Методы культивирования бактерий и определение их количества в исследуемом материале

 

Методы культивирования бактерий и определение их количества в исследуемом материале. Питательные среды и их классификация. Типы и механизм питания и дыхания бактерий.

Методы  создания анаеробних условий.

Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Методы стерилизации и дезинфекции. Асептика и антисептика. Особенности стерилизации стоматологического инструментария. Методы контроля. Учение об генетике микроорганизмов. Организация генетического аппарата бактерий. Генотипическая и фенотипическая изменчивость  у микроорганизмов, практическое значение. Внехромосомные факторы наследственности у бактерий. Плазмиды, их свойства. Мигрирующие  генетические элементи. Рекомбинационные процессы (трансформация, конъюгация, трансдукция ). Генная инженерия и биотехнологии.

 

Бактериологический метод является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. Для этого широко используются питательные среды, на которых выращивают исследуемые микроорганизмы.

Главный метод в борьбе с инфекционными болезнями – профилактический. В связи с этим в деятельности медицинских заведений большое значение имеет предупреждение проникновения возбудителей заболеваний в организм человека или другие объекты. Это проводится методами микробной деконтаминации. Основные из них – стерилизация, дезинфекция, антисептика и асептика. Бактериологический метод один из основных в диагностике большинства инфекционных заболеваний. Характеристика колоний – важная составная часть работы бактериолога, ведь микроорганизмам каждого вида свойственные свои особенности роста.

Типы питания бактерий

 

 

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

Источники углерода и типы питания. Все микроорганизмы по своей способности усваивать разнообразные источники углерода делятся на две группы — автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (лат. autos — сам, trophe — питание) синтезируют Ше углеродсодержащие компоненты клетки из СОг как единственного источника углерода. Гетеротрофы (лат. heteros — Другой, «питающийся за счет других») не могут существовать только за счет ассимиляции СО₂. Они используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения — гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, реже углеводороды. Многие микроорганизмы в качестве источника углерода используют аминокислоты, органические кислоты и другие соединения.

Источники энергии и доноры электронов. В зависимости от источников энергии и природы доноров электронов микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций. К фототрофам относятся исключительно сапрофитные микроорганизмы. В патологии человека ведущую роль играют хемосинтезирующие микроорганизмы.

В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на хемолитотрофы (хемоавтотрофы) и хемоорганотрофы (хемогетеротрофы)

Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии) или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов. Другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из глюкозы и солей аммония, называются прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из указанных соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в гото­вом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода, всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы Mg, К, Са, Fe и другие микроэлементы.

 

Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами требуется достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.

Мир микроорганизмов очень разнообразен. Некоторые из них могут получать энергию даже из минеральных соединений. Так, например, железобактерии получают энергию, выделяющуюся при непосредственном окислении ими железа (Fe2+B Fe3+), которая используется для фиксации СО₂, бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений. Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования.

Аэробы для этой цели нуждаются в свободном кислороде. Облигатные (строгие) аэробы (например, некоторые виды псевдомонад) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, поскольку они используют его в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются ими при окислительном фосфорилировании с участием цитохромоксидаз, флавинзависимых оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ. При этом, если конечным акцептором электронов является О₂, выделяются значительные количества энергии.

Анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода путем ускоренного, но не полного расщепления питательных веществ. Облигатные анаэробы (например, возбудители столбняка, ботулизма) не переносят даже следов кислорода. Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков и липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется сравнительно небольшое количество энергии.

Существуют факультативные анаэробы, которые могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании.

 

Oсновные механизмы питания бактерий:

1.     пассивная диффузия

2.     облегченная диффузия 

3.     активный транспорт 

4.     транслокация химических групп 

Однако большинство питательных веществ,  метаболітів, ионов проникают в клетку с помощью активного транспорта. Его также обеспечивают белки-пермеазы, но они являются  высокоспецифическими и способные переносить только определенные субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии, которую генерирует  клетка, потому возможный перенос и против градиента концентрации вещества. Если этому процессу предшествует определенная химическая модификация  молекулы, его называют транслокацией химических групп. Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.

 

 

Культивирование микроорганизмов.

 Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их многообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды.  Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия  для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

В первую очередь бактерии нуждаются в азоте, углероде  и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород  для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также  белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав  сред должны быть введенные источники питательных веществ и воды, а также ростовые факторы (витамины, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного  и растительного происхождения, белковые гідролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитичну жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.

Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию,  иметь в своем составе неорганические фосфаты.

Допустимым является употребление веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсиноутворення микробов (отдельные аминокислоты, твин, активированный уголь и тому подобное). Важной является стабилизация оптимума рН среды, его высокой буферности. Среды должны иметь определенную густоту Зависимо (жидкие, полужидкие, плотные), быть изотоническими, прозрачными и обовязково стерильными.

Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют  специальные среды. Часть их готовят в  лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны задовільнити самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

 

Oсновные требования к питательным средам:

1.     прозрачность,

2.     стерильность

3.     лёгкая усвояемость

4.     определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

5.     изотоничность,

6.     определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

Классификация питательных сред

 

 

 

 

Рис. 1. МПА                                               Рис. 2. Середовище Эндо.

 

 

Рис. 3. Середовище  Плоскирева.                     Рис. 4. Середовище Левина

 

 

Рис. 5. Среды Гисса.                                 Рис. 6. Желточно-солевой агар

 

Рис. 7. Кровяной МПА

 

 

Рис. 8. Разрежение желатина             Рис. 9. Тест на виявление индола.

(у правой пробирке – положи-                   Слева – незасеянный контроль,

тельный, в левой – отрица-                         справа – отрицательный результат,

тельный  тест).                                              в центре – положительный,

 

 

Методы обеззараживания биологических объектов.

Стерилизация – полное уничтожение вегетативных и споровых форм всех микроорганизмов на определенных предметах, материалах, питательных средах.

Дезинфекция – совокупность физических, химических и механических способов уничтожения вегетативных и споровых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Антисептика – комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение или угнетение роста микробов в ране, на поверхности кожи или слизистых оболочек.

Асептика – система профилактических мероприятий, направленных против проникновения микробов в рану, ткани, органы больного.

 

Методы стерилизации:

1.     стерилизация паром под давлением,

2.     текущим паром,

3.     сухим жаром,

4.     ионизирующее и ультрафиолетовое облучение,

5.     холодная стерилизация.

 

Рис.  Сухожаровой шкаф

 

Рис. 10. Строение автоклава.

 

 

Контроли стерилизации.

 

Рис. 11. Контроли стерилизации.

 

Рост и  размножение бактерий. Любое живое существо способно к росту и размножению. Под ростом понимают координированное воссоздание бактериальных структур и соответственно увеличение массы микробной клетки. Размножение – это способность микробов к самовоспроизведению, при этом увеличивается количество особей в популяции на единицу обєму среды

Размножение бактерий – сложный процесс, повязаний с синхронным взаимодействием многих их структур. Начинается оно из воссоздания генетического материала – ДНК, которая локализована в нуклеоиде. Сначала происходит репликация (удвоение) генетического материала полуконсервативным путем. Начинается она из реплікативної точки на ДНК, расположенной  в месте зєднання мезосоми с цитоплазматичною мембраной. Нуклеиновая кислота деспирализируется, и нити ДНК расходятся. Каждая из них является матрицей, на которой  по принципу комплементарности  синтезируются их копии,  которые впоследствии соединяются в двунитевую ДНК. Синтез дочерних нитей ДНК происходит ступенево, небольшими фрагментами по 1-2 тыс. нуклеотидів, которая позже сшивается ферментом лигазой. В зависимости от условий, репликация может длиться 20-40 минут.

Параллельно с репликацией начинается образование поперечной перегородки за счет цитоплазматичної мембраны. Потом она окружается пептидогликаном. Во время репликации и образования перегородки клетка растет, синтезируются биополимеры, из которых будут состоять цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клетки отделяются одна от другой, а у грамотрицательных  микробов  синтезируется дополнительно внешняя мембрана. Если клетки хранят звязки, образуются цепи из коккоподобных или палочкоподобных форм.

Подол клеток может происходить за тремя типами. Опережающий – такой тип, при котором образуются многоклеточные палочки и коки. При синхронном репликация нуклеоиду сопровождается делением клетки, и образуются одноклеточные организмы. Третий тип – с опережающим делением нуклеоиду, при котором  образуются многоядерные формы бактерий.

Как правило, бактерии размножаются простым делением, что происходит в разных плоскостях. Это влечет, например,  образование   разных морфологических типов коккоподобных микроорганизмов – диплококков,  стафилококков, тетеракоків, сарцин. Актиномицеты могут размножаться путем фрагментации нитевидных клеток, почкованием. Возможно образование клеток, подобных к спорам, конидий.

Облигатные внутриклеточные паразиты – хламидии – размножаются, проходя ряд стадий: элементарные тельця, инициальные тельця, промежуточные тельця. Именно последние являются тем источником, из которого формируется  новое поколение  элементарных телец. Длительность цикла составляет 40-48 часов.

Микоплазмы также могут образовывать особенные элементарные тела, которые способны к размножению фрагментацией или почкованием. Однако они могут размножаться  и простым бинарным делением.

Скорость размножения бактерий зависит от многих факторов: возраста культуры, состава питательной среды, его рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и тому подобное.

Бактерии размножаются в геометрической прогрессии. Если считать, что при оптимальных условиях бактерия удваивается каждые 30 минут, то через час их будет 4, через два часа – 16, через 4 – 256, через 15 – миллионы. Через 35 год их обєм будет составлять  до 1000 м³, а масса – свыше 400 т.

При внесении в питательную среду бактерии размножаются за определенными закономерностями. Они растут и размножаются, достигая определенного максимума до той поры, пока не будет исчерпано запасы питательных веществ. Если не удалять конечные продукты обмена и не добавлять необходимые вещества, то можно получить периодическую культуру (популяция в ограниченном пространстве). Микроорганизмы в такой культуре ведут себя как многоклеточные системы с генетически ограниченным ростом.

Кривая, которая описывает зависимость логарифму числа живых клеток от  времени культивирования, называется кривой роста.

 

Основные фазы роста периодической культуры:

1.     начальная (лаг-) – 1,

2.     экспоненциальная (або логарифмическая ) – 2 ,

3.     стационарная – 3

4.     отмирания – 4 (рис. 12)

 

Рис. 12. Основные фазы роста микробной популяции

на жидких питательных средах.

 

 

Классификация бактерий по типам дыхания :

 

Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры)

Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии)

Факультативные анаеробы (стафилококки, ешерихии, сальмонелли, шигеллы)

Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии)

Капнеичные (возбудитель бруцеллеза бычьего типа)

Сегодня, в зависимости от условий получения энергии (способа дыхания), прокариоты разделяются на ряд групп.  Облигатные  аэробы – микроорганизмы, для оптимальнгоо роста которых необходимо 21 % кислорода. К ним принадлежат возбудители туберкулеза, чумы, холерный вибрион. На поверхности жидких питательных сред они растут, как правило, в виде пленки.  Облигатные анаэробы – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода. Такими бактериями являются  возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерії и др. Отдельные клостридии могут быть аэротолерантными. Для культивирования их используют специальные питательные среды и аппараты (анаеростати), в которых создаются анаэробные условия за счет поглощения кислорода или замены его індиферентиними газами (азотом, водородом).  Факультативные анаэробы (факультативные аэробы) приспособились, в зависимости от условий среды (наличия или отсутствия кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот. Группу факультативных анаэробов формируют многочисленные представители семьи  кишечных бактерий (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафилококки и некоторые другие бактерии. Микроаэрофилы – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост. Эта группа представлена молочнокислыми, азотфиксирующими бактериями. Капнеичными называют такие микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа. Типичными представителями являются  возбудители бруцеллеза бычьего типа.

У облигатных аэробов кислород используется в качестве конечный акцептор электронов в реакциях, что каталізуються цитохромоксидазами и оксигеназами. В клетках факультативных анаэробов  также есть  цитохромоксидази, однако у облигатных анаэробов ферментов, которые катализируют взаимодействие с молекулярным кислородом, нет.

Детальное изучение механизмов дыхания у бактерий довело, что первыми микроорганизмами на земном шаре были анаэробы, так как до возникновения фотосинтезирующих эукариотов содержание кислорода в атмосфере был незначительным сравнительно с настоящим. По расчетам, чтобы  состоялось переключение механизма брожения на аэробное дыхание,  достаточно было 0,2 %  кислорода в атмосфере (на сегодня его концентрация составляет 21 %). В свою очередь рост содержания кислорода привел к изменению характера атмосферы из обновительного  на окислительное за счет соответствующих реакций. В условиях бескислородной атмосферы существовал дефицит акцепторов электронов, а с появлением кислорода эта проблема была розвязана.

 

 

Основные питательные среды для культивирования анаэробов: сахарный агар, сахарный кровяной агар Цейсслера, среда Китт-Тароцци, среда Вильсона-Блера, тиогликолевая среда.

 

Биологический метод создания анаэробных условий Фортнера:

Посев делают на сахарном кровяном агаре, который разделён посредине на две половины. На одной половине делают посев анаэробов, на второй – аэробов. Чашку  герметизируют парафином и ставят в термостат. Сначала растут аэробы. Когда весь кислород используется –  начинается рост анаэробов.

Для создания анаэробных условий тоже используется метод Хеннеля (часовых стеклышек).

 

 

               

Рис. 19. Анаэростаты.