Методична вказівка для студентів

(ННІ медсестринства, спеціальності «Сестринська справа»)

ЗАНЯТТЯ № 10 (практичне – 6 год.)

ТЕМИ: 1. Амінокислотний склад білків та пептидів.

2. Будова та склад білків білків та пептидів

3. Фізико-хімічні властивості білків. Реакції осадження. Білки сироватки крові.

МЕТА. Навчитися виявляти білок та амінокислоти в розчині та пояснювати їх будову у зв’язку з хімічними та біологічними властивостями. Провести осадження білків та визначити загальний вміст білка в сироватці крові.

ПРОФЕСІЙНА ОРІЄНТАЦІЯ СТУДЕНТІВ

Білки виконують в організмі ряд важливих функцій, однією з яких є пластична. Вони є будівельним матеріалом для клітин та тканин. Лікарська і харчова цінність білкових препаратів залежить від їх амінокислотного складу. Хроматографічний метод визначення вільних амінокислот широко застосовують в клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики окремих захворювань; у фармації - для контролю за якістю фармпрепаратів.

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ практичної РОБОТИ (9°°-12°°)

І. Амінокислотний склад білків та пептидів. Хроматографічний розподіл амінокислот.

Робота 1. Виявлення a- амінокислот в реакції з нінгідрином.

a-Амінокислоти дають з нінгідрином синє або фіолетове забарвлення. Реакція характерна для аміногруп, що знаходяться в a-положенні й використовується для виявленняa-амінокислот, розділених хроматографічним методом.

Принцип реакції. При нагріванні білка з водним розчином нінгідрину a-амінокислоти утворюють сполуки синього або фіолетового забарвлення.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: гліцин, 0,5 % спиртовий розчин нінгідрину, піпетки, пробірки.

В пробірку помістити 4 краплі 1 % розчину гліцину і додати 2 краплі 0,1 % розчину нінгідрину. Вміст пробірки обережно нагріти. Спостерігаємо появу синього забарвлення.

Робота 2. Виявлення карбоксильних груп в гліцині.

В пробірку помістити 5 крапель 1 % розчину гліцину і додати 1 краплю метилового червоного. Розчин забарвлюється в жовтий колір (нейтральне середовище). Додати 5 крапель формаліну. З’явиться червоне забарвлення (кисле середовище). Ця реакція використовується для кількісного визначення карбоксильних груп (формольне титрування) в a-амінокислотах.

Робота 3. Виявлення аміногруп в гліцині.

В пробірку помістити 5 крапель 1 % розчину гліцину та 5 крапель 5 % розчину нітриту натрію. Додати 2 краплі концентрованої оцтової кислоти. Обережно струснути суміш. Спостерігається виділення газу (N₂). Реакцію використовують для кількісного визначення аміногруп в амінокислотах.

Робота 4. Виявлення ароматичних амінокислот ксантопротеїновою реакцією.

Ксантопротеїнова реакція характерна для ароматичних амінокислот: тирозину, триптофану, фенілаланіну. Жовте забарвлення спостерігається у випадках, коли концентрована азотна кислота потрапляє на шкіру, нігті, які у великій кількості містять ці амінокислоти.

Принцип реакції: Реакція зумовлена нітруванням бензольного кільця циклічних амінокислот та утворенням нітросполук жовтого кольору, який при додаванні аміаку переходить у оранжевий.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка; концентрована азотна кислота, пробірки, піпетки.

Хід роботи: У пробірку вносять 5 крапель 1 % розчину тирозину або яєчного білка додають 1 краплю концентрованої азотної кислоти. Суміш нагріти до появи жовтого кольору. Пробірку охолодити і додати по краплях водний розчин аміаку до появи оранжевого забарвлення.

Робота 5. Виявлення сірковмісних амінокислот в білку реакцією Фоля.

Реакція Фоля відкриває сірковмісні амінокислоти цистин та цистеїн. Метіонін цієї реакції не дає тому, що сірка в ньому зв’язана метильною групою.

Принцип реакції: У процесі кип’ятіння білка з лугом від цистеїну і цистину легко відщеплюється сірка у вигляді сірководню, який з ацетатом свинцю утворює осад сульфіду свинцю чорного або сірого кольору.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1% розчин яєчного білка, 5 % розчин ацетату свинцю і 30 % розчин їдкого натру ( реактив Фоля), піпетки; пробірки.

Хід роботи: У пробірку вносять 3-5 крапель 1 % розчину яєчного білка додають 5 крапель 30% розчину їдкого натру і 1 краплю 10 % розчину ацетату свинцю (або реактиву Фоля). Нагрівають і спостерігають за появою чорного або сірого забарвлення.

Робота 6. Виявлення триптофану в білку (реакція Адамкевича).

Реакція Адамкевича є характерною для білків, у молекулі яких міститься амінокислота триптофан або інших сполук, що містить у своєму складі індольне кільце.

Принцип реакції: Додавання до розчину триптофану концентрованої оцтової (яка завжди має залишок гліоксалевої кислоти) і сірчаної кислот призводить до утворення червоно-фіолетового кільця.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: Білок курячого яйця, нерозведений, концентрована оцтова кислота, концентрована сірчана кислота, піпетки; пробірки.

Хід роботи: В пробірку помістити 2-3 краплі розчину білка, додати 1-2 краплі концентрованої оцтової кислоти і обережно по стінці внести 2-3 краплі сірчаної кислоти. Через деякий час на межі двох рідин утворюється червоно-фіолетове кільце.

Робота 7. Виявлення пептидного зв’язку в білку біуретовою реакцією.

Принцип реакції: Додавання до розчину біуретового реактиву призводить до утворення синьо-фіолетової комплексної сполуки білка або пептиду з купрумом (ІІ) гідроксидом, яка є якісною реакцією на пептидні зв’язки.

Хід роботи: В пробірку помістити 5 крапель яєчного білка, додати рівний об’єм 10 % розчину гідроксиду натрію та 1-2 краплі розчину сульфату міді. Спостерігаємо появу червоно-фіолетового забарвлення.

ІІ. Гідроліз простого білка. Реакції осадження білків.

Робота 8. Реакції зворотного осадження альбумінів та глобулінів

Висолювання – це зворотна реакція осадження білків нейтральними солями лужних та лужноземельних металів (NH₄)₂SO₄, NаСI, Nа₂SO₄, MgSO₄. За цих умов білки, які осаджуються, не зазнають глибоких структурних змін і їх осад можна знову розчинити у вихідному розчиннику, а молекула білка зберігає свої попередні нативні властивості.

До зворотних реакцій осадження належать реакції осадження білків органічними розчинниками ( спиртом, ацетоном) за умов нетривалої дії і низької температури.

Метод висолювання широко використовується для фракціонування суміші білків, коли треба відокремити один білок від іншого (наприклад, альбуміни від глобулінів). Грубодисперсні білки-глобуліни висолюються значно легше, ніж альбуміни напівнасиченим розчином сірчанокислого амонію, тоді як альбуміни – насиченим розчином.

Принцип методу: Реакція висолювання зумовлена дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією його електричного заряду.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: Сироватка крові, насичений розчин сульфат амонію, сульфат амонію в порошку, 10 % розчин їдкого натру, 1% розчин сульфату міді, паперові фільтри, лійки; піпетки, пробірки.

Хід роботи: У пробірку наливають 2-3 мл сироватки крові, додають рівний об’єм насиченого розчину сульфату амонію і перемішують. В осад випадають глобуліни, які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. У фільтрат, в якому залишились альбуміни, насипають кристалічний сульфат амонію доти, поки сіль перестане розчинятися. Спостерігають випадання в осад альбумінів (100 % насичення), які мають відносно невелику молекулярну масу і великий заряд. Осад альбумінів відфільтровують. Фільтрат перевіряють на відсутність білків за допомогою біуретової реакції. Осади альбумінів і глобулінів на фільтрі розчиняють в 3-5 мл води, щоб впевнитися, що висолювання носить зворотний характер.

Робота 9. Незворотне осадження (денатурація) білків солями важких металів, концентрованими кислотами, загальноалкалоїдними (осаджувальними) реактивами, дією високої температури

І. Осадження солями важких металів

Принцип методу: Солі важких металів (міді, свинцю, срібла, ртуті) осаджують білки з розчинів, утворюючи солеподібні і комплексні сполуки, що розчинні у надлишку цих солей, але нерозчинні у воді. Це пояснюється тим, що надлишок іонів металу, адсорбуючись, спричиняє перезарядку білкового комплексу, внаслідок чого в розчин переходить комплекс зміненого білка з металом. Це явище називається адсорбційною пептизацією.

Властивість білка міцно зв’язувати іони важких металів у вигляді нерозчинного осаду у воді використовується при отруєнні солями ртуті, міді, свинцю тощо. Рекомендують одразу ж після отруєння вживати білки молока або яєць, доки ці солі знаходяться ще в шлунку і не встигли всмоктатись. Після чого у хворого викликають блювання, щоб вивести отруту.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка, 5 % розчин сульфату міді, 5 % розчин ацетату свинцю, 5 % розчин нітрату срібла, піпетки; пробірки.

Хід роботи: У три пробірки вносять по 5 крапель 1 % розчину яєчного білка. Додають у першу пробірку 2-3 краплі 5% розчину сульфату міді; в другу – 2 краплі розчину ацетату свинцю, в третю - 1-2 краплі 5 % розчину нітрату срібла. У всіх пробірках утворюється осад, нерозчинний у воді. Якщо потім в першу пробірку додати 5-10 крапель 1 % розчину сульфату міді спостерігають розчинення блідо-голубого осаду у надлишку реактиву. У другій пробірці, коли додати 5-10 крапель 5 % розчину ацетату свинцю, осад розчиняється теж. Якщо у третю пробірку добавити 5-10 крапель 5% розчину срібла, то розчинення осаду не відбувається.

ІІ. Осадження органічними і мінеральними кислотами

Принцип методу: При дії на білок концентрованих мінеральних і органічних кислот відбувається денатурація білка внаслідок дегідратації та утворення комплексних солей білка з кислотами.

У надлишку всіх мінеральних кислот, крім азотної, осад білка розчиняється. Тому реакція осадження концентрованою азотною кислотою лежить в основі кількісного визначення білка за методом Робертса-Стольнікова-Брандберга.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка, концентровані азотна і сірчана кислоти, 10 % розчин сульфосаліцилової кислоти, 10% розчин трихлороцтової кислоти, піпетки, пробірки.

2. Осадження органічними кислотами: трихлороцтовою та сульфосаліциловою кислотами

Хід роботи: У дві пробірки вносять по 1 мл розчину білка першу додають 1 мл 20 % розчину сульфосаліцилової, а в другу – 1 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти. Випадає осад білка.

Осадження білків за допомогою трихлороцтової кислоти застосовують для повного видалення білків з біологічних рідин (наприклад, із сироватки крові), тому що вона осаджує тільки білки. Сульфосаліцилову кислоту використовують для якісного визначення білка у сечі.

ІІІ. Осадження білків загальноалкалоїдними (осаджувальними) реактивами: Розчини білків можуть утворювати осади при взаємодії з загальноалкалоїдними (осаджувальними) реактивами (таніном, пікриновою кислотою, гексоціанофератом калію). Ця властивість білків до осадження алкалоїдними реактивами пояснюється наявністю азотистих груп як у білках, так і в алкалоїдах.

Хід роботи: У три пробірки наливають по 1 мл 1 % розчину яєчного білка, додають по 0,5 мл 1 % розчину оцтової кислоти і по 2-3 краплі: у першу – 10 % розчину пікринової кислоти, у другу – насиченого розчину таніну, в третю – 1 % розчину червоної кров’яної солі. У всіх пробірках випадає осад.

В’яжучі лікарські препарати до складу яких входить танін, викликають слабку денатурацію білків на поверхні слизової оболонки або шкіри при запальних процесах, що створює своєрідну біологічну пов’язку і сприяє загоєнню.

IV. Денатурація білків під впливом високої температури

Більшість білків тваринного походження при нагріванні до 45-55⁰ С коагулюють.

Це пояснюється тим, що висока температура руйнує гідрофобні та водневі зв’язки. Відбувається перебудова структури білкової молекули. Білок втрачає свої нативні властивості і розчинність. Реакція денатурації перебігає поступово і прискорюється з підвищенням температури, тому короткочасне нагрівання може і не призвести до коагуляції.

Найбільш повна і швидка коагуляція має місце в ізоелектричній точці. Деякі білки, в складі яких багато дисульфідних зв’язків, стійких до високої температури, здатні до ренатурації і не втрачають своєї структури та функціональної активності після припинення дії високої температури (ферменти трипсин та рибонуклеаза).

Хід роботи. В пробірку вміщують 1 мл розчину білка, нагрівають і спостерігають за утворенням осаду.

ІІІ. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

Робота 10. Визначити концентрацію білка в сироватці крові рефрактометричним методом.

Принцип методу: Метод рефрактометрії оснований на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення: n = sin a / sin b

Величина показника заломлення сироватки крові залежить головним чином, від вмісту в ній білка. Інші складові частини сироватки крові мало впливають на ступінь рефракції. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.

Хід роботи: Спочатку встановлюють нульову точку шляхом визначення показника заломлення дистильованої води. Для цього за допомогою дзеркала - 5 направляють промінь світла на шкалу, а за допомогою дзеркала - 6 освітлюють рефрактометричну камеру. Далі відкривають рефрактометричну камеру і піпеткою наносять на нижню призму 1-2 краплі дистильованої води. Закривають рефрактометричну камеру і маховиком - 2 межу світлотіні вводять у центр перехрестя окуляра. Маховиком - 3 повертають до зникнення забарвлення межі світлотіні. Після цього рефрактометричну камеру відкривають, витирають воду марлею і наносять на призму 1-2 краплі досліджуваної сироватки. Закривають камеру і спостерігають в окулярі зміщення межі світлотіні. Повертаючи маховик - 2, знову встановлюють межу світлотіні в центр перехрестя окуляра. На шкалі відмічають показник заломлення. Користуючись таблицею 3, визначають вміст білка в сироватці крові.

Таблиця 2. Визначення вмісту білка за показником заломлення

Показник заломлення	Білок у сироватці крові (г/л)	Показник заломлення	Білок у сироватці крові (г/л)	Показник заломлення	Білок у сироватці крові (г/л)
1,34124	30,6	1,34537	54,7	1,34947	78,5
1,34162	32,8	1,34575	56,8	1,34984	80,5
1,34199	35,0	1,34612	59,0	1,35024	82,8
1,34237	37,2	1,34650	61,2	1,35058	84,9
1,34275	39,4	1,34687	63,4	1,35095	87,1
1,34313	41,6	1,34724	65,5	1,35132	89,2
1,34350	43,8	1,34761	67,7	1,35169	91,4
1,34338	46,0	1,34798	69,8	1,35205	93,5
1,34426	48,1	1,34836	72,0	1,35242	95,7
1,34463	50,3	1,34873	74,2	1,35279	97,8
1,34500	52,3	1,34910	76,3

ПРОГРАМА САМОПІДГОТОВКИ СТУДЕНТІВ

І. Амінокислотний склад білків та пептидів. Хроматографічний розподіл амінокислот.

1. Біологічна роль та класифікація амінокислот.

2. Будова амінокислот. Амфотерність.

3. Хімічні властивості амінокислот:

а) декарбоксилювання

б) дезамінування

в) взаємодія з кислотами

г) взаємодія з основами

4. Якісні реакції на окремі амінокислоти:

а) нінгідринова реакція;

б) ксантопротеїнова реакція;

в) виявлення карбоксильних та аміногруп в гліцині;

г) Фоля;

д) Адамкевича

5. Амінокислотний склад білків, методи його дослідження.

6. Хроматографія (адсорбційна, розподільна, іонообмінна, афінна, гель-хроматографія), їх суть.

7. Хроматографія висхідна, низхідна, радіальна, паперова.

8. Значення хроматографії у медицині і фармації.

ІІ. Гідроліз простого білка. Реакції осадження білків.

1. Загальна характеристика білків (хімічний склад та фізико-хімічні властивості). Використання фізико-хімічних властивостей білків при отриманні і очищенні білкових фармпрепаратів.

2. Функції білків в організмі.

3. Структурна організація білків.

4. Первинна структура білка, методи її визначення (метод Сенджера, Едмана, секвенації).

5. Вивчити всі альфа-амінокислоти, уміти писати поліпептиди.

6. Вторинна, третинна, четвертинна структури білка та методи їх визначення. Доменні білки.

7. Типи зв’язків, що утворюють структурні рівні білкової молекули: водневий, дисульфідний, гідрофобний, іонний.

8. Вплив фізико-хімічних факторів (рН середовища, температури, радіації та ін.) на структуру та властивості білків.

9. Будова та склад складних білків: фосфопротеїнів, ліпопротеїнів, нуклеопротеїнів, глікопротеїнів, хромопротеїнів, їх біологічна роль.

10. Молекулярна маса білків, методи її визначення.

11. Розчинність білків та фактори, що впливають на цей процес. Фактори стабілізації білкової молекули у розчині.

12. Методи осадження білків з розчину. Висолювання білків. Фактори, що викликають зворотне осадження, суть їх дії.

13. Денатурація та ренатурація білків. Фактори, що викликають незворотне осадження, суть їх дії.

14. Значення реакцій осадження білків в медицині і фармації.

ІІІ. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

1. Основні білки плазми крові, їх фізико-хімічні властивості та функції.

2. Білки як лікарські препарати.

3. Причини та наслідки зміни вмісту загального білка плазми крові.

4. Принцип біуретового та рефрактометричного методів визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

5. Клініко-діагностичне значення визначення загального білка в сироватці крові.

СЕМІНАРСЬКЕ ОБГОВОРЕННЯ ТЕОРЕТИЧНИХ ПИТАНЬ

Зразки тестових завдань та ситуаційних задач.

І.Тестові завдання.

1. Гістидин – α-амінокислота, яка входить до складу білків. Похідним якого гетероциклу є гістидин:

A. Індолу;

B. Пірану;

C. Імідазолу;

D. Піримідину;

E. Піридину;

2. Які з нижче перерахованих амінокислот є кислими:

A. Тирозин, фенілаланін;

B. Аспарагінова і глютамінова амінокислоти;

C. Аспарагінова кислота і гліцин;

D. Глютамінова кислота і гліцин;

E. Метіонін, триптофан.

3. До складу білка входять протеїногенні амінокислоти. У якому положенні в їх структурі обов’язково повинна бути аміногрупа?

A. d-положенні;

B. b-положенні;

C. g-положенні;

D. a-положенні;

E. e-положенні.

4. Білки - це:

A. органічні сполуки, похідні вуглеводнів, що мають у своєму складі карбоксильну групу

B. біоорганічні високомолекулярні сполуки, складної будови, побудовані із залишків α-L-амінокислот, що сполучені амідними (пептидними) зв’язками;

C. сполуки, що мають циклічну будову молекули

D. сполуки, до яких входять кілька гідроксильних груп

E. похідні ароматичних вуглеводнів

5. Висолювання – це зворотне осадження білків з розчину під дією:

A. Солей важких металів

B. Концентрованих мінеральних кислот

C. Насичених та напівнасичених солей лужних та лужноземельних металів.

D. Алкалоїдів

E. Високої температури

6. Вибрати основні типи вторинної структури природних білків:

A. γ і β –спіраль;

B. α – спіраль і β – структура;

C. ∆ - спіраль;

D. γ і ∆ - спіраль;

E. β і γ структури.

ІІ. Ситуаційні задачі

1. Розчин дає позитивну ксантопротеїнову реакцію. Що містить даний розчин?

2. В пробірці відмічено позитивну нінгідринову реакцію. Які амінокислоти переважають в розчині?

3. Розчин дає позитивну реакцію Фоля. Які амінокислоти переважають в розчині?

4. Розчин, що міститься в пробірці, дає позитивну біуретову реакцію та Адамкевича. Що містить даний розчин?

5. Гідролізат виділеного з молока білка дає позитивну біуретову реакцію та з амоній молібдатом. Який було виділено білок?

Вихідний рівень знань та вмінь

Студент повинен знати:

1. Структуру пептидів та білків, їх властивості.

2. Методи якісного визначення білка та амінокислот.

3. Будову білка, рівні його структурної організації.

4. Типи зв’язків в молекулі білка.

Студент повинен вміти:

1. За допомогою кольорових якісних реакцій дослідити амінокислотний склад білків та їх гідролізатів.

2. Визначити вміст білка в сироватці крові.

Відповіді на тести та ситуаційні задачі.

І.Тестові завдання.

1. C; 2. B; 3. D; 4. В; 5. С; 6. В.

ІІ. Ситуаційні задачі

1. Ароматичні амінокислоти;

2. a-амінокислоти;

3. Сірковмісні амінокислоти;

4. Білок, що містить триптофан (або інші сполуки, до яких входить похідне індолу);

5. Фосфопротеїни.

Джерела інформації:

Основні:

1.Музиченко В.П. Медична хімія.Медицина(Київ).-2010.-496с.

2.Губський Ю.І. Біоорганічна хімія. – Вінниця: Нова книга, 2004. – С. 18-69, 98-114, 114-126.

3.Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – С. 15-20. 20-35

4.Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига. – 2000. – С. 9-26. 19-33.

5.Біологічна хімія: лабораторний практикум / За ред. Я.І. Гонського. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – С. 7-10. 11-13.

6. http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/index.php?&path=zag_him/classes_stud/uk/nurs

Додаткові:

1. .Мороз А.С.,Ковальова А.Г. Фізична та колоїдна хімія. Л. «Світ» 1994

2.Степаненко Б.Н., Курс органической химии. – М.., Высшая школа, 1979.

3.Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И., Биоорганическая химия. – М., Медицина, 1991. – С.189-190, 160-167.

Методичну вказівку склали: доц. Дмухальська Є.Б.

Обговорено і затверджено на засіданні кафедри

29„”08 2013. протокол №_1 .