Лекция 02
Физиология микроорганизмов. Питание, рост, размножение, дыхание, метаболизм. Влияние факторов внешней
среды.
Физиология микроорганизмов изучает биохимические и энергетические процессы, которые происходят в бактериальной клетке и обеспечивают воссоздание ее структурного материала и энергетические потребности.
Бактерии являются сложными живыми организмами, в которых происходят разнообразные биохимические превращения. Они предопределяют рост, размножение, продукцию ферментов, токсинов и других биологически активных веществ, отвечают за регуляцию функциональной активности клеток, их высокую пластичность и способность адаптироваться к условиям внешней среды.
Химический состав бактерий. Как и все живые существа, бактериальная клетка состоит из четырех основных элементов - азота, углерода, водорода, кислорода. Углерод складывает 45- 55 % сухого остатка клетки, кислород - 25-30 %, азот - 8-15 % и водород - 6-8 %. Этот органоген служит материалом, из которого построены все составные компоненты клетки, : нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, многочисленные ферментные системы и тому подобное.
В зависимости от вида бактерии содержат от 70 до 90 % воды. Она может находиться в свободном (в цитоплазме) или связаному состоянии. Свободная вода является средой, в которой происходит разнообразие биохимических превращений (расщепления и синтез веществ) в результате действия гидролитических ферментов, в ней наблюдается движение ионов, она выступает в качестве растворителя многих веществ, которые поступают в клетку, обеспечивает коллоидное состояние цитоплазмы.
Сухой остаток представляет 10-30 %. Он формируется из белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, полисахаридов, низкомолекулярных органических веществ и солей.
В клетке насчитывается свыше 2,4 млн разнообразных белковых молекул 1850 видов
Белок складывает до 55 % сухого остатка клетки. Он представлен простыми и сложными белками. Простые белки называют протеинами. За своим составом они существенно не отличаются от белков эукариотических организмов. Основная их масса содержится в цитоплазме клетки, цитоплазматической мембране, клеточной стенке грамотрицательных микробов, нуклеоиде. Токсины возбудителей газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма, фермент гиалуронидаза являются простыми белками.
Сложные белки - протеиды свое название получили за способность соединяться с другими веществами. Так, белки, связаные с нуклеиновыми кислотами, получили название нуклеопротеиды, с углеводами - гликопротеиды, липидами - липопротеиды, железом, медью- хромопротеиды. Они играют важную роль в жизнедеятельности клетки.
Тонкие физико-химические исследования позволили установить, что в клетке насчитывается свыше 2,4 млн разнообразных белковых молекул 1850 видов.
Нуклеиновые кислоты представлены дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислотами. Их содержимое колеблется в пределах 25-30 % сухой массы. В клетке есть две молекулы ДНК и свыше 250 тысяч молекул РНК. Последние можно разделить на три группы: рибосомальные РНК, транспортные РНК и матричные (информационные) РНК. Углеводы представляют 12–20 % сухого остатка. Они представлены разнообразными сахарами, многоатомными спиртами, олиго- и полиозидами, полисахаридами, другими соединениями. Их роль в обеспечении жизнедеятельности клетки трудно переоценить, так как они входят в состав любых структур клетки. Простые сахара являются субстратом, из которых синтезируются более сложные соединения. Полисахариды разных бактерий отличаются за своей специфичностью. Они предопределяют антигенные свойства клетки, их вирулентные (капсулы пневмококков) свойства.
Отличия в строении бактериальных полисахаридов легли в основу разработки методов хемотаксономии микробов, их идентификации. Особенности состава полисахаридов оболочки позволяют получать вакцины, специфические диагностические сыворотки.
В клетке содержится в среднем до 10 % липидов. Однако у отдельных групп микроорганизмов (микобактерии, риккетсии) эта часть увеличивается до 40 %. У грамотрицательных бактерий в связи с особенностями строения клеточной стенки их в 2-5 раз больше, чем в грамположительных.
Клеточный метаболизм. Совокупность всех биохимических превращений в клетке называется метаболизмом. Он происходит за двумя основными направлениями. Первый обеспечивает синтез сложных клеточных соединений из более простых. Поэтому он получил название биосинтез, конструктивный метаболизм или анаболизм. Однако подавляющее большинство реакций синтеза и распада требуют энергетического обеспечения. Поэтому энергетический метаболизм или катаболизм представляет собой поток реакций, которые сопровождаются накоплением электрохимической энергии, что потом викорстовуеться клеткой.
Конструктивный и энергетический метаболизм - тесно связанный между собой комплекс превращений, часто их пути совпадают, и одни и те же вещества используются для разных потребностей. В этом случае такие субстраты называются амфиболитами, а пути — амфиболичними.
Метаболические циклы микробов чрезвычайно разнообразны. Они способны использовать разные виды энергии и многочисленные исходные субстраты для построения собственных структур. Именно этим предопределяется убиквитарнисть их распространения.
Конструктивный метаболиз прокариотов. Для того, чтобы клетка могла существовать, должен происходить постоянный обмен веществ с окружающей средой. В клетку извне должен поступать пластичный материал, из которого она синтезирует все необходимы ей молекулы.
В конструктивном метаболизме ведущая роль принадлежит соединениям углерода, из которого построены все живые организмы. В зависимости от того, какой углерод усваивают бактерии, они разделяются на две группы: автотрофы и гетеротрофы.
Типы метаболизма бактерий
Автотрофы (autos - сам, trophe - питание) способны синтезировать все необходимые им органические соединения из CO2 как единственного источника углерода. Гетеротрофы (heteros -другие) - микроорганизмы, источником углерода для которых являются органические соединения. Они способны потреблять любые простые и сложные углеродные соединения - сахара, аминокислоты, многоатомные спирты, парафины и др.
Степень выражения гетеротрофии у бактерий может быть самая разнообразная. Наивысшую гетеротрофность имеют прокариотические организмы, которые способны жить только внутри живых клеток (риккетсии, хламидии). Их метаболические пути полностью зависят от организма хозяина. Такие микрорганизми называют облигатными (строгими) паразитами.
Однако много микробов можно выращивать на искусственных питательных средах, в состав которых входят белки, пептиды, витамины, фрегменти нуклеиновых кислот. Такие формы бактерий, способных расти вне клеток человека или животных при создании необходимых условий, называют факультативными паразитами.
Большинство бактерий, которые населяют земной шар (свыше 99 %), принадлежат к сапрофитам. Они непосредственно от живых организмов не зависят и питаются за счет мертвых органических остатков.
Дикие штаммы бактерий способны синтезировать все необходимы им вещества из ограниченного числа органических соединений, например, глюкозы и солей аммония. Они называются прототрофами. Отдельные микроорганизмы (варианты прототрофов) потеряли способность к синтезу некоторых необходимых им ростовых факторов, следовательно не могут расти на минимальных питательных средах. Их называют ауксотрофными организмами.
Источники энергии и доноры электронов. В зависимости от источника энергии, которые усваивают микробные клетки, их разделяют на фототрофы и хемотрофы.
Фототрофные бактерии способны использовать энергию солнечного света. Их иначе называют фотосинтезирующими бактериями. Патогенных для человека среди них нет. Другие прокариоты, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций в субстратах, называются хемотрофами.
Для осуществления разнообразных реакций клетке необходимые электроны. Вещества, которые в процессах биохимических превращений отдают электроны, называются донорами. Молекулы, которые получают электроны, называются акцепторами.
Микроорганизмы, для которых источником электронов являются неорганические соединения типа Н2, Н2 S, NH3+, Fe +2 и другие, называются литотрофами (litos - камень). Другие бактерии, для которых в качестве донора электронов выступают органические вещества, называются органотрофами.
В зависимости от способа получения энергии, донора электронов и источника углерода для усвоения можно выделить 8 основных типов прокариотических организмов: фотолитоавтотрофы и фотолитогетеротрофы, фотоорганоавтотрофы и фотоорганогетеротрофы, хемолитоавтотрофы и хемолитогетеротрофы, хемооргано-автотрофы и хемоорганогетеротрофы.
Микроорганизмы, которые способны вызывать у человека заболевание, принадлежат к хемоорганогетеротрофам.
Поступление веществ в клетку.
Облегченная диффузия осуществляется за счет особенных белков - пермеаз, которые содержатся в цитоплазматической мембране. Этот процесс также не требует энергетического обеспечения.
Однако большинство питательных веществ, метаболитив, ионов проникают в клетку с помощью активного транспорта. Его также обеспечивают белки-пермеазы, но они являются высокоспецифическими и способны переносить только определенные субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии, которую генерирует клетка, потому возможный перенос и против градиента концентрации вещества. Если этому процессу предшествует определенная химическая модификация молекулы, его называют транслокацией химических групп. Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.
Обмен белков у микроорганизмов происходит за двумя основными направлениями: расщепление полипептидов до аминокислот и биосинтетические процессы, связаные с конструированием новых молекул. Первое направление обеспечивают ферменты экзопротеазы, что выделяются в окружающую среду, и эндопротеазы, которые накапливаются в клетке. Конечные продукты — аминокислоты, что образуются во время этого процесса, могут подвергаться дезаминированию и декарбоксилированию, превращаясь в аммиак, углекислый газ, оксикислоты.
Биосинтетические процессы происходят при участии готовых аминокислот, какие трансаминируются или пераминируются. Некоторые микрорганизми способны синтезировать аминокислоты из простых соединений азота. Необходимо отметить, что микроорганизмы, в отличие от клеток организма человека, способны синтезировать незаменимые аминокислоты — лизин, метионин, триптофан.
.Ферменты микроорганизмов. Все биосинтетические процессы и другие метаболические превращения в клетке происходят при участии особенных высокоактивных биологических катализаторов, которые называются ферментами. Они принадлежат до 6 классам: гидролазы (обеспечивают реакции расщепления при участии воды), оксидоредуктазы (катализируют разнообразные окислительно-восстановительные реакции, участвуют в процессах дыхания), изомеразы (осуществляют перенос фосфатных групп в молекулах, побуждая процессы изомеризации), трансферазы (переносят аминогруппы, адениловые группы из одних субстратов на другие), лиазы (катализируют реакции отщепления химических групп негидролитическим путем), лигазы (отвечают за синтез новых веществ, который происходит за счет энергии АТФ).
Способность образовывать определенные ферменты кодируется клеточным геномом и является постоянным признаком бактерий. Так как бактериальная клетка занимает небольшой объем, в ней преобладают адаптивные ферменты над конститутивными.
Классификация ферментов бактерий
1. Адаптивные, конститутивные
2. Экзоферменты, эндоферменты
3. Гидролазы, оксидоредуктазы, изомеразы, трансферазы, лиазы, лигазы
Роль ферментативной деятельности микроорганизмов трудно переоценить. Они имеют общебиологическое значение. Известно участие бактерий у кругообороте веществ в природе, формировании месторождений полезных ископаемых (нефть, уголь, залежи серы). Микроорганизмы - прекрасные санитары окружающей среды. Они способны биодеградировать практически любые вещества, которые загрязняют окружающую среду.
Человек поставил микробные ферменты себе на службу. Их широко используют в разных отраслях химической, пищевой, фармацевтической, парфюмерной промышлености, сельском хозяйстве, медицине.
Протеазами удаляют волосяной покров с кож животных, снимают желатиновый слой из кинопленки. Ферменты, которые обеспечивают брожение, используются для получения бутанола, ацетона, необходимых для проведения хроматографических исследований, этилового спирта, масляной кислоты. Кисломолочные продукты - кефир, йогурт, простокваша, кумыс - также продукты деятельности бактерий брожения.
Микроорганизмы используются в виноделии, производстве пива, при изготовлении сливочного масла, силосовании кормов, квашении овощей. Из дрожжей получают белково-кормовые добавки для выкармливания скота. Как питательную среду используют парафины - отходы нефти.
С помощью микроорганизмов и их ферментных систем в медицинской промышленности получают гормоны гидрокортизон, преднизолон, разнообразные алкалоиды. Пропионибактерии, актиномицеты синтезируют витамины (В12-). Из стрептококков получено фибринолизин, стрептодорназу и стрептокиназу, которые разрушают тромбы в кровеносных сосудах.
Поскольку способность образовывать ферменты определенной специфичности присущая всем микроорганизмам, это широко используется в лабораторной практике для идентификации бактерий. Ее проводят за комплексом сахаролитических, протеолитических, пептолитических, липолитических и других ферментов.
Энергетический метаболизм прокариотов. По своему объему реакции, которые обеспечивают клетку внутренней энергией, значительно превышают биосинтетические процессы.
Микроорганизмы могут использовать не все формы энергии, которые существуют в природе. Они способны пользоваться только энергией солнечного света (фотосинтезирующие бактерии) и химической (хемотрофные микробы). Недоступные для них ядерная, механическая и тепловая энергии.
Явление нагромождения энергии рассматривается как перенос ионов водорода путем отдельного транспорта протонов и электронов: протоны при этом выделяются в окружающую среду, а электроны передаются на соответствующие молекулы — акцепторы.
В течение своей эволюции бактерии освоили три способа получения энергии: брожение, дыхание и фотосинтез.
При брожении в анаэробных условиях в определенных окислительно-восстановительных реакциях образуются нестабильные молекулы, фосфатная группа которых содержит много свободных энергий. Она переносится на молекулу аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), которая превращается в АТФ. Реакции, в которых энергия запасается на АТФ, получили название субстратного фосфорилирования. Восстановитель, который при этом образуется, переносит электроны на эндогенный акцептор (пируват, ацетальдегид) или освобождается в виде водорода.
Окисление происходит в результате переноса электронов через специальную электроннотранспортную цепь, локализованную на мембране. Он состоит из набора переносчиков и в большинстве случаев вызывает возобновление молекулярного кислорода к Н2О.
Основой фотосинтетических процессов у представителей микробного мира является поглощение солнечной энергии разными пигментами: флавопротеинами, хиноном, цитохромами и белками, которые содержат негемовое железо. Они и обеспечивают перенос электронов и, соответственно, высвобождение энергии.
Энергия, которую генерирует клетка, запасается в форме электрохимического трансмембранного градиента ионов водорода - Н+ или в молекулах АТФ.
Самое главное место в переносе химической энергии принадлежит системе АТФ. Она образуется при субстратном и мембранозависимом фосфорилировании. При этом от субстрата отщепляется фосфатная группа и переносится на молекулу АДФ. Она содержит две макроэргические связи, которые при гидролизе освобождают 31,8 кДж/моль энергии. Молекулы АТФ считают энергетической валютой клетки, а малые размеры позволяют им легко диффундировать в те участки клетки, где необходима энергия. Подсчитано, что для удваивания клеточной массы молекула АТФ должна около 10000 раз участвовать в процессах гидролиза и синтеза.
На примере E. coli определенно, сколько необходимо энергии, чтобы синтезировался 1 г клеточного вещества. Это требует 37 ммоль АТФ, из них 20 ммоль используется на синтез белка, 7 ммоль - на синтез ДНК и РНК, 2 ммоль - для полимеризации сахаров. Остальные идут на поддержание жизнедеятельности - осмос, движение клетки и тому подобное.
Другой универсальной клеточной энергией является энергия трансмембранного потенциала Н+. Это осуществляется с помощью специальной "петли", локализованной в цитоплазматической мембране. Переносчик хинона обеспечивает движение двух атомов водорода от внутренней стороны ЦПМ наружу. Потом цитохромы возвращают в клетку два электрона, а протоны высвобождаются во внешнюю среду.
При таком переносе наружу клетки накапливаются ионы водорода, среда подкисляется, а в цитоплазме их число уменьшается, и она приобретает более щелочной характер. Возникает ориентированная поперёк ЦПМ градиент ионов водорода. Поскольку Н+ - химические частицы с позитивным зарядом, то их накопление из обеих сторон ЦПМ вызывает создание не только концентрационного градиента частей, но и ориентированного поперек мембраны электрического поля. Напряжение потенциала Н+ достигает 200-250 мВ.
Энергия трансмембранного потенциала может разряжаться при участии локализованного в мембране протонного АТФ-синтетазного комплекса. Это создает возможность из АДФ и неорганического фосфата без любых промежуточных соединений образовать молекулы АТФ. Однако процесс может проходить и в противоположном направлении. Тогда при гидролизе АТФ растет энергия ((н+ на ЦПМ.
Таким образом, данные реакции являются естественными механизмами, которые соединяют процессы окисления с фосфорилированием. Энергия, которая накапливается на мембране, и энергия АТФ обеспечивают разные потребности клетки. Первая поглощается ДНК при генетической трансформации, предопределяет движение бактерий с помощью жгутиков, обеспечивает активный перенос веществ и ионов через мембрану, а энергия АТФ - синтетические процессы в клетке.
Но ни энергия Н+, ни АТФ не могут накапливаться и храниться в клетке достаточно длинный срок, ведь продолжительность жизни молекулы АТФ всего 1/3 с. Для консервирования энергии прокариоты создали механизм синтеза высокополимерных молекул, полисахаридов, липидов или полипептидов. Эти вещества упаковываются в специальные гранулы, укрываются оболочкой и хранятся в неактивном состоянии.
Дыхание бактерий. Это один из путей биологического окисления, который происходит с образованием молекул АТФ, то есть сопровождается нагромождением энергии. Во время этого процесса одни вещества (органические и неорганические соединения) служат донорами электронов и при этом окисляются, в качестве акцепторов электронов выступают неорганические соединения, они восстанавливаются. У одних микроорганизмов в качестве конечного акцептора электронов выступает кислород, в других - неорганические сульфаты, нитраты, карбонаты.
Л. Пастером было впервые замечено, что некоторые микробы получают энергию без участия кислорода. В 1863 г. он предложил термины "аэроб" и "анаэроб".
Классификация бактерий по типам дыхания
Сегодня, в зависимости от условий получения энергии (способа дыхания), прокариоты разделяются на ряд групп. Облигатные аэробы - микроорганизмы, для оптимальнгоо роста которых необходимо 21 % кислороду. К ним принадлежат возбудители туберкулеза, чумы, холерный вибрион. На поверхности жидких питательных сред они растут, как правило, в виде пленки. Облигатные анаэробы - бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода. Такими бактериями являются возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии и др. Отдельные клостридии могут быть аэротолерантными. Для культивирования их используют специальные питательные среды и аппараты (анаеростати), в которых создаются анаэробные условия за счет поглощения кислорода или замены его индиферентиними газами (азотом, водородом). Факультативные анаэробы (факультативные аэробы) приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот. Группу факультативных анаэробов формируют многочисленные представители семейства кишечных бактерий (эшерихии, сальмонеллы, шигеллы), стафилококки и некоторые другие бактерии. Микроаэрофилы - особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост. Эта группа представлена молочнокислыми, азотфиксирующими бактериями. Капнеичными называют такие микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа. Типичными представителями являются возбудители бруцеллеза бычьего типа.
У облигатных аэробов кислород используется в качестве конечный акцептор электронов в реакциях, которые катализируются цитохромоксидазами и оксигеназой. В клетках факультативных анаэробов также есть цитохромоксидазы, однако у облигатных анаэробов ферментов, которые катализируют взаимодействие с молекулярным кислородом, нет.
Детальное изучение механизмов дыхания у бактерий доказало, что первыми микроорганизмами на земном шаре были анаэробы, так как к возникновению фотосинтезирующих эукариотов содержимое кислорода в атмосфере было незначительным в сравнении с нынешним временем. За расчетами, чтобы состоялось переключение механизма брожения на аэробное дыхание, достаточно было 0,2 % кислорода в атмосфере (на сегодня его концентрация представляет 21 %). В свою очередь рост содержимого кислорода привел к изменению характера атмосферы из восстановительной на окислительную за счет соответствующих реакций. В условиях бескислородной атмосферы существовал дефицит акцепторов электронов, а с появлением кислорода эта проблема была решена.
Рост и размножение бактерий. Любое живое существо способно к росту и размножению. Под ростом понимают координированное воссоздание бактериальных структур и соответственно увеличения массы микробной клетки. Размножение - это способность микробов к самовоспроизведению, при этом увеличивается количество особей в популяции на единицу обьема среды.
Размножение бактерий - сложный процесс, связаный с синхронным взаимодействием многих их структур. Начинается он с воссоздания генетического материала - ДНК, которая локализована в нуклеоиде. Сначала происходит репликация (удваивания) генетического материала полуконсервативным путем. Начинается он с репликативной точки на ДНК, расположенной в месте соединения мезосомы с цитоплазматической мембраной. Нуклеиновая кислота деспирализуеться, и нити ДНК расходятся. Каждая из них является матрицей, на которой по принципу комплементарности синтезируются их копии, которые впоследствии объеденяються в двунитевую ДНК. Синтез дочерних нитей ДНК происходит постепенно, небольшими фрагментами по 1-2 тыс. нуклеотидов, которые позже сшиваются ферментом лигазой. В зависимости от условий, репликация может длиться 20-40 минут.
Параллельно с репликацией начинается образование поперечной перегородки за счет цитоплазматической мембраны. Потом она окружается пептидогликаном. Во время репликации и образования перегородки клетка растет, синтезируются биополимеры, из которых будут состоять цитоплазматическая мембрана, рибосомы, цитоплазма.
Клетки отделяются одна от другой, а у грамотрицательных микробов синтезируется дополнительно внешняя мембрана. Если клетки сохраняют связь, образуются цепи из коккоподобных или палочковидных форм.
Деление клеток может происходить тремя типами. Опережающий - такой тип, при котором образуются многоклеточные палочки и кокки. При синхронном репликация нуклеоида сопровождается делением клетки, и образуются одноклеточные организмы. Третий тип - с опережающим делением нуклеоида, при котором образуются многонуклеоидные формы бактерий.
Как правило, бактерии размножаются простым делением, которое происходит в разных плоскостях. Это вызывает, например, образование разных морфологических типов коккоподобных микроорганизмов - диплококков, стафилококков, тетеракокков, сарцин. Актиномицеты могут размножаться путем фрагментации нитевидных клеток, почкованием. Возможно образование клеток, подобных спорам, конидиям.
Облигатные внутриклеточные паразиты - хламидии - размножаются, проходя ряд стадий : элементарные тельца, инициальные тельца, промежуточные тельца. Именно последние являются тем источником, из которого формируется новое поколение элементарных телец. Длительность цикла составляет 40-48 часов.
Микоплазмы также могут образовывать особенные элементарные тела, которые способны к размножению фрагментацией или почкованием. Однако они могут размножаться и простым бинарным делением.
Скорость размножения бактерий зависит от многих факторов: возраста культуры, состава питательной среды, его рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и тому подобное.
Бактерии размножаются в геометрической прогрессии. Если считать, что при оптимальных условиях бактерия удваивается каждые 30 минут, то через час их будет 4, через два часа - 16, через 4 - 256, через 15 - миллионы. Через 35 часов их объем будет представлять до 1000 м3, а масса - свыше 400 т.
При внесении в питательную среду бактерии размножаются по определенным закономерностям. Они растут и размножаются, достигая определенного максимума до той поры, пока не будут исчерпаны запасы питательных веществ. Если не удалять конечные продукты обмена и не добавлять необходимые вещества, то можно получить периодическую культуру (популяция в ограниченном пространстве). Микроорганизмы в такой культуре ведут себя как многоклеточные системы с генетически ограниченным ростом.
Кривая, которая описывает зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования, называется кривой роста.
Различают четыре основных фазы роста периодической культуры: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную и фазу отмирания ((черт. 19).
Начальная или лаг-фаза охватывает промежуток между инокуляцией бактерий и достижением наивысшей скорости их деления. В этот период происходит адаптация бактерий к условиям существования. В клетке в 8-12 раз растет количество РНК, увеличивается концентрация ферментов. Длительность фазы 1-2 час.
Экспоненциальная (логарифмическая) фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и ростом их количества в геометрической прогрессии. Она зависит от возраста микробов и состава среды. Так, энтеробактерии делятся каждые 15-30 мин., стрептококки - 30 мин., а грунтовые нитробактерии и возбудители туберкулеза - 5-18 час. Время, в течение которого происходит деление микроба, называется порою генерации. Длительность фазы - 5-8 час.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Наступает равновесие между количеством живых микробов и тех, которые отмирают. Этому способствует высокая плотность популяции, дефицит питательных веществ в среде, низкое парциальное давление кислорода, накопления токсичных продуктов обмена. Однако количество биомассы в этот период достигает наивысшего уровня, потому концентрацию клеток отмечают как максимальную (М-) концентрацию, а величину биомассы - сроком выход или урожай. Этот признак является специфическим и характерным для каждого вида бактерий. Длится фаза 6-7 час.
Фаза отмирания (до 10 ч.) сопровождается резким уменьшением числа живых клеток. Этому способствуют значительный дефицит питательных веществ в среде, нагромождение кислот, автолиз под воздействием собственных ферментов.
Следовательно, в периодической культуре условия культивирования все время изменяются: плотность микробов растет, а запасы питательных веществ уменьшаются. Однако во многих случаях необходимо поддерживать клетки в фазе экспотенциальнго роста и М-концентрации, потому что именно в этот период они наиболее физиологически и функционально активные: синтезируют много белка, продуцируют большое количество разнообразных ферментов, токсинов, антибиотиков, других биологически активных веществ. Это достигается постоянным удалением популяций бактерий, которые растут, обновлением питательной среды, дополнительной аэрацией (для аэробных бактерий). Именно по таким принципам работают хемостаты и турбидостаты - приборы, которые позволяют проводить непрерывное культивирование в промышленных и лабораторных условиях.
Рост микробов на твердых питательных средах происходит по аналогичным закономерностям, однако плотность клеток значительно более высока.
Классификация питательных сред
|
П р о с т ы е |
С л о ж н ы е |
|
Жидкие: ПВ, МПБ Плотные: МПЖ, МПА |
Специальные: сахар. МПА, МПБ, сывор. МПА, кровь. МПА, асцит. МПА Обогащения, накопления: селенит МПБ, с-да Мюллера, Кауффмана, Китт-Тароцци Элективные: Ру, 1% щелочная ПВ Дифференциально-диагностические: 1.для определения сахаролитических свойств (с-да Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева) 2. для определения протеолитических свойств (свернутая сыворотка, МПЖ, кусочки мышц) 3. для определения пептолитических свойств (МПБ, ПВ) 4. для определения гемолитических свойств (кровь. МПА) 5. для определения редуцирующих свойств (среды с разными красителями) |
На поверхности плотной питательной среды микрорганизми могут образовывать сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония - это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Образование ее является проявлением культуральных свойств бактерий.
Характеристика колоний - важная составляющая часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.
Характеризовать колонии можно по разным признакам. По величине (диаметром) они разделяются на большие (4-6 мм и больше), средние (2-4 мм), мелкие (1- 2 мм), карликовые или точечные (менее 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебовидная), ризоидная. Они бывают прозрачными, что пропускают свет, и мутными.
По рельефу и контуром формы в вертикальном разрезе колонии делятся на плоские, выпуклые, куполообразные, каплеобразные, конусообразные. плосковыпуклые, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, с приподнятой в виде соска серединой.
Поверхность колоний изучают сначала невооруженным глазом, а потом с помощью лупы или малого увеличения микроскопа. Она может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой или шершавой. Гладкие колонии обозначают как S -формы (smooth - гладкий), а шершавые - R -формы (rough - шершавый, неравный).
Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.
Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно-молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.
Структуру колоний исследуют в проходящем свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные и волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.
При прикасании к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.
На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному. хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.
Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно-анаэробных микроорганизмов.
Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть зернистоподобным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет серовато-белый или желтоватый цвет. Подобным образом растут, как правило, анаэробные бактерии.
Пристеночный рост проявляется хлопьеобразованием, появлением зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.
Аэробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влажная, толстая, иметь вязкую, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянутся за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.