Серологічіні реакції для серологічної ідентифікації. Серологічні реакції для серологічної діагностики.

Сучасні методи імунологічних досліджень при інфекційних хворобах (імунофлуоресцентний, імуноферментний аналіз, генодіагностика, полімеразна ланцюгова реакція). Серологічні реакції, які використовуються у вірусології. Гіперчутливість негайного і сповільненого типу.

Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою: 1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів - для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами - для серологічної ідентифікації збудників.

Якщо в реакції антитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени (бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації (РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антигенами (полісахариди, білки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У реакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й антитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких залежить від кількісного співвідношення антигену й антитіла

Коли до комплексу антиген — антитіло приєднується комплемент, відбувається реакція зв'язування комплементу (РЗК).

Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати нейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію негайної гіперчутливості.

Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають властивості спричинювати РП, РА, РЗК-

У ряді випадків з'єднання антитіла з антигеном може бути неміцним; оборотність комплексу антиген—антитіло відбувається в результаті конформаційних змін молекули антитіла, при надлишку антигену або зменшенні спорідненості між антигеном і антитілом, а також під впливом зовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).

Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й полісистемні.

РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ Аглютиніни — антитіла, що мають властивість спричиняти склеювання відповідних бактерій, еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, клітин тканин, корпускулярних хімічних часточок з адсорбованими на них антигенами або антитілами з утворенням конгломератів (аглю-тинатів), видимих неозброєним оком.

Додавання відповідних імунних сироваток до зависі бактерій спричиняє їх аглютинацію і випадання в осад у вигляді пластівців або зерен. В реакції аглютинації (моносистемній, прямій, двокомпонентній) беруть участь антитіло (аглютинін) і корпускулярний антиген (аглютиноген); вони взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях і при наявності електроліту (0,85 % розчин натрію хлориду).

РА бактерій з відповідними аглютинуючими сироватками характеризується специфічністю. Проте може траплятися групова аглютинація, тобто склеювання близьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в слабших розведеннях сироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, бактерія В — b, c, d, бактерія С — с, d, є, а в сироватках крові імунізованих тварин утворюються відповідні їм аглютиніни.

Для виявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тварин, імунізованих складним комплексом антигенів бактеріальної клітини, застосовують метод адсорбції аглютинінів (реакція виснаження Кастеллані).

За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають також антигенну структуру бактерій; крім того, його використовують для приготування специфічних аглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті методом адсорбції аглютинінів, називають монорецепторними. Вони дають змогу точніше визначати видову залежність низки збудників інфекційних захворювань.

При імунізації тварин рухливими бактеріями, що містять джгутикові (Н) і соматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. Джгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких пластівців, соматичні аглютиніни порівняно повільно утворюють конгломерати бактерій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається крупнопластівцевою, а О-аглютинація — дрібнозернистою.

Бактерії, що містять Vi-антиген, слабко або зовсім не аглютинуються О-сироватками, але добре аглютинуються Vi-сироватками. Це доводить, що О- і Vi-антигени, так само як О- і Vi-антитіла, мають різну структуру.

При здійсненні РА треба враховувати феномен затримки аглютинації. Це буває як при занадто великих, так і при малих концентраціях імунної сироватки, взятої для РА. Цей феномен властивий усім реакціям імунітету і має враховуватись при лабораторній діагностиці інфекційних захворювань.

РА широко застосовують для серологічної діагностики черевного тифу, паратифів А і В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями Провачека), туляремії, лептоспірозу та інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці крові хворих відповідні аглютиніни.

РА використовують для ідентифікації виділених у хворих, людей і тварин мікроорганізмів із застосуванням заздалегідь відомих аглютинуючих сироваток.

Крім прямої аглютинації, у практиці діагностики інфекційних захворювань застосовують також реакцію непрямої гемаглютинації (РИГА), сутність якої полягає в тому, що антиген, який використовується для проведення РА з сироватками крові хворих, попередньо адсорбований на поверхні еритроцитів барана. Зокрема, РНГА застосовують при діагностиці черевного, висипного тифу і паратифів, туберкульозу, токсоплазмозу та ін. Для здійснення РНГА можна використати спеціальні еритроцитарні діагностикуми (завись формалізованих еритроцитів, «навантажених» антигенами або антитілами).

Реакція аглютинації латекса (РАЛ) Для постановки РАЛ використовують сенсибілізовані частинки полістиролового латекса діаметром 0,5-1,2 мкм, які в присутності гомологічного імунологічного реагента (антигена або антитіла) склеюються. Ця реакція відбувається досить швидко – протягом 2-7 хв, що дозволяє її застосовувати як експрес-метод виявлення антигенів і антитіл. Навантажені антитілами часточки латексу широко використовуються для виявлення антигенів вірусів і бактерій.

Навантажуючи латекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у сироватці хворого. Таку модифікацію РАЛ використовують для виявлення протигрипозних, протикраснушних, протикорових антитіл тощо.

Реакція коаглютинації (КОА). Для постановки КОА використовують золотисті стафілококи (штам Cowan 1). У клітинній стінці цих мікроорганізмів міститься білок А, який має значну спорідненість до Fc фрагмента IgG людини і кролика. Тому молекули IgG після адсорбції на стафілококах, що мають білок А, орієнтовані в оточуюче середовище своїми вільними Fab фрагментами, в яких знаходиться активний центр антитіла.

Реакцію ставлять на скляних пластинках, змішуючи рівні об’єми (1-2 краплі) досліджуваного матеріала (кров, сеча, слина, фільтрати фекалій та інш.) і стафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують і через 2-5 хв на темному фоні враховують результати. На темному фоні повинна чітко буде проглядатись дрібнозерниста аглютинація стафілококів.

1. Реакція преципітації відрізняється від аглютинації за характером антигенів: в реакції аглютинації вони корпускулярні, навіть цілі клітини, а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні речовини.

Реакція преципітації (РП) — взаємодія розчинного антигену (пре-ципітиногену) й антитіла (преципітину) в присутності електроліту (0,85 % розчин натрію хлориду).

РП має високу чутливість і специфічність. Вона дає змогу виявити антиген (преципітиноген) у розведенні 1 : 1 000 000 і 1 : 10 000 000. Як преципітиногени можуть бути використані білки тваринного, рослинного і бактеріального походження: кров, сироватка крові, екстракти з різних органів і тканин, харчових продуктів білкового походження (м'ясо, риба, молоко), фільтрати культур мікроорганізмів або тканин, уражених ними. Преципітиногени збудників сибірки, чуми, туляремії термостійкі. Деякі преципітиногени витримують нагрівання до температури 120—180 °С.

Відомо понад 20 модифікацій РП, які поділяють на кілька груп: РП у пробірках, капілярах, на предметних стеклах, фільтрувальному папері, ацетатцелюлозній плівці, в гелі та ін.

РП використовують у діагностиці сибірки, туляремії, віспи та ін., а також при вивченні антигенної структури деяких груп бактерій. У судовій медицині за допомогою РП визначають видову належність плям крові, сперми; в санітарній експертизі виявляють домішки молока одного виду тварини у молоці іншого виду, добавляння штучного меду до натурального, фальсифікацію м'ясних, рибних, борошняних виробів і т. д. У біології РП застосовують для встановлення генетичних зв'язків близьких між собою видів тварин, рослин, мікроорганізмів.

Феномен преципітації полягає в тому, що антитіла (преципітини), зєднуючись із розчинними антигенами (преципітиногенами), зумовлюють утворення осаду (преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції приймають найбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.

Феномен преципітації широко використовується в мікробіологічній практиці. В судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального менінгіту, чуми, дизентерії, визначення інфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина).

Для аналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципітації в гелі. Розрізняють просту і подвійну дифузію в гелі.

Проста імунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, який містить преципітуючу сироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху нашаровують розчин антигена. Дифундуючи в гель, антиген звязується з відповідними антитілами, утворюючи мутні лінії преципітації (рис. 17.10.). Розміщення ліній в агарі визначається концентрацією відповідного антигена.

Подвійна імунодифузія за Оклі і Фулторпом. На відміну від попереднього методу у подвійній імунодифузії реагенти розділені шаром нейтрального гелю, який не містить реагентів. На поверхню гелю, змішаного з специфічною сироваткою, вносять шар нейтрального гелю, після застигання якого нашаровують антиген. Дифундуючи назустріч один одному, антиген і антитіла зустрічаються в шарі нейтрального геля та утворюють лінії преципітації.

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який розлитий тонким шаром в чашках Петрі або на предметних скельцях, за допомогою спеціальних штампів роблять круглі лунки на однаковій відстані одна від одної (4-10 мм). У лунки вносять досліджувану сироватку і розчин антигена в різних розведеннях або різні антигени. Із лунок антигени й антитіла дифундують назустріч один одному, і в точці їх оптимального співвідношення утворюється преципітат у вигляді тоненьких білих ліній. Якщо в сироватці є різні антитіла або антигени декількох видів, зявляються декілька ліній преципітації.

Ухтерлоні розрізняв 4 основні варіанти реакції між антигеном і антитілом :

1) при взаємодії ідентичних антигенів із специфічними антитілами лінії преципітації зливаються, утворюючи дугу;

2) коли обидва антигени неідентичні - лінії преципітації перехрещуються при умові, що сироватка містить антитіла проти двох антигенів;

3) при частковій ідентичності лінії преципітації нагадують дугу із шпорою. Чим більшою є спорідненість антигенів, тим шпора менше виражена і розміщується ближче до дуги;

4) обидві лінії перехрещуються і одночасно зливаються. Це означає, що обидва антнгена містять як одинакові, так і різні детермінанти, які вступають в реакцію з антитілами поліспецифічної сироватки

Однією із різновидностей реакції преципітації в гелі є проста радіальна імунодифузія за Манчіні. За її допомогою визначають концентрацію імуноглобулінів у сироватці крові.

Методика постановки реакції наступна. Розтоплений агар при температурі 56°С змішують з відповідною антисироваткою (анти IgG, IgM чи IgA) у співвідношенні 3:1 і швидко вливають у чашку Петрі або на скляні пластинки. Після його застигання з допомогою трафарета роблять лунки. У кожну дослідну лунку вносять по 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні лунки додають у чотирьохкратних розведеннях стандартну сироватку з відомим вмістом імуноглобулінів.

Після чого чашки або пластинки поміщають у вологе середовище в ексикатор на 24-48 год при 4°С і оцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець преципітації навколо лунок. За величиною діаметрів кілець преципітації навколо лунок із стандартною сироваткою будують калібровальну криву. При цьому враховують, що у певному інтервалі концентрації імуноглобулінів діаметр кільця прямо пропорційний логарифму концентрації імуноглобулінів .

Реакція радіальної імунодифузії Манчіні

Феномен преципітації широко використовується в мікробіологічній практиці. Зокрема, у судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального менінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція термопреципітації Асколі, яку використовують для визначення інфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із досліджуваного матеріалу шляхом кипятіння екстрагують сибірковий антиген, який потім використовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить феномен преципітації. Її використовують для визначення антигенного складу органів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у складних системах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та інших захворювань.

2. Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – електрофорезу в гелі і наступної після нього подвійної імунодифузії.

Для проведення реакції імуноелектрофорезу використовують скляні пластинки, предметні скельця, на які наносять тонкий шар агару або агарози. Спочатку антигени розміщують в центрі пластинки і розділяють їх в електричному полі. Потім у канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії розділу антигенів, вносять специфічну сироватку. Дифундуючи назустріч один одному, антигени і антитіла у місці контакту утворюють дуги преципітації.

Лізини і реакції лізису

Лізинами називають специфічні антитіла, які спричиняють розчинення бактерій, клітин рослин і тварин. Лізис бактерій відбувається за участю двох інгредієнтів: специфічного антитіла, яке є в імунній сироватці, і неспецифічної речовини будь-якої нормальної й імунної сироватки — комплементу.

Лізини мають властивість розчиняти бактерії, трепонеми, лептоспіри (бактеріолізини), а також спричиняти глибокі порушення структури еритроцитів (гемолізини), лейкоцитів та інших клітин (цитолізини). Вони мають усі основні властивості антитіл, але діють на антиген тільки в присутності комплементу.

Реакція лізису моносистемна, непряма, трикомпонентна. У зв'язку з нестійкістю комплементу в реакціях лізису використовують консервований комплемент, найчастіше сироватку крові морської свинки. Консервують комплемент добавлянням натрію хлориду в концентрації до 10 %, або 4 % борної кислоти, або 5 % натрію сульфату, а також висушуванням при низькій температурі у вакуумі (ліофілізація).

а б в

Послідовні фази лізису (а, б, в) холерних вібріонів.

При імунізації кролів зависсю еритроцитів барана у них в крові накопичуються антитіла, що мають властивість змінювати еритроцити, в результаті чого адсорбційний зв'язок між гемоглобіном і стромою еритроцитів порушується, гемоглобін легко проникає з еритроцитів в оточуючу рідину і вона забарвлюється в рожевий колір. Нагрівання імунної сироватки при температурі 56 °С протягом ЗО хв супроводиться втратою її гемолітичних властивостей внаслідок інактивування комплементу, а добавляння свіжої сироватки крові тварини, навіть неімунізованої, знову відновлює гемолітичні властивості імунної сироватки. Якщо в пробірку вмістити у відповідних кількісних співвідношеннях гемолітичну сироватку (антитіло), еритроцити барана (антиген) і комплемент, то протягом кількох хвилин суміш із каламутно-червоної стає рожевою (лаковою).

Реакція гемолізу має яскраво виражену специфічність. її використовують як індикатор для реакції зв'язування комплементу.

Отже для реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) використовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того, проти яких клітин спрямована дія лізинів, вони мають свої назви: проти бактерій – бактеріолізини, спірохет – спірохетолізини, еритроцитів – гемолізини, проти інших клітин – цитолізини. Комплемент при утворенні комплексу клітина (антиген) – антитіло, звязується з ним, активується за класичним шляхом і викликає розчинення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу.

Реакція лізису

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити барана), антитіло (гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської свинки або стандартний сухий комплемент). Для одержання еритроцитів у барана беруть кров із яремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергійно струшують, щоб нитки фібрину намотались на кульках, і кров не згорнулась. Потім ізотонічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми. Для цього кров центрифугують 10 хв при 2000 об/хв. Плазму відсмоктують піпеткою, а до осаду еритроцитів знову додають ізотонічний розчин, ретельно перемішують і центрифугують. Таке промивання еритроцитів роблять тричі. Рідину обережно відсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації кроликів еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої готують сироватку, де містяться антитіла проти еритроцитів. Для інактивації комплементу, що знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і визначають титр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у потрійному титрі. Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до 1:600. Комплемент беруть у розведенні 1:10.

Схема постановки реакції гемолізу

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити лізувались. Рідина червоного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні пробірки немає. Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осіли на дно, рідина над ними безбарвна.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент не зв’язується, залишається вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити барана – гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповідності антигена антитілу з ним зв’язується комплемент. Щоб переконатись в цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна (рис. 54).

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні сироватки відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку прогрівають при 56 °С протягом 30 хв, для інактивації власного комплементу, а потім готують ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами можуть бути бактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні речовини, екстракти органів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою гвінейської свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку використовують у потрійному титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолітичні сироватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому зберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед основним дослідом титрують. У ряді пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні розведення гемолізину до титру. У кожну пробірку вносять по 0,5 мл 3 % зависі еритроцитів, по 0,5 мл комплементу у розведенні 1:10 і по 0,5 мл фізіологічного розчину. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину. При відсутності гемолізу в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за трьохплюсовою системою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), відсутність гемолізу (–).

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її розведення, яке в присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть робочу дозу гемолітичної сироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки складав 1:1800, то робочою дозою буде 1:600.

Схема титрування гемолітичної сироватки

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК для визначення дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб повністю зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу залишиться незв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, останні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом додають 1 мл ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково розводять 1:10 і використовують як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози комплементу, починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого об’єму 1,5 мл додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з рівних об’ємів 3 % суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в робочому титрі. Її витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що необхідно для зв’язування еритроцитів із гемолізином.

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробірки вносять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 – 0,5 мл ізотонічного розчину. Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину.

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром комплементу буде та його найменша кількість, при якій спостерігається повний гемоліз (+++). Робоча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і практично вона буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій пробірці, де є повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу приймають 0,25, ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Схема титрування комплементу

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК запропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з цією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний об’єм її становить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній послідовності. Спочатку в пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають рівні об’єми антигена і комплементу в робочій дозі. Пробірки ретельно струшують і ставлять у термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з антитілом, і на цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в термостаті інкубують гемолітичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду додають по 1 мл гемолітичної системи і знову ставлять у термостат. Через 30-45 хв проводять облік реакції при умові повного гемолізу в контролях сироватки, антигена і комплементу.

Схема постановки основного досліду РЗК

РЗК оцінюють за чотириплюсовою системою: різко позитивна реакція (++++, +++) – повна затримка гемолізу, рідина безколірна або блідо-рожевого кольору, еритроцити осідають на дно; позитивна реакція (++) – часткова затримка гемолізу, рідина рожевого кольору, компактний осад еритроцитів; сумнівна реакція (+) – незначна затримка гемолізу, на дні ледь помітний осад, рідина рожевого кольору; негативна реакція (–) – повний гемоліз, осад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу відзначається більш високою специфічністю ніж реакція аглютинації, проте вона менш чутлива. Антитіла, які зв’язують комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту захворювання, в той же час аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох інфекційних захворювань, алергічних станів. Вона використовується для серологічної діагностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, лептоспірозу, бруцельозу, туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та ін.), вірусного походження (грипу, паротиту, цитомегалії, поліомієліту, лімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), грибкових (кандидозу, асперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що при утворенні комплексу антиген - антитіло до нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, то комплемент не звязується, залишається вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити барана – гемолізини вільний комплемент, звязуючись з ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповідності антигена антитілу з ним звязується комплемент. Щоб переконатись в цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна.

Методи ідентифікації вірусів

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

Реакція гемадсорбції

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Облік реакції гальмування гемаглютинації

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслідок чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі системи – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусмісткого матеріалу, який містить 100 ТЦД₅₀, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідними компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бентонітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імунної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середовищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через 2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають нейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при відповідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її можна ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – антитіло – комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

Облік РЗК

У реакціях імунодифузії використовують принцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому середовищі, наприклад, агаровому гелі. У зоні оптимальних співвідношень антигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від кількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія відповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке покривають 1 % агарозою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну лунку вносять специфічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного імуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу гепатиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які розташовані ближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. Після цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Вірусні антигени з негативним зарядом рухаються в напрямку до аноду, а антитіла сироватки – до катоду. Через 24 год в агаровому гелі спостерігають появу ліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити комплекси, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із специфічними антитілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш ефективним, ніж використання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації методу матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з антитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього додають 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють відповідне значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають під електронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у вірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. Існують численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після попереднього зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який дає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який зумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). Метод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для ідентифікації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них специфічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуоресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

РІФ

При реакції радіального гемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У присутності комплементу спостерігається лізис еритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони гемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсутності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як негативну. Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується у вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними противірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції є еритроцити, оброблені таніновою кислотою з адсорбованими на них молекулами противірусних антитіл (сенсибілізовані еритроцити), вірусні антигени і розчин електроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) розводять двократно електролітом, після чого додають такий самий об’єм еритроцитарного антитільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом 30 хв при температурі 37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розподіляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – “перевернута парасолька”. При негативному результаті – щільний, компактний осад з рівними краями.

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали застосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Непрямий ІФА

Облік ІФА

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пероксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчастіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є модифікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergosorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. Фіксовані блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають радіоактивно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції антиген-антитіло.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні зонди, що застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, штучного синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на відміну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділити дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним аналогом трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який знаходиться в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагують з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, свідченням чого є зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфічний субстрат. Зонди з біотином можна виявити, використовуючи мічені флуорохромом антитіла проти біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. Смуги промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулінову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобулінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де наступила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовувати мічені ізотопом антитіла .

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, застосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’язану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної реакції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослідження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ на основі виявлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

Чотири типи реакцій гіперчутливості за Coombs i Gell:

1. Реакції анафілактичні, атопічні.

2. Реакції цитолітичні, цитотоксичні. Гіперчутливість негайного типу

3. Реакції імунних комплексів (гістотоксичні).

4. Реакції туберкулінового типу - Гіперчутливість сповільненого типу

Алергени поділяються на неінфекційні та інфекційні. Найбільш багаточисленною і різноманітною є група неінфекційних алергенів.

До них відносяться: пилкові, побутові, епідермальні, харчові алергени.

Однією із найбільш розповсюджених груп неінфекційних алергенів є група алергенів із пилка рослин, яка спричиняє масові алергічні захворювання – полінози. Полінози тісно пов’язані з сезоном цвітіння різноманітних рослин. У цей час у повітрі одночасно може знаходитись декілька десятків видів пилка.

Розрізняють такі види пилкових алергенів:

1. Із пилку бур’янів – амброзії, лободи, полину, пирію тощо.

2. Із пилку дерев – клена, дуба, берези, ліщини, ясеня.

3. Із пилку злаків – жита, сонячника, кукурудзи.

4. Із пилку лугових трав.

ГІПЕРЧУТЛИВІСТЬ НЕГАЙНОГО ТИПУ

До гіперчутливості негайного типу відносять анафілаксію, сироваткову хворобу, атопії та ін. Гіперчутливість негайного типу проявляється незабаром після введення антигену. У розвитку її бере участь реакція антиген — антитіло в тканинах і рідких тканинних середовищах. Гіперчутливість негайного типу може передаватися від однієї тварини до іншої пасивним способом, тобто при введенні імунної сироватки сенсибілізованих тварин. У більшості випадків стан гіперчутливості негайного типу можна зняти десенсибілізацією.

Анафілаксія

Однією з форм зміненої реактивності є анафілаксія (лат. ana — проти, phylaxis — захист) — стан підвищеної чутливості організму, спричинений повторним введенням антигенів (сироваток, антибіотиків та ін.). Анафілаксію відкрив і вивчив Ш. Ріше, дослідження якого в 1913 р. були відзначені Нобелівською премією.

Першу дозу антигену, яка спричиняє підвищену чутливість, називають сенсибілізуючою (лат. sensibilitas — чутливість), другу дозу, від введення якої розвивається анафілаксія,— вирішальною. Сенсибілізуючу дозу вводять тваринам підшкірно, внутрішньоочеревинно, внутрішньовенно, внутрішньосерцево, вирішальну — внутрішньовенно або внутрішньосерцево і в більшій кількості, ніж сенсибілізуючу. Стан підвищеної чутливості у тварин розвивається не відразу після введення антигену, а через певний (інкубаційний) період (8— 21 день).

Основну роль у механізмі анафілаксії в людини відіграє реакція антигенів з антитілами (IgE), що мають цитофільність до тканинних базофілів (тучних клітин). Повторне введення антигену зумовлює з'єднання його з антитілом на поверхні клітин, що приводить до утворення біологічно активних речовин — медіаторів (гістамін, ацетилхолін, серотонін, брадикінін та ін.) і спричиняє розвиток патологічного процесу: зниження дисперсності гуморального середовища, закупорку капілярів, подразнення нервових закінчень, зміни обмінних процесів і порушення життєдіяльності клітин.

Антитіла (IgE) можуть сполучатися з антигенами як на поверхні клітин, так і в крові, де утворюється багато розчинного комплексу антиген — антитіло, який може фіксувати комплемент. Різні прояви клінічних форм анафілаксії у різних видів тварин залежать від швидкості вивільнення медіаторів, їх кількості і неоднакової чутливості до них органів і тканин.

Найбільш демонстративно клінічна картина анафілаксії відтворюється у морських свинок. Якщо попередньо сенсибілізувати морську свинку підшкірним введенням 0,01 мл кінської сироватки, к потім через 8—21 день внутрішньосерцево ввести їй 0,1—0,5 мл тієї ж сироватки, то в неї розвивається картина анафілактичного шоку. Через 1—2 хв після повторного введення сироватки у морської свинки виникає неспокій, її шерсть стає скуйовдженою; тварина чухає лапками ніс, у неї спостерігається мимовільне виділення сечі і калу, чхання, різка ядуха, тонічні і клонічні судороги, сповільнене й утруднене дихання. Через 5—10 хв тварина гине від асфіксії при явищах зниження температури тіла, зменшення кількості комплементу і зниження зсідання крові. На розтині виявляють емфізему легень внаслідок спазму м'язів бронхів, незсідання крові, гіперемію і крововиливи у слизовій оболонці шлунка, кишок та в інших органах.

У людей анафілактичний шок виникає внаслідок повторного введення (через кілька хвилин — діб) гетерогенних імунних сироваток при лікуванні хворих на різні інфекційні захворювання (дифтерія, правець, сибірка, анаеробна інфекція), притому антибіотиків (пеніцилін та ін.). Настає ядуха, частішає пульс, знижується артеріальний тиск, температура тіла, з'являються судороги, спазм бронхів, набряки, біль у суглобах, висипи на тілі та ін. У деяких випадках шок призводить до летального кінця.

У розвитку гіперчутливості негайного типу певне значення має спадковий фактор (схильність до алергійних захворювань, яка передається за рецесивним типом).

Частість розвитку гіперчутливості негайного типу залежить од віку людей, інтенсивності синтезу білка і продукції антитіл. У новонароджених і дітей грудного віку внаслідок слабкого розвитку нервової та інших систем організму вона проявляється менш інтенсивно; у віці від 1^х/₂ року до періоду статевого дозрівання буває значно частіше і з важчим перебігом; у дорослих схильність до алергічних захворювань знижується і в похилому віці стає незначною.

Місцевий прояв анафілаксії. Багаторазові, з 6-денними інтервалами підшкірні шєкци антигену (сироватки) кролям спричиняють після 5—6-го введення інфільтрат і некроз шкіри (реакція, або феномен, Артюса). Місцева анафілаксія розвивається від введення й інших антигенів (бактерії, токсини, антибіотики і т. д.), які можуть сполучатися з IgE.

Анафілаксію можна створити у сенсибілізованих тварин і на окремих ізольованих органах (реакція Шультца — Дейла) з гладенькою м'язовою тканиною (матка, кишки та ін.).

Пасивна анафілаксія. Підвищену чутливість відтворюють в інтактних морських свинок пасивним способом, тобто ін'єкцією імунної сироватки сенсибілізованих тварин. Стан сенсибілізації у них настає не відразу, а через 24 год при підшкірному, через 12 год при внутріш-ньоочеревинному й через 4 год при внутрішньовенному введенні; підвищена чутливість зберігається у тварин від 3—4 тижнів до 2 місяців.

Десенсибілізація. Якщо вирішальна доза не спричинила анафілаксії, то тварина втрачає підвищену чутливість до цього антигену, десенсибілізується на 2—3 тижні, а потім знову стає чутливою, іноді ще більше. Десенсибілізація настає і після перенесеної анафілаксії.

Специфічний, простий і дуже ефективний метод десенсибілізації дробним введенням антигену (сироватки) запропонував О. М.. Безредка (1907). Введені роздрібнені невеликі дози антигену (сироватки) зв'язують циркулюючі в крові IgE і тим самим запобігають утворенню у високих концентраціях гістаміну та інших токсичних речовин, які спричиняють анафілактичний шок.

Розвиткові анафілаксії можна запобігти введенням у гіперчутли-вий організм (з 7-денними інтервалами) невеликих кількостей високо-молекулярного антигену, при цьому в сироватці крові з'являються блокуючі антитіла (IgG), які взаємодіють з антигеном і запобігають реакції IgE з тканинними базофілами.

Для лікування анафілактичного шоку застосовують введення кисню, штучне дихання, лікарські засоби — адреналін, кордіамін, кортикостероїди, антигістамінні препарати; в разі пеніцилінового _ШОКу — антишокову терапію і введення пеніцилінази.

Атопії

Одним із видів гіперчутливості негайного типу є атопії (грец. atopos — незвичайний, дивний), що являють собою генетично детерміновану схильність до патологічних імунних реакцій у відповідь на дію подразників (алергенів), які для більшості людей (80—90 %} нешкідливі.

Атопії зумовлені появою в окремих людей антитіл (IgE) з шкірно-сенсибілізуючою активністю. Фіксовані на клітинах різних органів і тканин IgE вступають у реакцію з алергенами (атопенами), і в результаті утворення медіаторів розвивається клінічний прояв атопії.

Форма алергічної реакції залежить від того, де утворюється і локалізується комплекс антиген — антитіло. Якщо антиген вступає у реакцію з антитілом в шкірі, виникає кропив'янка; у верхніх дихальних шляхах — алергічний риніт, у слизовій оболонці ока — кон'юнктивіт, у слизовій оболонці бронхів — бронхіальна астма.

У патогенезі атопічних реакцій важливе значення має спадкова схильність, що реалізується за допомогою алельних генів Н і h (генотип НН — здоровий, hh — алергічний).

Понад 10 % населення земної кулі уражені атопією. У половини хворих в анамнезі є аналогічне захворювання батьків. Атопічні реакції піддаються гіпосенсибілізації.

Атопени (алергени) поділяють на побутові й епідермальні (пил пухових перин, подушок, епідерміс шкіри, шерсть свійських тварин та ін.), виробничі (бібліотечний пил, пил шерсті, бавовни, деякі барвники, мила, лаки, деревина, вибухові й синтетичні речовини та ін.), рослинні (пилок квітуючих лучних трав, садових і кімнатних рослин), харчові (яйця, полуниці, раки, цитрусові, кава, шоколад та ін.), лікарські (ацетилсаліцилова кислота, антибіотики і сульфаніламідні препарати).

Діагностика атопій провадиться за клінічними ознаками і лабораторними даними (шкірні алергічні проби, виявлення антитіл до алергенів).

Лікування і профілактика спрямовані на припинення контакту З алергенами, введення (внутрішньошкірне, нашкірне, пероральне, інгаляційне, в слизові оболонки і кон'юнктиву) хворим зростаючих Доз алергену, до якого виявлена підвищена чутливість, відтворення толерантності за допомогою толергенів; в разі відсутності ефекту від гіпосенсибілізації призначають антигістамінні препарати (бронхолі-тики та ін.).

Цитотоксичні реакції спостерігаються при переливанні групонесумісної крові, резус конфлікті та вживанні різних лікарських засобів. До комплексу клітина (антиген) – антитіло приєднується комплемент. Активуючись за класичним шляхом зумовлює лізис клітин (еритроцитів, лейкоцитів тощо) і виділення факторів запалення.

Ізоімунні реакції при переливанні крові: а) при переливанні групонесумісної крові ізогемаглютиніни зумовлюють склеювання введених еритроцитів, що приводить до їx лізису; б) гемолітична хвороба новонароджених при резус-конфлікті.

Схема розвитку гемолітичної хвороби новонароджених, зумовленої

Rh -конфліктом

Медикаментозні реакції. Різноманітні фармакологічні препарати i продукти їx деградації можуть зв'язуватися з тканинами i клітинами організму i тим caмим із гаптенів перетворюються на повноцінні антигени, які індукують синтез антитіл, що реагують з ними. Часто це відбувається на поверхні форменних елементів крові. До утвореного комплексу антиген-антитіло приєднується комплемент, що обумовлює лізис цих клітин.

Реакції третього типу - імунокомплексні супроводжуються утворенням імунних комплексів. При тривалому контакті організму з надлишком антигена (персистентна інфекція, при синтезі аутоантитіл проти власних тканин тощо), взаємодія антигену з антитілом приводить до утворення розчинних імунних комплексів-преципітатів, які здатні відкладатись на стінках кровоносних судин i блокувати циркуляцію крові, а це спричиняє порушення трофіки в даній ділянці. Якщо з такими комплексами зв'язуються компоненти комплемента, то утворюються продукти розщеплення СЗа i C5a, які є анафілатоксинами. Ці речовини викликають виділення активних біологічних факторів, що зумовлюють місцеве пошкодження тканини i стимулюють запальний процес.

Механізм розвитку гіперчутливості сповільненого типу. Після першого контакту з антигеном зростае кілъкість сенсибілізованих CD4 Т-лімфоцитів (Th-1), частина iз них - це Т-лімфоцити пам’яті. При повторному попаданні антигену в організм Th-1 хелпери його розпізнають у комплексі з антигеном гістосумісності другого класу на поверхні макрофага, що стимулює їx бласттрансформацію і проліферацію. Активовані Th-l клітини виділяють значну кількість цитокінів клітинного імунітету: фактор переносу, мітогенний фактор, фактор, що замінює Т-лімфоцити; фактор, який стимулює Т-лімфоцити; фактор, який стимулює В-лімфоцити, фактор, який пригнічує міграцію макрофагів (МПФ), фактор, який активує макрофаги (МАФ) лімфотоксин, інтерферон та інші.

Узагальнена таблиця гіперчутливості

Виявити стан сенсибілізації організму можна за допомогою клінічних алергічних проб.

Проби in vivo

1. Епікутанна проба

2. Cкарифікаційна шкірна проба

3. Аплікаційна проба

5. Внутрішньошкірні проби.

6. Кон’юктивальна проба

7. Назальна провокаційна проба.

Проби in vitro

Реакція ушкодження нейтрофілів–лейкоцитолізу

Реакція агломерації лейкоцитів.

Реакція дегрануляції базофілів за Шеллі.

Реакція специфічної бласттрансформації лейкоцитів (РБТЛ

Імунологічна толерантність

Імунна система суворо контролює антигенну стабільність організму, швидко реагує на чужорідні агенти, що проникають в організм, елімінуючи і знищуючи їх. У той же час вона не реагує на антигени власного організму. Таким чином імунна система терпима, толерантна до своїх речовин, але нетерпима до речовин не властивих власному організму.

Такий вид реакції організму, який оберігає “своє” та елімінує “чуже” одержав назву природньої толерантності. Основна роль природньої толерантності – збереження біологічної характеристики індивіда.

Толерантність завжди розвивається тільки на конкретний антиген, який її індукував. Організм не відповідає на нього видимою реакцією. У той же час організм зберігає здатність реагувати імунною відповідю на будь-який інший чужорідний чинник.

Така закономірність пояснюється тим, що здатність розрізняти свої і чужі антигени виникає у тварин, як правило, після народження. В ембріональному і ранньому постнатальному періодах імунна система сприймає введені в організм чужорідні антигени як свої.

АУТОІМУННІ ПРОЦЕСИ

Аутоімунний процес - це такий стан, при якому з'являються антитіла або сенсибілізовані лімфоцити до антигенів власних тканин.

Залежно від локалізації патологічного процесу аутоімунні захво-рювання поділяють на органоспецифічні i неорганоспецифічні.

Аутоімунними захворюваннями вважаються такі патологічні процеси, при яких аутоімунні peaкцiї відіграють основну патогенетичну роль.

Аутоантитіла можна виявити у здорових oci6, наприклад, проти ядер клітин епітелію щитовидноі залози, міоглобіну, тиреоглобуліну, клітин гладкої мускулатури та інші. Кількість аутоантитіл підвищується з віком, причому в жінок у більшій мipi, ніж у чоловіків.

При органоспецифічних виявляють аутоантитіла специфічні до антигену відповідного органу. До таких захворювань відносять аутоімунні хвороби крові, щитовидної залози, поліендокринопатії, ураження центральної нервової системи та очей.

Для вcix цих захворювань характерне деструктивне ураження певного органа, зумовлене імунною клітинною відповіддю (в основному аутореактивними Т-лімфоцитами).

До неорганоспецифічних системних захворювань відносять систем ний червоний вовчак, псоріаз, хвороби сполучної тканини. У цих хворих виробляються аутоантитіла до різних клітинних i позаклітинних структур (ядер, мітохондрій тощо). Тканинні пошкодження часто розвиваються внаслідок утворення імунних комплексів.

Критерії підтвердження аутоімунної патології:

і) наявністъ аутоантигенів;

2) наявність відповідних аутоантитіл або сенсибілізованих лімфоцитів;

3) пасивний пepeбir захворювання.

У життєдіяльності людського організму важливу роль віді грають природні (нормальні) протитканинні аутоантитіла, що мають властивість знешкоджувати і зв'язувати продукти розпаду й метаболізму клітин; 3 віком концентрація аутоантитіл у крові і тканинах збільшується.

При розмноженні в клітинах нервової системи вірусів поліомієліту, кліщового енцефаліту, деяких штамів вірусу герпесу та ін. утворюються проміжні (вірусіндуковані) антигени, які спричиняють синтез аутоантитіл. Реакція цих антитіл з антигенами нормальної нервової тканини зумовлює її глибоке ушкодження.

При старінні різко знижується імунологічна активність лімфоїдної тканини, настає дефіцит Т- і В-лімфоцитів, значно підвищується частість мутацій імунокомпетентних клітин, у них з'являється агресивність проти нормальних систем.

Ушкодження тканин виникають в результаті утворення у великій кількості розчинних комплексів антиген — антитіло. До них віднесено хвороби імунних комплексів (імунокомплексні): інфекційний ендокардит, гломерулонефрит, системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит та інші аутоімунні захворювання. Аутоімунний характер мають також деякі гемолітичні анемії і тромбоцитопенії.

Генетична зумовленість аутоімунної відповіді в патології людини визначає родинні випадки захворювання, розподіл їх за статтю і віком. У монозиготних близнюків буває більш високий ступінь конкордантності за цими ознаками, ніж у дизиготних. Аутоімунний процес індукується клітинною (сенсибілізовані клітини лімфоїдного ряду) і гуморальною (сироваткові антитіла) імунною системою.

Імунологічні реакції, що відбуваються у вагітнит жінок, мають значення в^розвитку безплідності, невиношування вагітності, гемолітичної хвороби новонароджених, коли настає невідповідність плода й організму матері щодо еритроцитарних, лейкоцитарних, тканинних та інших антигенів.

Аутоімунні реакції виникають також в результаті реакцій між ідіотипами (антигенними детермінантами, розташованими у варіабельних ділянках поліпептидних ланцюгів антитіл, й антиідіотиповими антитілами).

Клітинні і гуморальні захисні реакції — це ефективна система, яка забезпечує збереження сталості внутрішнього середовища макроорганізму. Вони проявляються на молекулярному, клітинному й орга-нізмовому рівнях, що наділяє їх широким діапазоном дії на патогенні агенти.

Незважаючи на важливу роль клітинного і гуморального імунітету, стан несприйнятливості не вичерпується цими формами захисту. Несприйнятливість до інфекційних агентів може проявлятися без участі фагоцитозу й антитіл. Помічено, що діти, уражені агамагло-булінемією, іноді порівняно легко переносять кір, видужують і повторно не хворіють. У ряді випадків високий рівень антитіл не захищає організм від захворювання. Явища незавершеного фагоцитозу і тривалого носійства патогенних бактерій свідчать про те, що клітинні і гуморальні форми імунітету не завжди можуть забезпечити той складний процес несприйнятливості, який потрібний для захисту організму вищих тварин і людини.