Морфология и и структура бактерий. Морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, грибов.

Морфология и и структура бактерий. Морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, грибов.

Физиология микроорганизмов. Питательные среды для культивирования бактерій.

Дезинфекция и стерилизация.

 

 

Актиномицеты (грец. actis — луч, tnyces — гриб) — одноклеточные граммположительные микроорганизмы, которые входят в семейство Actinomy–cetaceae, Streptomycetaceae. В семейство Actinomycetaceae входят 370 видов, но только некоторые из них являются возбудителями актиномикоза. К патогенным актиномицетам принадлежат A. bovis, обнаруженный в 1877 г. К. Гар-цом, и A. israilii, выделенный в 1891 г. И. Израилем от больных актиномикозом.

У актиномицетов, как и у бактерий, генетическую функцию выполняет нуклеоид.

 

Друзы  патогенных актиномицет.

 

В нитях мицелия  есть зерна хроматина.

Размножаются актиномицеты прорастанием спор, прикрепленных на спороносцах, простым делением и почкованием.

Много видов актиномицетов имеют свойство производить антибиотики.

Патогенность для животных. Патогенные актиномицеты поражают крупный рогатый скот, реже — свиней,лошадей. Заболевание имеет хроническое течение с образованием воспалительных очагов и фистул.

К патогенным актиномицетам принадлежат некоторые виды рода Nocardia, в частности N. asteroides, которая при бактериоскопии имеет тонкий разветвленный мицелий, что распадается на палочкоподобные и коккоподобные элементы; растет в аэробных условиях, образует морщинистые зернистые колонии желтого или темно-оранжевого цвета. N. asteroides живет в почве; заражение наступает воздушно-пылевым путем и в результате проникновения актиномицетов в поврежденную кожу. Кроме человека, болеют крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки, мартышки, норки, выдры и другие животные. У человека N. asteroides вызывает нокардиоз — хроническое грану-лематозное поражение легких, кожи, лимфатических узлов, мозга и его оболочек, почек. Если местом проникновения актиномицетов является кожа стопы, развивается мицетома стопы (мадурская болезнь), которая проявляется образованием абсцессов и  множественных  фистул.

ПАТОГЕННЫЕ СПИРОХЕТЫ

К семействам  Spirochetaceae и Leptospiraceae входят сапрофиты и патогенные виды бактерий. К сапрофитам принадлежат Spirochaeta  и Cristispira, что являются крупными клетками размером 200—500 мкм с заостренными или тупыми концами; некоторые из них имеют крипты (волновые гребни). Патогенные спирохеты живут на мертвых субстратах, в загрязненных водоемах, в кишечнике хладнокровных животных; в естественных условиях живут и непатогенные лептоспири. За Романовским — Гимзой эти бактерии окрашиваются в синий цвет.   *•

 

К патогенным спирохетам относятся три рода: Treponema, Borrelia, Leptospira.

Treponema pallidum открыли в 1905 г. Ф. Шаудин и Е. Гофман. Старое название возбудителя — бледная спирохета —определено тем, что микроорганизм плохо окрашивается   анилиновыми   красителями

 

Морфология. Т. pallidum— тонкие клетки спиралеподобной формы с 12— 14 завитками (рис. 88). Они не имеют видимой в микроскоп осевой нити или осевого гребеня- Концы трепонем заострены или округлены. Длина их 10—13 мкм, ширина — 0,1—0,18 мкм.

При электронной микроскопии продольных и поперечных ультратонких срезов возбудителя сифилиса хорошо видно трехслойную внешнюю мембрану под которой расположенные базальные темном поле микроскопа, тела; к ним прикрепленные нитевидные образования—фибрилы диаметром 17 нм. На каждом конце клетки есть по три фибрилы. В цитоплазме бактерий есть рибосомы, вакуоля нуклеоида и мезосомы. Размножаются бактерии поперечным делением.

Трепонемы подвижны (им свойственно оборотное, поступательное, згибательное и волнообразное движения), плохо воспринимают красители, грамотрицательные. По методу Романовского — Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет, что объясняется низким содержанием нуклеопротеида.

Под воздействием факторов внешней среды и лекарственных средств трепонемы в ряде случаев свертываются в клубки, образовывая цисты, покрытые непроницаемой муциноподобной оболочкой. Цисты могут длительное время быть в организме больного в латентном состоянии, при благоприятных условиях они превращаются в зерна, а затем в типичные спиралеподобные трепонемы. Цистообразование — одна с форм защиты трепонем, которая дает возможность им противостоять действиям лекарственных средств, которые назначаются больным сифилисом. Бледные трепонемы могут образовывать L-формы. Цисты и L-формы трепонем более стойкие к действию факторов внешней и внутренней сред.

Патогенность для животных. В естественных условиях у кроликов может возникнуть заболевание (кроличий сифилис), которое вызывается Тгеponema canicola, которая морфологически не отличается от Т. pallidum.

Бледная трепонема малопатогенная для животных, за исключением мартышек. Достигнут позитивный результат при заражении кроликов в роговицу глаза или яичко. С помощью экспериментального сифилиса изучен вопрос иммунитета, специфической химиотерапии и культивирования бледной трепонемы.

 

Лептоспиры — Leptospira (грец. leptos — длинный, тонкий) являются возбудителями зоонозных заболеваний. Они входят к семейство Leptospiraceae. Лептоспироз вызывает Leptospira interrogans.

 

Морфология. Лептоспиры — микроорганизмы с 12—18 мелкими первичными завитками, которые плотно прилегают друг к другу. Напоминают пружину с загнутыми и утолщенными концами. На концах лептоспир есть вторичные завитки, которые придают им S- или С-подобной формы. Есть также безкрючкрвые  штаммы лептоспир. Длина лептоспир 7—14 (иногда 20—ЗО) мкм, толщина 0,06—0,15 (0,25—0,3) мкм. Они подвижны, делают оборотные и поступательные движения.

При электронно-микроскопическом исследовании структуры лептоспир доказано, что они состоят из осевой нити, цитоплазматического цилиндра, равномерно закрученного вокруг ригидной осевой нити, поперечных колец и многослойной оболочки. Считают, что осевая нить состоит из двух отрезков, которые сближаются в центральной части лептоспиры. На поверхности цитоплазматического цилиндра при специальной обработке обнаруживают микрофибриллы, цитоплазма мелко-гранулярная, в старых культурах есть вакуоля. Нуклеоид расположен эксцентрически, имеет тонкие, беспорядочно расположенные фибрилы ДНК.

Морфологически патогенные и сапрофитные лептоспиры не отличаются друг от друга, они отличаются лишь по составу клеточных жирных /кислот: у патогенных видов высокий уровень олеиновой, у сапрофитных штаммов —миристиновой кислоты.

 

 

 

Лептоспиры грамотрицательны, за Романовским — Гимзой окрашиваются в бледно-розовый цвет. Их можно обнаружить по методу Бурри или серебрением за Морозовым. Лептоспиры слабо преломляют свет.

Под воздействием питательной среды, повышенной температуры и при длительном культивировании могут появляться атипичные формы лептоспир.

Патогенность для животных. В естественных условиях резервуаром лептоспир являются млекопитающие из отряда грызунов, насекомоядных, сумчатых, парнокопытных   и   хищников.

В очагах лептоспироза наибольшее эпидемиологическое значение имеют хомяки, мыши, крысы и др., которые выделяют лептоспиры во внешнюю среду с мочой и испражнениями. Пораженность этих животных лептоспирозом может достигать 30—60 % и больше. Лептоспироз регистрируют также среди свиней, большого и мелкого рогатого скота, собак и т.д.

Из лабораторных животных наиболее чувствительные к лептоспирозу золотистые хомяки, морские свинки и сосунки кроликов. Заболевания у этих животных вызывают свежевыделенные штаммы лептоспир некоторых серогрупп. Лабораторные штаммы лептоспир обычно теряют свою вирулентность.

Микоплазмы принадлежат к классу Mollicutes, семей Mycoplasmata-ceae, Acholoplasmataceae, Spiroplasmaceae.

Морфология. Микоплазмы — мелкие полиморфные бактерии размером 0,3—0,8 мкм, не образуют спор, неподвижные, грамнеотрицательные. Форма их может быть яйцевидной, коккобацилярной, нитевидной, ветвистой. В поздней фазе роста образуются цепочки коккоподобных телец. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, покрыты трехслойной цитоплазматической мембраной толщиной 7,5—10 нм; в цитоплазме есть ДНК и РНК, рибосомы и другие клеточные компоненты, в которыхсодержится холестерин. Микоплазмы хорошо окрашиваются за Романовским — Гимзой.

ПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ И ЗАБОЛЕВАНИЯ,  КОТОРЫЕ  ОНИ ВЫЗЫВАЮТ У ЧЕЛОВЕКА

Систематика. Грибы отнесены к растительным гетеротрофным нефото-синтезирующим организмам-еукариотам,  что не имеют хлорофилла. Тип грибов (Fungi s. Mycetes) насчитывает свыше 100 000 видов,  объединенных в классы Zygomycotina,  Ascomycotina,  Basidiomycoina,  Dеuteromycotina (несовершенные грибы),  которые,  в свою очередь,  разделяются на подклассы,  порядки,  семейства,  роды,  виды; внутри последних есть штаммы. Среди грибов есть сапрофиты,  паразиты и факультативные паразиты растений,  животных и человека. Около 100 видов грибов могут вызывать заболевания у  людей или животных.

Форма клеток у молодых культур круглая,  яйцевидная или удлиненная,  в зрелых — грушевидная,  булавовидная,  веретенообразная,    амебовидная.

По строению грибы похожие на водоросли,  они имеют дифференцированное ядро (одно или несколько),  клеточную стенку и цитоплазматичну мембрану. Цитоплазма у молодых культур гомогенная,  у зрелых — зернистая,  в цитоплазме есть митохондрии,  комплекс Гольджи,  вакуоля,  разные включения (гликоген,  волютин,  липиды,  кристаллы органических солей,  пигменты).

Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий,  построенный из разветвленных бесцветных нитей (гиф) длиной 4— 70 мкм и диаметром 1—10 мкм. У одних видов грибов мицелий состоит из нерасчленяющейся клетки (Мисог),  у других (высших грибов) – многоклеточный; у дрожжеподобных грибов (Candida) есть псевдомицелий.

Морфология клеточных элементов грибов очень многообразна,  особенно в культурах на разных питательных средах; тканевые формы патогенных грибов менее полиморфны,  они значительно отличаются от культуральных,  что учитывают при лабораторной диагностике микозов.

Грибы размножаются делением,  прорастанием,  почкованием и спороношением. Самой частой формой размножения является прорастание,  которое сопровождается выпячиванием стенки и протопласта за ходом или по сторонам мицелия. Побег отмежевывается от материнской клетки перегородкой,  потом образуется ветвистая грибница. Достаточно часто грибы   размножаются   почкованием.

Спорообразование является средством не только размножения,  но и распространения грибов во внешней среде. Споры разделяются на внешние и внутренние. Внешние,  или екзоспоры, образуются на грибнице,  по сторонам или на концах ее мицелия. Ендоспоры у совершенных грибов является результатом полового процесса, созревают они в асках (аскомицеты),  спорангиях (мукор и др.).

 

У несовершенных  грибов есть талоспоры,  которые образуются в результате превращения отдельных веточек мицелия в специальные споры (артроспоры,  бластоспоры, конидии, алейрии, гемиспоры).

Патогенез заболевания у человека. При благоприятных условиях патогенные грибы в виде спор или фрагментов мицелия проникают в ткани и потом размножаются. Инкубационный период длится от нескольких суток до нескольких месяцев. Чаще всего повреждаются кожа,  волосы и ногти (дерматофиты); легкие (кандидоз,  бластомикоз,  плесневые микозы); слизистые оболочки (кандидоз,  риноспоридоз); лимфоидно-макрофагальная система и внутренние органы (гистоплазмоз); лимфатические узлы,  кожа (споротрихоз). При некоторых микозах поражаются кожа и внутренние органы,  развиваются генерализовани процессы.

Определенную роль в развитии микозов играют другие патогенетические факторы. Дерматофития поражает главным образом детей дошкольного и школьного возраста; к кандидозам наиболее восприимчивые новорожденные и дети раннего возраста. Нарушение обмена веществ,  наличие аномалий развития,  предопределенных гормональными расстройствами,  недоношенисть плода способствуют возникновению кандидозов.

К условиям,  которые содействуют развитию микозов,  принадлежат гипо- и авитаминоз,  дисбактериоз,  гипергидроз (избыточная потливость),  перенесенные острые и хронические заболевания крови,  злокачественные опухоли,  травмы,  особенно при хро-момикози,  споротрихози,  нерациональная антибиотикотерапия при разных инфекционных заболеваниях.

За характером первичной локализации патогенных грибов,  патогенезом и клиническими проявлениями выделяют четыре группы микозов: 1) кератомикозы (разноцветный лишай,  узловатая трихоспория); 2) дерматофития (эпидермофития стоп,  рубромикоз,  трихофитии,  микроспории); 3) кандидоз (поверхностный,  хронический,  висцеральний); 4) глубокие микозы (бластомикозы,  гистоплазмоз,  кокцидиоидоз,  споротрихоз).

 

Морфологические особенности различных грибов

В микробиологической практике важное значение имеют сложные методы окрашивания,  с помощью которых можно обнаружить многообразные клеточные

Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

 Методы стерилизации и дезинфекции.

Бактериологический метод является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. Для этого широко используются питательные среды, на которых выращивают исследуемые микроорганизмы.

Главный метод в борьбе с инфекционными болезнями – профилактический. В связи с этим в деятельности медицинских заведений большое значение имеет предупреждение проникновения возбудителей заболеваний в организм человека или другие объекты. Это проводится методами микробной деконтаминации. Основные из них – стерилизация, дезинфекция, антисептика и асептика. Бактериологический метод один из основных в диагностике большинства инфекционных заболеваний. Характеристика колоний – важная составная часть работы бактериолога, ведь микроорганизмам каждого вида свойственные свои особенности роста.

 

Физиологические и биохимические особенности микроорганизмов положены в основу их систематики. Они важны для изучения механизмов патогенного действия, культивирования, дифференцировки и идентификации отдельных микроорганизмов, а также для разработки биотехнологии производства вакцин, антибиоти­ков и других биологически активных продуктов.

 

МЕТАБОЛИЗМ

Как известно, метаболизм представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов — ката­болизма, или энергетического метаболизма, и анаболизма, или пластического (конструктивного) метаболизма.

У прокариот, так же как у эукариот, в процессе ферментатив­ных катаболических реакций происходит выделение энергии, ко­торая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе фермента­тивных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге монтируются биополимеры — состав­ные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и ката­болизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

 

ИСХОДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ АНАБОЛИЧЕСКИХ И КАТАБОЛИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ. ПИТАНИЕ

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выра­женным разнообразием. В качестве питательных веществ ми­кробные клетки используют различные органические и минераль­ные соединения.

Источники углерода и типы питания. Все микроорганизмы по своей способности усваивать разнообразные источники углерода делятся на две группы — автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (лат. autos — сам, trophe — питание) синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО₂ как единственного источника углерода. Гетеротрофы (лат. heteros — Другой, «питающийся за счет других») не могут существовать только за счет ассимиляции СО₂. Они используют разнообразные органи­ческие углеродсодержащие соединения — гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, реже углеводороды. Многие микроорга­низмы в качестве источника углерода используют аминокислоты, органические кислоты и другие соединения.

Источники энергии и доноры электронов. В зависимости от источников энергии и природы доноров электронов. микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислитель­но-восстановительных реакций. К фототрофам относятся исклю­чительно сапрофитные микроорганизмы. В патологии человека ведущую роль играют хемосинтезирующие микроорганизмы.

В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на хемолитотрофы (хемоавтотрофы) и хемоорганотрофы   (хемогетеротрофы).  

Источники азота. Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии) или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов. Другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из глюкозы и солей аммония, называются прототрофами. В отли­чие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из указанных соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в гото­вом виде из” окружающей среды или организма хозяина (чело­века, животного). Ауксотрофами чаще всего являются патоген­ные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода, всем микроорганизмам для биосин­тетических реакций необходимы соединения, содержащие фос­фор, серу, а также ионы Mg, К, Са, Fe и другие микроэлементы.

 

Типы питания бактерий

 

 

 

ФАКТОРЫ РОСТА

К факторам роста относят аминокислоты, пуриновые и пири-мидиновые основания, липиды, витамины, железопорфирины (гем) и другие соединения. Некоторые микроорганизмы самос­тоятельно синтезируют необходимые им ростовые факторы, дру­гие получают их в готовом виде из окружающей среды. Потреб­ность того или другого микроорганизма в определенных ростовых факторах является стабильным признаком, который использует­ся для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовления питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Аминокислоты. Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или несколь­ких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например клостридии — в лейцине, тирозине, стрептококки — в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называют­ся ауксотрофными по тем аминокислотам или другим соедине­ниям, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факто­рами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотис­тые основания нужны для роста стафилококков и других бакте­рий, В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов — жирные кислоты, нужны для роста некоторых стрептококков, микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим сте-ринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы В, входят в состав ко-ферментов или их простетических групп. Многие бактерии аук­сотрофны по определенным витаминам. Например, коринебакте-рии дифтерии, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амаде, который входит в состав НАД и НАДФ, золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы — тиамине (Тi), входящем в состав пирофосфата, Некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка — в пантотеновой кислоте, являющейся составной частью кофермента КоА и т. д. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы — компоненты цитохромов. Последние необходимы гемо-фильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

 

Дыхание бактерий

Как известно, атмосферный воздух содержит приблизительно 78 % азота, 20 % кислорода и 0,03—0,09 % углекислого газа. Газообразный азот используется только азотфиксирующими бактериями, СО₂— единственный источник углерода — утилизируется литотрофними бактериями. Кислород играет очень важную роль в метаболизме большинства видов бактерий.

Дыхание бактерий — это сложный процесс, который сопровождается выделением энергии, нужной микроорганизмам для синтеза разных органических соединений.

Процессы дыхания у бактерий являются длинной цепью последовательных окислительно восстановительных реакций с участием многих ферментативних систем, которые осуществляют перенесение электрона от системы с наибольшим негативным потенциалом к системе с наибольшим позитивным потенциалом. При постепенном и дробному высвобождении энергии дыхания и при промежуточном перенесении водорода повышается активность реакции клетки. Биохимические механизмы дыхание более подробное описано в учебниках биологической химии.

Представление о дыхании как процесс биологического окисления органических веществ кислородом испытало значительных изменений в связи с открытием анаэробных бактерий, которые не могут существовать в присутствии кислорода. Л. Пастер доказал, что энергия, нужная для жизнедеятельности некоторых видов бактерий, образуется в процессе брожения.

Все бактерии по типу дыхания разделяются на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы.

 

Классификация бактерий по типам дыхания:

Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры) – микроорганизмы, для оптимального роста которых необходимо 21 % кислорода.

Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии) – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода.

Факультативные анаэробы (стафилококки, ешерихии, сальмонели, шигели и другие) – приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот.

Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии) – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост.

Капнеические (возбудитель бруцеллеза бычьего типа) – микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа.

 

Причиной вредного действия на бактерии молекулярного кислорода является образование перекиси водорода (Н₂О₂). Аэробные бактерии расщепляют его с помощью каталази, у анаэробов этого фермента нет.

В процессе дыхания аеробни бактерии окисляют разные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и другие соединения). При полном окислении граммолекули глюкозы высвобождается определенное количество тепла, которое отвечает запасу потенциальной энергии, которая была аккумулирована в молекуле углевода при фотосинтезе его в зеленых растениях из углекислого газа и воды.

При неполном (частичном) аэробном окислении выделяется в соответствии со степенью окисления меньше энергии.

Типичным представителем факультативных анаэробов является Е. colli, которая в углеводной среде сначала развивается как анаэроб, расщепляя углеводы брожениям, потом начинает потреблять кислород и растет как аэроб, окисляя продукты брожения (молочная кислота) к углекислому газу и воде. Факультативные анаэробы имеют значительные преимущества, но они могут жить как в кисневых, так и в бескислородных условиях.

Дыхание анаэробов происходит с помощью ферментации субстрату с образованием небольшого количества энергии. При брожении одной граммолекулы глюкозы образуется гораздо меньше энергии, чем при аеробному дыхании.

Механизм анаэробного дыхания заключается вот в чем. Если окисляемым субстратом являются углеводы, то они предварительно расщепляются с помощью ферментов. Например, глюкоза прохидит фосфорилирование с участием АТФ и АДФ, в результате образуется гексозодифосфат, который под действием фермента альдолази расщепляется на две части: фосфо-глицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. Последний под воздействием оксиизомерази превращается в фосфоглицериновий альдегид; в дальнейшем в результате нескольких последовательных реакций образуется пировиноградная кислота. На этой стадии анаэробная фаза превращения углерода заканчивается. Последующие этапы превращений характеризуются специфичностью и завершаются образованием конечных продуктов. К анаэробным процессам принадлежит спиртное брожение, которое осуществляется дрожжами, молочнокислое, которое вызывается лактобактериями, и маслянокислое, что предопределяется маслянокислими клостридиями.

Наличие облигатных анаэробов объясняет значительную приспосабливаемую живых существ и полноту круговорота веществ в природе. Дышат бактерии с участием ферментов типа оксидаз и дегидраз, которые имеют выраженную специфичность действия. Оксидазный и дегидразный процессы дыхания тесно связаны между собой, дополняя друг друга, но вместе с тем разные как относительно биологической роли, так и относительно ферментов, которые осуществляют эти реакции.

Оксидазный тест используют для дифференциации разных семей и родов микроорганизмов. К оксидазно-позитивным бактериям отнесены нейсерии, синегнойная палочка   и др., к оксидазно-негативным — энтеробактерии.

 

ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микроорганизмы синтезируют разнообразные ферменты, ко­торые принадлежат ко всем 6 известным классам: оксидоредуктазам, трансферазам, лиазам, гидролазам, изомеразам и лигазам. Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и является достаточно стабильным признаком. По­этому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариан­тами бактерии, широко применяется для их идентификации. Вместе с тем ряд ферментов (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, посколь­ку субстратом их действия являются вещества, входящие в сос­тав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты микроорганизмов локализуются в их цито­плазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве, другие, например гидролазы, выделяются в окру­жающую среду. На этом основано деление ферментов на экзо-и эндоферменты. Функциональное назначение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений, которые затем транспортируются в микробную клетку. Некоторые ферменты, локализованные в ци­топлазме, функционируют независимо друг от друга, другие тес­но связаны между собой, обеспечивая протекание метаболичес­ких реакций в определенной последовательности. Внутриклеточ­ные ферменты, объединенные структурно и функционально, сос,-ставляют мультиферментные комплексы, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазмати­ческой мембране.

Ферменты, которые постоянно синтезируются в микробных клетках в определенных концентрациях, называют консти­тутивными.  К ним относятся ферменты гликолиза. Ферменты, концентрация которых резко возрастает в зависимости от наличия соответствующего субстрата, называют индуцибельными («индукция субстратом»). К ним относятся фер­менты транспорта и катаболизма лактозы — галактозидпермеаза, р-галактозидаза и галактозидацетилтрансфераза, фермент, раз­рушающий пенициллин, — β-лактамаза. В отсутствие субстрата они находятся в бактериальной клетке в следовых концентра­циях, а при наличии соответствующего индуктора их количество резко возрастает.

Функциональная активность ферментов и скорость фермента­тивных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм и прежде всего от температуры среды и ее рН. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являют­ся температура 37 °С и рН 7,2—7,4.

Особенности бактериальных ферментов

1.ГИДРОЛАЗЫ                       АДАПТИВНЫЕ                       ЭКЗОФЕРМЕНТЫ

2.ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ       КОНСТИТУТИВНЫЕ            ЭНДОФЕРМЕНТЫ

3.ИЗОМЕРАЗЫ

4.ТРАНСФЕРАЗЫ

5.ЛИАЗЫ

6.ЛИГАЗЫ

 

Практическое использование ферментативных свойств микроорганизмов

Микроорганизмы принимают участие в круговороте азота (гниение), углерода (брожение), серы, фосфора, железа и других элементов, которые имеют важное значение в жизнедеятельности организмов. Благодаря ферментативним процессам образовались лечебные грязи и рапы Микроорганизмы применяют как индикаторы для выявления процессов гидролиза в морях и океанах, определения потребностей почвы в удобрениях, точного количества витаминов, аминокислот и других веществ, которые не поддаются  выявлению химическими  аналитическими  методами.

Определенные  виды микроорганизмов синтезируют антибиотики, ферменты, гормоны, витамины, аминокислоты, которые используются в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. Освоен микробиологический синтез белков с помощью специальных видов дрожжей.

Некоторые почвенные бактерии способны обезвредить (разрушать) определенные пестициды, которые применяются для борьбы с вредными для сельскохозяйственных растений насекомыми. Водородные бактерии могут быть использованы для производства кормового белка выращиванием на мочевине или аммонии сульфата. Отдельные виды бактерий применяют для борьбы с образованием метана в шахтах

Большого значения предоставляют специфическому ферментативному свойству патогенных бактерий, на основе которого определяют видовую принадлежность возбудителей. Многие бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты или кислоты и газа, а белки — с образованием индола, аммиака, сероводороду и др. Ферментативные особенности микроорганизмов используют при изучении микрофлоры почвы, воды и воздуха.

 

ТРАНСПОРТ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

 

Основные механизмы питания бактерий:

1.                 Пассивная диффузия

2.                 Облегченная диффузия

3.                 Активный транспорт

4.                 Транслокация химических групп

5.                 Ионный транспорт

 

Пассивная диффузия функционирует тогда, когда создается градиент концентрации вещества внутри бактериальной клетки и внешне. Она происходит пассивно, потому что не требует затрат энергии.

Облегченная диффузия осуществляется за счет особенных белков – пермеаз, которые содержатся в цитоплазматичній мембране. Этот процесс также не требует энергетического обеспечения.

 

Однако большинство питательных веществ,  метаболітів, ионов проникают в клетку с помощью активного транспорта. Его также обеспечивают білки-пермеази, но они являются  высокоспецифическими и способные переносить только определены субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии, которую генерирует  клетка, потому возможен перенос и против градиента концентрации вещества. Если этому процессу предшествует определенная химическая модификация  молекулы, его называют транслокацией химических групп. Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.

 

Транспорт питательных веществ

Впитывание клетками питательных веществ — достаточно сложный процесс. Одноклеточным самым простым свойственный голозойний тип питания, которое характеризуется заглатыванием твердых частиц еды, перевариванием и превращением их в растворимые соединения. Бактериям, водорослям, грибам, растениям свойственный голофитный тип питания; они поглощают питательные вещества в растворенном виде.

Однако это отличие несущественно, поскольку клетки самые простые, равно как и растительных организмов, используют растворимые в воде или клеточном соке Питательные субстраты, а многие бактерии и грибы могут усваивать твердые Питательные вещества, предварительно расщепляя их внешним перевариваниям с помощью екзоферментів. При диффузии растворенное вещество перемещается из зоны высокой концентрации за пределами тела бактериальной клетки в организм бактерий до тех пор, пока концентрация не станет одинаковой.

Прохождение растворителя через цитоплазматичну мембрану бактерий из зоны низшей концентрации растворенного вещества в зону высшей концентрации происходит в результате осмоса. Градиент концентрации и осмотические силы, которые действуют с обеих сторон цитоплазматичної мембраны, очень разнообразные и зависят от разницы концентрации многих веществ, которые есть в клетке и питательной среде. Перенесение растворенных веществ из питательной среды в клетку может осуществляться втягиваниям их вместе с растворителем при условии достаточной пористости цитоплазматичної мембраны. Цитоплазматична мембрана состоит из липидных и белковых молекул, расположенных в определенной последовательности. Заряженные группы молекул своими концами направленные к поверхности мембраны. На заряженных концах адсорбируются слои белка, которые состоят из белковых цепей и образуют сплетение на внешней и внутренней поверхностях цитоплазматичної мембраны. Высокое избирательное свойство, которое дает возможность клеткам бактерий отличать одни вещества от других, связано с наличием ферментных систем, локализованных на поверхности клеток. Благодаря действию этих ферментов нерастворимые в цитоплазматичній мембране вещества становятся растворимыми.

Цитоплазматическая мембрана играет важную роль в метаболизме бактерий. Она должна свойство быстро изменять свою проницаемость для разных веществ и тем самым регулировать поступление их в клетку и деление в ней, а также влиять на ход реакций, в которых эти вещества принимают участие.

В процессе питания бактерий различают пассивное и активное перенесение разных веществ и ионов. При пассивном перенесении поток веществ двигается в соответствии с разницей концентраций или электрохимических потенциалов. Активное перенесение веществ происходит в результате генерирующей в клетке энергии по типу «биологических насосов».

В регуляции важнейших биологических процессов первостепенную роль играют универсальные циклические нуклеотиди, а также ионы калию, натрию, кальцию, магнию, перенесение которых происходит в результате разнишь в зарядах поверхности цитоплазматичної мембраны и окружающее микроорганизмы среды, причем роль переносчиков, как считают, выполняют жирорастворимые вещества X и Y; при этом образуются соединения с ионами калию и натрию (КХ и NAY), которые могут дифундувати через оболочки клеток. Из цитоплазматической мембраны некоторых микроорганизмов выделены белки, которые принимают участие в транспортировке аминокислот, а также белковые системы, ответственные за перенесение некоторых сахаров вообще и глюкозы в частности.

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

Под ростом клетки понимают координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки. Термином «размно­жение» обозначают увеличение числа клеток в популяиЩ! Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. Грибы размножаются путем спорообра­зования.

При размножении микробной клетки наиболее важные про­цессы происходят в ядре (нуклеоиде), содержащем всю гене­тическую информацию в двунитевои молекуле ДНК- Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, обеспечиваю­щим равномерное распределение генетического материала меж­ду дочерними клетками. Надежность процесса репликации и пра­вильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечи­вается связью ДНК с цитоплазматической мембраной.

Репликация начинается в определенной точке (локус) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлени­ях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, равными 1—2 тыс. нуклеотидов, которые «сшива­ются» специальным ферментом лигазой.

Параллельно с репликацией ДНК начинается образование межклеточной (поперечной) перегородки. Вначале с обеих сто­рон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматичес­кой мембраны. Затем между ними синтезируется пептидогликан. Этот процесс чувствителен к действию некоторых антибиотиков (пенициллинов), ингибирующих синтез пептидогликана.

В период репликации ДНК и образования перегородки мик­робная клетка “непрерывно растет. Наряду с пептидогликаном синтезируются биополимеры, входящие в состав цитоплазмати­ческой мембраны, рибосом и цитоплазмы. На последней стадий дочерние клетки отделяются друг от друга. В этот период у грамотрицательных бактерий синтезируется наружная мембрана, которая встраивается между двумя слоями пептидогликана меж­клеточной перегородки. В том случае, когда разделившиеся бак­териальные клетки сохраняют межклеточные связи, образуются цепочки, состоящие из клеток шаровидных или палочковидных форм (стрептококки и стрептобактерии).

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИИ НА ЖИДКИХ И ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.

ФАЗЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ

Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью размножения по сравнению с другими прокариотами. Скорость их размножения, помимо видовой принадлежности, зависит От состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид ко­лоний у многих бактерий настолько характерен, что может слу­жить одним из дифференциальных признаков для их идентифика­ции. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, фор­ме, поверхности, окраске, прозрачности и др. Однако эти призна­ки могут изменяться в зависимости от условий культивирования.

На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помут­нения, либо осадка.

Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возрас­та, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем их колонии образуются через 18—20 ч либо через 3—5 нед соответственно.

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размно­жения бактериальных клеток.

Динамика развития бактериальной популяции представлена на рис.

I   — исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бак­териальных клеток не увеличивается.

II— лаг-фаза, или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но ско­рость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продол­жительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды.

III — лог-фаза,   или  логарифмическая   (экспоненциальная), фаза отличается максимальной скоростью раз­множения клеток и увеличением численности бактериальной по­пуляции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколь­ко часов.

IV — фаза отрицательного ускорения харак­теризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удли­нением периода генерации. Это происходит в результате истоще­ния питательной среды, накопления в ней продуктов метабо­лизма и дефицита кислорода.

Максимальная стационарная фаза характе­ризуется равновесием между количеством погибших, вновь обра­зующихся и находящихся в состоянии покоя клеток. Графи­чески максимальная стационарная фаза изображается в виде прямой линии, параллельной оси абсцисс. При этом количество живых бактерий в популяции обозначают как их максимальную (М) концентрацию в единице объема питательной среды. Данный признак является достаточно стабильным для определенного вида бактерий в стандартных условиях.

VI — фаза логарифмической гибели бактерий происходит с постоянной скоростью и сменяется VII— VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

 

Допустимо  выделять и четыре фазы.

Основные фазы роста микробной популяции  на жидких питательных средах.

 

1.     начальная (лаг-) – 1,

2.     экспоненциальная (або логарифмическая ) – 2 ,

3.     стационарная – 3

4.     отмирания – 4

 

 

ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточ­ных паразитов — риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и по­лучение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных за­болеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиоло­гическом производстве вакцин, антибиотиков и других биоло­гически    активных    продуктов    микробной    жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответ­ствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в те­чение 1—2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша — в 2—3 сут, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 нед.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания ис­пользуют метод глубинного культивирования, который заключа­ется в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотех­нологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами, в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокис-лый натрий и др.). уменьшающие окислительно-восстановитель­ный потенциал.

 

Выращивание микроорганизмов

Питательные среды должны быть такими, что легко усваиваются, с определенным составом азотистых веществ, углеводов, витаминов и соответствующей концентрацией солей, изотоническими, стерильными, иметь буферные свойства, оптимальную вязкость и определен окислительно восстановительный потенциал.

Микроорганизмы, которые нуждаются в высоких концентрациях солей, называют галофильными. Они распространены в морях, океанах, соленых озерах. К ним принадлежат некоторые патогенные для человека виды (Vibrio parahaemolyticus и   др.).

В течение всей истории микробиологии питательные среды постепенно совершенствовались. В допастеровский период как среды для выращивания микроорганизмов применяли только настои и отвары. Л. Пастер и К. Негели внедрили в практику культивирования безбелковые  среды.

Р. Кох и Ф. Леффлер для выращивания бактерий использовали мясную воду, пептон и натрия хлорид. Эта среда являет собой мясо-пептонный бульйон (МПБ), из которого готовят мясо-пептонный агар (МПА), добавляя  1—2 %  агара.

Агар — твердый волокнистый материал, который добывают из некоторых водорослей. В водных растворах он образует густой гель (студень). Агар состоит из 70—75 % полисахаридов, 2—3 % белков и других азотсодержащих веществ, 2—4 % золы. Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества — агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при нагревании и охлаждается при комнатной температуре. Его выпускают в виде бесцветных пластинок или порошка. Благодаря свойству агара предоставлять питательному субстрату при охлаждении консистенцию густого геля и высокой стойкости к ферментативному действию микроорганизмов его широко применяют при изготовлении полужидких, плотных и сухих питательных сред.

Разработана методика изготовления синтетического полимерного материала, который используется для приготовления густых питательных сред и с успехом заменяет естественный дефицитный агар.

Требования к питательным средам. Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их разнообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды. Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения, белковые гидролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.

Среды должны быть сбалансированными по микроэлементному составу и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты.

Допускается применение веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсинообразование микробов (отдельные аминокислоты, твіни, активирован уголь и тому подобное). Важной является стабилизация оптимума рН среды, его высокой буферности и уровень окислительно восстановительного потенциала (Еh), который для аэробных микроорганизмов достигает свыше 0,08 В, а для анэробных бактерий колеблется в пределах 0,12-0,60 В.

Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть изотоническими, прозрачными и обязательно стерильными.

 

Oсновные требования к питательным средам:

1.     прозрачность,

2.     стерильность

3.     лёгкая усвояемость

4.     определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

5.     изотоничность,

6.     определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

 

Основные питательные среды. Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

Среды разделяются на естественные и искусственные. Как естественные используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань. Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 % агара. Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.

 

В зависимости от потребностей бактериологов питательные среды разделяются на пять основных групп.

Первая группа – универсальные (простые) среды. К ним принадлежат мясо-пептонний бульйон (МПБ) и мясо-пептонний агар (МПА). За своим составом, наличием питательных веществ они пригодны для культивирования многих видов бактерий.

Вторая группа – специальные среды. Они используются в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агары, сывороточный бульйон, асцитический бульйон, асцит-агар и другие.

Третья группа – элективные среды, на которых микроорганизмы определенного вида растут быстрее, более интенсивно, опережают в своем развитии другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.

Четвертая группа  селективные среды, которые благодаря добавлению определенных компонентов (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. да, среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновый агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).

Пятая группа – дифференциально–диагностические среды. Это большая группа сред, которые позволяют определить определенные биохимические свойства микроорганизмов и проводить их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).

 

Классификация питательных сред

 

 

 

 

 

 МПА                                             

 

  Среда Эндо.

 

 

 Среда  Плоскирева.                    

 

Среда Левина

 

 

 

Среды Гисса.                                

 

Желточно-солевой агар

 

 Кровяной МПА

 

 

 Разжижение желатины            

 

 

 Тест на выявление индола.

Слева – незасеянный контроль (отрицательный  тест); справа – отрицательный результат, в центре – положительный тест

 

 

Все более широкое приложение в микробиологических лабораториях находят многочисленные коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов, изготовленные на основе разнообразных дифференциально диагностических сред. В одном варианте выполнения они вносятся в специальных полистиролу или другие планшеты и высушиваются для удаления воды. К ним принадлежат системы АРЕ-20 для идентификации стафилококков, коринебактерий, энтеробактерий, анаэробных микробов, Enterotest 1 и 2, российская система ПБД (пластина биохимическая дифференциальная) для идентификации ентеробактерій. Неплохо зарекомендовали себя тест-системы Roche и другие.

 

Биохимическая идентификация бактерий с помощью тест-систем

Другие варианты подобных тест-систем предусматривают адсорбцию дифференцирующих субстратов на бумажных или полимерных носителях. Среди них распространены системы Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Подобные системы удобны в пользовании, они позволяют одновременно исследовать широкий спектр микробных признаков, всегда готовые к использованию в любых микробиологических лабораториях, они простые и надежные, требуют небольших объемов посевного материала, потому экономят лабораторную посуду, пипетки. Компьютерная обработка полученных результатов дает возможность быстро определить и оценить вид неизвестного возбудителя.

Изготовление питательных сред. В состав любых сред входят преимущественно натуральные животные или растительные продукты и компоненты – мясо, рыбная мука, яйца, молоко, кровь, дрожжевой экстракт, картофель и тому подобное. Из них готовят специальные полуфабрикаты в виде экстрактов, настоев, ферментативних и кислотных гидролизат ів (мясная вода, дрожжевой экстракт, триптичний гидролизат  Хоттингера, пептон и другие), которые являются основой для последующего конструирования питательных сред. Кроме этого, в питательные среды добавляют разные неорганические соли в зависимости от потребностей микробной клетки. Как правило, концентрация хлорида натрия составляет 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, другие соли добавляются из расчета 0,001 г/л. В необходимых случаях к составу вводят углеводы (сахара, многоатомные спирты), аминокислоты в концентрации 0,5-1,0 %, а также витамины (до 0,001 мг/мл).

Для обеспечения необходимой плотности среды используют агар-агар, который получают из морских водорослей. Он является удобным и необходимым компонентом сред, поскольку не потребляется бактериями как ростовой субстрат. Образовывая в воде гель, он плавится при температуре возле 100 °С, а густеет при 40 °С. Источником желатина являются богатые на коллаген субстраты. Среди них хрящи, сухожилия, кости и тому подобное. Гель, который получают в результате использования желатина, плавится при температуре возле 32-34 °С и застывает при 28 °С. Однако многочисленные микроорганизмы способны расщеплять желатин, потому использование последнего как наполнителя среды считается нецелесообразным. Чаще всего такие среды с желатином применяются для определения протеолитических свойств бактерий.

Изготовление питательных сред является сложным динамическим процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде согласно с прописью добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью іонометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их освітляють осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Да, среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100  °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115-120  °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативний белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем витримування их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С.

Приводим примеры изготовления некоторых простых питательных сред, которые чаще всего используются в микробиологической практике и могут быть основой для изготовления более сложных.

Мясная вода. Для ее изготовления используют свежую говядину, которую предварительно очищают от жира, фасций, сухожилий и тому подобное, разрезают на мелкие куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, размешивают и на сутки оставляют в прохладном месте. Полученный настой кипятят в течение 30-60 мин, периодически снимая накипь, а затем отстаивают. Отделяют жидкость от фарша, фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно и доливают водопроводной водой к первичному объему, потом разливают в флаконы и стерилизуют при 1 атмосфере (температура 120  °С) в течение 30 мин. Стерильная мясная вода прозрачна, имеет желтоватый цвет, а на стенках флакона и на дне образуется осадок из белков, которые свертывались. Потому при последующем использовании среды его опять фильтруют. Активная реакция среды – 6,2.

Мясо-пептонный бульйон (МПБ). Чтобы изготовить МПБ, к мясной воде добавляют 1 % пептону и 0,5 % хлориду натрия, устанавливают необходимое рН с помощью 20 % раствору NAOH и кипятят 30-40 мин, постоянно перемешивая. Бульйон фильтруют через бумажный или полотняный фильтры, разливают в флаконы, пробирки, проверяют активную реакцию среды и стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К мясо-пептонного бульйону добавляют мелко нарезанный агар-агар (2-2,5 %). Полученную смесь кипятят к растворению агар-агара, фильтруют, устанавливают рН и разливают в флаконы. Стерилизацию проводят в течение 20 мин при температуре 120 °С.

Среды с кровью, сывороткой или асцитической жидкостью. Поскольку эти среды не могут долго сохраняться, их готовят непосредственно перед применением. Для этого к растопленному и охлажденному до 45-50 °С МПА додают стерильно 5-10 % свежей или дефибринированной крови барана, кролика или другого животного. Флаконы с агаром тщательным образом перемешивают и разливают в чашки Петри, следя за отсутствия пены.

Идентично готовят сывороточный (5-10 % сыворотки крови) или асцитичный агар (25 % асцитичной жидкости).

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает бактериологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

Для культивирования бактерий широко применяют безбелковые среды, в которых хорошо растут много органотрофних, в том числе патогенных видов бактерий. В эти среды входят много компонентов.

Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность детальнее дифференцировать бактерии за характером их  биосинтеза.

Для дифференциации прототрофних и ауксотрофних бактерий широко используют селективные среды. Прототрофы растут на минимальной среде, которая содержит только соли и углеводы, поскольку они сами могут синтезировать нужные им для развития метаболиты, тогда как ауксотрофы нуждаются в среде, которая содержит определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.

На густых питательных средах бактерии образуют разные по форме и величине колонии — видимые скопления микроорганизмов одного вида, которые формируются в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, их поверхность — гладкой (S-фор-ми), шершавой (R-формы), исчерченной, бугорчатой, края — ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, деревовидная. По  величине (диаметру) колонии разделяются на большие (4— 5 мм, средние (2—4 мм), мелкие (1—2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Колонии бактерий

 

Колонии отличаются и за консистенцией, плотностью, цветом. Они могут быть прозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными, влажными, сухими и слизистыми. В жидких питательных средах бактерии растут с образованием диффузной мути, пленки, осадка, которые видно невооруженным глазом.

В лабораторных условиях бактерии выращивают в пробирках, чашках Петр и, в флаконах.

В институтах, которые изготовляют вакцины и сыворотки, микроорганизмы культивируют глубинным способом, который дает возможность более рационально использовать питательный субстрат и получать бактериальную массу в большом количестве. Культуры выращивают в реакторах с большим объемом питательной среды. Аэрации достигают пропусканием струи воздуха через толщу среды. Метод аэрации используют и для лабораторных исследований с целью быстрого выращивания аеробних бактерий и изучения некоторых процессов обмена веществ.

В условиях лаборатории анаэробы выращивают в стационарных анаеростатах или портативных мікроанаеростатах с разжижением воздуха до 1—8 мм или в вакуум-ексикаторах.

Культивирование анаэробов возможно в условиях замещения кислорода атмосферным азотом или другим инертным газом. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью вазелинового масла, которое вмещают слоем поверх питательной среды, или высеиванием материала в толщу агара. Применяют специальные стеклянные трубки, которые заполняют МПА и запаивают на концах. Выращивают анаэробы обычно в средах Китта — Тароцци, Вильсона — Блера  и   др.

 

 

Методы обеззараживания биологических объектов.

 

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Температура. В зависимости от температурных параметров выделяют три группы микроорганизмов — термофилы, психрофилы и мезофилы.

Для термофилов (теплолюбивых) зона оптимального роста равна 50—60 °С, верхняя зона задержки pocfa — 75 °С, нижняя — 45 °С. Термофилы не способны размножаться в орга­низме теплокровных животных, поэтому медицинского значения не имеют.

Психрофилы (холодолюбивые) имеют зону оптимально­го роста в пределах 10—15 °С, максимальную зону задержки роста 25—30 °С, минимальную 0—5 °С. Психрофилы являются свободно живущими организмами или паразитами холоднокров­ных животных, но некоторые виды, например иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывают заболе­вания у человека. Размножаясь в пищевых продуктах при температуре бытового холодильника, эти бактерии более виру­лентны при низких температурах.

Мезофилы обитают главным образом в организме теплокров­ных животных. Оптимальная температура их роста колеблется в пределах 30—37 °С, максимальная 43—45 °С, минимальная 15—20 °С. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются.

 

Дифференциация микроорганизмов по температурного режима

 

Температурные зоны гибели микроорганизмов широко вариируют. Вегетативные формы погибают при температуре 60— 80 °С в течение часа, при 100 °С — мгновенно. Споры и цисты устойчивы к температуре 100 °С, гибнут при 130 °С и более длительной экспозиции (до 2 ч). Нижняя температурная грани­ца гибели микроорганизмов варьирует от 20 °С (возбудители кори, коклюша, сифилиса, менингококковой и гонококковой инфекции) до абсолютного нуля. Повреждающее действие вы­сокой температуры связано с необратимой денатурацией фер­ментов микроорганизмов, низкой — с разрывом клеточной мем­браны кристаллами льда и приостановкой метаболических про­цессов.

Ионизирующая радиация. Повреждающая сила радиации зависит прежде всего от ее вида, в меньшей степени от вида мик­роорганизма. Ионизирующая радиация обладает мощным прони­кающим и повреждающим клеточный геном действием. Однако летальные для микробных клеток дозы на несколько порядков выше, чем для животных и растений.

Повреждающее действие УФ-излучения, наоборот, в большей мере выражено в отношении микроорганизмов, чем животных и растений. УФ-лучи в относительно небольших дозах вызывают повреждения ДНК микробных клеток, которые приводят к мута­циям или их гибели. Световое и инфракрасное излучение при интенсивном и длительном воздействии способно оказать повреждающее   влияние  лишь   на   некоторые   микроорганизмы.

Ультразвук. Определенные частоты ультразвука при искус­ственном воздействии способны вызывать деполимеризацию орга-нелл микробных клеток, а также денатурацию входящих в их состав молекул в результате локального нагревания или повыше­ния давления.

Давление. Атмосферное давление даже в сотни атмосфер не оказывает существенного влияния на бактерии. Однако к осмо­тическому давлению, как повышенному, так и сниженному они высокочувствительны. В том и другом случае происходит разрыв клеточной мембраны и гибель микробных клеток (осмотичес­кий шок).

 

Одним из методов консервирования пищевых продуктов есть  сублимация — обезвоживание при низкой температуре и высоком вакууме, которое сопровождается испарением воды, быстрым охлаждением и замораживанием. Лед, который образовался в продукте, легко сублимируется, проходя жидкую фазу. Длительность сохранения пищевых продуктов свыше 2 лет. Сублимацийне сушки обеспечивает сохранения всех цукрив, витаминов, ферментов и других компонентов.

Высушивание в вакууме при низкой температуре не убивает бактерии и вирусы. Этот метод сохранения культур используют в производстве стабильных и с длительным сроком хранения живых вакцин против туберкулеза, чумы, туляремии и других заболеваний.

Лучевая энергия. Разные виды излучения имеют бактерицидное или стерилизующее действие. К ней принадлежат ультрафиолетовое, рентгеновское, альфа-, бета-, гамма- и нейтронное излучение. Наиболее выраженное бактерицидное действие имеет прямой солнечный луч. Ультрафиолетовое облучение влечет образование перекисей, которые действуют на микроорганизмы как окислители, повреждает молекулы ДНК в результате  появления  пиримидиновых димеров.

Опыт использования коротковолнового излучения для дезинфекции палат, обеззараживания инфицированного материала, консервирования пищевых продуктов, приготовления вакцин, обработки помещений операционных, родильных палат и т.д. показал, что оно имеет очень высокое бактерицидное действие. Под воздействием ультрафиолетового излучения с длиной волны 260—300 мкм происходит скорая инактивация вирусов. При этом ультрафиолетовое излучение поглощается  нуклеиновой кислотой вирусов.

Вирусы сравнительно с бактериями менее стойкие против действия рентгеновского та альфа-излучение; бета имеет более выраженную вирулициднисть. В небольших дозах альфа-, бета-, гамма-излучение способствует жизнедеятельности вирусов, а в больших — имеет гиблое действие. Вирусы, патогенные для животных, инактивуються от действия излучения 11 352—72 240 мКл/кг (44 000—280 000 Р). Высокую стойкость против ионизирующего излучение имеют тионови бактерии, которые живут в залежах урановых руд. Некоторые виды бактерий обнаруживали в воде атомных реакторов при дозе ионизирующего излучение 20 000—30 000  грей  (Дж/кг).

Ионизирующее излучение может быть использовано в практике стерилизации пищевых продуктов. Этот метод холодной стерилизации имеет ряд преимуществ: он не изменяет качества продукта в отличие от тепловой стерилизации, при которой наступает денатурация его составных частей (белки, полисахариды, витамины). Лучевую стерилизацию можно применять для обработки биологических препаратов (вакцин, сывороток, фагив и  др.).

Представляет интерес феномен фотореактивации, который заключается в том, что бактерии, предварительно облученные видимым светом, становятся более стойкими против действия ультрафиолетового луча. Если же после обработки ультрафиолетовым лучом завись Е. соlи облучить видимым светом, наступает значительный рост бактерий при высевании на питательные среды.

Высокое давление, ультразвук, механическое сотрясение. Действую высокого атмосферного давления — 10 132,5 — 91 192,5 кПа (100—900 атм) на глубине морей и океанов 1000—10 000 м бактерии переносят легко. Дрожжи хранят свою жизнеспособность при давлению 50 662,5 кПа (500 атм). Некоторые бактерии, дрожжи, плесневые грибы выдерживают давление 303 975 кПа (3000 атм),   фитопатогенные вирусы — 506 625 кПа (5000 атм).

Ультразвук имеет бактерицидные свойства, которые используют для стерилизации пищевых продуктов, изготовления вакцин и дезин фекциї предметов. Механизм бактерицидного действия ультразвуку заключается в том, что в цитоплазме бактерий, которые содержатся в водной среде, образуется кавитационня полость, которая заполняется парами жидкости; в пузырьке возникает давление до 1 013 250 кПа (10 000 атм), что приводит к разрушению цитоплазматичних структур бактериальной клетки. Возможно, что в кавитационных полостях, которые при этом образуются, возникают высокореактивные гидроксильные радикалы.

Определеное значение в обеззараживании воздуха предоставляется аэроионизации. Негативно заряженные ионы пагубно действуют на бактерии.

Эффективное и электрогидравлическое бактерицидное действие на микроорганизмы, что возникает под воздействием физических и химических явлений в результате высокого давления, кавитацийних процессов, ударных волн и ионизации, ультрафиолетового и ультразвукового излучения, импульсного магнитного поля. Это может быть использовано для обезвреживания стоковых вод, дегельминтизации гноя, стерилизации молока, разных соков, пищевых продуктов, а также в производстве инактивированных вакцин, антигенов, для обработки кормовых и пивных дрожжей.

 

Действие химических веществ

 

Противомикробным действием обладают следующие классы химических веществ:

1) галогены и их соединения (йод, йодо­форм, йодинол, йодонат, йодпирон, хлорамин Б, пантоцид),

2) окислители (пероксид водорода, перманганат калия, гидро­пирит),

3) кислоты и их соли (надмуравьиная, оксолиновая, бензойная, салициловая, сорбиновая, борная, пиоцид, тетраборат натрия, перборат натрия),

4) щелочи (аммиак и его соли, бура),

5) спирты (70—80% этанол, 60—70% пропанол),

6) альдеги­ды (формальдегид, уротропин, уросал, кальцекс, циминаль),

7) соли тяжелых металлов — ртути, серебра, меди, свинца, цин­ка, олова,

8) фенол и его производные (резорцин, хлорофен, фенил-резорцин, тимол, салол, бензонафтол),

9) производные 8-оксихинолина (хинозол, интестопан, нитроксолин), 4-хинолона (оксолиниевая кислота, грамурин) и хиноксалина (хиноксидин, диоксидин),

10) производные нитрофурана (фурацилин, фурагин фуразолидон),

11) поверхностно-активные вещества (роккал, хлоргексидин, этоний, декаметоксин, дегмин, цетилпиридиний хлорид, сульфонол, палмитат натрия, цетавлон, дегмицид, полимиксины, грамицидин С, амфолан, твины, спаны),

12) триклозан,

13) длинноцепочечные жирные кислоты,

14) фитонциды,

15) антибиотики,

16) красители (метиленовый синий, бриллиан­товый зеленый, риванол).

 

По механизму действия противомикробные вещества разделя­ются на:

а) деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки бактерий,

б) повышающие проницаемость клеточной мембраны,

в) блокирующие те или иные биохимические реакции,

г) денату­рирующие ферменты,

д) окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов,

е) растворяющие липопротеиновые структуры,

ж) повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции и др

 

В зависимости от физико-химического состава среды, концентрации, длительности контакта, температуры химические вещества по-разному влияют на микроорганизмы. В малых дозах они действуют как раздражители, а в бактерицидных концентрациях парализуют жизнедеятельность бактерий.

 

Поверхностно активные вещества, или детергенты, могут накапливаться на поверхности раздела фаз и влечь резкое снижение поверхностного натяжения, который приводит к нарушению нормального функционирования клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. К бактерицидным веществам с поверхностно активным действием принадлежат жирные кислоты, в том числе и мыла, которые вызывают повреждение только клеточной стенки и не проникают в клетку. Широко используются синтетические детергенты, которые лучше растворяются в воде.

Фенол, крезол и их производные сначала повреждают клеточную стенку, а затем и белки клетки. Некоторые вещества этой группы подавляют функцию коферменту (дифосфопиридиннуклеотиду), который принимает участие у дегидрировании глюкозы и молочной кислоты.

Красители должны свойство задерживать рост бактерий. В основе их действия лежит выраженное родство с фосфорнокислыми группами нуклеопротеидов. К красителям с бактерицидными свойствами принадлежат брильянтовий зеленый, риванол, трипафлавин, акрифлавин и др.

Соли тяжелых металлов (свинец, медь, цинк, серебро, ртуть) вызывают коагуляцию белков клетки. При взаимодействии соли тяжелого металла с белком образуются альбуминат металла и свободная кислота (R—СООН + AgNO₃–> COOAg + HNO₃).

Некоторые металлы (серебро, золото, медь, цинк, олово, свинец и др.) имеют олигодинамичну действую (бактерицидное свойство). Да, например, посуда из серебра, посеребрены предметы, посеребрен песок при контакте с водой предоставляют ей бактерицидных свойств относительно многих видов бактерий. Механизм олигодинамического действия заключается в том, что позитивные заряженные ионы металлов адсорбируются негативно заряженной поверхностью бактерий и изменяют проницаемость их цитоплазматической мембраны. Возможно, что при этом нарушается питание и размножение бактерий. Вирусы также очень чувствительны к солям тяжелых металлов, под воздействием которых они необратимо инактивуются.

Окислители действуют на сульфгидрильные группы активных белков; более сильные окислители вредно влияют и на другие группы (феноловые, тио-этиловые, индольные и аминные). К окислителям принадлежат хлор, который действует на дегидразу, гидролазу, амилазу, протеазу бактерий, в результате чего его широко используют для обеззараживания воды, а также, хлорная известь и хлорамин, что применяются для дезинфекции. Как антибактериальное средство в медицине с успехом применяют йод в виде спиртного раствора, который не только окисляет активные группы белков цитоплазмы бактерий, но и вызывает их денатурацию.

В связи с возможным косвенным действием йода рекомендуется применять в хирургической практике хлоргексидин, который имеет высокую антибактериальную активность относительно как граммположительных, так и грамнегативних микроорганизмов. Его используют для обработки рук персонала, кожи, операционного поля больных, которых оперируют, для дезинфекции инструментов, катетеров, аппаратов ингаляционного наркоза. Хлоргексидин применяют для лечения гнойных ран, промывания операционных ран и полостей.

Окислительные свойства, кроме названных веществ, имеют калию перманганат, перекис водороду и др.

Много видов вирусов стойкие против действия эфира, хлороформа, этилового и метилового спирта, эфирных масел. Почти все вирусы долго сохраняются в растворах глицерина Рингера, Тироде. Вирусы разрушаются под воздействием NAOH, KOH, а также хлорамина, хлорной известки, хлору, других окислителей.

Формальдегид применяют в виде 37—40 % раствору, который достал название формалина. Его бактерицидное действие, как считают, объясняется тем, что он присоединяется к аминогруппам белков и вызывает их денатурацию. Формальдегид убивает как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов. Его применяют для обезвреживания дифтерийного, столбнякового и других экзотоксинов, в результате чего они превращаются в анатоксины. Кроме формальдегида, алкилюючу действие имеет етиленоксид (газ), который применяют для дезинфекции разных  поверхностей.

 

Методы обеззараживания биологических объектов.

 

Главное направление в борьбе с инфекционными болезнями – профилактический. В связи с этим в деятельности лечебных заведений большое значение имеет предупреждение попадания возбудителей заболеваний в организм человека или другие объекты. Это проводится хорошо разработанными и апробированными методами микробной деконтаминации. Основные из них – стерилизация, дезинфекция, антисептика и асептика.

 

 

Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный, свободный от бактерий) – полное уничтожение вегетативных и споровых форм всех микроорганизмов на предметах, материалах, в питательных средах.

В медицинской практике стерилизуют инструменты, перевязочный и шовный материал, операционное белье, лекарственные препараты. В микробиологических лабораториях – питательные среды, пробирки, пипетки, колбы, чашки Петри и тому подобное. Потому перед стерилизацией необходимо уметь подготовить инструменты, посуду, пробирки, пипетки, перевязочный материал и другое.

Инструменты обрабатывают в такой последовательности. Сначала их прополаскивают в проточной воде, потом замачивают в моющем растворе 15 мин, моют в том же растворе 0,5-1 мин, прополаскивают проточной и дистиллированной водой, высушивают в сухожаровий шкафу при 80-85 °С до полного исчезновения влаги.

Пробирки, флаконы, колбы закрывают ватными пробками. Пробирки заворачивают в бумагу по 25-30 штук, а чашки Петри – по 4-5 штук или вмещают в стерилизацийни коробки (биксы). Пастеровские и градуированные пипетки из широкого конца затыкают ватой, обвертывают бумагой или вмещают в картонные или металлические пеналы по 10-15 штук. Питательные среды в колбах, флаконах, пробирках также закрывают пробками.

В лабораторной практике используют такие виды стерилизации: а) высокой температурой; бы) механическая (холодная); в) химическими веществами и газами.

Существуют много способов стерилизации с помощью высокой температуры. Эффективность такой стерилизации при нагревании характеризуется показателем D – временами, который необходим при данной температуре, чтобы получить десятикратне уменьшение популяции бактерий (на 90 %). Его величина измеряется, как правило, в минутах.

Прожаривание в пламени горелки – быстрый и абсолютно надежный способ. Им стерилизуют бактериальные петли, пинцеты, предметные и покровные скельця.

Кипячения в течение 40 мин в специальных стерилизаторах используют для обработки хирургических инструментов, шприцев, игл, резиновых трубок. Для повышения температуры кипения и устранения жесткости воды добавляют 1 % бикарбонатунатрию. Этот метод не обеспечивает полной стерилизации, поскольку споры некоторых видов бацилл и клостридий выдерживают кипячение в течение нескольких часов.

Стерилизацию сухим жаром в сухожаровий шкафу проводят при 160 °С в течение 120-150 мин, или при 180 °С – 45-60 мин после достижения заданной температуры.

Сухожаровой шкаф

 

Стерилизуют преимущественно стеклянную посуду. Преимущество этого метода над другими заключается в том, что не повреждается стекло, не происходит коррозии металлических инструментов. Его можно использовать для стерилизации термостойких порошков и других веществ. Одним из недостатков данного метода есть достаточно длительный срок стерилизации. Кроме того, при высоких температурах может состояться обугливание и загорание ватных пробок, бумаги, в какую завернутую посуду.

Стерилизация паром под давлением – самый надежный метод полного уничтожения бактерий и их спор. Он достигается действием пара, температура которой под давлением более высока, чем при кипячении. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Стерилизация парой под давлением более эффективна, чем действие сухого жара.

Существуют разнообразные электрические автоклавы, которые отличаются между собой за размерами, формой, расположением (вертикальные и горизонтальные), они могут быть с ручным управлением, полуавтоматические и автоматические.

Конструктивно все типы автоклавов представляют собой двустенный крепкий металлический котел цилиндрической формы с крышкой, которая герметически закрывается, что позволяет выдержать высокое давление.

 

Автоклав

 

 Строение автоклава.

 

Внутренняя часть автоклава являются стерилизацийной камерой, в которую помещают материал, который стерилизуется. Она имеет специальный кран для выхода воздуха и манометр  с предохранительным клапаном. Манометр определяет рабочее давление пара в камере, а предохранительный клапан способствует выходу избытка пара с целью предотвращения разрыва автоклава. Дистиллированную воду в водопаровую камеру заливают через специальную лейку, следя за ее уровнем в специальной водомерной трубке. Пар из водопаровой камеры поступает в стерилизационную камеру через специальные отверстия в ее верхней части. Современные автоклавы имеют манометры и автоматические регуляторы включения и отключения тока, держа заданное давление, а следовательно и заданную температуру внутри автоклава. Работа с ним требует сурового соблюдения правил безопасности, какие изложены в инструкции к каждому автоклаву.

Основные правила работы с автоклавом

1. Перед началом работы следует тщательным образом осмотреть автоклав, его контрольно-измерительную аппаратуру, проверить упругость резинової прокладки, крепления крышки стерилизационной камеры.

2. Через специальную лейку к уровню отметки на водомерной трубке в автоклав заливают дистиллированную воду и закрывают кран.

3. Необходимый материал вмещают в стерилизационную камеру и закрывают герметически крышкой автоклава. Желательно следить, чтобы предметы не размещались в автоклаве очень тесно, поскольку между ним должен проходить пар. Иначе они могут остаться нестерильными из-за отсутствия нагрева к необходимой температуре.

4. Открывают кран, который соединяет стерилизационную камеру с окружающей средой, и включают электрический нагрев.

5. После того, как начался процесс образования пара, необходимо удалить воздух из стерилизационной камеры. Для этого пар и конденсат отводят в специальный сосуд с водой или в канализацию. Чистый пар, которая выходит из автоклава с равномерным шипящим звуком, в течение 10 мин пропускают через камеру, а затем закрывают пароотводной кран.

6. Доводят давление пары до уровня, которого требует режим стерилизации. Для этого учитывают соотношение показателей давления манометра и температуры кипения воды (табл.).

 

Зависимость между избыточным давлением пары, температуры кипения воды и длительностью стерилизации

 

7. По завершении цикла стерилизации автоклав отключают. Давление в автоклаве постепенно падает и уравнивается с атмосферным. Тогда открывают выпускной кран и постепенно выпускают избыток пара в сосуд с водой. Несоблюдение этих правил может привести к резкому снижению давления, в результате чего жидкость в пробирках, колбах, которые стерилизовались, бурно закипает, смачивая ватно-марлевые пробки и даже выталкивая их. Такая ситуация нарушает стерильность материала.

В автоклаве при 120 °С в течение 20 мин стерилизуют простые питательные среды (МПБ, МПА), изотонические растворы, белье, перевязочный материал, а при 134 °С – обезвредил заразные материалы, отработанные культуры бактерий в течение 40 мин. Среды с углеводами не выдерживают такой обработки, поскольку они карамелизуються, в связи с чем их стерилизуют текучей парой.

Стерилизация текучим паром (100 °С) проводится в автоклаве с некрученной крышкой. При нагревании пар проникает между вложенными объектами и стерилизует их. Таким способом обрабатывают среды с углеводами. Поскольку одноразовое действие пары не убивает споры, применяют дробну стерилизацию – 3 дня кряду по 30 мин. Те споры, которые не погибли при первом нагревании, прорастают до следующего дня в вегетативные клетки и погибают при второй и третьей обработке.

Для тех веществ, которые не выдерживают 100 °С (белковые жидкости, витамины, некоторые лекарства), применяют тиндализацию – стерилизацию на водяной бане при температуре 58-60 °С в течение часа 5-6 дней подряд. Однако этот метод в настоящий момент широко не применяется, поскольку требует значительных затрат времени на его проведение.

Пастеризацией считают одноразовое прогревание материала к температуре ниже 100 °С, при которой уничтожаются, в первую очередь, вегетативные формы микроорганизмов. Этот способ впервые предложил Л.  Пастер для уничтожения безспорових форм микробов, преимущественно патогенных и условно патогенных видов. Споры при этом остаются живыми, а микроорганизмы, что остались, становятся заметно ослабленными. Метод широко используют в пищевой промышленности, когда при кипячении могут потеряться органолептические свойства продуктов. Так проводят термическую обработку молока, пива, вина, разных соков при 70  °С в течение 30 мин или при 80 °С – 5-10 мин. Пастеризованные продукты сохраняются на холоде.

Свертывания (уплотнение) сыворотки и яичных сред с одновременной их стерилизацией проводят в специальных згортувачах Коха с электрическим подогревом.

 

 

Свертыватель сыворотки

Асептически приготовлены сыворотки и яичные среды в наклоненном положении прогревают однократно при 80-90 °С один час. При подозрении на микробную контаминацию их прогревают при той же температуре три дня кряду.

Механические методы стерилизации широко используются в микробиологических лабораториях. Особенно при тех условиях, когда повышенная температура может разрушить субстраты. Это касается жидких сред и жидкостей, которые содержат белки, витамины, антибиотики, углеводы, летучие вещества и тому подобное. Метод можно применить для очистки бактериальных токсинов, бактериофагов от микроорганизмов. Однако этот метод считается менее надежным сравнительно с классической стерилизацией.

Механическая (холодная) стерилизация проводится с помощью фильтрования через мелкопористые антибактериальные или антивирусные фильтры. Их создают из специальных материалов, пронизанных порами, которые имеют разную форму и идут через фильтр извилисто. Фильтры можно изготовлять из положительно заряженного материала, тогда бактерии, которые несут на поверхности негативный заряд еще и взаимодействуют с ним электростатически, а не только механически в результате разного диаметра бактерий и пор. Чтобы предварительно проверить качество фильтров, используют мелкие тестовые микроорганизмы (Serratia marcescens или Pseudomоnas aeruginosa). Фильтрат высевают на питательную среду и выдерживают при оптимальной температуре в течение 5 дней. При отсутствии роста тестовых бактерий можно применять фильтр для стерилизации.

Промышленность разных стран выпускает самые разнообразные фильтры, которые отличаются по материалу изготовление и диаметром пор. Мембранные или коллоидные фильтры, которые изготовляют из нитроцеллюлозы, представляют собой диски диаметром до 35 мм

 

Фильтр

 

В микробиологических лабораториях часто используют фильтры Зейтца. Они представляют собой пластины (диски или квадраты) толщиной 4-6 мм, которые изготовляют из смеси асбеста и целлюлозы.

Однако эти фильтры имеют ряд недостатков, которые следует учитывать при работе с ними. Во-первых, возможно загрязнение фильтратов посторонними веществами, которые попадают у него из фильтра (щелочи, соли щелочных металлов, волокна асбеста). Во-вторых, асбест в результате своего негативного заряда связывает некоторые вещества из жидкости, которая фильтруется. Кроме того, следует тщательным образом проверять фильтры перед работой, чтобы не использовать те, которые имеют механическую деформацию (трещины, надломы и тому подобное).

Кроме асбестовых, широко используются фарфоровые фильтры, впервые предложенные Пастером и Шамберланом. Их иначе называют свечи Шамберлана. Изготовляют их из каолина и кварцевого песка и предоставляют формы порожнистогоцилиндра, который закрыт из одного конца. Величина пор отражается L1-L13. Фильтры L5-L13 являются антибактериальными.

Другой тип фильтров, которые изготовляют из земли (диатомиту или кизельгуру) инфузории, получил название свеч Беркефельда. За своим внешним видом они подобны цилиндрам, замкнутым из одного из концов. Свечи маркируют буквами V, N и W, что отвечает диаметру пор в пределах соответственно 8-12, 5-7 и 3-4 мкм.

Выпускаются еще и стерилизующие фильтры из стекла „Пирекс” в виде двухслойных дисков. Разделяют фильтры по размеру пор на три основных типа: С, М и Р. Розмир пор у них соответственно составляет свыше 1,7, от 1 до 1,7 и меньше 1 мкм.

Перед работой фильтр закрипляють в специальном держателе. В частности, асбестовые пластинки вмещают между цилиндровой и опорной частью металлического корпуса аппарата Зейтца. Обе части соединяют винтами. Собранный фильтр вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена с боковым отростком. Полностью вмонтированный фильтр заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. Жидкость для фильтрования наливают в металлический цилиндр, соединяют боковой отросток колбы с вакуумным насосом, чтобы создать вакуум в колбе и ускорить фильтрование. Фильтрат в колбе будет стерильным.

Химическим способом стерилизуют изделия из резиновых и полимерных материалов. Для этого используют 6 % раствор перекиси водорода, в который окунают изделия на 6 год при 18 °С и на 3 год при 50 °С. Можно применить раствор дексона с экспозицией 45 мин при 18 °С. По окончании стерилизации изделия дважды прополаскивают в стерильной дистиллированной воде, каждый раз изменяя ее, и переносят корнцангом в стерильный бикс.

Инструменты для эндоскопии и автоматические пипетки можно также стерилизовать спиртом.

Газовый метод стерилизации парами формальдегида, хлороформа, бета-пропиолактона, окисью этилена, окисью пропилена, метилбромида, озоном используют для обеззараживания эндоскопических инструментов, аппаратов для искусственного кровообращения, радиоэлектронного оборудования, пластмассовых изделий, кетгуту и тому подобное. Эффективной зарекомендовала себя смесь окиси этилена и бромистого метила в соотношении 1:1,44. Для проведения стерилизации газом используют специальные плотные камеры, которые герметически закрываются. Для каждого действующего фактора разработаны свои режимы стерилизации. После завершения процедуры газовая смесь выкачивается из камеры и заменяется стерильным воздухом. Предметами, какие булопростерилизовано указанным способом, рекомендуется пользоваться не раньше, чем через 24 год, для того, чтобы удалился весь газ.

Одним из методов стерилизации есть применение разных типов облучения. В практике используются для этого электроны, гамма-лучи, ультрафиолетовые лучи, радиочастотное облучение.

Электронные ускорители позволяют фокусировать электроны в узкий направленный пучок высокой мощности. Этот метод используют для стерилизации в промышленных масштабах хирургического перевязочного и шовного материалов еще на этапе их производства. Недостатком данного метода стерилизации является низкая проницаемость лучей.

К гамма-облучение чувствительные вегетативные и споровые формы разнообразных бактерий, грибов, дрожжей, вирусы. Облучение мощностью 2,5 Мрад используется для обеззараживания антибиотиков, витаминов, стероидных и других гормонов, пластмассового одноразового оборудования (чашек Петри, шприцев), хирургического перевязочного и шовного материалов и тому подобное.

Стерилизацию с помощью ультрафиолетового облучения проводят для обезвреживания бактерий в воздухе операционных, палат, боксов, микробиологических лабораторий и тому подобное. Для этого используют специальные бактерицидные лампы разной мощности – БУВ-15, БУВ-30 и др.

Однако следует помнить, что микробы могут быть защищены от действия ультрафиолетового облучения многочисленными органическими веществами, пылью и другими факторами. Вегетативные формы бактерий в 3-10 раз более чувствительны к УФО, чем споры.

Методы радиочастотного облучения на сегодня начинают интенсивно разрабатываться, особенно в пищевой промышленности. Сложность их заключается в опасности для обслуживающего персонала (например, препятствования систем связи, разная частота облучения, которая применяется для обезвреживания микроорганизмов).

Для проверки эффективности стерилизации, надежности работы автоклавов применяют химический и биологический контроль. Известны химические вещества с определенной температурой плавления: бензонафтол – 110 °С, антипирин – 115 °С, сера – 119  °С, бензойная кислота – 120-122 °С, манноза и мочевина – 132-133 °С. Именно при таких температурах чаще всего осуществляют стерилизацию. Химические вещества вмещают в стеклянные трубки, добавляют небольшое количество анилинового красителя (сафранин, фуксин или метиленовий синей), запаивают и кладут между объектами, которые стерилизуются. Равномерная расцветка препарата в цвет красителя в трубке свидетельствует о надлежащей температуре в автоклаве, а следовательно и надежность стерилизации. Для биологического контроля стерилизации в автоклав вмещают специальные биотесты – полоски фильтровальной бумаги, марли и тому подобное, на которых находятся споры бактерий с известной термостойкостью, споры известной численности и др.

 

Споры бактерий, которые чаще всего используют в качестве индикаторы

 

 

Контроли стерилизации

 

Они раскладываются в биксах, которые подлежат стерилизации. После завершения цикла в пробирки с полосками заливают питательную среду и инкубируют при оптимальной температуре. Отсутствие прорастания спор бактерий свидетельствует об эффективной стерилизации.

 

 

Способы стерилизации медицинских объектов

Дезинфекция. Дезинфекция – это совокупность мероприятий для полного, частичного или селективного уничтожения потенциально патогенных для человека возбудителей на разных объектах окружающей среды с целью предупреждения передачи возбудителя от источника инфекции к восприимчивому организму.

Поскольку микроорганизмы имеют разную чувствительность к дезинфицирующим средствам, выделяют четыре степени дезинфекции: A, B, C, D. Дезинфекцийни мероприятия степени A предусматривают уничтожение аспорогенних форм микробов, риккетсий, микоплазм, самых простых. Мероприятия степени B используются для ликвидации грибов, некоторых вирусов, бактерий, которые имеют повышенную стойкость (стафилококки, микобактерии). Борьба с возбудителями особенно опасных инфекций (чумы, холеры, сыпного тифа, мелиоїдозу, сапу) требует мероприятий степени С. Знищення спор микроорганизмов и самых простых – мероприятий степени D.

Мероприятия дезинфекциї, что используются в клиниках, микробиологических, вирусологических и других лабораториях достаточно разнообразные. Их условно можно разделить на 2 группы: физические и химические.

К первой группе можно отнести сжигание использованного перевязочного материала, отходов, мусора, прожигания в пламени горелки, действую сухого жара, автоклавування при разных режимах, использовании ультразвуку. Эффективными мероприятиями является кипячение предметов особенно с поверхностно активными веществами, дезинфекция воздух с помощью ультрафиолетового облучения. Постоянно используются такие элементарные мероприятия, как влажная уборка, мойка, очистка, вытрепывание одеял, простынь и тому подобное. Такие мероприятия хотя и не уничтожают микроорганизмов, однако способствуют существенному снижению их популяций на разных объектах.

 

Мощным комплексом дезинфекционных мероприятий выступают многочисленные химические препараты – дезинфектанты.

К ним предъявляют определенные требования:

1) противомикробный эффект широкого спектра действия;

2) высокая растворимость в воде, способность образовывать с водой или воздухом активные и стойкие суспензии, эмульсии, аэрозоли;

3) способность не терять противомикробных свойств при наличии в среде органических примесей;

4) низкая токсичность;

5) отсутствие алергизуючої действия;

6) отсутствие пошкоджуючого эффекта относительно предметов, которые ими обрабатываются;

7) доступность сырья, из которого изготовляются дезинфектанти, ее дешевизна и тому подобное.

 

Существует несколько сотен дезинфикуючих средств разных групп. Среди них алкоголи, альдегиды, четвертично-аммониевые соединения. Самое широкое использование нашли хлоромистки препараты. К ним принадлежат 0,2-1,0 % хлорная известка, которую изготовляют ех tempore с 10 % осветленных растворов этого вещества; 0,2-1,0 % растворы хлорамина В или Т; 5 % водород растворы гипохлорида кальция; 0,05-0,1 % раствор трихлоизоциануровой кислоты (дикониту); 0,1-0,2 % раствор сульфохлорантину. Окислители представлены 1-10 % раствором перекиси водорода, фенолами и их производными – 3-5 % растворами лизола, карболовой кислоты, фенола. К группе препаратов из солей тяжелых металлов принадлежат мертиолят натрию, сулема. Широкое приложение приобрели 2-3 % раствор формальдегида, 3-10 % раствор крезола и другие. Используются в практике и газообразные дезинфектанти – 40 % водный раствор формальдегида, смеси окиси этилена с углекислым газом (1:10) и окиси этилена из бромидметилом (1:1).

На практике выделяют текущую и заключительную дезинфекцию. Текущие дезинфекцию проводят для уменьшения микробной контаминации в очагах инфекции. Ей подлежат кровати, постельное и нательное белье, полотенца, матрасы, подушки, мебель, ковры, посуда, инструменты, приборы, которые находятся на поверхности разных объектов, воздуха, выделения, стоковые воды и тому подобное.

В частности, поверхности столов, окон, потолка, стены, мебель дезинфикують протиркой и мойкой с помощью дезинфикуючих растворов, постельное и другое белье стирают в этих растворах. Кровати, матрасы, подушки обрабатывают в специальных камерах методами термохимии, мягкая мебель – с помощью специальных аэрозолей, посуда – погружением в дезинфикуючи растворы. Обработка выделений и стоковых вод проводится термическими и химическими методами. Воздух помещений можно дезинфикувати пропусканием через специальные антибактериальные фильтры, как это делают в палатах гнотобиологичної изоляции, или облучая его ультрафиолетовыми лучами. Медицинские инструменты, приборы сначала очищают, дезинфикують, а затем, в случае необходимости, стерилизуют известными способами.

Заключительная дезинфекция проводится с целью уничтожения возбудителей инфекционных заболеваний в помещении, где находился инфекционный больной, и предметах, зякими он был в контакте. Такая ситуация складывается после выписывания его из инфекционного стационара, переводу из соматического отделения в инфекционное и тому подобное.

Для обеспечения ухода за проведением дезинфикуючих мероприятий разработанную специальную систему контрою. Она включает у себя: а) внешний и внутренний контроль отделами дезинфекций санитарно эпидемиологических станций и лабораторий лечебно-профилактических заведений, который осуществляется визуальным, бактериологическим, биологическим, химическим и другими методами; бы) бактериологический контроль проводят, обнаруживая в очагах инфекции индикаторных бактерий: при кишечных заболеваниях – кишечные палочки, при крапельних инфекциях, туберкулезе – стафилококки, в лечебно-профилактических заведениях – условно патогенные микроорганизмы; контроль осуществляется 1 раз в месяц – один раз в квартал в зависимости от ранга лаборатории; в) забор контрольных проб (10-30 штук) проводят не раньше, чем через 30-45 минут по завершении дезинфекциї; площадь смывов не должна быть меньше, чем 200 см2; г) смывы берут стерильными ватными тампонами и засевают на питательные среды с соблюдением всех правил асептики с целью предотвращения контаминации посторонней флорой; для выделения бактерий группы кишечной палочки и золотистых стафилококков пользуются специальными наборами питательных сред и схемами идентификации, определенных соответствующими инструкциями.

Дезинфиципующие мероприятия считаются эффективными, если в пробах не определяются бактерии группы кишечной палочки, условно патогенные микробы, золотистые стафилококки.

 

Большое значение в практической медицине имеет антисептика (комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране или в организме в целом). Еще в 1865 г. М. И. Пирогов подчеркивал необходимость уничтожения источника госпитальной инфекции и применял для борьбы с нагноением ран хлорную воду, нитрат серебра, йод и другие антисептические вещества. В 1867 р, Д. Листер как антисептическое средство широко применяло фенол.

Учение об антисептике сыграло позитивную роль в развитии хирургии. Практическое применение микробиологии в хирургии привело к уменьшению количеству послеоперационных осложнений, гангренозных процессов и в значительной мере обусловило снижение смертности в хирургических  отделениях.

В 1897 г. E. Бергман внедрил в практику хирургии асептику — систему мероприятий, направленных на предотвращение попадания в рану микроорганизмов. Для этого используют стерилизацию хирургического инструментария и шовного материала, обработку рук хирурга перед операцией, поверхности кожи в участке операционного поля, а также дезинфекцию воздуха и предметов операционной.

 

Запомните:

Стерилизация – полное уничтожение вегетативных и споровых форм всех микроорганизмов на определенных предметах, материалах, питательных средах.

Дезинфекция – совокупность физических, химических и механических способов уничтожения вегетативных и споровых форм патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Антисептика – комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение или притеснение роста микробов в ране, на поверхности кожи или слизевых оболочек.

Асептика – система профилактических мероприятий, направленных против проникновения микробов в рану, ткани, органы больного.