Спектрофотометрия. Спектрофотометрическое определение содержания веществ.

 

         Оптические методы анализа применяются в анализе многочисленных лекарственных препаратов и субстанций. Исследование сравнительно простых по составу систем выполняют прямой спектрофотометрией. В случае невозможности ее применения по ряду причин (неизвестный состав, высокая концентрация) определение проводят методом дифференциальной спектрофотометрии. Этот метод характеризуется высшей точностью. Расширенными концентрационными границами (анализ субстанций с содержанием около 100 %), высокой селективностью. Дифференциальная спектрофотометрия нашла широкое применение в анализе многих двохкомпонентных смесей лекарственных средств: кофеин и аспирин, кофеин и амидопирин, кофеин и фенацетин, теобромил и барбамин, теофилин и барбамин, папаверина гидрохлорид и кислота никотиновая, и т.п.

         Современные лекарственные средства большей частью являются многокомпонентными. Спектрофотометрический анализ таких средств невозможен в случае наложения спектров поглощения нескольких компонентов. На помощь провизору-аналитику приходит многоволновая спектрофотометрия, которая дает возможность провести определение двух-трех компонентов с одной навески препарата. Теоретической базой многоволновой спектрофотометрии является адитивность «парциальных» оптических плотностей компонентов в случае отсутствия химического взаимодействия между ними. Этот метод, как разновидность, спектрофотометрии – фармакопейный.

         Фотометрическое титрование объединяет в себе преимущества титриметрии (точность) и возможность фотометрии (селективность). Главным преимуществом метода фотометрического титрования является возможность анализа слабо окрашенных и разбавленных растворов, которые часто невозможно оттитровать другими методами, а также возможность автоматизации собственно процесса титрования.

         Флуориметрия – высокочувствительный фармакопейный метод количественного анализа. Он широко применяется при контроле качества фолиевой кислоты, этакридина лактата, хинина гидрохлорида, натрий n–аминосалицилата, хлортетрациклина гидрохлорида, резернина, тиамина хлорида и бромида, рибофлавина. Много катионов металлов можно определить после переведения их в хелатные комплексные соединения с разными органическими соединениями – 8–оксихинолином, 2,2¢-дигидроксиазобензолом, дибензоилме-таном и др. Флуориметрично определяют содержание катионов Магния в биологических жидкостях после переведения катионов Магния в комплекс с 8–оксихинолином. В отдельных случаях анализа сложных смесей объединяют экстракцию с флуориметрическим определением – эктракционно-флуориметрический анализ. В флуориметрическом титровании применяют флуориметрические индикаторы (органические вещества, которые при возбуждении излучением длины волны изменяют флуоресценцию в точке эквивалентности или ококло нее), они часто имеют узкий интервал перехода окраски флуоренценции, что повышает точность титриметрического анализа.

 

Классификация оптических методов анализа.

         В оптических методах анализа используется связь между оптическими свойствами системы:

–         светопоглощением;

–         светорассеянием;

–         преломлением света;

–         обращением плоскости поляризации плоскополяризованного света;

–         вторичным свечением вещества и его составом.

         К оптическому диапазону относят электромагнитные волны с длиной (l) от 100 до 10000 нм. Его разделяют на три области:

–         ультрафиолетовую (УФ) – (100-380-400);

–         видимую – (380-400-760);

–         инфракрасную (ИК) – (760-10000).

         В зависимости от природы взаимодействия вещества с электромагнитным излучением оптические методы анализа разделяют на:

–         абсорбционные (основаны на измерении поглощения веществом                        светового излучения). К ним принадлежат следующие методы:

         1) калоролиметрия;

         2) фотоколорометрия;

         3) спектрофотометрия;

         4) атомно-абсорбционный анализ;

–         эмиссионные (основаны на измерении интенсивности света, излучаемого веществом). К ним принадлежат следующие методы:

         1) эмиссионный спектральный анализ;

         2) пламенная эмиссионная фотометрия;

         3) флуориметрия.

         Методы, связанные со взаимодействием светового излучения с суспензиями, делятся на:

–         турбидиметрию (основана на измерении интенсивности света, которое поглощается неокрашенной суспензией);

–         нефелометрия (базируется на измерении интенсивности света, которое отражается или рассеивается окрашенной или неокрашенной суспензией).

         Методы, которые базируются на явлении поляризации молекул под действием светового излучения, делят на:

–         рефрактометрию (базируется на измерении показателя преломления);

–         поляриметрию (базируется на измерении угла обращения плоскости поляризации поляризованного пучка света, который прошел через оптически активную среду);

–         интерферонометрию (базируется на измерении сдвига интерференции световых лучей при прохождении их сквозь кюветы с раствором вещества, растворителя и сквозь коллиматор).

         Главные характеристики электромагнитного излучения:

         Поскольку свет имеет двойственную природу – волновую и корпускулярную, то для его описания используют два вида характеристик – волновые и квантовые.

         К волновым характеристикам принадлежат частота колебаний, длина волны и волновое число, к квантовым – энергия квантов.

         Частота колебаний (n) показывает число колебаний в 1 с, измеряется в Герцах (Гц).

         Длина волны (l) показывает наименьшее расстояние между точками, которые колеблются в одинаковой фазе. Это линейная единица, измеряется в СИ в метрах (м) и его частичных единицах см, мм, нм.

Например, зеленый свет представляет собой электромагнитные колебания с n=6*10¹⁴ Гц и l=500-550 нм.

 

В зависимости от длины волны в электромагнитном спектре обычно выделяют следующие участки:

Интервал длин волн (нм)	Участок спектра
10-4 – 10-1	g – излучение
10-2 – 10	Рентгеновское излучение
10 – 400	УФ – излучение
400 – 760	Видимый участок
760 – 106	ИК – излучение
106 – 109	Микроволны или сверхвысокие частоты
l > 109	Радиоволны

 

Длина волны и частота связаны между собой соотношением:

n = с / l,

где с – скорость света в вакууме с=3*10⁸м/с=3*10¹⁰см/с.

         Величину, обратную длине волны, называют волновым числом n и выражают обычно в обратных сантиметрах (см^-1).

         Энергия электромагнитного излучения определяется соотношением:

E=hn,

где h – постоянная Планка, h=6,62*10^-34Дж*с.

 

         При нагревании вещества, находящегося в газообразном или парообразном состоянии, от 800-1000 ⁰С и выше могут быть получены спектры трех видов:

1)                Линейчатые – это результат электронных переходов в середине атомов и ионов;

2)                Полосатые – характерные для молекул или свободных радикалов и есть следствием изменения их электронной, колебательной (вибрационной) и вращательной (ротационной) энергии;

3)                Сплошные спектры – имеют сложное происхождение.

 

 

Многоволновая спектрофотометрия.

         Оптическая плотность любой системы, содержащей ограниченное число окрашенных компонентов, которые химически один со вторым не взаимодействуют, равновесие сумме оптических плотностей компонентов смеси при этой же длине волны:

причем любая из “парциальных” оптических плотностей равна:

где – молярный коэффициент светопоглощения вещества і при длине волны l;

l – толщина светопоглощающего слоя, см;

С_і -концентрация поглощающего вещества, моль/л.

Если система содержит окрашенных веществ, то проводятнезависимых измерений оптической плотности приразных длинах волн l₁, l₂, …l_n… В результате получают систему линейных уравнений:

         Значения  определяют в процессе анализа, значения  находят предварительно, а толщина слоя l постоянная и равна длине кюветы.

         В многокомпонентном спектрофотометрическом анализе, как и конечно, измерение оптических плотностей следует проводить относительно раствора сравнения, содержащего все использованные реагенты. Это делается для уменьшения систематических ошибок, обусловленных наличием примесей в самих реагентах.

 

Спектрофотометрический анализ двохкомпонентных систем.

Наиболее часто приходится иметь анализ двохкомпонентных ситем. При этом возможны варианты анализа.

1.                            Кривые  светопоглощения обоих веществ перекрываются по всему спектру, но есть разделенные максимумы поглощения.

Кривые поглощения 1 и 2 для растворов двух чистых веществ с концентрациями С₁ и С₂. Максимумы проглощения соответствуют длинам волн l₁ и l₂. Если в этих же условиях приготовить раствор смеси этих веществ, то он даст кривую светопоглощения 3. При каждой длине волны l любая точка кривой 3 определяется суммой оптических плотностей первого и второго вещества. Суммарная отическая плотность при длинах волн l₁ и l₂:

Значение молярных коэффициентов светопоглощения либо берут из таблиц, либо (чаще) определяют экспериментально следующим образом. Готовят стандартный раствор чистого вещества (1) и отдельно стандартный раствор чистого вещества (2) с известной концентрацией. Измеряют оптические плотности обоих растворов при двух длинах волн соответственно l₁ и l₂. Получают оптические плотности

,                                         ;

,                                        ;

,                                          ;

 ,                              .

 

где,  – молярные коэффициенты поглощения вещества 1 и 2 при l₁ и l₂ соответственно;

С₁ и С₂ – концентрации веществ 1 и 2;

l – толщина слоя.

         За полученными значениями А и С, l можно рассчитать и рассчитывают значение молярных коэффициентов поглощения. Подставляют эти значения в уравнения суммарных оптических плотностей:

При толщине слоя l = 1 см будем иметь:

Решение этой системы дает

           

         Чтобы относительная ошибка DС/С была меньше, значение должны лежать в интервале 0,3-1,  а отношения  должны быть максимальными.

2.                            Кривые светопоглощения обоих веществ перекрываются, но есть участок спектра, где светопоглощением одного из веществ можно пренебречь.      В данном случае при длине волны l₁ по измеренной оптической плотности А обычным способом рассчитывают концентрацию первого вещества:

Концентрацию второго вещества находят, зная С₁

3.                            В спектре поглощения раствора есть участки, в одной из которых поглощает только первое вещество, а во второй – только второе.

         В таких наиболее благоприятных условиях для анализа определения проводят независимо для каждого компонента по уравнению:

 (при длине волны l₁);

 (при длине волны l₂).

         Для фотометрического определения смеси веществ описанным выше способом необходимо применение спектрофотометра, хотя в отдельных случаях можно пользоваться фотометрами, которые оборудованы светофильтрами с узкими полосами пропускания.

         В практическом отношении наибольший интерес представляет второй случай анализа двохкомпонентных систем, то есть тот случай, когда удобно найти такой участок спектра, в котором поглощением одного из компонентов можно пренебречь. В таких случаях наиболее удобным для аналитических лабораторий является метод градуировочных кривых.

         Суть метода станет понятной при рассмотрении примера определение калия перманганата и калия бихромата при совместном присутствии в кислом растворе. Кривые поглощения раствора каждого из этих веществ, получены с помощью спектрофотометра.

         При длине волны l₁ = 570 нм раствор калия бихромата не поглощает. Поэтому хотя при этом и происходит некоторая потеря чувствительности, определение KМnO₄ в присутствии K₂Cr₂O₇ лучше вести при этой длине волны. Определение калия бихромата лучше проводить при l₂ = 380 нм, так как при этой длине волны наименьшим является влияние поглощения калия перманганата.

        

         При l₂ = 380 нм для правильного определения K₂Cr₂O₇ необходимо вводить поправку на поглощение калия перманганата, так как оно значительно и ним пренебречь нельзя. В таком случае поступают следующим образом: по серии стандартных растворов калия перманганата строят при l₁ = 570 нм градуировочный график. 

         Для этих же растворов при l₂ = 380 нм строят второй график. По серии стандартных растворов K₂Cr₂O₇ строят график 3 при l₂ = 380 нм.

При анализе смеси KМnO₄ и K₂Cr₂O₇ измеряют оптическую плотность при 570 нм и по графику 1 находят содержание KМnO₄. Потом по графику 2 находят оптическую плотность раствора KМnO₄ при l₂ = 380 нм с найденной концентрацией Т_KМnO4.

         Дальше измеряют оптическую плотность смеси KМnO₄ и K₂Cr₂O₇ при 380 нм. Рассчитывают разность

 .

         Зная поглощение или оптическую плотность лишь раствора K₂Cr₂O₇ рассчитывают по графику 3 содержание K₂Cr₂O₇ в исследуемой смеси.

         Метод градуировочного графика дает хорошие результаты не только при использовании спектрофотометров, но и колориметров с узкополосными светофильтрами.

 

Экстракционно-фотометрический анализ.

         Экстракционно-фотометрический анализ базируется на соединении экстракции определяемого вещества и последующего его фотометрического определения. Этот метод применяется:

1.                При анализе сложных смесей;

2.                Когда необходимо определить маленькие количества одних веществ в присутствии больших количеств других;

3.                При определении примесей в присутствии основных компонентов;

4.                Когда непосредствено определение исследуемого элемента в смеси есть невозможным (полное перекрывание кривых поглощения).

         При экстракции маленьких количеств примесей происходит не только их выделение, но и концентрирование. Поэтому экстракционно-фотометрический метод приобретает особо важное значение в связи с определением маленьких количеств примесей в веществах высокой степени чистоты, которые широко применяются в атомной и полупроводниковой технике.

         Экстракционно-фотометрические методы анализа являются высокочувствитель-ными методами.

         Наиболее часто применяется экстракция разнолигандных комплексов, они применяются для определения не только ионов металлов-комплексообразователей, но и анионов-реагентов (лигандов). Разнообразие при образовании смешанных комплексов, которые экстрагируются, значительно расширяет возможности в повышении чувствительности и селективности экстракционно-фотометрических методов анализа.

         Молекулы многих используемых в аналитической практике органических аналитических реагентов имеют в своем составе свободные сульфогруппы, вследствие чего и сами реагенты и образованные ними хелаты растворимы в воде. Такие реагенты (например, ализарин С, арсеназо, торон и др.) образуют в водных растворах анионные комплексы. Анионные комплексы с ионами металлов экстрагируются в виде ионных ассоциатов с большими органическими катионами, которыми могут быть катионы тетрафениларсония, дифенилгуанидиния, бензилтиурония и др. Анионные комплексы часто бывают координационно ненасыщенными, поэтому они лучше экстрагируются координационно-активными растворителями (спиртами), особенно в присутствии анионных добавок (CCl₃COO^–, ClО₄^– и др.), которые оказывают содействие координационной насыщенности. По такому типу экстрагируют U^IV,VI, Th^IV, РЗЭ и др. элементы.

         Много ионов тежелых металлов способны образовывать анионные ацидокомплексы MXn^– (где X – электроотрицательный лиганд SCN^–, Cl^–, Br^–, I^– и др.). Поскольку такие комплексы практически бесцветны, то их экстракцию для последующего фотометрического определения выполняют в присутствии крупных катионов основных красителей, таких как метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый, родамины, метиленовый голубой, сафранины, тиазины и др.

         Некоторые органические реагенты, такие как, о-фенантролин, дипиридил и др., способны связывать ионы металлов в катионные хелаты. С крупными гидрофобными анионами эти катионные комплексы образуют ионные пары, склонные экстрагироваться. Таким анионами могут быть анионы арилсульфокислот (например, 2–нафталинсульфокислота), тетрафенилбората и кислотных красителей (например, метиловый оранжевый) и др. В случае образования координационно-насыщенных комплексов используются координационно-активные растворители, или экстракцию проводят в присутствии хлоридов, бромидов, перхлоратов и других анионов, которые компенсируют избыточные заряды в частичке катионного комплекса.

         По такому типу экстрагируют Au^III, Bi^III, Fe^III, Sb^V и прочие.

         Возможные два типа цветных экстракционных реакций:

1.                            Реакции с образованием ассоциатов, которые состоят из ион металла, который владеет хромофорным действием (Сr^III, Co^III, Cu^II и др.), реагента (о-фенантролин, пиридин, хинолин) с анионными добавками (SCN^–, Cl^–, Br^–, ClО₄^–);

2.                            Реакции с образованием ассоциатов, которые состоят из иона-металла с недостаточным хромофорным действием (Ag^I, Cd^II и т.д.), окрашенного реагента (эозин, метиловый оранжевый) и аниона реагента (тиурам, пиридин и т.д.).

         В фарманализе экстракционно-фотометрический метод применяется для:

1.                             Определения примесей в субстанциях и лекарственных средствах на их основе (салициловая кислота в ацетилсалициловой кислоте);

2.                             Определения биологически-активных веществ в препаратах растительного происхождения (сердечные гликозиды, алкалоиды).

 

Дифференциальная спектрофотометрия.

         Колориметрическое и спектрофотометрическое определение обычно дает хорошие результаты при определении маленьких концентраций окрашенных веществ в растворе. Часто при анализе приходится применять фотометрию при высоком содержании исследуемых веществ. Обычно эти определения выполняют продолжительными во времени анализами весовыми или объемными методами, которые часто требуют предварительного отделения определяемого компонента от большинства сопутствующих элементов.

         К применению более быстрых фотометрических определений есть одно препятствие: возрастание оптической плотности с увеличением концентрации окрашенного соединения. Как уже указывалось, измерение оптических плотностей больше 0,8 проводит к большим ошибкам, что в конечном варианте приводит к большим ошибкам в определении содержания веществ. Наиболее простым средством уменьшения величины оптической плотности является разведение раствора в необходимых границах. Однако при больших разведениях возникают ошибки, связанные с измерением объемов, которые сводят на нулю точность определения при фотометрировании. Более разбавленный раствор можно приготовить также взятием меньшей навески; точность в данном случае обусловлена только чувствительностью применяемых весов.

 

Дифференциальный метод применяют для:

–                                 повышения воспроизводимости результатов анализа при определении больших количеств вещества;

–                                 для устранения постороннего мешающего влияния других компонентов и исключения поглощения реактива.

         Суть метода состоит в том, что: оптические плотности исследуемого и стандартного окрашенных растворов измеряются не по отношению к чистому растворителю с нулевым поглощением, а по отношению к окрашенному раствору определяемого элемента с концентрацией С₀, близкой к концентрации исследуемого раствора.

Дифференциальный метод в зависимости от способов измерения относительной оптической плотности исследуемого раствора и расчета его концентрации может иметь несколько вариантов.

 

 

                                                                                            

Н2О

Сх

Ссompari

Сх

 

 

 

    І₀                  І_х                   І_comparis         І_х      

 

          Обычная             дифференциальная

спектрофотометрия     спектрофотометрия

Отношение интенсивностей  называется условным коэффициентом пропускания.

Отношение І_срав. к І_о характеризует пропускание раствора сравнение

Отношение І_х к І_о характеризует пропускание раствора пробы

Тогда относительный коэффициент пропускания

Или если записать для оптической плотности

Таким образом, прямая  не проходит через начало координат.

                                                                 

Градуировочный график дифференциальной спектрофотометрии.

 

                                                                 

 

 

 

 

 

 

 

         Пусть анализируемый раствор имеет оптическую плотность А = 4,0, который в обычной фотометрии измерять невозможно. Но и взяв в качестве растворителя раствор с А_срав.=3,0 получаем относительную оптическую плотность А_{х относ.} = А_х – А_срав. = 4,0-3,0 = 1,0, что уже возможно измерять с необходимой точностью.

         Наиболее часто применяют вариант, в котором концентрация раствора сравнения меньше концентрации исследуемого раствора (С_о < С_х).

         Вымеренная экспериментально относительная оптическая плотность А^¢ представляет собой разность оптических плотностей фотометрованного раствора и раствора сравнения:

А_{х относ.} = А_х – А_срав. = e(С_x – C_o)×l

А^¢_{ст относ.} = А_ст – А_срав. =  e(С_ст – C_o)×l.

Концентрацию исследуемого раствора определяют либо с помощью: 1) градуировочного графика, либо 2) расчетным способом.

А

1) Для построения кривой в области возможных концентраций исследуемого раствора готовят серию стандартных растворов с концентрациями С₁, С₂, …С_i, …С_n (C_n>C_i…>C₂>C₁) и измеряют их оптические плотности по отношению к окрашенному раст-вору сравнения с концентрацией С_срав.. По полученным данным строят градуировочную кривую, принимая за начало отсчета концентрацию раствора сравнение С_о.

2) При расчетном способе определения концентрации исследуемого раствора учитывают, что отношение значений относительных оптических плотностей исследуемого и стандартного растворов соответствует отношению разности между концентрациями этих растворов и раствора сравнения, то есть

или

         Отношение разности концентраций стандартного раствора и раствора сравнения к относительной оптической плотности стандартного раствора (С_ст-С_о)/А_{ст. относ.} (обратный угловой коэффициент градуировочного графика) называют фактором перерасчета F. В одной серии измерений для определенного интервала концентраций исследуемого раствора F остается постоянной величиной.

         Преимущества дифференциальной спектрофотометрии:

1)                значительное расширение границ определяемых содержаний в высоких концентрациях;

2)                относительная ошибка 0,05-2 %, что значительно ниже, чем в обычной фотометрии (повышение точности).

         Дифференциальный метод может применяться тогда, когда будет обеспечено прохождение через сильно окрашенный раствор достаточно мощного монохроматического луча света.

         Наиболее точные – определения, которые проводятся на СФ, но во многих случаях для дифференциальной фотометрии могут быть использованы фотоэлектроколориметры.

 

Фотометрическое титрование.

         Оптические методы могут служить не только для непосредственного определения концентрации вещества, но и для определения точки эквивалентности в процессе титрования при условии, что существует линейная зависимость между светопоглощением и концентрацией вещества в исследуемом растворе.

         Аликвотную часть анализируемого раствора помещают в кювету, через которую проходит монохроматический луч света, который потом попадает на фотоэлемент, и приступают к титрованию. В процессе титрования отмечают значение оптической плотности.

         На основе результатов титрования строят кривую спектрофотометрического титрования, откладывая по оси ординат значение оптической плотности А, а на оси абсцисс – объем раствора титранта (в мл).

         Точку эквивалентности находят путем экстраполяции, используя такие участки кривой титрования, которые соответствуют избытку либо определяемого вещества, либо титранта. С этой целью в процессе титрования проводят измерения в моменты, достаточно отдаленные от точки эквивалентности, тогда когда реакция проходит еще количественно, и, проводя через соответствующие им точки прямые, графически находят точку эквивалентности. Если реакция проходит количественно, кривая титрования имеет вид двух прямых, которые пересекаются в точке эквивалентности.

         Объем титранта, который пошел на титрования до т.э. можно рассчитать, решив систему уравнений:

(1) – уравнение прямого изменения оптической плотности от V_титр. до т.э., а (2) – соответственно после т.э.

.

Этот метод расчета эквивалентного объема может применяться для всех случаев линейных титрований: амперометрического, кондуктометрического и др.

Метод СФ титрования имеет ряд преимуществ над визуальными методами:

1.                Высшая селективность и разрешает проводить последовательное определение нескольких компонентов пробы;

2.                Возможность титрования окрашенных растворов;

3.                Определение низких концентраций веществ (абсолютные количества веществ, определяемые этим методом, лежат в границах 1·10^-1 – 1·10^-8 г);

4.                Возможность использования реакций, которые не заканчиваются в т.э. (образование малоустойчивых комплексных соединений, нейтрализация слабых кислот и оснований и т.д.).

В методе СФ титрования применяют реакции:

–                     кислотно-основные;

–                     комплексообразования;

–                     окислительно-восстановительные.

Кривые СФ титрования могут быть разной формы. Характер их зависит от того, какие компоненты реакции поглощают при выбранной длине волны.

В общем случае ход кривой титрования до и после т.э. зависит от значения De:

,

реакция                      А      +        В ®        АВ

                          опред. в-во      титр.        продукт

e_АВ, e_В, e_А – молярные коэффициенты светопоглощения продукта реакции, титранта и определяемого вещества соответственно.

1’

         В качестве примера рассмотрим некоторые, которые наиболее частое встречаются в случае СФ титрование.

А

                                                        1 – поглощает исходное вещество (А)                                          

1

                                                                 

Vтитр.

                                                                  l = 350 нм

                                                                  1′ – поглощает продукт реакции (АВ).

2

А

                                                                  Fe²⁺ + Co³⁺ = Co²⁺ + Fe³⁺

                                                                  поглощение при l = 360 нм

 

Vтитр.

                                                                  2 – As^III + Ce^IV = As^V + Ce³⁺

4

                                                                  поглощает титрант l_Ce4+ = 320 нм

		5

 

 

 

 

 

А

                                                      3 – поглощает продукт (АВ) и титрант (В).

                                                      продукт поглощает больше чем титрант

                                                      4 – поглощает продукт (АВ) и титрант (В).

Vтитр.

                                                      но продукт поглощает меньше чем титрант

 

 

                                                      5 – поглощает определяемое вещество (А) и           

                                                      титрант (В).

 

 

                                                     6, 6’ – поглощают все три компонента

         Светопоглощение до т.э. определяется соотношением e_А и e_АВ, если образуется продукт, который имеет e_АВ > e_А, то кривая имеет наклон вверх 6’; если ж образуется продукт, который имеет e_АВ < e_А, то кривая имеет наклон вниз 6. При раздельном титровании смеси кривая будет иметь несколько изломов, число которых отвечает числу компонентов в смеси.

         СФ титрование может применяться и тогда, когда титрант, определяемое вещество и продукт не поглощают свет. Тогда используют индикаторы. В их роли выступают вещества, которые сами не поглощают, а образуют соединения с определяемым веществом (АInd), титрантом (ВInd) или продуктом реакции (АВInd), которые поглощают свет.

         Например, комплексонометрическое определение Fe³⁺.

А

                                                 

 

 

                                                      

Fe³⁺ + Salyc. + H⁺ = красное окрашивание (поглощается зеленое) поглощения = 525 нм

Fe³⁺Salyc. + Na₂H₂Y = FeY^– + 2NaSalyc. + 2H⁺

 

         В качестве индикаторов используют также вещества, которые в т.э. изменяют свою структуру (вследствие изменения рН, окислительно-восстановительного потенциала системы или концентрации ионов), что сопровождается резким изменением светопоглощения раствора. Например, при титровании по методу нейтрализации с кислотно-основным индикатором в т.э. содержание определенной формы индикатора резко увеличивается. При дальнейшем добавлении титранта светопоглощение не изменяется.

 

 

 

 

 

         Разбавление анализируемого раствора в процессе титрования изменяет формы кривых титрования. Для уменьшения влияния разбавления на светопоглощение применяют концентрированные растворы титрантов. При титровании разбавленными растворами необходимо умножить результат каждого измерения на величину:

, где V₀ – объем анализируемого раствора, мл; V_титр. – объем добавленного титранта, мл.

А_испр. = А_измер.*

 

 

Определение содержания суммы флавоноидов в настойках боярышника, календулы, пустырника.

         Аликвоту настойки (7,0 мл настойки боярышника или 0,5 мл настойки календулы, или 2,0 мл настойки пустырника) помещают в мерную колбу вместительностью 25,0 мл, прибавляют 10 мл 70% раствора спирта, 2 мл 5% спиртового раствора алюминий хлорида и нагревают на кипящей водной бане до кипения. Полученный раствор охлаждают, прибавляют к нему 0,1 мл ледяной ацетатной кислоты, доводят объем раствора 70% спиртом до метки и перемешивают.

         Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения раствор, который содержит аликвоту настойки, 10 мл 70% раствора спирта и обработанный аналогично исследуемому, начиная со слов: “… и нагревают на кипящей водной бане …”.

         По результатам измерений рассчитывают содержание суммы флавоноидов в перерасчете на рутин в %, учитывая, что удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминий хлоридом при 408 нм составляет 218.

         В настойке боярышника содержание суммы флавоноидов должен быть не меньше 0,005%, календулы – 0,07%, пустырника – 0,04%.

Количественное определение флавоноидов пустырника сизого

         Пустырник сизый (Leonurus glaucescens Bunge) – многолетнее травянистое растение рода Пустырник семейства Яснотковые с четырехгранным ветвящимся стеблем, достигающее 1,5 м в высоту. Растения этого рода широко применяются в народной медицине многих стран как сердечное и противокашлевое средство. Настой и настойка травы замедляют ритм сердца, увеличивают силу сердечных сокращений, снижают кровяное давление. Установлено, что препараты пустырника действуют успокаивающе на центральную нервную систему, причем сильнее настойки валерианы в 3-4 раза. Эти фармакологические свойства растения связывают с наличием в нем комплекса флавоноидных соединений.

         Цель настоящего исследования –количественное определение суммы флавоноидов в траве пустырника сизого.

         Экспериментальная часть

         Исследовалась надземная часть пустырника сизого, собранного в период цветения в Толебийском районе Южно-Казахстанской области в 2002-2005 гг.

         Содержание суммы флавоноидов в траве пустырника определяли фотоколориметрическим способом.  Из измельченного сырья (аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито (ТУ 23.2.2068-89) с диаметром отверстий 1 мм) брали навеску около 1,0 г (точная навеска), помещали в пакет из фильтровальной бумаги и обрабатывали хлороформом в аппарате Соксклета в течение 14 часов до обесцвечивания (20 сливов). Пакет высушивали на воздухе до исчезновения запаха хлороформа. Навеску количественно переносили в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл 70 % спирта и нагревали 30 мин на кипящей водяной бане с открытым холодильником. Извлечения отфильтровывали в колбу вместимостью 50 мл, избегая попадания частиц сырья на фильтр. Экстракцию повторяли дважды порциями по 10 мл спирта. Полученные извлечения объединяли, упаривали на водяной бане при температуре 70^ОС под вакуумом до объема 6-7 мл, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора 96 % спиртом до метки и перемешивали (раствор А).

         В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл 0,5 % раствора стрептоцида в 10% растворе кислоты серной, прибавляли 2 мл 0,2 % раствора натрия нитрита, взбалтывали 2 минуты, прибавляли 1 мл раствора А и 1 мл 10% раствора натра едкого, взбалтывали 1 минуту и доводили объем раствора до метки (раствор Б). Через 15 минут измеряли оптическую плотность раствора Б на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 432 нм. В качестве раствора сравнения использовали раствор А, разбавленный 96 % спиртом без добавления реактивов.

         По калибровочному графику находили концентрацию рутина в мг/мл.

         Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

                                         

                                             С ∙ 10 ∙25 ∙100∙100

                               х  =      ————————       

                                               m ∙ 1000 (100 – W)

 

 

         где С – содержание рутина в колориметрируемом растворе, найденное по калибровочному графику,  мг;

m – масса сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.

         Построение калибровочного графика. Около 0,1 г  (точная навеска) РСО рутина (ФС 42-2508-87) в пересчете на сухое вещество помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 70% спирте и доводили объем раствора 70 % спиртом до метки. Из исходного раствора готовили ряд разведений концентраций рутина от 0,02 до 0,08 мг/мл.

         Далее поступали согласно методике, приведенной выше. По результатам измерения оптической плотности растворов строили калибровочный график, откладывая по оси абсцисс концентрацию рутина в мг/мл, по оси ординат – оптическую плотность раствора.

         Определение влажности травы пустырника.

Масса пустого бюкса            –  25,44870

Масса бюкса с травой           –  26,11775

Масса после высушивания   – 26,06155

 

26,11775 – 25,44870 = 0,66905                    0,66905  –  100 %

26,11775 – 26,06155 = 0,05620                    0,05620  –   х

 

                                         0,05620 ∙  100

                       х      =      ———————   =     8,3 %    

                                               0,66905

 

         Определение количественного содержания рутина в сырье.  Для проведения анализа взяли навеску (1,0001 г)  измельченного сырья. Навеска стандартного образца рутина составила 0,10265 г,  по построенному калибровочному графику определили, что оптической плотности Д равной 0,4 соответствует концентрация 0,03 мг\мл  рутина.

         Как показал анализ полученных данных, содержание флавоноидов в исследуемом сырье колеблется от 0,75 до 0,8 %.

 1.     Разработана методика количественного определения в траве пустырника сизого суммы флавоноидов в пересчете на рутин фотоколориметрическим методом.

2.     Установлено, что содержание суммы флавоноидов находится в пределах  0,75 – 0,8 %.

 

Методологические подходы к использованию спектрофотометрии в анализе лекарственного растительного сырья

         При работе с лекарственным растительным сырьем (ЛРС) широко применяется метод спектрофотометрии. Он используется для количественного определения флавоноидов, антраценпроизводных, сапонинов, алкалоидов и других групп биологически активных веществ (БАВ). Экстракты из растительного сырья являются многокомпонентными системами, и работа с ними имеет определенные особенности, которые необходимо учитывать.

         Так ранее нами была показана экстремальная зависимость эффективности экстракции флавоноидов от рН среды. На рис. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая выход флавоноидов из растительного сырья в настои, приготовленные с использованием буферных растворов с различными значениями рН. На модельных опытах и при работе с образцами ЛРС было показано, что максимальная экстракция флавоноидов, различных по структуре, проходила при различных значениях рН. Другой серьезной проблемой является необходимость использования редких или дорогостоящих стандартных образцов.

Рис. 1. Зависимость эффективности экстракции флавоноидов от рН

 

         На примере количественного определения флавоноидов и тритерпеновых сапонинов рассмотреть некоторые проблемные вопросы, возникающие при спектрофотометрическом анализе растительного сырья, и выработать общие закономерности, которые могут использоваться при разработке спектрофотометрических методик определения.

         Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках ромашки аптечной согласно фармакопейной статье предприятия одной из фирм предполагает спектрофотометрию окрашенного комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия. При этом в реакционную смесь для подавления собственной диссоциации флавоноидов предлагается добавлять уксусную кислоту, а оптическую плотность замерять при длине волны 415 нм. Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в цветках ромашки должно быть не менее 1,5 %. Результаты, полученные по методике нормативной документации, оказались ниже предельно допустимого уровня в трех сериях сырья ромашки. Также в ходе исследований было установлено, что государственный стандартный образец рутина, имеющий паспорт, при этих условиях имеет максимум поглощения при длине волны 409 нм (рис. 2).

Таблица 1

Содержание суммы флавоноидов в цветках ромашки аптечной

Рис. 2. Абсорбционный спектр комплекса рутина с алюминия хлоридом

 

         Спектры, полученные из образцов цветков ромашки разных производственных серий, имели максимумы поглощения при различных длинах волн. Это может быть обусловлено преобладанием в определяемой сумме флавоноидов каждой серии сырья различных флавоноидов. Также сырье может различаться по содержанию органических кислот, в связи с чем рН извлечений будет разным и может служить причиной сдвига максимума поглощения.

         Как показывают экспериментальные данные, анализ с использованием длины волны 415 нм дает либо заниженные результаты по показателю «содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин», либо результаты на нижней границе нормы. Таким образом, во избежание ошибок необходимо каждый раз снимать спектр поглощения в определенном интервале длин волн и уточнять аналитическую длину волны конкретного образца сырья.

         Данную проблему можно решить путем использования удельного показателя поглощения, численно равного оптической плотности 1 % раствора при длине кюветы 1 см. В этом случае при анализе не требуется наличие стандарта.

         Другой пример — определение суммы сапонинов в сырье синюхи голубой. Количественное определение суммы сапонинов в действующей нормативной документации на корневища с корнями синюхи проводится с использованием стандартного образца β-эсцина и основано на определении оптической плотности окрашенных продуктов взаимодействия сапонинов с концентрированной серной кислотой при 381 нм. Было установлено, что при рекомендуемой длине волны максимум поглощения у β-эсцина крайне незначителен. При снятии полного спектра поглощения продуктов реакции β-эсцина с концентрированной серной кислотой был обнаружен выраженный максимум поглощения при 258 нм, длина волны 381 нм входила в состав «плеча» абсорбционного спектра.

         УФ-спектр поглощения спиртового образца β-эсцина имеет максимум поглощения при 216 нм. Имеющий место сдвиг максимумов поглощения объясняется происходящей деструкцией молекул веществ с образованием продуктов окисления и деградации, имеющих в своей основе новые хромофорные группировки, дающие полосы поглощения в более длинноволновой области спектра.

         В условиях фармакопейной методики были получены спектры поглощения спиртовых экстрактов растительного сырья синюхи (корневища с корнями и трава) и раствора β-эсцина после добавления концентрированной серной кислоты в интервале длин волн 200–500 нм. Анализ спектров показал, что наиболее интенсивный максимум поглощения наблюдается при длине волны 282 ± 2 нм, который и следует брать как аналитический, о чем свидетельствуют расчетные данные.

Рис. 3. Спектры поглощения продуктов реакции с кислотой серной спиртовых извлечений из корневищ с корнями синюхи (1), травы синюхи (2) и раствора β-эсцина

Таблица 2

Содержание суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на β-эсцин в сырье синюхи голубой

 

1.                 Разработка спектрофотометрической методики количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье должна начинаться с изучения обзорного спектра извлечения.

2.                 Полученные экспериментальные данные показали необходимость получения спектров в диапазоне длин волн даже при проведении серийного анализа.

3.                 В случае необходимости использования редких или дорогостоящих стандартных образцов целесообразным является проведение расчетов с использованием удельного показателя поглощения.

4.                 При наличии разницы между максимумом поглощения стандартного образца и анализируемой пробы более, чем на 2 нм, нужно брать реальный максимум. Использование реального максимума возможно, если интервал между максимумом дифференциальной кривой и длинноволновой полосой стандартного отклонения не превышает полуширины полосы поглощения стандартного образца.

 

Определение перманганата и бихромата при совместном присутствии

1.Изучения светопоглощения растворов КMnO₄ и К₂Cr₂O₇

         В две мерных колбы вместительностью 100 мл помещают – в одну 2,00 мл 0,01 моль/л раствора КMnO₄, а в другую 2,00 мл 0,01 моль/л раствора К₂Cr₂O₇. В обе колбы прибавляют по 20,0 мл нитратной кислоты (1:3) и водой доводят до метки. Растворы помещают у кюветы с толщиной пласта 1 см и измеряют оптическую плотность растворов поочередно в диапазоне длин волн 350 – 600 нм. В качестве раствора сравнения используют воду. Строят электронные спектры поглощения обеих растворов в координатах оптическая плотность – длина волны.

         За абсорбционными спектрами находят l₁ и l₂ при которых наблюдается максимальное светопоглощение соответственно для КMnO₄ и К₂Cr₂O₇, но так, чтобы в области l₁ поглощение раствора К₂Cr₂O₇ было близко к нулю.

2. Построение градуировачных графиков

         При избранных l₁ и l₂ строят градуировочные графики для КMnO₄. Отбирают по 2,0; 4,0; 5,0; 6,0; 8,0; 10,0 мл 0,01 моль/ раствора КMnO₄ в мерные колбы вместительностью 100 мл, прибавляют 20 мл нитратной кислоты (1:3) в каждую и разводят водой до метки. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны l₁ и l₂, применяя в качестве раствора сравнения воду.

При длине волны l₂ строят градуировачный график для раствора К₂Cr₂O₇. Отбирают 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл 0,01 моль/л раствора К₂Cr₂O₇ в мерные колбы вместительностью 100 мл, прибавляют 20 мл нитратной кислоты (1:3) в каждую и разводят водой до метки. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны l₂, применяя в качестве раствора сравнения воду.

3. Определение содержания калий перманганата и калий бихромата при совместном присутствии.

         К полученной задаче, которая содержит смесь КMnO₄ и К₂Cr₂O₇, прибавляют 20 мл нитратной кислоты (1:3) и разводят водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора при l₁ и l₂ : А_l1 и А_l2. По полученному значению А_l1 и градуировочному графику для раствора КMnO₄ при l₁ рассчитывают содержание калий перманганата (мл) в смеси и находят значения оптической плотности раствора перманганата при длине волны l₂ : . По полученному значению А_l2 смеси и найденным  находят оптическую плотность лишь раствора К₂Cr₂O₇:  По найденному значению   рассчитывают содержание калий бихромата в смеси (в мл).

 

Оптические свойства растворов окрашенных соединений.

         Молекулярно-абсорбционные методы базируются на измерении поглощения молекулами (или ионами) веществ электромагнитного излучения оптического диапазона. В зависимости от области оптического диапазона, ширины полосы измеренного излучения, способа измерения различают такие молекулярно-абсорбционные методы:

–         колориметрию – сравнение окраски анализируемого раствора и стандартного раствора происходит визуальным способом;

–         фотоколориметрия – измерение интенсивности светового потока, который прошел через раствор вещества (либо вещества в твердой или газовой фазе) фотоэлектрическим способом;

–         спектрофотометрию – измерение интенсивности монохроматического (определенной длины волны) светового потока, который прошел через раствор вещества, фотоэлектрическим способом;

         В зависимости от длины волны различают спектрофотометрию в УФ, видимой и ИК – области спектра.

         При прохождении пучка белого света с интенсивностью І₀ через стеклянный сосуд, заполненный раствором, происходит уменьшение интенсивности первоначального света, и свет, который выходит из сосуда, будет иметь интенсивность І, причем І < І₀.

         Это уменьшение частично связано с отражением на границах поверхностей воздух-стекло, стекло-раствор; частично с рассеиванием света (І_р), которое вызвано присутствующими в растворе зависшими частичками; но главным образом уменьшение света связано с поглощением его раствором (І_а). Таким образом, для описания прохождения света через раствор будет справедливым уравнение:

І₀ = І_а + І_отраж + І_р + І

         При сравнительном изучении поглощения света разными растворами пользуются одинаковыми кюветами, для которых интенсивность отраженной части светового потока является постоянной и маленькой, и ней можно пренебречь; при работе с истинными растворами достаточно чистых исходных веществ потеря света за счет рассеивания становится тоже незначительной. Поэтому уравнение можно записать в более простом виде:

І₀ = І + І_а.

         Интенсивность подающего светового потока и того, который выходит из кюветы, можно непосредственно измерить. Степень поглощения светового потока раствором неодинакова для световых потоков разных длин волн, которые составляют белый свет. В результате этого свет, которое выходит “из раствора” часто окрашен. Цвет раствора, который воспринимается глазом, обусловлен светом той части падающего потока света, которая прошел через раствор непоглощенным.

         Цвет света, который прошел через раствор, отличается от цвета его поглощенной части и называется дополняющим цветом (условным цветом вещества). Например, раствор, который поглощает желто-зеленую часть спектра (l = 560-570 нм) будет для наблюдателя окрашенный в фиолетовый цвет. Зависимость окраски раствора от поглощенной части светового спектра приведена в таблице.

Спектральный диапазон поглощенной части, нм	Цвет поглощенной части света	Условный цвет раствора (дополняющий цвет)
400-450	Фиолетовый	Желто-зеленый
450-480	Синий	Желтый
480-490	Зелено-синий	Оранжевый
490-500	Сине-зеленый	Красный
500-560	Зеленый	Пурпуровый
560-575	Желто-зеленый	Фиолетовый
575-590	Желтый	Синий
590-625	Оранжевый	Зелено-синий
625-750	Красный	Сине-зеленый

 

         Таким образом, первой характеристикой растворов веществ является их цвет, который связан с длиной волны поглощенной части светового потока. Длина волны поглощенного света для разных веществ отличается и зависит от их структуры. Это создает дополнительные возможности для их открытия.

Второй важной характеристикой растворов окрашенных веществ является количество поглощенного светового излучения, которое зависит от количества вещества в растворе. Если, например, каждая молекула вещества поглощает квант света, то количество поглощенных квантов зависит от количества молекул.

 

Основной закон фотометрии.

         Атом, ион или молекула, поглощая квант света, переходит в более высокое энергетическое состояние. Обычно это бывает переход из основного, невозбужденного уровня на один из более высоких уровней, чаще всего, на первый возбужденный. Вследствие поглощения излучения при прохождении его через слой вещества интенсивность излучения уменьшается и тем больше, чем выше концентрация светопоглощающего вещества.

         Закон Бугера-Ламберта-Бера связывает уменьшение интенсивности света, который прошел через слой светопоглощающего вещества, с концентрацией вещества и толщиной слоя.

         Чтобы учесть потери света на отражение и рассеивание, сравнивают интенсивности света, который прошел через исследуемый раствор и через растворитель.

         При одинаковой толщине слоя в кюветах из одинакового материала, в которых будет находиться один и тот же растворитель, потери на отражение и рассеивание света в обоих случаях будут приблизительно одинаковыми, и уменьшение интенсивности света будет зависеть только от концентрации вещества.

         Уменьшение интенсивности света, который прошел через раствор, характеризуется коэффициентом пропускания или просто пропусканием (трансмиссия) Т:

где І и І₀ – интенсивности света, который прошел через раствор и растворитель соответственно.

Взятый с обратным знаком десятичный логарифм Т называется оптической плотностью А (Д):

Уменьшение интенсивности света при прохождении его через раствор подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:

І = І₀ × 10^–elС,

І/І₀ = 10^–elС

или –lgТ = A = elC,

где e – молярный коэффициент поглощения;

l – толщина светопоглощающего слоя;

С – концентрация раствора.

         Оптическая плотность раствора при одинаковых условиях прямо пропорциональна концентрации вещества и толщине поглощающего слоя.

Физический смысл e становится понятным, если принять l = 1 см и С = 1 моль/л, тогда  А = e. Так, молярный коэффициент поглощения равен оптической плотности одномолярного раствора при толщине слоя 1 см.

         Молярный коэффициент поглощения еще называют молярным поглощением или экстинцией (e).

         Если выразить концентрацию раствора в процентах, то поглощение 1% раствора с толщиной слоя 1 см называют удельным поглощением или удельным показателем поглощения Е_1%.

         Оптическая плотность раствора, который содержит несколько окрашенных веществ, владеет свойством аддитивности, которое иногда называют законом аддитивности светопоглощения. В соответствии с этим законом поглощение света каким-нибудь веществом не зависит от присутствия в растворе других веществ. При наличии в растворе нескольких окрашенных веществ любое из них будет давать свою аддитивную составную в экспериментально определяемую оптическую плотность А:

А = А₁ + А₂ +…+А_k,

где А₁, А₂, … А_k – оптическая плотность вещества 1, 2, …k…

Учитывая, что A = e×lC, получаем

A = l(e₁c₁ + e₂c₂ + …e_kс_k).

         Молярный коэффициент поглощения не зависит от концентрации вещества при прохождении света данной длины волны. Величины молярного коэффициента поглощения различны для растворов разных соединений и могут колебаться в широких пределах: от единицы до сотни тысяч. Поэтому молярный коэффициент поглощения является мерой чувствительности колориметрических реакций. Чем больше величина молярного коэффициента поглощения, тем выше чувствительность колориметрического определения.

Например, молярный коэффициент поглощения растворов аммиаката меди равен 500, а дитизоната меди – 50000. При каких концентрациях меди реакциями с аммиаком и дитизоном можно получить одинаковые оптические плотности?

Оптическая плотность раствора аммиаката меди A = 500 × c₁× l;

а раствора дитизоната меди: A = 50000 × c₂× l.

Так, как по условию оптические плотности равны, то

500c₁l = 50000c₂l  Þ 500 c₁ = 5000c₂  Þ  c₁ = 100c₂

         То есть, для получения одинаковой оптической плотности в случае применения дитизона концентрация меди должна быть в 100 раз меньше, чем в случае использования аммиака. Иначе говоря, определение меди дитизоном является в 100 раз чувствительнее от определения меди аммиаком.

         Молярный коэффициент можно рассчитать по результатам измерения оптической плотности раствора данной концентрации:

Приведем примеры значений молярных коэффициентов отдельных окрашенных веществ.

Растворенное вещество	e
Роданид железа	103
Комплекс Ti с H2O2	103
Комплекс Ti с хромотроповой кислотой	105
Комплекс Cu с аммиаком	5 ×102
Комплекс Cu с дитизоном	5 ×104
Комплекс Al с алюминоном	1,7 ×104
Комплекс Al из стильбазо	3,5 ×104

        

В соответствии с основным законом светопоглощения

A = elC

        

         Зависимость оптической плотности от концентрации графически выражается прямой линией, которая выходит из начала координат. Опыт показывает, что линейная зависимость наблюдается не всегда. При практическом применении необходимо учитывать следующие причины возможного отклонения от основного закона:

1.                Закон справедливый только для монохроматического света. Чтобы отметить это, в уравнение вводят индекс l:

A = e_l×l×C.

Этот индекс l показывает, что величины А и l относятся к монохроматическому излучению с длиной l.

Если свет немонохроматический, возможны отклонения от основного закона.

2.                Пучок света должен быть параллельным.

3.                Температура при излучениях должна оставаться постоянной хотя бы в границах нескольких градусов.

4.                Коэффициент e в уравнении зависит от показателя преломления среды. Если концентрация раствора сравнительно небольшая, то его показатель преломления остается таким же, каким он был в чистом растворителе, и отклонений не наблюдается.

         При высоких концентрациях растворах показатель преломления становится функцией от концентрации раствора, что может обусловить отклонение от основного закона светопоглощения.

5. Еще одной причиной отклонения может быть непропорциональность силы тока            фотоэлемента и интенсивности светового потока

Кроме указанных физических причин отклонения от основного закона существуют химические причины:

         Уравнение основного закона справедливо только для систем, в которых светопоглощающими центрами являются частички только одного сорта. Если при изменении концентрации будет изменяться природа этих частичек вследствие, например, кислотно-основного взаимодействия, полимеризации, диссоциации и т.д., то зависимость A = f(C) не будет линейной, так как молярный коэффициент поглощения новообразовавшихся и исходных частичек в общем случае не будет одинаковым.

 

Например, при разбавлении раствора K₂Cr₂O₇ проходит не просто уменьшение концентрации иона Cr₂O₇^2-, а протекают химические процессы:

Cr₂O₇^2- + H₂O Û 2HCrО₄^– Û 2CrО₄^2- + 2H⁺.

         Так, вместо дихромат-ионов в растворе образуются гидрохромат – хромат-ионы. Так как,  и  разные, то зависимость оптической плотности от общей концентрации хрома в растворе не будет линейной.

Таким образом, химическими причинами отклонения от закона будут:

1) разбавление раствора (чем больше избыток реагента, тем меньше отклонение от закона);

2) рН среды: состояние иона металла, устойчивость комплексного иона

Cu²⁺ + 2NH₃  ® Cu(NH₃)²⁺

рН кислое: NH₃ + H⁺ ® NH₄⁺ ; рН щелочное Cu²⁺ + OH^– ® Cu(OH)⁺

оптимальное значение рН находят экспериментально

3) конкурирующие реакции на лиганд

4) конкурирующие реакции на комплексообразователь

Fe³⁺ + 6SCN^– ® Fe(SCN)₆^3-

Конкурирующая реакция: Fe³⁺ + 6F^– ® FeF₆^3-

5) реакции полимеризации, диссоциации

6) прохождение ox-red реакций:

Mn²⁺ + 4H₂O + 5e = MnO₄^– + 8H⁺ катализатор (NH₄)₂S₂O₈

 

Электронные спектры поглощения и их происхождение.

         Интерпретация электронных спектров может быть сделана на основе квантово-механических представлений, например, метода молекулярных орбиталей.

         В соответствии с основными положениями этого метода электроны в молекуле могут находиться на связывающих, несвязывающих и разрыхляющих орбиталях. Схема относительного размещения энергетических уровней, которые отвечают разным МО, показанная на рис. Разные электронные переходы требуют неодинаковой энергии, поэтому полосы поглощения размещаются при разных длинах волн.

         Наибольшей энергии требует s ® s* переход, связанный с возбуждением внутренних электронов. Он отвечает поглощению в далекой УФ-области [l £ 200 нм, Е ³ 600 кДж/моль]. Такие переходы характерные для метана, этана и других насыщенных углеводородов. Переход® s* связан уже с меньшими затратами энергии. Полосы, вызванные этим переходом, размещены в обычном (невакуумном) ультрафиолете (l = 200…300 нм). Еще меньше энергия требуется для перехода на разрыхляющих p*-орбиталей. Переходы® p* и p ® p* встречаются в молекулах соединений с сопряженными связями и молекулах ароматических соединений. Этим же переходом (n ® p*) можно объяснить, например, интенсивную окраску ионов MnО₄^2–, CrО₄^2– (переход с несвязывающей орбитали кислорода). Теоретический расчет энергии разных МО громоздкий и связан с большой трудностью, поэтому существенное значение имеют разные эмпирические закономерности, которые связывают спектр поглощения со строением и свойствами молекул вещества.

         Так, свет поглощается раствором выборочно (селективно): при некоторых длинах волн светопоглощение происходит интенсивно, а при некоторых свет не поглощается. Интенсивно поглощаются кванты света, энергия которых hn равна энергии возбуждения частички и вероятность их поглощения больше нуля. Молярный коэффициент поглощения при этих частотах (или длинах волн) достигает больших значений.

         Распределение по частотам (или длинах волн) значений молярного коэффициента поглощения называется спектром поглощения.

         Обычно спектр поглощения изображают в виде графической зависимости оптической плотности А или молекулярного коэффициента поглощения e от частоты n или длины волны l падающего света. Вместо А или e нередко откладывают их логарифмы.

         Кривые в координатах lg A – l показаны на рис. При изменении концентрации или толщины слоя перемещаются по оси ординат вверх или вниз параллельно самим себе, тогда как кривые в координатах A – l, этим свойством не владеют.

         Таким образом, при изучении спектров наиболее существенное значение имеют следующие характеристики спектров:

–                   число максимумов или полос поглощения

–                   положение полос поглощения по шкале длин волн (или частот);

–                   форма полос поглощения.

         Введение в молекулу разных заместителей или изменение внешних условий, например, растворителя, обычно вызывает сдвиг полос поглощения. Если полоса поглощения смещается в сторону более длинных волн, то говорят, что проходит батохромный сдвиг или углубление окраски (красное смещение). Если полоса смещается в сторону более коротких волн, эффект называют гипсохромным сдвигом или повышением окраски (голубой или синий сдвиг).

         Наибольшей интенсивностью в спектрах поглощения владеют полосы, которые обусловлены переносом заряда от одного атома ко второму (полосы переноса заряда). Часто эти полосы связаны с переносом электрона с р-орбиталей лиганда на d-орбиталь центрального иона и наоборот. Более правильно говорить о переносе электрона между молекулярными орбиталями, локализованными возле разных атомов. Интенсивнее полосы в спектре, которые возникают вследствие таких переходов, для которых e > 10⁴. К ним принадлежат p ® p* и® p* -переходы. Именно переносом заряда объясняют, например, интенсивную окраску ионов MnО₄^2–, CrО₄^2–, окраску тиоцианатных комплексов Fe(III), Co(II), Mo(VI), сульфосалицилатных комплексов железа, фенанатролиновых и других комплексов.

         Значительно менее интенсивные полосы, связанные с внутриатомными d-d или f-f переходами. Эти переходы являются запрещенными по энергии, и они дают полосы с молярным коэффициентом поглощения от 1 до величины < 100. Снятие запрета с d-d – переходов в комплексах часто происходит из-за частичной гибридизации d и р – орбиталей и переход электронов уже происходит из смешанных d- и р- орбиталей на d- орбитали, которые не являются запрещенными.

         Спектры окрашенных соединений в растворе обычно характеризуются достаточно широкими полосами поглощения. Расширение полос связано с сильным влиянием молекул растворителя на энергетические уровни электронов, которые отвечают за светопоглощение, и наложение колебательных переходов на электронный переход. Почти всегда такие широкие полосы наблюдаются в спектрах переноса заряда.

         Ионы лантаноидов имеют узкие полосы поглощения, так как их внутренние 4f – электроны, отвечающие за светопоглощение, находятся под экраном 5s- и 5р – электронов.

         Конечно, чем выше молярный коэффициент поглощения и меньше ширина полосы, тем более ценными химико-аналитическими свойствами владеет соединение. Эти характеристики определяют:

–         границу определения (Е);

–         селективность (ширина полосы).

 

Оптические условия фотометрического определения.

         При всем разнообразии схем и конструктивных особенностей приборов абсорбционной спектроскопии, в любом из них есть несколько главных узлов, функций которых приблизительно одинаковы в разных приборах. Такими узлами являются:

–         источник света;

–         монохроматизатор света;

–         кювета с исследуемым раствором;

–         приемник света.

         Главным источником света в абсорбционной спектроскопии является:

–         вольфрамовые лампы накала;

–         ртутная и водородная газонаполненные лампы;

–         штифт Нернста;

–         глобар.

         В лампе накала  светящаяся вольфрамовая спираль дает свет в широком спектральном интервале. Однако стекло пропускает свет лишь в интервале длин волн 350……1000 нм, то есть в видимой части спектра и самых ближних УФ и видимой области. В водородной лампе происходит свечение Н₂ при разряде. Условия возбуждения выбирают так, что возникает практически сплошное излучение в области 200 – 400 нм. В ртутной лампе излучают линейчатый спектр, в котором доминируют излучения с l = 254, 302, 334 нм.

Штифт Нернста – столбик, спрессованный из оксидов РЗЭ. При разжаривании путем пропускания электрического тока дает ИК – излучение 1.6….5.6….6.0 мкм.

         Глобар-штифт сделан из карборунда SiС, дает излучение в интервале 2…16 мкм тоже при пропускании электрического тока.

         Монохроматизаторы или монохроматоры – устройства для получения света с заданной длиной волны.

 Наиболее распространенные в практике абсорбционной спектроскопии:

–         светофильтры (абсорбционные, интерференционные, интерференционно-поляризационные).

–         призмы (стеклянные, кварцевые).

         Приемники света. В качестве рецепторов света в приборах абсорбционной спектроскопии применяют:

–         фотоэлементы;

–         фотоумножители.

         Приемники света характеризуются спектральной чувствительностью-способностью воспринимать излучение разных длин волн; интегральной чувствительностью, которая измеряется при действии на рецептор неразложенного в спектр излучения.

         Светофильтры для фотометрирования, как правило, стараются выбрать так, чтобы спектральная область максимального поглощения окрашенного раствора и область максимального пропускания света светофильтром была одной и той же, то есть максимум поглощения раствора должен отвечать максимуму пропускания (минимума поглощение) светофильтра.

         На практике светофильтр подбирают экспериментально: светофильтр при котором абсолютное значение или разность оптических плотностей DА двух стандартных растворов с концентрациями С₁ и С₂ получается максимальной, является наиболее удачным для фотометрирования данной окраски раствора.

         Важное влияние на успешное фотометрирование имеют разные химические факторы, связанные с полнотой и условиями протекания фотометрической реакции, концентрацией окрашенных и других реактивов, их устойчивостью. В зависимости от свойств анализируемой системы выбирают те или другие условия анализа.

1.                Выбор длины волны (на так светопоглощения). Если есть несколько полос, то на наиболее интенсивной. Плоские максимумы имеют преимущество, поскольку незначительное отклонение от длины волны несущественно влияет на оптическую плотность. Чувствительность приемника света должна быть максимальной. Выбор светофильтра.

2.                Светопропускание (оптическая плотность). Измерительное устройство фотометра обычно дает постоянную ошибку DТ в величине коэффициента пропускания Т во всем интервале его значений. Методом математического анализа найдено, что минимальная ошибка измерения будет наблюдаться при А = 0,435. Более строгое рассмотрение дает значение »0,6….0,7. Расчеты и опыт показывают, что фотометрированибкой растворов с 2.0<А<0.03 характеризуется большой ошибкой и его нельзя проводить.

3.                Толщина светопоглощающего слоя. Уравнение закона Бугера-Ламберта-Бера показывает, что чем больше толщина слоя, тем чувствительнее будет определение при других одинаковых условиях А = e l С, если l = больше, то С = меньше. Однако с увеличением толщины слоя увеличиваются потери на рассеивание света, особенно при работе с растворами. l > 5 не применяется.

4.                Фотометрические реакции. Химические реакции, которые применяют в фотометрии для получения окрашенных соединений, должны отвечать ряду требований:

а) При реакции должен образовываться окрашенный продукт. Этого достигают, применяя комплексовобразованием, введение хромофорных групп, увеличивая число сопряженных p-связей, и другими способами.

б) Продукт фотометрической реакции должен иметь постоянный состав. Для стабилизации состава, например, комплексных соединений подбирают условия среды, избыток реагента, оптимальное время проведения реакции.

в) Продукт фотометрической реакции должен иметь высокую интенсивность окраски. Для фотометрических определений применяют реакции, которые дают продукты с e > 500 – 10000. Тогда лишь обеспечивается высокая чувствительность реакции.

г) Все фотометрические измерения проводят в абсолютно одинаковых условиях, добавляя необходимые реактивы, как в анализируемый раствор, так и в раствор сравнения, выравнивая рН, t°, V_{растворов}.

д) Фотометрическая реакция должна быть избирательной и проходить по возможности, только с определяемым компонентом.

         Применяемые реакции:

–         образование азосоединений;

–         образование хинониминовых соединений;

–         образование полиметиновых соединений;

–         образование за счет реакций конденсации;

–         образование окрашенных продуктов в результате ох – red;

–         реакции комплексообразования;

–         применение реакций образования ионных ассоциатов в процессе экстракции.

         В уравнение основного закона светопоглощения входит концентрация окрашенного (светопоглощающего) соединения, поэтому преобразование определяемого компонента в такое соединение является одной из важнейших операций, которая в значительной мере определяет точность анализа. Окрашенные соединения, главным образом, получают реакциями ox-red и комплексообразования. Ох-red реакции, например окисление до MnО₄^–, проходит практически до конца.

         Значительно более сложным является вопрос о протекании в растворе реакций комплексообразования. На них влияют:

–                   ступенчатое комплексообразование;

–                   протолитические равновесия;

–                   маленькая устойчивость образующегося комплекса;

–                   собственная окраска реагента.

         Действие большинства этих факторов можно предусмотреть, если равновесия в системе достаточно полно изучены и константы соответствующих равновесий известны. Используя их можно рассчитать:

–                   рН

–                   С_a

при которых будет достигнута необходимая полнота реакции, будет смещено влияние посторонних элементов и ионов.

         Особое внимание следует предоставить постоянству рН во всех исследуемых растворах.

         Для выяснения оптимальных условий фотометрического определения каждая система требует специального физико-химического исследования для установления состава соединений, которые образуются, определение констант равновесия и т.д.

         Отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бера –

         Отклонение от линейности А = e×l×c.

         Причины: – химические (особенности комплексообразования)

– физические (условия измерение интенсивности окраски, l).

         Чувствительность и точность метода.

         Минимальную концентрацию, которую можно измерять фотометрическим методом рассчитывают:

C_min = A_min / (el)

Если А = 0,01, l = 1 см, e = 10³, то

         Эта концентрация может быть значительно выше, так как может быть e > 1000.

         Точность фотометрических методов зависит от индивидуальных особенностей фотометрической реакции, характеристик применяемого прибора и ряда других факторов и изменяется в достаточно широких границах. Обычная ошибка фотометрических методов составляет около 1…2 % (относительных).

 

Основные приемы количественного анализа

1.                            Метод градуировочного графика. A = ¦(C).

2.                            Метод молярного коэффициента светопоглощения.

C_x = A_x/(el) 

Ограничение: обязательная линейность.  и т.д.

3.                            Метод добавок.

Применяется при анализе сложных растворов.

 

Экстракционно-фотометрический метод определения тяжелых металлов в природных водах

         Для определения загрязняющих веществ используют инструментальные методы современной аналитической химии, основанные на измерении различных физических свойств определяемых веществ или продуктов их химических превращений (аналитических реакций) с помощью физических и физико-химических приборов. Результат измерения, несущий химико-аналитическую информацию, часто называют аналитическим сигналом.

         Спектроскопические методы анализа основаны на использовании взаимодействия атомов или молекул определяемых веществ с электромагнитным излучением широкого диапазона энергий. Это могут быть (в порядке уменьшения энергии) гамма-кванты, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое и видимое, инфракрасное, микроволновое и радиоволновое излучение. Сигналом может быть испускание или поглощение излучения. Важнейшими для экологического мониторинга, по-видимому, являются нейтронно-активационный, рентгеноспектральный, атомно-абсорбционный и атомно-эмиссионный анализ, спектрофотометрический и флуориметрический методы, инфракрасная спектрометрия.

        

Сущность экстракционно-фотометрических методов

         Эти методы применяют в аналитической химии очень даже широко, причем определение анализируемого компонента в экстракте может производиться как фотометрическим, так и другим методом: полярографическим, спектральным.

         Вместе с тем существуют некоторые группы экстракционных методов, в которых фотометрическое окончание является наиболее эффективным, обеспечивая необходимую быстроту и точность определения. Эти методы называются экстракционно-фотометрическими. Весьма распространенной является методика, по которой определенный микроэлемент переводят в растворимое в воде окрашенное соединение, экстрагируют его и экстракт фотомоделируют. Такая методика позволяет устранить мешающее влияние посторонних компонентов и увеличивает чувствительность определения, так как при экстракции происходит концентрирование микропримесей. Например, определение примесей железа в солях кобальта или никеля проводят экстракцией его тиоцаинатных комплексов амиловым спиртом.

         Фотометрическая технология – основная технология для определения концентраций многих жидкостей и газов, используемых в промышленности, на ppm и процентном уровнях. Приборы, основанные на данной технологии, называют фотометрами. Каждый газ или жидкость обладают своим характерным спектром поглощения электромагнитного излучения. Можно подобрать такой диапазон длин волн, на котором спектр поглощения измеряемого компонента будет кардинально отличаться от спектров поглощения остальных компонентов. Если пропускать излучение необходимой длины волны через ячейку с пробой, то по изменению спектра поглощения можно узнать концентрацию измеряемого компонента. 
В зависимости от длины волны источника излучения анализаторы могут работать в инфракрасном, ультрафиолетовом или оптическом диапазоне.

 

 

Люминесцентный метод анализа.

         Склонность атомов и молекул поглощать энергию, которая поступает к ним извне, вызывает новое энергетическое состояние вещества, которое называется возбужденным. Избыточная энергия атомов или молекул, полученная при возбуждении, может быть использована на отрывание электронов – ионизацию вещества; на какие-либо фотохимические реакции; на нагрев вещества, то есть переход избыточной энергии в тепловую. Кроме того, возбужденные атомы или молекулы способны отдавать всю избыточную энергию в тепловую. Кроме того, возбужденные атомы или молекулы способные отдавать всю избыточную энергию или часть ее в виде света. Как правило, большинство твердых веществ при сильном нагревании светятся. Такое свечение накаленных тел называют температурным или тепловым излучением. Чем больше энергии при данной температуре поглощает тело, тем оно больше ее излучает.

          У некоторых веществ наблюдается свечение и без нагревания при комнатной температуре, которое называют холодным свечением либо люминесценцией. В отличие от температурного люминесцентное излучение является неравновесным и продолжается относительно долго после прекращения действия внешнего возбуждающего фактора. Полное определение понятия люминесценции дал С.М. Вавилов: «Люминесценцией называют избыток над температурным излучением тела в том случае, если это избыточное излучение владеет конечной продолжительностью приблизительно от 10^-10 с и больше».

         Продолжительность послесвечения для разных люминесцирующих веществ разная: от миллиардных долей  секунды (для отдельных атомов и молекул) до нескольких часов и даже нескольких суток (для кристаллофоров).

     Явление люминесценции разнообразны по свойствам и происхождению. Разные виды люминесценции определяются природой энергии возбуждения, продолжительностью свечения и химическими свойствами люминесцирующих веществ. В зависимости от вида люминесценции рассматривают следующие разделы люминесцентного анализа:

1)                   фотолюминесценция или флюоресценция (базируется на свечении вещества после поглощения световой энергии УФ или видимого участка спектра);

2)                   катодолюминесценция (базируется на свечении вещества, вызванного бомбардированием быстрыми электронами);

3)                   хемилюминесценция (базируется на свечении веществ, которое возникает за счет энергии химических реакций);

4)                   термолюминесценция (базируется на свечении веществ, которое вызывается нагреванием);

5)                   триболюминесценция (базируется на измерении свечения веществ, которое вызывается механическим влиянием  на них: трением и т.д.).

         Люминесценцию также классифицируют по наличию послесвечения.  Она может прекращаться сразу при снятии возбуждения – флюоресценция или может продолжаться и длиться некоторое время после прекращения возбуждающего действия – фосфоресценция.

         В химическом анализе главным образом используют явление флюоресценции, поэтому метод назвали флюориметрией. В разработку теории люминесценции большой вклад внес великий ученый С.М. Вавилов.

         Все люминесцирующие вещества имеют общее название люминофоры. Неорганические люминофоры наиболее часто называют просто люминофорами, а органические – органолюминофоры. Органические и неорганические люминофоры существенно отличаются по природе свечения. У первых процессы поглощения возбуждающего света и излучения проходят в границах каждой, способной люминесцировать молекулы. У вторых, чаще всего активированных и имеющих кристаллическую структуру, в акте люминесценции принимают участие не отдельные атомы и молекулы, а кристаллы. Эти люминофоры называют кристаллофосфорами.

         Известно два механизма возникновения свечение:

1)                свечение отдельных центров, когда процесс возникновения люминесценции проходит лишь в одной частичке (центр свечения), которая является поглотителем энергии и излучателем световых квантов;

2)                рекомбинационные процессы свечения, при которых, как правило, поглощение энергии осуществляется не одними и теми же частичками, которые излучают световые кванты.

         По первому механизму осуществляется свечение большинства органических веществ в растворе, в том числе и внутрикомплексных соединений органических люминесцентных реагентов с катионами. Свечение кристаллов с решетками молекулярного типа, например, нафталина, антрацена и их производных, определяется рекомбинационными процессами.

Такое свечение наблюдается и у сульфида цинка, сульфида кадмия, оксида кальция и т.п., кристаллические решетки которых владеют некоторым дефектами, вызванными включением примесей – ионов тяжелых металлов. В этом случае в возникновении флюоресценции принимает участие весь кристалл в целом, такой вид свечения называют свечением кристаллофосфоров.

         Способность веществ люминесцировать определяется химической структурой люминофоров. Во всех видах люминесценции проявляются характерные свойства вещества и это может быть основой для распознавания и изучения этих веществ.

         В аналитической практике наиболее широкого применения приобрела фотолюминесценция, а именно флуоресценция, то есть характерное свечение анализируемых растворов и кристаллофосфоров в ультрафиолетовом свете.

Таким образом, люминесценция отличается от излучения нагретых тел своей неравновесностью: люминесценция практически не использует тепловую энергию излучаемой системы, поэтому называется холодным свечением. Это определение отличает люминесценцию от других видов неравновесного свечения – рассеивания, отражения света, комбинационного рассеивания, излучения Вавилова-Черенкова и т.д.

         Люминесценция возникает в результате электронного перехода при возвращении частичек из возбужденного состояния в нормальное. Таким образом, молекула превращает поглощенную энергию в собственное излучение. Этим люминесценция отличается от процессов несобственного излучения – рассеивания и отражения света. Люминесцирующие вещества могут находиться в любом агрегатном состоянии.

        Колебательная релаксация

                                      

V4

                                       V3                          V2

                                                     V1    Возбужденное состояние

                                 V₀

 

                                     Флюоресценция

                                                   

                        V4            Колебательные уровни   

                              Основное состояние

 

    V₀       Электронный уровень  

    

         При поглощении кванта света электрон переходит c основного уровня на более высокий, который отвечает возбужденному состоянию. При комнатной температуре молекулы наиболее часто находятся в основном состоянии и почти все электронные переходы при поглощении света происходят из нижнего (основного) колебательного подуровня на разные колебательные подуровни возбужденного состояния.

          Возбужденная молекула за счет так называемой колебательной релаксации при столкновенье с окружающими молекулами очень быстро сравнительно со временем электронного перехода теряет избыточную колебательную энергию и переходит на основной колебательный уровень возбужденного колебательного состояния (волнистая стрелка).

         При переходе из основного колебательного подуровня возбужденного состояния на какой-нибудь колебательный подуровень основного электронного состояния происходит излучение кванта света. Этот процесс называется флуоресценцией. Время затухания флуоресценции составляет 10^-9… 10^-7 с.  Дезактивация возбужденной молекулы может происходить также за счет безизлучательных переходов внутренней конверсии.

         Так как в зависимости от частоты света, которым облучают, частичка переходит в энергетически разные возбужденные состояния, можно было бы ожидать связи спектра флюоресценции со спектром возбуждения источника. Однако в действительности эта связь не наблюдается. Независимость спектра флуоресценции от длины волны падающего света, главным  образом, связана с тем, что возбужденные молекулы в результате колебательной релаксации успевают израсходовать колебательную энергию за время, значительно меньше, чем время жизни возбужденного состояния, и перейти на основной колебательный уровень возбужденного электронного состояния. Переход такой системы в невозбужденное состояние характеризуется излучением одних и тех же квантов света, то есть наблюдается один и тот же спектр флуоресценции. В то же время в некоторых случаях это расширяет возможности люминесцентного анализа, давая возможность селективного возбуждения определенных соединений.

1) Как видим, между спектром поглощения вещества и ее спектром излучения можно ожидать определенного сходства, так как они оба определяются одними и теми же электронными переходами. Сходство действительно есть, причем, как установлено законом Стокса – Ломмеля, спектр излучения и его максимум всегда сдвинуты в сторону больших длин волн сравнительно со спектром поглощения и его максимумом. Это первая закономерность.                                                                       

2) правило зеркальной симметрии, в соответствии с которым, спектры поглощения и флюоресценции, построенные в шкале частот, приблизительно симметричны относительно прямой, которая проходит через точку их пересечения. 

                                                                                             

     Вк     

     Ев                           1                   2

 

 

               поглощение       люминесценция

 

 

         Расстояние между максимумами спектра поглощения и спектра люминесценции называют стоксовым смещением. Люминесцирующие вещества характеризуются величиной стоксового смещения. Чем больше его значение, тем более надежно определяют вещества люминесцентным методом.

Важной закономерностью люминесценции, которая применяется в люминесцентном анализе, является связь между интенсивностью возбуждающего света и интенсивностью люминесценции. Полнота преобразования возбуждающей энергии при люминесценции характеризуется энергетическим выходом В_е, это отношение энергии люминесценции которая излучается веществом Е_л к поглощенной энергии возбуждения Е_возб:

В_е =  Е_л/Е_возб

или величиной квантового выхода В_к, которая равна отношению числа излучаемых квантов при люминесценции N_л к числу поглощенных при возбуждении квантов N_возб:

В_к = N_л/N_возб

Так, как энергия кванта (Е) прямо пропорциональная частоте n или обратно пропорциональная длине волны (l)

Е=hn =h*c/ l

то устанавливается зависимость между энергетическим и квантовым выходом

                 B_e = E_л / Е_возб = hn_л N_л / hn_возбN_возб  = n_л /  n_возб  * В_к   = l_возб / l_л *В_к

Знание величины выхода люминесценции и влияния разных факторов на эту величину имеет очень большое значение для люминесцентного анализа. Очевидно, что чем больше выход люминесценции для какого-нибудь вещества, тем чувствительнее аналитическая реакция, которая базируется на использовании излучения этого вещества.

         С. Вавилов установил зависимость энергетического выхода люминесценции от длины волны возбуждающего света. Она выражается графически, а формулируется следующим образом:

 

 

 

 

 

 

II

         При возбуждении люминесценции коротковолновой частью спектра поглощения величина энергетического выхода возрастает пропорционально возрастанию длины волны света, которое является возбудителем; потом в некотором спектральном диапазоне выход не изменяет своей величины при увеличении длины волны возбуждающего света, после чего в области наложения спектров поглощения и излучения происходит резкое падение выхода по энергии.

         Участок первой кривой, которая соответствует пропорциональности энергетического выхода длине волны, можно описать уравнением:

                                                         В_е= а *  l_возб

В то же время:

                                                          В_е =* В_к

Объединив эти уравнения и зная, что l_л = const   получаем:

В_к  = а *  l_Л = сonst

B_e   = l_возб.* а

l_возб.* а =В_К

В_К / l_Л = а

В_к =l_л * а

         Это означает, что квантовый выход люминесценции остается постоянным при увеличении длины волны возбуждающего света вплоть до некоторого значения l_n и спектр люминесценции не зависит от того, каким участком спектра возбуждается люминесценция данного вещества. Если возбуждение молекулы, вызванное УФ – излучением с большой величиной энергии кванта, то избыток энергии поглощенного кванта (относительно энергии излученного кванта) расходуется на внутримолекулярные колебания, то есть превращается в тепловую энергию. На практике для получения люминесценции многих веществ чаще применяют УФ-лучи, то есть коротковолновый свет с энергией кванта, так как это, хотя и менее выгодно энергетически, но значительно  проще в техническом выполнении.

         Процессы, которые ведут к снижению выхода люминесценции, называются гашением люминесценции. Причины этих процессов:

–                     внешние (гашение 1 рода);

–                     внутренние (гашение 2 рода);

         Гашение 1 рода называют явления, которые обусловлены быстрым возвращением возбужденной молекулы в нормальное состояние. Это происходит, например, при возбуждении люминесценции длинноволновым светом, которое перекрывается со спектром люминесценции.

         Для обычных условий люминесцентного анализа главное значение имеет гашение 2 рода, которое вызвано взаимодействием между возбужденными молекулами и молекулами посторонних веществ или другими молекулами самого люминесцирующего вещества: это концентрационное гашение, температурное гашение и гашение люминесценции посторонними веществами.

Концентрационное гашения – выход люминесценции при маленьких количествах люминесцирующего вещества пропорционален его содержанию в растворе и может быть использован для количественного анализа.

І_л= k*С

         Линейная зависимость интенсивности люминесценции от концентрации будет наблюдаться при постоянности таких факторов, как квантовый выход, интенсивность возбуждающего света и т.д. Также существенным является условие низкой концентрации люминесцирующего вещества.

         В некотором интервале концентраций увеличение концентрации люминесцирующего вещества приводит не к усилению яркости свечения, а наоборот, к ее уменьшению. И в конце концов, при достижении определенной концентрации вещества наступает полное гашение люминесценции, то есть наступает концентрационный барьер или концентрационное гашение. Концентрационный барьер для большинства люминесцирующих веществ лежит в области концентраций 10^-4 – 10^-3 моль/л и является специфическим для разных веществ, а также зависит от типа раствора (водный…).

         Явление концентрационного гашения обратимо: при разбавлении концентрированных растворов свечение восстанавливается, что свидетельствует об отсутствии сложных физико-химических преобразований.

         Температурное гашение. На выход люминесценции органических молекул и кристаллофоров сильно влияет температура. Повышение температуры приводит к уменьшению вязкости растворителя люминесцирующих растворов, содержащих органические вещества, и увеличивает колебательную энергию молекул. Это приводит к ослаблению внутренне-молекулярных связей и может обусловить переход молекулы без излучения в нормальное состояние, в новую нелюминесцирующую модификацию, вызвать диссоциацию при возбуждении.

         Гашение люминесценции посторонними веществами. Природа их взаимодействия с люминесцентными веществами может быть химической (в результате образования новых нелюминесцентных продуктов) и физической (за счет передачи энергии возбужденной молекулы молекуле гашения). Эффективно гасят люминесценцию ионы окислителей или вещества, которые легко принимают электроны (I₂, Fe³⁺, Cu²⁺, Ag ⁺ и др.).

 

Флюоресцентные методы анализа делятся на:

–                     прямые (непосредственно измеряют І_л);

–                     косвенные (флюоресценция является индикатором и указывает на окончание процесса определения веществ).

         Методы прямого флюоресцентного анализа базируются на законе С.И. Вавилова:

Ф= К * С

где Ф – интенсивность флюоресценции;

К – коэффициент пропорциональности;

С  – концентрация моль/л.

         Закон справедлив в области маленьких концентраций 10^-7 – 10^-4  моль/л.

Прямым флюоресцентным методом могут определяться вещества в растворе, которые владеют собственной флюоресценцией (определение витамина В₁); или которые образуются с разными регентами флюоресцирующего вещества (определение Al³⁺ по его комплексу с салицилаль–о–аминофенолом); которые гасят люминесценцию разных веществ (определение Zn²⁺ по гашению флюоресценции родамина(С)–тиоцината, который связывается с Zn²⁺-ионами).

Разновидностью прямого флюоресцентного метода является экстракционно-флюоресцентный метод, при котором соединение, которое образуется, экстрагируется из водного раствора органическим растворителем, потом измеряется интенсивность флюоресценции экстракта.

Таким способом определяют содержание алюминия, получая его оксихинолят, который потом экстрагируют хлороформом. Интенсивность флюоресценции хлороформного экстракта измеряют на флюориметре:

 

 

 

                                                                                        Усилитель    гальванометр

 

                 

 

                                                                             

                                                                                                     кювета

                 СФ                                  

 

 Источник                                          ФЭ

ртутно-кварцевая лампа.

 

 

         Для количественного определения пользуются методом градуировочного графика.

         Из косвенных методов флюориметрического анализа получили распространение титрование с флюоресцентными индикаторами.

Окислительно-восстановительные флюоресцентные индикаторы изменяют интенсивность или цвет флюоресценции в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала системы. Например, при титровании

Fe²⁺  + Ce^IV             Ce³⁺ + Fe³⁺

 В присутствии силоксена (Si₆H₆O₃)_n флюоресценция раствора исчезает в присутствии небольшого избытка титранта. Наиболее широкое применение нашли флюоресцентные индикаторы в методах кислотно-основного титрования. Ионизированная и неионизированная форма характеризуется интервалом рН перехода цвета флюоресценции. Флюоресцентные индикаторы имеют более узкие интервалы перехода цвета, которые повышают точность анализа.

                                               рН перехода                цвет флюоресценции

Антраниловая кислота          1,5-3,0                          нет – голубой.

Салициловая кислота            2,5-4,0                          нет – синий.

Акридин                                    5,2-6,6                                зеленый – фиолетовый.

Люминол                                6,0-7,0                          нет – синий.

 

В химии и фармации флюоресценцию применяют для:

–                     определения следов металлов:

–                     органических (ароматических) соединений;

–                     витаминов Д₁, Р₁;

–                     флюоресцентные индикаторы применяются при титровании мутных или темно – окрашенных растворов (процесс титрования проводят в темноте, освещая титрованный раствор, куда добавлен индикатор, светом люминесцентной лампы; высокая чувствительность ~10^-5  %).

Ошибка метода прямой люминесценции 5…7 %

 

Нефелометрический и турбидиметрический методы анализа.

         При прохождении света через дисперсные системы наблюдается рассеивание или поглощение света твердыми частичками. Это явление положено в основу нефелометрии и турбидиметрии. Интенсивность светового потока, который рассеивается небольшими частичками зависи, описывается уравнением Релея:

где І, І₀ – интенсивности рассеянного и падающего света соответственно;

F – функция, которая зависит от показателя преломления частичек в растворе;

N – общее число частичек в зависях;

V – объем частичек;

l                       – длина волны падающего света;

r  – расстояние к наблюдателю;

b                  – угол между направлениями падающего и рассеянного света.

В нефелометрических измерениях все определения проводят при определенных значениях F, V, r, b. Поэтому, объединяя их в одну константу, можно записать:

І = І₀ * К* N = I₀ * К * С.

Отсюда интенсивность рассеянного светового потока прямопропорциональна числу частичек в зависях, а потому и концентрации частичек, которые находятся в растворе.

         Из приведенной выше формулы вытекает, что интенсивности рассеянного света в двух растворах с частичками одинаковой формы и размера относятся между собой, как концентрации частичек определяемого вещества: 

Это уравнение лежит в основе нефелометрических определений.

При нефелометрических определениях измеряют интенсивность рассеянного света  І  в направлении,  перпендикулярном направлению падающего пучка света.

 

І₀

                                                     І_р

        

         При турбидиметрическом методе анализа интенсивность светового потока уменьшается вследствие поглощения и рассеивания светового потока и определяется уравнением:

где І и І₀ – интенсивность светового потока, который прошел через раствор и падающего светового потока соответственно;

С – концентрация поглощающих частичек в растворе;

l – толщина поглощающего слоя раствора;

d – средний диаметр поглощающих частичек;

K’, a – константы, которые зависят от метода измерения и природы суспензии;

l – длина волны.

         При аналитических турбидиметрических определениях все измерения проводятся при определенных значениях К’, d, a и l.

         Объединяя их в одну постоянную величину, получаем:

 или А = К*l*С.

         Это уравнение имеет вид, аналогичный уравнению Бугера – Ламберта  – Бера, но К – молярный коэффициент мутности раствора.

         При турбидиметрических определениях измеряют интенсивность света І, который выходит из кюветы в направлении падающего пучка света.

         Приведенные уравнения справедливы только для очень разбавленных растворов суспензии (не больше 100 мг на 1 л). Турбидиметрические и нефелометрические методы владеют высокой чувствительностью. Однако используются они не широко, что объясняется трудностью получения зависей с одинаковым размером частичек. Количественные нефелометрические и турбидиметрические определения проводят, пользуясь градуировочным графиком.

         Для точных исследований применяют метод уравнивания. Довольно часто применяют метод фототурбидиметрического и фотонефелометрического титрования.

 

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

а) Основные:  1. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия. – М:Высшая школа, 2001. – С.340 – 341; 354-356, 375-376.

2. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. ч. 2. – М.: Высшая школа, 1982. – С. 183-195.

3. Васильев В.П. Аналитическая химия. т. 2. – М.: Высшая школа, 1989. – С. 70-87.

4. Барковский В.Ф., Горелик С.М., Городенцева Т.Б. Физико-химические методы анализа. – М.: Высшая школа,1972. – С. 66-75.

б) Дополнительные: 1. Крешков А.П. Основы аналитической химии. – М.: Химия, 1977.–С. 254-270.