основы КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Тема 26. Санитарная микробиология. Санитарно микробиологические исследования в аптеках.

Тема 27. Микробиологические исследования нестерильных и стерильных лекарственных средств.

 

 

СанИтарнаЯ мИкробИологИя.

 

Экологическая микробиология как раздел общей микробиологии изучает взаимоотношения микро- и макроорганизмов, совместно обитающих в определенных биотопах. Это понятие введено С. Н. Виноградским  (1945).

Экологическая микробиология использует понятия общей экологии. Главные из них: популяция — совокупность особей одного вида, обитающих в пределах определенного биотопа; б и о т о п — территориально ограниченный участок биосферы с от­носительно однородными условиями жизни; микробиоценоз — сообщество популяций микроорганизмов, обитающих в оп­ределенном биотопе; экосистема — система, состоящая из биотопа и биоценоза; геосфера, гидросфера, атмосфера, онтосфера — соответственно совокупность почвенных, водных, воздушных и паразитарных экосистем; биосфе­ра— живая  оболочка  планеты,  общая сумма  всех экосистем

 

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В МИКРОБИОЦЕНОЗАХ

Важнейшим объектом изучения экологической микробиологии является микробиоценоз. В естественных средах (почва, вода, воздух, живые организмы) микроорганизмы живут в виде сообществ, образуя экологические связи как между собой, так и с растениями, животными и человеком, а также с абиогенными факторами окружающей среды.

Популяции микроорганизмов состоят из особей одного вида, который характеризуется гетерогенностью, так как содержит различные варианту. Отношения между ними носят преимущественно симбиотический характер, хотя в некоторых случаях, например при разных темпах размножения в среде с лимитирующим источником питания, имеет место конкуренция.

Межвидовые взаимоотношения сложны, многообразны и ди­намичны. Они могут быть разделены на несколько видов.

Нейтрализм — форма межвидовых отношений, при ко­торой обитающие в одном биотопе популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.

При симбиозе обе популяции извлекают для себя пользу. Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм).

Мутуализм наблюдается в тех случаях, когда симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Например, одна популяция синтезирует продукт, которой является основой питания для другой популяции. Симбиоз наблюдается между аэробами и анаэробами, организмом человека и его собственной (аутохтонной) микрофлорой.

Рис. Азотфиксирующие бактерии

 

Содержание явления коменсализм хорошо отражает его русский синоним — нахлебничество. Коменсалы питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значения. Например, коменсалы человека — аутохтонные бактерии и грибы, питающиеся слущенным эпителием или остатками органических веществ.

Рис. Бифидобактерии – коменсалы человека

 

При конкуренции, или антагонизме, происходит подавление жизнедеятельности одной популяции другой. Антагонисты обладают способностью выделять в среду обитания вещества, которые вызывают задержку размножения или гибель компонента микробиоза. К таким веществам относятся антибиотики, бактериоцины, органические и жирные кислоты и др.

Рис. Антагонизм между микроорганизмами

 

Паразитизм — такой вид межвидовых связей, при кото­ром одна популяция (паразит), нанося вред другой популяции (хозяину), извлекает для себя пользу. Паразитами бактерий являются фаги. К микробам-паразитам человека относятся бактерии, вирусы, грибы, простейшие.

 

Рис. Вирус полимиелита

 

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

В зависимости от среды обитания микроорганизмы разделяют на свободноживущие и паразитические. Свободноживущие заселяют лито-, гидро- и атмосферу, обитают и в различных антропогенных средах (жилища, одежда, продукты, химические препараты, в том числе лекарственные и др.). Попадая в организм человека, они могут иногда вызывать инфекционное заболевание.

 

МИКРОФЛОРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

 

Микроорганизмы являются постоянными спутниками не только человека и животных, но и, в равной степени, высших растений, в том числе используемых в качестве лекарственного сырья. Микроорганизмы поселяются и ведут активный образ жизни, как на поверхности, так и внутри зеленых частей растений, их корней, семян, плодов. Для приготовления лекарств служат самые разнообразные растения и работники аптечных учреждений, фармацевтических фабрик и заводов должны обеспечивать сохранность лекарственного сырья от микробной порчи.

Все микроорганизмы, населяющие лекарственные растения, можно разделить на две группы:

1.  представители нормальной микрофлоры растений;

2.  фитопатогенные микроорганизмы  – возбудители заболеваний растений.

Нормальная микрофлора растений представлена ризосферными и эпифитными микробами.

Зона почвы, находящаяся в контакте с корневой системой растений, носит название ризосферы, а микроорганизмы, развивающиеся в данной зоне, называются ризосферными. Условно различают два типа ризосферы: ближнюю и отдаленную.

Ближняя располагается непосредственно на поверхности корней и извлекается вместе с ними, отдаленная начинается на расстоянии нескольких миллиметров от корней и распространяется в радиусе 50 см от них. Количество микроорганизмов в ближней и отдаленной ризосфере различно: на поверхности корней их от 50 млн до 10 млрд, на расстоянии 15 см от корней до 5 млн в 1 г. почвы. Число микроорганизмов в ризосфере в 100 раз больше, чем в почве, где растения не произрастают, что связано с выделением корнями растений различных питательных веществ. В свою очередь, почвенные микробы могут оказывать благоприятное воздействие на жизнь растений, что обусловлено:

1). минерализацией органических веществ  и растительных остатков;

2). образованием витаминов, аминокислот, ферментов и других факторов роста, усиливающих ферментативные процессы в растениях и способствующих усилению корневого питания и более энергичному обмену веществ растений;

3). антагонистической ролью в отношении фитопатогенных микроорганизмов.

Качественный и количественный состав микрофлоры ризосферы специфичен для каждого вида растений. Основная масса прикорневой микрофлоры представлена неспороносными грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas, микобактериями и грибами, главным образом, базидиомицетами, реже фикомицетами, аскомицетами. Указанные грибы образуют симбиоз с корнями растений, в том числе и лекарственных, называемый микоризой. В зависимости от морфологических особенностей сожительства грибов с растениями различают эктотрофные и эндотрофные микоризы. Эктотрофные – ассоциации, при которых гриб не проникает внутрь корней, а поселяется на их поверхности, образуя своего рода чехол из мицелия. При эндотрофных микоризах мицелий гриба располагается в клетках коры корней растений, где образует скопления в виде клубков.

Микориза рассматривается как симбиотическое сожительство далеких организмов. Особенно это сожительство благоприятно для развития растений:

1.     увеличивает поглощающую поверхность корней за счет разветвлений гиф гриба;

2.     грибы своими ферментами разлагают богатые азотом органические соединения, обеспечивая растения аминокислотами, минеральными веществами и водой;

3.     микоризные грибы снабжают растения ростовыми веществами.

Растения в свою очередь выделяют ряд ростовых веществ, стимулирующих развитие гриба. Кроме этого, грибы получают от растений углеводы, служащие источником энергии.

Эпифитная микрофлора. Эпифитной называется микрофлора, находящаяся на поверхности надземных частей растений. По качественному составу она довольно однообразна и типичными ее представителями являются Pseudomonas furbicola aurum – грамотрицательные короткие подвижные палочки, образующие колонии золотистого цвета на МПА; Pseudomonas fluorescens – полиморфные грамотрицательные палочки с полярными жгутиками, дающие флуоресценцию на МПА и МПБ. Реже встречаются споровые бактерии Bacillus mesentericus, Bacillus vulgatus, бесспоровые молочнокислые бактерии E. coli, грибы плесневые и дрожжевые.

Эпифитные микроорганизмы являются антагонистами фитопатогенных бактерий, тем самым, предохраняя растения от заболеваний.

 

ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Инфекционные болезни растений вызываются фитопатогенными бактериями. Заражение растений происходит через инфицированные семена, почву, грунтовые и дождевые воды, насекомых. Главным источником инфекции является почва, так как в ней могут содержаться остатки неперегнивших полностью больных растений.

Фитопатогенные микроорганизмы сравнительно легко могут проникать в растения через естественные образования (чечевички, нектарники, желёзки, корневые волоски) и искусственные повреждения, даже ничтожные царапины. Некоторые микроорганизмы, способны вырабатывать ферменты, гидролизирующие кутикулу растений и облегчающие внедрение возбудителя.

Основные роды бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний растений:

Род Erwinia – вызывает болезни типа ожога, увядания, мокрой или водянистой гнили.

Род Pseudomonas – вызывает бактериальную пятнистость (на листьях образуются пятна различной окраски и размеров).

Род Xanthomonas – вызывает сосудистые бактериозы (закупорка сосудов, увядание и гибель), поражает листья, вызывает пятнистость.

Род Corynebacterium – сосудистые и паренхиматозные заболевания, бактериальный рак.

^ Род Agrobacterium – вызывает образование опухолей (корончатые галлы).

Род Pectobacterium – вызывает преимущественно гнили растений.

К вирусным заболеваниям растений относятся мозаичные болезни, желтухи, болезнь увядания, карликовость, закукливание и др.

Грибные болезни растений – микофитозы: фузариозы, гнили, аскохитозы, головни и др.

Грибы, поражающие растения, могут в случае приготовления из пораженного зерна продуктов питания вызывать пищевые отравления человека – микотоксикозы. Примером является эрготизм – заболевание, возникающее при употреблении продуктов, приготовленных из зерна, зараженного спорыньей.

 

 

Попав в растение и достигнув критической концентрации в количественном отношении, микроорганизмы вызывают заболевания, называемые бактериозами. Различают общие бактериозы – поражение всего растения вследствие распространения возбудителя в сосудистой системе; и местные или очаговые – поражения на листьях, стволах, ветвях, корнях и корневищах, возникающие при интрацеллюлярном распространении микроба.

От начала заражения до момента проявления у растения симптомов болезни проходит инкубационный период, длительность которого различна и зависит от многих факторов: температуры, влажности, света, питания и др.

По совокупности анатомических и физиологических изменений определяют тип болезни растений:

1.     Камедетечения, смолотечения, слизетечения. Чаще всего вызываются бактериями рода Erwinia и грибами (класс Ascomycetes), в большинстве наблюдаются у лиственных и хвойных деревьев.

2.     Сухая и мокрая гниль. При этом размягчаются и разрушаются отдельные участи тканей и органов растения за счет жизнедеятельности бактерий (род Pectobacterium) и грибов (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti).

3.     Мучнистая роса. На листьях и побегах возникает белый налет, который является следствием размножения грибов (класс Ascomycetes).

4.     Пожелтение, увядание, засыхание. Это заболевание чаще всего вызывается грибами (Fungi imperfecti), реже бактериями (род Corynebacterium), в ряде случаев заболевание носит неинфекционный характер.

5.     Чернь. На листьях и побегах появляется черная пленка вследствие развития сумчатых и несовершенных грибов или бактерий рода Erwinia.

6.     Ожог. Листья, молодые побеги, цветы, плоды буреют, чернеют. Возбудителями ожога являются бактерии рода Erwinia.

7.     Пятнистость. Некоторые бактерии (род Pseudomonas), грибы (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti), вызывают образование пятен разного цвета, формы, размеров на листьях, семенах и плодах.

8.     Опухоли. Местное увеличение объема стволов, ветвей, корней, корневищ в виде наростов, вздутий, утолщений за счет гиперплазии клеток. Эти заболевания вызываются бактериями (род Agrobacterium), грибами и механическими повреждениями.

9.     Язвы. Проявляются в виде углублений, часто окруженных наплывом. Вызываются бактериями (род Erwinia), грибами, механическими повреждениями, низкой температурой.

10.               Мозаика листьев. На листьях появляются бледно окрашенные пятна, чередующиеся с нормально окрашенными участками. Вызываются вирусами.

11.                Ведьмины метлы. Образование побегов из спящих почек в результате развития бактерий (род Rhisobium), грибов (класс Ascomycetes) и вирусов.

12.               Деформация. Проявляется в изменении формы органов растения (искривление побегов, курчавость листьев, карликовость) вследствие поражения грибами (класс Ascomycetes и Fungi imperfecti), вирусами (семейство Reoviridae).

Сосудистый бактериоз капусты: 1 – больной лист; 2 – поперечный разрез сосудов листа; 3 – продольный разрез сосудов листа

 

Бактериоз косточковых пород: 1 – корневой рак (опухоль на корнях сливы); 2 – бактериальная пятнистость листьев косточковых пород (дырчатость листьев сливы); 3 – больные плоды сливы с пятнами.

 

 

Существенно важным является, то обстоятельство, что в больных растениях заметно отклоняются от нормы обменные процессы вплоть до качественных изменений клеточных структур, что приводит к нарушению химического состава тканей и снижению содержания действующих начал в лекарственных растениях, и использование их в качестве сырья в аптечных и заводских условиях становится невозможным.

Растительный организм обладает защитными механизмами, противодействующими внедрению и размножению фитопатогенных бактерий. К ним можно отнести особенности покровных тканей, высокую кислотность клеточного сока, образование биологически активных веществ – фитонцидов, подавляющих развитие микробов.

Меры профилактики. Заключаются в дезинфекции семян и посадочного материала, дезинфекции почвы, опрыскивании растений химическими веществами, уничтожении растительных остатков, переносчиков возбудителей, удалении больных растений и изоляции здоровых.

Существующая классификация фитопатогенных бактерий  несовершенна, не всегда определена их родовая и видовая принадлежность.

Фитопатогенные бактерии относятся к родам: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Corynebacterium, Pectobacterium, Rhisobium (табл.).

Известно, что вирусы вызывают более 20% болезней растений. Большинство вирусов относится к семейству Reoviridae, родам Phytoreovirus, Fijvirus.

Из фитопатогенных грибов следует отметить два класса – аскомицеты (Ascomycetes), и несовершенные грибы (Fungi imperfecti).

 

Таблица

Фитопатогенные бактерии  – возбудители инфекционных заболеваний лекарственных растений

 

 

МИКРОФЛОРА РАСТИТЕЛЬНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СЫРЬЯ

Лекарственное растительное сырье может обсеменяться микробами на всех этапах заготовки (сбор, первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка) и хранения. При хранении сырья важно соблюдение санитарного режима в аптеках. Неблагоприятное действие оказывают: влажность, пыль, насекомые и другие факторы, повышающие микробное обсеменение и приводящие к порче лекарственного сырья. Внешними проявлениями микробной порчи растительного сырья являются изменение цвета и консистенции, загнивание, плесневение всего растения или его частей. При этом резко снижается содержание или полностью исчезают фармакологически активные вещества и использование такого недоброкачественного сырья становится бесполезным. Легко портятся плоды, ягоды и корневища, богатые углеводистыми соединениями, более устойчивыми являются сухие листья, корни, кора.

Состав микроорганизмов зависит от вида лекарственного сырья, его структуры и фармакологических свойств. Преобладают грибы (Mucor, Penicillium, Aspergillus, Saccharomyces, Candida), актиномицеты и спорообразующие виды бактерий (B. subtillis, B. megatherium).

 

 

МИКРОФЛОРА ГОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

Микробной порче подвергаются также и  готовые лекарственные формы. Под лекарственной формой понимают одно или несколько лекарственных веществ, подвергшихся специальной обработке, в результате которой им придана удобная для применения больным форма. В аптеках изготовляют следующие лекарственные формы: сухие (порошки, сборы), жидкие (микстуры, настои, отвары, капли), мягкие (мази, пасты, шарики, свечи) и стерильные инъекционные препараты.

Лекарства с повышенной обсемененностью микробами, особенно патогенными, могут вызывать инфекционные заболевания у людей, кроме того, размножение микроорганизмов в лекарственных средствах ведет к изменению их  физических и органолептических свойств, а в отдельных случаях и к превращению лекарств в токсический продукт.

Срезанные и сорванные при заготовке лекарственные растения (растительное сырье) могут содержать большое количество микробов. Растительное сырье может быть загрязнено:

1) нормальной микрофлорой растений;

2) фитопатогенной микрофлорой; т.е. микробами самих растений,

3) микробами из окружающей среды (почвы, воздуха, от людей).

Растительное лекарственное сырье может загрязняться микроорганизмами из окружающей среды на всех этапах его заготовки и хранения: сбор, первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка, получение резаного сырья, растительных порошков, а также при приготовлении брикетов, гранул, таблеток.

Срезанные и сорванные растения являются хорошей питательной средой для размножения микроорганизмов (грибов, гнилостных и целлюлозоразрушающих бактерий и др.). Поэтому происходит микробная порча сырья. Признаки порчи: изменение цвета, появление очагов размножения плесени и пр. Микробная порча приводит к изменению фармакологических свойств растений и лекарственных препаратов, полученных из растений, а также может служить причиной образования токсичных продуктов. Патогенные микроорганизмы могут вызывать заболевания у людей, использующих препараты. 

Одним из способов, препятствующих росту микроорганизмов на растениях, является их высушивание. На высушенных растениях жизнедеятельность микробов значительно снижается, многие бактерии погибают. В связи с этим, микробная порча сырья происходит в первую очередь при повышенной влажности, которая способствует размножению гнилостных микробов.

Поэтому необходимо строго соблюдать условия хранения растительного сырья и проводить бактериологический контроль его микробной загрязненности.

 

Микробная обсемененность лекарственных препаратов зависит от соблюдения в аптеке санитарно-гигиенического режима.

Микрофлора готовых лекарственных форм, изготовляемых в аптеках и на производстве, зависит от : 1) вида сырья, его питательной ценности для микроорганизмов или, напротив, его антимикробной активности, начальной загрязненности; 2) химической природы веществ, входящих в состав лекарственного средства; 3) технологии приготовления (настои, отвары, температура, время, объем и пр.); 4) условий хранения; 5) санитарно-гигиенических условий в аптеках и на фабриках.

Инъекционные препараты, глазные капли и мази, препараты для новорожденных должны быть стерильными.

В ряде случаев инъекционные средства, оставаясь стерильными, обладают пирогенными свойствами. Пирогенная реакция организма человека, возникающая за счет убитых бактерий и продуктов их распада, содержащихся в лекарственном препарате, характеризуется повышением температуры, вазомоторными расстройствами, в тяжелых случаях – шоковым состоянием. Пирогенные вещества (пирогены), представляющие собой эндотоксины (преимущественно грамотрицательных бактерий), проходят через бактериальные фильтры, не инактивируются при кипячении, для их разрушения необходимо автоклавирование в течение 3 ч.

Причиной пирогенности лекарственных препаратов, являются загрязнение дистиллированной воды, нарушение асептики технологического процесса, увеличение времени (более 1,5 ч) между приготовлением раствора и началом стерилизации.

Из инъекционных жидких лекарственных форм легче всего обсеменяются микробами настои и отвары; при их хранении появляются признаки порчи: муть, изменение цвета, пленка, необычный запах. Срок хранения этих препаратов ограничен. Спиртовые настойки меньше подвержены порче вследствие антимикробного действия алкоголя.

Сухие порошкообразные средства, особенно тальк и крахмал, мягкие лекарственные формы также подвержены микробному загрязнению. Их микробная порча носит очаговый характер и состоит в изменении цвета и консистенции вещества.

Микробный состав готовых лекарств представлен следующими группами:

1.  плесневые грибы – Penicillium, Aspergillus, Mucor;

2.  дрожжевые грибы;

3.  кокки – сарцины, стафилококки;

4.  спороносные палочки – B. subtillis, B. mesentericus.

Предупреждение микробной порчи готовых лекарственных веществ возможно при соблюдении условий, исключающих их микробное загрязнение: соблюдение правил личной гигиены фармацевтами, качественное обеззараживание воздуха аптечных помещений, правильная обработка посуды, оборудования, при необходимости (стерильные лекарственные формы) асептическое изготовление лекарств.

 

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В АПТЕКАХ

В аптеках работниками государственного санитарно-эпидемиологического надзора согласно инструкции, утвержденной приказом Министерства здравоохранения, не менее двух раз в квартал осуществляется бактериологический контроль, объектами которого служат:

1) вода дистиллированная;

2) инъекционные растворы до стерилизации;

3) инъекционные растворы после стерилизации;

4) глазные мази после стерилизации;

5) глазные капли, приготовленные в асептических условиях на стерильной основе;

6) сухие лекарственные вещества, используемые для приготовления инъекционных растворов;

7) нестерильные лекарственные формы;

8) аптечная посуда, пробки, прокладки, прочие материалы;

9) инвентарь, оборудование, руки, санитарная одежда персонала;

10) воздух аптечных помещений.

 

Микроорганизмы, попадающие в лекарства, приводят к их порче и могут изменить их качество, разлагая своими ферментами действующее начало и переводя его в другие соединения. Таким образом,. микроорганизмы могут изменять свойства лекарств, делая их неактивными или даже токсичными, например, в результате образования микробных токсинов и пирогенов. Патогенные микроорганизмы могут вызывать инфекционные заболевания у людей, использующих препараты, загрязненные микроорганизмами родов Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella и др. Среди готовых лекарственных форм наиболее загрязненными являются препараты растительного происхождения – настои и отвары. При хранении этих лекарств, особенно в теплом месте, количество микробов в них возрастает до высоких цифр, и появляются признаки порчи. Признаками микробной порчи жидких лекарственных форм является помутнение, если лекарственная форма должна быть прозрачной, появление осадка, увеличивающегося в объеме, образование пленки на поверхности, появление запаха, несвойственного данной лекарственной форме.

В связи с этим осуществляется бактериологический контроль соблюдения санитарно-гигиенического режима изготовления лекарственных препаратов на предприятиях и в аптеках и проводится санитарно-микробиологический контроль каждой сериивыпускаемой лекарственной формы, т.е. проводится определение микробной загрязненности различных готовых лекарственных препаратов.
^

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ МИКРОБНОЙ ЧИСТОТЫ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ.

Определение микрофлоры в лекарственных формах

Определение микрофлоры в лекарственных формах состоит из следующих этапов:

1.  определение общего микробного числа (микробная обсемененность);

2.  определение бактерий группы кишечной палочки;

3.  определение дрожжевых и плесневых грибов;

4.  определение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (по специальным показателям).

Общее микробное число (ОМЧ) – количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (мл) препарата, определяют по числу выросших колоний.

Определение микробной обсемененности растительного лекарственного сырья

В асептических условиях (в стерильной чашке Петри, обоженными ножницами и пинцетом) из листа или верхнего слоя корневища вырезают кусочек площадью 1 см², который помещают в пробирку с 10 мл стерильного физиологического раствора и взбалтывают в течение 5 мин. Из полученного смыва готовят четыре десятикратных разведения  (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000), для посева используют два последних разведения в связи с большой обсемененностью растительного сырья. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл смыва, после чего в нее наливают 15 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С МПА, перемешивают и после застывания агара посевы инкубируют при 37⁰С 24-48 ч. Производят подсчет выросших колоний на поверхности и в глубине агара. Полученное число колоний следует умножать на степень разведения.

Для оценки микробной обсемененности растительного сырья используется метод смывов. В асептичных условиях, используя стерильные инструменты, взвешивают 1 г сырья, помещают в стерильную пробирку с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 10 мин; берут 1 мл смыва, делаю разведения 1:10, 1:100; из каждого разведения делают посев в глубину питательной среды в чашках Петри. подсчитывают число выросших колоний и, зная разведение смыва, подсчитывают микробную загрязненность сырья. Микробную загрязненность лекарственного сырья выражают количеством клеток микроорганизмов в 1 г (мл) сырья.. Для выявления роста грибов и дрожжей используют среду Сабуро или сусло-агар, для выявления бактерий – МПА. При этом засевают 2-3 параллельные чашки на каждое разведение. Оставляют в термостате при 37°С и при 24°.

 

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ ГОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Имеются определенные требования ВОЗ и фармакопеи по микробной загрязненности различных лекарственных средств.
Микроорганизмы могут загрязнять и различные готовые лекарственные препараты. В готовые лекарственные препараты микробы попадают: 

1) из растительного лекарственного сырья (нормальная и фитопатогенная микрофлора растений);
2) из окружающей среды во время изготовления лекарственных препаратов в аптеках и на фармацевтических фабриках.

Источники микробного загрязнения лекарственных препаратов:
1) лекарственные растения; 2) вода 3) аптечная посуда, оборудование и пр.; 4) воздух производственных помещений; 5) руки персонала. Микроорганизмы могут попадать в лекарственные средства в процессе неправильного анализа, особенно органолептического. 

Лекарственные средства для парентерального введения в виде инъекций, глазные капли, мази, пленки, средства для новорожденных, должны быть стерильными. 

Стерильные инъекционные растворы могут обладать пирогенными свойствами, т.е. вызывать повышение температуры тела. Это обусловлено наличием в них убитых бактерий или продуктов их распада. Пирогены – это сложные по своей структуре вещества, которые содержат протеины, липиды и полисахариды, и вызывают в макроорганизме комплекс изменений, характеризующихся повышением температуры тела, вазомоторными расстройствами, в тяжелых случаях – шоковым состоянием. Пирогенами являются бактериальные эндотоксины. Все растворы, предназначенные для инъекций не должны содержать пирогенов. Но освободить от них готовый продукт не удается, т.к. пирогены проходят через бактериальные фильтры и устойчивы к нагреванию. 

Для этого необходимо соблюдать специальные требования при изготовлении стерильных лекарственных средств: 
1) дистиллированная вода уже до стерилизации не должна содержать кишечной палочки; 
2) общее количество микробов в воде не должно превышать 10 – 15 клеток на 1 мл;
3) препараты готовят в асептических условиях, пользуются стерильной посудой, соблюдают стерильность при их упаковке, после приготовления стерилизуют.
Проверку стерильности производят в боксах со строгим соблюдением правил асептики. Делают посев на тиогликолевую среду (для выявления различных бактерий, в том числе анаэробов) и посев на среду Сабуро (для выявления грибов, г.о. рода Кандида). Если нет роста микробов на средах, то препарат является стерильным.
Если лекарственное средство обладает антимикробным действием, то стерильностьопределяют путем мембранной фильтрации. После фильтрации исследуемого препарата фильтр делят на части и вносят для роста задержанных микроорганизмов в жидкие питательные среды. При отсутствии роста препарат считается стерильным.

Лекарственные средства, не требующие стерилизации, содержат микроорганизмы. Но их содержание не должно превышать предельно допустимых значений для различных лекарственных форм. 

Оценка микробной загрязненности нестерильных препаратов.

Определяют:
1) количество жизнеспособных бактерий в 1 г или 1 мл препарата;
2) количество жизнеспособных грибов в 1 г или 1 мл препарата; 
3) кишечную палочку и представителей семейства энтеробактерий, синегнойную палочку и золотистого стафилококка, которые не должны присутствовать в нестерильных лекарственных средствах.

^ Методы определение микробной загрязненности лекарственных средств, не обладающих антимикробным действием.

От каждой серии препарата отбирают 10 проб из 10 разных упаковок, в целом не меньше 50 г или мл. На анализ берут 30 г т(мл), разделив на 3 части по 10 г (мл).

^ Определение общего количества бактерий и грибов. 10 г (мл) разводят в 10 раз 0,1 М раствором фосфатного буфера, доводя конечный объем до 100 мл. Делают посев по 1 мл разведенного препарата двухслойным агаровым методом в 2 чашки Петри с МПА, содержащим 0,1% глюкозы для определения бактерий и по 1 мл в 2 чашки Петри со средой Сабуро с антибиотиками для грибов. ЧС 5 дней. Затем подсчитывают число колоний, находят среднее арифметическое для 2-х чашек и высчитывают количество бактерий и грибов в 1г (мл) отобранного на анализ образца.°С 5 дней, а со средой Сабуро для определения грибов при 24°ашки с МПА для определения бактерий инкубируют при 37

^ Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae. С 24 час. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на :°С 24 – 48 час. На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют малиновые колонии с металлическим блеском. На висмут-сульфитном агаре – черные или зеленовато-бурые, светло-зеленые или коричневые колонии. Колонии исследуют микроскопически и выявляют грам «-» неспоровые палочки. Подозрительные колонии пересевают на скошенный в пробирках МПА с 0,1% глюкозой и инкубируют при 37°С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Инкубируют при 37°Следующие 10 г(мл) образца вносят в 90 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 37 

1) среду с глюкозой и феноловым красным ( энтеробактерии ферментируют глюкозу и среда становится желтой); 

2) среду с нитратом калия (энтеробактерии восстанавливают нитраты в нитриты и не имеют фермента цитохромоксидазы).

Если в образце обнаружены грам «-» неспоровые палочки, которые дают отрицательную реакцию на цитохромоксидазу, ферментируют глюкозу и восстанавливают нитраты в нитриты, то делают вывод, что исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae.

^ Определение бактерий S. aureus и P. aeruginosa. С. Стафилококк коагулирует плазму.°С 24 – 48 час. Стафилококк на солевом агаре образует желтые колонии, окруженные желтыми зонами. При микроскопии обнаруживаются грам”+” кокки. С чистой культурой стафилококка ставят реакцию плазмокоагуляции. Для этого в пробирку с 0,5 мл разведенной (1:4) плазмой крови человека или кролика вводят петлю агаровой культуры стафилококка и инкубируют 1-24 час при 37°С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев петлей на чашки Петри с солевым агаром с маннитом для стафилококка и на чашки Петри со средой для идентификации синегной палочки. Инкубируют при 37°Следующие 10 г(мл) образца вносят в 90 мл накопительной среды и инкубируют при 37 

P. aeruginosa на диагностической среде образует зеленые флюоресцирующие колонии. Их идентифицируют микроскопически и биохимически. Под микроскопом бнаруживают грам «-» палочки. Реакция на цитохромоксидазу положительна (бумажка с индикатором синеет).

Нормативы. В нестерильных лекарственных средствах для приема внутрь в 1 г (мл) должно быть не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов, а также должны отсутствовать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы – представители семейства энтеробактерий, синегнойная палочка и золотистый стафилококк.

Лекарственные средства для местного применения (полость уха, носа, интравагинально) не должны содержать более 100 (суммарно) микробных клеток в 1 г (мл).

В таблетированных препаратах не должно быть патогенной микрофлоры, а общая обсемененность не должна превышать 10 тыс. микробных клеток на 1 таблетку.

Бактериологическое исследование стерильных лекарственных средств

Инъекционные растворы, глазные капли, лекарственные средства для новорожденных, а также другие лекарственные препараты, стерилизуемые в процессе их изготовления, засевают неразведенными в тиогликолевую среду для определения микробной обсемененности и среду Сабуро для выявления дрожжевых и плесневых грибов. Посевы на тиогликолевой среде выдерживают 14 сут при 37⁰С, на среде Сабуро 14 сут при 24⁰С. Учет результатов посевов проводят по отсутствию видимых изменений в посевах.

Определение микробной обсемененности готовых лекарств

Жидкие лекарственные формы разводят стерильным физиологическим раствором 1:10 (или 1:100) и засевают в объеме 0,5 мл на МПА в чашке Петри.

1 г порошка или таблеток помещают в пробирку с 10 мл физиологического раствора и после растворения производят посев на МПА.

Мягкие лекарственные формы (мази, пасты) в количестве 1 г взвешивают в асептических условиях, переносят в пробирки с 10 мл стерильного 1,4% раствора натрия гидрокарбоната для диспергирования, которое производят вращательным движением  пробирки между ладонями в течение 2-4 мин. 0,5 мл полученного раствора засевают на МПА в чашках Петри.

Чашки с посевами помещают в термостат на 48 ч, затем подсчитывают число бактериальных колоний и определяют количество бактерий в 1 мл или 1 г образца.

Определение общего количества грибов

Определение общего количества грибов проводят на твердой среде Сабуро, на которую засевают 0,5 мл цельного или разведенного 1:10 препарата. Посевы инкубируют при 24⁰С в течение 5 сут, затем подсчитывают число выросших колоний и определяют количество грибов в 1 мл или 1 г препарата.

Качественное определение условно-патогенных

и патогенных микроорганизмов

1. Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Salmonella, Shigella).

Посев лекарственных средств  производят на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Идентификацию энтеробактерий осуществляют следующим образом: если в образце обнаружены грамотрицательные неспоровые палочки, дающие отрицательную реакцию на цитохромоксидазу, ферментирующие глюкозу и восстанавливающие нитраты в нитриты, исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae

2. Определение патогенных стафилококков.

Определение патогенных стафилококков производят посевом препарата на желточно-солевой агар. На этой среде патогенные стафилококки вызывают лицитовителлазную реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком по периферии. Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

3. Выявление Pseudomonas aeruginosa.

Осуществляют на среде с глицерином. Синегнойная палочка на этой среде образует зеленоватые флуоресцирующие колонии, выделяющие в среду сине-зеленый пигмент.

4. Выявление протея.

Производят посевом на МПА по Шукевичу.

Наличие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в лекарственных препаратах недопустимо.

В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI издания приняты следующие критерии оценки микробной обсемененности лекарственных средств (табл.)

Таблица

Нормативы предельно допустимого содержания

непатогенных микроорганизмов в лекарственных формах

 

Определение на пирогенность

Пирогенность (повышение температуры тела) обусловлена наличием в стерильных лекарственных препаратах убитых бактерий и продуктов их распада (липополисахаридов).

Стерильные инъекционные растворы должны быть апирогенны.

Определение на пирогенность проводят на здоровых кроликах обоего пола, не альбиносах, весом 2,5-3,0 кг, содержащихся на полноценном рационе. Испытуемую дистиллированную воду или лекарственные средства вводят трем кроликам в ушную вену в количествах и растворителях, предусмотренных соответствующими инструкциями.

Воду для инъекций и раствор лекарственного средства считают непирогенными если сумма повышений температуры у 3 кроликов меньше или равна 1,4⁰С. Если сумма превышает 2,2⁰С, то испытуемые растворы считают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений температуры у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2⁰С, испытание проводят на 5 кроликах. В этом случае воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7⁰С.

 

Бактериологическое исследование в аптеках

С целью проверки качества мытья посуды, санитарного состояния аптек, соблюдения правил личной гигиены персоналом проводят санитарно-бактериологическое  исследование аптечной посуды, оборудования, рабочих столов, полотенец, санитарной одежды и рук аптечных работников.

Для определения микробной загрязненности используют метод смывов с поверхности исследуемых объектов стерильным физиологическим раствором.

Приготовление смывов. Для исследования используют 3 флакона. В один из флаконов наливают 10 мл стерильного физиологического раствора, ополаскивают внутреннюю поверхность сосуда, переливают во второй и третий флаконы, последовательно ополаскивая их.

Пробки (корковые, полиэтиленовые, резиновые) в количестве  5 штук стерильным пинцетом помещают в широкогорлую стерильную колбу, закрытую ватно-марлевой пробкой, заливают 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно прополаскивают.

Воронки, пробирки, пипетки ополаскивают 10 мл стерильного физиологического раствора.

Смыв со стола производят с поверхности 100 см², для чего используют специальные трафареты из проволоки или жести, стерилизуемые прокаливанием перед взятием смывов. Смыв осуществляется стерильным ватным тампоном, помещенным в пробирку с 2 мл стерильного физиологического раствора (тампон не должен касаться поверхности раствора). Непосредственно перед взятием смыва тампон смачивают физиологическим раствором, тщательно протирают поверхность стола ограниченную трафаретом, помещают в пробирку, в которую добавляют 8 мл стерильного физиологического раствора и тщательно тампон прополаскивают.

Смывы с рук берут влажным тампоном (тампон находится в пробирке с 2 мл стерильного физиологического раствора), протирая ладони, подногтевые, межпальцевые пространства обеих рук. Тампон помещают в пробирку, добавляют 8 мл стерильного физиологического раствора и тщательно его прополаскивают.

Смывы исследуют на общее бактериальное загрязнение (ОМЧ), на наличие кишечной палочки и золотистого стафилококка; обнаружение которых свидетельствует о грубых нарушениях санитарного режима в аптеках.

Определение микробного числа.  1 мл смыва вносят в стерильную чашку Петри, заливают 12-15 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С МПА, тщательно перемешивают содержимое чашки и после застывания агара ее помещают в термостат на 24-48 час. Подсчитывают количество выросших колоний, умножают на 10 и определяют общую микробную обсемененность объекта.

Определение бактерий кишечной палочки как показателя фекального загрязнения. Остаток смывной жидкости (около 8 мл) засевают в пробирку, содержащую 1 мл  концентрированной среды Эйкмана. Посев инкубируют при 43⁰С 24 ч. При наличии газообразования в среде производят высев на дифференциально-диагностическую среду Эндо в случае появления типичных темно-красных колоний производят микроскопию и ставят оксидазную пробу.

Критерии оценки микробной обсемененности аптечной посуды, рабочих столов, рук персонала.

1.     При исследовании микробной загрязненности посуды, оборудования, рук аптечных работников количество мезофильных аэробов и факультативных анаэробов не должно превышать 150 в 10 мл смывной жидкости.

2.     При бактериологическом исследовании в аптеках наличие бактерий группы кишечной палочки и золотистых стафилококков не допускается.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха аптечных помещений. Включает определение общего микробного числа воздуха и санитарно-показательных микробов. Исследование проводят аспирационным методом с помощью аппарата Кротова, ПАБ и др. Скорость прокачивания воздуха должна быть не менее 25 л/мин. Количество пропущенного воздуха 100 л для определения общего количества бактерий и 250 л для выявления золотистого стафилококка, дрожжевых и плесневых грибов.

Для получения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов – сусло-агар или среду Сабуро, золотистого стафилококка – желточно-солевой агар. После инкубации в термостате проводят подсчет количества выросших колоний и делают перерасчет на 1 м³ воздуха (табл.).

Таблица

Повышенное микробное загрязнение воздуха аптеки, аптечного оборудования, посуды и тары, рук персонала, растительного сырья, свидетельствующее о нарушениях санитарного режима и правил личной гигиены работников, является причиной микробной обсемененности готовых лекарств (табл. 8). Поэтому необходимо принятие срочных мер по наведению санитарного порядка: тщательная мойка посуды, влажная уборка помещения с дезинфицирующими веществами, обеззараживание воздуха бактерицидными лампами, мытье рук персонала в соответствии с инструкцией, работа в чистых халатах и колпаках.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

В зависимости от среды обитания микроорганизмы разделяют на свободноживущие и паразитические. Свободноживущие заселяют лито-, гидро- и атмосферу, обитают и в различных антропогенных средах (жилища, одежда, продукты, химические препараты, в том числе лекарственные и др.). Попадая в организм человека, они могут иногда вызывать инфекционное заболевание.

 

МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ

Почвы являются важнейшей средой обитания микроорганизмов. Вместе с растениями и животными они составляют сложные и многообразные биогеоценозы, состав которых, плотность, функциональная активность и прочие характеристики зависят от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, влажности, концентрации углекислого газа, осмотического давления, интен­сивности инсоляции. Существенное влияние на состав микро­биоценозов оказывают агротехнические мероприятия, такие как вспашка, мелиорация, внесение, удобрений, ядохимикатов и др. Плотность микрофлоры особенно высока в черноземных, каштановых почвах, хорошо удобряемых сероземах. Она максимальна на глубине 10—20 см. В верхнем слое почвы и на глубине свыше 1—2 м микроорганизмы встречаются в незначительном количестве.

Микроорганизмы почвы участвуют во всех процессах трансформации вещества и энергии: осуществляют синтез биомассы и аккумуляцию энергии, биологическую фиксацию азота, броже­ние, гниение (аммонификацию), нитрификацию, денитрификацию, трансформацию серы, фосфора и других элементов.

Почва содержит также микроорганизмы, поступающие из воды, воздуха, от животных, растений. С фекально-бытовыми, сточ­ными водами различных предприятий в почву попадают патоген­ные и условно-патогенные для человека микроорганизмы. В нормально функционирующей почве интенсивно протекает процесс самоочищения, в результате чего относительно быстро перерабатываются органические вещества в гумус и почва освобожда­ется от несвойственных ей микроскопических грибов и бактерий.

Сроки переживания патогенных для человека микробов в почве широко варьирует в зависимости от их вида и интенсивности процессов самоочищения. Аспорогенные патогенные и условно-патогенные бактерии, вирусы выживают в течение нескольких дней, недель или месяцев; споры возбудителей столбняка, сибир­ской язвы, анаэробной раневой инфекции могут сохраняться мно­го лет. Для возбудителей ботулизма, актиномикоза, глубоких микозов, микотоксикозов почва является естественной средой обитания.

 

 

Рис. Колонии микроорганизмов почвы

 

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бакте­рий и бактерий — показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием бактерий, свидетельствующих о фекальном загрязнении  (санитарно-показательные бактерии), рассматривают как санитарно неблагополучные. Для определения давности фекального загрязнения почвы определяют несколько санитарно-показательных организмов. Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерии родов Citrobacter и Enterobacter — на несвежее, a Clostridium perfringens — на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса — количества бакте­рий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра — массы почвы (в граммах), в которой обнаружена особь вида Cl. perfringens, общей численности са­профитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

 

МИКРОФЛОРА ВОДОЕМОВ

Вода открытых морских и пресноводных водоемов, так же как и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших. В грунтовых водах содержатся единичные микро­организмы. Микрофлора водоемов разделяется на собственную (аутохтонную) и заносную, поступающую из почвы, воздуха, живых организмов.

Количественный и качественный состав микробиоценозов за­висит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, кон­центрации кислорода и углекислого газа, скорости движения воды и особенно от массивности поступления ливневых, фекаль-но-бытовых и промышленных сточных вод. Они несут с собой большое количество органических веществ, промышленных отхо­дов и различных микробов.

Состав микроорганизмов и их функции различны на поверхности воды и на дне водоемов (в иле). В иле активно протекают процессы гниения и брожения, хемоаутотрофного, метилтроф-ного и гетеротрофного синтеза. На поверхности воды микро­организмы образуют пленку, в которой энергично протекают про­цессы фотосинтеза. В прибрежной зоне открытых водоемов, особенно вблизи крупных населенных пунктов, вода содержит большое количество заносных микробов, в том числе патоген­ных и условно-патогенных для человека, обитающих в кишечни­ке животных и самого человека.

Хотя вода и неблагоприятна для существования патогенных и условно-патогенных микробов, многие из них способны пережи­вать в ней определенное время, а в некоторых случаях даже размножаться. Сроки выживания патогенных микробов в воде зависят главным образом от их вида, контаминирующей дозы, температуры воды, степени насыщения воды органическими ве­ществами и состава сапрофнтических микробов.

Определенное влияние на продолжительность выживания оказывают химический состав, рh воды, солнечная радиация, тип  водоисточника. Споры возбудителя сибирской язвы могут сохра­няться в воде годы; многие месяцы переживают в воде энтеро-вирусы, сальмонеллы, лептоспиры, вирус гепатита А; меньше (дни, недели) — возбудители дизентерии, холеры, бруцеллеза. Условно-патогенные аспорогенные бактерии выживают в воде в течение нескольких недель.

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу — количеству мезофильных хемоорга-нотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру — наимень­шему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу — количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300, коли-индекс — не более 3, а микробное число — не более 100.

     

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды

(Приказ МЗО Украины от 23.12.1996 г.)

 

 

Рис. Определение коли-титра и коли–индекса воды (метод мембранных фильтров).

Рис. Микроорганизмы на фильтре (метод мембранных фильтров). Электронная фотография.

 

 

Рис. Colilert тест (ферментный метод)

 

 

 

 

 

 

МИКРОФЛОРА    ВОЗДУХА

Воздух непригоден для размножения микроогранизмов, так как в нем недостаточно влаги и питательных веществ, а солнечная радиация и высушивание действуют на микроорганизмы губительно. Обнаруживаемые в воздухе микробы поступают главным образом из почвы, с поверхности растений и жи­вотных, с продуктами отходов некоторых производств.

Видовой и численный состав микрофлоры атмосферного воз­духа малочислен, вариабелен и динамичен. Он зависит от интенсивности солнечной радиации, ветра, метеоосадков, покрова почвы, плотности населения и др. Преобладают споры грибов, актиномицетов, бацилл, пигментообразующие виды аспо-рогенных бактерий. Воздух жилых помещений содержит в основ­ном микрофлору дыхательных путей и кожи человека, мно­гие представители которой способны переживать в воздухе в течение времени, достаточного для инфицирования находящихся в нем людей.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу — количеству осо­бей, обнаруженных в 1 м³ воздуха, наличию санитарно-показа-тельных бактерий — представителей микрофлоры дыхательных путей (гемолитические стрептококки, золотистый стафилоккок). ГОСТ на микробную обсемененность воздуха пока отсутствует.

 

Критерии оценки микробного загрязнения  воздуха в помещениях больницы

Исследуемый обьєкт	Микробное число	Staph. aureus (в 250 л)
Воздух операционных: до начала работы во время работы Воздух родильных залов	Не больше 500 Не больше 1000 Не больше 1000	Не должно быть То же самое То же самое

 

    

 

Рис. Колонии бактерий на МПА после посева микрофлоры воздуха седиментационным методом

 

Рис.  Аппарат Кротова

 

 

МИКРОФЛОРА ДРУГИХ СРЕД

Кроме почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов, микроорганизмы обнаруживаются на разнообразных предметах в окружении человека. Эти объекты могут быть разделены на три группы: бытовые, производственные и медицинские. К бытовым объектам относятся внутренние поверхности помещений, мебель, посуда, белье, одежда, обувь, средства уборки, книги, игрушки, картины, кухонные принадлежности и др.; к производственным — сырье, оборудование, продукция, инструментарий и т. д. В медицинских учреждениях, кроме бытовых предме­тов, имеются также специфические медицинские объекты. К ним относятся медицинский инструментарий и оборудование, перевязочный и шовный материалы, лекарственные препараты, раст­воры дезинфектантов, антисептиков, спецодежда, предметы ухода за больными. В перечисленных объектах обнаруживаются как свободноживущие, так и паразитические микроорганизмы. Главным источником контаминации (загрязнения) условно-патогенными и патогенными видами микроорганизмов являются выделения человека и реже — животных. Ряд возбудителей инфекционных заболеваний (легионеллы, псевдомонады, протеи, клебсиелла пневмонии, иерсинии) способны размножаться на некоторых объектах внешней среды (ванные, душевые и др.). Другие микроорганизмы — возбудители контактных, кишечных и ка­пельных инфекций — сохраняются в окружающей среде в течение определенных сроков, достаточных для передачи новому хозяину. Эти сроки колеблются от нескольких минут (возбудители кори, коклюша, сифилиса) до многих месяцев (возбудитель туберкулеза и лет (споры возбудителя сибирской язвы).

Санитарный контроль за микробной контаминацией проводится в медицинских и детских учреждениях, предприятиях общественного питания и по производству продуктов питания, в эпидемических очагах инфекционных болезней. Показателями микробной контаминации являются общее микробное число, наличие БГК.П, а также протея, энтерококка, синегнойных бактерий, стафилококка и различных видов патогенных бактерий, главным образом возбудителей кишечных и капельных инфекций.

 

РОЛЬ СВОБОДНОЖИВУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОЗНИКНОВЕНИИ И СУЩЕСТВОВАНИИ БИОСФЕРЫ

Формирование биосферы произошло около 3 млрд лет тому назад, когда единственными обитателями Земли были прокариотические бактерии. Это позволяет допустить их участие в фор­мировании биосферы планеты в сочетании с геологическими и атмосферными явлениями.

В современнную эпоху развития Земли, заселенной разнообразными видами растений, животных, грибов, водорослей, доминирующая роль в жизнедеятельности биосферы принад­лежит также микроорганизмам. Они активно участвуют в кру­говороте веществ и энергии (биогеохимические циклы). Как известно, животные и растения синтезируют большее количество органических веществ, чем может быть минерализовано ими самими или под действием абиогенных факторов. Это могло бы привести к «эффекту складирования», лимитирующему содержа­ние таких жизненно важных элементов, как азот, углерод, се­ра, фосфор и др.; к сужению возможностей проявления жизни, а в последующем и к ее прекращению. Микроорганизмы в отличие от животных и растений способны трансформи­ровать все органические вещества, в том числе синтезируемые животными и растениями. Кроме того, они самостоятельно осуществляют синтез биомассы и ее разложение до исходных элементов. Так, азотфиксирующие бактерии из молекулярного азота воздуха синтезируют белки, аммонификаторы трансформируют белки в аммиак и его соли, нитрифицирующие бактерии превращают аммонийные соли в соли азотной кислоты, а денит-рофикаторы восстанавливают их в молекулярный азот. Одни микроорганизмы из диоксида, углерода, карбонатов и минераль­ных веществ синтезируют углеводы, другие в процессе брожения снова превращают их в диоксид углерода  и карбонаты.

Такая трансформация происходит также с серой, которую микроорганизмы окисляют до серной кислоты, а затем восстанавливают до серы, с фосфором, водородом и другими элемента­ми. Эти биогеохимические циклы возникли на заре жизни, они протекают и в современный период, когда главным проду­центом биомассы стали растения, а главным ее минерализатором — микроорганизмы.

На важную роль микроорганизмов в существовании современной биосферы указывает количество суммарной биомассы прокариотических  бактерий  в  природных  субстратах  планеты, равное 74,46 • 10⁹ т, в то время как для растений оно составля­ет — 55 • 10⁹ т, животных — 0,55 • 10⁹ т, простейших и почвен­ных водорослей— 1,5 • 10⁹ т. При этом метаболическая актив­ность биомассы бактерий в десятки и даже сотни раз превышает таковую животных и растений.

Велика роль микроорганизмов в синтезе «парниковых эле­ментов», которые определяют климат атмосферы. Два из них — метан и оксиды азота — синтезируются только бактериями. Главный «парниковый элемент» — диоксид углерода — поступает в атмосферу в результате разложения органических веществ грибами (около 50—70% всей массы) и бактериями (около 30—50%  массы  без учета  искусственного сжигания топлива).

 

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Проблема охраны окружающей среды состоит в сохранении экологического равновесия в биосфере. Микробиологические ас­пекты этой проблемы определяются той важной ролью микроор­ганизмов в существовании биосферы, о которой было сказано выше.

Первый аспект — это охрана групп микроорганизмов, участ­вующих в круговороте веществ. Негативное действие антропо­генных факторов, прежде всего промышленных и автомобильных выбросов, проявляется в замедлении или полном прекращении процессов синтеза биомассы и ее трансформации. Подавление деятельности нитрифицирующих бактерий приводит к накоплению в воде и почве аммиака, солей аммония и азотистой кислоты, повышению активности денитрифицирующих бактерий. Это резко снижает количество нитратов, которые являются глав­ным источником азота для растений в природных экосистемах. Подавление бактерий-аммонификаторов приводит к накоплению в почве и воде неразложившихся органических веществ и исключению, таким образом, азота из круговорота веществ. Подавле­ние азотфиксирующих бактерий снижает концентрацию биоген­ного азота и приводит к нарушению экологического баланса между ним и атмосферным азотом, обеднению почв гумусом, сни­жению их плодородия. Антропогенные факторы оказывают также негативное воздействие на круговорот углерода, серы, фосфора и других элементов. В результате описанных процессов возможности жизни микроорганизмов в экосистемах сужаются и они часто погибают.

Второй аспект, требующий внимания, заключается в необходимости дифференцированного отношения к микроорганизмам, осуществляющим биодеградацию. С одной стороны, следует охранять микроорганизмы, которые разрушают попадающие в воду и почву ксенобиотики — соединения, обычно не встречающиеся в природе и появляющиеся в ней в результате деятельности человека. Многие из ксенобиотиков обладают токсическим, аллергенным, тератогенным, канцерогенным действием на человека. С другой стороны, необходимо подавлять развитие или даже уничтожать микроорганизмы, которые наносят ущерб народному хозяйству, вызывая порчу зерна, овощей, фруктов, ягод, мяса, рыбы, молока и продуктов из них, лекарств, а также вызыва­ют разрушение различных материалов, водопроводной и канали­зационной сети.

И наконец, третий аспект — это защита биосферы от кон­таминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

С развитием молекулярной генетики возникла проблема за­щиты природы от искусственных мутантов, а с выходом человека в космос — предупреждение заноса на нашу планету внеземных и попадания в космос земных микроорганизмов.

 

МИКРОФЛОРА ТЕЛА ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА

Человек является обитателем биосферы Земли, населенной огромным количеством разнообразных микроорганизмов. При этом он и сам служит источником поступления в окружающую среду множества микроорганизмов.

Однако человек не рождается на свет с той микрофлорой, которая формируется в его организме в процессе его жизнедеятельности. Пока ребенок находится в чреве матери, он стерилен. При рождении ребенка и затем в течение ряда лет после рождения формируется характерный для определенных биотопов его организма микробный «пейзаж». Аутомикрофлора взрослого человека остается постоянной.

На основании современных воззрений организм человека является определенной экологической нишей для множества разнообразных микроорганизмов, которые формируют своего рода биотопы, являющиеся достаточно сложными системами, сформировавшимися в процессе эволюции и выполняющими многочисленные функции в организме человека. Для биотопов, наряду с многокомпонентностью и количественным разнообразием входящих в них представителей микрофлоры, характерна определенная колониальная резистентность, то есть постоянство микробного сообщества, что обеспечивает естественные механизмы защиты и нормальное функционирование микробного биоценоза, а также устойчивость применительно к особенностям макроорганизма. Безусловно, нормальное функционирование биотопов является важным фактором, отражающим состояние общего здоровья.

Наличие четырех основных биотопов, а именно аутомикрофлоры кожи, слизистой полости рта, кишечника и урогенитальной области, позволяет рассматривать человеческий организм как своеобразный прокариотический орган (рис.). При этом изменения в одном из биотопов могут приводить к нарушениям резистентности в других, а также провоцировать развитие либо обострение различных заболеваний.

Наличие четырех основных биотопов, а именно аутомикрофлоры кожи, слизистой полости рта, кишечника и урогенитальной области, позволяет рассматривать человеческий организм как своеобразный прокариотический орган (рис.). При этом изменения в одном из биотопов могут приводить к нарушениям резистентности в других, а также провоцировать развитие либо обострение различных заболеваний.

На формирование микрофлоры биотопов оказывает влияние множество как эндогенных, так и экзогенных факторов  (рис. 2). Заселение микробиоты кишечника начинается с момента рождения ребенка, проходит несколько этапов, что напрямую связано с изменением характера питания, и в большей степени затрагивает количественный межвидовой состав. Завершается процесс формирования в препубертатном периоде.

 

 

 

    Факторы, влияющие на состояние нормальной микрофлоры.

   1. Эндогенные:
    1) секреторная функция организма;
    2) гормональный фон;
    3) кислотно-основное состояние.
    2. Экзогенные условия жизни (климатические, бытовые, экологические).
Микробное обсеменение характерно для всех систем, имеющих контакты с окружающей средой. В организме человека стерильными являются кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы: сердце, мозг, паренхима печени, почек, селезенки, матка, мочевой пузырь, альвеолы легких.

В значительной части микрофлора тела одинакова у всех людей в сравниваемых биотопах, но в составе микробиоценозов имеются индивидуальные различия. Они носят часто количественный, но порою и качественный характер. Изучение этой индивидуальной характеристики аутофлоры имеет значение при формировании космических экипажей и других групп людей для работы в изолированных от внешних воздействий условиях, но в тесном контакте друг с другом. Обмен микрофлорой происходит также в закрытых коллективах, например в детских садах, яслях, школах, казармах, больницах и др. Такой обмен может быть опасным, так как многие из микроорганизмов, входящих в состав микрофлоры человека, являются условно-патогенными.

Врач любой специальности должен знать качественный и количественный состав микрофлоры отдельных биотопов человека, их различия в зависимости от возраста. При использовании антимикробных средств для лечения больных инфекционными заболеваниями врач должен помнить о возможной гибели отдельных представителей аутофлоры и корректировать такие нарушения в качественно-количественном составе микрофлоры.

Микробный «пейзаж» отдельных биотопов тела человека различен и требует раздельного рассмотрения.

Микрофлора кожи. Различают собственную микрофлору ко­жи и транзиторную, заносную. Микробы последней категории быстро погибают под влиянием бактерицидных свойств кожи, антагонизма аутохтонных видов. Постоянная микрофлора представлена главным образом стафилококками (эпидермальными в первую очередь, но и золотистыми, сапрофитными также) и ко-ринебактериями. Место постоянного обитания — роговой слой кожи, протоки сальных желез, волосяные мешочки. У некоторых людей обнаруживаются стрептококки, дрожжеподобные грибы рода Candida, спорообразующие аэробные бактерии. Количество микроорганизмов на разных участках кожи варьирует от сотен до тысяч на 1 см² и зависит от пола, возраста. Наибольшее число микроорганизмов у взрослых людей обитает в складках кожи. Видовой состав их заметно меняется по мере приближения к естественным выходам полостей.

Кожа является внешним покровом, состояние которого зависит от состояния здоровья человека. Часто кожа первая сигнализирует о возникновении патологии в организме, что проявляется в снижении ее стерилизующей активности.

Определение микрофлоры кожи имеет большое практическое значение. Помимо выявления уровня общей резистентности (по индексу бактерицидности), изучают качественный состав микрофлоры кожи у больных перед операциями, в динамике лечения антибиотиками, гормонами, лучистой энергией, определяя как поверхностную, так и глубинную микрофлору. Обследованию подвергаются также персонал клиник, детских учреждений, работники пищевых предприятий и др.

 

Рис. Электронная фотография микрофлоры кожи

 

Микрофлора желудочно-кишечного тракта

На формирование микрофлоры биотопов оказывает влияние множество как эндогенных, так и экзогенных факторов (рис. 2). Заселение микробиоты кишечника начинается с момента рождения ребенка, проходит несколько этапов, что напрямую связано с изменением характера питания, и в большей степени затрагивает количественный межвидовой состав. Завершается процесс формирования в препубертатном периоде.

Биотоп кишечника является наиболее представительным и по численности, и по видовому разнообразию — так, в нем может встречаться до 500 видов различных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов). При этом в разных отделах самого биотопа количество и состав микроорганизмов различен, в тонком кишечнике микробов меньше и это преимущественно лактобациллы, стрептококки и вейлонеллы, в толстом кишечнике их больше и преобладают кишечные палочки с нормальными ферментативными свойствами, бифидобактерии и лактобактерии. Основными функциями, которые и обеспечивают представители нормальной биоты кишечника, являются: выработка ферментов, участвующих в метаболизме белков, липидов, жиров, нуклеиновых и желчных кислот, формирование механизмов иммунной защиты, поддержание гомеостаза организма, продукция биологически активных веществ и витаминов, детоксикация эндогенных и экзогенных субстратов и многие другие.

Микрофлору кишечника принято подразделять на постоянную (защитную, сапрофитную) и оппортунистическую (условно-патогенную) (рис. 3). Постоянная защитная микрофлора наиболее многочисленная (до 95%) и в основном представлена лактобактериями, бифидобактериями и кишечной палочкой с нормальными ферментативными свойствами. Как раз они и обеспечивают колониальную резистентность биотопа кишечника: так, бифидобактерии, лактобактерии выделяют молочную, уксусную кислоты, другие вещества, обладающие избирательным антимикробным действием, что подавляет избыточное размножение условно-патогенной микрофлоры и препятствует проникновению и закреплению на слизистой патогенных микробов. Помимо этого компоненты клеточной стенки данных бактерий способны активировать систему врожденного иммунного ответа, что приводит к запуску адаптивных механизмов иммунной защиты. Так, бифидобактерии стимулируют клеточное звено иммунитета и участвуют в синтезе иммуноглобулинов. Плюс ко всему эти бактерии являются естественными биосорбентами и способны сорбировать соединения тяжелых металлов, фенолов, формальдегидов и других токсичных вещества. Однако считается, что, скорее всего, недостаточное количество лактобактерий является основным отягощающим фактором при атопическом дерматите. Именно лактобактерии в значительной степени снижают всасывание аллергенов в кишечнике и стимулируют синтез иммуноглобулинов класса А, которые, особенно в раннем детском возрасте, являются основными антителами против пищевых аллергенов.

 

Микрофлора полости рта, носоглотки представлена большим разнообразием видов бактерий, грибов, простейших, вирусов.

Рис . Микрофлора ротовой полости  в тушевом препарате.

 

Микрофлора желудка бедна. Несмотря на попадание с пищей, слюной большого количества микроорганизмов, в 1 мл желудочного содержимого обнаруживается лишь несколько десятков тысяч особей и в основном — кислотоустойчивые (лактобактерии, дрожжи и др.). Большинство попадающих в этот биотоп микроорганизмов погибают под действием соляной кислоты желудочного сока.

Микрофлора тонкой кишки на всем протяжении различна. В верхних отделах, 12-перстной кишке обнаруживаются лактобактерии, отличающиеся по адгезивным свойствам от тех, что находят в полости рта и желудка, бифидумбактерии, фекальные стрептококки. Количество их 10⁴—10⁵ на 1 мл содержимого. По ходу кишки микрофлора несколько меняется: количество перечис­ленных видов нарастает и появляются представители, характерные для толстой кишки.

 

Микрофлора толстой кишки наиболее разнообразна и велика по сравнению со всеми другими биотопами  по числу видов и количеству обнаруживаемых микробов. В толстой кишке содержится около 1,5 кг различных микроорганизмов. В 1 грамме содержимого слепой кишки обнаруживают около 2 миллиардов микробных клеток (представители 17 семейств, 45 родов, 500 видов). Плотность заселения микроорганизмами увеличивается к дистальному отделу тонкой кишки, резко возрастает в толстой кишке, достигая максимальных значений на уровне ободочной кишки. Толстая кишка человека в наибольшей степени колонизирована микроорганизмами. Количество бактерий в фекалиях может достигать 5х10¹² КОЕ/г содержимого (количество образующих колонии микроорганизмов – колониеобразующих единиц – на 1 грамм фекалий). В прямой кишке плотность обсеменения составляет до 400 миллиардов бактерий на 1 грамм содержимого.

Численно превалируют анаэробы: бифидумбактерии, бактероиды, лактобактерии, вейллонеллы, клостридии, пептококки. Они составляют 96—99 % всей микрофлоры данного биотопа. Аэробы и факультативные анаэробы (1—4 %) представлены энтеробактериями, стафилококками, стрептококками (главным образом фекальными), дрожжеподобными грибами рода Candida, кишечными амебами и др.

В микрофлоре желудочно-кишечного тракта различают мукозную (М) флору, тесно ассоциированную со слизистой оболочкой вследствие выраженной адгезии, и просветную (П) флору. Состав М- и П-флоры различен. М-флора более стабильна и представлена главным образом бифидумбактериями и лактобактериями, которые обусловливают колонизационную резистентность толстой кишки, образуя слой так называемого «бактериального дерна». Последний препятствует пенетрации слизистой оболочки патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, конкурируя с ними за взаимодействие с рецепторами эпителиальных клеток. Просветная флора наряду с бифидум- и лактобактериями включает и других постоянных обитателей кишечника.

Состав микрофлоры кишечника меняется в течение жизни человека. Так, сразу после рождения в кишечнике грудных детей, находящихся на вскармливании молоком матери, развивается бифидум-флора, которая формируется на 5—6-й день и становится основой микробиоценоза здорового ребенка. Количество этих микроорганизмов в 1 г фекалий составляет 10⁹—10’° осо­бей, их развитие стимулируют вещества, находящиеся в грудном молоке. У детей, искусственно вскармливаемых, а также у недо­ношенных, слабых детей формирование бифидумфлоры отодвигается во времени. В микробиоценозе их кишечника почти в равных соотношениях находятся кишечные палочки, энтерококки, стафилококки и лактобактерии. Такие дети чаще, чем получающие материнское молоко, страдают кишечными заболеваниями.

При переводе детей на коровье молоко появляются грамотрицательные анаэробы, увеличивается число энтеробактерий, кокков. При правильно -сформировавшемся микробиоценозе кишечника преобладают бифидумбактерии, лактобактерии, обеспечивающие поддержание здоровья человека.

 

Микрофлора дыхательных путей. Большая часть микроорганизмов вдыхаемого воздуха (³/4—⁴/s) задерживается в полости носа, где погибает через некоторое время. В отделяемом  зева, трахеи, бронхов,  носа  в  норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans,  Neisseria,  Corynebacterium, Lactobacillus,  Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumonia, S. pyogenes.  Это явление расценивается как резидентное носительство.

Слизистая оболочка трахеи и бронхов сохраняется стерильной благодаря очищению вдыхаемого воздуха при его прохождении через верхние дыхательные пути, а отдельные микроорганизмы выбрасываются движениями ворсинок эпителия или уничтожаются макрофагами и другими фагоцитирующими клетками. Только при нарушении активности эпителия бронхов (например, при ингаляционном наркозе, заболеваниях дыхательной системы, иммунодефиците) микроорганизмы могут проникнуть вглубь бронхиального дерева. Мелкие бронхи, альвеолы, паренхима легких человека свободны от микроорганизмов.

Незрелость детского организма, особенно у недоношенных детей, сказывается на функциональном состоянии легких. Снижение синтеза сурфактанта, недостаточная продукция иммуноглобулина А у детей раннего возраста является важным фактором, определяющим несовершенство защитных механизмов “органов дыхания, и может быть одной из причин респираторных заболе­ваний и их тяжелого течения в этом возрасте.

Микрофлора конъюнктивы глаза бедна. Бактерицидное свойство слезной жидкости обеспечивает уничтожение большинства попадающих на слизистую оболочку глаза микроорганизмов. в норме только с конъюнктивы и в  небольшом  количестве  регулярно выделяются Staphylococcus epidermidis,  Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudodiphteriticum,  непатогенные  микроорганизмы семейства Neisseriaceae,  Sarcina.  У отдельных лиц временно могут выделяться Staphylococcus   aureus,    микроорганизмы семейства Streptococсaceaе  (S. pneumoniae,  S. feacalis, S. viridans), представители  семейства  Enterobacteriaceae,  рода   Haemophilus,   микоплазмы.  Количество их не бывает большим, но при снижении естественной защиты могут возникать воспалительные процессы, эндогенные инфекции.

Микрофлора мочеполовой системы. Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре стерильны. В нижней части уретры встречаются неспорообразующие анаэробы: пептококки, пептострептококки, бактероиды, а также коринебактерии, микобактерии и грам-отрицательные бактерии кишечного происхождения. На наружных половых органах обитают микобактерии смегмы, морфологичес­ки сходные с микобактериями туберкулеза, и сапрофитная трепонема, морфологически сходная с возбудителем сифилиса. Кроме того, здесь встречаются стафилококки, микоплазмы.

Микрофлора влагалища формируется у девочек спустя 12— 24 ч после рождения и сначала состоит из молочнокислых бактерий, полученных от матери при родах. Затем в микробиоценоз влагалища включаются энтерококки, стрептококки, стафилококки, коринебактерии. С наступлением половой зрелости (эстрогенизация организма собственными гормонами, понижение рН влагалищного секрета до 4,0—4,2) развиваются палочки Додерлайна. Полость матки стерильна.

Различают несколько категорий чистоты влагалища здоровых женщин: 1-я категория: реакция среды кислая, большое количество палочек Додерлайна, других видов микроорганизмов почти нет; 2—3-я: реакция слабокислая или слабощелочная, кроме палочек Додерлайна, количество которых мало, в микробиоценоз входят стрептококки, стафилококки и обнаруживаются лейкоциты; 4-я — реакция среды щелочная, обильное количество лейкоцитов, лишь единичные палочки Додерлайна и множество других микроорганизмов (стафилококки, стрептококки, могут быть энтеробактерии, бактероиды и др.).

Благоприятное влияние на состояние микрофлоры влагалища оказывает беременность. Часто бывшая до нее 3-я категория чистоты переходит во 2-ю и даже в 1-ю. Гормональная перестройка благоприятствует развитию молочнокислой флоры, с которой встречается организм новорожденного после стериль­ного внутриутробного существования. Прерывание беременности влечет за собой изменения микрофлоры влагалища в неблагоприятную сторону. Возникновение вслед за абортом воспалитель­ных процессов половой сферы часто обусловлено эндогенной инфекцией, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, обитающими во влагалище.

Степени чистоты вагинального секрета

 

    

І степень чистоты                   ІІ степень чистоты

вагинального секрета               вагинального секрета

             

ІII степень чистоты                   ІV степень чистоты

вагинального секрета                 вагинального секрета

 

Значение микрофлоры тела в жизни человека. Эволюционно сложившиеся отношения человека с его микрофлорой играют важную роль в нормальном функционировании организма. Большинство аутохтонных микроорганизмов в различных биотопах обладают выраженными антагонистическими свойствами по отношению к другим, в частности патогенным представителям микробного мира. Эта защитная роль микрофло­ры тела человека позволила отнести ее к факторам естественного иммунитета. Антагонизм, ярко выраженный у бифидум-бактерий и лактобактерий, обусловлен выделением кислот, спиртов, лизоцима, бактериоцинов при высокой биохимической активности. Кроме того, упомянутые микроорганизмы обладают рядом полезных свойств. Они ингибируют выделение энтеропа-тогенными эшерихиями термолабильного токсина, способствуют усилению процесса всасывания из кишечника ионов кальция, витамина D и железа, предотвращая тем самым развитие рахита, синтезируют аминокислоты и белки, витамины Bi, B₂, К, рибофлавин, никотиновую, пантотеновую и фолиевую кислоты, всасывающиеся в кишечнике и участвующие в метаболических реакциях организма. Высокое содержание бифидумбактерий и лактобактерий в кишечнике в определенной мере препятствует развитию канцерогенеза.

Своевременное формирование микробиоценоза и его заселе­ние бифидумбактериями у грудных детей отражаются на здо­ровье не только в раннем возрасте, но и на всей последующей жизнедеятельности растущего организма и взрослого человека.

Микрофлора желудочно-кишечного тракта оказывает влияние на морфологическую структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность; расщепляя сложные органические вещества, микроорганизмы этого биотопа способствуют п и щеварению. Обмен липидов, нейтральных жиров и жирных кислот, абсорбция желчных кислот в кишечнике, разложение желчных кислот и образование стеркобилиногена, копростерина и дезоксихолевой кислоты связаны с жизнедеятельностью бакте­рий кишечника. Отдельные процессы сложного обмена белка также связаны с жизнедеятельностью кишечной микрофлоры, представители которой способны разлагать до конечных продуктов белки, а образующиеся при этом индол, скатол, фенол способствуют перистальтике и создают благоприятные условия для существования микрофлоры толстой кишки. Кислоты и газы, образующиеся при нормальных процессах ферментации, протекающих с участием микроорганизмов, благоприятно влияют на обмен веществ, перистальтику и топографию кишок, процессы всасывания и образования кала. Микроорганизмы кишечника принимают участие вдетоксикации попадающих из внеш­ней среды в организм ксенобиотиков и образующихся токсичных продуктов метаболизма путем их биосорбции или трансформации в нетоксичные продукты.

Большое значение для организма имеет иммунизирующее свойство микрофлоры тела здорового человека. Бактериальная микрофлора способствует организации и созреванию иммунной системы. В опытах на стерильных животных (гнотобионтах) показано, что масса лимфатических узлов безмикробных животных снижена в несколько раз, а количество центров размножения в этих узлах — в десятки раз по сравнению с контрольными животными.

 

 

 

ДИСБАКТЕРИОЗ (ДИСМИКРОБИОЦЕНОЗ)

Для нормального функционирования человеческого организма очень важным является регуляция взаимоотношений макроорганизма и населяющей его тело микрофлоры, между отдельными видами микробов, обитающих в различных участках тела человека. При нарушении сложившихся взаимоотношений, причиной которого становятся многие испытываемые человеком воздействия (переохлаждение, перегревание, нарушение сна, психические стрессовые воздействия, ионизирующая радиация и др.), микробы-симбионты из мест своего обычного обитания распространяются, проникая во внутреннюю среду и вызывая патологические процессы. Нарушение качественного и количественного состава микрофлоры тела человека, перемещение ее в другие биотопы есть проявление дисбактериоза.

 

Микробиоценозы биотопов человека характеризуются относительным постоянством, которое поддерживается механизмами аутостабилизации. Только при длительном воздействии дестабилизирующих факторов или кратковременном действии факторов большой повреждающей, силы происходит нарушение механизмов аутостабилизации. Следствием этого является формирование нового состава микробиоценоза с иными количественными соотношениями участников — дисбактериоз  (от др.-греч. δυσ– — приставка, отрицающая положительный смысл слова или усиливающая отрицательный, и «бактерия») .

Чаще всего дисбактериоз встречается в пищеварительном тракте или на коже, но может также встречаться на любой обнажённой поверхности или слизистой оболочке – такой как влагалище, лёгкие, рот, нос, пазухи, уши, ногти или глаза.

 

Современные представление о нормобиоценозе и дисбиозе

В настоящее время нормальная микрофлора пищеварительного тракта человека рассматривается как совокупность бесконечного множества микробиоценозов, занимающих почти все экологические ниши (биотопы) на слизистых оболочках всех полостей организма, сообщающихся с внешней средой, а также на коже человека.

У каждого человека формируется индивидуальная микрофлора, с которой он проживает всю жизнь. Общее количество микроорганизмов в организме взрослого человека более чем в 10 раз превышает количество его собственных клеток.

Количественное соотношение между различными микробными популяциями характеризуется определенной стабильностью и динамическим равновесием. Физиологическое равновесие качественного и количественного состава микрофлоры в условиях полного здоровья называется «эубиозом» или нормобиоценозом».

Качественные и количественные изменения нормальной микрофлоры под воздействием различных экзогенных и эндогенных факторов приводят к нарушению эубиоза и формированию дисбактериоза, который свидетельствует о снижении резистентности организма и, как правило, отягощает течение основного заболевания, ухудшая его прогноз.

При дисбактериозе кишечника изменяются количественные соотношения и состав нормальной микрофлоры кишечника, что проявляется уменьшением количества или исчезновением микроорганизмов, составляющих ее в нормальных условиях, а также доминированием атипичных, редко встречающихся или не свойственных ей микроорганизмов.

В последние годы наблюдается неуклонный рост дисбиозов кишечника, что обусловлено усилением негативного воздействия химических факторов, ухудшением экологической обстановки, повышением радиационного фона, возрастанием стрессорных воздействий, массовым, бесконтрольным применением антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, а также неполноценным питанием.

 

Факторы, обусловливающие развитие дисбактериоза, многочисленны и разнообразны. Прежде всего к ним относится длительное применение антибиотиков и антисептиков, которые угнетают жизнедеятельность одних видов и не оказывают влияния на другие. Дисбактериоз развивается также в случаях снижения местного и общего иммунитета, вызванного радио-, гормонотерапией, применением иммунодепрессантов, местными и общими ин­фекционными болезнями, особенно хроническими.

 

Основные причины развития дисбактериоза кишечника

Экзогенные факторы:

1.     Алиментарные факторы.

2.     Дефицит ряда важнейших нутриентов (белков, углеводов, витаминов, растительной клетчатки).

3.     Нефизиологичные формы питания.

4.     Стресс (травма, ожоговая болезнь, оперативные вмешательства).

5.     Лекарственные воздействия (антибиотики, гормоны, цитостатики).

6.     Радиация.

      Эндогенные факторы:

1.     Функциональные или воспалительные заболевания органов пищеварения (секреторные, моторные, воспалительные нарушения ЖКТ).

2.     Онкологические заболевания.

3.     Острые и хронические инфекции ЖКТ.

4.     Урогенитальные инфекции.

5.     Инфекционно-аллергические заболевания.

6.     Иммунодефициты.

 

Классификация дисбактериоза кишечника

по И.Б. Куваевой и К.С. Ладодо (1991)

 

Несмотря на введение в микробиологическую практику новых усовершенствованных методов исследования, до сих пор четкой границы между микробиоценозом кала здоровых и больных лиц так и не выявлено. Каловый микробиоценоз является сложным и динамичным. Состав и количество бактерий широко варьируют.

В последних исследованиях, посвященных анализу микробиоценоза кала, используется метод флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (FISH). Количественный анализ бактериального состава и интенсивности свечения в центральных участках образца фекалий, на поверхности и в слизи позволили различить особенности биологической структуры кала здоровых и больных. Особенностью данных исследований является то, что исследуются не гомогенизированные образцы, а цилиндрические образцы кала, полученные от больных, так как при гомогенизации бактерии равномерно распределяются в образце, чего не бывает в естественных условиях.

Существуют и другие методы диагностики дисбактериоза кишечника, основанные на определении метаболитов кишечной микрофлоры. Эти соединения разделены на 4 группы. В первую группу входят индикан, n-крезол, фенол. Индикан расщепляется индол-положительными микробами, n-крезол, фенол — анаэробными и аэробными микроорганизмами. Вторая группа включает H₂, СН₄, СО₂, С₂-С₆ жирные кислоты. Это метаболиты строгих анаэробов. Третью группу составляют деконъюгированные желчные кислоты — метаболиты бактероидов, бифидобактерий, клостридий, стрептококков и энтеробактерий. Аммиак входит в четвертую группу, является метаболитом грамположительных и грамотрицательных анаэробов, энтеробактерий и стрептококков.

Для определения метаболитов кишечной микрофлоры используются такие методы, как газо-жидкостная, высокоэффективная жидкостная хроматография, к сожалению, не всегда доступные в повседневной клинической практике.

В настоящее время идентифицирован ряд факторов кишечной микрофлоры, обеспечивающих персистенцию и колонизацию симбионтной и условно-патогенной микрофлоры. К таким факторам относятся ферменты, которые формируют устойчивость некоторых представителей кишечной микрофлоры к действию секреторных антител. Накоплены данные о том, что ферменты, способные расщеплять секреторные иммуноглобулины слизистых оболочек, способствуют колонизации эпителия патогенными бактериями. В связи с этими фактами в последнее время были предложены и апробированы скрининговые биохимические методы оценки состояния микробиоценоза кишечника по уровню протеолитической, Ig-расщепляющей активности супернатантов фекалий. Эти методы диагностики дисбиоза основаны на том, что различные таксономические виды бактерий, колонизирующие разные отделы кишечника, обладают неодинаковой протеолитической способностью. Как правило, индигенная микрофлора кишечника человека и его фекалий, в частности бифидо- и лактофлора, обладает выраженной сахаралитической, нежели протеолитической активностью. Возрастание суммарной протеолитической активности супернатантов фекалий тесно связано с увеличением количественного содержания многих видов условно-патогенных бактерий в кишечнике или с возрастанием доли бактерий, продуцирующих протеолитические энзимы, колонизирующих стенку кишечника. IgА-протеазы — секретируемые факторы бактериальной природы. Они представляют собой специфические энзимы, расщепляющие IgА на классические Fab- и Fc-фрагменты, лишая его тем самым антительных свойств.

Протеолитическая активность, в том числе иммуноглобулин-расщепляющая активность, выявлена у многих видов патогенных и условно-патогенных бактерий, грибов и простейших, способных колонизировать кишечник. Выделены IgA-протеиназы у представителей семейства энтеробактерий: Proteus spp, Serratia marcescens, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumonie, E. Coli, Shigella spp., Salmonella spp. Грамположительная кокковая микрофлора кишечника — S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus faecalis — также способна к продукции Ig-расщепляющих протеиназ. IgA-протеиназы индуцируют грибы рода Candida. Изучены протеолитические ферменты, являющиеся факторами вирулентности, у таких простейших, как Lamblia intestinalis. Некоторые представители фекальной микрофлоры здоровых людей: Streptococcus faecalis, Staphyloccocus spp. Propionibacterium acnes, Cl. perfringens, Cl. bifermentas, Cl. sporogenes, Cl. ramnosum, Bacteroides spp. Bifidobacterium spp. — также обладают протеолитической активностью. Вероятно, эта способность вносит свой вклад в вирулентность нормальной микрофлоры, которая, как известно, появляется при дисбактериозе кишечника наряду со снижением антагонистических свойств.

Возрастание суммарной протеолитической активности тесно связано с увеличением количественного содержания многих видов условно-патогенных бактерий в кишечнике и/или с возрастанием доли бактерий, продуцирующих протеолитические энзимы, колонизирующих стенку кишечника.

Способность продуцировать IgА протеиназы характерна в основном для патогенных микроорганизмов и является тем условием, которое обеспечивает существование микробов на слизистых поверхностях.

Патогенность микробных протеиназ обусловлена не только их деградирующей активностью в отношении антител, но и способностью непосредственно повреждать эпителиальные клетки слизистых оболочек и активировать гемокоагуляционные механизмы в очаге воспаления. Некоторые из бактериальных протеиназ способны снижать жизнеспособность энтероцитов кишечника и повреждать защитный барьер слизистых. Протеолитическая активность исследовалась при патологических состояниях. Так, изучен протеолитический потенциал фекалий при колитах, болезни Крона, в детском возрасте — при кишечной инфекции и дисбактериозах. Было показано, что положительные протеолитические (казеинолитические) пробы, причем высокой степени активности, чаще выявлялись в группе детей с превалирующим выделением различных видов условно-патогенных бактерий и выраженными изменениями микроэкологии кишечника. Протеолитическая активность фекалий нарастала с увеличением содержания в фекалиях гемолитических E. Coli, бактерий рода Proteus, Staphyloccocus и их ассоциаций с псевдоманадами, клебсиеллами, серрациями, гафниями и грибами рода Candida. Во всех случаях, когда в микрофлоре находили бактерии рода Proteus в количестве 5 lg КОЕ/г и выше, протеолитическая активность супернатантов была высокой.

Особый интерес представляет исследование, в котором изучалась Ig-расщепляющая активность микрофлоры кишечника по профилю протеиназ в норме и при патологических состояниях. Выявлено, что условно-патогенная микрофлора обладает более выраженным агрессивным потенциалом, обусловленным Ig-протеолитической активностью по сравнению с бифидофлорой. Уровень иммуноглобулин — расщепляющей активности фекалий у детей с нарушениями микроэкологии кишечника — был выше, чем у детей с эубиозом.

Тактика критерии диагностики дисбактериоза

Наиболее распространенным методом лабораторной диагностики заболевания является посев кала на дисбактериоз.

Критерии диагностики дисбактериоза кишечника, основанные на посеве кала на дисбактериоз:

1.     Снижение содержания или исчезновение бифидофлоры.

2.     Снижение содержания полноценной кишечной палочки.

3.     Увеличение содержания штаммов гемолитической кишечной палочки.

4.     Изменение общего количества кишечной палочки.

5.     Наличие условно-патогенных энтеробактерий.

6.     Изменение количества энтерококков.

 

Для дисбактериоза характерно наличие не менее 3 критериев, стойко сохраняющихся при трехкратном анализе.

Золотым стандартом считается бактериологическое исследование тощекишечного соскоба, биоптата или аспирата.

 

Микробиологические критерии дисбактериоза:

1.                      Нарастание количества условно-патогенных микроорганизмов одного или нескольких видов в кишечнике при нормальном количестве бифидобактерий.

2.                      Нарастание одного или нескольких видов условно-патогенных микроорганизмов при умеренном снижении (на 1-2 порядка) концентрации бифидобактерий.

3.                      Снижение содержания облигатных представителей микробиоценоза (бифидобактерий и/или лактобацилл) без регистрируемого увеличения количества сапрофитной или условно-патогенной микрофлоры кишечника.

4.                      Умеренное или значительное (менее10 ⁷ ) снижение содержания бифидобактерий, сочетающееся с выраженными изменениями в аэробной микрофлоре: редукцией лактобацилл, появлением измененных форм кишечной палочки, обнаружением одного или нескольких представителей условно-патогенных микроорганизмов высоких титрах (до 10 ⁷ -10 ⁸ КОЕ/г).

 

Диагноз дисбактериоза устанавливается повторным (с интервалом 5—7 дней) бактериологическим исследованием с использованием методик количественного определения видов и вариантов микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза.

Рис. Кандидоз ротовой  полости

 

Пробиотики и пребиотики в лечении дисбактериоза

Впервые термин «пробиотик» был употреблен R. Parker в 1974 г. для обозначения живых микроорганизмов, которые вводились в корма животных для стимуляции роста и устойчивости к стрессу. Позднее (в 1989 г.) R. Fuller сформулировал это понятие как «добавка к корму», содержащая живые микроорганизмы, благотворно воздействующая на организм животного путем оздоровления микрофлоры кишечника. Это определение, бесспорно, было применимо также к организму человека.

По определению большинства авторов, пробиотики – это живые микроорганизмы или ферментированные ими продукты, которые способствуют сохранению или восстановлению нормального состава кишечной микрофлоры.

Большинство специалистов и исследователей относят к пробиотикам бактерии эубиотики (представители нормальной микрофлоры кишечника и других полостей организма): бифидобактерии и молочнокислые микроорганизмы рода Lactobacillus. Их называют классическими пробиотиками.

Вместе с тем, имеется достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у молочнокислых палочек и кокков, а также других микроорганизмов – Bacillus, E. coli, Citrobacter, дрожжей и грибов, в том числе высших.

Основные направления пробиотического воздействия молочнокислых продуктов:

1.                      Колонизация желудочно-кишечного тракта пробиотическими микроорганизмами, проявляющими антагонизм в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, вирусов, грибов, дрожжей.

2.                      Улучшение нарушенного баланса микроорганизмов в кишечнике и устранение дисбактериозов.

3. Полезная и адекватная метаболическая активность – продукция витаминов К, биотина , ниацина ,фолиевой кислоты , гидролиз желчных солей и др.

4.                      Оптимизация пищеварения и нормализация моторной функции кишечника путем выработки субстанций, оказывающих морфокинетическое действие; регуляция времени прохождения пищи по желудочно-кишечному тракту за счет участия в метаболизме желчных кислот, ингибиции синтеза серотонина.

5.                      Детоксицирующая и защитная роль. Эта функция пробиотиков (потенцирование продукции интерферона, интерлейкинов, увеличение фагоцитарной способности макрофагов и др.) в настоящее время вызывает все возрастающий интерес и активно изучается, в частности проводится поиск штаммов с наиболее выраженными иммуногенными свойствами.

6.                      Молочнокислые бактерии рассматриваются как живые носители иммуногенов и защитных антигенов, а разработка эффективных иммунных препаратов из пробиотиков признается одним из самых приоритетных направлений.

 

Заслуживают внимания протосимбиотические ассоциации заквасочной микрофлоры, поскольку полезные свойства вырабатываемых при их участии кисломолочных продуктов (кумыс, йогурт, кефир и др.) реализуются наряду с антагонизмом микроорганизмов закваски к возбудителям инфекций и через механизм неспецифической иммуностимуляции.

В настоящее время создаются препараты, состоящие из нескольких пробиотиков – «симбиотики» . Каждый штамм симбиотика в кишечнике отыскивает для себя наилучшее условие и занимает свойственную ему микроэкологическую нишу.

Понятие «пребиотики» используются для обозначения веществ или диетических добавок, в большинстве своем не абсорбируемых в кишечнике человека, но благотворно влияющих на организм хозяина путем селективной стимуляции роста и активизации метаболизма полезных представителей его кишечной микрофлоры (пребиотики-стимуляторы пробиотиков).

Примечательно, что в последние годы в нашей стране разработаны и успешно вырабатываются различные кисломолочные продукты, обладающие пробиотическими свойствами. Интересное исследование проводилось в Клинике лечебного питания Института питания РАМН по использованию диетотерапии с включением специализированных продуктов, обогащенных бифидо- и лактобактериями. Полученные результаты позволяют использовать кисломолочные продукты, обладающие пробиотическими свойствами, в качестве эффективного средства коррекции микробиоценоза толстой кишки с одновременным воздействием на Т-клеточное звено иммунитета.

Пробиотики

Пробиотики, содержащие культуры живых микробов, характерные для нормальной микрофлоры кишечника человека.

Применение пробиотиков называют также «бактериальной терапией».

Наиболее часто применяются пробиотики, содержащие бифидобактерии, лактобактерии, энтерококки, кишечную палочку.

«Подсев» полезной микрофлоры необходимо осуществлять строго индивидуально. В противном случае возможно формирование ятрогенных дисбактериозов кишечника, которые часто возникают в результате неправильной терапии (особенно при лечении колисодержащими пробиотиками).

При выборе препаратов следует учитывать взаимосвязь микробов в естественном биоценозе кишечника. Бифидобактерии обеспечивают условия для роста и метаболической деятельности лактобактерий. Лактобактерии способствуют росту бифидофлоры, а также росту и развитию полноценной кишечной палочки. Поэтому не рекомендуется при снижении колифлоры на 1-2 порядка сразу начинать лечение с применения колибактерина и других содержащих кишечную палочку пробиотиков, так как нормальная кишечная палочка может восстанавливаться при лечении бифидо- и лактопрепаратами.

Значимым является и путь введения пробиотиков. У людей с высокими показателями кислотопродукции в желудке из-за высокой асептичности желудочного сока для бактерий показан ректальный путь введения, или перед пероральным приемом в таких случаях необходимо давать цельные минеральные воды или антациды. Внутрь бактериосодержащие препараты назначают за 20-30 мин до еды, перед употреблением разводят кипяченой водой непосредственно во флаконе, затем переносят в стакан.

Для повышения эффективности разработаны:

1.       Жидкие формы (жидкие бифидо- и лактобактерии, Биовестин, Биовестин-лакто, Лактофлор).

2.       Сорбционные формы (Бифидобактерин-форме, Пробиофор, Бификол форте, Экофлор): колонии микробов сорбированы на носителе – косточковом угле.

3.       Энтеросолюбильные капсулы (Бифиформ, Линекс).

4.       Аутопробиотики.

 

Пребиотики

Пребиотики – вещества (медицинские препараты, продукты питания), стимулирующие рост и развитие нормальной микрофлоры. Пребиотики благотворно влияют на различные функции организма и не оказывают побочных эффектов при длительном применении.

Пребиотики можно сочетать с пробиотиками, продуктами функционального питания или при дисбактериозах I степени тяжести использовать в виде монотерапии.

К лекарственным препаратам-пребитотикам относятся: Хилак-форте, лактулоза (Дюфалак, Нормазе,Лактусан

), Лактофильтрум (препарат содержит 85% сорбента – гидролизного лигнина и 15% лактулозы), парааминобензойная кислота, пантотенат кальция.

Позитивные эффекты пребиотиков:

o    Муколитическое действие.

o    Репаративное действие.

o    Поддержание оптимальных значений рН.

o    Увеличение объема каловых масс.

o    Улучшение моторики кишечника.

o    Снижение газообразования.

o    Стимуляция синтеза витаминов группы В и витамина К.

o    Антибактериальное действие, опосредованное факторами неспецифической резистентности.

o    Бифидогенная активность.

o    Восстановление нарушенной нормальной микрофлоры.

o    Пребиотики стимулируют размножение и функциональную активность «родной» для пациента собственной нормальной кишечной микрофлоры.

Пребиотическими эффектам обладают следующие компоненты пищи и лекарственные препараты:

o    Олигосахариды (лактулоза, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды).

o    Пищевые волокна.

o    Растительные микробные экстракты (дрожжей, морковный, картофельный, кукурузный, рисовый, тыквенный, чесночный).

o    Экстракты водорослей.

o    Моносахариды, спирты (ксилит, раффиноза, сорбит, ксилобиоза).

o    Полисахариды (пектины, декстрин, инулин, хитозан).

o    Аминокислоты (валин, аргинин, глутаминовая кислота).

o    Антиоксиданты (витамины А

, С, Е, селен, убихинон, глутатион, каротиноиды).

o    Ненасыщенные жирные кислоты (эйкозопентаеновая кислота).

o    Ферменты (микробные бета-галактозидазы, протеазы сахаромицетов).

o    Лектины.

 Симбиотики и синбиотики

Кроме пре- и пробиотиков в литературе можно встретить такие термины как симбиотики и синбиотики.

Синбиотики являются комбинацией нескольких пробиотичесих видов бактерий (например, Бификол, Бифилин).Их действие основано на синергизме пробиотиков и пребиотиков, за счет которого наиболее эффективно не только вводимые микроорганизмы – пробиотики в желудочно-кишечного тракта хозяина, но стимулируется его собственная микрофлора. В синбиотики могут включаться также пищевые волокна, ферменты, микроэлементы, растительные добавки.

Симбиотики представляют собой комплексные препараты, включающие пре- и пробиотики (Биовестин, Биовестин-лакто, Бифилиз, Эуфлорины (Эуфлорин-L и Эуфлорин-B), Бифиформ, Бифидо-бак, Ламинолакт).