БУДОВА ГЕНА ПРО- ТА ЕУКАРІОТІВ. ГЕНИ СТРУКТУРНІ, РЕГУЛЯТОРНІ, Т-РНК, Р- РНК. ОРГАНІЗАЦІЯ ПОТОКУ ЕНЕРГІЇ У КЛІТИНІ. РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ. МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ МІНЛИВОСТІ В ЛЮДИНИ.
Під терміном "ген" розуміють послідовність нуклеотидів у ДНК, яка обумовлює певну функцію в організмі або забезпечує транскрипцію іншого гена.Отже, одна і та ж ДНК-послідовність може кодувати не один, а декілька різних поліпептидів. Макромолекули ДНК контролюють синтез білків, що є основною речовиною клітини. Інформація від ДНК передається до так званої інформаційної РНК (іРНК). Інформаційна РНК синтезується в ядрі і переходить у рибосоми – органоїди клітини, розміщені, в основному, на мембрані ендоплазматичної сітки. У рибосомах і-РНК вступає у взаємозв'язок із рибосомальною РНК і служить матрицею, на якій синтезується білок. Виявляється, що ця інформація, яка спочатку записана у вигляді послідовності нуклеотидів у молекулі ДНК, записана у вигляді специфічної послідовності нуклеотидів в інформаційній РНК і переводиться в специфічну послідовність амінокислот у молекулі білка.
У 1909 р. В. Іоганнсен запропонував назвати складові спадковості генами (від грец. γένος – нащадок, народження). Цей термін у генетиці набув визнання і став загальноприйнятим. Проте В. Іоганнсен не пов’язував розташування генів у хромосомах клітинного ядра. Докорінних змін уявлення про ген набули в результаті робіт Т. Моргана і його учнів. Поняття гена в хромосомній теорії спадковості отримало матеріальне підґрунття. Перш за все було доведено зв’язок генів з хромосомами. Потім встановлено, що гени розташовані в хромосомах лінійно, утворюючи групи зчеплення. Між генами, які знаходяться в одній парі гомологічних хромосом, завдяки кросинговеру може відбуватися рекомбінація. Частота рекомбінацій є функцією відстані між генами.
У хромосомній теорії спадковості ген уявлявся як елементарна одиниця спадковості, мутації і рекомбінації. Проте пізнішими дослідами (М.П. Дубінін, О.С.Серебровський та ін.) було доведено, що ген не можна розглядати як корпускулу, неподільну частку спадкового матеріалу. Ген у дійсності має більш складну будову. Уявлення про складну будову гена викладено в центровій теорії гена.
Весь ген (базиген) складається з окремих ділянок – центрів, названих трансгенами, а явище отримало назву ступінчастого алелізму. Між трансгенами одного гена існують такі ж алельні відносини, як і між функціонально різними генами. Явище ступінчастого алелізму і створення центрової теорії гена похитнуло усталене уявлення про неподільність гена як одиниці функції, мутації і рекомбінації. Зазнало сумніву й уявлення, що ген функціонально неподільна одиниця, і неможливість його поділу шляхом кросинговеру.
Подальше вивчення структури і функції гена показало, що ген є ділянкою хромосоми і контролює розвиток конкретної ознаки. Він має певну довжину, складається з окремих різних за функцією одиниць, які можуть розділятися кросинговером і самостійно мутувати. За пропозицією американського фізика і генетика С. Бензера в 1957р. були введені три нові поняття гена: рекон, мутон і цистрон.
Одиниця рекомбінації генів – рекон. С. Бензер довів, що ген складається з великої кількості дуже дрібних, здатних до рекомбінації одиниць. Допускається, що кросинговер може відбуватися між двома сусідніми нуклеотидами і тоді величину рекона слід визнати рівною одному нуклеотиду. Отже, найменший, здатний до рекомбінації структурний елемент гена, довжина якого вже не поділяється кросинговером може вважатися за одиницю рекомбінації. Бензер назвав її реконом. Вважають, що рекон складається з однієї або кількох пар мононуклеотидів.
Одиниця мутаці генів – мутон. Найменша ділянка молекули ДНК, зміна якої спричиняє генні або точкові мутації, отримала назву мутон. Спочатку вважалося, що мутон – це група, яка складається з п’яти нуклеотидів. Пізніше було доведено, що мутон відповідає одному нуклеотиду. У ряді робіт пропонується замінити термін мутон на одиницю мутації – сайт (site). Вважають, що сайт складається не з одного, а з декількох нуклеотидів.
Одиниця функції генів – цистрон – найменша функціональна одиниця, далі неподільна на доповнюючі одна одну ділянки. Складне функціональне поєднання кількох генів, що бере участь у передаванні спадкової інформації про будову певної білкової молекули.
Згідно із сучасним уявленням ген – універсальна структурна одиниця живої матерії, яка, завдяки закодованій у ній інформації, забезпечує єдність і різноманітність існуючих форм живого, контролює клітинний обмін (метаболізм), спадковість, еволюцію. Тобто, ген є структурою (певною ділянкою молекули ДНК), яка кодує яку-небудь окрему ознаку клітини. За хімічною природою ген – це ділянка молекули ДНК, на кожному ланцюгу якої у певній послідовності розміщені три нуклеотидні кодони – “кодові слова”, що визначають порядок розміщення амінокислотних залишків при синтезі поліпептидного ланцюга. Кожний ген займає на хромосомі певне місце – локус. Сукупність генів формує генотип. Генотип вірусів містить десятки генів, у бактерій їх сотні, у вищих організмів десятки і сотні тисяч. Всі гени бактерій, як правило, знаходяться в одній хромосомі й об’єднані у функціональні блоки, що контролюють усі ланки метаболізму в бактеріальних клітинах.
В еукаріот, крім ядерних генів, є також нехромосомні гени, які локалізуються в клітинних органелах (мітохондріях, пластидах) і контролюють синтез білків, що забезпечує їх функціонування. Залежно від функцій розрізняють структурні гени (цистрони) та регуляторні (ген-регулятор, ген-оператор). На структурних генах здійснюється синтез (транскрипція) інформаційних (матричних) РНК (мРНК), у послідовності нуклеотидів яких (триплетів) закодована первинна структура поліпептидних ланцюгів (послідовність розміщення амінокислотних залишків). Якщо білок має олігомерну структуру (два і більше поліпептидних ланцюгів), синтез окремих поліпептидних ланок здійснюється на кількох цистронах, які можуть бути розміщені поряд, або знаходяться на різних ділянках геному. Гени-оператори і гени-регулятори разом із групою структурних генів (цистронів) утворюють узгоджено діючі блоки – оперони, які є одиницею транскрипції.
Впродовж перших 40 років XX сторіччя біологи не мали уяви про те, що ДНК хромосом несе генетичну інформацію. Оскільки білки є основними матеріальними структурами живого, то вважалася і домінуюча роль їх в успадкуванні ознак, що вони специфічні компоненти в спадковій структурі хромосом.
Більшість дотримувалося погляду, що спадковість організму визначається білковим компонентом хромосом. А ДНК, зважаючи на просту будову і хімічний склад, не може контролювати такого складного процесу. На початку 30-х років російський генетик М.К. Кольцов дійшов висновку, що хромосома – це гігантська біологічна молекула, яка має здатність до самоподвоєння, і всі ознаки й властивості організмів зумовлені будовою білка і взаємозв’язком його молекул.
Проте поглиблене дослідження ДНК дозволило переглянути усталене уявлення щодо ролі білка в спадковості. Було доведено, що ДНК визначає генетичну специфіку організмів. Виняткове значення ДНК і РНК стало зрозумілим після встановлення незаперечного факту, що нуклеїнові кислоти є обов’язковим компонентом у процесах синтезу специфічних білків, зокрема ферментів у клітині. Експериментальними дослідженнями було показано, що ДНК властива всім хромосомам рослин, тварин, людини та є основою явища спадковості. Тільки нуклеїнові кислоти визначають специфіку будови білків.
Водночас зауважимо, що обов’язковим компонентом процесу відтворення генетичної інформації є білки. Якщо зберігання спадкової інформації і окремі стани її передачі в спрощених системах може здійснюватися без білків, то відтворення неможливе без ензимів. Не можна протиставляти функції білків і нуклеїнових кислот. Усі форми живої матерії, всі процеси відтворення і функціонування нуклеїнових кислот нерозривно пов’язані з білками.
Гіпотеза про прямі зв’язки між генами і ферментами була запропонована на початку XX ст. (1909 р.), проте тільки в 1940 р. постулат “один ген – один фермент” отримав загальне схвалення. Тепер ближче до істини теза “один ген – один поліпептидний ланцюг”, коли білок складається більше ніж з одного поліпептидного ланцюга, кожний із них синтезується окремо, і лише потім вони об’єднуються в готовий продукт.
У середині 50-х років XX століття була висунута матрична теорія синтезу білка. Згідно з нею – це складний багатоступінчастий процес. У ньому беруть участь ДНК, різні види РНК і різноманітні ферменти. Тільки інформаційна РНК відіграє роль матриці в цьому процесі. Кількість утворених на ДНК молекул іРНК визначається числом генів, що контролюють у даного організму синтез специфічних білків.
Кожний білок синтезується на своїй матриці і для нього потрібна своя особлива іРНК. Одна молекула іРНК транскрибує послідовність нуклеотидів з відрізка ДНК, рівного одному гену, і переносить цю інформацію на послідовність розміщення амінокислот у поліпептидному ланцюгу одного білка. Інформаційна РНК, проникнувши з ядра в цитоплазму і прикріпившись до рибосом, починає діяти щодо білків як матриця.
Одним із важливих досягнень у генетиці в 60-х роках було відкриття генетичного коду (Пішак, Захарчук, 2011)
Більшість генів мають до 50000 пар нуклеотидів.
Ген як одиниця генетичної інформації забезпечує такі функції:
• зберігання спадкової інформації;
• керування біосинтезом білків та інших сполук у клітині;
• редуплікації ДНК і РНК (подвоєння генів під час поділу);
• репарації (відновлення) пошкоджених ДНК і РНК;
• забезпечення спадкової мінливості клітин і організмів;
• контроль за індивідуальним розвитком клітин і організмів;
• явище рекомбінації.
Отже, за функціональним
значенням розрізняють структурні гени, які характеризуються унікальними послідовностями нуклеотидів,
що кодують свої білкові продукти, які можна ідентифікувати за допомогою
мутацій, що порушують функцію білка, і регуляторні гени - послідовності
нуклеотидів, що не кодують специфічні білки, а здійснюють регуляцію дії гена
(інгібування, підвищення активності та ін.) За впливом на фізіологічні процеси в клітині
розрізняють летальні, умовно летальні, супервітальние гени, гени-мутатори,
гени-антімутатори та ін.
Слід зазначити, що будь-які біохімічні і біологічні
процеси
в організмі знаходяться під генним контролем. Так, поділ клітин (мітоз, мейоз)
контролюється кількома десятками генів; групи генів здійснюють контроль
відновлення генетичних пошкоджень ДНК (репарація). Онкогени і гени - супресори
пухлин беруть участь упроцесах нормального
ділення клітин. Індивідуальний розвиток організму (онтогенез) контролюється
багатьма сотнями генів. Мутації
в генах призводять до зміненого синтезу білкових продуктів і порушення
біохімічних або фізіологічних процесів.
Гомеозисні мутації у дрозофіли дозволили відкрити існування
генів, нормальною функцією яких
є вибір або
підтримка певного шляху ембріонального розвитку, за яким розвиваються клітини.
Кожен шлях розвитку характеризується експресією певного набору генів, дія яких
призводить до появи кінцевого результату: очі, голова груди, черевце, крило,
ноги і т. д. Дослідження генів комплексу bithorax дрозофіли американським генетиком Льюїсом
показали, що це гігантський кластер тісно зчеплених генів, функція яких
необхідна для нормальної сегментації грудей (thorax) і черевця (abdomen).
Подібні гени отримали назву гомеобоксних. Гомеобоксние гени розташовані в ДНК
групами і виявляють свою дію строго послідовно. Такі гени виявлені і у ссавців, і вони мають
високу гомологію (схожість).
Клітини функціонують завдяки скоординованій дії генів. Так, у геномі людини у виконанні функцій бере участь різна кількість генів: синтез РНК і білків -22 %, обмін (метаболізм) - 17 %, клітинний поділ -12 %, клітинні сигнали - 12 %, захист клітини -12%; клітинні структури - 8 %.
Гени утворюють функціональні групи, які забезпечують синтез первинного продукту: ферментів, модуляторів функцій білків, рецепторів, транскрипційних факторів, внутрішньоклітинного матриксу, позаклітинного матриксу, трансмембранних переносників, гормонів, імуноглобулінів.
Найбільшу функціональну категорію складають гени, які кодують утворення ферментів (31 % загального числа), на частку модуляторів функції білків припадає 13,6 % генів, на інші категорії - менше 10 % загального числа генів.
Ген є елементарною структурно-функціональною одиницею спадковості, що визначає розвиток певної ознаки клітини або організму. Внаслідок передачі генів у ряді поколінь забезпечується спадкоємність ознак батьків.
Г. Мендель був першим, хто в 1865 р. стверджував про одиницю спадковості, він назвав її "спадковим фактором". Слово "ген" було введено В. Йогансеном у 1909 р. для позначення одиниці спадковості, що займає особливе місце (локус) у хромосомі. У 1948 р. Дж. Бідл і Е. Тейтем запропонували гіпотезу "один ген - один білок" і розглядали ген як одиницю спадкового матеріалу, що містить інформацію для утворення одного білка. Відповідно до сучасної концепції, гени - це ділянки ДНК, що мають унікальну послідовність нуклеотидів, які кодують певні ІРНК, т-РНК або р-РНК. За допомогою трьох різновидів РНК відбувається синтез білків, які здійснюють метаболізм і зумовлюють розвиток ознак. Ген — це мінімальна кількість спадкового матеріалу, що необхідний для синтезу певної РНК. Мінімальні за розміром гени складаються з кількох десятків нуклеотидів, наприклад, гени т-РНК. Гени великих макромолекул р-РНК та і-РНК містять кілька сот і навіть тисяч нуклеотидів. Наявність генів виявляється за присутності певних білків клітини або ознак організму.
Більша частина генів клітин знаходиться в репресованому (неактивному) стані. Приблизно 5-10 % генів дерепресовані (активні) і можуть бути транскрибовані. Кількість і якість функціонуючих генів залежить від тканинної належності клітин, періоду їх життєвого циклу і стадії індивідуального розвитку.
Класифікація генів.
Накопичені знання про структуру,
функції, характер взаємодії, експресії, мутабільності та інші властивості генів
породили кілька варіантів класифікації генів.
За місцем локалізації генів у структурах
клітини розрізняють розташовані в хромосомах ядра ядерні гени і цитоплазматичні
гени, локалізація яких пов'язана з хлоропластами і мітохондріями.
Будова гена еукаріотів у хромосомах.
Кожна інтерфазна хромосома має одну молекулу ДНК, що містить велику кількість гені. Геном людини містить 3,5 х 109 нуклеотидних пар, яких достатньо для утворення 1,5 млн. генів. Однак дослідження показують, що організм людини має приблизно 35000-40000 генів. Це означає, що в організмі використовується тільки близько 1 % нуклеотидних послідовностей ДНК, тільки 1 % записаної інформації. Значна частина геному використовується для здійснення процесів ембріонального розвитку, диференціювання, росту і надалі не експресується. Інша частина надлишкової ДНК входить до складу інтронів. І ще більша частина ДНК подана численними повторами послідовностей, що не мають змісту (сателітна ДНК) ). Таким чином, ДНК еукаріотів можна розділити на два типи послідовностей нуклеотидів. Це неповторювані (унікальні) та повторювані послідовності. До першого типу відносяться гени, що кодують білки. Повторювані послідовності зустрічаються з частотою від 2 до 107 на одну клітину. У ссавців більше половини геномної ДНК належить до типу унікальних послідовностей.
Гени в ДНК розташовані у лінійному порядку. Кожний ген має своє місце розташування (локус). Теломерні та центромерні ділянки хромосом не містять генів. Аналогічне розташування алелів характерне для гомологічної хромосоми.
За способами організації нуклеотидів у ДНК, її можна розділити на такі фрагменти: 1) структурні гени; 2) регуляторні гени; 3) сателітна ДНК; 4) спейсерна ДНК; 5)кластери генів;6)повторювані гени.
Структурна організація нуклеотидних послідовностей (генів) у ДНК: 1 - повторювані групи (кластери) структурних генів (наприклад, гістонових білків); 2 - міжгенна (спейсерна) ділянка; 3 - ділянка з великою кількістю повторів (сателітна ДНК); 4 - ділянки регуляції активності структурного гена (регуляторний ген); 5 - структурний ген; Є - екзони; 7 - інтрони; 8 - ДНК; 9 - повторювані гени.
У залежності від структури та функцій нуклеотидні послідовності можуть бути кількох типів.
Структурні гени несуть інформацію про структуру певних поліпептидів. Із цих ділянок ДНК транскрибується ІРНК, яка спрямовує синтез білків. Регуляторні гени контролюють і регулюють процес біосинтезу білка. Сателітна ДНК містить велику кількість повторюваних груп нуклеотидів, що не мають змісту і не транскрибуються. Поодинокі гени серед сателітної ДНК, звичайно, мають регуляторну або посилювальну дію на структурні гени. Кластери генів - це групи різних структурних генів у певній ділянці хромосоми, об'єднані загальними функціями. Наприклад, кластери п'ятьох різних гістонів повторюються 10-20 разів. Між такими кластерами знаходяться великі спейсерні ділянки, що не транскрибуються. їх роль до кінця не з'ясована.
Повторювані гени - один і той самий ген багаторазово повторюється (декілька сотень раз); не відокремлюючись один від одного, вони створюють тандеми. Наприклад, гени рРНК.
Встановлення структури генів еукаріотів є одним із головних відкриттів кінця XX ст. Доведено, що структурний ген, який кодує білок, має дуже складну будову. Розглянемо принцип його організації на прикладі гена (3-ланцюга гемоглобіну . На початку гена розташовані ділянки регуляції гена. Спочатку розташована ділянка промотора, відповідальна за приєднання РНК-полімерази та наступної ініціації транскрипції. Неспецифічні ділянки регуляції називають TATA-БОКС, що складається з багаторазово повторюваного тиміну й аденіну. Встановлено, що РНК-полімераза приєднується до цієї послідовності так, що її активний центр розташовується над першим нуклеотидом, що зчитується. Ця ділянка складається із сайту-розпізнавання, сайту-зв'язування і сайту-ініціації. Комбінація нуклеотидів у промоторі специфічна і при порушенні рамки зчитування утворює "стоп"-кодони, що призводить до припинення транскрипції. У ділянці промотора розташований оператор, який може приєднувати фактори регуляції транскрипції. Далі розташована КЕП-послідовність ТТГЦТТАЦ, на якій ініціюється транскрипція й утворюється 5'-початкова ділянка РНК (сайт-ініціації транскрипції). Згодом розташований кодон ТАЦ (сайт-ініціації трансляції) з'являється в утвореній ІРНК. Між сайтом транскрипції і сайтом трансляції лежить проміжна ділянка ДНК, що складається з 50 пар основ і називається лідерною послідовністю. Далі з'являється частина структурного гена, що складається з екзонів і інтронів. Спочатку розташований екзон, що містить 90 пар основ, які кодують з першої по ЗО амінокислоти (3-ланцюга гемоглобіну. Далі знаходиться інтрон, що складається із 130 пар основ, він не кодує амінокислоти. За ним міститься екзон, що складається із 222 пар основ, що кодують амінокислоти з 31 по 104. Далі розташований інтрон, що складається з 850 пар основ, за ним екзон, що містить 126 пар основ, які кодують амінокислоти 105-146. Після цього - кодон-термінації трансляції ТАА. Потім трейлер і сайт поліаденілування ААТААА, який необхідний для приєднання до РНК-транскрипту "хвоста" полі-А, який складається приблизно з 200-300 аденілових залишків. Ця ділянка ДНК необхідна для припинення транскрипції. Послідовність термінатора транскрипції починається відразу за полі-А ділянкою і складається приблизно із 1000 нуклеотидів. Ця послідовність разом із полі-А зупиняє процес транскрипції. У межах послідовності транскрибуючого З'-кінця ДНК на відстані 600-900 нуклеотидів.
Будова активного центру РНК-полімерази.
Транспортна РНК (тРНК). Молекули т-РНК утворюються на спеціальних генах. Транспортні РНК короткі, однониткові, мають форму листка конюшини завдяки комплементарному сполученню основ на різних ділянках ланцюга, складаються з невеликого числа нуклеотидів - 75-90. Від загальної маси РНК на т-РНК припадає близько 10-15 %. Молекули т-РНК переносять до місць синтезу білків тільки відповідні їм амінокислоти з цитоплазми. Кожній амінокислоті відповідає своя т-РНК внаслідок особливостей нуклеотидної послідовності та просторової структури. Молекули т-РНК мають чотири важливі ділянки: а) транспортну; б) антикодон; в) ділянку приєднання фермента; г) ділянку зв'язування з рибосомою.
До транспортної ділянки приєднується специфічна амінокислота. Вона утворена двома комплементарними кінцевими ділянками РНК, 3'-кінець якої складається з семи пар основ, він довший і формує одноланцюгову ділянку, що закінчується послідовністю ЦЦА з вільною ОН-групою. До цієї групи приєднується амінокислота, що транспортується.
Будова молекули т-РНК: 1 - петля 1,2- петля 2; 3 - петля 3; 4 - акцепторний кінець; 5 - ОН 3'-кінець; 6-5'-кінець; 7-антикодон; 8 - модифікаційні нуклеотиди.
Модель т-РНК, иллюстрація с сайту sciencephoto.com
Антикодон складається з п'яти нуклеотидів. У центрі - три специфічних рибонуклеотиди (триплет). Азотисті основи антикодона мають комплементарний триплет на ланцюгу і-РНК, цей триплет називається кодоном. У період синтезу білка антикодон знаходить відповідний йому кодон на ІРНК і тимчасово приєднується до нього водневими зв'язками.
Ділянка приєднання ферменту - це спеціальна частина молекули т-РНК для специфічного зв'язування з ферментом аміноацил-т-РНК-синтетазою, що каталізує приєднання амінокислоти до молекули т-РНК.
Ділянка зв'язування з рибосомою - особлива частина молекули (певна послідовність нуклеотидів) т-РНК, що потрібна для прикріплення до рибосоми.
Ліворуч наведена схема спарювання основ у відповідних ділянках молекули (структура "конюшинового листка"), а праворуч - тривимірна модель конфігурації молекули. Один кінець молекули (акцепторний) призначений для приєднання амінокислот, а другий містить антикодон, що складається з трьох нуклеотидів.
Рибосомальна РНК (рРНК). Рибосомальна РНК утворюється на спеціальних генах ДНК в ядерці. Рибосомальна РНК - велика одноланцюгова розгалужена молекула, що включає 3000-5000 нуклеотидів. Із загальної маси РНК на її частку припадає до 90 %. У каріоплазмі р-РНК і різні білки об'єднуються у співвідношенні 1:1 для утворення малих і великих субодиниць рибосом.
Рибосомальна РНК утворює структурний каркас рибосоми, їй належить важлива роль у процесі синтезу білків. Рибосомальна РНК забезпечує зв'язування іРНК з рибосомами за допомогою певних послідовностей нуклеотидів. Таким чином встановлюється початок і рамка зчитування інформації з і-РНК. Багато білків рибосом виконують не тільки структурну, але й ферментативну функцію.
Таким чином, чотири різновиди нуклеїнових кислот мають багато спільного в будові, але виконують різноманітні функції.
Генетичний апарат — це тонко регульована система. Відомо, що гени не проявляють постійної активності. Ген перебуває в неактивному стані, але коли є необхідність, він активується, а це, зокрема, зумовлює синтез відповідного білка. Таким чином, клітинам властивий механізм, що контролює кількість будь-якого ферменту в певний проміжок часу. Синтез білків регулюється генетичним апаратом і факторами внутрішнього і зовнішнього середовища (Пішак, 2009).
Концепція оперону в регуляції генів у прокаріотів
У 1961 р. французькі біологи Ф. Жакоб і Ж. Моно запропонували механізм регуляції генів, який було названо гіпотезою оперона. Вони виявили, що додавання лактози до культури Е.соlі індукує утворення відразу трьох ферментів: галактозидази, пермеази і трансацетилази, необхідних клітині для розщеплення лактози до глюкози і галактози.
Франсуа Жакоб та Жак Люсьєн Моно - лауреати Нобелівської премії з фізіології та медицини в 1965 році (спільно з Андре Львовом ) «за відкриття в галузі генетичного контролю синтезу ферментів і вірусів»
Гени, що кодують ці ферменти, межують один з одним у хромосомі, їх назвали структурними генами, або цистронами. Вони транскрибуються РНК-полімера-зою в одну довгу і-РНК, що має кодони для всіх трьох ферментів. Інформаційна РНК, що транскрибується з декількох генів, називається поліцистронною. Функція цих цистронів контролюється ділянкою молекули ДНК, яка називається оператором. Операторний локус — це певна ділянка послідовності нуклеотидів довжиною 27 пар основ. Даний сегмент ДНК розташований між промотором, до якого перед початком транскрипції приєднується РНК-полі-мераза, і початком першого структурного гена (3-галак-тозидази. Цистрон синтезує ІРНК, якщо оператор увімкнений, і припиняє синтез, коли він вимкнений. Оператор вмикається або вимикається білком, який назвали репресором, синтезованим регуляторним геном. Репресор або зв'язується з оператором і пригнічує його активність, або не зв'язується з ним, дозволяє виявляти активність структурним генам. Таким чином, репресор є негативним регулятором. Усі названі елементи функціонування генів входять до складу оперона.
Репресор не є обов'язковим для функціонування оперона, але він необхідний для регуляції його роботи. Таким чином, значення гена-регулятора полягає в тому, щоб за допомогою білка-репресора керувати функціонуванням структурних генів.
Отже, оперон - це послідовність спеціальних функціональних сегментів ДНК та структурних генів, які кодують синтез певної групи білків одного метаболічного ланцюга, наприклад, ферментів гліколізу. Регульована одиниця транскрипції складається з наступних структурних частин: 1) ген-регулятор, який контролює утворення білка-репресора; 2) промотор - ділянка ДНК, до якої приєднується РНК-полімераза і з якої розпочинається транскрипція; 3) оператор - ділянка промотора, яка може зв'язувати репресор; 4) структурні гени - ділянки ДНК, які кодують іРНК конкретних білків; 5) термінаторна ділянка ДНК, яка несе сигнал про зупинку транскрипції (Пішак, 2009).
Схема механізму генетичного контролю синтезу ферментів у бактерій
(за: Жакоб і Моно, 1961)
Особливості експресії генів в еукаріотів.
Принцип експресії та її регуляції однаковий як у прокаріотів, так і в еукаріотів. Однак останні, особливо багатоклітинні. - більш складні організми, тому експресія їх генів складніша і дещо відрізняється за деталями.
У еукаріотів транскрипція здійснюється з ділянок, подібних оперона прокаріотів і також складаються з регуляторних і структурних генів, однак у оперонів еукаріот є ряд особливостей:
1. До складу оперона еукаріот входить лише один структурний ген (а не кілька - як у прокаріотів).
2. Оперон еукаріот майже завжди містить тільки структурний ген, а інші гени розкидані по хромосомі або навіть розташовані у різних хромосомах.
3. Оперон еукаріотів складається з розміщених почергово один з одним значущих (екзонів) і незначущих (інтронів) ділянок. При транскрипції інформація зчитуються як екзонів, так і з інтронів, а потім у ході процесингу відбувається вирізання інтронів (сплайсинг).
Генетичний код ДНК. Унікальність кожної клітини полягає в унікальності її білків. Клітини, що виконують різні функції, здатні синтезувати свої власні білки, використовуючи інформацію, що записана в молекулі ДНК. Ця інформація існує у вигляді особливої послідовності азотистих основ у ДНК і називається генетичним кодом.
Знання про білки і нуклеїнові кислоти накопичувалися протягом тривалого часу. До середини XX століття їх стало достатньо для того, щоб висунути перші ідеї про природу генетичного коду. До 1953 року було відомо, що окремі білки мають унікальні амінокислотні послідовності і що, мабуть, не існує ніяких обмежень щодо порядку амінокислот в поліпептиді.. Були дані про те, що білки складаються приблизно з 20-23 різних амінокислот, однак списки розрізнялися в різних авторів. У генетиці була сформована концепція «один ген - один фермент» (більш точно «один ген - один поліпептид»), також було встановлено, що гени це ДНК, а не білки.
У 1953 році Уотсон і Крик опублікували дві роботи: у першій йшлося про вторинну структуру ДНК, а в другій - про можливий механізм копіювання ДНК шляхом матричного синтезу. В останній роботі, вони вказали на те, що певна послідовність азотистих основ є кодом, який несе генетичну інформацію. Тепер належало вирішити питання про те, як ця послідовність основ визначає послідовність амінокислот у білках.
Хоча деякі припущення про механізм кодування висловлювалися і раніше, першим хто запропонував абстрактну гіпотезу кодування, а також спосіб її перевірки, був радянський і американський фізик-теоретик Георгій (Джордж) Гамов. У 1954 році Гамов опублікував свою роботу, в якій запропонував у якості механізму кодування встановлення відповідності між бічними ланцюгами амінокислот і ромбоподібними «дірками», утвореними чотирма нуклеотидами ДНК. Пізніше цей код був названий ромбічним або бубновими.
Виходячи зі своєї моделі Гамов припустив, що код може бути триплетним. Незважаючи на всі очевидні недоліки цієї гіпотези (наприклад, ідея про те, що структура білка безпосередньо кодується ДНК) вона стала першою серед багатьох більш чи менш абстрактних гіпотез про природу коду.
Гамов був першим, хто представив проблему кодування не як біохімічну, а просто як завдання перекладу їх з чотиризначної системи в двадцятизначну.
Георгій (Джордж) Гамов - американський фізик-теоретик, космолог українсько-російського походження, автор першої абстрактної теорії кодування ДНК
За кілька наступних років було запропоновано велику кількість різних моделей. Всі запропоновані коди можна розділити на дві категорії: ті, що перекриваються (один нуклеотид входить до складу більш ніж одного кодону) і ті, що неперекриваються. До тих, що перекриваються відносяться трикутний, мажорно-мінорний і послідовний коди Гамова з колегами. У міру накопичення даних про амінокислотну послідовность білків, стало ясно, що порядок амінокислот в них може бути будь-яким, тому потрібно віддавати перевагу кодами, що неперекриваються. Найбільш відомими кодами, що неперекриваються є комбінаційний код Гамова і Ічаса і «код без ком» Крика, Гріффіта і Оргела. Згідно комбінаційного коду амінокислоти кодуються триплетами нуклеотидів, при цьому значення має не порядок нуклеотидів в триплеті, а його склад (наприклад, триплети ТТА, ТАТ і АТТ кодують одну і ту ж амінокислоту). «Код без ком» дає пояснення тому, як вибирається рамка зчитування. Відповідно до цієї моделі, деякі триплети мають сенс (відповідають амінокислотам), а деякі - ні. При цьому код влаштований таким чином, що якщо розташувати буд-які значущі триплети один за одним, то триплети в інший рамці зчитування будуть безглуздими. Крик з співавторами показали, що можна підібрати триплети, що відповідають цим вимогам, і що їх рівно 20. Незважаючи на те що самі автори сумнівалися в обґрунтованості цієї моделі, вона отримала визнання і панувала протягом наступних п'яти років.
Тим не менше на початку 60-х років XX століття нові дані виявили неспроможність гіпотези «коду без ком». Тоді експерименти показали, що кодони, що вважалися Криком безглуздими, можуть провокувати білковий синтез в пробірці і до 1965 року був встановлений сенс всіх 64 кодонів. Виявилося, що деякі кодони просто надлишкові, але є цілий ряд амінокислот, що кодуються двома, чотирма або навіть шістьма триплетами (Електронний ресурс: http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D0%BA%D0%BE%D0%B4).
М. Гамов ще в 1954 р. припустив, що кодування інформації в ДНК може здійснюватися сполученням декількох нуклеотидів. Порядок азотистих основ у і-РНК, що побудована відповідно до матриці ДНК, визначає порядок зв'язування амінокислот у синтезованому поліпептиді. Встановлено, що кожна амінокислота кодується послідовністю трьох азотистих основ (триплетом, або кодоном). Одне з визначних досягнень біології XX століття - розшифрування триплетного генетичного коду. Генетичний код є послідовністю триплетів у молекулі ДНК, що контролює порядок розташування амінокислот у молекулі білка.
Послідовність нуклеотидів у молекулі ДНК кодує певну послідовність нуклеотидів в ІРНК. Кожний триплет нуклеотидів кодує одну конкретну амінокислоту. Внаслідок трансляції, на основі генетичного коду на рибосомах синтезується необхідний білок.
Чотири азотистих основи в комбінаціях по 3, тобто 43, можуть утворити 64 різних код они. У молекулі ДНК кожна основа входить до складу лише одного кодону. Тому код ДНК не перекривається. Кодони розташовуються один за одним безперервно. Оскільки можливих варіантів кодонів 64, амінокислот - 20, то певні амінокислоти можуть кодуватися різними триплетами (кодонами-синонімами). Внаслідок цього генетичний код називають виродженим або надмірним.
Є декілька амінокислот, які кодуються різними кодонами (наприклад, амінокислота аланін кодується триплетами ЦГА, ЦГГ, ЦГТ, ГЦГ). Поряд з ними є амінокислоти, які кодуються двома триплетами, і тільки дві амінокислоти - одним. Однак кожний триплет кодує тільки одну певну амінокислоту, що свідчить про його специфічність. Крім того, деякі триплети (АТТ, АЦТ, АТЦ) не кодують амінокислоти, а є своєрідними "точками" термінації процесу зчитування інформації. Якщо процес синтезу доходить до такої "точки" в молекулі ДНК, синтез даної РНК припиняється. Встановлено кодони для всіх 20 амінокислот.
Послідовність триплетів у ДНК визначає порядок розташування амінокислот у молекулі білка, тобто має місце колінеарність. Це означає, що положення кожної амінокислоти в поліпептидному ланцюгу залежить від положення триплету в ДНК. Численними дослідженнями встановлена універсальність генетичного коду. Він однаковий для всіх живих організмів, від бактерій до рослин і ссавців. Тобто у всіх живих організмів той самий триплет кодує ту ж амінокислоту. Це один з найбільш переконливих доказів спільності походження живої природи.
Таким чином, генетичний код ДНК має такі фундаментальні характеристики: 1) триплетність (три сусідні азотисті основи називаються кодоном і кодують одну амінокислоту); 2) специфічність (кожний окремий триплет кодує тільки одну певну амінокислоту); 3) неперекривність (жодна азотиста основа одного кодону ніколи не входить до складу іншого кодону); 4) відсутність розділових знаків (генетичний код не має "пунктуаційних позначок" між кодуючими триплетами у структурних генах); 5) універсальність (даний код он у ДНК або ІРНК визначає ту саму амінокислоту в білкових системах всіх організмів від бактерій до людини); 6) надмірність (одна амінокислота часто має більш ніж один кодовий триплет); 7) колінеарність (ДНК є лінійним полінуклеотидним ланцюгом, а білоклінійним поліпептидним. Послідовність амінокислот у білку відповідає послідовності триплетів у його гені. Тому ген і поліпептид, який він кодує, називають колінеарними); 8) відповідність гени - поліпептиди (Пішак, 2009)
Більшість організмів переважно користуються одним варіантом коду, так званим «стандартним кодом», проте це не завжди є правилом. Перший приклад відхилення від стандартного генетичного коду був відкритий в 1979 році при дослідженні генів мітохондрій людини. З того часу було знайдено декілька подібних варіантів [2], включаючи різні альтернативні коди мітохондрій [3], наприклад, прочитування стоп-кодону стандартного коду UGA як кодону, що визначає триптофан у мікоплазм. У бактерій і архей GUG і UUG часто використовуються як стартові кодони. В деяких випадках гени починають кодувати білок із старт-кодону, який відрізняється від зазвичай використовуваного даним видом. У деяких білках нестандартні амінокислоти, такі як селенцистеїн і піролізин вставляються рибосомою, під час зчитування стоп-кодону за умовами наявності певних послідовностей в м-РНК після кодону. Селенцистеїн часто розглядається як 21-а, а піролізин - 22-а амінокислоти, що входять до складу білків (Електронний ресурс
Секторний варіант запису, внутрішнє коло — 1-а основа кодона (от 5'-кінця)
Утворення і-РНК: 1 - синтезована ІРНК; 2 - РНК-полімераза; 3 - подвійна спіраль ДНК; 4 - ДНК-геліказа; 5 - другий ланцюг, не матричний; б - дестабілізувальний білок.
Генетичний код і-РНК. При транскрипції закодована інформація з матричного ланцюга ДНК переписується на комплементарну молекулу ДНК. При цьому генетичний код ДНК перекладається в генетичний код і-РНК. Код і-РНК комплементарний коду ДНК. Наприклад, якщо в матричному ланцюгу ДНК розташовані ААГЦТАТГЦЦААА, то в молекулі і-РНК знаходиться УУЦГАУАЦГГУУУ. Таким чином, ті ж самі амінокислоти кодуються на молекулі і-РНК комплементарними триплетам. Характеристики коду і-РНК такі ж, як і для ДНК. Крім цього, і-РНК має старт-кодон АУЦ, який вмикає початок синтезу, а стоп-кодони УАА, УАГ, УГА зупиняють процес трансляції.
Процес зчитування інформації відбувається в одному напрямку. Так, якщо в молекулі ІРНК азотисті основи будуть розташовуватися в такому порядку: ААА ЦЦЦ УГУ УЦУ.., це означає, що послідовно закодовані такі амінокислоти: лізин, пролін, цистеїн, серин. Саме в цій послідовності вони повинні знаходитися в поліпептидному ланцюгу при синтезі білка. Якщо в першому триплеті ІРНК буде втрачений один аденін, то порядок основ набуде такого вигляду: АА ЦЦЦ УГУ УЦУ... В результаті склад всіх триплетів зміниться. Перший триплет стане не ААА, а ААЦ. Подібний триплет кодує аспарагінову амінокислоту, а не лізин, як раніше. Другий триплет стане вже не ЦЦЦ, а ЦЦУ і т. д. Те ж відбувається при вставці нових основ. Таким чином, зникнення або вставка лише однієї основи може порушити синтез певної молекули білка. Молекули ДНК кожної клітини містять інформацію для синтезу всіх необхідних їй білків. Молекули ДНК містяться в ядрі, а синтез білків відбувається в цитоплазмі. ДНК не може переміщуватися до місця синтезу білків у цитоплазму. Вона передає інформацію про структуру білків за участю специфічних молекул і-РНК, що утворюються на ДНК і переносяться з ядра в цитоплазму до місця синтезу білків. У синтезі білків беруть участь також інші РНК (т-РНК і р-РНК). Утворення молекул РНК на матриці ДНК називається транскрипцією (від лат. transcriptio - переписування). Цей процес відбувається, в основному, під час інтерфази. На генах матриці ДНК утворюються всі три типи РНК - інформаційна, транспортна і рибосомальна.
Зчитування спадкової інформації з генів регулюється спеціальними білками. Зокрема, гістони не тільки забезпечують структурну організацію хроматину, але є репресорами, тому що перешкоджають зчитуванню генетичної інформації. Початок зчитування генетичної інформації пов'язаний зі звільненням певної ділянки ланцюга ДНК (гена) від гістонів, після чого ген активується і з нього починається зчитування спадкової інформації. Негістонові білки мають здатність розпізнавати гени, і цим забезпечується синтез необхідних білків.
Основні етапи транскрипції:
1. Ініціація. За сигналом з цитоплазми певна ділянка подвійної спіралі ДНК розкручується і розділяється на два ланцюги. Це відбувається за допомогою ферменту гелікази, що зв'язується з ДНк. Ферменти РНК-полімерази забезпечують утворення РНК, що зростають у довжину по мірі просування ферменту уздовж нитки ДНК.
РНК-полімераза починає синтезувати новий ланцюг біля спеціального старт-сигналу ДНК, що називається промотором, і закінчує його біля стоп-сигналу (сигнал термінації), після чого полімераза та синтезований готовий ланцюг РНК відокремлюються один від одного. Ділянка ДНК між промотором і термінатором, яка транскрибується, називається одиницею транскрипції. . Молекула РНК, яка при цьому утворюється, називається первинним транскриптом або про-іРНК.
Швидкість полімеризації при 37 °С складає приблизно ЗО нуклеотидів за 1 сек., тому синтез ланцюга РНК довжиною 5000 нуклеотидів триває близько 3 хв.
Один з двох ланцюгів ДНК, на якому йде транскрипція, називається кодуючим ланцюгом. Другий ланцюг ДНК називається ланцюгом, що не кодує. Для різних білків кодувати можуть як один, так і другий ланцюги ДНК.
Процесинг. Молекулярні механізми, пов'язані з "дозріванням" різних типів РНК, називаються процесингом. Вони здійснюються в ядрі перед виходом РНК із ядра в цитоплазму.
У процесі "дозрівання" ІРНК спеціальні ферменти вирізають інтрони і зшивають активні ділянки, що залишилися (екзони). Цей процес називається сплайсингом. Тому послідовність нуклеотидів у дозрілої ІРНК не є цілком комплементарною нуклеотидам ДНК. В ІРНК поруч можуть стояти такі нуклеотиди, комплементарні яким нук-леотиди в ДНК знаходяться один від одного на значній відстані.
Сплайсинг - дуже точний процес. Його порушення змінює рамку зчитування при трансляції, що призводить до синтезу іншого пептиду. Точність вирізання інтронів забезпечується розпізнаванням ферментів певних сигнальних послідовностей нуклеотидів у молекулі про-іРНК.
Процес синтезу білків (трансляція), як реплікація і транскрипція, умовно поділяється на три етапи: ініціацію, елонгацію і термінацію.
Схема трансляції
1. Ініціація. Розпочинається з активації амінокислот. Амінокислоти (АК) в цитозолі клітини вступають в реакцію з АТФ. Цей комплекс називається активованою амінокислотою. Так формується АК-АМФ-комплекс. Реакцію каталізує фермент аміно-ацил-тРНК-синтетаза. Для кожної амінокислоти існує свій особливий фермент.
Процеси ініціації вимагають присутності специфічних факторів ініціації, що мають білкову природу та володіють регуляторною активністю.
2. Елонгація (подовження поліпептидного ланцюга). Друга, навантажена, наприклад, проліном, т-РНК з'єднується з рибосомою на ділянці А. її антикодон зв'язується з комплементарним кодоном ланцюга ІРНК. На ділянці П метіонін звільняється від своєї т-РНК і з'єднується пептидним зв'язком з проліном Процес каталізує фермент пептидилтрансфераза. У цьому процесі зв'язок між першою амінокислотою та її т-РНК розривається і -СООН група першої амінокислоти утворює пептидний зв'язок з вільною -NH2 групою другої амінокислоти. Таким чином, друга т-РНК уже несе дипептид. Перша т-РНК, тепер вільна, відокремлюється від П-ділянки рибосоми і повертається у загальний фонд т-РНК у цитоплазмі. Тут вона може знову зв'язуватися зі своєю амінокислотою.
Будова рибосоми.
2. Термінація (закінчення синтезу та вивільнення поліпептидного ланцюга). У кінці ланцюга і-РНК знаходиться один із "стоп"-кодонів (УАА, УАГ, УГА). Вони не розпізнаються жодною т-РНК. Фактор термінації (спеціальний білок) приєднується до цього кодону і блокує подовження поліпептидного ланцюга. Як наслідок, до останньої амінокислоти синтезованого білка приєднується вода і її карбоксильний кінець відокремлюється від т-РНК. Зв'язок між останньою т-РНК і поліпептидним ланцюгом розривається спеціальними ферментами - факторами вивільнення. Рибосома відокремлюється від ланцюга і РНК і розпадається на дві субодиниці. Синтезований поліпептид звільняється і потрапляє в цитоплазму.
Кожна молекула ІРНК транскрибується декілька разів, а згодом руйнується. Середній час "життя" і-РНК складає приблизно 2 хв. Вибірково руйнуючи старі й створюючи нові ІРНК, клітина може регулювати як якісний, так і кількісний склад білків, а значить, рівень і спрямованість метаболізму
.
Етапи біосинтезу білка
Значення трансляції.
Білковий синтез є основою поділу, диференціювання, росту й розвитку, забезпечує особливості метаболізму і функцій. Білки сприяють об'єднанню клітин у групи, що призводить до утворення тканин і органів. Будь-які порушення трансляції та синтезу білків спричиняють порушення метаболізму, функцій, що призводить до появи хвороб.
Посттрансляційна модифікація білка як основа для їх функціонування. Вивільнений поліпептид - це прямолінійна молекула, що не має метаболічної активності. Синтезовані з амінокислот поліпептидні ланцюги надалі можуть надходити в цитоплазму, ендоплазматичну сітку або комплекс Гольджі, де завершується формування білкової молекули. У процесі "дозрівання" вона може втрачати деякі кінцеві амінокислоти за допомогою ферменту екзопептидази, а згодом утворювати вторинну і третинну структури. Молекули можуть об'єднуватися з іншими поліпептидами для утворення четвертинної структури складних білків. Синтезовані молекули об'єднуються з вуглеводними або ліпідними молекулами, вбудовуються в біомембрани або інші комплекси клітини.
Процеси зміни початкової структури поліпептиду та формування нової називаються посттрансляційною модифікацією. Внаслідок цього білки набувають специфічних властивостей і функціональної активності.
Відкриття явища переривчастості гена еукаріотів сприяло формуванню уяви про мозаїчну будову гена - коли кодуючі послідовності ДНК у межах того ж гена розділяються некодуючими вставками з неінформаційної, "мовчазної" ДНК. Кодуючі ділянки отримали назву — екзони, а неінформаційний матеріал - інтрони.
Така будова гена вказує, що функціональні частини гена роз'єднані, що ген не є неподільною одиницею не тільки щодо рекомбінацій та мутацій, але й стосовно своїх функціональних властивостей.
Відкриття екзонно-інтронної організації генів сприяло обґрунтуванню того, що поряд з міжгенною існує і внутрішньогенна функціональна взаємодія. Ген (базиген) складається з окремих ділянок - центрів, названих трансгенними, які мають схожі функції. Між трансгенами одного гена існують такі ж алельні взаємозв'язки, як і між окремими функціонально різними генами.
Для синтезу білка весь ген, зокрема екзони й інтрони, транскрибується в довгу молекулу РНК (первинний транскрипт). Перш ніж покинути ядро, ця молекула РНК комплексом ферментів здійснює процесинг - видаляє всі послідовності інтронів. Зріла молекула РНК стає значно коротшою (майже в 10 разів у порівнянні з первинним транскриптом), виходить у цитоплазму у вигляді м-РНК і бере участь у синтезі білка.
Отже, присутність в еукаріотів численних інтронів полегшує генетичну рекомбінацію між екзонами і забезпечує більшу гнучкість у синтезі білка. Виникнення нових білків збільшує ефективність еволюції організмів.
З вищевикладеного випливають висновки:
- біосинтез білків відбувається в цитоплазмі клітини на спеціальних органелах – рибосомах;
- кожна рибосома має велику і малу субодиниці, які відіграють важливу роль на різних етапах біосинтезу білків;
- біосинтез білка відбувається в чотири етапи:
- на першому етапі, у процесі траскрипції на матриці ДНК синтезуються всі необхідні для біосинтезу білка РНК;
- матричні (інформаційні) РНК після транскрипції зазнають процесу посттранскрипційної модифікації: у процесі сплайсингу з новоутвореної іРНК вирізаються неінформаційні фрагменти – інтрони і зшиваються інформаційні ділянки – екзони;
- модифікована і-РНК у комплексі з білками (у вигляді інформосом) виходить з ядра в цитоплазму;
- рибосомальна РНК (р-РНК) необхідна для побудови рибосом, де вона утворює комплекси з різними білками;
- транспортна РНК (тРНК) бере участь у процесі активації амінокислот;
- на другому етапі, який називається рекогніція, відбувається активація амінокислот за допомогою тРНК і ферменту аміноацил-т-РНК-синтетази;
- на третьому етапі, у процесі трансляції, відбувається зчитування інформації з і-РНК і перенесення її на амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга;
- у процесі трансляції рибосома стрибкоподібно пересувається триплетними кроками, у результаті чого до і-РНК приєднуються все нові комплекси тРНК-амінокислота і нарощується поліпептидний ланцюг;
- на четвертому етапі синтезований поліпептидний ланцюг набуває вторинної, третинної, а в деяких випадках і четвертинної структури (процес посттрансляційної модифікації).
Для синтезу білка необхідно: 1) енергія (у вигляді АТФ у мітохондріях); 2) відповідні ферменти; 3) інформація про структуру білка (у ДНК, а потім в і-РНК); 4) амінокислоти і відповідні їм т-РНК; 5) рибосоми. Молекули білка синтезуються в клітині впродовж 1-2 с. Синтез білків у клітині відбувається в інтерфазі – період між її поділом.
Мобільні генетичні елементи.
Тривалий час вважали, що всі нуклеотидні послідовності мають стале розташування й опосередковано, через і-РНК, беруть участь у синтезі поліпептидів. Американський вчений-генетик Барбара Мак Клінток, вивчаючи природу різного забарвлення зерен кукурудзи в одному качані, зробила припущення, що існують так звані мобільні гени, які контролюють пігментацію зерен.
Б. Мак-Клінток (Barbara McClintock) (нар. у 1902 р.)
Цей ген розташований в гетерохроматинній ділянці хромосоми і коли він перебуває поруч з геном, відповідальним за пігментацію, то блокує його дію. Стрибаючий ген (хромосомний дисоціатор) регулярно викликає розриви у суміжних з ним ділянках хромосом. Справедливість такої гіпотези була експериментально підтверджена на інших генетичних моделях (дрозофіли, миші та ін.) ДНК багатьох видів містять мобільні (рухомі) генетичні елементи послідовності, здатні "стрибати" з одної ділянки ДНК в іншу і в цих нових місцях залишати свої копії, збільшуючи тим самим генетичний матеріал. Така думк була спростована повідомленнями, що лише невелика частина ДНК (у клітинах людини близько 1 %) дійсно кодує білки. Доведено, що в межах молекули ДНК існують некодуючі нуклеотидні послідовності, які не містять ніякої інформації щодо білкового продукту.
Кожний з мобільних генів складається з декількох тисяч ланок. На обох кінцях такого елементу розташовані однакові ділянки. Вони забезпечують рухливість генів і включають ген у роботу. Мобільні генетичні елементи забезпечують підвищений синтез РНК і виконують наступні функції: є важливим фактором біологічної еволюції;
1) утворюють новий генетичний матеріал, який може використовуватися для формування нових генів;
2)впливають на мінливість організму;
3) порушують роботу генетичного апарату, що призводить до утворення ракових клітин.
Сучасний стан досліджень теорії гена.
Внаслідок досліджень елементарних одиниць спадковості виникли поняття, що носять загальну назву теорії гена. Основні положення цієї теорії такі:
1. Ген займає певну ділянку (локус) у хромосомі.
2. Ген (цистрон) C частина молекули ДНК, що має певну послідовність нуклеотидів і є функціональною одиницею спадкової інформації. Кількість нуклеотидів, які входять до складу різноманітних генів, різна.
3. Всередині гена можуть відбуватися рекомбінації (відповідні ділянки цистрона рекони) і мутації (відповідні ділянки цистрона мутони).
4. Існують структурні і регуляторні гени.
5. Структурні гени кодують синтез білків.
6. Регуляторні гени контролюють і спрямовують діяльність структурних генів.
7. Ген не бере участі в синтезі білків, він є матрицею для утворення посередників різних молекул РНК, які безпосередньо беруть участь у синтезі.
8. Розташування триплетів із нуклеотидів у
структурних генах колінеарне до амінокислот у поліпептидному ланцюгу, який кодується даним геном.
9. Молекули ДНК здатні до репарації, тому не всі пошкодження гена ведуть до мутації.
10. Генотип є дискретним (складається з окремих генів), але функціонує як єдине ціле. На функцію генів впливають фактори як внутрішнього, так і
зовнішнього середовища.
Молекулярні механізми мінливості в людини.
Мінли́вість— здатність живих організмів набувати нових ознак, відмінних від предків і їхніх станів у процесі індивідуального розвитку. Розрізняють декілька типів мінливості:
· Спадкову і неспадкову (модифікаційну або фенотипну).
· Індивідуальну (відмінність між окремими особинами) і групову (між групами особин, наприклад, різними популяціями даного виду). Групова мінливість є похідною від індивідуальної.
· Якісну і кількісну
· Спрямовану і неспрямовану.
Мінливість є протилежним процесом спадковості. Вона забезпечує появу нових ознак та їхніх станів, завдяки чому утворюються нові види і відбувається історичний розвиток біосфери в цілому.
Мутаційна мінливість зумовлює зміну структури спадкових одиниць (генів, хромосом) та успадкування цих змін.
· Геномні (зміна кількості хромосом)
· Поліплоїдія (3n, 4n тощо)
· Гетероплоїдія (n+1, 2n+2 тощо)
· Хромосомні
· делеція - випадання ділянки хромосоми (втрачання певних спадкових властивостей);
· дуплікація - подвоєння ділянки хромосоми;
· інверсія - поворот ділянки хромосоми на 180°;
· транслокація - перенесення ділянки хромосоми на іншу хромосому;
· генні (зачіпання структури гена - мутону - ділянки, що складається з двох нуклеотидів).
Прикладом мутації є деамінування цитозину в молекулах ДНК та утворення пари У-Г замість канонічної пари Ц-Г. Це зумовлюється деамінуванням цитозину внаслідок спонтанних хімічних реакцій. Загалом, мутації виявляються у фенотипі, тільки якщо вони є домінантними. Домінантні мутації пригнічують рецесивні мутації того ж роду. Проте, при чинниках навколишнього середовища, які не відповідають домінантним мутаціям, відбувається вивільнення рецесивних мутацій та успадкування цих змін - такий загальний механізм стабілізувального природного добору.
Мутаційна мінливість приймається синтетичною теорією еволюції як субстрат природного добору. Згідно з цією теорією, етапи природного добору поділяються на такі стадії:
1) Спочатку з’являється особина з новими властивостями (мутаціями);
2) Потім вона виявляється здатною або нездатною залишити нащадків;
3) Якщо особина залишає нащадків, то зміни у її генотипі закріплюються.
Під впливом різних фізико-хімічних факторів у молекулах ДНК можуть відбуватися порушення структурної організації. Такі зміни, якщо вони торкаються функціонально активних генів, призводять до порушень метаболізму або функцій (ознак). Якщо ці зміни не викликають загибелі організму або клітини, вони передаються нащадкам. Таким чином, генними мутаціями називаються стабільні зміни хімічної структури генів, що повторюються в наступних циклах реплікації та виявляються в нащадків у вигляді нових варіантів ознак. Усі різновиди мутацій пов'язані зі зміною нуклеотидної послідовності генів (Пішак, 2009).
Причини мутацій:
1. Помилки реплікації. Вони виникають у випадку некомплементарного приєднання азотистих основ у процесі реплікації. Якщо помилки не буливиправлені ДНК-полімеразою, вони передаються нас тупним поколінням у процесі реплікації.
2. Помилки рекомбінації. Порушення точності рекомбінацій ділянок ДНК при кросинговері веде дообміну невідповідними ділянками хромосом. Це призводить до порушення генного складу хромосом - хромосомних мутацій.
3. Хімічні мутагени. Багато хімічних речовини можуть змінювати структуру ДНК. Наприклад,аналоги азотистих основ, включаючись у ДНК, можуть зупиняти реплікацію або порушувати комплементарність ланцюгів; формальдегід (НСОН) може "зшивати" між собою ДНК, РНК, білки; гідроксиламін (NH2OH) - специфічно реагує з цитозином, а його деривати замість гуаніну зв'язують аденін; азотиста кислота (HNO2) окиснює й пошкоджує азотисту основу ДНК.
Пестициди – один із небезпечних хімічних мутагенів
4.
Фізичні мутагени. Зокрема, ультрафіолетове випромінювання (20СМ00 нм) викликає утворення димерів тиміну, що порушує структуру ДНК. В результаті
зупиняється транскрипція, порушується реплікація.
Іонізуюча радіація (рентгенівські промені, у-промені)
порушують структуру пуринових основ і
фосфодиефірні зв'язки ДНК.
Іонізуюча радіація - один з фізичних мутагенів.
5. Біологічні мутагени (наприклад, віруси, які мають здатність вмонтовувати свій ген у ДНК клітини хазяїна і змінювати вихідну структуру генетичного матеріалу).
Вірус кору - один із біологічних мутагенів
6. Спонтанні зміни (без видимих причин). Наприклад, спонтанне дезамінування цитозину й утворення при цьому урацилу призводить до порушення комплементарності і заміни однієї пари основ на іншу (Пішак, 2009).
Зміни послідовності нуклеотидів ДНК.
Мутації гена здебільшого є наслідком зміни послідовності нуклеотидів ДНК. Структурна класифікація мутацій гена:
1) заміна одних азотних основ іншими (транспозиція);
2) зміна кількості нуклеотидних пар у структурі гена;
3) зміна порядку послідовності нуклеотидів у складі гена (інверсії, дуплікації, делеції, інсерція);
4) розрив ланцюгів;
5) утворення зшивок.
Заміна азотистих основ.
Причинами таких мутацій є: а) помилки реплікації, б) вплив певних хімічних агентів. Під впливом хімічних агентів може відбуватися порушення структури азотистої основи вже приєднаного нуклеотиду Наприклад, під впливом азотистої кислоти може відбуватися спонтанне дезамінування цитозину. В результаті цього цитозин перетворюється в урацил. Надалі у циклі реплікації урацил з'єднується з аденіном, що в наступному циклі приєднує тимідиновий нуклеотид. Ще однією причиною може бути помилкове включення в ланцюг ДНК, що утворюється, нуклеотиду зі зміненою основою або його аналога. Якщо це залишається невиправленим ферментами репарації, змінена основа включається в процес реплікації, що може призвести до заміни основної пари на іншу. Помилки реплікації виникають дуже рідко, тому що ДНК-полімерази мають здатність до контролю комплементарності та встановлення помилкових приєднань невідповідних нуклеотидів.
Таким чином, мутації за типом заміни азотистих основ виникають спочатку в одному із ланцюгів ДНК. Якщо вони не виправляються в ході репарації, то при наступних реплікаціях закріплюються в обох ланцюгах молекули. Наслідком цього є утворення нового триплету в генетичному коді ДНК. Це може позначитися на первинній структурі кодованого білка, його просторовій організації і функції. Зміни первинної структури пептиду не відбудеться в тому випадку, якщо новий триплет є синонімом колишнього, тобто буде кодувати ту ж амінокислоту. Наприклад, амінокислота лейцин кодується шістьма триплетами: УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Заміна одного з нуклеотидів у цих триплетах не змінить їх змісту. Цей приклад демонструє важливе значення надмірності генетичного коду. Однак у деяких випадках заміна однієї амінокислоти іншою призводить до серйозних наслідків. Наприклад, заміна глутамінової кислоти валіном у молекулі гемоглобіну змінює його структуру і функції. Внаслідок у людини розвивається хвороба - серпоподібноклітинна анемія. Здебільшого заміна азотистих основ може призвести до появи нонсенс-кодонів, які не кодують амінокислот. Внаслідок цього буде спостерігатися передчасне переривання процесу синтезу. Вважається, що заміна азотистих основ призводить у 25 % випадків до утворення триплетів синонімів, у 5 % випадків до утворення нонсенс - кодонів і в 70 % C до виникнення генних мутацій.
Еритроцити людини при серпоподібноклітинній анемії – наслідок заміни глутамінової кислоти валіном у молекулі гемоглобіну .
Зміна кількості нуклеотидів у гені.
Цей вид мутацій відбувається в результаті випадання (делеції) або вставки однієї чи декількох пар нуклеотидів у молекулі ДНК. Такий тип мутацій зустрічається досить часто. Зазначена зміна відбувається внаслідок впливу на ДНК деяких хімічних агентів, радіоактивного опромінювання. Результатом цієї мутації є зрушення рамки зчитування інформації з генетичного коду. Наслідком цього є синтез поліпептидів із зміненою амінокислотною послідовністю, порушення структури і функцій білків, зміна фенотипу. Отже, якщо кількість встановлених або втрачених нуклеотидів кратна трьом, то зрушення рамки не відбувається. У цьому випадку в білку може з'явитися зайва амінокислота або їх буде на одну менше. Однією з причин мутацій, що призводять до зміни кількості нуклеотидів, є вставки або делеції в результаті активності рухливих генетичних елементів. Це певні нуклеотидні послідовності, вмонтовані в геноми багатьох організмів. Дані структури ДНК здатні спонтанно змінювати своє положення
внаслідок помилок при рекомбінації.
Зміна нуклеотидної послідовності гена
(інверсія).
Цей тип мутації пов'язаний з поворотом певної ділянки ДНК на 180°. Такі порушення відбуваються внаслідок дії хімічних агентів і фізичних факторів на молекулярно-генетичні процеси реплікації і рекомбінації. Наслідком цього є порушення нуклеотидної послідовності гена, що призводить до зміни первинної структури поліпептиду, порушення структури і функції білка і зміни фенотипу. Розриви одного з ланцюгів можуть відбуватися під дією іонізуючої радіації, внаслідок ушкодження хімічних зв'язків між молекулами. Вони можуть відновлюватися ферментом лігазою. Зшивання нуклеотидів, наприклад, двох поруч розташованих тимінів, відбувається під дією ультрафіолетового опромінення. Це призводить до помилок транскрипції.
Генна інженерія та біотехнологія.
Генна інженерія - галузь молекулярної біології і генетики, завдання якої конструювання генетичних структур за заздалегідь наміченим планом, створення організмів із новою генетичною програмою. Виникнення генної інженерії стало можливим завдяки синтезу ідей і методів молекулярної біології, генетики, біохімії і мікробіології. Основні принципи генної інженерії були розроблені в 60-70-х роках. XX сторіччя. Вони включали три основних етапи:
а) отримання генетичного матеріалу (штучний синтез або виділення природних генів);
б) включення цих генів у генетичну структуру, яка реплікується автономно (векторну молекулу ДНК), тобто створення рекомбінантної молекули ДНК;
в) введення векторної молекули (з включеним у неї геном) у клітину реципієнта, де вона вмонтовується в хромосомний апарат . Експериментальне перенесення генів в інший ге-
ном називається трансгенезом. Він ґрунтується на технології рекомбінантної ДНК. В основі генної інженерії лежать різні методи маніпуляцій із молекулами ДНК.
Отримання генетичного матеріалу.
У сучасній генетиці використовуються два способи синтезу генів поза організмом хімічний і ферментативний. Для хімічного синтезу необхідно мати повністю
розшифровану послідовність нуклеотидів ДНК.
Основні етапи клонування ДНК людини: 1 % одержання певного гена; 2 % підготовка вектора; 3 % вмотування гена людини у вектор; 4 % проникнення рекомбінантної ДНК у бактерію, де разом із плазмідою реплікується (відтворюється) ген людини.
Вперше штучний ген синтезував індійський вчений Г. Корана (1970). Це був ген аланінової т-РНК дріжджів, який складався з 77 нуклеотидів. У перших дослідах він не виявляв функціональної активності, бо не мав регуляторних ділянок. У 1976 р. вдалося синтезувати ген тирозинової т-РНК кишкової палички, який складається не тільки із структурної ділянки (126 нуклеотидних пар), а й регуляторних частин промотора і термінатора. Цей штучно створений за спеціальною програмою ген був трансплантований у бактеріальну клітину і функціонував як природний. Іншим прикладом хімічного синтезу є синтез гена, який кодує фермент розщеплення лактози. Синтезований у пробірці ген був вмонтований у плазміду і введений у бактерію; кишкова паличка набула здатності засвоювати лактозу.
Г. Корана (Наг Gobind Khorana) (нар. у 1922 p.)
Проте хімічним шляхом можна синтезувати невеликі за розміром гени прокаріотів. Синтез генів еукаріотів, які складаються з тисячі й більше нуклеотидів, шляхом хімічного синтезу створити поки що не вдалося. Ферментативний синтез генів здійснюють за допомогою процесу зворотної транскрипції. Відкриття цього процесу зроблено на пухлиноутворювальних РНК-вмісних вірусах. Проте згодом виявилося, що передавання генетичної інформації з і-РНК на ДНК може відбуватися в умовах експерименту і з іншими РНК. Саме це лежить в основі ферментативного синтезу гена. Спрощено це можна подати таким чином: у пробірці на матриці і-РНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази (ревертази) синтезується комплементарна до неї нитка ДНК потім утворюється двониткова молекула ДНК. Після цього і-РНК руйнується ферментом рибонуклеазою отриману ДНК називають ДНК-копією (к-ДНК). Така к-ДНК не має вставок-інтронів, тобто схема її будови не відрізняється від бактеріального гена. Матричну (інформаційну) РНК (м-РНК) виділяють із клітин або тканин, в яких експресується потрібний ген. Так, для клонування проінсулінового гена використовують B-клітини підшлункової залози, тому що саме для них характерний високий вміст проінсулінової м-РНК. Ген, отриманий внаслідок ферментативного синтезу, може функціонувати в бактеріальній клітині. На ньому синтезується і-РНК, а потім білок.
Під керівництвом В. Енгельгардта був отриманий ген, який визначає синтез ферменту галактозидази. Цей ген вводили у фаг, при розмноженні якого в клітині одержали безліч копій, що забезпечило синтез великої кількості ферменту. Це має не тільки теоретичне, але й практичне значення, тому що галактозидаза застосовується в харчовій промисловості. Синтезовано гени глобіну людини, кроля, голуба, деякі гени мітохондрій печінки пацюків і багато інших. Гени, синтезовані за допомогою ревертази, не мають регуляторної частини і промотора. Від-Гени, синтезовані за допомогою ревертази, не мають регуляторної частини і промотора. Відсутність регуляторних ділянок перешкоджає функціонуванню цих штучних генів у тваринних клітинах. При перенесенні в мікробну клітину до структурних генів експериментально, за допомогою ферментів, приєднують промотор, який добувають з мікробної клітини. Так були синтезовані два гени, відповідальні за синтез ланцюгів інсуліну. їх уводили в геном кишкової палички, яка почала продукувати інсулін. Важливим досягненням генної інженерії є синтез гена соматостатину, який може функціонувати у мікробній клітині. Таким же методом під керівництвом Ю. О. Овчиннікова і М. П. Дубініна здійснений синтез генів, які кодують нейрогормони людини (лейциненкефалін і брадикінін). Ферментативний синтез генів має велике значення, тому що принципово можливо проводити штучний синтез будь-яких індивідуальних генів шляхом транскрибування їх із відповідних матричних РНК.Основною перешкодою є синтез не структурних, а регуляторних частин генів, необхідних для їх нормальної роботи. Це здебільшого обмежує використання штучно синтезованих генів. У генній інженерії широко використовують так само і виділення природних генів з метою створення рекомбінативних молекул ДНК. Включення отриманого гена у вектор.
Вектор - це щось подібне до молекулярного"таксі", здатного переносити чужу ДНК всередину бактеріальної клітини таким чином, щоб вона там змогла реплікуватися. Існує два основних типи векторів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги. Після виділення або синтезу гена його зшивають з векторною (спрямовуючою) молекулою ДНК. З цією метою використовують особливі бактеріальні ферменти. Такі ферменти є у бактерій, у яких вони зупиняють репродукцію вірусу, вирізаючи вірусну ДНК із геному бактерії. Вони називаються рестриктазами, оскільки обмежують розмноження вірусів. Кожен тип ферментів рестрикції, а їх відомо близько 100, розділяє ДНК у специфічному місці,
що називається сайтом рестрикції .
Поділ подвійного ланцюга ДНК.
У проміжку, що з'явився, може бути розміщена ділянка чужорідної ДНК. Таку ДНК можна розрізати за допомогою того ж ферменту рестрикції. Одноланцюгові комплементарні кінці двох ДНК називають "липкими кінцями", тому що вони з'єднуються внаслідок комплементарного спарювання азотистих основ. Вони полегшують вставку чужорідної ДНК у векторну. Таким чином, можна поєднувати відрізки ДНК, отримані з різних джерел, і створювати комбінації генів в одній довгій молекулі. Оскільки водневі зв'язки легко розриваються, для з'єднання ділянок застосовують фермент лігазу - один із ферментів репарації. Комбінуючи різні рестриктази і лігази, можна розрізати нитку ДНК у різних місцях і одержувати рекомбінантні молекули (наприклад, плазмідну ДНК з вмонтованим чужим геном). Вмонтовування в геном реципієнта. Векторні молекули, які містять у собі фрагменти чужорідної ДНК, повинні мати властивість, яка забезпечує третій етап генної інженерії - проникнення в клітину-реципієнта і вмонтовування в її геном. Реципієнтні клітини, тобто клітини, обрані для клонування гена, можуть бути як про-, так і еукаріотичними. Найчастіше для цієї мети використовують бактерії, оскільки їх легко одержувати у великих кількостях. Перенесення генів може здійснюватися з однієї бактерії в іншу за допомогою плазмід.
Рекомбінантні молекули ДНК відокремлюють від молекул, що містять тільки донорську або тільки плазмідну ДНК. Для їхнього поділу використовується плазміда, що має два гени стійкості до двох визначених антибіотиків. При цьому клітини, що ростуть за наявності двох антибіотиків, містять тільки вихідну плазміду. Клітини, що гинуть під дією двох антибіотиків, позбавлені плазмід і містять тільки донорську ДНК. Клітини, що ростуть за наявності одного антибіотика і гинуть за наявності іншого, містять рекомбінантну плазміду. Якщо в плазміду вмонтовані інші гени, вони передаються в клітину-хазяїна шляхом трансдукції і вмонтовуються в її геном, де здатні до швидкої реплікації за допомогою ферментативної системи клітини-хазяїна. Цей процес швидкого одержання великої кількості однакових копій називається клонуванням ( Пішак, 2009).
Клон - це велика популяція ідентичних молекул, бактерій, клітин, організмів, які от-
римані від одного предка. Клонування генів - це процес, що включає виділення й ампліфікацію (дублювання великої кількості) окремих генів у реципієнтних про- й еукаріотичних клітинах. Ці клітини, які містять потрібний нам ген, можна використовувати для одержання:
а) великої кількості білка, що кодується даним геном,
б) великої кількості самого гена у високоочищеному вигляді.
Вівця Доллі (англ. Dolly) — самка вівці, перша успішно клонована тварина з клітини іншого дорослого організму. Експеримент проводився у Великобританії, у місті Мітлодіан, Шотландія. Тут вона народилася 5 липня 1996 року, преса ж повідомила про це лише через 7 місяців — 22 лютого 1997 року. Проживши 6 років, вона померла 14 лютого 2003року.
Спочатку вівці було присвоєно ідентифікаційний код 6LL3. Ім'я Доллі вона отримала згодом, в честь американської співачки Доллі Партон за пропозицією одного із пастухів, який допомагав при родах вівці. Своєю появою вона завдячує технології соматичного перенесення ядер клітин.
До клонування Доллі уже були перші спроби склонувати організми, зокрема були клоновані вівці Меган і Мораг тією самою групою вчених. Статті про них були опублікована у журналі Nature 1997 року.
В процесі створення Доллі в 277 яйцеклітин було вселено ядра із нестатевих клітин, після чого було утворено 29 ембріонів, із яких вижила лише Доллі.
Доллі померла 14 лютого 2003 року від прогресуючого захворювання легень, що очевидно було спричинено ретровірусом. Такі захворювання переважно проявляються лише у літніх (пристарілих) овець (середня тривалість їх життя становить 10-12 років). Проте немає доказів того, що причиною захворювання стало передчасне старіння: в овець, які постійно перебувають у закритому приміщенні, ризик цього захворювання зростає, а Доллі якраз задля безпеки перебувала у приміщенні і рідко виходила випасатися з іншими вівцями.
9 квітня 2003 року муміфіковані рештки вівці було передано до Единбурзького музею.
Вперше клонована вівця Долі і її нащадок - ягня Бонні (http://uk.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D1%96%D0%B2%D1%86%D1%8F_%D0%94%D0%BE%D0%BB%D0%BB%D1%96)
Крім плазмід, як вектор використовуються фаги (фаг лямбда), віруси (мавпячий вірус SV40). У випадку використання фагів і вірусів перенесення генетичного матеріалу здійснюється за допомогоютрансдукції. Особливим випадком трансдукції є перенесення чужорідних генів в еукаріотичні клітини за допомогою неонкогенних вірусів і фагів. Вперше припущення, що трансдукція можлива в еукаріотів, було висловлено
С. М.Гершензоном у 1966 р. при дослідах на шовковичному шовкопряді.
С. М.Гершензон ( фото із сайту: http://www.logos-ukraine.com.ua)
Рекомбінантна ДНК-технологія має як наукове значення (дозволяє виділити окремий ген складного організму і вивчити його функцію на молекулярному рівні), так і практичне застосування.
За допомогою рекомбінантної ДНК-технології можна виробляти різні білки для медичної практики. Такі ліки більш безпечні, ніж аналогічні білки, отримані безпосередньо з організмів. Першим таким рекомбінантним препаратом став інсулін.
Інший важливий напрямок біотехнології - виробництво вакцин. Такі вакцини не можуть викликати хвороб, тому що виготовляються з одного із поверхневих білків. Ген такого білка використовується для біореконструкції бактерії. Так створена вакцина проти гепатиту В. Успішно ведеться робота над вак-цинами для гепатитів А, С, хламідіозів, герпесу й інших захворювань.
Трансгенні організми.
За допомогою методів генної інженерії можна одержати різні організми, які мають у складі свого геному чужорідні гени інших організмів. Такі організми називаються трансгенними. У даний час ця галузь науки швидко розвивається. У різних галузях господарської діяльності людини використовуються трансгенні бактерії.
Крім того, що бактерії використовуються для клонування генів і виробництва білка, вони реконструюються і для інших цілей. Так, біоінженерні бактерії використовуються для оздоровлення рослин. Бактерії, що живуть у рослинах і стимулюють утворення кришталиків льоду, були змінені з холод-плюс на холод-мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рослин від морозу. У бактерій, що утворюють симбіоз з коренями кукурудзи, були введені, гени (від інших бактерій), що кодують токсин для шкідливих комах. У природі існують бактерії, що можуть розщепити будь-яку органічну речовину. Бактерії відбираються за здатністю розщеплювати певну речовину, а згодом ця здатність підсилюється внаслідок біотехнології. Таким шляхом були створені бактерії, які поїдають нафту, що розлилася внаслідок техногенних катастроф.
Бактерії використовують для бактеріального синтезу. Так, були реконструйовані бактерії для виробництва амінокислоти фенілаланіну. Широке використання рекомбінантних бактерій у сільському господарстві, промисловості, захисті навколишнього середовища обмежувалося побоюванням того, що такі бактерії можуть замінити природні мікроорганізми в екосистемах з виникненням несприятливих наслідків. На даний час розроблено методи визначення, виміру і навіть блокування діяльності цих клітин у навколишньому середовищі.
Зручним об'єктом для генетичних маніпуляцій виявилися рослини, тому що рослинні клітини можна вирощувати в культурі, де із кожної клітини отримують цілу рослину. Ведуться роботи зі створення біоінженерних рослин, що могли б мати наступні властивості:
1) високу пристосованість до умов зовнішнього середовища;
2) містити більшу кількість необхідних для людини поживних речовин;
3) тривалий час зберігатися без псування.
Розробляються трансгенні рослини, здатні продукувати в інтересах людини хімічні речовини й ліки. Реконструйовано картоплю для продукції альбуміну людини. Передбачається, що в майбутньому рослини зможуть утворювати у своїх насіннях такі білки, як гормони людини.
Швидкими темпами розвивається біоінженерія тварин. Яйцеклітину поміщають у спеціальну мішалку разом з чужорідною ДНК і дрібними силіконкарбідними голками. Голки роблять множинні отвори в оболонці, крізь які ДНК попадає в клітину. За допомогою цієї технології бичачий гормон росту був введений у яйцеклітини багатьох видів тварин. Завдяки цій технології отримані великі риби, корови, свині, кролики, вівці. Трансгенні тварини створені для виробництва продуктів медичного значення. Ланцюговим інструментом для генетичних досліджень стали трансгенні миші. Вони
дають важливу інформацію при плануванні генної терапії у людини. Вчені, що вивчають м'язову дистрофію Дюшена, виділили ген і його продукт - нормальний білок дистрофін, що відсутній у хворих. Запропоновано спосіб забезпечення хворих дітей дистрофіном. Але що буде, якщо дистрофін потрапить в інші тканини, або його буде утворюватися занадто багато? Для вирішення цих питань були створені трансгенні миші, у м'язах яких міститься дистрофіну в 50 разів більше, а також відбувається продукція цього білка в інших тканинах. Дистрофін не викликає у таких мишей патологічних відхилень. Трансгенні миші виявилися вкрай необхідними при вивченні моногенних хвороб, злоякісних пухлин і навіть мультифакторіальних хвороб людини.
Проте трансгенна технологія є неточною, тому що введення ДНК не спрямоване у визначений локус хромосоми. Ген, що переноситься, може порушити функцію іншого гена або потрапити під контроль інших генів. Навіть якщо трансген вставляється в хромосому й експресується, його ефект може бути перекритий таким же геном клітини-хазяїна. Тому була розроблена технологія більш точного "націлювання" гена (gene targeting), при якій ген, що вводиться, займає місце свого двійника у хромосомі клітини-хазяїна. При цьому використовується природний процес гомологічної рекомбінації. Внаслідок такої технології заміняють інактивованим геном активний ген у мишей і простежують ефект його відсутностінавіть в ембріона. Так вивчають функцію білків імунної системи, механізм взаємодії онкогенів у виникненні пухлини, розвиток генетичних захворювань.
"Націлювання" гена - складна методологія, вона не працює у заплідненій яйцеклітині ссавців. Ген можна впровадити тільки в клітини на ранніх етапах розвитку зародка, до його імплантації у стінку матки. Клітини такого зародка тотипотентні і багато генів у них ще не експресовані. "Націлювання" гена має велике значення при створенні моделей генетичної патології у тварин. Важливо те, що вчені ідентифікують версію людського алеля, який викликає хворобу у тварин. Потім відповідний людський мутантний алель переноситься в ембріональні стовбурові клітини і, нарешті, схрещують тварин, гомозиготних за інактивованим геном. Тварин з "виключеним" геном використовують у вивченні складних хвороб, у які задіяно багато генів. Так, наприклад, вивчають атеросклероз шляхом інактивації сполучення генів, продукти яких контролюють ліпідний метаболізм.
Геном миші.
Розшифровка геному людини в лютому 2001 року не дала відповіді на всі питання
антропогенетики. Незважаючи на секвенування геному і визначення приблизної кількості генів, що кодують білки, функція більшості з них залишається невідомою. На даний час не ідентифіковано всі гени, що відповідають за розвиток спадкових хвороб і хвороб зі спадковою схильністю. Розшифровка геному миші, яку використовували в лабораторних дослідженнях з 1900 р., у грудні 2002 року дала нові можливості для вивчення геному людини.
Кількість генів миші складає 27000-30500, що приблизно відповідає кількості генів людини. Близько 99 % цих генів мають нуклеотидну послідовність, властиву людському геному і 96 % із них знаходяться в "синтенних" ділянках хромосом миші і людини. На даний час можливе виведення трансгенних мишей з точним "вимиканням" (делецією) генів, проводити аналіз змін фенотипу, що виникають внаслідок цього, і згодом шукати подібні нуклеотидні послідовності в геномі людини.
Трансгенні миші.
Аналіз нуклеотидної послідовності миші дозволить точно "націлювати" гени людини у схожі нуклеотидні послідовності миші і створювати "людські"ознаки у лабораторних трансгенних мишах. Наприклад, включені в геном миші людські гени білків цитохромів, що беруть участь у метаболізмі ліків,дозволять точно моделювати дію ліків.
В даний час використовуються кілька підходів в отриманні трансгенних тварин. Найбільш широко поширений метод мікроін'єкцій чужорідної ДНК (чДНК) у пронуклеус зигот. Оптимальні умови для проведення мікроін'єкцій в пронуклеус зигот мишей описані в роботі Брінстера і співавторів (1994).
Розмір такого ДНК може досягати 30 Mb. Інтеграція декількох копій (від 1 до кількох сотень) екзогенної ДНК в геном відбувається, як правило, в одному сайті в орієнтації "голова до хвоста" або "голова до голови". При ін'єкції декількох рекомбінантних конструкцій, їх вбудовування в геном, також відбувається в одному сайті.
Інший підхід в отриманні трансгенних тварин полягає в інфікуванні ранніх ембріонів ссавців рекомбінантів-ниміретровірусамі. Недоліком цього методу є отримання трансгенних тварин з мультісайтовой інтеграцією трансгена і його нестабільною успадкованого в поколіннях.
Ще одним підходом в отриманні трансгенних тварин є використання трансформованих чужорідної ДНК, ембріональних стовбурових клітин, шляхом ін'єкції останніх у порожнину бластоцисти. Основною перевагою даного методу є можливість проводити спрямований мутагенез на рівні цілого організму, за допомогою гомологічною рекомбінації чужорідної ДНК з ДНК геному.
Для отримання трансгенних тварин використовувалися й інші методи, до яких відносяться: застосування сперматозоїдів, оброблених екзогенної ДНК, для запліднення яйцеклітин в умовах in vitro; використання ліпосом як вектор чужорідної ДНК. Однак, ці методи мають значно менш широке поширення, у порівнянні з методом мікроін'єкції чужорідної ДНК в пронуклеус зиготи.
МЕТОДИ ТРАНСГЕНЕЗА У ТВАРИННИЦТВІ
Трансгенні тварини - це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетична інформація (Трансген). Така інформація представляє собою або окрему ділянку ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями (еукаріотична транскрипційних одиниця), або сконструйований з різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген. Таким чином, трансгени - це штучно введений та інтегруватися в ДНК тварин чужорідний ген. Під трансгенезом розуміють процес перенесення та інтеграції чужорідної генетичної інформації в геном тварин.
Метод мікроін'єкції
Вперше про отримання трансгенних сільськогосподарських тварин повідомили дві лабораторії в США та Німеччині [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обох випадках для переносу генних конструкцій у ембріональні лінії був використаний метод мікроін'єкції. Цей метод і сьогодні залишається найбільш широко використовуваним для трансгенеза у тваринництві.
Суть методу мікроін'єкції полягає у введенні розчину генних конструкцій в чоловічій пронуклеус зигот. Зазвичай ін'еціруют 1-2 ПКЛ розчину ДНК в концентрації, що відповідає 1000 копій в 1 ПКЛ мікроін'екціонного розчину. При цьому виходять з того, що кількість 1000 копій / ПКЛ приблизно відповідає концентрації X нг / мкл, де X - довжина генної конструкції в тисячах парах нуклеотидів (т.п.н). Наприклад, якщо довжина генної конструкції дорівнює 10 т.п.н., то кількість 1000 копій в 1 ПКЛ буде досягатися при концентрації рівної 10 нг / мкл.
Для більш точного розрахунку концентрації генних конструкцій використовують наступну формулу:
Кількість копій (копій ПЛК) = 6,023 * 10 23 * З * 10 -9 / Mr, де 6,023 * 10 23 - число копій в 1 М розчині;
С - концентрація ДНК [мкг / мл];
Mr - молекулярна маса [мг / моль].
Для розрахунку концентрації вимірюють оптичну щільність розчину генної конструкції на спектрофотометрі при довжині хвилі 260 нм. 1 OD відповідає концентрації двуточечной ДНК дорівнює 50 мкг / мл. При розрахунку молекулярної маси виходять з того, що молекулярна маса 1 пар основ дорівнює 6,6 * 108 мг / моль.
Про успішне виконання мікроін'єкції судять по збільшенню обсягу пронуклеусів в 1,5-2 рази [Брем та ін, 1995]. У ембріонах мишей кроликів, овець і кіз пронуклеус досить добре візуалізуються під мікроскопом при збільшенні Х400 без виконання будь-яких додаткових маніпуляцій. Що стосується ембріонів свиней і великої рогатої худоби, то внаслідок наявності в цитоплазмі темних ліпідосодержащіх гранул визначення місця розташування пронуклеусов в них утруднено. Для усунення цих гранул до країв ембріона і полегшення тим самим локалізації пронуклеусов виконують центрифугування ембріонів свиней та ВРХ при 15000 об / хв протягом 3 хв. [Wall et ai, 1985]. По завершенні мікроін'єкції ембріони культивують кілька годин до моменту їх пересадки в яйцепровід синхронізованих реципієнтів. Ембріони ВРХ культивують in vitro протягом 6-7 днів до досягнення ними стадій морули або бластоцисти і потім виконують пересадку в матку синхронізованих реципієнтів. Після народження від всіх тварин відбирають проби тканини для аналізу на інтеграцію трансгена. Ступінь інтеграції, тобто число трансгенних тварин від загального числа народжених тварин, при використанні методу мікроін'єкції в залежності від виду тварин коливається в незначних межах. Так, у мишей цей показник у середньому становить 15%, у свиней - 10-15%, у кроликів - 10%, у овець, кіз і ВРХ -5-10% [Брем та ін, 1995]. Найбільш важливим, з точки зору витрат, потрібних для отримання одного трансгенної тварини, є показник загальної ефективності трансгенеза, який розраховується як відношення числа отриманих трансгенних тварин до загальної кількості пересаджених ембріонів, виражене у відсотках. Величина цього показника також щодо постійна і становить у мишей -2%, у кроликів 1%, у овець і кіз - 0,5 - 1%, у свиней та ВРХ - 0,5%. На частоту інтеграції впливає ступінь очищення ін'єкційного розчину, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину, якість ембріонів, спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (не хірургічний, хірургічний, лапароскопічний). При використанні розчину MSOF (синтетична середу ембріонів) для мікроін'єкції зигот великої рогатої худоби (Hageman [1995]) було показано, що ін'єкція розчину MSOF не чинила впливу на життєздатність ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Так, частки ембріонів, що розвинулися до стадії бластоцисти, в групах MSOF та контрольної становили, відповідно, 27,6% і 27,5%. У групі ТІ до стадії бластоцисти розвинулися лише 13,9% ін'єктовані зигот. Зіставляючи результати двох наведених вище досліджень, можна припустити, що буфер MSOF виявиться більш ефективним у порівнянні зі стандартним розчином ТІ для отримання трансгенного великої рогатої cкота та інших видів сільськогосподарських тварин.
Не дивлячись на досягнуті в області трансгенеза успіхи, ефективність одержання трансгенних сільськогосподарських тварин залишається дуже низькою [Wall et al., 1992; Wall et al. 1997] що спонукає дослідників шукати нові підходи. Одним із шляхів підвищення ефективності трансгенеза є розробка методів оцінки ембріонів на трансгенність перед іхпересадкой реципієнтам. До них відноситься використання в конструкціях репортерний генів, таких як β-галактозидаза, лужна фосфотаза та інші, а також визначення трансгенів в ембріонах методом ПЛР і флюоресцентної гібридизації.
Не дивлячись на використання великого числа маркерів, не було розроблено системи, що дозволяє підвищити ефективність трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Основні підходи, ісполбзующіеся в даний час:
Використання ретровірусних векторів
Результативним способом перенесення ДНК в ембріональні лінії тварин є застосування ретровірусних векторів. Ретровіруси - сімейство еукаріотичних вірусів, генетичний матеріал яких представлений одноланцюжковою РНК.
Віруси складаються покритих липопротеидной оболчкой вірусних частинок діаметром 70-120 нм і внутрішньої капсули ікосаедричної форми, яка містить дві копії геномної РНК довжиною 5-10 тисяч пар нуклеотидів у формі рибонуклеопротеїни. Зовнішня оболонка вірусу є частиною цитоплазматичної мембрани клітини господаря і представлена короткими гликопротеидами. Ендогенні ретровіруси є хромосомними елементами і складають до 1% ДНК в геномі людини [Tarusio Mantovani, 1998]. Ендогенні ретровіруси є одним з різновидів ретроелементов, що складають до 10% геному ссавців.
За своїй здатності інфікувати клітини господаря ретровіруси поділяються на екотропние і амфотропние. Екотропние віруси здатні реплицироваться в клітинах тільки одного або декількох близько споріднених видів тварин. Так, наприклад, вірус лейкемії миші (MLV) розмножується тільки в клітинах миші та щури. Амфотропние віруси, навпаки, мають широкий спектр господарів і здатні до розмноження в клітинах різних видів ссавців.
Геном всіх здатних до реплікації ретровірусів влаштований аналогічним чином і складається з трьох кодують регіонів, які, не дивлячись на те, що мова йде про послідовності РНК, отримали назву генів. Ген gag кодує білки капсиду і вірусного кора. Ген кодує pol вірусну реверсивну транскриптазу й інші пов'язані з вірусом нуклеази. Ген кодує env глікопротеїди у вірусній ліпідної оболонці.
Геноми РНК ретровірусів містять на свох кінцях повторюваних послідовностей, які залежно від типу вірусу мають довжину від 10 до 80 нуклеотидів. Вони отримали назву R-сегментів. На 3-кінці геномної РНК R-сегмента розташований регіон U3 довжиною 170-1250 нуклеотидів, а на 5 'кінці r-сегмента регіон u5 довжиною 80-100 нуклеотідов.Прі формуванні ДНК-копії вірусного РНК-геному на кінцях молекули відбуваються зміни: на 5 'кінці розташовується сегмент U3, а на 5' - U5.Такіе характерні для ДНК-форми ретровірусоа ділянки отримали назву LTR - довгих кінцевих повторів. LTR, розташований на 5 'кінці несе дуже сильний промотер, тоді як LTR на 3' кінці містить сигнали Поліаденілювання РНК.
Інфекція починається з взаємодії ретровірусу з клітинною мембраною і зв'язування поверхневого білка ретровірусу (env) зі специфічним білком-рецептором. Проникнення ретровірусу в клітину відбувається за допомогою мікропіноцітоза. В одних вірусів кор, що складається з білка gag, РНК-залежної ДНК-полімерази (реверсивної транскриптази), інтегрази і двох копій ретровірусної РНК, переноситься в ядро, де і відбувається транскрипція, а в інших вірусів транскрипція здійснюється безпосередньо в цитоплазмі. Зворотня транскрипція вірусної РНК в двухцепочечную ДНК здійснюється за допомогою ферменту реверсивної транскриптази, що є частиною комплексу ферментів кора. У ході транскрипції відбувається дуплікація послідовностей на 5 'і 3' кінцях ретровірусу. Якщо транскрипція має місце в цитоплазмі клітини, то дволанцюжкова ДНК вірусу транспортується в ядро, де відбувається її циркуляція з подальшою інтеграцією однієї або декількох копій в геном клітини. Така інтегрована ДНК клітини хазяїна форма існування вірусного геному отримала назву провірусу. Кроки життєвого циклу ретровірусів.
Для інтеграції необхідна наявність на обох кінцях ДНК 9 пар підстав, які пізнаються і відщеплюються закодованої у вірусі специфічної інтегрази, що є частиною комплексу ферментів кора. Процесу інтеграції завжди передує відщеплення двох пар основ на обох кінцях провірусу і подвоєння 3-6 пар основ (залежно від типу вірусу) послідовності ДНК клітини хазяїна. Хоча інтеграція в геном клітини господаря не є специфічною, слід відзначити, що місця інтеграції часто розташовуються в транскрипційно активних ділянках ДНК. Якщо відбувається інтеграція в геном генеративних клітин, то ретровіруси передаються у спадок нащадкам. У цьому випадку мова ведуть про ендогенних ретровірусів.
Інтегрована вірусна ДНК транскрибується з допомогою РНК-полімерази клітини-хазяїна та трансляціруется як і інші клітинні гени.
Утворені в ході процесу транскрипції продукти є ідентичними вірусної РНК. Всі транскрипти містять на 5 кінці кеп-сайт, а на 3 'кінці ділянку Поліаденілювання. Такі РНК служать матеріалом для синтезу білків капсиду і вірусного кора, а також білків зворотної транскриптази .. Ці білки утворюють з геномної РНК вірусу комлекс-кори, після чого вірусні частинки залишають клітину через цитоплазматичну мембрану. При цьому кор бере з собою частину мембрани клітини господаря, з якої утворює оболонку. Інтеграція вірусних частинок в геном клітини господаря відбувається тільки в мітотично активні клітини.
Інфікування клітин ретровірусами найчастіше за все не позначається на їхній життєдіяльності. Однак якщо інтеграція провірусу сталася поблизу клітинних протоонкогенів, то можлива їх активація і, як наслідок, загибель клітин. Порушення життєздатності клітин. Може мати місце і в тому випадку інтегріраціі провірусу в діючий клітинний ген (наприклад, пухлинні гени-супресори).
Найбільш часто використовуваними ретровірусними векторами являютя вектори на основі ретровірусів миші типу С (вірус лейкемії миші) Такі векторні системи складаються з двох компонентів: векторної конструкції та лінії клітин-пакувальниці.
У векторної конструкції (провірусної ДНК) гени, кодіруюрущіе структурні білки ретровірусу (gag, pol, env), замішані іншими важливими генами (генами β-галактозидази і стійкості до неоміцину). Джерелом структурних білків є клітинна лінія, яка містить інтегрований у геном провірус. Даний провірус модифікують таким чином, що у нього відсутній сигнал впізнавання ψ, необхідний для упаковки вірусної РНК. Таким чином, транскрипційного вірусна РНК не може бути упакована у вірусні частинки.
РНК векторної конструкції, навпаки, містить сигнал впізнавання ψ і тому може бути упакована в рибонуклеопротеїдними комплекс. Таким чином, відбувається формування інфекційних вірусних частинок, що містять інформацію ретровирусного вектора і переносять її в інфіковані клітини. Однак такі вірусні частки не здатні до утворення нових вірусів, тому що в инфицируемой клітинної лінії відсутня генетична інформація про структурні білках, необхідних для формування вірусних частинок.
Необхідними складовими частинами векторної конструкції є 5 'і 3' LTR, а так само сигнал упаковки, розташований "вниз за течією" від 5 'UTR. Експресія трансгена направляється промоторів 5 'UTR або альтернативними вірусними або клітинними промотерамі (наприклад, вірус саркоми Рауса, тирозин, α-казеїн). Вперше присутність вірусної ДНК в клітинах дорослих мишей встановлено в 1974 році. Ретровірусних вектори можуть служити альтернативою для ефективного транспорту генів у сільськогосподарських тварин. Інфекція зигот або імплантаційних ембріонів у більшості випадків призводить до отримання трансгенних тварин-мозаїки. Поясненням цьому служити те, що інтеграція відбувається тільки в тому випадку, якщо клітина вступає в мітоз після попередньої реплікації ДНК. Усі нащадки, які народилися з інфікованих ооцитів, були трансгенними. Не дивлячись на обмежене число отриманих трансгенних тварин, були доведені передача трансгена у спадок і експресія рекомбінантного продукту. Ефективність отримання трансгенного ВРХ з використанням ретровірусної інфекції ооцитів у метафазі II другий мейотичного поділу.
Перевагою використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є те, що до 100% оброблених ембріонів можуть бути успішно інфіковані ретровірусами. Недоліком застосування ретровірусних векторів є їх обмежена ємність (розмір вставки не повинен перевищувати 8 000 п. н. Крім того, в результаті сплайсингу з ретровірусів вирізаються інтроннние послідовності, які як і інші дистальні або проксимальні послідовності грають важливу роль в ефективній експресії генів у трансгенноих тварин [Palmiter, 1991]. До недоліків лікування ретровірусними векторів слід так само віднести придушення експресії трансгенів in vivo внаслідок інактивації вірусних промоторів в клітинах, наприклад, за допомогою а-і у-інтерферонів, що діють на вірусні LTR [Ghazizadeh, 1997] . Однак дана проблема може бути вирішена за допомогою включення в ретровірусну конструкцію внутрішніх промоторів або використанням нового покоління ретровірусів, що містять модифіковані ділянки контролю експресії, такі як внутрішній рибосомних сайт (IRES) [Salen, 1997] і тетрациклінова регуляторна система.
Ще одним обмеженням використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є їх низький титр. Звичайні ретровірусних вектори мають титр 1 х 105-6 колонієутворюючих одиниць (cfu) у мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низький титр ретровірусів обмежує способи їх введення в ембріони. Проблема низького титру була нещодавно вирішена за допомогою розробки нового вектора на основі вірусу везикулярного стоматиту (псевдотіп VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Відомо, що тропізм ретровірусу визначається геном env, тому його заміна у векторі на ген env іншого ретровірусу може розширити спектр господарів і змінити властивості ретровірусу. Дана технологія отримала назву псевдотіпірованія. Включення білка вірусу везикулярного стоматиту С у вектор на основі Мо - MLV (Burns et al, 1994) дозволило зробити його більш стабільним при ультрацентрифугирование. Цей вектор може бути сконцентрований до титру 1x109-10 КУО / мл і має дуже широкий спектор клітин-господарів. З його використанням були отримані трансгенні лінії клітин комах, ссавців, амфібій, риб, а також створені трансгенні тварини. Високий титр ретровірусу зробив можливим отримання трансгенних тварин за допомогою ін'єкції містить віруси середовища в перівітеліновое простір [Chan et al, 1998) / У ооцитах великої рогатої худоби обсяг перівітелінового простору становить 200-300 ПКЛ. При використанні вірусу з титром 1 * 10 9-10 КУО / мл, ін'єкція 10 ПКЛ призводить до проникнення в перівітеліальное простір від 10 до 100 інфекційних вірусних частинок. Якщо титр вірусу дорівнює 1 * 105-6 КУО / мл, то для введення в ембріон однієї вірусної частинки знадобилося не менше 1 нл розчину.
До недоліків використання ретровірусів належить можливість клітинних онкогенів за допомогою вірусних транскрипційних послідовностей. Навіть при застосуванні ретровірусів, які не можуть існувати як інфекційні вірусні частинки, існує хоча й дуже невеликої, але ризик, що при рекомбінації з присутніми в ембріонах ендогенними ретровірусними послідовностями можуть утворюватися нові активні форми ретровірусів.
Не дивлячись на перераховані недоліки та обмеження, ретровіруси можуть бути широко використані для трансгенеза у тваринництві. Успішне введення генетичного матеріалу в ооцити робить можливим проведення генної терапії спадкових захворювань. Використання ретровірусних векторів дозволяє здійснювати трансформацію окремих органів. Так, Archer з співавторами [1994] ввели в молочну залозу кози шляхом інфузії через сосковий канал в період гормонально индуцируемого маммогенеза ретровірус, який кодує гормон росту людини (hGH). Лактація настала на 14-ий день гормональної обробки. Максимальний рівень hGH (60 нг / мл) спостерігався в перший день лактації і потім опускався до 12 нг / мл на 9-12 дні лактації.
Аналогічні експерименти з використанням експресійна вектора pLNS, отриманого на основі Mo-MLV проводяться у відділі біотехнології Всеросійського НДІ тваринництва. LTR - довгий кінцевий повтор, ψ + - сигнал упаковки, Н4 - промотер гистона людини, NEO - ген стійкості до неоміцину, ЕР - делеція в області промотера-енхансера, РА - сигнал Поліаденілювання Цей вектор містить тільки цис-діючі послідовності генома вірусу, необхідні для реплікації. Послідовності вірусу, що кодують білки, виключені з векторної конструкції. Вектор містить 5 'довгий кінцевий повтор LTR, з якого відбувається транскрпція, ψ + область, відповідальну за упаковку вірусного генома в віріон, ген стійкості до неоміцину, під контролем промотера Н4 гистона людини для селективного введення конструкції в клітинну лінію і 3' LTR з делецій в області промотера-енхансера вірусу. Після одного циклу реплікації делеція в області ЕР LTR буде присутнім на обох кінцях провірусу, регуляторні елементи провірусу будуть повністю інактивованих і клоновані гени будуть експресуватися тільки під контролем власних промотеров.
Доведено можливість успішної інфекції альвеолярних клітин молочної залози свиней і корів рекомбінантними ретровірусами..
Інфекція молочної залози не носить локального характеру. Послідовності провірусу крім досвідчених долей вимені були виявлені в контрольних частках молочної залози, в слинної залозі, селезінці, підшлунковій залозі, спинному мозку, надниркових. ІФА молока свиней виявив наявність рекобінантного продукту в кількості від 30 до 290 нг / мл.
Основними недоліками методу безпосередньої інфекції окремих органів тварин є необхідність використання великої дози ретровірусів з тим, щоб інфікувати достатнє число клітин, а так само неможливість передачі трансгена в спадщину наступному поколінню тварин. Однак на відміну від введення грансгенов в ембріональні лінії, даний підхід дозволить синтезувати рекомбінантні продукти в молоко вже через кілька місяців після початку експерименту. Для ВРХ у порівнянні з традиційним методом мікроін'єкції витрати часу від початку експерименту і до отримання перших результатів про рівень експресії в молоці скорочуються, відповідно, з 4-5 років до 4 5 місяців.
Метод пересадки ядер клітин, культивованих in vitro
Ще одним способом отримання трансгенних ссавців є використання трансформованих генними конструкціями клітинних ліній. З цією метою можуть бути використані як стовбурові клітинні лінії, так і соматичні клітини, культивовані in vitro. Вперше експресія генних конструкцій в соматичних тканинах химерних мишей, отриманих з використанням трансформованих клітин ембріональної карциноми, була доведена Stewart з співавторами [1985]. Частка химерних мишей була дуже високою, причому частина з них передавала Трансген у спадок. Проте в даний час найбільше поширення для отримання химерних тварин отримали ембріональні стовбурові клітини, ЕСК [Robertson et al., 1986]. Перевагою отримання трансгенних тварин за допомогою трансформованих стовбурових клітин є можливість тестування інтеграції трансгена в культурі клітин. Це означає, що кожен ембріон, який розвинувся в культурі після пересадки ядер, буде трансгенним і подальша селекція трансгенних ембріонів не потрібно. Крім того, пересадка таких ембріонів реципієнтам призведе до народження тільки трансгенного потомства. Використання для одержання трансгенних тварин трансформованих ЕСК робить можливим у ряді випадків проводити оцінку експресії трансгенів, що має важливе значення. При мікроін'єкції трансгени навмання інтегруються в будь-яку частину геному. Це означає, що вони можуть руйнувати досить істотні гени (но інсерційні мутації) або розміщатися в тих частинах хромосоми, які недоступні для транскрипції. Тестування експресії в культурі зробить можливим використання для пересадки ядер, а отже і для отримання трансгенних тварин тільки тих клітинних ліній, в яких трансгени є транскрипційно і трансляційної активними. Крім того, на відміну від методу пронуклеарной ін'єкції дослідження ЕСК дозволяє цілеспрямовано впливати на геном.
Сенсаційне повідомлення було опубліковано в 1996 році в Nature. Була продемонстрована можливість отримання життєздатних овець за допомогою пересадки ядер соматичних клітин, культивованих in vitro. Пізніше повідомили про полученіітрансгенних овець за допомогою пересадки ядер стабільно трансформованих первинних фетальних фібробластів (Schnieke et al., 1997). З шести отриманих трансгенних ягнят п'ять виявилося життєздатними. Ступінь трансгенність при використанні даної, методу становила 100%, в той час як застосування методу мікроін'єкції в тій же лабораторії дозволяло отримати лише 4,35% трансгенних нащадків від кількості народжених тварин. Для отримання одного трансгенного ягняти методом пересадки ядер потрібно 20,8 овець, у той час як при використанні методу пронуклеарной ін'єкції - 51,4 вівці [Schnieke et at., 1997]. Як і при використанні ЕСК, даний метод дозволяє проводити аналіз інтеграції в культурі клітин, а також здійснювати цілеспрямоване вбудовування генних конструкцій у бажані ділянки геному. Крім того, використовувані клітинні лінії можуть бути каріотіпізіровани в культурі, що дозволить заздалегідь визначати стать трансгенних тварин. Після отримання трансгенних тварин з різних клітинних ліній та визначення рівня експресії може бути проведений відбір бажаних клонів для їх подальшого використання в пересадках ядер. Схема отримання трансгенних тварин з використанням стабільно трансформованих клітин.
Ліпосоми як переносники ДНК
Векторами для перенесення генних конструкцій у ембріональні лінії ссавців можуть служити ліпосоми [Rottmann et al, 1985], однак опосередкований ними перенесення генів не отримали широкого розповсюдження.
Використання статевих клітин сім'яників (спермії і сперматогонії)
Сперматозоїди є природним вектором, що приносять ДНК у клітину. Використання сперміїв в якості переносників однієї ДНК розглядається як один з перспективних методів генетичної модифікації тварин. У дослідах Lavitrano (1989) 30% мишей отриманих після запліднення обробленої ДНК спермою, виявилися трансгенними і передавали Трансген у спадок.
Численні спроби в інших лабораторіях неуспішними. Аналіз 1300 мишей, народжених in vitro обробленої ДНК спермою, не виявив Трансген ні в жодній з досліджуваних особин [Brinster, 1989), Недавнє дослідження показали, що при застосуванні методу переносу ДНК за допомогою сперматазоідов в одній і тій же лабораторії дае пра використанні однакової схеми досліджень можуть бути отримані суперечливі результати [Maiore et al, 1998]. Це дозволяє припустити, що вбудовування ДНК відбувається тільки на певній стадії клітинного циклу. Однак до теперішнього часу не встановлено механізм інтеграції екзогенної ДНК в геном сперматозоїдів.
Huguet і Esponda [1998] досліджували здатність сперматозоїдів поглинати лінійну ДНК in vitro і in vivo. У дослідах in vitro відмиті прідатковие сперматозоїди інкубували 2 години з лінійної ДНК. ДНК ін'єктувати в проксимальну область сім'яних канальців, після чого через 6 годин витягували сперматозоїди. Присутність чужорідної ДНК було показано у 60-70% сперматозоїдів. Сперматозоїди здатні поглинати ДНК, акумулювати її в ядрі. Секркти придатків і сім'яних канальців не блокують цей процес.
Для підвищення ефективності зв'язування ДНК із сперматозоїдами використовують різні методи: ДНК-ліпосомних комплекси [Bachiller et al .. 1991], ін'єкцію в насінники [Sato et al .. 1994], безпосередню ін'єкцію в сім'яні канальці [Kim et al .. 1997] і придатки [Huguet і Esponda, 1998], ін'єкцію в сім'яні канальці з подальшою електропорація [Yamazaki et al .. 1998], ко-ін'єкцію головок сперміїв і ДНК в ооцити [Perry et al. 1999]. Також було показано, що екзогенна ДНК може бути ефективно доставлена в ооцити мікроін'ецірованнимі сперматозоїдами.
Велика увага останнім часом привертають маніпуляції із стовбуровими клітинами сім'яників-сперматогонії [Brinster, Nagano. 1998]. Була продемонстрована можливість перенесення сперматогонії від одного самця іншого як у тварин одного виду (Avarbock, 1994; Brinster і Zimmermann. 1994), так і між двома видами.
Після пересадки статевих клітин з сім'яників самця миші в насінники іншого самця, до 80% потомства відбувалося з сперматозоїдів самця-донора. Була доведена можливість успішного перебігу сперматогенезу після пересадки кріоконсервованих клітин семенника і після їх тривалого консервірованія.пересадке в насінники мишей клітин з сім'яників пізніх стадій сперматогенезу статевих клітин донорів виявлено не було / Dobnnski et al., 1999].
Успішне тривалий культивування статевих клітин тварин in uru робить можливим проведення трансформації сперматогонії екзогенної ДНК з подальшою селекцією. Nagano з співавторами 2000] повідомили про успішне запровадження екзогенної ДНК в сперматогонії т vitro та in vivo за допомогою ретровірусної системи доставки. Експресія ретровірусної генної конструкції, що включає lacZ, спостерігалася в сім'яниках більше 6 місяців. Аналіз показав, що принаймні 1 з 300 стовбурових клітин сім'яників містять трансгени.
У поєднанні з пересадкою трансформованих статевих клітин у насінники реципієнтів і успішним протіканням сперматогенезу підхід може бути використаний для отримання трансгенного потомства.
Не дивлячись на хороші результати у використанні сперматозоїдів для отримання трансгенних мишей, а також окремі успішні спроби отримання трансгенних свиней та ВРХ [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], яких-небудь значних успіхів у отриманні трансгенних сільськогосподарських тварин за допомогою трансформованих сперматогонії і сперміїв до теперішнього часу досягнуто не було. Досягнення у використанні трансгенних технологій.
ФАКТОРИ ПІДВИЩЕННЯ ЕКСПРЕСІЯ ТРАНСГЕНІВ В ОРГАНІЗМІ ТВАРИН
Поряд з низькою ефективністю більшості методів трансгенеза основним лімітуючим чинником отримання трансгенних є випадковий характер інтеграції трансгена в геном. На експресію трансгена в організмі тварин впливають послідовності, прилеглі кв ділянці інтеграції, що є причиною великої варіабельності рівня експресії. Рівень синтезу трангенного продукту може варіювати у різних тварин від ектопного до слабкого або навіть знаходиться нижче порога детекції.
Вплив ділянки інтеграції на рівень і характер експресії пояснюється так званим позиційним ефектом [Wilson et al., 1990, Sippel., 1997). Крім того, обмежені знання регуляторних послідовностей більшості генів призводять до використання часто повністю не охарактеризованих геномних фрагментів, що і є причиною низької ефективності експресії в експериментах з перенесення генів [Palmlter, Brinster, 1986].
Для того щоб подолати позиційний ефект і таким чином збільшити ймовірність оптимальної експресії трансгенів, інтегірованних у випадковій локалізації, був застосований цілий ряд різних стратегій.
Першим таким підходом, що дозволив збільшити рівень експресії, було введення в генні конструкції гомологічних інтрони послідовностей. Позитивний вплив на рівень експресії трансгенів справляло введення в генні конструкції S / MAR-елементів
Найбільш вдалим рішенням проблеми подолання позиційного ефекту стало інтеграція в певну ділянку геному за допомогою гомологічною рекомбінації в ембріональних стовбурових клітинах, оскільки це забезпечує контроль трансгенної конструкції всіма регуляторними послідовностями, присутніми в обраному ендогенному локусі. Оптимальна локалізація трансгенів у геномі клітини господаря може бути обрана виходячи з рівня та характеру експресії експериментального трансгена. Ще одним підходом, що дозволив дайной інтеграції трансгена в геном господаря є включення в генні конструкції всіх регуляторних елементів, відповідальних за його експресію. Стандартні плазмідні, космідние або фагових вектори в більшості випадків не можуть бути використані, внаслідок їх обмеженої місткості. Дана стратегія може бути використана із застосуванням векторів типу штучних хромосом, які мають підвищену клонуючої здатністю.
Найбільш широке застосування для отримання трансгенних тварин знайшли векторні системи на основі YAC (огляди Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC-еукаріотичні клонуючі вектори, здатні до стабільного збереження геномних фрагментів ДНК довжиною більше 1 мільйона п. о. [Burke., 1987]. Вони являють собою лінійні фрагменти ДНК, що містить всі необхідні елементи для їх збереження в клітинах дріжджів у вигляді штучних хромосом. Перші результати успішного використання YACs в експериментах з трансгенезу на мишах були отримані в 1993 році [Jakobovits et al., 1993, Schedl et al., 1993, Strauss etal., 1993].
Для введення YACs в ембріони мишей знайшли застосування три різних підходи: пронуклеарная мікроін'єкція очищеної в гелі YAC-ДНК [Schedl et al, 1993], ліпофекція YAC-ДНК в ембріональні стовбурові клітини [Strauss et a /., 1993] і злиття дріжджового сферобласта з ембріональними стволовими клітинами [AtoboWte ef a /., 1993). Дослідження експресії YACs у різних ліній трансгенних мишей виявило залежність рівня експресії від числа копії трансгена. З іншого боку, рівень експресії не залежав від позиційного ефекту
У той час, як YAC-технології широко використовуються для отримання трансгенних мишей [огляди Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Кілька ісселдователай повідомили про успішне створення YAC-трансгенних сільськогосподарських тварин. Були отримані свині і щури допомогою ксенотрансплатаціі і спрямованої експресією рекомбінантних генів в молоко трансгенних тварин. Так, Brem з співавторами використовуючи концентрації YAC-ДНК 1-4 нг/мкл, отримали 7,4% трансгенних кроликів, що відповідало загальній ефективності 0,74%. Roue з співавторами ін'єктувати в пронуклеус зигот кроликів розчин YAC в концентрації 1 нг / мкл і досягли ступеня інтеграції 11,8% при загальній ефективності 0,71%. Таким чином, розмір ін'еціруемой ДНК суттєво не впливав на ефективність одержання трансгенних тварин.
Було встановлено, що при мікроін'єкції YAC в пронуклеос зигот тварин часто відбувається інтеграція в геном тільки частини молекули. Причиною може бути механічне пошкодження молекул ДНК великої довжини в ході приготування розчину ДНК і мікроін'єкції в пронуклеос. Щоб припинити пошкодження додають поліаміни, які формують комплекси з ДНК і стабілізують її допомогою утворення компактних структур.
Не дивлячись на величезні переваги векторів на основі YAC, вони мають ряд недоліків, що виражаються в певних труднощах лри створенні і підготовці YAC-конструкцій. До них відносяться химеризмом інсерцій (більше 50% клонів в YAC бібліотеці), нестабільність інсерцій, перебудови і потенційна контамінація ендогенними дріжджовими хромосомами, що ускладнює їх ефективне очищення. З метою виключення таких проблем були створені інші типи векторів на основі штучних хромосом, такі як клони Р1-фага, BAC - "bacterial artificial chromosome", PAC - "P1 bakteriophage-derived artificial chromosome".
Клонуються система бактеріофага Р1 може ефективно зберігати інсерцій гетерологічних ДНК розміром 70-100 т.п.о. [Stemberg, 1999].
Поряд з YACs BACs використовуються для виконання широкого спектру фундаментальних досліджень, що включає вивчення мутацій, дослідження функції і дії генів in vivo, ідентифікація та аналіз регулярних послідовностей, що знаходяться на значній відстані від структурного гена. Потенційні можливості BACs знайшли також застосування для підвищеної експресії рекомбінантних білків у молочній залозі трансгенних тварин [Stinnakre et al., 1999, Zuelke, 1998].
ПЕРСПЕКТИВИ ГЕННО-ІНЖЕНЕРНІ РОБІТ У ТВАРИННИЦТВІ
Розвиток біотехнології сільськогосподарських тварин, у тому числі генна інженерія, відкриває нові можливості розвитку тваринництва. Вже наявні результати з отримання трансгенних тварин говорять про можливість зміни ряду найважливіших господарсько-цінних ознак. Наприклад, трансгенні тварини (свині, кури, кролики) з геном гормону росту при рівних умовах характеризуються підвищеними темпами зростання.
Іншим важливим напрямом генної інженерії є одержання трансгенних особин з інтегрованими в геном генними конструкціями, пов'язаними з посиленням імунітету тварин до інфекційних захворювань.
Третім актуальним напрямком генної інженерії жівотниж є отримання тварин продуцентів біологічно активних речовин, необхідних у медицині, ветеринарії та технології переробки продуктів тваринництва. Багато біологічно активні речовини не можуть проводитися традиційними методами в достатніх кількостях і з бажаною якістю. Існує величезний комерційний інтерес до виробництва цих білків. У сироваріння існує значний дефіцит молокозсідальної ензимів, в зокрема, химозина, необхідного для отримання високоякісних твердих сортів сиру. Першим примірником трангенного тваринного стала миша, розмірами вдвічі перевершує звичайну особина в неї був введений ген, що синтезує гормон росту пацюка. І вчених відразу зацікавила можливість трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Напрямок, пов'язаний з отриманням з трансгенних сільських тварин людських білків вже наближається до стадії комерціалізації. Вчені небезуспішно намагаються синтезувати людські білки в бактеріях і дріжджах. Але це дорого і технічно складно: з бактеріальних культур не завжди вдається виділити чистий білок. До того ж деякі білки неможливо отримати в бактеріях чинності громіздкість генів, що визначають їх синтез. Біореактор у вигляді корови або вівці позбавлений цих недоліків, і він набагато продуктивніше, а кінцевий продукт (білок) виходить в десятки разів дешевше. Але почалося все знову-таки з миші. У 1987 році в США вивели трансгенних мишей, в молоці яких містився тканинний плазміну-генний активатор, сприяє розсмоктуванню тромбів в людських судинах. Після цього успіху напрямок зацікавило великий капітал (ринок лікарських білків оцінюється приблизно в 10 млрд. доларів), і в надії на ефективність нової технології на майбутньому ринку почали впроваджуватися біотехнологічні гіганти, активно інвестуючи в НДДКР. За неповні десять років, що минули з американського досягнення, від трансгенних кіз, овець, свиней, кролів і навіть корів було отримано сімнадцять лікарських білків. Причому десять з цих білків виділялися з молоком в пристойній концентрації - близько одного грама на літр молока. Це велика кількість, оскільки для курсу лікування деяких хвороб потрібно всього кілька міліграмів. А зараз таким способом навчилися синтезувати набагато більше білків. Як мінімум три препарати, отриманих від трансгенних тварин, проходять сьогодні останні клінічні випробування.
Найбільш цікавим є використання молочної залози як продукуючого органу, тому що в цьому випадку рідину, що містить рекомбінантні протеїни, можна легко витягнути. Крім того, молочна залоза фізіологічно володіє величезним потенціалом синтезу протеїнів. Принципова можливість специфічної експресії трансгенів протеїну молока і чужорідних протеїнів у молочній залозі була продемонстрована в експериментах на мишах, кроликах, свинях, вівцях, кіз. Серед сільськогосподарських тварин отримання і використання трансгенних дрібних жуйних значно дешевше (на одиницю біологічної продукції), ніж корів, тому що вівці та кози мають коротку репродуктивним періодом і в разі інтенсивної експресії відповідного гена відразу ж відкривається можливість швидкого розмноження трансгенних тварин, створення промислового стада продуцентів і перманентних ліній трансгенних тварин, експрес-ючий бажані протеїни. При отриманні трансгенних тварин дослідники прагнуть до того, щоб всі соматичні клітини (повна трансгенність) і, особливо, генеративні клітини, містили генну конструкцію. У цих випадках інтеграція рекомбінантної ДНК призводить до повної трансгенів і за умови достатньої експресії обумовлює зміну фенотипу тварин і передачу цієї ознаки потомству. Основним способом одержання трансгенних тварин на сьогоднішній день залишається мікроін'єкція рекомбінантної ДНК в чоловічій пронуклеус ранніх зигот. Тому мікроін'єкцій генів здійснюють на максимально ранніх етапах розвитку тварини: в більшості випадків на стадії заплідненої яйцеклітини або двуклеточний ембріонів. Вже є трансгенні по гену химозина кролики з промотором казеїну великої рогатої худоби, в молоці яких відзначений високий рівень химозина і доведена його висока активність. У деяких кроликів в 1л молока міститься до 1500 мг химозина, а за лактацію від одного кролика можна одержати таку кількість химозина, яке здатне переробити до 10000 кг коров'ячого молока. Якщо врахувати, що для згортання 1 тонни молока при виробництві сиру потрібно 1 г химозина, то для виробництва сиру в Росії буде потрібно лише 300 кг химозина. Для цього необхідно мати «біотехнологічну» або «генну» ферму на 5 - 6 корів або 300 овець. Слід підкреслити, що головним критерієм при виборі відповідного виду тварин для «генних» ферм у більшості випадків повинен бути необхідний обсяг виробництва. Для виробництва протеїнів у молочній залозі в масштабах тонн доцільно використовувати корів, в сотнях кілограмів - овець і кіз, а в кілограмах - кроликів (Brinster Е.А., 1985).
В даний час розробляються і апробуються системи організації та функціонування біологічних підприємств на племінних фермах, що використовують трансгенних овець або кіз. Основна і найбільш трудомістка робота-створення первинних трансгенів з гарною продукцією (експресією) білка інтересу або т.зв. «Генних ферм». Для досягнення цієї мети, особливо в молочному козівництві, витрачені великі матеріальні та інтелектуальні ресурси, проте говорити про розвинену та діючої біоіндустрії на основі трансгенних овець і кіз, особливо в нашій країні, передчасно. Пов'язано це в першу чергу з тим, що метод мікроін'єкцій в пронуклеус не стовідсотковий. Часто трапляється, що генна конструкція може взагалі не вбудуватися в геном тварини, а якщо і вбудується, то може виявитися не у всіх клітинах. З трансплантованих яйцеклітин з генної конструкцією прижитися може лише п'ята частина, а вбудуватися в потрібну ділянку геному - 1-2%. Великого мистецтва вимагає і трансплантація зиготи в статеві шляхи самки. Інша проблема - пошук і виділення найбільш ефективних генних конструкції. Проводяться інтенсивні досліди з різними тваринами, з метою отримання такої експресії білка, яка була б найбільш економічно вигідною. Зараз біотехнологи Інституту біології гена і МГУ створюють конструкцію, яка буде містити ген, що визначає синтез лактоферину (білка, що відповідає у жіночому молоці за імунітет новонародженого). Складність полягає в тому, щоб підібрати до цього гену такий промотор, який не просто змусить його працювати в тканині молочної залози, а працювати ефективно, тобто викликати найбільший рівень експресії потрібного білка. Як правило, перші досліди зазвичай проводяться з мишами. На відміну від великих тварин їх простіше і дешевше утримувати, вони швидко доходять до статевозрілого віку, тому менше часу йде на отримання і розмноження трансгенних особин для подальшого їх вивчення. Далі спостерігають, які яйцеклітини прижилися, в яких тварин генна конструкція вбудувалася в активну частину генома. У кращому випадку зі ста яйцеклітин може вийти один-два трансгена (Ернст Л.К., 1993, Clark AJ Е.А., 1989, Pursel VG Е.А., 1990, Wilmut Iea, 1991). Як тільки в мишачому молоці з'явиться бажаний рівень лактоферину, можна буде переходити на продуктивних сільськогосподарських тварин, зокрема, кіз. Коза не так плодовита, як миші, і може народити двох, у кращому випадку трьох ягнят, тому кіз в експерименті повинно бути багато.
У той же час у кози, як біологічного об'єкта для генно-інженерних робіт, є чимало переваг. На кілограм живої маси коза дає в 2-3 рази більше молока, ніж корова, її репродуктивний цикл практично вдвічі коротше, і, нарешті, вона менш вибаглива і більш стійка. І все ж найбільш важлива проблема - доставка генної конструкції не просто в ядро яйцеклітини, а в потрібну хромосому. На думку багатьох фахівців, вимагають тонкої і точної роботи мікроін'єкції генів у зиготу можуть бути замінені в недалекому майбутньому більш ефективної і тиражованою технологією. І, судячи з публікацій, вчені наближаються до вирішення цього завдання. Поки ж більш ефективним методом, ніж мікроін'єкції гена в зиготу, представляється метод клонування тієї клітини, яка була відібрана в результаті численних дослідів в лабораторних умовах. Потомство, яке народилося з застосуванням такої технології, буде стовідсотково трансгенним. Втім, ця технологія тільки розробляється, її механізм ще не відпрацьований. Можна тільки з достатньою впевненістю припустити, що вже в найближче десятиліття технологія клонування може стати превалюючою
На закінчення хотілося б підкреслити, що, розробка теорії трансгенезусільськогосподарських тварин і пошуки шляхів практичного використання цього методу йдуть паралельно, у зв'язку з чим одержання як позитивних так і негативних результатів цілком можливо. Останнє десятиріччя XX століття знаменно глибоким інтегруванням біотехнології та молекулярної генетики в сучасну зоотехнії і в практику селекційно-племінної роботи. Ця взаємодія починається з планування генних конструкцій, яке базується на фундаментальних даних про обмінні процеси, що відбуваються в організмі тварин і знанні основних генетичних закономірностей, які керують формуванням їх продуктивності і закінчується об'єктивною оцінкою ефекту інтеграції в геном тварин чужорідного гена. Очевидно також, що можливість отримання трансгенних сільськогосподарських тварин реалізувалася в результаті розвитку методу трансплантації ембріонів, що саме по собі є серйозним досягненням зоотехнічної науки. Як і слід було очікувати, інтеграція в геном тварин чужорідних генів, незалежно від того, аналогічні вони вже наявних, або є новими, що зачіпають життєво важливі функції організму, викликає за активної їх експресії порушення фізіологічного гомеостазу як на клітинному так і на організмовому рівнях. При переході порога внутрішніх можливостей корекції посиленого генно-інженерним шляхом ознаки метаболічними системами тварин наставало розвиток різних патологічних змін, у тому числі і прогресуючих, що призводять до скорочення тривалості життя трансгенних тварин, порушення їх відтворної функції (Ернст Л.К. і співавт., 1993 ). Для вирішення завдання генно-інженерного зміни кількісних ознак тварин, що мають полігенну природу, очевидно, буде потрібно одержання політрансгенних сільськогосподарських тварин тільки внаслідок технічних причин (оскільки для цього, можливо, буде потрібно здійснення багатоступеневого трансгенеза), а й з-за неможливості клонувати ще невідомі гени. У зв'язку з цим основний інтерес більшості дослідників пов'язаний зараз з генами, робота яких визначає відносно незалежні морфофункціональні ознаки тваринного (інформаційний генетичний імунітет, продукція білків тварин і людини). Не виключено, однак, що на цьому шляху може бути отримано позитивну зміну будь-яких інших господарсько-корисних ознак тварин, визначених одиничними генами тварин.
Таким чином, успіхи в галузі молекулярної генетики та біології гена повинні забезпечити подальший прогрес у проблемі трансгенеза сільськогосподарських тварин, а, отже, у підвищенні ефективності і рентабельності виробництва різноманітної тваринницької продукції.