементи грибів у волоссі розміщені все-

редені. Це поліморфний (тонкий і більш широкий) септований міцелій із заокруг-

леними або загостреними кінцями. Тут же зустрічаються ланцюжки і купки круг-

лих і багатогранних спор, бульки повітря, крапельки жиру.

Виділення чистих культур грибів проводять шляхом посіву на щільне сере-

довище Сабуро. Колонії починають рости з 3-4 дня у вигляді сіруватого горбика.

На 10-й день вони досягають розмірів 1-2 см, ще пізніше стають зморшкуваті,

ніздрюваті, сухі, подібні на гриб сморж або губку, мають різноманітний колір:

білий, жовтий, кремовий, коричневий.

При мікроскопічному дослідженні молодих колоній у препараті надавленої

краплі виявляють тонкий, ніжний, чітко сегментований міцелій; пізніше він стає

грубшим, на ньому появляються бокові веретеноподібні здуття і розгалуження на

кінцях, що нагадують канделябри, роги північних оленів тощо. У великій кількості

видно інтеркаларні й кінцеві хламідоспори. Макроконідії множинні (по 5-8 штук),

тонкосептовані, їх розміри коливаються від 6-10 мкм до 30-80 мкм.

Рис. 99. Microsporum audouinii:

1 – колонії, 2 – схема мікроморфології.

1 2

399

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

Глибокі (вісцеральні) мікози

Збудниками глибоких мікозів є гриби, що знаходяться в грунті та органічних

субстратах лише у певних географічних зонах, де значна частина людей інфікова-

на ними. Початок хвороби має безсимптомний перебіг і лише у небагатьох осіб

вона може призвести до розвитку тяжких форм або смерті.

Криптококоз (європейський бластомікоз) – один із мікозів, що має гострий,

підгострий або хронічний перебіг, поширений повсюдно, але зустрічається порів-

няно рідко, переважно в європейських країнах. Збудник – Cryptococcus neoformans.

Патологічний процес спочатку локалізується в легенях, пізніше проходить

дисемінація збудника в мозок, шкіру, слизові оболонки. Матеріалом для дослі-

дження служить харкотиння, гній із нориць, осад сечі і спинномозкової рідини,

шматочки уражених тканин, взятих при біопсії або автопсії. Для серологічних

реакцій беруть кров.

Під мікроскопом краще розглядати незабарвлені тушові препарати. При цьо-

му видно елементи гриба, оточені слизовою жовтуватою капсулою. Вони мають

округлу або яйцеподібну форму розміром від 3-5 до 10-15 мкм з однією малень-

кою брунькою. Інколи видно короткий відросток міцелію (рис. 100).

Для забарвлення гістологічних зрізів найчастіше використовують муцикармін

або гематоксилін-еозин, за допомогою яких особливо чітко виявляють капсули.

Виділення чистих культур проводять шляхом посіву на агар Сабуро або сус-

ло-агар з антибіотиками. Культивують при температурі 37 °С. Колонії на щільних

середовищах мають округлу форму, гладенькі, блискучі, куполоподібні, інколи

ледь зморшкуваті, дрібнозернисті, сметаноподібної консистенції, тягнуться за

петлею. Вони забарвлені в різний колір – від білувато-жовтуватого до бурувато-

коричневого. При мікроскопічному їх дослідженні клітини з культур і з патологіч-

ного матеріалу виглядають однаково. Найхарактернішою ознакою криптококів є

дріжджоподібна форма з наявністю товстої слизової капсули, яка за своїми розмі-

рами в декілька разів перебільшує величину клітин (до 50 мкм).

У ряді випадків для визначення патогенності збудника ставлять біологічні

проби на мишах і гвінейських свинках. Тварин заражують інтрацеребрально

Рис. 100. Cryptococcus neoformans:

1 – колонії; 2 – клітини в незабарвленому мазку; 3 – схема мікроформології.

1 23

400

Частина V. Мікози

(0,05 мл) або в черевну порожнину (0,5 мл). Двох із заражених мишей досліджують

через 2 тижні, а двох інших – через 1-2 місяці. Гомогенізовані шматочки печінки,

селезінки і мозку висівають на середовища й ідентифікують виділені культури.

При підозрі на криптококоз проводять також серологічні дослідження, спря-

мовані як на визначення антигенів збудника, так і антитіл у сироватці крові. Для

виявлення антигенів використовують реакцію латекс-аглютинації, імуноелектро-

форез та імуноферментний аналіз. Антитіла визначають за допомогою реакції аглю-

тинації, преципітації, непрямої гемаглютинації та зв’язування комплементу. Рідко

проводять внутрішньошкірні проби. Серологічні й алергічні реакції мають не ви-

рішальне, а лише допоміжне значення.

Північноамериканський бластомікоз – антропозоофільний мікоз з уражен-

ням шкіри, слизових оболонок, внутрішніх органів і кісток, ендемічний для Кана-

ди і США. Збудник – Blastomyces dermatitides. Для лабораторної діагностики ви-

користовують гній, харкотиння, сечу, спинномозкову рідину, пунктат лімфовузлів,

кров для серологічних реакцій. Проводять мікроскопічні, культуральні та імуно-

логічні дослідження.

Доставлений матеріал обробляють 10 % розчином гідроксиду калію, прогля-

дають у нативних препаратах методом надавленої краплі в суміші спирту з гліце-

рином. Використовують сухі об’єктиви (20×, 40×). Бластоміцети виглядають як

крупні (до 20 мкм) дріжджоподібні клітини круглої чи овальної форми з двокон-

турною стінкою та однією брунькою, яка зв’язана материнською клітиною широ-

кою основою. Псевдоміцелій відсутній. Це так звана дріжджова фаза гриба. До-

сліджують також мазки, забарвлені за методом Грама або Романовського-Гімзи.

Для виділення чистої культури патологічний матеріал сіють на щільне сере-

довище Сабуро, сусло-агар і глюкозний МПА. Культивують при кімнатній темпера-

турі. При цьому гриби можуть виростати у дріжджовій або міцелярній фазі.

Дріжджові колонії мають округлу форму, білуватий колір, сметаноподібну конси-

стенцію. У мазках із таких колоній видно круглі або овальні клітини розміром

8-12 мкм із бруньками.

Колонії з міцелярної форми гриба мають округлу форму, пухнасту поверхню

сіруватого кольору. При мікроскопії таких колоній видно клітини з капсулами,

розгалужений септований міцелій з товстими стінками та великою кількістю бо-

кових конідій круглої, овальної, рідше грушоподібної форми. У старих культур

появляється велика кількість хламідоспор діаметром 10-18 мкм.

Виділити чисту культуру з одночасним визначенням її патогенності можна

також шляхом зараження білих мишей з наступним висівом матеріалу з тканин і

органів на живильні середовища.

Для досить ефективного серологічного дослідження в пізні періоди захво-

рювання використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу, ІФА.

Високої оцінки заслуговує і алергічна проба з алергеном бластоміцином.

Паракокцидіоїдоз (південноамериканський бластомікоз) – хронічний гли-

бокий мікоз, розповсюджений в країнах Південної Америки. Частіше хворіють

люди від 30 до 50 років. Збудником є двофазний гриб Paracoccidioides brasiliensis.

401

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

Уражуються спочатку слизова оболонка рото- і носоглотки, шкіра, особливо на-

вколоанальної зони. Пізніше процес переходить у лімфатичні вузли та внутрішні

органи (легені, печінка, шлунок, селезінка). Досліджують гній, харкотиння, гра-

нуляції, виділення нориць, біоптати тканин і органів.

Для лабораторної діагностики використовують ті самі методи, що й при

північноамериканському бластомікозі. В уражених тканинах гриби мають сфе-

ричну або овальну форму дріжджоподібних клітин діаметром 30-60 мкм, які ма-

ють двокамерну оболонку з великою кількістю дрібних бруньок на поверхні у

вигляді корони, що є важливою диференціальною ознакою збудника (рис. 101).

Рис. 101. Paracoccidioides brasiliensis: 1 – клітини; 2 – колонії; 3 – старі спори.

123

Чисті культури виділяють на кров’яному і сироватковому агарі з антибіоти-

ками. P. brasiliensis росте повільно. У дріжджоподібній фазі культивують при 37 °С

(гладенькі або гірозні колонії). Під мікроскопом видно крупні, овальні або круглі

клітини з бруньками або без них.

Міцелярні форми виростають при кімнатній температурі (колонії складчасті,

покриті білувато-сірим або жовтуватим пушком). При мікроскопії виявляють роз-

галужений міцелій і овальні конідії. З діагностичною метою досліджуваний мате-

ріал вводять у паренхіму яєчок лабораторних тварин, потім виділяють збудника з

уражених ділянок.

У пізні строки захворювання досліджують сироватку крові на наявність анти-

тіл у реакціях зв’язування комплементу та преципітації в гелі. Алергічну пробу

вважають специфічною. Для її постановки використовують алерген із тканинної

форми гриба.

Гістоплазмоз – широко розповсюджений хронічний системний мікоз. Збуд-

ник американського гістоплазмозу – Histoplasmа capsulatum, африканського –

H. duboisii. Гриби мають тканинну (дріжджову) і культуральну (міцелярну) фор-

ми. Тканинна форма розташовується всередині макрофагів, лейкоцитів, гігантсь-

ких клітин селезінки, печінки, лімфатичних вузлів.

Спочатку процес розвивається в носоглотці, гортані й легенях, пізніше ура-

жуються майже всі тканини і органи.

При лабораторній діагностиці досліджують гній, харкотиння, спинномозко-

ву рідину, сечу, пунктати лімфатичних вузлів і кісткового мозку, біоптати лімфа-

402

Частина V. Мікози

тичних вузлів і органів. Для серологічних реакцій беруть кров. Етіологію гісто-

плазмозу встановлюють шляхом мікроскопічного і мікологічного дослідження,

постановки біопроби та імунологічних реакцій.

Мікроскопія патологічного матеріалу дає змогу виявити гістоплазми – грам-

позитивні овальні або круглі клітини, що брунькуються, оточені капсулою. Ха-

рактерне їх внутрішньоклітинне розташування. H. duboisii можуть виявлятись і

позаклітинно. Препарати забарвлюють за методом Грама або Романовського-Гімзи.

Для гістологічного дослідження виготовляють препарати-зрізи з уражених тка-

нин і фарбують їх за Грамом-Вейгертом.

Мікологічні (культуральні) дослідження проводять в умовах суворого режи-

му, прийнятого для особливо небезпечних інфекцій. Клінічний матеріал сіють на

середовище Сабуро, сироватковий або кров’яний агар з антибіотиками, а також

заражують курячі ембріони. Посіви інкубують при 25-30 °С і 37 °С протягом 2-3-х

тижнів. При температурі 25 °С виростає міцелярна форма гриба, при 37 °С –

дріжджова.

Колонії міцелярної форми сірувато-білого або коричневого кольору, пухнасті,

вростають в агар. При мікроскопії міцелій розгалужений, септований, з боковими

мікроконідіями; макроконідії округлої або грушеподібної форми.

Колонії дріжджоподібної форми гладенькі, блискучі або матові, білувато-сірі,

м’якої консистенції, містять округлі клітини, що брунькуються, часто розташо-

вані ланцюжками.

Для серологічної діагностики найбільш ефективними вважають реакцію пре-

ципітації в гелі та РЗК. Хороші результати дає постановка біологічної проби на

білих мишах або золотистих хом’ячках. Патологічний матеріал вводять у черевну

порожнину і через місяць від тварин виділяють та ідентифікують чисті культури

грибів. Для виявлення алергічного стану ставлять внутрішньошкірну пробу з

гістоплазміном. Але останні методи мають лише допоміжне значення.

Кокцидіоїдоз – гострий або хронічний глибокий системний особливо небез-

печний мікоз людей і тварин, що викликається Coccidioides immitis. Хвороба ен-

демічна для США і Латинської Америки. Уражуються шкіра, підшкірна кліткови-

на, легені та інші внутрішні органи і кістки. Збудник знаходиться в грунті. Зара-

ження відбувається при вдиханні пилу. Від людини до людини цей мікоз не

передається. Досліджуваним матеріалом служить харкотиння, гній, ліквор, біоп-

сійний матеріал, взятий під час операції.

Лабораторна діагностика базується на проведенні мікроскопічного, культу-

рального, біологічного та імунологічного дослідження. Патологічний матеріал

мікроскопують в нативних препаратах або забарвлених за Грамом-Вейгертом і

Мак-Манусом. При цьому виявляють великі (до 200 мкм), округлі, товстостінні

сферули, наповнені дрібними спорами.

Виділення чистих культур і всі маніпуляції з ними проводять у лабораторі-

ях суворого режиму як із збудниками особливо небезпечних інфекцій. Для цьо-

го гриба характерний диморфізм: при 37 °С виростає дріжджоподібна форма

(гладенькі без повітряного міцелію колонії), а при 25 °С – міцелярна форма

403

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

(плоскі, оксамитово-пухнасті, ніби припорошені борошном колонії, які мають

міцелій з великими боковими або кінцевими хламідоспорами). Мікроконідії

відсутні. Чисту культуру можна легко виділити і при зараженні хом’ячків або

самців гвінейських свинок. Патологічний матеріал вводять у паренхіму яєчок

або черевну порожнину. В осередках ураження мікроскопічно виявляють тка-

нинну форму гриба – великі сферули.

Для серологічної діагностики використовують реакції аглютинації, преципі-

тації, зв’язування комплементу, непрямої гемаглютинації. При значній дисемінації

патологічного процесу наростання титру комплементзв’язуючих антитіл свідчить

про несприятливий прогноз. Шкірні алергічні проби ставлять із кокцидіоїдним

алергеном у розведенні 1:1000. Результат враховують через 48 год. При пози-

тивному ефекті спостерігається гіперемія, припухлість і папула в місці введення

препарату.

Споротрихоз (хвороба Шенка) – хронічний глибокий мікоз, що уражує сли-

зові оболонки, мигдалики, шкіру, підшкірну клітковину, лімфовузли, рідше

внутрішні органи і кістки. Збудником хвороби є Sporotrichum schencкii. Зустрі-

чається в багатьох країнах світу. Хворіють переважно чоловіки у віці 25-40 років,

які контактують із рослинами і деревиною.

У лабораторії досліджують гній із виразок і нориць, пунктати з лімфовузлів,

кров, харкотиння, біоптати уражених тканин, кров для серологічних реакцій. Діаг-

ностика базується на виявленні грибів у патологічному матеріалі й виділенні чис-

тих культур.

Тканнина форма гриба під мікроскопом у забарвлених за Грамом препаратах

має вигляд овоїдних, сигароподібних або булавоподібних тілець, що брунькують-

ся. Вони, як правило, знаходяться в макрофагах.

Чисті культури виділяють посівом на агар Сабуро або рідкі середовища. В

культурах S. schencкii виростає в міцелярній формі (коричневі та чорні пухнасті

колонії), або в дріжджовій формі (гладенькі, м’які, жовтуваті колонії, які появля-

ються на 4-й день). Міцелій гіллястий, септований; конідії круглі, овальні, розта-

шовуються парами або у вигляді розетки (рис. 102).

Рис. 102. Sporotrichum. schencкii:

1 – клітини, що брунькуються; 2 – колонії; 3 – міцелій і розетки.

12 3

404

Частина V. Мікози

Для виділення чистих культур використовують також внутрішньоочеревин-

не або інтратестикулярне зараження гвінейських свинок, хом’ячків, білих мишей

і щурів. У тварин виникають гранульоматозні ураження, в яких виявляють типові

тільця дріжджоподібних форм.

Із серологічних методів найчастіше ставлять реакції аглютинації (особливо

латекс-аглютинації), преципітації і зв’язування комплементу. В усіх реакціях ан-

титіла виявляють у високих титрах. Досить ефективним методом діагностики є

постановка алергічних проб із споротрихіном.

Хромомікоз (тропічний бластомікоз) – хронічне захворювання шкіри,

підшкірної клітковини і внутрішніх органів, яке супроводжується утворенням

бородавчастих, папіломатозних розростань, дрібних і великих абсцесів та грану-

льоматозних вогнищ. Найчастіше хромомікоз викликає Phialophora verrucosa,

значно рідше – інші види дейтероміцетів. Даний мікоз зустрічається переважно в

країнах із тропічним і субтропічним кліматом; в Україні реєструється рідко.

Лабораторну діагностику хромомікозу проводять за допомогою мікроскопії

гною, зскрібків або біоптатів уражених тканин у краплі 10 % КОН або в розчині

спирту з гліцерином під покрівним скельцем. Досліджують і забарвлені за мето-

дом Романовського-Гімзи і Ціля-Нільсена препарати. Тканинні форми гриба ма-

ють вигляд великих (5-15 мкм) округлих клітин бурого, зеленуватого або янтарно-

жовтого кольору. Цей метод мікроскопічного дослідження дає найдостовірніші

результати.

Чисті культури грибів виділяють на середовищі Сабуро, інкубуючи посіви

при 25-28 °С. Колонії опуклі, оксамитово-пухнасті, сірувато-оливкового кольору.

Міцелій септований, хламідоспори інколи розділені на 2-4 клітини (рис. 103).

Ідентифікують виділені культури за морфологічними ознаками колоній і особ-

ливостями спороутворення. При потребі чисті культури можна виділити шляхом

інтратестикулярного зараження самців гвінейських свинок.

Часом проводять постановку реакцій преципітації та зв’язування комплементу,

а також алергічну пробу, але вони не мають суттєвого значення в діагностиці хро-

момікозу.

Рис. 103. Phialophora verrucosa: 1 – тканинна форма; 2 – колонії; 3 – міцелій.

12 3

405

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

Плісняві (цвільові) мікози

До цієї групи мікозів належать різноманітні грибкові захворювання легень,

шкіри, нігтів, внутрішніх органів тощо. Залежно від збудника, їх називають ас-

пергільозами, пеніцилінозами, мукорозами та ін. Вони виникають, як правило, у

людей з імунодефіцитами або мають професійний характер (борошномели, пиво-

вари, робітники пеніцилінових заводів тощо).

Аспергільоз – мікоз, який викликають різні види грибів роду Aspergillus. Ос-

новним збудником є Aspergillus fumigatus, інші види – A. niger, A. flavus, A. nidulans –

зустрічаються рідше. У людей аспергіли уражують шкіру, легені, бронхи, приносові

пазухи, рогівку очей, нігті, зовнішні слухові проходи, внутрішні органи і тканини.

Досліджують харкотиння, гній, пунктати, випорожнення, лусочки шкіри і

нігтів, біопсійний матеріал. Використовують мікроскопічний, культуральний, біо-

логічний та імунологічний методи діагностики.

Виявлення аспергіл у закритих вогнищах ураження (інфільтрати, абсцеси), а

тим більше виділення з них чистих культур є важливою основою для встановлен-

ня діагнозу. Під мікроскопом спостерігають нитки міцелію з характерними орга-

нами плодоносіння у вигляді конідієносців із кінцевим здуттям, стерігмами і лан-

цюжками конідій.

Молоді колонії A. fumigatus на агарі Сабуро округлі, вовнисті, білого кольору.

При старінні вони стають порошкоподібними, сизо-зеленуватими або чорними.

Мікроскопічне дослідження колоній виявляє септований міцелій з характерними

органами плодоносіння (рис. 104).

Діагностика аспергільозу при відкритих ураженнях часто утруднена. Кліти-

ни грибів у харкотинні або промивних водах бронхів у більшості випадків

відсутні, або поодинокі. Виділення чистих культур, навіть таких як A. fumigatus,

не може бути доказом наявності асперільозу відкритих поверхонь. Адже всі види

аспергіл є сапрофітами. У вигляді спор вони розповсюджені в повітрі й люди

можуть вдихати їх. Окрім того, аспергіли вегетують на слизових оболонках здо-

рових людей як представники нормальної мікрофлори. Отже, в таких випадках

необхідно робити повторні дослідження з обов’язковим посівом для кількісного

123

Рис. 104. Aspergillus fumigatus: 1 – тканинна форма; 2 – колонії; 3 – міцелій.

406

Частина V. Мікози

визначення збудника в патологічному матеріалі. Ще краще діагностику аспергі-

льозу проводити виключно серологічними методами. Для цього використову-

ють реакції преципітації за Оухтерлоні та зв’язування комплементу. Позитивна

реакція на антитіла є специфічною для всіх видів аспергіл, що викликає не-

обхідність повторного тестування з антигенами різних видів грибів цього роду.

Діагностичне значення має також виявлення високого титру IgE в сироватці крові

хворих. Для уточнення діагнозу має значення постановка внутрішньошкірної

або інгаляційної алергічної проби.

Окремі представники аспергіл здатні продуктувати афлатоксини, які мають

високу отруйність і канцерогенну дію. Виділені культури грибів перевіряють на

токсигенність шляхом введення фільтратів бульйонних культур кроликам або

гвінейським свинкам.

Пеніциліноз – опортуністичний мікоз, при якому спостерігаються ураження

шкіри, нігтів, слизової оболонки ротоглотки, зовнішніх слухових проходів, легень

та інших внутрішніх органів, спричинених різними видами грибів роду Penicillium:

P. crustosum, P. notatum, P. glaucum та ін. Всі вони ще менш патогенні, ніж аспер-

гіли, і тому дуже рідко викликають захворювання, здебільшого у осіб із різними

імунодефіцитами.

Лабораторна діагностика пеніцилінозу має значні труднощі, оскільки вказа-

ні види грибів широко розповсюджені в бактеріологічних лабораторіях і є звичними

контамінантами живильних середовищ у процесі бактеріологічних досліджень.

Патологічним матеріалом служить гній, харкотиння, пунктат закритих вог-

нищ, лусочки шкіри і нігтів, зскрібки слизових оболонок, вушна сірка.

Беззаперечним для встановлення діагнозу є виділення чистої культури грибів

при посіві біопсійного або іншого матеріалу, взятого із закритого вогнища (абсцес,

закрита порожнина, уражена тканина), а також гістологічне дослідження забар-

влених зрізів уражених тканин.

Досліджуваний матеріал обробляють 10 % КОН або сумішшю спирту з гліце-

рином і виготовляють препарат надавленої краплі. Під мікроскопом видно короткі

розгалужені септовані гіфи та китички пеніцилу з ектоспорами-конідіями.

Культуральний метод діагностики проводять шляхом посіву матеріалу на агар

Сабуро з наступним вивченням характеру колоній та їх мікроскопічного дослі-

дження.

P. сrustosum утворює плоскі бархатні колонії, китички дво-, три- і багатому-

товчасті, конідії круглі або еліпсоподібні. P. glaucum має світло-голубі або зелені

колонії з радіальними борозенками, конідієносці одиничні, спори круглі й овальні

(рис. 105). P. notatum росте у вигляді синьо-зелених пластівчастих колоній, китич-

ки у них несиметричні, спори овальні.

Серологічні реакції преципітації та зв’язування комплементу з антигенами

відповідних видів грибів, а також алергічні проби не мають вирішального діагно-

стичного значення.

Мукороз (фікомікоз) – хронічний глибокий мікоз, що викликається різними

видами грибів родини Mucoraceae: Absidia corymbifera, Mucor mucedo, Rhisopus

407

Розділ 16. Лабораторна діагностика окремих мікозів

nigricans. Захворювання супроводжується ураженням шкіри, підшкірної клітко-

вини, органів дихання, вух, очей і центральної нервової системи.

Для лабораторного дослідження направляють харкотиння, слиз із носа, гній,

пунктати закритих вогнищ ураження, біопсійні й автопсійні матеріали, лусочки

шкіри, навколонігтьових валиків, виділення із слухових проходів.

Діагностика мукорозу вимагає ретельної оцінки отриманих результатів. У

харкотиння і на слизову оболонку носа спори грибів можуть потрапити з повітря

й вести себе як сапрофіти. Але можна й при явній клінічній картині не виділити

збудника. У таких випадках необхідно дослідити забарвлені гістологічні зрізи ура-

жених тканин.

Звичайно ж у патологічному матеріалі виявляють несептований розгалуже-

ний міцелій шириною 15-20 мкм. У харкотинні часто знаходять спорангії діамет-

ром до 60 мкм з овальними ендоспорами.

На середовищі Сабуро A. corymbifera росте у вигляді пухнастих, спочатку

білих, а потім темніших колоній. Розміри спорангіїв коливаються від 40 до 60 мкм.

Спори овальні, безбарвні, гладенькі, рідше шорсткі.

M. mucedo утворює субстратний міцелій. Спорангієносці закінчуються жов-

тувато-бурими спорангіями, що наповнені овальними спорами. Спорангії видимі

навіть неозброєним оком.

R. nigricans на поверхні агару має химерно переплетений міцелій, від якого

пучками відходять спорангії, які спочатку мають коричневий, а пізніше чорний

колір. Вони містять еліпсоподібні або неправильної форми шершаві спори.

Для визначення патогенності виділених культур часом проводять інтраназаль-

не або внутрішньоочеревинне зараження гвінейських свинок і курей спорами

грибів.

Серологічні та алергічні методи дотепер ще недостатньо розроблені і, як вва-

жають спеціалісти, вони можуть мати лише допоміжне значення.

Пневмоцистоз – класичний опортуністичний мікоз, що супроводжується

розвитком інтерстиціальної пневмонії. Збудник захворювання – Pneumocystis

carinii – донедавна відносили до найпростіших. Тепер встановлено, що він є

дріжджовим грибом класу Blastomycetes. Хвороба розвивається на фоні пригнічен-

ня імунологічної реактивності. Особливо часто вона виникає при ВІЛ-інфекції і є

Рис. 105. Penicillium glaucum: 1 – тканинна форма; 2 – колонія; 3 – органи плодоносіння.

12 3

408

Частина V. Мікози

однією з головних причин смерті захворілих. Пневмоцистоз розвивається при дов-

готривалому вживанні імунодепресантів, цитостатиків, кортикостероїдів і анти-

біотиків.

Основний метод діагностики – мікроскопічний. Збудник не росте на штуч-

них живильних середовищах, але є спроби отримати культури за допомогою леге-

невої моделі на білих мишах, яким попередньо вводили кортизон.

Найкращим матеріалом для дослідження є легенева тканина, взята при біопсії

на відкритих легенях або через бронхи, а також трансторакальні аспірати. Ос-

танні особливо рекомендують при діагностиці пневмоцистозу у дітей. Харкотин-

ня менш придатне для дослідження, за винятком ВІЛ-інфекції.

Проби тканин, взятих при відкритій легеневій біопсії, проглядають макро-

скопічно для виявлення уражених вогнищ. Із ущільнених ділянок відбирають ма-

ленькі шматочки й виготовляють “роздавлені мазки” та заморожені гістологічні

зрізи. Фрагменти тканин, отриманих при трансбронхіальній біопсії, дуже малі

для виготовлення вказаних препаратів. У таких випадках для “роздавлених мазків”

необхідно взяти 3-4 біоптати. Бронхоальвеолярний лаваж може бути корисним у

хворих на СНІД, у яких P. carinii значно більше.

Мазки і гістологічні зрізи найчастіше забарвлюють за методом Грама-Вей-

герта або Романовського-Гімзи. Найбільш ха-

рактерною структурою P. carinii в мазках є “ро-

зетки”, що складаються з 8 грушоподібних

структур, розміром 1-2 мкм. Вони об’єднані в

цистоподібну форму діаметром 7-10 мкм. Цис-

ти звичайно круглі, хоч зустрічаються і чашко-

подібні. Виявлення типових цист є патогномо-

нічною ознакою пневмоцистної інфекції

(рис. 106). Скупчення слизових цист утворю-

ють пінисті структури в легенях, оточені плаз-

матичними клітинами і еозинофілами.

Для виявлення антигенів P. carinii розроб-

лені варіанти реакцій імунофлуоресценції та схем імуноферментного аналізу, але

відповідні тест-системи практично недоступні для рутинних мікробіологічних

лабораторій. З метою серологічної діагностики запропоновані реакції зв’язуван-

ня комплементу, імунофлуоресценції та ензиммічених антитіл.

Рис. 106. Pneumocystis carinii:

цисти в “роздавленому мазку”.

Підцарство найпростіших (Protozoa) – досить численна й дуже різноманітна

група еукаріотичних одноклітинних мікроорганізмів. Тепер виділяють 4 класи

найпростіших: джгутикові (Zoomastigophora), саркодові (Rhisopoda), споровики

(Sporozoa) і війкові (Infusoria). У людей вони викликають амебіаз, малярію, ток-

соплазмоз, балантідіаз, лямбліоз, трипаносомоз, криптоспоридіоз, саркоспоридіоз,

ізоспороз і трихомоноз. Паразитарні інфекції через масове розповсюдження скла-

дають сьогодні проблему глобального значення. Вони завдають великої шкоди

здоров’ю людей і наносять значні економічні збитки в багатьох країнах світу.

Розділ 17

МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ

Лабораторні методи діагностики захворювань включають мікроскопічні, куль-

туральні, серологічні, алергічні й біологічні дослідження.

Матеріалом для дослідження може бути кров, харкотиння, випорожнення,

сеча, вагінальний вміст, пунктати абсцесів, лімфовузлів і кісткового мозку, зскрібки

з інфільтратів шкіри, шматочки тканин, взятих при біопсії й аутопсії тощо.

Мікроскопічний метод. Дослідження під мікроскопом направлено на вияв-

лення збудників у нативних і забарвлених препаратах. Окрім того, їх можна знай-

ти в гістологічних зрізах, виготовлених з уражених тканин. Для забарвлення най-

простіших найчастіше використовують метод Романовського-Гімзи.

При лабораторній діагностиці малярії, трипаносомозу і токсоплазмозу досліджу-

ють звичайні мазки крові й товсту краплю, яку виготовляють кількома способами:

1. Знежиреним предметним склом торкаються краплі крові, що виступає після

проколу м’якоті пальця, і, не відриваючи від неї скла, круговими рухами доводять

діаметр до 1-1,5 см.

2. На одному предметному склі готують комбінований препарат – звичайний

тонкий мазок і на деякій відстані від нього товсту краплю.

3. На звичайний, ще вологий мазок наносять краплю крові, яка розтікаючись,

утворює правильний диск, розмір якого визначає величина краплі, але товщина

практично не змінюється. В ній збудники і клітини крові розподіляються рівно-

мірніше, ніж у звичайній товстій краплі (рис. 107).

Звичайні тонкі мазки крові фіксують метанолом (3 хв), етанолом (10-15 хв)

або в суміші Никифорова (20 хв). Товсті краплі, незалежно від способу виготов-

Частина VІ

ПРОТОЗОЙНІ ІНФЕКЦІЇ

410

Частина VІ. Протозойні інфекції

лення, висушують поступово і не фіксують. Мазки за-

барвлюють 40-45 хв фарбою Романовського (1 крапля

робочого розчину фарби на 1 мл нейтральної (рН 7,0)

води, а товсту краплю – 4-5 % водним розчином фарби

протягом 20-25 хв. Препарати ретельно промивають

водою, висушують у вертикальному положені й мікрос-

копують під імерсійним об’єктивом.

Мазки з ліквора і пунктатів готують так само, як і

мазки крові, фіксують і забарвлюють за методом Рома-

новського-Гімзи.

Зскрібки з інфільтратів шкіри роблять так: ураже-

ну ділянку протирають спиртом, стискають між двома

пальцями і гострим скальпелем роблять поверхневий

надріз шкіри. Тим же скальпелем роблять зскрібок із

дна і країв надрізу, швидко наносять тонким шаром на

предметне скло, фіксують у суміші Никифорова й за-

барвлюють за Романовським-Гімзою. Забарвлення залізним гематоксиліном за

Гейденгайом використовують для виявлення тонкої структури ядра і цитоплазми

найпростіших.

Мазки із вагінального вмісту роблять при підозрі на трихомоноз. Нанесену на

предметне скло краплю матеріалу накривають покрівним скельцем і відразу мікро-

скопують. У такій надавленій краплі виявляють рухливі форми найпростіших. Ви-

сушені та фіксовані мазки забарвлюють за методом Грама або Романовського-Гімзи.

Останній має переваги, оскільки дає змогу легко ідентифікувати трихомонади.

Для виявлення найпростіших у кишечному тракті готують мазки із дуоденаль-

ного вмісту і випорожнень. При дуоденальному зондуванні беруть всі три порції (А,

В, С) так, щоб не було домішки шлункового соку. Отримані порції окремо вилива-

ють у чашки Петрі, відбирають слизові грудочки і готують препарат надавленої

краплі. Порції жовчі центрифугують, з осаду роблять мазки, які досліджують спо-

чатку під малим, а потім під великим збільшенням. У дуоденальному вмісті можна

виявити вегетативні форми лямблій. Рекомендують проглядати 10-20 препаратів на-

давленої краплі.

Нативні препарати з фекалій готують так: на предметне скло наносять краплю

ізотонічного розчину хлориду натрію і поряд таку ж кількість розчину Люголя. Де-

рев’яною або скляною паличкою беруть частинку випорожнень і розтирають окре-

мо в обох краплях, які потім накривають покрівними скельцями і розглядають при

малому і великому збільшенні мікроскопа. Дуже добрі результати отримують при

дослідженні живих найпростіших під фазово-контрастним або аноптральним мікро-

скопом.

Якщо неможливо негайно дослідити випороження, їх консервують і направ-

ляють до лабораторії. Для цього використовують консерванти Барроу або Сафар-

лієва, налиті у пеніцилінові флакони приблизно до половини. До них додають

свіжі фекалії в об’ємі, що складає третину консерванта. При цьому морфологічні

Рис. 107. Різні способи

виготовлення товстої

краплі.

411

Розділ 17. Методи лабораторної діагностики

ознаки вегетативних форм і цист найпростіших зберігаються протягом 30 і більше

днів. Перед дослідженням консервований матеріал не перемішують, а з придон-

ного осаду краплю переносять піпеткою на предметне скло і ретельно розтира-

ють дерев’яною паличкою до отримання гомогенної емульсії. При використанні

консерванта Барроу до матеріалу добавляють краплю розведеного барвника (три-

панований або метиленовий синій, янусовий зелений, нейтральний червоний).

При малій кількості цист найпростіших у досліджуваному матеріалі викори-

стовують методи збагачення. Вони базуються на спливанні цист у розчинах із ви-

сокою щільністю (флотація у сульфаті міді чи цинку) або осіданні їх у рідині з

низькою щільністю (формалін-ефірна седиментація).

Виділення чистих культур при діагностиці протозоозів використовують

значно рідше, ніж мікроскопічні дослідження. Культивування найпростіших про-

водять лише у спеціалізованих лабораторіях, інститутах, наукових центрах. Виді-

ляти чисті культури найпростіших у звичайних мікробіологічних лабораторіях не

рекомендують. У відповідних центрах на спеціальних середовищах, курячих емб-

ріонах або культурах клітин можна виділяти практично всі види патогенних най-

простіших. До живильних середовищ потрібно добавляти кров, сироватку, яєч-

ний білок, вуглеводи, амінокислоти, вітаміни. Переважну більшість найпрості-

ших культивують при 37 °С, але лейшманії й трипаносоми краще ростуть при

температурі 20-25 °С. Для виявлення останніх сіють кров хворих, пунктати лімфа-

тичних вузлів і кісткового мозку, ліквор, зскрібки з горбків або інфільтратів чи

виразок. Види найпростіших, які уражають кишечний тракт (амеби, лямблії, ба-

лантидії, кишкові трихомонади) значно легше виявити за допомогою мікроскопії,

ніж культуральним методом.

Для швидкої діагностики деяких протозойних інфекцій (малярія, трипаносо-

моз та ін.) розроблено новий метод виявлення найпростіших – ДНК-зонди з різни-

ми мітками. Метод дуже чутливий і високоспецифічний. Він грунтується на вияв-

ленні в лізованій крові характерних для збудників фрагментів ДНК.

Серологічна діагностика. Антитіла в діагностичних титрах (спочатку IgM,

пізніше IgG) появляються в сироватці крові на другому-четвертому тижні хворо-

би. При різних видах протозоозів використовують реакції аглютинації (особливо

латекс-аглютинації), преципітації в гелі, зв’язування комплементу, прямої й не-

прямої імунофлуоресценції, імуноелектрофорезу, непрямої гемаглютинації та іму-

ноферментний аналіз. Частіше серологічні реакції ставлять при підозрі на амебіаз,

лейшманіоз, трипаносомоз і токсоплазмоз. Однак всі вони мають лише допоміж-

не діагностичне значення. Набагато ширше серологічні дослідження використо-

вують при вивченні динаміки інфекційного процесу, ефективності проведеного

лікування і особливо для виявлення інфікованості донорів з метою попередження

посттрансфузійної малярії, американського трипаносомозу тощо.

Методика постановки серологічних реакцій при протозоозах така сама, як і

при інших інфекційних хворобах. Для виявлення та ідентифікації антитіл викори-

стовують антигенні діагностикуми, а для визначення антигенів – еритроцитарні

антитільні діагностикуми.

412

Частина VІ. Протозойні інфекції

Біологічний метод з діагностичною метою вживають порівняно рідко. Зара-

ження лабораторних тварин (гвінейських свинок, кошенят, цуценят, хом’ячків,

білих мишей) здебільшого проводять з метою вивчення наукових проблем, зокре-

ма патогенності найпростіших, вірулентності окремих штамів, виявлення патоло-

гоанатомічних змін, лікарської ефективності різних препаратів тощо.

Найпростіший метод зараження лабораторних тварин – згодовування їх

досліджуваним матеріалом, який добавляють до корму. Значно рідше цей матері-

ал вводять парентерально або через зонд у шлунок чи сліпу кишку при лапаро-

томії та ін. Впродовж 30 днів у тварин мікроскопічно досліджують кров, мазки-

відбитки з паренхіматозних органів або гістологічні зрізи з уражених тканин.

Останнім часом почали також використовувати зараження курячих ембріонів при

діагностиці лейшманіозів і токсоплазмозів та тканинних культур при багатьох

протозоозах.

Алергічні проби для діагностики протозойних інфекцій найчастіше викорис-

товують при лейшманіозах із лейшманіном та при токсоплазмозі з токсоплазмі-

ном. Методика постановки цих проб така сама, як і з іншими алергенами.

Розділ 18

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ ПРОТОЗООЗІВ

Протозойні захворювання людини можуть викликати біля 50 видів патоген-

них найпростіших. На території України зустрічається 10 нозоологічних форм,

що спричиняються цими своєрідними мікроорганізмами. Розглянемо методи ла-

бораторної діагностики найголовніших протозоозів.

Малярія

Малярія (пропасниця, болотна лихоманка) – гостра або хронічна ендемічна

трансмісивна хвороба, що характеризується приступами гарячки, збільшенням

печінки й селезінки, гемолітичною анемією, рецидивуючим перебігом. Захворю-

вання у людей викликають 4 види малярійних плазмодіїв:

1. Plasmodium vivax – збудник триденної форми малярії;

2. Plasmodium ovale – викликає триденну овале-малярію;

3. Plasmodium malariae – збудник чотириденної форми малярії;

4. Plasmodium falciparum – викликає тропічну малярію.

Захворювання через укуси передають самиці комарів роду Anopheles. Окрім

того, певне епідеміологічне значення має трансфузійна малярія, що виникає після

переливання крові від донора-паразитоносія або при маніпуляції інструментами,

забрудненими зараженою кров’ю.

413

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

У процесі своєї життєдіяльності плазмодії проходять складний цикл розвит-

ку зі зміною хазяїна. Він складається з двох фаз: статевої (спорогонії), яка прохо-

дить у тілі самиці комара, і безстатевої (шизогонії), що відбувається в організмі

людини. Спочатку плазмодії проникають у клітини печінки (тканинна шизого-

нія), пізніше – в еритроцити (еритроцитарна шизогонія). Успішна лабораторна

діагностика малярії можлива саме в період еритроцитарної шизогонії.

Мікроскопічне дослідження товстої краплі і мазків крові є найпоширені-

шим і найважливішим методом діагностики захворювання. Кров від хворих треба

брати до початку лікування й кілька разів повторювати під час лікування. Плаз-

модіїв у крові більше на висоті гарячки, особливо після 2-3-го приступу, хоч їх

можна виявити і в період апірексії. Для дослідження крові від кожного хворого

після проколу м’якоті пальця готують 4-8 препаратів (мазки і товсті краплі), які

забарвлюють за методом Романовського-Гімзи. Ядра паразитів фарбуються в чер-

воний, а цитоплазма – у синьо-голубий колір.

При наявності збудників в еритроцитах виявляють різні стадії їх розвитку:

1) кільцеподібні трофозоїти виникають після проникнення їх в еритроцити; ву -

зенький обідок цитоплазми оточує вакуоль, яка витискає ядро до периферії і пара-

зит за формою нагадує перстень (кільце); 2) амебоподібні трофозоїти (дорослі

форми); 3) зрілі трофозоїти (шизонти), які діляться на 6-24 еротроцитарних меро-

зоїтів. При руйнуванні еритроцитів вони потрапляють у плазму крові. Частина

мерозоїтів в еритроцитах перетворюється у незрілі чоловічі та жіночі статеві кліти-

ни – мікро- і макрогаметоцити.

Для визначення виду малярійних плазмодіїв необхідно вміти диференціюва-

ти їх морфологічні особливості. Спочатку проглядають товсті краплі. Якщо в них

плазмодіїв не виявляють, тонкі мазки крові взагалі не досліджують. І лише при

наявності паразитів у товстій краплі, особливості їх будови вивчають у мазках.

Морфологічна диференціація збудників малярії

P. vivax у товстій краплі. Голубі кільця збудника часто розірвані, шматочки

цитоплазми набувають форми коми або пропелера. Амебоїдні шизонти мають виг-

ляд окремих грудочок цитоплазми, серед яких виявляють червоне ядро і зерна пігмен-

ту. До морули входять 16-18 мерозоїтів. Гаметоцити мають круглу або овальну фор-

му, забарвлені у блідо-рожевий колір, із невеликим ексцентрично розміщеним яд-

ром. Найхарактерніша ознака цього виду плазмодіїв – поява напівпрозорої строми

еритроцитів із збудником. У кожному полі зору видно велику кількість паразитів.

P. vivax у мазку крові. Як правило, виявляють усі стадії розвитку збудника.

На стадії кільця він займає третину еритроцита, в якому зрідка може бути 2-3

паразити. На стадії шизонта вони набувають амебоїдної форми з появою вакуолі,

а також бурого чи золотистого пігменту. При поділі зрілого шизонта утворюється

від 4 до 20 ядер. Гаметоцити великі, мають округлу або довгасту форму. Уражені

збудником еритроцити збільшуються в діаметрі й містять характерну зернистість

Шюффнера червоного або фіолетового кольору (див. вкл., рис. 31).

414

Частина VІ. Протозойні інфекції

P. ovale у товстій краплі. Кільцеподібні трофозоїти мають цілий, а інколи й

розірваний вигляд, загалом нагадують такі ж структури, як у P. vivax, але мають

ядра трохи більших розмірів. Дозрілі шизонти числом від 6 до 12 розташовуються

безладно навколо частинок пігменту. Гаметоцити такі самі, як у P. vivax.

P. ovale у мазку крові. Інвазовані еритроцити збільшені в розмірах і мають

овальну форму. Кільця і шизонти за розміром такі самі, як у P. vivax, але ядра

паразитів набувають більших розмірів. Псевдоподії й вакуолі на цій стадії розвит-

ку збудника не утворюються. Частинки пігменту темно-бурого кольору розташо-

вані безладно по всій цитоплазмі (зернистість Джеймса). У морулі розміщені 6-12

мерозоїтів. На цій стадії розвитку пігмент вже збирається в купки, які розміщені

ексцентрично. Навколо них безладно розташовані мерозоїти. Гаметоцити такі самі,

як у збудника триденної малярії (див. вкл., рис. 32).

P. malariae у товстій краплі. Вигляд кільця такий самий, як у P. vivax. Ши-

зонти частіше мають округлу форму і значно рідше довгасту. Цитоплазма напов-

нена великою кількістю темних пігментних грудочок. На стадії морули утворюється

від 6 до 12 мерозоїтів. Гаметоцити такі ж, як у P. vivax, їх діаметр не перебільшує

розмірів нормального еритроцита. Строма інвазованих еритроцитів у товстій краплі

не проглядається.

P. malariae у мазку крові. На стадії кільця в еритроциті є лише один паразит,

який має неправильну форму, займає 1/3-1/4

діаметра еритроцита і дуже подібний

до кільця P. vivax. Шизонти правильної круглої форми і лише невелика частина з

них набуває вигляду стрічки, тоді паразит витягується впоперек еритроцита. З

одного боку його знаходиться довгасте ядро, з другого – зерна пігменту у вигляді

грубих темних грудочок (зернистість Цимана). Морула найчастіше складається з

8 мерозоїтів. Гаметоцити за своєю формою подібні до аналогічних структур у

P. vivax, але дещо менші за розмірами. У тонких мазках крові вони взагалі виявля-

ються в малій кількості, переважно на 2-3-й тиждень хвороби (див. вкл., рис. 33).

P. falciparum у товстій краплі. У перші дні хвороби виявляються лише ха-

рактерні дрібні кільця або кільця і гаметоцити. Інколи цитоплазма кілець розри-

вається і розташовується з обох боків від ядра (“крила ластівки”). Досить часто

спостерігаються і розриви ядер. Якщо у препараті дуже мала кількість паразитів,

необхідно повторити аналіз через 12-24 год. Важливо пам’ятати, що шизонти можна

виявити лише при тяжких перебігах захворювання. Гаметоцити P. falciparum ма-

ють характерну півмісячну форму, особливо якщо вони розташовані по периферії

краплі або в найтонших її ділянках. Саме за морфологічними особливостями га-

метоцитів найімовірніше можна поставити діагноз тропічної малярії.

P. falciparum у мазку крові. У периферичній крові знаходяться лише кільця.

Вони мають найменші розміри. Діаметр кілець становить всього 1/8 розміру ерит-

роцитів. Ядро виглядає маленьким, круглим, навколо нього є дуже тоненький обі-

док цитоплазми. Більш дорослі кільцеподібні трофозоїти мають дещо більші роз-

міри (1/3

діаметра еритроцита), товстіший обідок цитоплазми, який різко звужуєть-

ся біля ядра. Такі морфологічні особливості збудника тропічної малярії утруднюють

його диференціацію від інших видів. У еритроцитах із кільцевими трофозоїтами

415

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

при забарвленні протягом більше години часом виявляють невелику кількість азу-

рофільних пігментних часточок (зернистість Мауера). Шизонти в тонких мазках

практично не виявляються. Вони зустрічаються лише при розвитку коматозного

стану, що є загрозливою прогностичною ознакою. Ці форми паразитів також малі

за розміром, а за формою подібні до шизонтів P. malariae. У них швидко зникають

вакуолі, а грудочки пігменту інтенсивно забарвлені в чорний колір. Морула містить

12-24 дрібних мерозоїтів, які розташовані безладно (див. вкл., рис. 34).

Гаметоцити P. falciparum мають бананоподібну форму з центрально розта-

шованим ядром. Вони майже цілком заповнюють еритроцити й деформують їх. У

тонких мазках гаметоцити можуть розташовуватись і вільно між клітинами крові.

Строк розвитку гаметоцитів в декілька разів перевищує тривалість шизогонії. Вони

появляються в периферичній крові на 8-10-й день після виявлення кільцеподіб-

них трофозоїтів і продовжують поступати в кров протягом кількох тижнів, навіть

після зникнення клінічних симптомів хвороби. Досить часто при тропічній ма-

лярії в тонких мазках крові можуть зустрічатися тільки самі гаметоцити.

Морфологічні особливості основних збудників малярії у тонких мазках крові

представлені в таблиці 75.

Під час мікроскопічного дослідження необхідно також оцінювати масивність

інвазії, тобто визначати кількість плазмодіїв в 1 мл крові. Це особливо важливо

при підозрінні на хлорохінрезистентну малярію, коли кількісне визначення пара-

зитів у крові проводять до початку і в процесі лікування. Таке дослідження прово-

дять за допомогою методу товстої краплі. Підраховують загальну кількість лейко-

цитів і плазмодіїв у одному й тому ж полі зору. Потім вираховують загальне число

паразитів, що припадає на 200 лейкоцитів, складають відповідну пропорцію з ура-

хуванням вмісту лейкоцитів в 1 мл при визначенні формених елементів крові.

Дослідження крові на лейкоцитоз і кількісне визначення плазмодіїв малярії

слід проводити синхронно, інакше результати будуть недостовірними.

За допомогою методу товстої краплі можна виявити збудників малярії при їх

концентрації 10 тис. екземплярів в 1 мл крові.

Серологічне дослідження використовують, в основному, для виключення

діагнозу малярії у хворих з гарячкою серед донорів та при епідеміологічному об-

стеженні неблагополучних щодо малярії регіонів. Наявність протиплазмодійних

антитіл у високих титрах у жителів неендемічних або звільнених від малярії регі-

онів може бути доказом інфікування відповідним збудником.

У лабораторну практику впроваджені серологічні реакції непрямої гемаглю-

тинації (РНГА), імунофлуоресценції (РІФ) та метод імуноферментного аналізу

(ІФА). Для постановки РІФ як антиген використовують зрілі еритроцитарні ши-

зонти плазмодіїв людини або мавп, а для ІФА – розчинені антигени еритроцитар-

них паразитів, адсорбовані на твердій фазі. Для епідеміологічного обстеження

найбільш придатна непряма РІФ, яка дозволяє виявити антиген у мазках крові.

Розроблено і впроваджено новий метод діагностики з використанням ДНК-

зондів з різними мітками. Метод дуже чутливий. Він базується на виявленні у

лізованій крові високоспецифічних для збудників фрагментів ДНК.

416

Частина VІ. Протозойні інфекції

Токсоплазмоз

Токсоплазмоз – хронічна паразитарна хвороба, що характеризується уражен-

ням нервової й лімфатичної систем, скелетних м’язів, міокарда, очей, печінки,

селезінки, кишечного тракту. Розрізняють набутий і уроджений токсоплазмоз.

Збудником хвороби є Toxoplasma gondii, яка належить до родини Eimeriidaе,

класу Sporozoa. Найчастіше джерелом інфекції є коти, собаки, свині, рідше – інші

домашні тварини і гризуни. Зараження відбувається переважно аліментарним

шляхом при вживанні в їжу недостатньо термічно обробленого м’яса або через

руки, забруднені екскрементами котів. Можлива й трансплацентарна передача

збудника від матері до плода.

Таблиця 75

Диференціальні ознаки малярійних плазмодіїв

Форми

паразитів,

еритроцити

P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum

Молоді

шизонти

(кільця)

Кільця

неправильної

форми, займають

1/3-1/4

діаметра

еритроцита

Такі самі за

розмірами, як і в

P. vivax, але з

більшим ядром

Такі самі, як і

в P. vivax

Дрібні кільця

займають 1/8 діа-

метра еритроцита,

часто по 2-3 кільця

в еритроциті

Дорослі

(амебоїдні)

шизонти

Мають добре

виражені

псевдоподії

Псевдоподії

нечіткі, частина

шизонтів стрічко-

подібної форми

Такі самі, як і

в P. ovale

У периферичній

крові, як правило,

не виявляють

Морула

12-18 мерозоїтів,

розташованих

навколо пігмента

6-12 великих

мерозоїтів, ядра

крупніші

6-12, частіше 8

мерозоїтів,

розташованих у

вигляді розетки

12-24, частіше 16

дрібних мерозої-

тів, розташованих

безладно навколо

пігмента

Гамонти

Круглої або

овальної форми,

за розміром біль-

ші від нормаль-

ного еритроцита

Такі самі, як і

в P. vivax

Меншого роз-

міру, ніж у P.

vivax, не більше

від нормально-

го еритроцита

Бананоподібної

форми, цитоплаз-

ма синьо-бузкова,

компактне ядро

Еритроцити

Збільшені і зне-

барвлені, азуро-

фільні елементи

у вигляді точок

(зернистість

Шюффнера)

25 % еритроцитів

збільшені, оваль-

ної, інші непра-

вильної форми,

азурофільні еле-

менти у вигляді

великих зерен

(зернистість

Джеймса)

Нормальних

розмірів,

азурофільні

елементи у

вигляді дрібних

пилинок

(зернистість

Цимана)

Нормальних

розмірів,

азурофільні

елементи у вигляді

плям (плямистість

Маурера)

417

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

Діагностувати токсоплазмоз за клінічними симптомами досить важко. Тому

лабораторні паразитологічні дослідження мають дуже важливе значення. Матері-

алом для виявлення збудника може бути пунктат лімфовузлів, кісткового мозку,

кров, спинномозкова рідина, біоптати тканин, від трупів – шматочки головного

мозку, печінки, селезінки, легень; при патологічній вагітності – зскрібки із по-

рожнини матки і плаценти та навколоплідна рідина. Доставлений матеріал підля-

гає мікроскопічному, культуральному, біологічному і серологічному досліджен-

ню. Використовують також і алергічну пробу.

Мікроскопічне дослідження. З доставлених клінічних матеріалів виготов-

ляють мазки, відбитки або гістологічні зрізи, які

фіксують етанолом (метанолом) і забарвлюють за ме-

тодом Романовського-Гімзи. За своєю формою ток-

соплазми нагадують дольку апельсина завдовжки 4-

7 мкм, завширшки 2-4 мкм. Один кінець збудника

загострений, другий злегка заокруглений. Цитоплаз-

ма забарвлюється в голубий колір, має вигляд одно-

рідної маси з дрібними гранулами. Вакуолі, як пра-

вило, відсутні, або мають маленькі розміри. Полюси

клітини забарвлюються більш інтенсивно. Ядро має

рубіново-червоний колір, розташоване в центрі або

трохи ближче до одного з полюсів (рис. 108).

Крім поодиноких паразитів у препаратах можуть

спостерігатись і скупчення токсоплазм – псевдоцисти і цисти. Псевдоцисти утво-

рюються при розмноженні збудника в клітинах хазяїна. Вони не мають своєї влас-

ної оболонки, а лише оболонку клітини. Після багатократних поділів клітина руй-

нується і токсоплазми вивільняються, проникають в нові клітини і цикл розмно-

ження повторюється знову. Таку мікроскопічну картину – наявність псевдоцист і

вільних токсоплазм – виявляють у гострий період хвороби.

У хронічній або латентній стадії інфекції токсоплазми виявляють переважно

в тканинах макроорганізму (скелетні м’язи, тканини ока, головний мозок, міо-

кард, легені, матка) у вигляді справжніх цист, що мають оболонку, утворену сами-

ми паразитами. Розміри цист коливаються від 20 до 100 мкм.

Виявлення вільних токсоплазм, псевдоцист і справжніх цист має беззапереч-

не діагностичне значення, хоч позитивні результати цей метод дає не так уже й

часто. До того ж, часом за токсоплазми вважають дріжджові та інші клітини.

Біологічне дослідження. Для постановки біопроби з досліджуваного матері-

алу, взятого у хворого або після його смерті, виготовляють гомогенат і вводять по

1,0 мл у черевну порожнину або головний мозок білих мишей чи золотистих хом’яч-

ків. Через 7-14 днів (рідше через місяць) після загибелі і розтину тварин у перито-

неальному ексудаті мікроскопічно виявляють токсоплазми. Можна також досліджу-

вати печінку, селезінку й легені загиблих тварин. У головному мозку появляються

справжні цисти. Для їх виявлення шматочок мозкової тканини роздавлюють між

предметним і покрівним скельцями, мікроскопують при малому збільшенні. Можна

Рис. 108. Toxoplasma gondii:

мазок крові.

418

Частина VІ. Протозойні інфекції

також робити мазки-відбитки з мозкової тканини, фіксувати їх метанолом і фарбу-

вати за Романовським-Гімзою.

Якщо інфіковані тварини не гинуть, за ними спостерігають протягом 6 тижнів,

після чого ставлять серологічні реакції для виявлення специфічних антитіл. Для

біологічної проби останнім часом використовують 7-8-денні курячі ембріони, які

найчастіше заражають у хоріон-алантоїсну оболонку. Можна культивувати ток-

соплазми і в культурі клітин Hela та ін.

Серологічні дослідження в сучасній діагностиці токсоплазмозу використо-

вують найчастіше при раціональному та комбінованому застосуванні різних іму-

нологічних реакцій, мають високу цінність. Специфічні антитіла до токсоплазм

можна виявити за допомогою реакцій імунофлуоресценції, зв’язування компле-

менту, непрямої гемаглютинації та латекс-аглютинації. Високочутлива й специфіч-

на проба Себіна-Фельдмана.

Реакцію імунофлуоресценції використовують у непрямому варіанті. Антиге-

ном для неї служить суспензія убитих токсоплазм, яку випускають централізова-

но. Спочатку до антигену додають сироватку хворого, потім утворений комплекс

антиген-антитіло обробляють міченою флуорохромом антиглобуліновою сироват-

кою. Діагностичне значення має титр 1:80 і вище. За допомогою цієї реакції вияв-

ляють антитіла до токсоплазм уже в кінці першого тижня хвороби.

Для діагностики вродженого токсоплазмозу ставлять варіант цієї реакції –

РІФ-IgM (тест Ремінгтона). Він виявляє антитіла класу IgM, які не проходять че-

рез плаценту, а, отже, наявність їх свідчить про інфікування новонародженого.

Реакцію зв’язування комплементу ставлять, починаючи з третього тижня хво-

роби, за класичною схемою реакції Борде-Жангу. Антиген для РЗК виготовляють

із перитонеального ексудату заражених токсоплазмами білих мишей або гвінейсь-

ких свинок. Рекомендують ставити реакцію повторно, що дає змогу виявити на-

ростання титру комплементзв’язуючих антитіл.

З діагностичною метою використовують також реакцію непрямої гемаглюти-

нації (РНГА). Принцип її полягає в тому, що танізовані еритроцити легко адсорбують

на собі лізований антиген токсоплазм. При наступному додаванні сироватки хворо-

го, в разі наявності в ній антитіл, такий еритроцитарний діагностикум аглютинується.

Необхідно пам’ятати, що всі ці серологічні реакції при хронічному токсо-

плазмозі можуть бути негативними.

Широкого практичного використання для діагностики та масових епідеміо-

логічних обстежень набула серологічна реакція з барвником Себіна-Фельдмана.

Вона стає позитивною вже в кінці першого тижня хвороби. Механізм цієї реакції

полягає в тому, що при дії специфічних антитіл на мембрану живих токсоплазм

останні стають непроникними для барвника (метиленового синього), а отже, не

забарвлюються і не втрачають своєї серпоподібної форми. Токсоплазми, оброб-

лені нормальною сироваткою, при додаванні метиленового синього забарвлюються

повністю і перетворюються із серпоподібних у круглі форми. Реакцію вважають

позитивною, якщо не забарвлюються більше 50 % токсоплазм, при цьому врахо-

вують тільки позаклітинно розміщені паразити. Діагностичний титр становить

419

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

1:64 і вище. До впровадження в лабораторну практику флуоресцентних методів

проба Себіна-Фельдмана вважалась найнадійнішим методом серологічної діагно-

стики токсоплазмозу. Недоліком реакції є те, що для її постановки необхідно мати

свіжий штам токсоплазм, вона технічно складна й не зовсім безпечна.

Останнім часом її поступово витісняють такі високоспецифічні методи, як

імуноферментний та радіоімунний. Зокрема для ІФА використовують розчинний

стандартний антиген токсоплазм і антитіла до імуноглобуліну людини, мічені пе-

роксидазою або фосфатазою.

Алергічна проба. Найбільш доступним методом діагностики токсоплазмозу

є внутрішньошкірна проба з токсоплазміном. Вона стає позитивною з 4-го тижня

хвороби і зберігається протягом багатьох років. Техніка її постановки така сама,

як і реакції Манту.

Облік реакції проводять через 24-48 год. При позитивному результаті в місці

введення токсоплазміну виникає набряк і почервоніння шкіри. Проба дає мож-

ливість виявити сенсибілізацію організму в результаті інфікування токсоплазма-

ми, але не дає змоги судити про активність процесу.

Для правильної комплексної оцінки результатів лабораторних досліджень і

алергічної проби потрібно паралельно використовувати 2 серологічні реакції та

внутрішньошкірну пробу. Лише в такий спосіб можна поставити або відкинути

діагноз на основі збігу (або навпаки) цих реакцій, особливо динаміки наростання

титру антитіл. Це також вирішує питання, чи є у хворого недавно набутий токсо-

плазмоз, чи вже давно перенесене захворювання.

Трипаносомоз

Трипаносомози – протозойні трансмісивні хвороби людей і тварин, які вик-

ликають джгутикові найпростіші – трипаносоми. У людей зустрічаються дві фор-

ми трипаносомозів: африканський (сонна хвороба) і американський (хвороба

Шагаса-Крузе).

Збудниками африканського трипаносомозу є Trypanosoma gambiense і більш

вірулентна Trypanosoma rhodesiense. Захворювання характеризується гарячкою,

висипаннями на шкірі, набряками, збільшенням лімфатичних вузлів, ураженням

центральної нервової системи (сонливість) і другими симптомами. Джерелом

інфекції в природі є людина (T. gambiense) і антилопа гну (T. rhodesiense), пере-

носник – муха цеце.

Збудником американського трипанозомозу є Trypanosoma cruzi. Хвороба ха-

рактеризується гарячкою, первинним афектом на шкірі, ураженням кишечника

(мегаколон), серця, печінки, селезінки й центральної нервової системи; у дітей

має гострий перебіг, у дорослих – переважно хронічний. Резервуар інфекції – хворі

люди, щури, кішки, собаки, броненосці, переносник – триатомові (поцілункові)

клопи. Всі три види трипаносом морфологічно подібні між собою.

Матеріалом для дослідження служить кров, спинномозкова рідина, пунктати

кісткового мозку й лімфовузлів, шматочки уражених тканин. Для лабораторної

діагностики використовують мікроскопічний, біологічний та серологічний методи.

420

Частина VІ. Протозойні інфекції

Важливо зробити люмбальну пункцію для виявлення трипаносом у лікворі

та розпізнавання природи уражень центральної нервової системи. В початковій

стадії хвороби збудника можна виявити в крові та місці укусів (T. rhodesiense) або

в шийних лімфатичних вузлах (T. gambiense).

Мікроскопічне дослідження. З крові виготовляють нативний препарат на-

давленої краплі, тонкий мазок і товсту краплю. У всіх препаратах легко побачити

трипаносоми, які розташовуються позаклітинно. В нативному препараті при змен-

шенні інтенсивності освітлення видно рухливі паразити. У фіксованих мазках,

забарвлених за методом Романовського-Гімзи, чітко видно голубу цитоплазму і

продовгувато-овальне червоно-фіолетове ядро, розташоване в центрі збудника. Роз-

міри трипаносом становлять 17-30 мкм у довжину і 1,5-2,0 мкм в ширину. На зад-

ньому кінці тіла видно блефаропласт, від якого відходить джгутик, що хвилепод-

ібно звивається біля зовнішньої оболонки трипаносоми і спрямовуються до її пе-

реднього кінця, де він трохи вільно виступає. Між тілом трипаносоми і джгутиком

розташована ундулююча мембрана (рис. 109).

Якщо в дослі-

джуваному матеріалі

трипаносом не виявля-

ють, вживають метод

збагачення. Для цього

10 мл цитратної крові

центрифугують 10 хв

при 1500 об/хв, від-

смоктують плазму, а з

осаду готують препа-

рати, які досліджують

у нативному й забар-

вленому стані. Плазму

повторно центрифугують протягом 20 хв і з осаду готують мазки, фіксують мета-

нолом і фарбують за методом Романовського-Гімзи. Так само забарвлюють мазки

із ліквору, пунктатів лімфовузлів і кісткового мозку. Слід пам’ятати, що при ура-

женні центральної нервової системи трипаносоми в крові й пунктатах лімфатич-

них вузлів не виявляються.

У хворих на гостру форму американського трипаносомозу паразити досить

легко виявляють у нативних і забарвлених препаратах. При хронічних формах

захворювання трипаносоми в периферичній крові або зовсім не знаходять, або їх

виявляють поодинокими дуже рідко при перегляді багатьох полів зору. Частіше їх

можна побачити при застосуванні методу збагачення, як і при сонній хворобі.

У деяких випадках найефективнішим методом виявлення Т. cruzi є ксеноді-

агностика. Декілька вирощених у лабораторії триатомових клопів, вільних від

трипаносом, висаджують на шкіру хворого, щоб вони насмоктались крові з пара-

зитами. Потім через 5 днів трипаносоми легко виявляють шляхом мікроскопії ек-

скрементів інфікованих клопів.

Рис. 109. Trypanosoma gambiense (1) і Trypanosoma cruzi (2)

у мазку крові.

421

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

Паразитологічне й біологічне дослідження. Патогенні трипаносоми всіх

трьох видів можна культивувати на штучних живильних середовищах для най-

простіших. Щоб виділити чисті культури трипаносом від хворих, роблять посіви

крові або пунктатів лімфатичних вузлів чи кісткового мозку. Для цього найчасті-

ше використовують агар NNN (Novy-Neal-Nicolle), що містить дефібриновану кров

кролика, середовище Веймана (кров’яний агар з цитратною плазмою крові люди-

ни) та ін. Посіви інкубують при температурі 22-26 °С. Характерні маленькі й про-

зорі колонії виростають на 3-4-й день після посіву.

Чисті культури трипаносом отримують також у курячих ембріонах (інокулю-

ючи матеріал у хоріоналантоїсну оболонку), або в культурах ембріональних тка-

нин щурів чи клітин Hela. Культуральний метод діагностики використовують рідко,

за виннятком хвороби Шагаса-Крузі.

Для діагностики трипаносомозів можна використовувати постановку біоло-

гічної проби на різних експериментальних тваринах. При американському варіан-

ті хвороби вводять 5-10 мл крові інтраперитонеально гвінейським свинкам, коше-

нятам або цуценятам. Через декілька днів у крові заражених тварин появляються

трипаносоми. До T. gambiense особливо чутливі мавпочки роду Erythrocebus, а до

T. rhodesiense – білі миші та щури.

При діагностиці африканського трипаносомозу важливо не тільки встанови-

ти вид збудника, а й стадію хвороби. Для цього досліджують спинномозкову ріди-

ну на вміст білка і кількість лімфоцитів. До першої (ранньої) стадії відносять ті

випадки, коли кількість білка не первищує 250 мг/мл, а число клітин не більше

3-х у 1 мл. Більш високий вміст білка й лімфоцитів свідчить про тяжке ураження

центральної нервової системи, а, отже, про другу (пізню) стадію хвороби.

Серологічні реакції більш детально розроблені для діагностики американсько-

го трипаносомозу. Але тепер вже запропоновані методи визначення антитіл класів

IgM та IgG в діагностичних титрах у всіх хворих на трипаносомоз. Для цієї мети

використовують реакції преципітації, аглютинації, імунофлуоресценції та зв’язу-

вання комплементу. Антигеном для їх постановки служить екстракт із серцевих

м’язів інвазованих тварин або живих трипаносом. Реакції аглютинації та преци-

пітації використовують при гострих формах хвороби, а РЗК – при хронічних. Ре-

зультати реакцій краще оцінювати при постановці методом парних сироваток.

Останнім часом розроблено специфічний і чутливий метод діагностики за

допомогою ензиммічених антитіл. Антигеном для ІФА служать лізати трипано-

сом від заражених тварин або лабораторних культур.

Лейшманіози

Лейшманіози – група хронічних антропонозних трансмісивних хвороб, які

викликаються лейшманіями і передаються москітами; поширені серед населення

тропічних і субтропічних країн.

Розрізняють шкірний лейшманіоз, який викликається Leishmania tropica і

характеризується ураженням шкіри; шкірно-слизовий лейшманіоз, збудником якого

422

Частина VІ. Протозойні інфекції

є Leishmania brasiliensis, супроводжується ураженням шкіри і слизових оболо-

нок; вісцеральний лейшманіоз, що викликається Leishmania donovani, характери-

зується переважним ураженням внутрішніх органів. Кожен із трьох видів лейш-

маніозів реєструється в певних ендемічних регіонах планети.

Всі три види лейшманій відносяться до родини Trypanosomatidae, класу

Mastigophora і мають ідентичні морфологічні властивості. Життєвий цикл цих

паразитів складається з двох стадій: безджгутикової (амастиготної) – в організмі

людини і джгутикової (промастиготної) – в тілі москіта. Безджгутикові форми є

внутрішньоклітинними паразитами системи мононуклеарних фагоцитів, мають

овальну форму, розміри 3-5 мкм у довжину і 1-3 мкм у ширину. Джгутикові форми

більші за розміром (10-15×4-6 мкм), монотрихи, активно рухливі, добре культиву-

ються на живильних середовищах.

Джерелом і резервуаром інфекції в природі є домашні й дикі тварини (соба-

ки, лисиці, шакали) та гризуни.

Матеріалом для лабораторної діагностики лейшманіозів шкіри і слизових

оболонок служить вміст виразок і крайового інфільтрату, біоптати уражених тка-

нин, пунктати лімфовузлів, кірочки слизової оболонки. Для збільшення частоти

виявлення лейшманій важливо правильно взяти матеріал. Ділянку шкіри, де є гор-

бик або крайовий інфільтрат навколо виразки, стискують між великим і вказівним

пальцем лівої руки для знекровлення, потім скальпелем роблять поверхневий надріз

епідермісу, зскрібають шматочки тканин з стінок і дна розрізу. Зскрібок разом з

краплею рідини використовують для виготовлення мазка. У хворих на вісцераль-

ний лейшманіоз беруть кров, пунктати кісткового мозку, печінки, селезінки, лімфа-

тичних вузлів. Проводять мікроскопічні, культуральні, біологічні та серологічні

дослідження, а також постановку алергічних проб.

Мікроскопічне дослідження є найбільш інформативним і поширеним мето-

дом діагностики всіх видів лейшманіозів. Виготовлені мазки фіксують етанолом,

метанолом або сумішшю Никифорова, забарвлюють за методом Романовського-

Гімзи, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. Цитоплазма амастиготів і про-

мастиготів фарбується в голубий, а ядро, кінетопласт і джгутики – у червоний або

рожево-фіолетовий колір.

При вісцеральній формі хвороби лейшамії виявляють у пунктатах кісткового

мозку або селезінки у 95-100 % випадків, а в пунктатах лімфатичних вузлів – у

40-75 %. Іноді паразитів можна побачити і в мазках крові (при індійському вісце-

ральному лейшманіозі майже завжди). У хворих на шкірну і слизову форми лейш-

маніозу в крові збудників практично не виявляють; у мазках із виразок і уражених

тканин їх також мало. Тому необхідно повторювати дослідження декілька разів.

Безджгутикові форми лейшманій (амастиготи) розташовуються переважно в

цитоплазмі гістофагоцитарних клітин. При виготовленні мазків ці клітини часто

руйнуються і паразити можуть знаходитись і поза клітинами. Вони мають кулясту

або овальну форму, містять ядро, паличкоподібний кінетопласт, але джгутики

відсутні. Наявність чітко окресленого ядра і кінетопласта дозволяє відрізнити лей-

шманій від інших утворів, що зустрічаються в мазках (рис. 110).

423

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

Культуральні й біологічні дослідження. Якщо мікроскопічний метод дає

негативні або сумнівні результати, проводять посіви взятих проб на NNN-агар.

Одержати культури лейшманій при посівах крові вдається рідко, особливо у хво-

рих на шкірну форму. Посіви інкубують при температурі 22 °С протягом 2-10 днів,

щодня перевіряючи ріст за допомогою мікроскопії колоній під об’єктивом 40×.

Для цього виготовляють нативний препарат за методом надавленої краплі. У маз-

ках із культур лейшманії набувають видовженої, веретеноподібної форми, розмі-

ри їх досягають 10-20 мкм завдовжки і 5-6 мкм завширшки. Вони обов’язково

мають джгутики (промастиготи), часто розміщуються клубками (рис. 116). Якщо

протягом 40 днів збудник не виявлено, видають негативний результат, але це не

дає права виключити діагноз лейшманіозу. Лейшманії можна також вирощувати

на хоріон-алантоїсній оболонці курячого зародка або в культурі клітин.

Порівняно рідко з діагностичною метою ставлять біологічну пробу. Для цьо-

го використовують білих мишей, ховрахів, золотистих хом’ячків. Тварин заражу-

ють внутрішньовенно або внутрішньоочеревинно пунктатами кісткового мозку,

лімфатичних вузлів, рідше кров’ю хворих.

Серологічні дослідження широко використовують для проведення епідеміо-

логічних обстежень населення в ендемічних регіонах, але для практичної діагно-

стики захворювання вони мають допоміжне значення. Найчастіше ставлять ре-

акції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним діагностикумом, зв’язування

комплементу та імунофлуоресценції. В якості антигену для них використовують

15-30-денні культури L. donovani. Однак всі ці реакції недостатньо специфічні й

можуть давати позитивний результат при трипаносомозах.

Останнім часом для діагностики вісцерального лейшманіозу розроблена тест-

система для проведення імуноферментного аналізу, в якій антигеном служить не-

розведений екстракт із культур L. donovani. Метод ІФА виявився більш чутливим,

специфічним і економічним, ніж навіть непряма реакція імунофлуоресценції. Діаг-

ностичний титр становить 1:400 і більше.

Алергічна проба. З метою ретроспективної діагностики, а також при масо-

вих епідеміологічних обстеженнях населення ендемічних регіонів широко прово-

дять постановку внутрішньошкірної проби з лейшманіном (реакція Монтенегро).

Рис. 110. Leishmania tropica:

1 – безджгутикові форми в макрофагах (а) і позаклітинні (б); 2 – джгутикові форми.

424

Частина VІ. Протозойні інфекції

Антигеном для неї служить поверхнева рідина або суспензія лейшманій, убитих

нагріванням чи формаліном. Його вводять в об’ємі 0,1-0,2 мл. При позитивній

реакції через 6-10 год на місці ін’єкції виникає гіперемія, набряк та інфільтрація.

Максимум реакції настає через 48 год.

Амебіаз

Амебіаз (син.: амебна дизентерія) – протозойна інфекційна хвороба, що ха-

рактеризується виразковим ураженням товстого кишечника, схильністю до реци-

дивуючого перебігу і позакишковими ускладненнями (абсцеси легень, печінки,

головного мозку).

Збудник захворювання – Entamoeba histolytica – належить до класу саркодо-

вих. В організмі людини патогенна амеба може існувати у 4-х формах:

1. Велика вегетативна або тканинна форма (forma magna) має розмір 30-

60 мкм, швидко пересувається за допомогою псевдоподій і здатна фагоцитувати

еритроцити. Вона має кругле ядро, яке у свіжих нативних препаратах видиме лише

при фазово-контрастній мікроскопії. Здатність фагоцитувати є характерною озна-

кою, що дає змогу відрізнити її від інших видів амеб кишечника.

2. Мала вегетативна або просвітна форма (forma minuta) має розмір 15-25 мкм,

яка фагоцитує бактерії та гриби і не пожирає еритроцити.

3. Вегетативна предцистна форма (forma praecystica) має ромір 10-20 мкм.

Включення (мікроорганізми, еритроцити) в цитоплазмі відсутні.

4. Цистна форма (forma cystica) має правильну кулясту форму, розміром

8-15 мкм, не містить бактерій та інших харчових включень.

Основним джерелом інфекції є хворі на гостру і хронічну форму амебіазу,

реконвалесценти та носії. Виділення цист може продовжуватись роками. Одна

людина може щодоби виділяти близько 500 млн цист. Механізм зараження – фе-

кально-оральний, цисти потрапляють в організм здорової людини разом із пит-

ною некип’яченою водою, харчовими продуктами, через брудні руки і предмети

вжитку.

Для лабораторної діагностики амебіазу використовують мікроскопічні, куль-

туральні, біологічні та серологічні дослідження. Матеріалом для мікробіологіч-

ного аналізу служать випорожнення, аспірати й біоптати, отримані при колоно-

фіброскопії та ректороманоскопії, харкотиння, гній з уражених органів, кров для

серологічних реакцій. При пересилці випорожнень до лабораторії, в якості кон-

серванта використовують полівініловий спирт.

Мікроскопічне дослідження. Вирішальним у діагностиці амебіазу є дані

паразитологічних досліджень. Великі тканинні форми з еритроцитами є патогно-

монічною ознакою гістолітичної амеби. Дуже важливим є також знаходження ха-

рактерних чотириядерних цист.

Мікроскопують 5-6 препаратів “надавленої краплі” із свіжовиділеного калу

(не пізніше 10 хв після випорожнення), а також мазки, забарвлені розчином Люго-

ля, сумішшю Сафарлієва або залізним гематоксиліном за Гейденгайном.

425

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

У нативних препаратах тканинна форма дизентерійної амеби має вигляд вели-

ких клітин, що активно рухаються. Ендоплазма і ектоплазма різко відрізняються

між собою. Ендоплазма темніша, зерниста, в ній розташовані вакуолі з фагоцито-

ваними еритроцитами або без них та мало помітне ядро, яке краще виявляється

під фазово-контрастним мікроскопом. Ектоплазма більш світла й прозора, нерівно-

мірної товщини. Мала просвітна форма менших розмірів має такий самий вигляд,

але без фагоцитованих еритроцитів. Інколи в цитоплазмі можна виявити невелику

кількість бактерій та грибів. Це основна форма існування гістолітичної амеби,

яку виявляють при хронічному амебіазі або у реконвалесцентів. При гострому

перебігу хвороби та у носіїв її не знаходять. Цисти в нативних препаратах мають

вигляд блискучих світлозаломлюючих кульок, розміром 8-15 мкм, їх внутрішній

вміст мало помітний.

При використанні консерванта Сафарлієва цитоплазма дизентерійної амеби

забарвлюється в голубий колір, ядро – в інтенсивно-синій, харчові й глікогенові

вакуолі залишаються безбарвними. Цей метод дозволяє відрізнити E. histolytica

від Entamoeba coli, у якої каріолема розташована ексцентрично, а грудочки хро-

матину різні за величиною.

У мазках, забарвлених за Гейденгайном, великі тканинні форми гістолітич-

ної амеби чітко видимі на фоні багатьох еритроцитів, поодиноких лейкоцитів та

бактерій. Цитоплазма амеби має чіткий поділ на світлу гомогенну безбарвну ек-

топлазму і темну дрібнозернисту ендоплазму темно-сірого кольору, в якій видно

забарвлені в чорний колір еритроцити. Вони мають різну величину і форму за-

лежно від ступеня їх перетравлення. В ендоплазмі амеби видно ядро розміром

3-5 мкм з тонкою оболонкою, під якою знаходять-

ся дрібні зерна периферійного хроматину. Центр

ядра займає п’ятикутна каріосома, також забарв-

лена в чорний колір (рис. 111). У мазках можуть

зустрічатись дегенеративно змінені амеби, в яких

видно інтенсивну вакуолізацію цитоплазми і

пікноз ядра.

Цисти дизентерійних амеб мають правиль-

ну круглу форму, рідше – овальну, з гладенькою

двоконтурною оболонкою. У цитоплазмі цист

зрілого віку видно 4 ядра, у незрілих – 1-2 ядра.

Під оболонкою ядер знаходяться серпоподібні

зерна хроматину, в центрі – каріосома. У незрілих

цист можна виявити вакуолі, що містять глікоген.

При забарвленні розчином Люголя великі

тканинні й просвітні форми мають типову мор-

фологічну структуру, але втрачають рухливість.

Цисти мають форму кілець із п’ятикутною карі-

осомою в центрі. Незрілі цисти мають краплю

глікогену, що фарбується в червоний колір.

Рис. 111. Різні форми дизентерійної

амеби: E. histolytica f. magna

з еритроцитами (1) і без них (2);

E. histolytica f. minuta (3-5); одно-,

дво- і чотириядерні цисти (6-8).

426

Частина VІ. Протозойні інфекції

Методика мікроскопічного дослідження слизу, гною, біоптатів, харкотиння

така сама, як і при мікроскопії випорожнень, але позитивні результати отримати

важко.

Культуральні й біологічні дослідження. Якщо виявити гістолітичні амеби

при мікроскопії нативних і пофарбованих препаратів не вдається, роблять посіви

досліджуваного матеріалу на середовище Робінзона або Павлової, до складу яких

входить печінковий екстракт, виділяють та ідентифікують чисті культури. Але

такий паразитологічний метод практичні лабораторії використовують дуже рідко.

У деяких випадках можна застосовувати постановку біологічної проби. Дос-

ліджуваним матеріалом заражають кошенят, хом’ячків та інших лабораторних

тварин. Так, при введенні випорожнень хворих, що містять дизентерійні амеби, у

пряму кишку кошенят, у них розвивається геморагічний коліт. У фекаліях зараже-

них тварин збудника легко виявити при мікроскопії нативних препаратів.

Серологічні дослідження при амебіазі також проводять рідко, здебільшого

для діагностики його позакишкових форм. При цьому використовують реакції

непрямої гемаглютинації з антигеном із зруйнованих ультразвуком дизентерійних

амеб, латекс-аглютинації, зв’язування комплементу, непрямої імунофлуоресценції,

зустрічного імуноелекрофорезу та метод ІФА. Серологічні реакції випадають по-

зитивними у 60-70 % хворих на кишковий амебіаз і в 90-95 % – при амебному

абсцесі печінки, легень чи головного мозку.

Балантидіаз

Балантидіаз (син.: інфузорна дизентерія) – інфекційна протозойна хвороба,

що характеризується гарячкою, болями в животі, проносом, виразковим уражен-

ням товстої кишки і значним схудненням.

Збудник – Balantidium coli – належить до родини Bursayidae, типу Ciliophora.

Це найбільший за розміром представник найпростіших (до 500 мкм), що парази-

тують в організмі людини. Його легко виявити під малим збільшенням мікроско-

па. Тіло балантидії несиметричне, має овальну форму, вкрите війками. Передній

кінець дещо загострений, задній – більш овальний. Спереду і трохи збоку знахо-

диться ротова щілина (цистосом), позаду – анальна пора (цитопрокт). Розрізня-

ють 2 форми балантидій – вегетативну і цистну.

Джерелом інфекції є інвазована людина, а також домашні та дикі свині, біля

80 % яких містять у кишечнику непатогенні для них балантидії. Спосіб інфіку-

вання фекально-оральний, найчастіше через воду, грунт, гній, предмети догляду

за тваринами.

Лабораторна діагностика балантидіазу базується на мікроскопічному дослі-

дженні свіжих випорожнень. Вегетативні форми паразита практично завжди можна

виявити в рідких, а цисти (рідше) в оформлених випорожненнях. Краще всього

матеріал для дослідження брати при сигмоїдоскопії або ректороманоскопії.

Мікроскопічне дослідження. Свіжі фекалії або слиз розводять теплим ізото-

нічним розчином хлориду натрію, виготовляють препарат надавленої або висячої

427

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

краплі й розглядають спочатку під малим, а

потім під середнім збільшенням мікроскопа,

використовуючи нагрівальний столик. Він дає

змогу тривалий час спостерігати швидкий рух

балантидіїв. Змінюючи інтенсивність освітлен-

ня, можна побачити миготливі війки, органо-

їди живлення і виділення. Ядро живих пара-

зитів залишається непомітним. У травних ва-

куолях і ендоплазмі видно багато еритроцитів,

грибів, бактерій та зерен крохмалю (рис. 112).

Якщо в нативних препаратах не виявля-

ють живих паразитів, досліджують забарвлені. Для фарбування використовують

слабкі розчини (1:1000-1:10000) метиленового синього або нейтрального черво-

ного. При цьому балантидії не сприймають барвник і стають чітко видимими на

голубому чи рожевому фоні вмісту кишечника.

Для забарвлення мертвих балантидіїв у фіксованих мазках краще всього ви-

користовувати залізний гематоксилін з додаванням фуксину або карміну. При цьо-

му стають добре видимі ряди війок, чорного кольору ядро, травні вакуолі з ерит-

роцитами, мікроорганізмами та іншими клітинами.

Цисти в кишечнику людини утворюються рідко. Щоб їх виявити, потрібно

взяти невеличку частинку фекалій або слизу і проемульгувати їх на предметному

склі в краплі розчину Люголя, накрити покрівним скельцем, витримати 5-10 хв і

мікроскопувати. Цисти мають кулясту або овальну форму, діаметром 40-60 мкм,

жовто-коричневого кольору з двоконтурною оболонкою. При забарвленні гема-

токсиліном всередині цист добре видно бобоподібне ядро чорного кольору. Од-

нак, останнім часом виявленню цист не надають великого діагностичного значення.

B. coli можна культивувати in vitro в різних середовищах для найпростіших.

Зокрема, добрі результати отримують при посіві фекалій на середовище Ріса (МПБ,

розведений 1:5 ізотонічним розчином хлориду натрію, до якого додають кінську

сироватку і рисовий відвар). Додавання до середовища антибіотиків пригнічує

розвиток супутньої мікрофлори і дає змогу надійніше виділяти чисті культури

балантидіїв. Однак у практичних лабораторіях з діагностичною метою чисті куль-

тури виділяють дуже рідко.

Серологічні дослідження і алергічні проби також не проводять.

Лямбліоз

Лямбліоз (син.: гіардіоз) – протозойна інфекційна хвороба, що характеризу-

ється ураженням верхнього відділу тонкої кишки (дуоденіт) і жовчного міхура

(холецистит). У більшості людей лямбліозна інвазія має безсимптомний перебіг

або супроводжується лише дисфункцією кишечника. Збудником захворювання є

Lamblia intestinalis (Giardia intestinalis) з родини Hexamitidae, класу Zoomas-

tigophora.

Рис. 112. Balantidium coli.

Вегетативна форма.

428

Частина VІ. Протозойні інфекції

Джерелом зараження є хворі люди або паразитоносії. В організмі людини

лямблії розмножуються у величезній кількості. Протягом доби одна людина може

виділити з випорожненнями до 18 млрд цист цього збудника. Лямбліоз зустрі-

чається повсюдно. L. intestinalis виявляють у 10-12 % дорослих людей і у 50-80 %

дітей дошкільного віку.

Механізм інвазії – фекально-оральний, факторами передачі є вода, їжа, іграш-

ки, предмети вжитку, забруднені руки. Інвазивні лише цисти лямблій, які досить

стійкі у зовнішньому середовищі.

Матеріалом для проведення лабораторної діагностики є випорожнення і дуо-

денальний вміст, отриманий при зондуванні, кров для серологічних реакцій.

Мікроскопічне дослідження. Із доставлених проб виготовляють нативні пре-

парати надавленої краплі й мазки для забарвлення. Діагноз ставиться при вияв-

ленні вегетативних форм лямблій у дуоденальному вмісті або рідких випорож-

неннях, а також цист у оформлених фекаліях.

У нативних препаратах вегетативна форма лямблій виглядає плоскою, гру-

шоподібною, з переднім заокругленим і заднім вузьким, загостреним краєм, заг-

нутим у бік дорзальної поверхні. Паразит має білатеральну симетрію, його розм-

іри в довжину 18-28 мкм, ширина у верхній частині тіла – 8-12 мкм. Спереду на

черевній стороні знаходиться світла, округла заглибина – присмоктуючий диск

(рис. 113). Це своєрідний присосок, за допомогою якого лямблія присмоктується

до ентероцитів слизової оболонки кишечника.

У надавленій краплі можна спостерігати досить характерний коливальний

або танцювальний рух, що нагадує політ листка, що падає.

Крім вегетативних форм лямблій у препаратах і мазках виявляють також ци-

сти. Вони мають правильну овальну форму. Розміри цист становлять 8-17 мкм у

довжину і 4-8 мкм у ширину.

При забарвленні мазків залізним гематоксиліном за Гайденгайном у лямблій

легко виявити два округлих ядра і чотири пари джгутиків: одна пара відходить від

заднього кінця тіла, решта – спереду, з боків і знизу. Від базальних тілець, що

розташовані поблизу ядер, відходять дві паралельні нитки – аксостилі. На межі

між передньою і середньою частиною лямблій розташовані одне-два парабазаль-

них тіла, які мають трикутну або серпоподібну форму.

Цисти лямблій, забарвлені розчином Люголя, мають жовто-коричневий колір,

правильну овальну форму, гладеньку тонку

двоконтурну оболонку. Біля переднього кінця

цист розташовані слабоконтуровані ядра – два

в незрілих і чотири – в зрілих цистах. Всере-

дині цитоплазми можна виявити скручені

джгутики. Більш демонстративно виглядають

цисти в мазках, забарвлених залізним гематок-

силіном. Ядра мають вигляд очок із темними

центральними каріосомами, оточеними світ-

лим незабарвленим обідком.

Рис. 113. Lamblia intestinalis.

429

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

Лямблії можна виростити на штучних живильних середовищах, до складу

яких додають екстракти дріжджоподібних грибів, але культуральний метод діаг-

ностики захворювання не проводять.

Дуже рідко з діагностичною метою використовують серологічні досліджен-

ня, в основному, реакції непрямої гемаглютинації та непрямої імунофлуоресценції.

Титри протилямбліозних антитіл випадають більшими при клінічно добре вира-

женому перебігу захворювання. Були також запропоновані алергічні внутріш-

ньошкірні проби, але й вони не набули широкого використання.

Отже, основним методом лабораторної діагностики лямбліозу і паразитоно-

сійства цих найпростіших є мікроскопічне дослідження дуоденального вмісту і

випорожнень.

Трихомоноз

Трихомоноз (трихомоніаз) – протозойна, виключно антропонозна, хронічна

хвороба урогенітального тракту, що найчастіше передається статевим шляхом.

У жінок уражаються піхва, уретра, шийка матки, вульва, рідко – пряма кишка; у

чоловіків – уретра, передміхурова залоза, придатки яєчок. Захворювання викли-

кає Trichomonas vaginalis із родини Trichomonadidae класу Zoomastigophora. В

організмі людини паразитують ще два види трихомонад: T. tenax – коменсал рото-

вої порожнини і T. intestinalis – мешканець тонкого і товстого кишечника. Ротова

і кишечна трихомонади дуже рідко спричиняють запальні процеси, переважно при

дисбактеріозах. Найбільше значення в патології людини відіграє T. vaginalis. Дже-

релом інфекції є хворі люди або безсимптомні носії трихомонад. Захворювання

найчастіше зустрічається у жінок дітородного віку.

Матеріалом для лабораторного дослідження на трихомоноз у жінок служать

виділення з вагіни (особливо заднього склепіння), каналу шийки матки, уретри і

парауретральних ходів. Його беруть за допомогою ложечки Фолькмана, жолобку-

ватого зонда або катетера. Найчастіше трихомонади виявляють у передменстру-

альний період або в перші дні після закінчення менструацій.

У чоловіків досліджують зскрібки з уретри або виділення після масажу пере-

дньої уретри, сік простати, отриманий після її масажу, сперму та осад сечі після

центрифугування. Дослідження проводять не пізніше, ніж через годину після взяття

матеріалу. Виконують мікроскопічні й культуральні дослідження.

Метод мікроскопії. Вагінальні трихомонади легко виявляють при вивченні

як нативних, так і забарвлених препаратів. Нативний мазок виготовляють шляхом

внесення клінічного матеріалу в краплю теплого ізотонічного розчину хлориду

натрію на підігрітому предметному склі. Суміш накривають покрівним скельцем

і досліджують під мікроскопом (об’єктив 40×, окуляр 10×). Особливо результа-

тивна фазово-контрастна мікроскопія, яка дає змогу спостерігати коливальний,

обертовий та поштовхоподібний рух живих трихомонад. У нативному препараті

T. vaginalis має грушоподібну, округлу або овальну форму з середнім розміром

13-20 мкм, інколи до 30 мкм (вдвічі більша за лейкоцит). Кількість джгутиків –

430

Частина VІ. Протозойні інфекції

чотири, один з них проходить

уздовж тіла, утворюючи разом

із складкою плазмолеми унду-

люючу мембрану. Вона корот-

ша за довжину тіла, тоді як у

T. intestinalis – значно довша і

закінчується вільним джгути-

ком (рис. 114). Трихомонади не

утворюють цист.

Для виготовлення забарв-

лених препаратів з клінічного

матеріалу готують тонкі мазки, висушують на повітрі, фіксують етанолом, мета-

нолом або сумішшю Никифорова й фарбують за методом Романовського-Гімзи,

Грама або метиленовим синім. Після забарвлення 5 % розчином азур-еозину про-

тягом 60 хв цитоплазма джгутиків та ундулююча мембрана видимі дуже чітко.

Ядро фарбується у темно-фіолетовий колір. Воно, як правило, розташоване екс-

центрично, має подовжену, часто ромбоподібну форму (кісточка сливи). Це одна з

основних ознак трихомонад, розташованих всередині епітеліальних клітин. Спе-

реду від ядра розміщені блефаропласти, від яких беруть початок джгутики, унду-

лююча мембрана і аксостиль, що трохи виступає на задньому кінці тіла.

При фарбуванні за методом Грама мазок має оранжево-червоне забарвлення

на тонких місцях мазка і темно-фіолетове – на товстих. Вагінальні трихомонади

забарвлюються блідо. Оболонка їх має вигляд тонкої смужки, сітчаста цитоплаз-

ма набуває оранжево-червоного кольору, ядро – фіолетового. Джгутики та унду-

лююча мембрана не помітні.

При забарвленні метиленовим синім продовгувате ядро трихомонад набуває

темно-синього кольору. Добре проглядається пінистість голубої цитоплазми. На

поверхні епітеліальних клітин видно велику кількість лейкоцитів.

Негативні результати мікроскопічного дослідження не слід оцінювати як ос-

таточні. Обстеження необхідно повторити через 2-3 тижні.

Метод виділення культур. Клінічний матеріал сіють у спеціальне рідке се-

редовище, яке містить гідролізат казеїну, дріжджовий автолізат, сироватку коней,

мальтозу, солі натрію, калію, кальцію, пеніцилін і стрептоміцин (по 1000 ОД/мл).

Перед посівом середовище заливають вазеліновим маслом. Через 3-5 днів після

інкубації посівів при 35-37

°С проглядають пробірки на виявлення росту. Піхвові

трихомонади на цьому середовищі дають придонний ріст з утворенням компакт-

ного білого осаду. Взятий пастерівською піпеткою осад досліджують мікроскопі-

чно в препараті надавленої краплі. Трихомонади в полі зору можуть розміщува-

тись поодинці або великими скупченнями. Вони активно рухаються.

При негативному результаті посіви витримують у термостаті 9-17 діб, пере-

віряючи наявність росту мікроскопічно.

Культуральний метод особливо цінний при діагностиці трихомонозу у чо-

ловіків, а також для перевірки ефективності проведеного лікування.

Рис. 114. Трихомонади людини:

1 – піхвова; 2 – кишкова; 3 – ротова.

431

Розділ 18. Лабораторна діагностика окремих протозоозів

Криптоспоридіоз, ізоспороз

Останнім часом, переважно як індикаторні протозоози при ВІЛ-інфекції, опи-

сують криптоспоридіози та ізоспорози.

Криптоспоридіоз – протозойна кишкова інфекція, яку викликає Crypto-

sporidium tezze з родини кокцидій. Джерелом зараження є молоді телята, ягнята,

кошенята, цуценята, у яких спостерігається діарея. Захворювання раніше розгля-

дали як рідкісну, безсимптомну інфекцію у працівників тваринницьких ферм та

сільського населення. Тепер воно частіше виникає у осіб з імунодефіцитами, особ-

ливо у хворих на ВІЛ-інфекцію, має затяжний або рецидивуючий характер. За

умов глибокого імунодефіциту криптоспоридіоз може уражувати легені, жовчеві

шляхи, жовчевий міхур.

Основним методом діагностики є мікроскопія мазків з випорожнень, в яких

виявляють ооцисти криптоспоридіїв. Препарати забарвлюють за методом Ціля-

Нільсена з додаваням до карболового фуксину диметилсульфоксиду. Ооцисти

мають вигляд яскраво-червоних або якраво-оранжевих дуг. Із серологічних ме-

тодів діагностики перевагу віддають реакції імунофлуоресценції.

Ізоспороз – протозойна кишкова інфекція, яка може виникати як у тварин,

так і в людей. Збудником хвороби є Isospora belli з родини кокцидій. За своїми

епідеміологічними особливостями і патогенезом це захворювання подібне до крип-

тоспоридіозу. Лабораторна діагностика базується на мікроскопії мазків-відбитків

із фекалій. Необхідно пам’ятати, що концентрація ізоспор у фекаліях значно мен-

ша, ніж криптоспоридіїв, у зв’язку з чим необхідно використовувати методи зба-

гачення шляхом седиментації або флотації. Після збагачення мазки забарвлюють

за Цілем-Нільсеном.

Література

1. Антибиотики. Смирнов В.В., Василевская И.А., Резник С.Р. – К: Вища школа,

1985. – 191 с.

2. Антисептики у профілактиці й лікуванні інфекцій / Кол. авторів; за ред. Палія Г.К.–

К.: Здоров'я, 1997. – 201 с.

3. Бактерии рода Pseudomonas / Смирнов В.В., Киприанова Е.А; Отв. ред. Айзенман

Б.Е. – К.: Наукова думка, 1990. – 264 с.

4. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты.

Аллергены. Дезинфекционно-стерилизационные режимы поликлиник /Под ред.

Н.А. Озерецковского, Г.И. Останина. – СПб: Фолиант, 1998. – 420 с.

5. Белозеров Е.С., Змушко Е.И. ВИЧ – инфекция. 2-е изд. – СПб: Питер, 2003 – 386 с.

6. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии / Под

ред. Борисова Л.И. – М.: Медицина, 1993. – 232 с.

7. Букринская. Вирусология. – М.: Медицина, 1986. - 336 с.

8. Вершигора А.Е. Общая иммунология: Учеб. пособие. – К.: Вища шк., 1990. – 736 с.

9. Гайдаш І.С., Флегонтова В.В. Медична вірологія: Підручник. – Луганськ, 2002. –

257 с.

10.Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. –

М.: Изд-во МГУ, 1992. – 448 с.

11. Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э. А. Руководство по медицинской мик-

робиологии. В 3-х т. Пер. с англ. – М.: Медицина, 1982.

12.Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – М.: Медиц. информац.

агентство, 2003. – 604 с.

13.Дранник Г.М., Гриневич Ю.Я., Дизик Г.М. Імунотропні препарати. – К.: Здоров’я,

1994. – 288 с.

14.Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии.–

М.: Медицина, 1983. – 321 с.

15.Кротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и виру-

сология. – СПб.: 1998. – 580 с.

16.Клиническая иммунология и аллергология: В 3-х т. Пер. с нем. / Под ред. Йегера

Л. – М.: Медицина, 1990.

17.Красильников А.П. Справочник по антисептике. – Мн.: Высшая школа, 1995. –

367 с.

18.Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев – М.: Гео-

тар Мед., 1998. – 1200 с.

19.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Борисов Л.Б.,

Смирнова А.М., Фрейдлин И.С. и др.; Под ред. Борисова Л.Б., Смирновой А.М. –

М.: Медицина, 1994. – 528 с.

20.Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия (справочник). –

М.: Медицина, 1982. – 496 с.

21.Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією: Підруч-

ник / Пер. з рос. – К.: Вища школа, 1992. – 431 с.

433

Література

22.Общая вирусология: Руководство. В 2-х т. / Под ред. Жданова В.М., Гайдамович

С.Я.– М.: Медицина, 1982.

23.Поздеев О.К. медицинская микробиологыя: Учебник / Под ред. В.И. Покровско-

го. – М.: Геот ар Мед., 2001. – 768 с.

24.Посібник з медичної вірусології / Гирін В.М., Порохницький В.Г., Вороненко С.Г

та ін.; За ред. Гиріна В.М. – К.: Здоров'я, 1995. – 386 с.

25.Ройт А. Основы иммунологии. Пер. с англ. – М.: Мир, 1991. – 328 с.

26.Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и лабора-

торной диагностике инфекционных болезней / Под ред. проф. Кривошеина Ю.С.–

К.: Вища школа, 1986. – 376 с.

27.СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита / Под ред. Широбокова В.П. –

К.: Здоров’я, 1988. – 232 с.

28.Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. – М.: Медицина,

1983. – 511 с.

29.Фролов А.Ф. Персистенция вирусов (Механизмы и клиникоепидемиологические

аспекты). – В.: Изд-во Винницкого медицинского университета им. Н.И. Пирого-

ва, 1995. – 233 с.

30.Фролов А.Ф., Шевченко Л.Ф., Широбоков В.П. Практическая вирусология. – К.:

Здоров’я, 1989. – 246 с.

31.Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология: Учебник. – М.: Меди-

цина, 2000. – 432 с.

32.Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. – М.: Мир, 1987. – 567 с.

33.Энтеробактерии. Руководство для врачей / Под ред. Покровского В.И. – М.: Меди-

цина, 1985. – 320 с.

34.De Almeida А.F. Antibiotics in Сlіnісаl Practice. – Basel, RECOM. – Publishers, 1991.

– 141 р.

35.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2 / Ed. J. Holt. – Baltimore: Williams

А. Wilcins, 1986.

36.Principles of bacteriology, virology and immunity. Vol 3. Васterial diseases / Ed.

G.R. Smith. – London, 1983-1984. – 610 р.

Зміст

Передмова .................................................................................................................... 3

Список умовних скорочень ........................................................................................ 4

Частина І. ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ ............................................................ 5

Розділ 1.ОРГАНІЗАЦІЯ, УСТАТКУВАННЯ, РЕЖИМ РОБОТИ

БАКТЕРІОЛОГІЧНИХ, ІМУНОЛОГІЧНИХ І ВІРУСОЛОГІЧНИХ

ЛАБОРАТОРІЙ (І.О. Ситник) ............................................................................... 5

Розділ 2. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ (І.О. Ситник) ................. 10

Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів ...................................... 11

Розділ 3. МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ (І.О. Ситник) .............................. 19

Виготовлення мазків і методи їх забарвлення................................................... 19

Прості способи забарвлення бактерій ............................................................... 23

Феноловий фуксин Циля ..................................................................................... 23

Фуксин Пфейфера ................................................................................................ 24

Насичений спиртовий розчин метиленової синьки .......................................... 24

Метиленова синька за Леффлером ..................................................................... 24

Водно-спиртовий розчин метиленової синьки .................................................. 24

Особливості морфології інших груп мікроорганізмів ..................................... 27

Складні методи забарвлення бактерій ............................................................... 32

Забарвлення окремих структур мікробної клітини .......................................... 35

Мікроскопічне дослідження живих мікробів .................................................... 42

Розділ 4. ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ (С.І. Климнюк) ............................................... 45

Культивування мікроорганізмів .......................................................................... 45

Основні методи стерилізації ............................................................................... 50

Бактеріологічне дослідження.............................................................................. 59

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі ...... 61

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі ...... 62

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація .......... 64

Виділення чистої культури анаеробних бактерій ............................................. 71

Виділення та ідентифікація анаеробних мікроорганізмів ............................... 73

Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів ........................ 75

Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою бактеріофагів .......................... 75

Визначення бактеріоциногенності мікроорганізмів......................................... 76

Молекулярно-генетичні методи .......................................................................... 77

Розділ 5. ЕКОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ (І.О. Ситник)..................................... 78

Мікробіологічне дослідження води ................................................................... 78

Дослідження мікрофлори повітря ...................................................................... 85

435

Зміст

Мікробіологічне дослідження грунту ................................................................ 88

Мікробіологічні дослідження змивів із рук та предметів ............................... 90

Мікробіологічні дослідження харчових продуктів .......................................... 91

Дослідження мікрофлори людини ...................................................................... 94

Розділ 6. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ІНФЕКЦІЯ. ВИКОРИСТАННЯ

ТВАРИН В ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ (І.О. Ситник) ................. 100

Способи зараження експериментальних тварин ............................................ 102

Мікробіологічне дослідження трупа................................................................ 107

Визначення вірулентності мікроорганізмів, смертельної дії

екзотоксинів та ендотоксинів............................................................................ 109

Розділ 7. ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ (С.І. Климнюк) ................................................111

Розділ 8. ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ БАКТЕРІЙ

ДО АНТИБІОТИКІВ (С.І. Климнюк) .............................................................. 113

Частина ІІ. ІМУНОЛОГІЯ .................................................................................... 125

Розділ 9. ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ (М.С. Творко) .......................................... 125

Реакція аглютинації (РА) ................................................................................... 126

Реакція преципітації (РП) .................................................................................. 137

Реакція лізису ..................................................................................................... 140

Реакція імунофлуоресценції (РІФ) ................................................................... 145

Імуноферментні методи (ІФА) .......................................................................... 146

Радіоімунні методи (РІМ) .................................................................................. 148

Імуноблотинг ...................................................................................................... 149

Дослідження імунного статусу організму ....................................................... 151

Оцінка стану В-системи імунітету ................................................................... 152

Оцінка клітинного імунітету – стану Т-системи ............................................ 154

Визначення стану системи фагоцитозу ............................................................ 156

Визначення активності системи комплементу ................................................ 157

Розділ 10. ІМУНОПРОФІЛАКТИКА ТА ІМУНОТЕРАПІЯ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ (М.С. Творко) ........................................ 160

Показання і протипоказання до проведення профілактичних щеплень ...... 166

Серотерапія і серопрофілактика ....................................................................... 167

Частина ІІІ. СПЕЦІАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ ............................................... 172

Розділ 11. МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ (І.О. Ситник) ........................................... 172

Стафілококові інфекції ...................................................................................... 172

Стрептококові інфекції ...................................................................................... 177

436

Зміст

Менінгококові інфекції ...................................................................................... 183

Гонококові інфекції ............................................................................................ 186

Ешерихіози.......................................................................................................... 190

Захворювання, спричиненні умовно-патогенними ентеробактеріями ......... 194

Черевний тиф і паратифи .................................................................................. 199

Сальмонельози (харчові токсикоінфекції)....................................................... 206

Дизентерія (шигельоз) ....................................................................................... 209

Клебсієльози ....................................................................................................... 212

Холера.................................................................................................................. 214

Кампілобактеріози і гелікобактеріози .............................................................. 221

Чума ..................................................................................................................... 223

Псевдотуберкульоз ............................................................................................. 227

Кишечний ієрсиніоз ........................................................................................... 228

Туляремія ............................................................................................................. 229

Бруцельоз ............................................................................................................ 232

Сап і меліоїдоз .................................................................................................... 237

Сибірка (злоякісний карбункул) ....................................................................... 239

Мікробіологічна діагностика анаеробних інфекцій ....................................... 243

Ботулізм ............................................................................................................... 243

Правець ................................................................................................................ 247

Ранова анаеробна газова інфекція .................................................................... 249

Бактероїдози ....................................................................................................... 253

Дифтерія .............................................................................................................. 257

Коклюш і паракоклюш....................................................................................... 263

Псевдомонадні інфекції ..................................................................................... 265

Інфекції, викликані гемофільними бактеріями............................................... 267

Легіонельози ....................................................................................................... 269

Лістеріоз .............................................................................................................. 270

Туберкульоз ......................................................................................................... 272

Лепра (проказа)................................................................................................... 279

Мікобактеріози ................................................................................................... 280

Актиномікоз ........................................................................................................ 282

Нокардіоз............................................................................................................. 283

Сифіліс та інші трепонематози ......................................................................... 284

Ендемічні побутові трепонематози .................................................................. 290

Лептоспіроз ......................................................................................................... 292

Бореліози ............................................................................................................. 295

Епідемічний поворотний тиф ........................................................................... 296

Ендемічний поворотний тиф............................................................................. 297

Бореліоз Лайма ................................................................................................... 298

Рикетсіози ........................................................................................................... 299

Епідемічний висипний тиф ............................................................................... 299

Ендемічний висипний тиф ................................................................................ 301

437

Зміст

Ку-гарячка ........................................................................................................... 302

Північноазіатський рикетсіоз ........................................................................... 303

Гарячка цуцугамуші ........................................................................................... 304

Пароксизмальний рикетсіоз .............................................................................. 305

Хламідіози........................................................................................................... 306

Трахома ................................................................................................................ 306

Орнітоз ................................................................................................................ 308

Респіраторний хламідіоз .................................................................................... 309

Сечостатевий хламідіоз ..................................................................................... 310

Мікоплазмози...................................................................................................... 312

Частина IV. ВІРУСОЛОГІЯ .................................................................................. 316

Розділ 12. БУДОВА І КЛАСИФІКАЦІЯ ВІРУСІВ (В.П. Широбоков) ............... 316

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій ................................... 321

Методи ідентифікації вірусів ............................................................................ 329

Виділення та титрування бактеріофагів .......................................................... 335

Розділ 13. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ

ІНФЕКЦІЙ (В.П. Широбоков) .......................................................................... 339

Грип...................................................................................................................... 339

Параміксовірусні інфекції ................................................................................. 344

Парагрип ............................................................................................................. 344

Епідемічний паротит .......................................................................................... 346

Кір ........................................................................................................................ 347

Респіраторно-синцитіальні інфекції ................................................................ 348

Ентеровірусні інфекції ....................................................................................... 349

Ротавірусні гастроентерити .............................................................................. 352

Герпесвірусні інфекції ....................................................................................... 354

Простий герпес ................................................................................................... 354

Вітряна віспа – оперізуючий герпес................................................................. 355

Цитомегалія ........................................................................................................ 356

Аденовірусні інфекції ........................................................................................ 357

Коронавірусні інфекції ...................................................................................... 358

Сказ ...................................................................................................................... 360

Гарячки Марбург і Ебола................................................................................... 361

Арбовірусні інфекції .......................................................................................... 362

Весняно-літній кліщовий енцефаліт ................................................................ 362

Японський енцефаліт ......................................................................................... 363

Гарячка Західного Нілу ...................................................................................... 364

Жовта гарячка ..................................................................................................... 364

Геморагічні гарячки ........................................................................................... 365

Кримська-Конго геморагічна гарячка .............................................................. 365

Геморагічна гарячка з нирковим синдромом................................................... 366

438

Зміст

Краснуха .............................................................................................................. 367

Лімфоцитарний хоріоменінгіт .......................................................................... 369

Вірусні гепатити ................................................................................................. 369

Гепатит А............................................................................................................. 370

Гепатит В ............................................................................................................. 372

Гепатит С, Д, Е, G ............................................................................................... 374

ВІЛ-інфекція ....................................................................................................... 375

Розділ 14. ШПИТАЛЬНІ ІНФЕКЦІЇ (І.О. Ситник) .............................................. 379

Частина V. МІКОЗИ ............................................................................................... 388

Розділ 15. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ

МІКОЗІВ (І.О. Ситник) ...................................................................................... 388

Розділ 16. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ

МІКОЗІВ (І.О. Ситник) ...................................................................................... 392

Кандидоз.............................................................................................................. 392

Дерматомікози .................................................................................................... 395

Глибокі (вісцеральні) мікози ............................................................................. 399

Плісняві (цвільові) мікози ................................................................................. 405

Частина VІ. ПРОТОЗОЙНІ ІНФЕКЦІЇ ............................................................. 409

Розділ 17. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ (І.О. Ситник) ............ 409

Розділ 18. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ОКРЕМИХ

ПРОТОЗООЗІВ (І.О. Ситник) ........................................................................... 412

Малярія................................................................................................................ 412

Морфологічна диференціація збудників малярії ............................................ 413

Токсоплазмоз ...................................................................................................... 416

Трипаносомоз ..................................................................................................... 419

Лейшманіози ....................................................................................................... 421

Амебіаз ................................................................................................................ 424

Балантидіаз ......................................................................................................... 426

Лямбліоз .............................................................................................................. 427

Трихомоноз ......................................................................................................... 429

Криптоспоридіоз, ізоспороз .............................................................................. 431

Література................................................................................................................. 432

Підписано до друку 5.02.2004. Формат 70×100/16. Гарнітура Times.

Друк офсетний. Ум. др. арк. 35,75. Обл.-вид. арк. 37,95. Папір офсетний.

Наклад 2000. Зам. № 54.

Ольга Котульська

Павло Кушик

Світлана Демчишин

Леся Капкаєва

Наталя Нижегородова

Редактор

Оформлення обкладинки

Технічний редактор

Коректор

Комп’ютерна верстка

Оригінал-макет підготовлено у відділі комп’ютерної верстки

видавництва “Укрмедкнига”

Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського.

Майдан Волі, 1, м. Тернопіль, 46001, Україна.

Надруковано у друкарні видавництва “Укрмедкнига”

Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського.

Майдан Волі, 1, м. Тернопіль, 46001, Україна.

Свідоцтво про внесення до державного реєстру суб’єктів видавничої справи

ДК № 348 від 02.03.2001 р.

Климнюк Сергій Іванович,

Ситник Іван Олександрович,

Творко Михайло Стефанович,

Широбоков Володимир Павлович

ПРАКТИЧНА МІКРОБІОЛОГІЯ

Посібник