МЕТОДИЧНА ВКАЗІВКА ДЛЯ СТУДЕНТІВ 3 КУРСУ

фармацевтичного факультету

ЗАНЯТТЯ № 16  (практичне – 6 год.)

 

         Тема: Хімічний аналіз лікарської рослинної сировини, яка містить флавоноїди

         Мета заняття: Уміти визначати кількісний вміст та проводити хроматографічний аналіз флавоноїдів у ЛРС, а також виявляти за допомогою якісних реакцій основні групи хімічних сполук.

         Професійна орієнтація: Флавоноїди – чисельна група поліфенольних сполук, похідних дифенілпропану різного ступеня окиснення і насиченості пропанового фрагменту. Використання лікарської сировини і препаратів, що містять флавоноїди, різноманітне: багато з них мають Р-вітамінну активність, зміцнюють стінку кровоносних капілярів, посилюють дію аскорбінової кислоти (рутин), виявляють седативну дію (собача кропива, шоломниця, глід). Флавоноїдам властива протизапальна, противиразкова (флакарбін, ліквірітон), деяким – кровоспинна дія (гірчак перцевий і почечуйний, вовчуг польовий). За останні роки з’явились повідомлення щодо протипухлинної і гіпоглікемічної дії флавоноїдів.

 
Методика виконання практичної роботи – 900-1200

 

         Матеріали та обладнання: пробірки, скляні палички, ваги аналітичні, колби, фільтрувальний папір, водяна баня, калібрувальне сито, зворотній холодильник, вата, лійки, фотоелектроколориметр, ЛРС.

         Реактиви: етанол (70%, 96%), поліамідний сорбент, хлористоводнева кислота (конц.), магній (металічний), октанол (бутанол), калію гідроксид (10% спиртовий р-н), заліза хлорид (10%), свинцю ацетат (10%), алюмінію хлорид (10% спиртовий р-н), етилацетат, метанол, оцтова кислота, вода дистильована.

         Робота 1. Виділення флавоноїдів з лікарської рослинної сировини для проведення якісних реакцій.

1.     Екстракція. Подрібнити сировину і просіяти через калібрувальне сито з розміром гратки 2 мм. Помістити 3 г наважки в колбу зі шліфом на 50 або 100 мл. Залити сировину 35 мл 70% етилового спирту. Закрити колбу зворотнім холодильником і кип’ятити на водяній бані  протягом 20 хвилин, періодично помішуючи. Наважку охолодити і профільтрувати.

2.     Очистка. Отриманий фільтрат нанести на колонку діаметром 1 см, заповнену 1,0 г поліамідного сорбенту, промивають 50 мл води і елюють флавоноїди з колонки 70%-ним етанолом. Отриманий розчин випарити до 1/2 об’єму і використовувати для проведення якісних реакцій і хроматографічного аналізу флавоноїдів.

        

Робота 2. Проведення якісних реакцій на флавоноїди з виділенням з ЛРС. В якості взірця для порівняння використайте 0,1%-ний розчин рутину.

Дослід 1. Ціанідинова реакція (проба Snoda): До 1 мл очищеного екстракту (і 0,1% розчину рутину) додати 2-3 краплі концентрованої соляної кислоти і 1-2 дрібки порошку металічного магнію. Спостерігають колір забарвлення що утворився в результаті реакції.

Дослід 2. Ціанідинова реакція по Брианту: До забарвленого розчину, що утворився в результаті ціанідинової реакції додати 1/3 октанолу або бутанолу по об’єму, розбавити водою до розділення шарів, струсити. Відмітити перехід пігментів у водяну чи органічну фази (пігменти глікозидів залишаються у воді, а аглікони – переходять в органічну фазу).

Дослід 3. Реакція з лугом: До 1 мл екстракту (і 0,1% розчину рутину) додати 1-2 краплі 10% спиртововодного розчину гідроксиду калію чи натрію. Розчин жовтіє або посилюється природне жовте забарвлення.

Дослід 4. Реакція з хлоридом заліза(ІІІ): До 1 мл екстракту (і 0,1% розчину рутину) додати 2-3 краплі 1%-ного спиртового розчину хлориду заліза. Утворюється темно-зелене або коричневе забарвлення в залежності від класу флавоноїдів.

Дослід 5. Реакція із ацетатом свинцю: До 1 мл очищеного екстракту (і 0,1% розчину рутину) додати 3-5 крапель 10% розчину основного свинцю ацетату; утворюється осад.

Результати якісного аналізу занести в таблицю:

 

Досліджуваний об’єкт

Забарвлення

Ціанідинова проба

КОН

FeCl3

Pb(CH3CO2)2

0,1% розчин рутину

 

 

 

 

Екстракт сировини

 

 

 

 

 

Зробити висновки.

 

         Робота 3. Хроматографічне виявлення флавоноїдів у лікарській рослинній сировині.

5 мл очищеного екстракту упарюють досуха на водяному нагрівнику у випарувальній чашці. Залишок розчиняють у 0,3 – 0,5 мл спирту і наносять на пластинку “Силуфол”, поряд наносять зразки “свідків” — розчини рутину і кверцетину. Пластинку сушать і поміщають в систему розчинників н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2). Хроматограму висушують у витяжній шафі і розглядають їх при денному та УФ-світлі до і після обробки 10 %-м спиртовим розчином лугу.

Робота 4. Визначити кількісний вміст флавоноїдів у звіробою траві по ст.324 ДФ ХІ.

Аналітичну пробу сировини, подрібнити до розміру, що проходить крізь сито з отворами діаметром 1 мм. Опісля 1г (точна наважка) подрібненої сировини помістити в колбу зі шліфом об’ємом 150 мл, добавляючи 30 мл 50% спирту. Колбу з’єднати з зворотнім холодильником і нагріти на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин періодично струшуючи для змивання частинок сировини зі стінок. Гарячий витяг профільтрувати через вату в мірну колбу об’ємом 100 мл. Вату помістити в колбу для екстрагування і додати 30 мл 50% спирту, повторюючи екстракцію, ще двічі. Після охолодження об’єм витягу довести 50 % до мітки і перемішати (розчин А).

У мірні колбу місткістю 25 мл поміщають 1 мл розчину алюмінію хлориду в 95 % спирті і доводять розчину 95 % спиртом до мітки. Через 40 хв. вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 415 нм в кюветі товщиною 10 мм. У якості розчину порівняння використовують розчин, що складається з 1 мл витягу, 1 краплі розведеної оцтовою кислотою і доведений 95 % спиртом до мітки у мірній колбі місткістю 25 мл.

Паралельно вимірюють оптичну густину розчину стандартного зразка рутину пиготовлений аналогічно досліджуваного розчину.

Обчислюють вміст суми флавоноїдів у перерахунку на рутин на абсолютно суху сировину за формулою:

де: D – оптична густина досліджуваного розчину, D0 – оптична густина стандартного розчину рутину; m – маса сировини у грамах; m0 – маса рутину у грамах; W – втрата маси при висушуванні у відсотках.

Робота 5. Визначити кількісний вміст флавоноїдів у собачої кропиви трави ДФУ 1.2 ст. 544-545.

         Вихідний розчин. 1,00 г здрібненої на порошок сировини (355) (2.9.12) поміщають у круглодонну колбу місткістю 100 мл, додають 1 мл розчину 5 г/л гексаметилентетраміну Р, 20 мл кислоти хлористоводневої Р, 2 мл кислоти хлористоводневої Р 1. Одержану суміш кип'ятять зі зворотним холодильником протягом 30 хв і фільтрують крізь тампон із вати у колбу. Додають тампон із вати до залишку у круглодонну колбу та екстрагують двома порціями, по 20 мл кожна, ацетону Р, кожний раз проводячи кип'ятіння зі зворотним холодильником протягом 10хв, і охолоджують. Кожний витяг фільтрують крізь тампон із вати у колбу. Одержані охолоджені об’єднані ацетонові витяги фільтрують крізь паперовий фільтр у мірну колбу, доводять об’єм розчину ацетоном Р до 100,0 обполіскуючи колбу та паперовий фільтр, 20,0 мл одержаного розчину поміщають у ділильну лійку, додають 20 мл води Р і струшують суміш із 15 мл етилацетату Р, а потім і трьома порціями, по 10 мл кожна, етилацетату Р. Одержані етилацетатні витяги об’єднують у ділильній лійці, промивають двома порціями, по 50 мл кожна, води Р, фільтрують над 10 г натрію сульфату безводного Р у мірну колбу та доводять об'єм розчину етилацетатом Р до 50.0 мл.

         Випробовуваний розчин. До 10.0 мл вихідного розчину додають 1 мл реактиву аію.мінію хлориду Рі доводять об'єм розчину розчином 5 % (oб/oб) кислоти оцтової льодяної Р у метанолі Р до 25.0 мл.

         Компенсаційний розчин. 10,0 мл вихідного розчину доводять розчином 5 % (об/об) кислоти оцтової льодяної Р і метанаїі Рп.о об'єму 25.0 мл.

Оптичну густину (2.2.25) випробовуваного розчину вимірюють через 30 хв після приготування за довжини хвилі 425 нм відносно компенсаційного розчину'.

Вміст флавоноїдів, у відсотках, у перерахунку на гіперозид, обчислюють за формулою:

де: А — оптична густина випробовуваного розчину за довжини хвилі 425 нм,

m — маса наважки випробовуваної сировини, у грамах.

Використовують питомий показник поглинання гілерозиду, що дорівнює 500.

 

Висновки стосовно відповідності даної ЛРС вимогам МКЯ занести до лабораторного журналу.

 

 

Семінарське обговорення теоретичних питань – 1230-1400

 

Теоретичні питання

1.                 Класифікація і особливості структури флавоноїдів.

2.                 Фізичні властивості флавоноїдів.

3.                 Методи виділення, очищення і розділення флавоноїдів.

4.                 Якісні реакції на флавоноїди.

5.                 Методи хроматографічного аналізу флавоноїдів.

6.                 Методи кількісного визначення флавоноїдів.

7.                 Фармакопейний метод аналізу рутину та його екстраполяція на визначення кількісного вмісту в лікарській рослинній сировині.

8.                 Формули пірану, піролу, флаванону, флаванонолу, флавону, флавонолу, халкону, аурону, ізофлавону, кверцетину, рутину.

 

Ситуаційні задачі:

1.     Для виявлення діючих речовин до квіток глоду додали порошок металічного магнію і концентровану хлористоводневу кислоту. Утворилось рожеве забарвлення, яке свідчить про наявність:

A.   алкалоїдів

B.    слизу

C.   флавоноїдів

D.   кумаринів

E.    дубильних речовин

2.     Для екстрагування флавоноїдів з ЛРС використовують:

A.             диетиловий спирт

B.              ацетон

C.             70% етиловий спирт

D.             50% етиловий спирт

E.              гарячу воду

 

Студент повинен знати

1.     Будову флавоноїдів та їх класифікацію.

2.     Основні методи якісного аналізу флавоноїдів.

Студент повинен вміти

1.     Проводити якісні реакції на флавоноїди.

2.     Проводити кількісне визначення вмісту флавоноїдів.

 

Година самостійної роботи - 1415-1500                 

 

Джерела інформації:

А - Основні:

1.     Государственная Фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР.– 11–е изд. – М. : Медицина, 1987.– 336 с.

2.     Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11–е изд. – М. : Медицина, 1989. – 400 с.

3.     Державна Фармакопея України / Держ. п–во “Науково–експертний фармакопейний центр”. – 1–е вид., 1 допов. – Х. : РІРЕГ, 2004. – 494 с.

4.     Державна Фармакопея України / Держ. п–во “Науково–експертний фармакопейний центр”. – 1–е вид., 2 допов. – Х. : РІРЕГ, 2008. – 620с.

5.     Державна Фармакопея України / Держ. п–во «Науково-експертний фармакопейний центр». – 1-е вид. – Х. : РІРЕГ, 2001. – 531 с.

6.     Державна Фармакопея України / Держ. п-во «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів». - 1–е вид., 3 допов. - Х. : РІРЕГ, 2009. – 280 с.

7.     Державна Фармакопея України / Держ. п-во «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів». - 1–е вид., 4 допов. - Х. : РІРЕГ, 2011. – 540 с.

8.     Ковальов В. М. Фармакогнозія з основами біохімії рослин / В. М. Ковальов, О. І. Павлій, Т. І. Ісакова; за ред. проф. В. М. Ковальова. – Х. : Прапор, вид-во НФАУ, 2000. – 704 с.

9.     Практикум по фармакогнозии : учеб. пособие для студентов вузов / В. Н. Ковалев, Н. В. Попова, В. С. Кисличенко и др. – Х. : Изд-во НФаУ; Золотые страницы, 2003. – 512 с.

10.            Веб-сторінка університету > Інтранет > На допомогу студентам > Матеріали для підготовки до практичних занять > Кафедра фармакогнозії з медичною ботанікою > Українська > Фармація > Повний термін навчання > Фармакогнозія> 3 курс> Хімічний аналіз ЛРС, яка містить флавоноїди.

 

В – Додаткові:

1.     Бобкова І. А. Фармакогнозія: підручник / І. А. Бобкова, Л. В. Варлахова, М. М. Маньковська. – 2-е вид., перероб. та доп. – К.: Медицина, 2010. – 512 с.

2.     Муравьева Д.А. Фармакогнозия. - М.: Медицина. - 2002. – 656 с.

3.     Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Фармакогнозия : учеб. пособие / под ред. Г. П. Яковлева. – СПб. : СпецЛит, 2006. – 845 с.

4.     Солодовниченко Н. М. Лікарська рослинна сировина та фітопрепарати : навч. посіб. з фармакогнозії з основами біохімії лікар. рослин для студ. вищих фармац. навч. закладів ІІІ-IV рівнів акред. / Н. М. Солодовниченко, М. С. Журавльов, В. М. Ковальов. - 2-е вид. – Х. : Вид-во НФаУ; МТК-книга, 2003. – 408 с.

5.     Фармакогнозия : учеб. пособие для студ. высш. учеб. завед. / В. Н. Ковалев, В. С. Кисличенко, И. А. Журавель и др. – 2-е изд., испр. и доп. – Х. : Изд-во НФаУ, 2009. – 218 c.

 

 

Методичну вказівку склала                                                       проф. Марчишин С. М.

 

 Обговорено і затверджено на засіданні кафедри             
27 серпня 2012 р. протокол № 1