Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации

Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики.

Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакия). Серологические реакции, которые используются в вирусологии.

Гиперчувствительность немедленного и замедленного типов.

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С

АНТИТЕЛОМ

 

Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплексов. Свойства комплекса АГ – АТ показано на рисунке 1.

Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количество детерминант в АГ, количественное соотношение, последовательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте, наличие в детерминанте ароматических аминокислот, аффинность и авидность (рис. 2).

Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты.

Авидность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами

Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и имеют ряд типичных характеристик: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия активного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект – несколько минут или часов)

Часто такие реакции называют серологическими (от латинского «serum» – сыворотка), так как источником АТ служит сыворотка крови.

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:

1. Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации.

2. Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации.

3. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации.

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.

5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

АНТИГЕНЫ

 

 Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других.

 Принципы получения корпускулярного антигена:

 Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах.

 При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств.

 Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки.

 Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных.

 С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав.

 Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.

 

Принципы получения растворимых антигенов

 Для изучения природы, функции и иммуногенности отдельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или других сложных систем, а также для выявления антител к от-дельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения комбинаций различных методов.

 Антигены прокариот и эукариот получают экстрагированием различными растворителями целых или дезинтегрированных клеток.

 Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют вещества, которые нековалентно интегрированы в состав клеточной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий.

 Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток.

 Наиболее часто клетки разрушают: 1) механически в специальных приборах (дезинтеграторах и прессах); 2)клетки можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком; 3) при помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи, разрушают отдельные клеточные структуры; 4) при помощи детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов.

 Полученную дезинтегрированную клеточную массу разделяют на отдельные клеточные компоненты, применяя различные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное, равновесное в градиенте плотности.

 Отдельные антигены из дезинтегрированных или интактных клеток, а также из их изолированных структур экстрагируют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот, щелочей и т. д.

 Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнительных балластных вещест

Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами: избирательным осаждением солями тяжелых металлов, гельфильтрацией, аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител.

 Высокая степень очистки микробных и тканевых антигенов имеет большое практическое значение, так как повышает чувствительность серологических реакций, следовательно, эффективность диагностики.

 

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену.

 В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

 В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, – их высокая специфичность и достаточное содержание антител.

 По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические – к одному конкретному антигену.

 Получить моноспецифические сыворотки можно: 1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены, 2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности. Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ – АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные антитела.

 Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой) принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ

 Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е. моноклональные антитела.

 Для иммунизации животных готовят корпускулярные или растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования.

 Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов введения антигенов.

 Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов.

 Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антиген

 

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни;

2) для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна. По данным признакам она уступает другим серологи­ческим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным и, так как содержат антителя только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара

В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее применима в следующих направлениях:

а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и иммунизированного.  Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физиологическом) растворе двукратно и последовательно (например, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

 Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37  С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в определенном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туляремии -1:100.

Для выявления антител можно ставить экспрессные реакции агглютинации (время учета несколько минут). Например:

1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят каплю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляремийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков.

2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютинации по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество антител в сыворотке.

б) для идентификации чистой культуры возбудителей инфекционных болезней.

 С этой целью используются иммунные диагностические агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтами вакцин и сывороток, путем иммунизации животных целыми микробными клетками.

 Для достоверности сыворотки лучше использовать адсорбированные, чтобы в них содержались только антитела, соответствующие определенному виду или типу микроорганизма.

При идентификации (серотипирования) чистой культуры возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую реакцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностических агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучаемую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается через несколько минут.

 Если сыворотки неадсорбированные – после ориентировочной ставят развернутую реакцию агглютинации.

 Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется соответствующей диагностической сывороткой не менее чем до ½ или ¾ ее титра.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Рис. Пластинчатая реакция агглютинации

 

Принадлежность выделенной культуры микроорганизма к данному виду определяется при агглютинации его известной сывороткой до титра антител, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Титром антител сыворотки считают последнее разведение ее, в котором еще наблюдается агглютинация культуры микробов, использованных для иммунизации животного. Адсорбированные и монорецепторные сыворотки используют обычно в реакции агглютинации на стекле неразведенными.

При.определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1 : 50 до 1 : 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами. Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Рис. Развернутая реакция агглютинация

 

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1 : 100 или 1 : 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.

Реакция Кастеллани. При некоторых инфекционных заболеваниях или иммунизации микроорганизмами, имеющими в своем составе групповые антигены, в сыворотке крови, помимо специфических для данного вида антител, появляются еще и групповые. В этом случае родственные виды бактерий будут агглютинироваться полученными сыворотками.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген — антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.

 

Непрямые (пассивные) реакции агглютинаци Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О-группы человека).

 Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.  Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА).

 Выпускаются коммерческие препараты – эритроцитарные диагностикумы (на эритроцитах нагружены известные молекулярные АГ), которые используются в РНГА для обнаружения специфических АТ в исследуемой сыворотке и эритроцитарные диагностикумы антительные (на эритроцитах нагружены Fc фрагментами известные АТ), которые применяются в РНГА для выявления АГ.

Рис. . Схема реакции пассивной гемагглютинации.

 Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции

сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки».

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами  разной групповой  специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

 

Реакция агглютинации латекса (РАЛ)

Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром  0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин, что позволяет ее применять как экспресс-метод выявления антигенов и антител. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.

Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

 

Рис. Проведение  реакции латекс-аглютинации

Учет реакции латекс агглютинации

 

Реакция коагглютинации (КОА) .Для постановки КОА  используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

 

 

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают  и через 2-5 мин. на тёмном фоне учитывают результаты.  На тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов: в реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества.

Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике. В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови. С помощью специфических преципитуючих сывороток против белка человека, разных животных и птиц можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. Таким же образом определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Эта реакция применяется для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). Реакцию Ухтерлони  используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

Реакция преципитации в жидкой среде

 Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Рис. Механизм  и положительный результат реакции кольцепреципитации

 

Рис. 15. Механизм реакций преципитации в агаре.

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.

Реакция преципитации в агаре ( геле )

 Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар-агара.

Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата. Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями.

 В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях. Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони.

 Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

 

Методика определения количества иммуноглобулинов

в сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена. В зависимости от специфичности заключенных в геле антител в ходе иммунодиффузии возникает одна или несколько полос преципитации, длина «пробега» которых от «линии старта» пропорциональна концентрации антигена. К усовершенствованным вариантам относятся: двойная радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони) и простая радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. Основная функция геля — локализация преципитата, основана на том, что растворимые антигены и антитела легко диффундируют в геле, а образующиеся иммунные комплек­сы ввиду их большей величины задерживаются внутри ячеек геля, образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное рас­положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

 

Имуноелектрофорез является сочетанием двух методов – электрофореза в геле и следующей после него двойной иммунодифузии.

Для проведения реакции иммуноелектрофорезу используют стеклянные пластинки, предметные стёклышки, на которые наносят тонкий слой агара или агарози. Сначала антигены размещают в центре пластинки и разделяют их в электрическом поле. Потом в канавку, сделанную в агаре параллельно к линии раздела антигенов, вносят специфическую сыворотку. Диффундируя друг навстречу другу, антигены и антитела в месте контакта образуют дуги преципитации.

Практическое применение реакции преципитации.

РП применяются:

– для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и  животных;

– для изучения токсигенности бактерий;

– при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной, грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.);

 В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жидкость и т.д.

– для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных –  определяют общий АГ;

– в судебно-медицинской практике – для определения видовой принадлежности  белков (крови, слюны, спермы и т.д.);

– для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях.

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат . f1оecus – хлопья шерсти) – появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин – антитоксин или анатоксин – антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл.

Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт стандартных препаратов.

 

Реакция лизиса и связывание комплемента.

 

Для реакции лизиса необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий – бактериолизины, спирохет – спирохетолизины, эритроцитов – гемолизины, против других клеток – цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) – антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

 

Реакция связывания комплемента (РСК). Характерным отличием РСК от реакции агглютинации и преципитации есть участие в ней, кроме антигена и антитела, ингредиентов реакции гемолиза, которая выступает в виде индикаторной системы. Взаимодействие антигена с антителом не всегда предопределяет визуальные изменения, которые позволяют определить результат реакции. Однако известно, что при образовании комплекса антиген – антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана – гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза – реакция негативная.

Постановка и учет РСК

 

Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы реагентов РСК.

Антитела (Ig M, Ig G), участвующие в РСК, характеризуются способностью связывать комплемент. Исследуемую сыворотку накануне постановки реакции прогревают на водяной бане при температуре 56

 С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. В день постановки реакции сыворотку разводят раствором хлорида натрия (0, 15 моль/л) в соотношении 1 : 5 (для качественного анализа) или же готовят ряд последовательных, кратных двум разведений – от 1 : 5 до 1 : 640 (для определения титра АТ).

Антигены, используемые в РСК, могут быть корпускулярными или растворимыми: взвеси бактериальных клеток, их лизаты. Белковые или полисахаридные вещества, экстракты из нормальных и патологически изменённых тканей.

Комплементом является смесь сывороток морских свинок – свежая или лиофилизированная (сухой комплемент – препарат промышленного изготовления), которую разводят раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 непосредственно перед употреблением, так как при хранении в жидком состоянии её активность снижается.

Гемолитическую сыворотку с известным титром АТ (1 : 1200, 1 : 1600, 1 : 1800) изготовляют промышленным путём, иммунизируя кроликов эритроцитами барана.

Эритроциты получают из дефибринированной крови барана. Кровь фильтруют через трёхслойный марлевый фильтр для удаления плёнок фибрина, затем фильтрат центрифугируют (2000 мин

-1) в течение 10 мин. Удаляют плазму, а эритроциты наоборот остаются.

Поэтому антигены перед проведением опыта титруют в присутствии рабочей дозы комплемента.

а) антиген разводят в объёмах 0,5 мл;

б) добавляют в каждую пробирку 0, 5 мл рабочей дозы комплемента;

в) помещают в термостат при температуре 37  С на 1 час;

г) добавляют во все пробирки по 1, 0 мл гемолитической системы;

д) помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час;

 

 

 

 

Рис. РСК

Учет реакции связывания комплемента

(++++) – реакция резко положительная (полная задержка гемолиза, жидкость бесцветная, все эритроциты на дне),

(+++, ++) – реакция положительная (слабо окрашенная жидкость, осадок эритроцитов на дне пробирки),

(+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне незначительное количество эритроцитов),

(−) – отрицательная реакция (наблюдается полный гемолиз).

 

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

В сыворотке крови иммунизированных людей или перенесших вирусное заболевание обнаруживают антитела, способные ней­трализовать инфекционность вирусов. Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст­вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри­имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су­дят о нейтрализующей активности сыворотки. Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз­будителя и титра вируснейтрализующих антител.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши­роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

Реакция торможения гемагглютинации является особой формой реакции нейтрализации, которая проводится в условиях in vitro. Большинство вирусов, особенно миксовирусы, например возбудители болезни Ньюкасла и парагриппа крупного рогатого скота, а также несколько других организмов, а именно Mycoplasma gallisepticum, способны агглютинировать эритроциты одного или нескольких видов животных. Эту реакцию можно затормозить специфическими антителами к вирусу; следовательно, ее можно считать реакцией как на антитела, так и на вирус. На первой стадии реакции при определении антител титруется суспензия вируса, например вируса болезни Ньюкасла, культивируемого на курином эмбрионе, чтобы рассчитать количество агглютинирующего вируса. Для этого готовят двукратные разведения вирусной суспензии и к кажому разведению суспензии добавляют равный объем 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Через 30 минут при комнатной температуре эритроциты оседают на дно лунки (эту реакцию обычно проводят на пластиковых досках, создавая картину, аналогичную той, которая описана для реакции с сенсибилизированными эритроцитами. При титровании вирусов в качестве конечной точки выбирается та лунка, в которой произошла полная агглютинация эритроцитов, а не какая-либо промежуточная точка. Разведение вируса в этой точке будет составлять 1 гемагглютинирующую единицу вируса, которой как раз достаточно для агглютинации всех добавленных красных кровяных клеток.

   Для реакции торможения гемагглютинации готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки и в каждую лунку вносят рассчитанный объем разведенной вирусной суспензии, содержащей 4 (а иногда только 2) гемагглютинирующие единицы вируса. После этого в каждую лунку добавляют 1%-ную суспензию эритроцитов и материал инкубируют в течение 30 минут. Агглютинация клеток в лунках с высоким разведением свидетельствует о том, что содержащиеся в сыворотке данного разведения антитела не могут нейтрализовать агглютинирующей активности вируса. И, наоборот, при низких разведениях сыворотки эритроциты образуют плотный осадок на дне лунки; конечную точку титрования выбирают между этими крайними значениями. Следует заметить, что перед проведением реакции торможения гемагглютинации сыворотку нужно обработать для удаления неспецифических ингибиторов вирусной гемагглютинации. Эти ингибиторы, по-видимому, относятся к мукопротеинам и разрушаются после обработки сыворотки фильтратом культуры Vibrio choleras или метаперйодатом калия.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется для идентификации вируса болезни Ньюкасла, большинства подтипов вируса гриппа и для титрования антител к ним. Недавно предложен модифицированный вариант этого метода для титрования антител к вирусу чумы крупного рогатого скота. Согласно этой модификации, для агглютинации эритроцитов обезьяны используется вирус, родственный вирусу кори человека. 

 

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ
ИЛИ АНТИТЕЛ

В настоящее время широкое применение получили сероло­гические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, ра­диоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувстви­тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу)

Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. Он может быть как прямым, так и непрямым.

 Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево-красное свечение.

 АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать физико-химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела.

 АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.  РИФ выявляют и идентифицируют:

1) микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках- отпечатках; 2) клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами;

3) Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы

РИФ используют: 1) для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов; 2) для выявления титра антител при серодиагностике; 3) для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразований на клеточном и тканевом уровне и т.д.

Для постановки РИФ клетки с искомыми (или известными АГ) помещают на

 стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне 10 минут при комнатной температуре),  высушивают в течение 20 минут при 37 0 С, а затем обрабатывают в зависимости от  применяемого варианта РИФ.

 После каждого этапа обязательна 2-х – 3-х кратная промывка буферным раствором  для удаления не вступившего в реакцию иммунореагента.

 

Варианты постановки РИФ:

1 Прямая РИФ (была предложена А. Кунсом в 1941 г.).

 Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная иммунофлюоресцентная  сыворотка

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологи­ческом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва­риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеи-на и др.) — прямой   метод  Куне а.

В связи с трудностями приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических сывороток более доступным являет­ся непрямой метод Кунеа. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей   антитела   против   кроличьих   глобулинов,   так  как большинство диагностических антисывороток приготовляется пу­тем иммунизации кроликов разными антигенами. При образовании комплексов антиген — антитело флюоресцирующие антиглобулиновые антитела фиксируются на них. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чув­ствительности и специфичности не уступает другим иммунологи­ческим реакциям.

РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции).

 Используется для выявления титра АТ в исследуемой сыворотке, при наличии  известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки.

 На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней  есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При

 добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ,

 присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет.

Свечения не наблюдается.

 

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологичес­ким реакциям, с простотой и высокой чувствительностью оп­ределения. По сравнению с обычными иммунологическими ме­тодами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие поли­меры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают спо­собностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген — антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необ­ратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологичес­кого материла.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлю­лоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой катали­тической активностью, позволяющей с помощью соответствую­щих субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 1СР¹⁵ моль/л и ниже. Принципиально решена

проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител.

Наиболее широкое применение находит твердофазный имму-ноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинил-хлорида. Один из наиболее распространенных на практике ва­риантов ИФА основан на использовании меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе ин­кубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген — антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные фер­ментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определя­ют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антивидовых антител выявляют специфические иммунокомплек-сы. Данная схема является одной из наиболее распространен­ных в ИФА.

С целью максимального упрощения использования ИФА разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анали­за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед­ствие образования продукта ферментативной реакции.

Области применения и чувствительность ИФА аналогичны РИА. Однако ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабиль­ность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко под­дается автоматизации.

Чаще всего для ИФА используют полистироловые, поливиниловые пластинки с лунками, которые позволяют адсорбционно связывать АТ и АГ различной природы – белки, ЛПС, гликопротеиды и т.д. Связывание происходит путем адсорбции (т.е. нековалентно) за счет гидрофобных или ионных сил, или конъюгацией (ковалентно). Для получения иммуносорбентов путем ковалентной связи ис пользуют в основном такие сшивающие реагенты, как

бромциан, глутаральдегид, изоцианаты, при этом в качестве твердой фазы применяют целлюлозу, биогель, сефадекс, агарозу и др.

Методы ТИФА применимы и при работе с корпускулярным АГ, например, клетками бактерий и эукариот. Клетки бактерий можно прикрепить к панели высушиванием и усилить прикрепление фиксатором.

 Например, перед адсорбцией клеток бактерий панели обрабатывают поли-L- лизином  в течение 1 часа, лунки промывают и вносят бактериальную взвесь (100мкл взвеси  5х103 – 5х104 в мл ), инкубируют 45 минут и фиксируют

глутаровым альдегидом в  течение 3-5 минут. После связывания иммунореагента свободные места носителя  блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связывание с ним  иммунореагентов на следующих этапах. Для этого применяют различные белки и  реагенты: БСА (бычий сухой альбумин), нормальные сыворотки, твин-20, желатин.

3.2. Варианты ТИФА.

 Существуют неконкурентные и конкурентные варианты.

При неконкурентных вариантах реакция АГ-АТ происходит на поверхности твердой  фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству  искомого АТ или АГ в исследуемом образце.

 При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ  или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству  искомого образца.

 Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометров, измеряя оптическую плотность в опытных и контрольных лунках.

При визуальном учете реакцию расценивают как положительную, если в лунках наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, значительно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательными контролями.

 ИФА обладает следующими преимуществами:

 высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

– возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

– стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

– простотой проведения реакции;

– наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета.

Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины.

Иммуноблотинг ( ИБ)

 В основе этого метода лежит использование нитроцеллюлозных полосок, на которые методами горизонтального и затем вертикального электрофореза переносятся АГ в порядке нарастания их молекулярных масс.

 При проведении исследования эти полоски, помещенные в индивидуальные пластиковые кюветы, последовательно взаимодействуют с сывороткой (иммунной или испытуемой), конъюгатом и субстратом в условиях горизонтального встряхивания с целью перемешивания и равномерного взаимодействия реагентов с полоской по всей ее длине.

 После завершения контакта с очередным ингредиентом полоску промывают специальным раствором для удаления несвязавшихся компонентов.

При наличии специфичности искомых АГ (АТ) известным АТ (АГ) они связываются в иммунные комплексы в определенных зонах полоски. К этому комплексу присоединяются конъюгат, представляющий собой антивидовые антитела, меченые пероксидазой или другим ферментом. После контакта с субстратом, в местах связывания образуется окрашенный продукт, по локализации и интенсивности окрашивания которого делают визуальное заключение о реакции.

Радиоиммунологический анализ (РИА) – это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов.

 Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА). В качестве радиоактивной метки используюи три типа изотопов – 3Н, 14С, 125 I (или 131 I ). Наиболее популярный способ получения коъюгатов – метка радиоактивным иодом, т.к. этот метод введения метки практически не снижает иммунологической активности антигенов и антител в процессе формирования ИК.

Чаще всего в РИА используется Y-изотоп – 125I, имеющий более длительное (60 дней) время полураспада, чем радионуклеоид 131 I (8 дней).

 Методика РИП заключается в 1) формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген-антитело радиоактивной метки), 2) отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул, 3) анализе его

радиоактивного компонента.

Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико-химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором ком плекс антиген-антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. . Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте-

ОСНОВЫ МЕТОДА ПЦР.

 

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний.

1. Прямое определение наличия возбудителей.

 Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3. Высокая чувствительность.

 Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

 Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма.

5. Высокая скорость получения результата анализа.

 Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа.

 

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

 Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

 

 Применение ПЦР в практическом здравоохранении.

 Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение

этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов. Используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина.

Амплификатор ICycler IQ-5 (Bio-Rad, США) – прибор с системой детекции флуоресцентного сигнала в  режиме «реального времени»

 

Показания к применению метода ПЦР при различных заболеваниях.

 1.Применение ПЦР в урогинекологической практике.

 2. Применение в неопатологии.

 3. Применение ПЦР в практике службы крови.

 4. Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии.

 5. Применение ПЦР в клинике инфекционных заболеваний.

 6. Применение ПЦР в иммунологии.

 7.Применение ПЦР в онкологии и др.

 

Иммунопатологические реакции и иммунодефицитные состояния

 

Четыре типа реакций гиперчувствительности за Coombs и Gell:

Гиперчувствительность немедленного типа

1. Реакции анафилактические, атопические.

2. Реакции цитолитические, цитотоксические.

3. Реакции    иммунных комплексов (гистотоксичные).

Гиперчувствительность замедленного типа

4. Реакции туберкулинового типа.                       

 Аллергены разделяются на неинфекционные и инфекционные. Наиболее многочисленной и разнообразной является группа неинфекционных аллергенов.

      К ним относятся: пыльцевые, бытовые, эпидермальные, пищевые аллергены.

 

      Одной из наиболее распространенных групп неинфекционных аллергенов является группа аллергенов с пыльцы растений, которая вызывает массовые аллергические заболевания – полиноз. Полиноз тесно связан с сезоном цветения разнообразных растений. В это время в воздухе одновременно может находиться несколько десятков видов пыльцы.

      Различают такие виды пыльцевых аллергенов:

    1. Из  пыльцы бурьянов – амброзии, лебеды, полыни, пырея и т.д.

    2. Из  пыльцы деревьев – клёна, дуба, берёзы, лещины, ясеня.

    3. Из  пыльцы злаков – рожь, подсолнуха, кукурузы. 

    4. Из  пыльцы луговых трав.

 

Реакции гиперчувствительности могут быть классифицированы на основе иммунологических механизмов, их вызывающих.

При реакциях гиперчувствительности I типа иммунный ответ сопровождается высвобождением вазоактивных и спазмогенных веществ, которые действуют на сосуды и гладкие мышцы, нарушая таким образом их функции.

При реакциях гиперчувствительности II типа гуморальные антитела непосредственно участвуют в повреждении клеток, делая их восприимчивыми к фагоцитозу или лизису.

При реакциях гиперчувствительности III типа (иммунокомплексных болезнях) гуморальные антитела связывают антигены и активируют комплемент. Фракции комплемента затем привлека­ют нейтрофилы, которые вызывают повреждение ткани.

При реакциях гиперчувствительности IV типа возникает по­вреждение ткани, причиной которого является патогенный эффект сенсибилизированных лимфоцитов.

 

 

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ I ТИПА–АНАФИЛАКТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Реакции гиперчувствительности I типа бывают системными и местными. Системная реакция развивается обычно в ответ на внутривенное введение антигена, к которому организм хозяина уже сенсибилизирован. При этом часто спустя несколько минут развивается шоковое состояние, которое может стать причиной смерти. Местные реакции зависят от места, в которое попадет антиген, и носят характер локализованного отека кожи (кожная аллергия, крапивница), выделений из носа и конъюнктивы (аллергический ринит и конъюнктивит), сенной лихорадки, бронхиальной астмы или аллергического гастроэнтерита (пищевая аллергия)

Схема. Реакции гиперчувствительности I типа— анафилактические реакции

Известно, что реакции гиперчувствительности I типа проходят в развитии две фазы (схема 25). Первая фаза инициального ответа характеризуется расширением сосудов и повышением их проницаемости, а также, в зависимости от локализации, спазмом гладкой мускулатуры или секрецией желез. Эти признаки появ­ляются через 5—30 мин после экспозиции аллергена. Во многих случаях вторая (поздняя) фаза развивается через 2—8 ч, без дополнительной экспозиции антигена и продолжается несколько дней. Эта поздняя фаза реакции характеризуется интенсивной ин­фильтрацией эозинофилами, нейтрофилами, базофилами и мо­ноцитами, а также деструкцией ткани в виде повреждения эпите­лиальных клеток слизистых оболочек.

Тучные клетки и базофилы играют главную роль в развитии реакций гиперчувствительности I типа; они активируются по­средством перекрестно реагирующих высокоаффинных рецепто­ров к IgE. Кроме того, тучные клетки активируются компонента­ми комплемента С5а и С3а (анафилатоксины), а также цитокинами макрофагов (интерлейкин-8), некоторыми лекарственными веществами (кодеин и морфин) и физическими воздействиями (тепло, холод, солнечный свет)

 

 

У человека реакции гиперчувствительности I типа вызывают­ся иммуноглобулинами класса IgE. Аллерген стимулирует продукцию IgE В-лимфоцитами в основном в слизистых оболочках в месте попадания антигена и в регионарных лимфатических узлах. IgE-антитела, образованные в ответ на аллерген, атакуют тучные клетки и базофилы, которые обладают высокочувствительными рецепторами для Fc-порции IgE. После того как тучные клетки и базофилы, атакованные цитофильными IgE-антитела-ми, повторно встречаются со специфическим антигеном, разви­вается серия реакций, приводящая к выбросу ряда сильных меди­аторов, ответственных за клинические проявления гиперчувствительности I типа.

Вначале антиген (аллерген) связывается с IgE-антителами. При этом мультивалентные антигены связывают более одной молекулы IgE и вызывают перекрестное связывание соседних IgE-антител. Связывание молекул IgE инициирует развитие двух независимых процессов: 1) дегрануляцию тучных клеток с выбросом первичных медиаторов; 2) синтез de novo и выброс вторичных медиаторов, таких как метаболиты арахидоновой кислоты. Эти медиаторы непосредственно ответственны за начальные симптомы реакций гиперчувствительности I типа. Кроме того, они включают цепь реакций, которые приводят к развитию второй (поздней) фазы инициального ответа.

Первичные медиаторы содержатся в гранулах тучных клеток. Их делят на четыре категории.

▲ Биогенные амины включают гистамин и аденозин. ГистамиН вызывает выраженный спазм гладкой мускулатуры бронхов, усиление сосудистой проницаемости, интенсивную секрецию носо­вых, бронхиальных и желудочных желез. Аденозин стимулирует тучные клетки к выбросу медиаторов, вызывающих бронхоспазм и торможение агрегации тромбоцитов.

▲ Медиаторы хемотаксиса включают эозинофильный хемотаксический фактор и нейтрофильный хемотаксический фактор.

▲ ферменты содержатся в матриксе гранул и включают проте­зы (химаза, триптаза) и некоторые кислые гидролазы. Ферменты вызывают образование кининов и активацию компонентов комплемента (СЗа), воздействуя на их предшественников.

▲ Протеогликан — гепарин.

Вторичные медиаторы включают два класса со­единений: липидные медиаторы и цитокины.

▲ Липидные медиаторы образуются благодаря последователь­ным реакциям, происходящим в мембранах тучных клеток и при­водящим к активации фосфолипазы А2. Она воздействует на фосфолипиды мембран, вызывая появление арахидоновой кис­лоты. Из арахидоновой кислоты в свою очередь образуются лейкотриены и простагландины.

Лейкотриены играют исключительно важную роль в патоге­незе реакций гиперчувствительности I типа. Лейкотриены С4 и D4 — самые сильные из известных вазоактивных и спазмогенных агентов. Они действуют в несколько тысяч раз активнее гистамина при повышении сосудистой проницаемости и сокращении гладкой мускулатуры бронхов. Лейкотриен В4 обладает сильным хемотаксическим действием в отношении нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов.

Простагландин D₂образуется в тучных клетках и вызывает интенсивный бронхоспазм и повышенную секрецию слизи.

Фактор активации тромбоцитов (ФАТ) — вторичный меди­атор, вызывающий агрегацию тромбоцитов, выброс гистамина, бронхоспазм, повышение сосудистой проницаемости и расшире­ние кровеносных сосудов. Кроме того, он обладает выраженным провоспалительным эффектом. ФАТ оказывает токсическое действие в отношении нейтрофилов и эозинофилов. В высоких концентрациях он активирует клетки, участвующие в воспале­нии, вызывая их агрегацию и дегрануляцию

▲ Цитокины играют важную роль в патогенезе реакций гипер­чувствительности I типа благодаря их способности рекрутиро­вать и активировать воспалительные клетки. Полагают, что туч­ные клетки продуцируют ряд цитокинов, включая фактор некро­за опухоли а (ФНО-а), интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестиму-лирующий фактор (ГМ-КСФ). В экспериментальных моделях по­казано, что ФНО-а является важным медиатором IgE-зависимых кожных реакций. ФНО-а считают сильным провоспалительным цитокином, который может привлекать нейтрофилы и эозинофилы, способствуя их проникновению через стенки сосудов и активируя их в тканях. Наконец, ИЛ-4 необходим для рекрутирования эозинофилов. Воспалительные клетки, накапливающиеся в местах развития реакции гиперчувствительности I типа, являются дополнительным источником цитокинов и гистаминвысвобождающих факторов, которые вызывают дальней­шую дегрануляцию тучных клеток.

Таким образом, гистамин и лейкотриены быстро выделяются из сенсибилизированных тучных клеток и ответственны за немедленно развивающиеся реакции, характеризующиеся отеком, секрецией слизи, спазмом гладкой мускулатуры. Многие другие медиаторы, представленные лейкотриенами, ФАТ и ФНО-а, включаются в позднюю фазу ответа, рекрутируя дополнитель­ное количество лейкоцитов — базофилов, нейтрофилов и эозинофилов.

Среди клеток, которые появляются в позднюю фазу реакции, особенно важны эозинофилы. Набор медиаторов в них столь же велик, как и в тучных клетках. Таким образом, дополнительно рекрутированные клетки усиливают и поддерживают воспалительный ответ без дополнительного поступления антигена.

Регуляция реакций гиперчувствительности I типа цитокинами. Во-первых, особую роль в развитии реакций гиперчувстви­тельности I типа играет IgE, секретируемый В-лимфоцитами в присутствии ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, причем ИЛ-4 абсолютно необ­ходим для превращений IgE-продуцирующих В-клеток. Склон­ность некоторых антигенов вызывать аллергические реакции от­части обусловлена их способностью активировать Т-хелперы-2 (Th-2). Наоборот, некоторые цитокины, образованные Т-хелпе-рами-1 (Th-1), например гамма-интерферон (ИНФ-γ), снижают синтез IgE. Во-вторых, особенностью реакций гиперчувствитель­ности I типа является повышенное содержание тучных клеток в тканях, рост и дифференцировка которых зависят от некоторых цитокинов, включая ИЛ-3 и ИЛ-4. В-третьих, ИЛ-5, выделяемый Th-2, исключительно важен для образования эозинофилов из их предшественников. Он также активирует зрелые эозинофилы.

Системнаяиместная анафилаксия

Системная анафилаксия возникает после введения гетерологичных белков, например антисывороток, гормонов, ферментов, полисахаридов и лекарственных веществ. Тяжесть заболевания зависит от уровня сенсибилизации. Шоковая доза антигена, однако, может быть исключительно мала. Например, для кожного тестирования различных форм аллергии достаточно минимального количества антигена. Спустя несколько минут после экспозиций появляются зуд, крапивница и кожная эритема, затем через короткое время развивается спазм респираторных бронхиол и появляется респираторный дистресс. Рвота, спазмы в животе, понос и обструкция гортани могут закончиться шоком и смертью больного. На вскрытии в одних случаях обнаруживаются отек и кровоизлияние в легких, тогда как в других — острая эмфизема легких с расширением правого желудочка сердца.

Местную анафилаксию называют атопической аллергией. Около 10 % населения страдает от местной анафилаксии, возни­кающей в ответ на попадание в организм аллергенов: пыльцы растений, перхоти животных, домашней пыли и т.п. К заболеваниям, в основе которых лежит местная анафилаксия, относят крапивницу, ангионевротический отек, аллергический ринит (сенная лихорадка) и некоторые формы астмы. Существует семейная предрасположенность к этому типу аллергии.

 

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ II ТИПА –ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

При реакциях гиперчувствительности II типа в организме появляются антитела, которые направлены против антигенов, рас­положенных на поверхности клеток или других компонентов тканей. Антигенные детерминанты могут быть связаны с клеточной мембраной или представляют собой экзогенный антиген, ад­сорбированный на поверхности клеток. В любом случае реакция гиперчувствительности возникает как следствие связывания антител с нормальными или поврежденными антигенами на поверхности клетки. Описаны три антителозависимых механизма развития реакции этого типа.

Комплементзависимые реакции (схема 26). Существует два механизма, с помощью которых антитело и комплемент могут вызывать реакции гиперчувствительности II типа: прямой лизис и опсонизация. В первом случае антитело (IgM или IgG) реагирует с антигеном на поверхности клетки, вызывая активацию системы комплемента и приводя в действие мембраноатакующий комплекс, который нарушает целостность мембраны, “продырявливая” липидный слой. Во втором случае клетки сенсибилизированы к фагоцитозу посредством фиксации антитела или СЗЬ — фрагмента комплемента к поверхности клетки (опсонизация). При этом варианте реакции гиперчувствительности II типа чаще всего затрагиваются клетки крови (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты), но антитела могут быть направлены также против внеклеточных структур, например против гломерулярной ба-зальной мембраны.

 

 

Схема 26. Реакция гиперчувствительности II типа— комплементзависимые реакции

 

Клинически такие реакции возникают в следующих случаях:

▲ при переливании несовместимой крови, когда клетки донора реагируют с антителами хозяина;

▲ при эритробластозе плода, когда имеются антигенные разли­чия между матерью и плодом, а антитела (IgG) матери, проникая сквозь плаценту, вызывают разрушение эритроцитов плода;

 

 

 

Гемолитическая болезнь новорожденного

 

▲ при аутоиммунной гемолитической анемии, агранулоцитозе и тромбоцитопении, когда происходит образование антител против собственных клеток крови, которые затем разрушаются;

▲ при некоторых реакциях на лекарства образующиеся антитела реагируют с препаратами, образуя комплексы с эритроцитарным антигеном.

Антителозависимая связанная с клетками цитотоксичность (схема 27) не сопровождается фиксацией комплемента, однако вызывает кооперацию лейкоцитов. Клетки-мишени, покрытые IgG-антителами в низких концентрациях, уничтожаются несенсибилизированными клетками, которые обладают Fc-рецепторами. Несенсибилизированные клетки связывают клетки-мишени ре­цепторами для Fc-фрагмента IgG, а лизис клеток происходит без фагоцитоза. В этом виде цитотоксичности участвуют моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и естественные киллеры (NK). Хотя в большинстве случаев в данном типе реакции участвуют антитела IgG; иногда (например, при связанной с эозинофилами цитотоксичности против паразитов) задействованы IgE-антитела. Этот вид цитотоксичности также имеет значение при реакции оттор­жения трансплантата.

 

 

Схема 27. Реакция гиперчувствительности II типа— антителозависимая связанная с клетками цитотоксичность

 

Антителоопосредованная клеточная дисфункция. В некоторых случаях антитела, направленные против рецепторов на по­верхности клеток, нарушают их функционирование, не вызывая повреждения клеток или развития воспаления. Например, при миастении антитела вступают в реакцию с ацетилхолиновыми рецепторами в двигательных концевых пластинках скелетных мышц, нарушая нервно-мышечную передачу и вызывая таким образом мышечную слабость. Наоборот, при антителоопосредованной стимуляции функций клетки развивается базедова болезнь. При этом заболевании антитела против рецепторов тиреотропного гормона на эпителиальных клетках щитовидной железы стимулируют клетки, что приводит к гипертиреозу. Этот же механизм лежит в основе реакций инактивации и нейтрализации.

 

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ III ТИПА –ИММУНОКОМПЛЕКСНЫЕ РЕАКЦИИ

Развитие реакций гиперчувствительности III типа вызывают комплексы антиген — антитело, которые повреждают ткань в связи с их способностью активировать различные медиаторы сы­воротки крови, главным образом систему комплемента (схема 28). Токсическая реакция возникает тогда, когда антиген связывается с антителом или в кровеносном русле (циркулирующие иммунные комплексы), или вне сосудов, где антиген может осаж­даться (иммунные комплексы in situ). Отдельные формы гломе-рулонефрита, при которых иммунные комплексы образуются in situ, начинаются с имплантации антигена в гломерулярную ба-зальную мембрану. Комплексы, образованные в кровотоке, вызывают повреждение тогда, когда они попадают в стенки кровеносных сосудов или оседают в фильтрующих структурах, таких как гломерулярный фильтр. Образование комплексов антиген — антитело еще не означает болезнь, так как они встречаются при многих иммунных процессах и могут представлять собой нор­мальный механизм элиминации антигена.

Известны два типа иммунокомплексных повреждений: 1) при поступлении в организм экзогенного антигена (чужеродный белок, бактерия, вирус) и 2) при образовании антител против собственных антигенов (эндогенные). Заболевания, развитие которых обусловлено иммунными комплексами, могут быть генерализованными, если иммунные комплексы образуются в крови и осе-Дают во многих органах, или местными, когда иммунные комплексы локализованы в отдельных органах, таких как почки (гломерулонефрит), суставы (артрит) или мелкие кровеносные сосуды  кожи (местная реакция Артюса).

 

Схема 28. Реакции гиперчувствительности III типа— иммунокомплексные реакции

 

 

Системная и местнаяиммунокомплексная болезнь

Системная иммунокомплексная болезнь. Одной из ее разно­видностей является острая сывороточная болезнь, которая часто возникает в результате многократного введения большого количества чужеродной сыворотки крови, используемой для пассивной иммунизации.

Патогенез системной иммунокомплексной болезни скла­дывается из трех фаз:

▲ образование в крови комплексов антиген — антитело;

▲ осаждение иммунных комплексов в различных тканях;

▲ воспалительная реакция в разных частях тела.

Первая фаза начинается с попадания антигена в кровь и его взаимодействия с иммунокомпетентными клетками, приводящего к образованию антител. Приблизительно через 5 дней после введения сыворотки вырабатываются антитела против ее компонентов, которые, еще находясь в кровотоке, образуют комплексы антиген — антитело. Во вторую фазу эти комплексы оседают в различных тканях. Дальнейшее течение болезни определяют два фактора: 1) размеры иммунных комплексов и 2) состояние системы моноцитарных фагоцитов (СМФ).

Очень крупные комплексы образуются при значительном избытке антител, быстро удаляются из кровотока клетками СМФ и относительно безвредны. Наиболее патогенны мелкие и средних размеров комплексы, которые образуются при незначительном избытке антител, дольше циркулируют и не так жадно захваты­ваются фагоцитирующими клетками.

В связи с тем что СМФ в норме разрушает циркулирующие иммунные комплексы, ее перегрузка или существенная дисфункция увеличивает возможность персистенции иммунных комплексов в кровотоке и их осаждение в тканях.

Кроме того, такие факторы, как заряд иммунных комплексов (анионный или катионный полюс комплекса), валентность анти­гена, авидность антитела, аффинность антигена к компонентам различных тканей, трехмерная структура комплексов (решетка) и гемодинамические факторы, влияют на осаждение иммунных комплексов в тканях. Чаще всего иммунные комплексы оседают в почечных клубочках, а также в суставах, коже, сердце, серозных оболочках и мелких кровеносных сосудах.

Для того чтобы комплексы покинули систему кровообраще­ния и осели в тканях, должна увеличиться проницаемость сосудистого русла. Во-первых, IgE-антитела, образовавшиеся вскоре после поступления в кровь антигена, связываются с циркулирую­щими базофилами, и происходит выброс гистамина и ФАТ. Эти медиаторы раздвигают эндотелиальные клетки, и иммунные комплексы проходят сквозь стенку сосудов. Как только иммун­ные комплексы оседают в тканях, они вызывают острую воспалительную реакцию. В эту фазу (приблизительно через 10 дней после введения антигена) наблюдаются клинические проявления болезни, такие как лихорадка, крапивница, артралгии, увеличе­ние лимфатических узлов и протеинурия. Вслед за осаждением иммунных комплексов происходит активация системы компле­мента с образованием его биологически активных компонентов.

Активация системы комплемента сопровождается провоспалительными эффектами: выбросом С3b-опсонина, способствующего фагоцитозу; образованием хемотаксических факторов, вы­зывающих миграцию полиморфно-ядерных лейкоцитов и моноцитов (С5, С5Ь67); выбросом анафилотоксинов (С3а и С5а), которые увеличивают проницаемость сосудов и вызывают сокращение гладких мышц; образованием мембраноатакующего комплекса (С5—9), вызывающего разрушение клеточных мембран и цитолиз.

Фагоцитоз комплексов антиген — антитело лейкоцитами при­водит к выбросу или образованию различных дополнительных провоспалительных веществ, включая простагландины, сосудорасширяющие белки и хемотаксические вещества, например некоторые лизосомальные ферменты, в том числе протеазы, спо­собные растворять базальную мембрану, коллаген, эластин и хрящ. Повреждение тканей опосредуется также свободными радикалами кислорода, продуцируемыми активированными нейтрофилами.

Иммунные комплексы вызывают агрегацию тромбоцитов и активацию фактора Хагемана, что приводит к усилению воспалительного процесса и образованию микротромбов. В результате развиваются васкулит, гломерулонефрит, артрит и т.п.

Все эти повреждения возникают при участии комплементсвязанных антител (IgG и IgM). Однако, так как IgA может активировать комплемент по альтернативному пути, IgA-содержащие комплексы также могут вызывать тканевые повреждения. Важная роль комплемента в патогенезе тканевых повреждений подтверждается наблюдением, что истощение комплемента в сыворотке крови (в эксперименте) обычно уменьшает выраженность повреждений.

В морфологической картине иммунокомплексного повреждения доминирует острый некротизирующий васкулит с образованием фибриноида и экссудацией нейтрофилов. Например, пораженные клубочки почки всегда увеличены вследствие набухания и пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток, ин­фильтрации нейтрофилами и моноцитами. При иммунофлюоресцентной микроскопии иммунные комплексы видны в виде гранулярных депозитов иммуноглобулина и комплемента, а под электронным микроскопом — в виде электронно-плотных депозитов вдоль гломерулярной базальной мембраны. Если заболевание возникает после разовой массивной экспозиции антигена, напри­мер при остром постстрептококковом гломерулонефрите и острой сывороточной болезни, то все повреждения имеют тенденцию к разрешению благодаря катаболизму иммунных комплексов.

Для развития хронической иммунокомплексной болезни необходима постоянная антигенемия, так как иммунные комплексы чаще всего оседают в сосудистом русле. Это наблюдается при некоторых заболеваниях, таких, как системная красная волчанка, которая обусловлена персистенцией аутоантигенов. Часто, однако, несмотря на наличие характерных морфологических изменений и других признаков, свидетельствующих о развитии иммунокомплексной болезни, антиген остается неизвестным, например при ревматоидном артрите, узелковом периартериите, мембранозном гломерулонефрите и некоторых васкулитах.

Местная иммунокомплексная болезнь. Ее еще называют реакцией Артюса. Она заключается в местном некрозе ткани, возникающем вследствие острого иммунокомплексного васкулита. реакцию можно вызвать в эксперименте путем внутрикожного введения антигена иммунному животному, которое имеет цирку­лирующие антитела против антигена. Вследствие избытка антител, когда антиген проникает в стенки сосудов, образуются крупные иммунные комплексы, которые вызывают воспалительную реакцию. В отличие от IgE-опосредованных реакций гиперчувствительности I типа, которые возникают немедленно, реакция Артюса развивается в течение нескольких часов и достигает пика через А—10 ч после инъекции. При иммунофлюоресцентном окрашивании удается выявить комплемент, иммуноглобулины и фибриноген, осажденные в стенках сосудов, обычно венул; при светооптическом исследовании — фибриноидный некроз сосудов. Разрыв сосудов приводит к возникновению кровоизлияний, но чаще наблюдается тромбоз, способствующий развитию местных ишемических повреждений.

 

 

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IV ТИПА ИММУНОКЛЕТОЧНЫЕ РЕАКЦИИ

Реакции гиперчувствительности IV типа вызывают специфи­чески сенсибилизированные Т-лимфоциты. К реакциям этого типа относятся классические замедленные реакции гиперчувствительности, вызываемые СD4⁺Т-лимфоцитами, и прямая клеточная цитотоксичность, опосредованная СD8⁺Т-лимфоцитами. Это основной тип иммунного ответа на различные внутриклеточные патогенные агенты, особенно микобактерии туберкулеза, а так­же на многие вирусы, грибы, простейшие и паразиты. Другими примерами являются контактная кожная чувствительность к химическим веществам и реакция отторжения. Описаны два варианта реакций гиперчувствительности IV типа.

Гиперчувствительность замедленного типа (схема 29). Хоро­шо известным примером такого варианта является реакция на введенный внутрикожно туберкулин — белково-липополисахаридный компонент микобактерии туберкулеза. У сенсибилизиро­ванного пациента через 8—12 ч возникают покраснение и уплот­нение в месте введения, а пик реакции наступает через 24—72 ч. сильно сенсибилизированных больных в месте инъекции может развиться некроз. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) характеризуется накоплением мононуклеарных клеток в дерме и подкожной основе (подкожно-жировая клетчатка). Наблюдается преимущественное накопление клеток вокруг мел­ких вен и венул с образованием характерных периваскулярных манжеток. Увеличение сосудистой проницаемости сопровожда­ется образованием пор между эндотелиальными клетками. Выход белков плазмы за пределы сосудистого русла увеличивает отек дермы и сопровождается оседанием фибрина в интерстиции. С помощью иммунопероксидазного метода в участках поврежде­ний обнаруживается преобладание СD4⁺Т-лимфоцитов-хелперов.

 

 

 

Схема 29. Реакции гиперчувствительности IV типа— гиперчувствительность замедленного типа

 

 

 

При персистенции антигена макрофаги часто трансформиру­ются в эпителиоидные клетки, которые окружает вал из лимфоцитов — формируется гранулема. Такой тип воспаления характерен для реакций гиперчувствительности IV типа и называется гранулематозным воспалением.

Последовательность событий при ГЗТ можно рассмотреть на примере туберкулиновой реакции, которая начинается с первой встречи индивидуума с микобактериями туберкулеза. CD4⁺T-лимфоциты распознают белки туберкулезной микобактерий, связанные с молекулами II класса на поверхности моноцитов или других антигенпредставляющих клеток. Эта первая встреча вы­зывает дифференцировку СD4⁺Т-клеток в Th-1-клетки. Образование Th-1 -клеток является важным звеном в патогенезе ГЗТ, _так как ее дальнейшее развитие зависит от цитокинов, которые секретируются Th-1-клетками. У неиммунизированного хозяина микроорганизмы впервые подвергаются атаке макрофагами, что приводит в некоторых случаях к продукции ИЛ-12. Этот цитокин регулирует дифференцировку СD4⁺Т-клеток в Th-1. Таким образом, развитие ГЗТ может быть связано с продукцией ИЛ-12. Сенсибилизированные Th-1-клетки поступают в кровоток и остаются там длительное время, иногда годами. В ответ на инъекцию туберкулина индивидууму, который имел раньше контакт с микобактериями туберкулеза, сенсибилизированные Th-1-клетки вза­имодействуют с антигеном на поверхности антигенпредставляющих клеток и активируются, например подвергаются бласттрансформации и пролиферации. Эти изменения сопровождаются секрецией цитокинов, ответственных за ГЗТ.

ИФН-7 является наиболее важным медиатором ГЗТ и сильным активатором макрофагов. Активированные макрофаги обладают способностью к фагоцитозу и уничтожают микроорга­низмы. На поверхности макрофагов имеются молекулы II класса, с помощью которых они способствуют представлению антигена. Возрастает их активность, направленная на элиминацию опухолевых клеток. Макрофаги секретируют некоторые полипептидные факторы роста, такие как тромбоцитарный фактор роста и трансформирующий фактор роста. Последний стимулирует пролиферацию фибробластов и усиливает синтез коллагена. Таким образом, активированные макрофаги обеспечивают элиминацию антигена, а если активация продолжается, то способствуют развитию фиброза и его отграничению.

ИЛ-2 вызывает аутокринную и паракринную пролиферацию Т-клеток, которые аккумулируются в местах развития ГЗТ, причем включение в инфильтрат антигенспецифических CD4+T-лимфоцитов активируется ИЛ-2.

ФНО-а и лимфотоксин являются цитокинами, оказывающими воздействие на эндотелиальные клетки. Повышенная секреция простациклина эндотелиальными клетками приводит к увеличению кровотока в результате вызываемого им расширения сосудов. Наблюдается усиление экспрессии адгезивной молекулы Е-селектина (ELAM-1), что способствует прикреплению при­шлых лимфоцитов и моноцитов. Происходит усиление секреции низкомолекулярных хемотаксических факторов, например ИЛ-8. Все эти изменения в эндотелии способствуют выходу лимфоцитов и моноцитов за пределы сосудистого русла в места развития реакции ГЗТ. ФНО-а также играет важную роль в образовании гранулем.

Этот тип гиперчувствительности является главным механизмом защиты от различных внутриклеточных патогенных агентов, включая микобактерии, грибы и некоторых паразитов, а также может участвовать в отторжении трансплантата и опухо­левом иммунитете.

 

Цитотоксичность, опосредованная Т-лимфоцитами. При дан­ной цитотоксичности сенсибилизированные СD8⁺Т-лимфоциты уничтожают клетки-мишени, которые являются носителями антигена. Такие эффекторные клетки называют цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Т-лимфоциты, направленные против антигенов гистосовместимости на поверхности клеток, играют важную роль в отторжении трансплантата. Они также участвуют в защите от вирусных инфекций. В клетках, пораженных вирусом, вирусные пептиды связываются с молекулами I класса и в виде комплексов транспортируются к поверхности клетки. Этот комплекс распознается CD8⁺ЦТЛ. Лизис зараженных клеток за­вершается до репликации вируса, что приводит к уничтожению инфекции. Полагают, что многие опухолевые антигены также могут быть представлены на поверхности клеток, а ЦТЛ могут участвовать и в противоопухолевом иммунитете.

Отторжениетрансплантата

В отторжении трансплантата принимают участие некоторые реакции гиперчувствительности (схема 30). Реакция отторжения зависит от распознавания хозяином пересаженной ткани как чужеродной. Антигенами, ответственными за такое отторжение у человека, являются антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). Отторжение трансплантата — сложный про­цесс, во время которого имеют значение как клеточный иммунитет, так и циркулирующие антитела.

Схема 30. Отторжениетрансплантата

Реакции, обусловленные Т-лимфоцитами. Активированные СD4⁺Т-хелперы участвуют в активации CD8+ ЦТЛ. Развитие реакций, опосредованных Т-лимфоцитами, происходит при встрече лимфоцитов реципиента с антигенами HLA донора. Полагают, что наиболее важными иммуногенами являются дендритические клетки в донорских органах. Т-клетки хозяина встречаются с дендритическими клетками в пересаженном органе, а затем мигрируют в регионарные лимфатические узлы. Предшественники СШ+ЦТЛ (прекиллеры Т-клеток), обладающие рецепторами к HLA-антигенам I класса, дифференцируются в зрелые ЦТЛ. Процесс дифференцировки сложен и не совсем понятен. В нем участвуют антигенпредставляющие клетки, Т-лимфоциты и цитокины ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5. Зрелые ЦТЛ лизируют пересаженную ткань. Кроме специфических ЦТЛ, образуются лимфокинсекретирующие СО4⁺Т-лимфоциты, которые играют исключительно важную роль в отторжении трансплантата. Как и при замедленной реакции гиперчувствительности, активированные СО4⁺Т-лимфоциты выделяют цитокины, вызывающие повыше­ние сосудистой проницаемости и местное скопление мононуклеарных клеток (лимфоцитов и макрофагов). Считают, что ГЗТ, проявляющаяся повреждением микрососудов, ишемией и деструкцией тканей, является наиболее важным механизмом деструкции трансплантата. Более вероятно, однако, что относительная важность цитотоксичности, связанной с СБ8⁺Т-лимфоцитами, по сравнению с реакциями, обусловленными СО4⁺Т-лимфоцитами, зависит от природы несоответствия HLA донора и HLA реципиента.

Реакции, обусловленные антителами. Эти реакции могут протекать в двух вариантах. Сверхострое отторжение развивается в том случае, если в крови реципиента имеются антитела против донора. Такие антитела могут встречаться у реципиента, у которого уже было отторжение трансплантата. Предшествующие переливания крови от HLA-неидентифицированных доноров также могут привести к сенсибилизации вследствие того, что тромбоциты и лейкоциты особенно богаты HLA-антигенами. В таких случаях отторжение развивается немедленно после трансплантации, так как циркулирующие антитела образуют иммунные комплексы, которые оседают в эндотелии сосудов пересаженного органа. Затем происходит фиксация комплемента и развивается реакция Артюса.

У реципиентов, которые не были предварительно сенсибили­зированы к антигенам трансплантата, экспозиция донорских HLA-антигенов I и II класса сопровождается образованием антител. Антитела, образованные реципиентами, могут вызывать повреждение с помощью нескольких механизмов, в том числе комплементзависимой цитотоксичности, антителозависимого, обусловленного клетками цитолиза и выпадения комплексов антиген — антитело. Изначально мишенью для этих антител служат сосуды трансплантата, поэтому феномен антителозависимого отторжения (например, в почке) представлен васкулитом.

 

Обнаружить состояние сенсибилизации организма можно с помощью клинических аллергических проб.

         Пробы    in vivo

   1. Епикутанная проба

   2. Cкарификационная кожная проба

   3. Аппликационная проба

   5. Внутрикожные пробы.

   6. Конъюктивальная проба

   7. Назальная провокационная проба.

             Пробы         in vitro

    1. Реакция повреждения нейтрофилов-лейкоцитолиза

    2. Реакция агломерации лейкоцитов.

    3. Реакция дегрануляции базофилов по Шелли.

    4. Реакция специфической  бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ)

 

Аллергическая проба

АЛЛЕРГИИ

В полости рта встречаются все варианты иммунной патоло­гии. Аллергические реакции генерализованного I (анафи­лактического) и II (ц и т о т о к с и ч е с к о г о) типа обнаруживаются в случаях медикаментозной аллергии. Они нередко встречаются в хирургической стоматологии при местном обезболивании новокаином. Наиболее опасной формой аллер­гической реакции I типа является отек Квинке, рас­пространяющийся на гортань и грозящий удушьем. Механизм заболевания связан с реакцией антиген — антитело, которая происходит на мембране тучных клеток с участием гомоцито-тропных антител класса IgE и сопровождается массивным выбро­сом гистамина и гистаминоподобных веществ в кровь.

Аллергические реакции III типа (иммуно-комплексного) на слизистой оболочке рта связаны с образовани­ем иммунных комплексов. Они могут быть вызваны либо бакте­риальными, либо медикаментозными антигенами. Данные реак­ции могут наблюдаться при пародонтозе, язвенно-некротическом гингивите, постгерпетической  многоморфной эритеме. Они при­водят к некрозу, возникающему в результате повреждения со­судистой стенки иммунными комплексами, которые образуются внутри сосудов и оседают на базальной мембране. Так, напри­мер, при язвенно-некротическом гингивите плазматические клет­ки соединительной ткани десен вырабатывают антитела классов IgG и IgM, которые образуют иммунные комплексы с поступаю­щими микробными антигенами. Это приводит к активации системы комплемента по классическому пути и вызывает иммун­ные повреждения типа феномена Артюса, которые проявляются в поверхностном васкулите, тромбозе и некрозе.

Аллергические реакции IV типа (клеточного) в полости рта возникают под воздействием инфекционных аген­тов. Классическим примером подобных воздействий является развитие инфекционной аллергии при туберкулезе. РГЗТ разви­вается также и при многих других инфекциях, а также при контактном дерматите и лекарственных стоматитах. Часто наблюдаемые лекарственные стоматиты связаны с широким применением в стоматологии акриловых смол, мышьяка, рива­нола, рентгеноконтрастных веществ и антибиотиков. С помощью кожно-аллергических проб показано, что чужеродные вещества, из которых изготавливают протезы, вызывают аллергизацию в 0,5—5 % случаях. В ранних стадиях язвенного гингивита преобладает иммунное воспаление клеточного характера при участии сенсибилизированных Т-лимфоцитов и привлеченных лимфокинами макрофагов.

При стоматитах встречаются разные типы иммунопатологии. Они могут развиваться на фоне сенсибилизации организма микробными и медикаментозными аллергенами, а также ауто-аллергенами. При наличии реакции воспаления гиперергического типа и повышенной проницаемости капилляров наблюдается преобладание альтеративной формы воспаления над экссудативной с некротическими изменениями участков слизистой обо­лочки рта на фоне сенсибилизации организма. В зависимости от этого различают серозный и язвенно-некротический стоматит. К иммунопатологическим состояниям со смешанным типом аллергии относится рецидивирующий афтозный стоматит, при котором наблюдаются аллергические реакции II, III и IV типов при наличии аутоиммунного процесса. В этиологии и патогенезе афтозного стоматита существенное значение имеют проявления РГЗТ к ряду бактериальных антигенов, и в первую очередь к тем из них, которые встречаются в полости рта. В частности, при постановке кожно-аллергических проб реакция ГЗТ может развиваться к стрептококку, стафилококку, кишечной палочке и другим антигенам или одновременно к нескольким бактериаль­ным антигенам. При этом в крови лиц, страдающих данным заболеванием, появляются соответствующие антитела. Из афт при рецидивирующем афтозном стоматите, кроме бактерий, могут быть выделены вирусы простого герпеса и аденовирусы I

типа, которые также вызывают состояние гиперчувствительности. Сама афта представляет собой клеточный инфильтрат,, состоя­щий из лимфоцитов, что соответствует иммуноморфологии аллергической РГЗТ, индуцированной к антигенам микроорга­низмов   полости   рта.

При развитии рецидивирующего афтозного стоматита особую роль играют аутоантигены, накапливающиеся при определенных условиях в тканях слизистой оболочки рта. К антигенам пато­логически измененной слизистой оболочки щек относится допол­нительный, так называемый Эн-антиген. Наличие у больных этого антигена подтверждает аутоиммунную концепцию происхожде­ния рецидивирующего афтозного стоматита. Заболевание отли­чается хроническим течением и характеризуется периодическими ремиссиями и обострениями. На слизистых оболочках рта появ­ляются афты, которые изъязвляются. Обычно это заболевание продолжается в течение всей жизни больного, с наиболее типич­ными проявлениями в возрасте 20—40 лет.

В возникновении афтозного рецидивирующего стоматита определенную роль играют наследственные и конституционные факторы: наблюдается врожденная генетическая предрасполо­женность к данному заболеванию, в результате чего довольно часто наблюдаются семейные проявления болезни.

РОЛЬ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ В ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПОЛОСТИ РТА

Защита слизистой оболочки рта осуществляется в большой степени иммуноглобулинами класса А, поэтому дефицит обра­зования этого класса иммуноглобулинов представляет наиболь­ший интерес для стоматологов. При дефектах Т-лимфоцитов больные подвергаются опасности поражения в первую очередь вирусными и грибковыми инфекциями. Первыми признаками иммунодефицита часто является кандидозный стоматит (молоч­ница) или тяжелое длительное течение герпетического стоматита. Врожденный дефект клеточного иммунитета с нарушением ме­ханизмов иммунорегуляции в результате преобладания Т-супрес-соров может сочетаться с хроническим кожнослизистым канди-дозом (хронический гранулематозный кандидоз).

Иммунодефицитные состояния могут быть либо причиной, либо следствием болезней гиперчувствительности или аутоиммун­ных заболеваний. Так, дефицит IgA способствует всасыванию через слизистую оболочку чужеродных антигенов, которые вызы­вают сенсибилизацию организма.

Клиническими проявлениями иммунодефицитных состояний могут служить инфекции, вызванные условно-патогенными мик­роорганизмами, аутоиммунные заболевания, аллергические реак­ции, опухоли. В полости рта нередко проявляются заболевания микробной этиологии (стоматит, гингивостоматит и др.), которые являются следствием первичных и вторичных иммунодефицитных

состояний. Так, у детей, страдающих иммунологической недо­статочностью, слизистая оболочка рта часто поражается бакте­риями, вирусами или грибами в результате резкого снижения клеточной или гуморальной защиты, Такие осложнения наблю­даются у детей с первичными дефектами — врожденной диспла-зией тимуса, приобретенным лимфогранулематозом, лейкозами, избирательным дефицитом IgA, лизоцима или интерферона. Аналогичные осложнения характерны для больных со вторичны­ми иммунодефицитными состояниями, индуцированными меди­каментозной терапией (глюкокортикостероидами и др.). В пато­генезе кандидоза слизистой оболочки рта преобладают эндоген­ные причины, главными из них являются вторичные иммуноде-фицитные состояния, возникающие при диабете, лейкозах, хрони­ческих инфекциях (туберкулезе и других), в послеоперационном периоде. Показательна особенно высокая восприимчивость к кандидозной инфекции у грудных детей и стариков, т. е. у лиц, у которых наблюдаются возрастные иммунодефицитные состоя­ния. При отсутствии у больных кандидозом специфических ан­тител и одновременном снижении специфической кожно-аллер-гической реакции можно прогнозировать неблагоприятное тече­ние заболевания.