ЛЕКЦИЯ
КЛИНИЧЕСКАЯ И ГОСПИТАЛЬНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ
· Бактериоскопичний
· Бактериологический
· Серологический
· Биологический
· Аллергический
· Экспресс-диагностика
Клиническая микробиология – раздел медицинской микробиологии, который изучает микробные заболевания в соматических отделениях всех клинических специальностей. Перед клинической микробиологией, которая осуществляет диагностику гнойно-септических процессов стоит широкий круг заданий, которые направлены на предоставление помощь клиницистам в диагностике, лечении и профилактике инфекционных осложнений.
Особенности гнойно-септических заболеваний в неинфекционной клинике – полиетиологичнисть, неспецифичность клинических проявлений – определяют ведущую роль микробиологических исследований в расшифровке их этиологической структуры.
В современном неинфекционном стационаре внебольничные и внутрибольничные гнойно-септические процессы предопределяются многими возбудителями – свыше 2000. это представители родов Staphylococcus, Streptococcus, Bacteroides, семейств Enterobacteriaceae (Proteus, Klebsiella, Escherichia, Serratia, Citrobacter, Hafnia и др.), Pseudomonadaceae, Neisseriaceae (роды Acinetobacter, Moraxella, Branchamella). В урологической и гинекологической клиниках возбудителями госпитальных инфекций часто являются представители семейств Mycoplasmataceae, Chlamydiaceae.
Взаимосвязь между врачом и лабораторией. Каждый врач должен уметь осуществлять некоторые самые простые микробиологические исследования (изготовление и расцветка мазка, микроскопическое ее исследование, занял патологического материала на соответствующую питательную среду). Кроме того, любой врач должен знать, когда и как необходимо собрать материал для исследования, на какие анализы его следует направить и как интерпретировать результаты.
.
Микробиологические лабораторные исследования часто требуют длительного времени для получения ответа. Много микроорганизмов растет медленно, потому могут пройти дни и недели, пока они не смогут быть идентифицированы.
Поэтому необходимо, чтобы врач правильно взял материал для исследования, сообщил в лабораторию о предыдущем диагнозе и почав соответствующее лечение препаратами, которые были бы эффективны относительно определенного возбудителя. Во время того как лаборатория начнет получать данные, которые имеют клиническое значение, она должна сразу передавать и клиницисту, чтобы он смог уточнить диагноз (учитывая и клиническое течение болезни) и при необходимости изменил лечение. Такая оперативная “обратная” информация включает предыдущие результаты, полученные на отдельных этапах выделения и идентификации возбудителей.
Критерии этиологической значимости выделенной культуры.
Выделенная чистая культура условно-патогенных микроорганизмов считается возбудителем болезни при наличии таких показателей:
– культура присутствующая в материале из патологического очага в количестве 104-105 колониеутворюючих единиц (КУО) в 1 мл или 1 г;
– повторное выделение из аналогичного материала той же культуры;
– нарастание в сыворотке больного антител к автоштаммам или культуре, которую считают достоверным возбудителем.
Микробиологическая диагностика гнойно-зажигательных процессов
Исследование крови. Бактериологическое исследование крови проводят при подозрении на сепсис, септикопиемию, бактериемию.
В норме кровь человека стерильна. Хотя микроорганизмы порой проникают в кровь из нормальной микрофлоры дыхательной или пищеварительной системы (явление транслокации микрофлоры), они очень быстро удаляются из крови клетками ретикулоэндотелиальной системы. Эти транзитные микроорганизмы очень редко влияют на бактериологическое исследование крови.
Взятие крови на исследование. Кровь от больного для посева следует брать в начале озноба при подъеме температуры. Кровь для посева берут из локтевой вены, сурово придерживаясь правил асептики и антисептики.
Проведение исследования. Занял 5-10 мл крови проводят на 50-100 мл жидкой питательной среды – 1 % сахарный бульон, а также на жидкие и полужидкие среды для культивирования анаэробов.
Однако при одноразовом исследовании не всегда удается получить позитивный результат гемокультуры. Более информативным трехкратен занял крови с интервалом между посевами в одни сутки.
Оценка результатов микробиологического исследования крови зависит от вида выделенного возбудителя и массивности его роста. Выделение патогенных видов без сомнения свидетельствует об их этиологической роли в заболевании. Если из крови выделяются условно-патогенные микроорганизмы следует учитывать их количественное содержимое (выделение одиночных клетке клетки чаще свидетельствует о контаминации), повторяемость выделения одной и той же культуры от больного и идентичность гемокультуры с культурами, выделенными из другого материала от этого больного.
Если через 10 дней после посева крови роста микроорганизмов на питательных средах не найдено, анализ крови можно считать негативным.
Исследование мочи
Микробиологическое исследование мочи проводят при зажигательных заболеваниях мочевыводящих путей, а также при почечной недостаточности и задержке мочи. Исследование мочи необходимо проводить у больных с подозрением на системные инфекции и при лихорадках неизвестной этиологии.
Моча, которая образуется в почках, стерильна, если почки не инфицированы. Моча, которая находится в мочевом пузыре, также как правило, стерильная. Однако в уретре есть нормальная микрофлора, потому при выходе из мочевыводящего канала в моче появляется небольшое количество микробов. В передних участках мочевыводящего канала как у мужчин, так и у женщин есть в небольшом количестве те же микробы, которые находятся на коже и в промежности. Эти мікрорганізми как правило выявляют в нормальной моче в количестве 102-104 КУО/мл.
Проведение исследования. Микробиологическое исследование мочи следует проводить как можно скорее после ее получения с тем, чтобы предотвратить размножение тех микробов, что в ней находятся.
Микроскопическое исследование. Каплю свежей нецентрифугированной мочи капают на предметное стеклышко, накрывают покровным стеклышком и исследуют при сниженной яркости освещение при большом увеличении. При этом видно не только эритроциты и лейкоциты, но и бактерии, если их число превышает 104-105 микроорганизмов в 1 мл. Этот простой прием дает быструю информацию о наличии в моче большого количества микроорганизмов, а также позволяет определить, предопределенная инфекция кокками или подвижными палочками. Для этого исследования могут быть использованные и высушенные мазки, окрашенные за методом Грамма. При короткотривалому (3-5 хв) центрифугировании на обычной лабораторной центрифуге седиментации бактерий не происходят, но наблюдаются осаждения нейтрофилов, в которых могут находится бактерии, которая облегчает быструю микробиологическую диагностику инфекции.
Бактериологическое исследование. Определяют степень бактериурии – количество колониеутворюючих единиц (КУО) в 1 мл мочи. Взятую мочу засевают на 3-5 % кровяной агар и на среду Ендо стандартной бактериологической петлей со следующим рассеиванием по секторам или готовят ряд десятикратных разведений мочи в физрастворе со следующим мерным (0,1 мл) высевом на указанные среды. Потом проводят подсчет числа колоний, которые выросли, и перечисляют на 1 мл мочи. Культуру идентифицируют и определяют ее чувствительность к антибиотикам.
При использовании бактериологического метода лаборатория дает предыдущий ответ через день и окончательную – через 3-4 дня.
Оценка результатов.
Оценку проводят на основании таких критериев:
1. Степень бактериурии, которая не превышает 103 КУО/мл мочи и которую выявляют однократно, свидетельствует об отсутствии воспалительного процесса и, как правило, является результатом контаминации мочи. Бактерии, которые находят повторно в таких же количествах, свидетельствуют о персистуючу хроническую инфекцию.
2. Степень бактериурии, которая равняется 104 КУО/мл, расценивается как сомнительный результат. Исследование следует повторить.
3. Степень бактериурии, которая равняется 105 КУО/мл мочи, указывает на наличие воспалительного процесса.
4. Изменение степени бактериурии в процессе заболевания может быть использовано для контроля за ходом процесса и эффективностью терапии.
Исследование цереброспинальной жидкости
Микробиологическое исследование цереброспинальной жидкости (ЦСР) необходимо в случаях, подозрительных на менингит, а также при коматозных состояниях и неврологических симптомах неясного генеза.
ЦСР в норме стерильная, потому позитивный результат микробиологического исследования – это всегда расшифровывание этиологического диагноза, своевременность выставления которого может в ряде случаев предотвратить смертельные последствия заболевания.
Забор проб. При строгом соблюдении правил асептика проводит люмбальну пункцию. Первые капли ЦСР (до 1 мл) собирают в пробирку и направляют на цитологичне исследование. Для посева используют следующие порции жидкости, которую собирают в стерильную пробирку в объеме 2-5 мл. При подозрении на туберкулезную или грибковую инфекцию следует брать не менее 10 мл ЦСР.
Учитывая, что один из ведущих возбудителей менингита – Neisseria memingitidis – чрезвычайно чувствительный к охлаждению, пробы, что взято, должны быть как можно быстрее доставлены в лабораторию, а к этому храниться при температуре 37 (С.
Проверку роста проводят через 18-24 час. и в дальнейшем ежедневно к появлению роста. При отсутствии роста в течение 7 дней выдается негативный результат.
Исследование выделений при инфекциях носу и зеву.
Микрофлору верхних дыхательных путей изучают при заболеваниях носу, ротоглотку, а также у больных пневмонией, которые не выделяют мокротиння. И при исследовании на бактерионосительство
Нормальная микрофлора полости рта и верхних дыхательных путей.
Забор материала. Выделение из носу берут сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубину полости носа. Материла из носоглотки берут стерильным задньоглотковим тампоном. Тампоны опускают в стерильные пробирки и доставляют в лабораторию в максимально короткие сроки.
Проведение исследования. Занял тампоном проводят на чашки Петри с 5 % кровяными агаром, инкубируют при 37 (С 18-24 час. Колонии, которые выросли, идентифицируют, определяют чувствительность к антибиотикам. Из материала, который остался на тампоне, готовят мазки, которые окрашивают из а Граммом и Нейссером.
Оценка результатов. При оценке результатов исследования следует учитывать количественный и качественный состав естественной микрофлоры, которая содержится в клиническом образце, : нахождения микроорганизмов, которые не принадлежат к естественной флоре верхних дыхательных путей, или необычно большое количество микробов какого-либо вида указывает на их этиологическую значимость в развитии заболевания.
Исследование выделений при инфекциях нижних дыхательных путей.
Микробиологическое исследование проводят при воспалительных процессах в дыхательных путях: пневмониях, бронхитах, плевритах, бронхоэктатической болезни, абсцессах легких и тому подобное.
Забор материала на исследование. Исследуют мокротиння, содержимое бронхов, полученные при бронхоскопии, плевральную жидкость, аспираты и пунктати трахеи, легочную ткань, полученную при пункции и биопсии легких.
Исследуют утреннюю порцию мокротиння.
Проведение исследования. Для ориентировочного вывода о характере и количестве микрофлоры в мокротинни можно применять бактериоскопию мазков, которые готовят из гнойных комочков мокротиння. При подозрении на туберкулез мазки окрашивают за методом Циля-Нильсена. Некоторые микроорганизмы (например, актиномицеты) лучше видно в неокрашенных нативных препаратах. Свижезбиране мокротиння может быть использовано для постановки “реакции набухания капсулы” с поливалентной сывороткой для выявления пневмококков. Мерный висел мокротиння (0,1 мл) из разведений его проводят на ряд питательных сред : 5% кровяной агар, среда Ендо, среда для анаэробов, растирая материал шпателем по поверхности среды. На поверхность кровяного агара, засеяного исследуемым материалом, можно положить диски с сапонином, чтобы создать селективные условия для роста Haemophylus influenzae.
При нахождении в микроскопическом препарате грибов рода Candida делают занял на среду Сабуро.
При подозрении на туберкулез или микоплазмову инфекцию делают висиви на соответствующие среды.
Для выделения Streptococcus pneumoniae можно внутришньоочеревинно заражать белых мышей.
Оценка результатов. Самое сложное определить этиологическую роль микроорганизмов, которые содержатся в мокротинни, и какие контаминуютть его при прохождении через верхние дыхательные пути и ротовую полость.
С помощью количественного метода определяют содержимое в мокротинни определенного вида микробов, исходя из того, что возбудитель есть в мокротинни в значительно большем количестве, чем микроби-контаминанти. Критическое число представляет 106 -107 КУО/мл. Рост микробов в меньших разведениях расценивается как контаминация мокротиння микрофлорой верхних дыхательных путей. Следует однако учитывать, что при проведении антимикробной терапии количественное обсеменение мокротиння возбудителем может уменьшиться.
Исследование выделений из ран и потовыделений
Микробиологическое исследование ран имеет значение для этиологической диагностики в каждом конкретном случае заболевания, а также важно в эпидемиологическом отношении, так как ранова инфекция является ведущей формой проявления госпитализма.
Забор материала для исследования. Материал из ран, полостей, пунктати, содержимое карбункулов, норицевих ходов и тому подобное забирают стерильным шприцем, пинцетом или ватным тампоном, по возможности из более глубоких отделов, так как верхние отделы могут содержать сапрофитную флору. При снятии повязки рекомендуется очистить поверхность от мази, тканей, какие загибли, а потом отбирать материал.В ряде случаев материал из очага инфекции может быть получен только при оперативном лечение. Хирург берет кусочки патологически измененных тканей с помощью стерильных инструментов. Из закрытых образований, какие флуктуюють, содержимое аспирують с помощью толстой иглы или шприца.Взятый материал помещают в стерильную пробирку, чашку Петри или баночку и доставляют в лабораторию проотягом 1-2 час. Забор материала должно быть осуществлено с соблюдением правил асептики
Проведение исследования. Микроскопия мазков ранового содержимого.
Для изготовления мазков ранового содержимого следует использовать отдельные тампоны, которыми забирают патологический материал и переносят его на стекло. Мазки окрашивают за Граммом. Если в лабораторию доставлен один тампон, то мазок готовят после посева патологического материала. При микроскопии отмечают морфологию и количество микроорганизмов. Особенности, которые при этом оказываются, позволяют внести коррективы к ходу исследования – использованию дополнительных питательных сред.
Занял ранового содержимому непосредственно из тампону на кровяной агар, в сахарный бульон и среду для анаэробов (тиогликолевевий бульон).Из жидких проб готовят десятикратни разведения. Из каждого разведения делают висиви на кровяной агар, среду Ендо, ЖСА.Кусочки тканей взвешивают, измельчают в стерильной ступке с питательным бульоном, а потом делают десятикратни разведения суспензии и по 0,1 мл каждого разведения высевают на плотные питательные среды.Посевы инкубируют в аэробных и анаэробных условиях при 37 (С, просматривая их ежедневно. При появлении роста на плотной питательной среде подсчитывают число колоний, которые выросли, и перечисляют на 1 г (1 мл) ткани. Культуру идентифицируют, определяют чувствительность к антибиотикам.
Негативный результат исследования выдают через 7 дней инкубации при отсутствии роста на всех средах.
Оценка результатов.
В тех случаях, когда патологический материал берется из закрытых полостей или глубины гнойных ран при условиях соблюдения правил асептики во время забора материала, выделенные микробы являются возбудителями данного инфекционного процесса.
При выделении ассоциаций микроорганизмов из ранового содержимого ведущее значение в ходе ранового процесса следует отдавать видам, которые количественно преобладают в данном микрообиоценози.
Критерии количественной оценки микробного роста при прямом штриховом посеве тампоном ранового содержимого на 1/2 чашки Петри с плотным питательными средой:
И – очень скудный рост – зист только в жидких средах, на плотных питательных средах рост отсутствует;
ИИ – небольшое количество – на плотной среде рост до 10 колоний;
ИИИ – умеренное количество – на плотной среде рост от 11 до 100 колоний;
IV – большое количество – рост на плотной среде свыше 100 колоний.
Рост И-ИИ степени чаще свидетельствует о контаминации, ИИИ-IV – об этиологической роли данного микроба.
Показано, что уровень обсеменения тканей в ране, который равняется 105 КУО/г, является критическим.
Исследование выделений из глаз
Воспалительные процессы глаза чаще локализуются на конъюнктиве, слизоввий оболочке ввек, слезному мешку, реже задевают роговицу. Инфекция внутренних сред глазного яблока может развиться в результате гематогенного ее распространения или после операций на глазном яблоке.
Нормальная микрофлора глаза (конъюнктивы).
Доминирующими микроорганизмами на слизистых оболочках глаза является дифтероид, нейсерии и грамотрицательные бактерии (бактерии рода Moraxella). Часто находят стафилококки и негемолитические стрептококки.
Забор материала для микробиологического исследования выполняет врач-окулист в присутствии лаборанта-микробиолога, который сразу проводит занял материалу на питательные среды.
Проведение исследований. При скудных выделениях используют только жидкие питательные середдовища – сахарный бульон и среда для анаэробов. При более рясних выделениях следует использовать кровяной агар, сывороточный агар, шоколадный агар. При подозрении на гонококовую или дифтерийную этиологию конъюнктивита викорисовують соответствующие среды.
Оценка результатов. Нахождение микроорганизмов условно-патогенной группы при условии соблюдения всех правил асептики свидетельствует об участии в воспалительном процессе тканей глаза или является показателем высокого риска развития воспалительного процесса, особенно в тех случаях, когда больных ожидают опреативни вмешательства на органах зрения.
Исследование выделений из ушей.
Забор материала для микробиологичнного исследования при среднем отите проводит врач-отоларинголог, используя стерильные инструменты. Выделение берут стерильным ватным тампоном. Самые достоверные результаты исследования получают при пункции среднего уха через барабанную перепонку, которая еще не была прорвана. При внешнем отите следует обработать кожу окружающих участков раствором антисептику.
Во внешнем ушном канале могут находиться жители кожи – стафилококки, коринебактерии. В среднем усе почти нет микрофлоры; в этот отдел микроорганизмы могут проникать через евстахиеву трубу, но там они погибают, так как сера имеет бактерицидные свойства.
Проведение исследования. Проводят микроскопию первичных мазков выделений, материал засевают на соответствующие питательные среды.
Оценка результатов. При острых воспалительных процессах как правило высевают в большом количестве монокультуры микроорганизмов, тогда их этиологическая значимость не вызывает сомнений. Сложнее является интерпретация результатов микробиологического исследования при хронических воспалительных процессах, когда выявляют ассоциации бактерий. В таких случаях важной является количественная оценка роста разных видов.
Исследование выделений женских половых органов.
Воспалительные процессы половых органов могут быть вызванными микрофлорой, которая присутствующая в норме в этих органах, а также при восходящем, гематогенном, лимфогенном распространении микроорганизмов из других органов и тканей.
Нормальная микрофлора влагалища. После рождения ребенка во влагалищном содержимом появляются лактобациллы (палочки Дедерлейна), которые проживают здесь несколько недель, пока среда остается кислой. Когда оно становится нейтральным (что хранится к половому дозреванию), развивается смешанная микрофлора (кокки и бактерии). После наступания половой зрелости опять в больших количествах появляются лактобациллы. Во время менопаузы количество лактобацилл опять уменьшается, появляется змишанна флора.
В состав нормальной влагалищной флоры входят вейлонели, еубактерии, фузобактерии, бифидобактерии, клостридии, пептострептококи, бактерроиди, гемолитические стрептококки группы В, колиформни бактерии, порой листерии, спирохеты.
Забор материала на исследование проводит врач акушер-гинеколог.
Проведение исследования. Готовят мазки для бактериоскопичного исследования. После высушивания при комнатной температуре мазки покрывают чистым предметным стеклом (или кладут в чашку Петри) и отправляют к лаборатории.
Материал, который взято тампоном, засевают на кровяной и шоколадный агары. Гной, содержимое тубовариальних образований засевают по 0,1 мл. Проводят также посевы в сахарный бульон для выделения анаэробов.
Оценка результатов. В каждом конкретном случае следует учитывать совокупность признаков. Да, при исследовании материала из закрытых полостей, а также из органов, в норме стерильных (содержимое полости матки, кусочки органов, тканей, которые удаляются при полостных операциях), рост микроорганизмов в монокультуре свидетельствует об их этиологической роли в воспалительном процессе.
Для ориентировочной оценки количественного соотношения в микробных ассоциациях можно использовать те же критерии, что и при исследовании выделений из ран.
Исследование содержимого желудочно-кишечного тракта
Возбудитель, которые выделяются при воспалительных процессах разнообразной локализации, в основном, являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. Для оценки этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов при разнообразных желудочно-кишечных расстройствах, в том числе при диагностике кишечного дисбактериоза, важно знать критерии качественного и количественного соотношения микробных видов в разных отделах шлунково-кишклового тракта.
Забор материала для исследования.
Пищевод и желудок. Материал для посева получают при эзофагоскопии и гастроскопии. На бактериологическое исследование направляются также рвотные массы и промывные воды желудка.
Тонкий кишечник. Материал берут с помощью специального зонда, который открывают в определенном участке, а после забора содержимого опять закрывают.
Толстый кишечник. Исследованию подлежат опорожнения. При необходимости изучения микрофлоры запальчиво измененных участков слизистой оболочки забор материала проводят при ректороманоскопии из пораженных участков.
Желчь получают при зондировании двенадцатиперстной кишки : исследуют все три порции желчи.
Проведение исследования. Для посева патологического материала из разных отделов желудочно-кишечного тракта используют такие питательные среды: среда Ендо, кровяной агар, молочно-солевой агар, агар Сабуро. Занял на среды проводят шпателем, используя определенную дозу патологического материала (или его разведение), чтобы определить КУО бактерий разных видов. При появлении роста подсчитывают количество разных видов и отсеивают по 2-3 колонии для идентификации.При диагностике кишечного дисбактериоза необходим количественный учет как аэробной, так и анаэробной микрофлоры кишечнику.
Оценка результатов. В связи с тем, что исследованию подлежат пробы, которые в норме содержат разнообразную микрофлору, ведущее значение принадлежит количественной оценке разных видов в ассоциациях, которые выделяются из патологического материала, и сравнению полученных данных с нормальным составом биоценоза данной области.
Определение чувствительности микроорганизме к антибактериальным препаратам
В связи с тем, что условно-патогенные микроорганизмы, как правило, имеют множественную врачебную стойкость, определение антибиотикограми выделенного возбудителя является необходимым условием успешной антибиотикотерапии.
За степенью чувствительности к антибиотикам микроорганизмы разделяются на три группы: чувствительные, умеренно стойкие и стойкие. К чувствительным принадлежат штаммы, рост которых подавляется концентрациями препарата, которые создаются в сыворотке крови больного при введении середньотерапевтичних доз антибиотиков. К умеренно стойким принадлежат штаммы, для притеснения роста которых нужные концентрации, которые создаются в сыворотке при введении больном максимальных терапевтических доз антибиотиков. Стойкими считаются те микроорганизмы, рост которых не подавляется максимально допустимыми дозами лекарственных веществ.
Степень чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в лабораторных условиях определяется минимальной концентрацией препарата, которая подавляет рост исследуемого штамма in vitro (МПК). Сопоставление минимальной подавляющей концентрации, определенной in vitro, и концентрации. Какая достигается в организме при введении терапевтических доз этого препарата больному, позволяет установить степень чувствительности возбудителя к данному препарату.
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам применяют метод диффузии в агар с использованием бумажных дисков с антибиотиками и метод серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.
Метод определения чувствительности с помощью дисков является качественным. Вместе с тем установленная корреляция между размерами зон задержки роста микробов и значениями МПК антибиотика, что позволяет определить количественно степень чувствительности исследуемого штамма.Количественный метод (метод серийных разведений) позволяет установить МПК препаратов.
