Методы культивирования бактерий и определение их количества в исследуемом материале

Методы культивирования бактерий и определение их количества в исследуемом материале. Питательные среды и их классификация. Типы и механизм питания и дыхания бактерий.

Методы  создания анаеробних условий.

Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Методы стерилизации и дезинфекции. Асептика и антисептика. Особенности стерилизации стоматологического инструментария. Методы контроля. Учение об генетике микроорганизмов. Организация генетического аппарата бактерий. Генотипическая и фенотипическая изменчивость  у микроорганизмов, практическое значение. Внехромосомные факторы наследственности у бактерий. Плазмиды, их свойства. Мигрирующие  генетические элементи. Рекомбинационные процессы (трансформация, конъюгация, трансдукция ). Генная инженерия и биотехнологии.

 

Бактериологический метод является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. Для этого широко используются питательные среды, на которых выращивают исследуемые микроорганизмы.

Главный метод в борьбе с инфекционными болезнями – профилактический. В связи с этим в деятельности медицинских заведений большое значение имеет предупреждение проникновения возбудителей заболеваний в организм человека или другие объекты. Это проводится методами микробной деконтаминации. Основные из них – стерилизация, дезинфекция, антисептика и асептика. Бактериологический метод один из основных в диагностике большинства инфекционных заболеваний. Характеристика колоний – важная составная часть работы бактериолога, ведь микроорганизмам каждого вида свойственные свои особенности роста.

Типы питания бактерий

 

 

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

Источники углерода и типы питания. Все микроорганизмы по своей способности усваивать разнообразные источники углерода делятся на две группы — автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (лат. autos — сам, trophe — питание) синтезируют Ше углеродсодержащие компоненты клетки из СОг как единственного источника углерода. Гетеротрофы (лат. heteros — Другой, «питающийся за счет других») не могут существовать только за счет ассимиляции СО₂. Они используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения — гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, реже углеводороды. Многие микроорганизмы в качестве источника углерода используют аминокислоты, органические кислоты и другие соединения.

Источники энергии и доноры электронов. В зависимости от источников энергии и природы доноров электронов микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций. К фототрофам относятся исключительно сапрофитные микроорганизмы. В патологии человека ведущую роль играют хемосинтезирующие микроорганизмы.

В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на хемолитотрофы (хемоавтотрофы) и хемоорганотрофы (хемогетеротрофы)

Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии) или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов. Другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из глюкозы и солей аммония, называются прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из указанных соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в гото­вом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода, всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы Mg, К, Са, Fe и другие микроэлементы.

 

Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами требуется достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.

Мир микроорганизмов очень разнообразен. Некоторые из них могут получать энергию даже из минеральных соединений. Так, например, железобактерии получают энергию, выделяющуюся при непосредственном окислении ими железа (Fe2+B Fe3+), которая используется для фиксации СО₂, бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений. Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования.

Аэробы для этой цели нуждаются в свободном кислороде. Облигатные (строгие) аэробы (например, некоторые виды псевдомонад) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, поскольку они используют его в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются ими при окислительном фосфорилировании с участием цитохромоксидаз, флавинзависимых оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ. При этом, если конечным акцептором электронов является О₂, выделяются значительные количества энергии.

Анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода путем ускоренного, но не полного расщепления питательных веществ. Облигатные анаэробы (например, возбудители столбняка, ботулизма) не переносят даже следов кислорода. Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков и липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется сравнительно небольшое количество энергии.

Существуют факультативные анаэробы, которые могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании.

 

Oсновные механизмы питания бактерий:

1.     пассивная диффузия

2.     облегченная диффузия 

3.     активный транспорт 

4.     транслокация химических групп 

Однако большинство питательных веществ,  метаболітів, ионов проникают в клетку с помощью активного транспорта. Его также обеспечивают белки-пермеазы, но они являются  высокоспецифическими и способные переносить только определенные субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии, которую генерирует  клетка, потому возможный перенос и против градиента концентрации вещества. Если этому процессу предшествует определенная химическая модификация  молекулы, его называют транслокацией химических групп. Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.

 

 

Культивирование микроорганизмов.

 Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их многообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды.  Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия  для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

В первую очередь бактерии нуждаются в азоте, углероде  и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород  для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также  белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав  сред должны быть введенные источники питательных веществ и воды, а также ростовые факторы (витамины, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного  и растительного происхождения, белковые гідролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитичну жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.

Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию,  иметь в своем составе неорганические фосфаты.

Допустимым является употребление веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсиноутворення микробов (отдельные аминокислоты, твин, активированный уголь и тому подобное). Важной является стабилизация оптимума рН среды, его высокой буферности. Среды должны иметь определенную густоту Зависимо (жидкие, полужидкие, плотные), быть изотоническими, прозрачными и обовязково стерильными.

Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют  специальные среды. Часть их готовят в  лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны задовільнити самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

Oсновные требования к питательным средам:

1.     прозрачность,

2.     стерильность

3.     лёгкая усвояемость

4.     определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

5.     изотоничность,

6.     определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

Классификация питательных сред

 

 

 

 

Рис. 1. МПА

 

             Рис. 2. Среда Эндо.

 

 

 

Рис. 3. Среда  Плоскирева.

 

 

 Рис. 4. Среда Левина

 

 

 

Рис. 5. Среды Гисса.

 

 

Рис. 6. Желточно-солевой агар

 

 

Рис. 7. Кровяной МПА

 

 

Рис. 8. Разрежение желатины

(в правой пробирке – положи тельный  тест).

 

 

  Рис. 9. Тест на виявление индола.

 Слева – незасеянный контроль,

   справа – отрицательный результат,

в центре – положительный,

 

Все более широкое приложение в микробиологических лабораториях находят многочисленные коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов, изготовленные на основе разнообразных дифференциально диагностических сред. В одном варианте выполнения они вносятся в специальных полистиролу или другие планшеты и высушиваются для удаления воды. К ним принадлежат системы АРЕ-20 для идентификации стафилококков, коринебактерій, ентеробактерій, анаэробных микробов, Enterotest 1 и 2, российская система ПБД (пластина биохимическая дифференциальная) для идентификации ентеробактерій. Неплохо зарекомендовали себя тест-системы Roche и другие. Другие варианты подобных тест-систем предусматривают адсорбцию дифференцирующих субстратов на бумажных или полимерных носителях. Среди них распространены системы Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Подобные системы удобны в пользовании, они позволяют одновременно исследовать широкий спектр микробных признаков, всегда готовые к использованию в любых микробиологических лабораториях, они простые и надежные, требуют небольших объемов посевного материала, потому экономят лабораторную посуду, пипетки. Компьютерная обработка полученных результатов дает возможность быстро определить и оценить вид неизвестного возбудителя.

Изготовление питательных сред. В состав любых сред входят преимущественно натуральные животные или растительные продукты и компоненты – мясо, рыбная мука, яйца, молоко, кровь, дрожжевой экстракт, картофель и тому подобное. Из них готовят специальные полуфабрикаты в виде экстрактов, настоев, ферментативних и кислотных гидролизат ів (мясная вода, дрожжевой экстракт, триптичний гидролизат  Хоттингера, пептон и другие), которые являются основой для последующего конструирования питательных сред. Кроме этого, в питательные среды добавляют разные неорганические соли в зависимости от потребностей микробной клетки. Как правило, концентрация хлорида натрия составляет 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, другие соли добавляются из расчета 0,001 г/л. В необходимых случаях к составу вводят углеводы (сахара, многоатомные спирты), аминокислоты в концентрации 0,5-1,0 %, а также витамины (до 0,001 мг/мл).

Для обеспечения необходимой плотности среды используют агар-агар, который получают из морских водорослей. Он является удобным и необходимым компонентом сред, поскольку не потребляется бактериями как ростовой субстрат. Образовывая в воде гель, он плавится при температуре возле 100 °С, а густеет при 40 °С. Источником желатина являются богатые на коллаген субстраты. Среди них хрящи, сухожилия, кости и тому подобное. Гель, который получают в результате использования желатина, плавится при температуре возле 32-34 °С и застывает при 28 °С. Однако многочисленные микроорганизмы способны расщеплять желатин, потому использование последнего как наполнителя среды считается нецелесообразным. Чаще всего такие среды с желатином применяются для определения протеолитических свойств бактерий.

Изготовление питательных сред является сложным динамическим процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде согласно с прописью добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью іонометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их освітляють осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Да, среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100  °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115-120  °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативний белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем витримування их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С.

Приводим примеры изготовления некоторых простых питательных сред, которые чаще всего используются в микробиологической практике и могут быть основой для изготовления более сложных.

Мясная вода. Для ее изготовления используют свежую говядину, которую предварительно очищают от жира, фасций, сухожилий и тому подобное, разрезают на мелкие куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, размешивают и на сутки оставляют в прохладном месте. Полученный настой кипятят в течение 30-60 мин, периодически снимая накипь, а затем отстаивают. Отделяют жидкость от фарша, фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно и доливают водопроводной водой к первичному объему, потом разливают в флаконы и стерилизуют при 1 атмосфере (температура 120  °С) в течение 30 мин. Стерильная мясная вода прозрачна, имеет желтоватый цвет, а на стенках флакона и на дне образуется осадок из белков, которые свертывались. Потому при последующем использовании среды его опять фильтруют. Активная реакция среды – 6,2.

Мясо-пептонный бульйон (МПБ). Чтобы изготовить МПБ, к мясной воде добавляют 1 % пептону и 0,5 % хлориду натрия, устанавливают необходимое рН с помощью 20 % раствору NAOH и кипятят 30-40 мин, постоянно перемешивая. Бульйон фильтруют через бумажный или полотняный фильтры, разливают в флаконы, пробирки, проверяют активную реакцию среды и стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.

М’ясо-пептонний агар (МПА). К мясо-пептонного бульйону добавляют мелко нарезанный агар-агар (2-2,5 %). Полученную смесь кипятят к растворению агар-агара, фильтруют, устанавливают рН и разливают в флаконы. Стерилизацию проводят в течение 20 мин при температуре 120 °С.

Среды с кровью, сывороткой или асцитической жидкостью. Поскольку эти среды не могут долго сохраняться, их готовят непосредственно перед применением. Для этого к растопленному и охлажденному до 45-50 °С МПА додают стерильно 5-10 % свежей или дефибринированной крови барана, кролика или другого животного. Флаконы с агаром тщательным образом перемешивают и разливают в чашки Петри, следя за отсутствия пены.

Идентично готовят сывороточный (5-10 % сыворотки крови) или асцитичный агар (25 % асцитичной жидкости).

Триптичний перевар за Хоттингером. Бульйон из него более экономический чем другие мясо-пептонные среды, поскольку позволяет из одной порции мяса получить в несколько раз больше бульйона. В этой среде содержится большое количество аминокислот, следовательно, повышается его буферність, и за счет этого стабильнее является значение активной реакции среды.

Для изготовления перевара берут один килограмм мяса без сухожилий и жира, порезанный на мелкие куски размером до 1-2 см, окунают в кастрюлю с двойным объемом воды, которая кипит, и кипятят 15-20 мин, пока мясо не станет серым, что свидетельствует о коагуляции белков. Его вынимают из жидкости и пропускают через мясорубку. В жидкости, которая осталась, устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш и охлаждают до 40 °С. Потом добавляют 10 % (к объему жидкости) свежей поджелудочной железы, предварительно очищенной от соединительной ткани, жиру и дважды пропускают через мясорубку. Вместо железы используют сухой препарат панкреатина (0,5 %). Полученную смесь тщательным образом взбалтывают и доводят рН до 7,8-8,0. Через 30  мин проверяют рН. Если активная реакция среды не изменяется в кислую сторону, это свидетельствует о недоброкачественности фермента. Когда рН среды стабилизируется, смесь переливают в большие бутыли, заполняя их на 1/3. Добавляют до 3 % хлороформу, закрывают посуду резиновими пробками и интенсивно взбалтывают для перемешивания жидкостей. Избыток паров хлороформа выпускают. Через 1-2 год опять проверяют рН среды, устанавливая его на 7,4-7,6. Полученную смесь оставляют при комнатной температуре сроком до 16 дней. В течение первых 3-4 дней ежедневно проверяют и корректируют рН среды, а также взбалтывают флаконы не меньше, чем 3 разы в сутки. Позже эту процедуру можно не проводить и взбалтывать среду следует не так часто. За 1‑2 дня до окончания цикла переваривания взбалтывания среды прекращают.

О завершенном качественном переваривании свидетельствуют просветления жидкости, которая приобретает соломенно-желтый цвет, а также образование на дне пылевидного осадка. Жидкость легко фильтруется, ее проверяют на наличие триптофана с помощью пробы с бромной водой (до 3-4 мл фильтрата добавляют 3-4 капли бромной воды). При наличии триптофана (до 2,0-3,0 г/л) цвет среды изменяется на розово-фиолетовый. Определяют общий азот, который в норме достигает 11,0-12,0 г/л, и аминный азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гидролизат фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, разливают в бутыли и автоклавують при 120 °С в течение 30 мин. В таком виде он может сохраняться длительное время.

Его используют для получения бульйона Хоттингера. С этой целью до 100-200 мл гидролизат у добавляют 800-900 мл дистиллированной воды, 0,5 % хлориду натрия и 0,2 % однозамещенного фосфорнокислого натрия. Доводят рН до 7,4‑7,6, разливают в флаконы и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Мясо-пептонний агар на основе гидролизат у Хоттингера готовят за рецептурой обычного МПА.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает бактериологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

Для культивирования бактерий широко применяют безбелковые среды, в которых хорошо растут много органотрофних, в том числе патогенных видов бактерий. В эти среды входят много компонентов.

Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность детальнее дифференцировать бактерии за характером их  биосинтеза.

Для дифференциации прототрофних и ауксотрофних бактерий широко используют селективные среды. Прототрофы растут на минимальной среде, которая содержит только соли и углеводы, поскольку они сами могут синтезировать нужные им для развития метаболиты, тогда как ауксотрофы нуждаются в среде, которая содержит определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.

На густых питательных средах бактерии образуют разные по форме и величине колонии — видимые скопления микроорганизмов одного вида, которые формируются в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, их поверхность — гладкой (S-фор-ми), шершавой (R-формы), исчерченной, бугорчатой, края — ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, деревовидная. По  величине (диаметру) колонии разделяются на большие (4— 5 мм, средние (2—4 мм), мелкие (1—2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

 

Методы обеззараживания биологических объектов.

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Температура. В зависимости от температурных параметров выделяют три группы микроорганизмов — термофилы, психрофилы и мезофилы.

Для термофилов (теплолюбивых) зона оптимального роста равна 50—60 °С, верхняя зона задержки pocfa — 75 °С, нижняя — 45 °С. Термофилы не способны размножаться в орга­низме теплокровных животных, поэтому медицинского значения не имеют.

Психрофилы (холодолюбивые) имеют зону оптимально­го роста в пределах 10—15 °С, максимальную зону задержки роста 25—30 °С, минимальную 0—5 °С. Психрофилы являются свободно живущими организмами или паразитами холоднокров­ных животных, но некоторые виды, например иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывают заболе­вания у человека. Размножаясь в пищевых продуктах при температуре бытового холодильника, эти бактерии более виру­лентны при низких температурах.

Мезофилы обитают главным образом в организме теплокров­ных животных. Оптимальная температура их роста колеблется в пределах 30—37 °С, максимальная 43—45 °С, минимальная 15—20 °С. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются.

 

Дифференциация микроорганизмов по температурного режима

 

Температурные зоны гибели микроорганизмов широко вариируют. Вегетативные формы погибают при температуре 60— 80 °С в течение часа, при 100 °С — мгновенно. Споры и цисты устойчивы к температуре 100 °С, гибнут при 130 °С и более длительной экспозиции (до 2 ч). Нижняя температурная грани­ца гибели микроорганизмов варьирует от 20 °С (возбудители кори, коклюша, сифилиса, менингококковой и гонококковой инфекции) до абсолютного нуля. Повреждающее действие вы­сокой температуры связано с необратимой денатурацией фер­ментов микроорганизмов, низкой — с разрывом клеточной мем­браны кристаллами льда и приостановкой метаболических про­цессов.

Реакция среды. Большинство симбионтов и возбудителей за­болеваний человека хорошо растут при слабощелочной, ней­тральной или слабокислой реакции. Для вибрионов, в том числе возбудителя холеры, оптимальная величина рН 9—10, для боль­шинства грибов 5—6. При культивировании микроорганизмов на питательных средах устанавливается оптимальная величина рН. В процессе размножения происходит сдвиг рН, обычно в сторону кислой среды, реже — щелочной, рост приостанавли вается, затем наступает гибель микроорганизмов. Механизм повреждающего действия рН состоит в денатурации ферментов гидроксильными ионами, нарушении осмотического барьера клеточной мембраны.

Влажность (высушивание). Рост и размножение микроорга­низмов происходят в средах с большим количеством воды, кото­рая необходима для пассивного и активного транспорта пита­тельных веществ в цитоплазму клетки. Снижение влажности среды приводит к переходу клетки в стадию покоя, а затем к гибели. Чувствительность микроорганизмов к высушиванию и сроки переживания на объектах внешней среды в этих условиях зависят от вида и формы возбудителя — с одной стороны, и свойств объекта — с другой. Покоящиеся формы микроорганиз­мов, особенно споры и цисты, сохраняются длительное время, иногда многие годы. Микобактерии туберкулеза, вирус натураль­ной оспы, сальмонеллы, актиномицеты, грибы устойчивы к высу­шиванию; менингококки, гонококки, трепонемы, бактерии кок­люша, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, герпесвирусы — чув­ствительны к нему.

Ионизирующая радиация. Повреждающая сила радиации зависит прежде всего от ее вида, в меньшей степени от вида мик­роорганизма. Ионизирующая радиация обладает мощным прони­кающим и повреждающим клеточный геном действием. Однако летальные для микробных клеток дозы на несколько порядков выше, чем для животных и растений.

Повреждающее действие УФ-излучения, наоборот, в большей мере выражено в отношении микроорганизмов, чем животных и растений. УФ-лучи в относительно небольших дозах вызывают повреждения ДНК микробных клеток, которые приводят к мута­циям или их гибели. Световое и инфракрасное излучение при интенсивном и длительном воздействии способно оказать повреждающее   влияние  лишь   на   некоторые   микроорганизмы.

Ультразвук. Определенные частоты ультразвука при искус­ственном воздействии способны вызывать деполимеризацию орга-нелл микробных клеток, а также денатурацию входящих в их состав молекул в результате локального нагревания или повыше­ния давления.

Давление. Атмосферное давление даже в сотни атмосфер не оказывает существенного влияния на бактерии. Однако к осмо­тическому давлению, как повышенному, так и сниженному они высокочувствительны. В том и другом случае происходит разрыв клеточной мембраны и гибель микробных клеток (осмотический шок).

Действие химических веществ

 

Противомикробным действием обладают следующие классы химических веществ:

1) галогены и их соединения (йод, йодо­форм, йодинол, йодонат, йодпирон, хлорамин Б, пантоцид),

2) окислители (пероксид водорода, перманганат калия, гидро­пирит),

3) кислоты и их соли (надмуравьиная, оксолиновая, бензойная, салициловая, сорбиновая, борная, пиоцид, тетраборат натрия, перборат натрия),

4) щелочи (аммиак и его соли, бура),

5) спирты (70—80% этанол, 60—70% пропанол),

6) альдеги­ды (формальдегид, уротропин, уросал, кальцекс, циминаль),

7) соли тяжелых металлов — ртути, серебра, меди, свинца, цин­ка, олова,

8) фенол и его производные (резорцин, хлорофен, фенил-резорцин, тимол, салол, бензонафтол),

9) производные 8-оксихинолина (хинозол, интестопан, нитроксолин), 4-хинолона (оксолиниевая кислота, грамурин) и хиноксалина (хиноксидин, диоксидин),

10) производные нитрофурана (фурацилин, фурагин фуразолидон),

11) поверхностно-активные вещества (роккал, хлоргексидин, этоний, декаметоксин, дегмин, цетилпиридиний хлорид, сульфонол, палмитат натрия, цетавлон, дегмицид, полимиксины, грамицидин С, амфолан, твины, спаны),

12) триклозан,

13) длинноцепочечные жирные кислоты,

14) фитонциды,

15) антибиотики,

16) красители (метиленовый синий, бриллиан­товый зеленый, риванол).

 

По механизму действия противомикробные вещества разделя­ются на:

а) деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки бактерий,

б) повышающие проницаемость клеточной мембраны,

в) блокирующие те или иные биохимические реакции,

г) денату­рирующие ферменты,

д) окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов,

е) растворяющие липопротеиновые структуры,

ж) повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции и др

Влияние биологических факторов

В естественных условиях микроорганизмы являются составной частью биоценоза (совокупность растений и животных, которые населяют участок среды существования из более или менее однородными условиями жизни).

Бактерии находятся в природе в ассоциациях, между которыми продолжается непрестанная борьба за существование. Одни виды, которые приспособились к соответствующей среде, имеют более выраженные антагонистические свойства относительно других видов, которые попадают в новую среду существования. Да, например, молочнокислые бактерии имеют антагонистичные свойства относительно возбудителей дизентерии, чумы и др. Синегнийна бактерия подавляет рост шигел, сальмонел, бацилл сибирки, холерного вибриона, возбудителей чумы, сапа, стафилококков, менингококков и др. Особенно сильные антагонистичные свойства имеют микроорганизмы, которые постоянно живут в человеческом организме: Е. coli, S. faecalis, молочнокислые бактерии, актиномицеты, микроорганизмы кожи, носовой части глотки и др.

Теперь доказана возможность антагонистичных взаимоотношений между патогенными штаммами одного и того же вида микроорганизмов. Такие свойства имеют некоторые штаммы Е. coli, стрептококки пневмонии, сальмонели, шигели, стафилококки и др., которые продуцируют бактериоцини.

В определенных условиях существования микроорганизмов антагонизм возникает в результате недостатка питательных веществ, и тогда одни виды вынуждены питаться за счет других. Да, например, паразитические бактерии Bdellovibrio bacteriovorus должны свойство проникать в некоторые грамотрицательные и грамположительные бактерии, размножаться в них и разрушать их. Бактерии-эндосимбионты, которые живут на простейших, насекомых, грибах, беспозвоночных и членистоногих, очень распространенные в природе (почва, морская вода, испражнения); они играют важную роль в элиминации из окружающей среды патогенных и условно патогенных видов (сальмонели, Е. coli и др.).

Антагонистичные взаимоотношения обнаружены и среди вирусов, когда один вирус защищает организм от проникновения у него другого вируса. В вирусологии это явление достало название интерференции   вирусов.

Между разными группами микроорганизмов есть несколько типов взаимоотношений: симбиоз, метабиоз, сателизм, синергизм, антагонизм.

Симбиоз — это сожительство микроорганизмов разных видов; вместе они развиваются лучше, чем каждый из них в частности. Иногда приспособленность организмов друг к другу так углубляется, что они теряют способность существовать врознь (сожительство грибов и сине-зеленых водорослей, азотфиксуючих и целюлозоруйнивних бактерий, бульбочкових бактерий и бобовых растений, разных грибов и корней растений, дрожжеподобных грибов и лямблий). Самый типичный симбиоз (симбиогенез) обнаружен у лишайников.

Одной из форм симбиоза есть вирогения — сосуществование некоторых бактерий, дрожжей и самых простых с вирусами.

Метабиоз — такой тип взаимоотношений, когда продукты жизнедеятельности одного вида являются источником питания другого вида (например, нитрификуючи и амонификуючи бактерии).

 

Стерилизация – полное уничтожение вегетативных и споровых форм всех микроорганизмов на определенных предметах, материалах, питательных средах.

Дезинфекция – совокупность физических, химических и механических способов уничтожения вегетативных и споровых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Антисептика – комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение или угнетение роста микробов в ране, на поверхности кожи или слизистых оболочек.

Асептика – система профилактических мероприятий, направленных против проникновения микробов в рану, ткани, органы больного.

 

Методы стерилизации:

1.     стерилизация паром под давлением,

2.     текущим паром,

3.     сухим жаром,

4.     ионизирующее и ультрафиолетовое облучение,

5.     холодная стерилизация.

 

 

 

Рис.  Сухожаровой шкаф

 

 

Рис. 10. Строение автоклава.

Зависимость между избыточным давлением пары, температуры кипения воды и длительностью стерилизации

 

Основные правила работы с автоклавом

1. Перед началом работы следует тщательным образом осмотреть автоклав, его контрольно-измерительную аппаратуру, проверить упругость резинової прокладки, крепления крышки стерилизационной камеры.

2. Через специальную лейку к уровню отметки на водомерной трубке в автоклав заливают дистиллированную воду и закрывают кран.

3. Необходимый материал вмещают в стерилизационную камеру и закрывают герметически крышкой автоклава. Желательно следить, чтобы предметы не размещались в автоклаве очень тесно, поскольку между ним должен проходить пар. Иначе они могут остаться нестерильными из-за отсутствия нагрева к необходимой температуре.

4. Открывают кран, который соединяет стерилизационную камеру с окружающей средой, и включают электрический нагрев.

5. После того, как начался процесс образования пара, необходимо удалить воздух из стерилизационной камеры. Для этого пар и конденсат отводят в специальный сосуд с водой или в канализацию. Чистый пар, которая выходит из автоклава с равномерным шипящим звуком, в течение 10 мин пропускают через камеру, а затем закрывают пароотводной кран.

6. Доводят давление пары до уровня, которого требует режим стерилизации. Для этого учитывают соотношение показателей давления манометра и температуры кипения воды (табл.).

7. По завершении цикла стерилизации автоклав отключают. Давление в автоклаве постепенно падает и уравнивается с атмосферным. Тогда открывают выпускной кран и постепенно выпускают избыток пара в сосуд с водой. Несоблюдение этих правил может привести к резкому снижению давления, в результате чего жидкость в пробирках, колбах, которые стерилизовались, бурно закипает, смачивая ватно-марлевые пробки и даже выталкивая их. Такая ситуация нарушает стерильность материала.

В автоклаве при 120 °С в течение 20 мин стерилизуют простые питательные среды (МПБ, МПА), изотонические растворы, белье, перевязочный материал, а при 134 °С – обезвредил заразные материалы, отработанные культуры бактерий в течение 40 мин. Среды с углеводами не выдерживают такой обработки, поскольку они карамелизуються, в связи с чем их стерилизуют текучей парой.

Стерилизация текучим паром (100 °С) проводится в автоклаве с некрученной крышкой. При нагревании пар проникает между вложенными объектами и стерилизует их. Таким способом обрабатывают среды с углеводами. Поскольку одноразовое действие пары не убивает споры, применяют дробну стерилизацию – 3 дня кряду по 30 мин. Те споры, которые не погибли при первом нагревании, прорастают до следующего дня в вегетативные клетки и погибают при второй и третьей обработке.

Для тех веществ, которые не выдерживают 100 °С (белковые жидкости, витамины, некоторые лекарства), применяют тиндализацию – стерилизацию на водяной бане при температуре 58-60 °С в течение часа 5-6 дней подряд. Однако этот метод в настоящий момент широко не применяется, поскольку требует значительных затрат времени на его проведение.

Пастеризацией считают одноразовое прогревание материала к температуре ниже 100 °С, при которой уничтожаются, в первую очередь, вегетативные формы микроорганизмов. Этот способ впервые предложил Л.  Пастер для уничтожения безспорових форм микробов, преимущественно патогенных и условно патогенных видов. Споры при этом остаются живыми, а микроорганизмы, что остались, становятся заметно ослабленными. Метод широко используют в пищевой промышленности, когда при кипячении могут потеряться органолептические свойства продуктов. Так проводят термическую обработку молока, пива, вина, разных соков при 70  °С в течение 30 мин или при 80 °С – 5-10 мин. Пастеризованные продукты сохраняются на холоде.

Свертывания (уплотнение) сыворотки и яичных сред с одновременной их стерилизацией проводят в специальных згортувачах Коха с электрическим подогревом.

Асептически приготовлены сыворотки и яичные среды в наклоненном положении прогревают однократно при 80-90 °С один час. При подозрении на микробную контаминацию их прогревают при той же температуре три дня кряду.

Механические методы стерилизации широко используются в микробиологических лабораториях. Особенно при тех условиях, когда повышенная температура может разрушить субстраты. Это касается жидких сред и жидкостей, которые содержат белки, витамины, антибиотики, углеводы, летучие вещества и тому подобное. Метод можно применить для очистки бактериальных токсинов, бактериофагов от микроорганизмов. Однако этот метод считается менее надежным сравнительно с классической стерилизацией.

Механическая (холодная) стерилизация проводится с помощью фильтрования через мелкопористые антибактериальные или антивирусные фильтры. Их создают из специальных материалов, пронизанных порами, которые имеют разную форму и идут через фильтр извилисто. Фильтры можно изготовлять из положительно заряженного материала, тогда бактерии, которые несут на поверхности негативный заряд еще и взаимодействуют с ним электростатически, а не только механически в результате разного диаметра бактерий и пор. Чтобы предварительно проверить качество фильтров, используют мелкие тестовые микроорганизмы (Serratia marcescens или Pseudomоnas aeruginosa). Фильтрат высевают на питательную среду и выдерживают при оптимальной температуре в течение 5 дней. При отсутствии роста тестовых бактерий можно применять фильтр для стерилизации.

Промышленность разных стран выпускает самые разнообразные фильтры, которые отличаются по материалу изготовление и диаметром пор. Мембранные или коллоидные фильтры, которые изготовляют из нитроцеллюлозы, представляют собой диски диаметром до 35 мм

В микробиологических лабораториях часто используют фильтры Зейтца. Они представляют собой пластины (диски или квадраты) толщиной 4-6 мм, которые изготовляют из смеси асбеста и целлюлозы.

Однако эти фильтры имеют ряд недостатков, которые следует учитывать при работе с ними. Во-первых, возможно загрязнение фильтратов посторонними веществами, которые попадают у него из фильтра (щелочи, соли щелочных металлов, волокна асбеста). Во-вторых, асбест в результате своего негативного заряда связывает некоторые вещества из жидкости, которая фильтруется. Кроме того, следует тщательным образом проверять фильтры перед работой, чтобы не использовать те, которые имеют механическую деформацию (трещины, надломы и тому подобное).

Кроме асбестовых, широко используются фарфоровые фильтры, впервые предложенные Пастером и Шамберланом. Их иначе называют свечи Шамберлана. Изготовляют их из каолина и кварцевого песка и предоставляют формы порожнистогоцилиндра, который закрыт из одного конца. Величина пор отражается L1-L13. Фильтры L5-L13 являются антибактериальными.

Другой тип фильтров, которые изготовляют из земли (диатомиту или кизельгуру) инфузории, получил название свеч Беркефельда. За своим внешним видом они подобны цилиндрам, замкнутым из одного из концов. Свечи маркируют буквами V, N и W, что отвечает диаметру пор в пределах соответственно 8-12, 5-7 и 3-4 мкм.

Выпускаются еще и стерилизующие фильтры из стекла „Пирекс” в виде двухслойных дисков. Разделяют фильтры по размеру пор на три основных типа: С, М и Р. Розмир пор у них соответственно составляет свыше 1,7, от 1 до 1,7 и меньше 1 мкм.

Перед работой фильтр закрипляють в специальном держателе. В частности, асбестовые пластинки вмещают между цилиндровой и опорной частью металлического корпуса аппарата Зейтца. Обе части соединяют винтами. Собранный фильтр вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена с боковым отростком. Полностью вмонтированный фильтр заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. Жидкость для фильтрования наливают в металлический цилиндр, соединяют боковой отросток колбы с вакуумным насосом, чтобы создать вакуум в колбе и ускорить фильтрование. Фильтрат в колбе будет стерильным.

Химическим способом стерилизуют изделия из резиновых и полимерных материалов. Для этого используют 6 % раствор перекиси водорода, в который окунают изделия на 6 год при 18 °С и на 3 год при 50 °С. Можно применить раствор дексона с экспозицией 45 мин при 18 °С. По окончании стерилизации изделия дважды прополаскивают в стерильной дистиллированной воде, каждый раз изменяя ее, и переносят корнцангом в стерильный бикс.

Инструменты для эндоскопии и автоматические пипетки можно также стерилизовать спиртом.

Газовый метод стерилизации парами формальдегида, хлороформа, бета-пропиолактона, окисью этилена, окисью пропилена, метилбромида, озоном используют для обеззараживания эндоскопических инструментов, аппаратов для искусственного кровообращения, радиоэлектронного оборудования, пластмассовых изделий, кетгуту и тому подобное. Эффективной зарекомендовала себя смесь окиси этилена и бромистого метила в соотношении 1:1,44. Для проведения стерилизации газом используют специальные плотные камеры, которые герметически закрываются. Для каждого действующего фактора разработаны свои режимы стерилизации. После завершения процедуры газовая смесь выкачивается из камеры и заменяется стерильным воздухом. Предметами, какие булопростерилизовано указанным способом, рекомендуется пользоваться не раньше, чем через 24 год, для того, чтобы удалился весь газ.

Одним из методов стерилизации есть применение разных типов облучения. В практике используются для этого электроны, гамма-лучи, ультрафиолетовые лучи, радиочастотное облучение.

Электронные ускорители позволяют фокусировать электроны в узкий направленный пучок высокой мощности. Этот метод используют для стерилизации в промышленных масштабах хирургического перевязочного и шовного материалов еще на этапе их производства. Недостатком данного метода стерилизации является низкая проницаемость лучей.

К гамма-облучение чувствительные вегетативные и споровые формы разнообразных бактерий, грибов, дрожжей, вирусы. Облучение мощностью 2,5 Мрад используется для обеззараживания антибиотиков, витаминов, стероидных и других гормонов, пластмассового одноразового оборудования (чашек Петри, шприцев), хирургического перевязочного и шовного материалов и тому подобное.

Стерилизацию с помощью ультрафиолетового облучения проводят для обезвреживания бактерий в воздухе операционных, палат, боксов, микробиологических лабораторий и тому подобное. Для этого используют специальные бактерицидные лампы разной мощности – БУВ-15, БУВ-30 и др.

Однако следует помнить, что микробы могут быть защищены от действия ультрафиолетового облучения многочисленными органическими веществами, пылью и другими факторами. Вегетативные формы бактерий в 3-10 раз более чувствительны к УФО, чем споры.

Методы радиочастотного облучения на сегодня начинают интенсивно разрабатываться, особенно в пищевой промышленности. Сложность их заключается в опасности для обслуживающего персонала (например, препятствования систем связи, разная частота облучения, которая применяется для обезвреживания микроорганизмов).

Для проверки эффективности стерилизации, надежности работы автоклавов применяют химический и биологический контроль. Известны химические вещества с определенной температурой плавления: бензонафтол – 110 °С, антипирин – 115 °С, сера – 119  °С, бензойная кислота – 120-122 °С, манноза и мочевина – 132-133 °С. Именно при таких температурах чаще всего осуществляют стерилизацию. Химические вещества вмещают в стеклянные трубки, добавляют небольшое количество анилинового красителя (сафранин, фуксин или метиленовий синей), запаивают и кладут между объектами, которые стерилизуются. Равномерная расцветка препарата в цвет красителя в трубке свидетельствует о надлежащей температуре в автоклаве, а следовательно и надежность стерилизации. Для биологического контроля стерилизации в автоклав вмещают специальные биотесты – полоски фильтровальной бумаги, марли и тому подобное, на которых находятся споры бактерий с известной термостойкостью, споры известной численности и др.

 

 

Контроли стерилизации.

 

Рис. 11. Контроли стерилизации.

 

Рост и  размножение бактерий. Любое живое существо способно к росту и размножению. Под ростом понимают координированное воссоздание бактериальных структур и соответственно увеличение массы микробной клетки. Размножение – это способность микробов к самовоспроизведению, при этом увеличивается количество особей в популяции на единицу обєму среды

Размножение бактерий – сложный процесс, повязаний с синхронным взаимодействием многих их структур. Начинается оно из воссоздания генетического материала – ДНК, которая локализована в нуклеоиде. Сначала происходит репликация (удвоение) генетического материала полуконсервативным путем. Начинается она из репликативной точки на ДНК, расположенной  в месте соиденения мезосомы с цитоплазматичною мембраной. Нуклеиновая кислота деспирализируется, и нити ДНК расходятся. Каждая из них является матрицей, на которой  по принципу комплементарности  синтезируются их копии,  которые впоследствии соединяются в двухнитевую ДНК. Синтез дочерних нитей ДНК происходит ступенево, небольшими фрагментами по 1-2 тыс. нуклеотидов, которая позже сшивается ферментом лигазой. В зависимости от условий, репликация может длиться 20-40 минут.

Параллельно с репликацией начинается образование поперечной перегородки за счет цитоплазматической мембраны. Потом она окружается пептидогликаном. Во время репликации и образования перегородки клетка растет, синтезируются биополимеры, из которых будут состоять цитоплазматична мембрана, рибосомы, цитоплазма.

Клетки отделяются одна от другой, а у грамотрицательных  микробов  синтезируется дополнительно внешняя мембрана. Если клетки хранят звязки, образуются цепи из коккоподобных или палочкоподобных форм.

Подол клеток может происходить за тремя типами. Опережающий – такой тип, при котором образуются многоклеточные палочки и коки. При синхронном репликация нуклеоида сопровождается делением клетки, и образуются одноклеточные организмы. Третий тип – с опережающим делением нуклеоиду, при котором  образуются многоядерные формы бактерий.

Как правило, бактерии размножаются простым делением, что происходит в разных плоскостях. Это влечет, например,  образование   разных морфологических типов коккоподобных микроорганизмов – диплококков,  стафилококков, тетракоков, сарцин. Актиномицеты могут размножаться путем фрагментации нитевидных клеток, почкованием. Возможно образование клеток, подобных к спорам, конидий.

Облигатные внутриклеточные паразиты – хламидии – размножаются, проходя ряд стадий: элементарные тельця, инициальные тельця, промежуточные тельця. Именно последние являются тем источником, из которого формируется  новое поколение  элементарных телец. Длительность цикла составляет 40-48 часов.

Микоплазмы также могут образовывать особенные элементарные тела, которые способны к размножению фрагментацией или почкованием. Однако они могут размножаться  и простым бинарным делением.

Скорость размножения бактерий зависит от многих факторов: возраста культуры, состава питательной среды, его рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и тому подобное.

Бактерии размножаются в геометрической прогрессии. Если считать, что при оптимальных условиях бактерия удваивается каждые 30 минут, то через час их будет 4, через два часа – 16, через 4 – 256, через 15 – миллионы. Через 35 год их обєм будет составлять  до 1000 м³, а масса – свыше 400 т.

При внесении в питательную среду бактерии размножаются за определенными закономерностями. Они растут и размножаются, достигая определенного максимума до той поры, пока не будет исчерпано запасы питательных веществ. Если не удалять конечные продукты обмена и не добавлять необходимые вещества, то можно получить периодическую культуру (популяция в ограниченном пространстве). Микроорганизмы в такой культуре ведут себя как многоклеточные системы с генетически ограниченным ростом.

Кривая, которая описывает зависимость логарифму числа живых клеток от  времени культивирования, называется кривой роста.

 

Основные фазы роста периодической культуры:

1.     начальная (лаг-) – 1,

2.     экспоненциальная (або логарифмическая ) – 2 ,

3.     стационарная – 3

4.     отмирания – 4 (рис. 12)

 

Рис. 12. Основные фазы роста микробной популяции

на жидких питательных средах.

 

 

Классификация бактерий по типам дыхания :

 

Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры)

Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии)

Факультативные анаеробы (стафилококки, эшерихии, сальмонеллы, шигеллы)

Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии)

Капнеичные (возбудитель бруцеллеза бычьего типа)

Сегодня, в зависимости от условий получения энергии (способа дыхания), прокариоты разделяются на ряд групп.  Облигатные  аэробы – микроорганизмы, для оптимальнгоо роста которых необходимо 21 % кислорода. К ним принадлежат возбудители туберкулеза, чумы, холерный вибрион. На поверхности жидких питательных сред они растут, как правило, в виде пленки.  Облигатные анаэробы – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода. Такими бактериями являются  возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерії и др. Отдельные клостридии могут быть аэротолерантными. Для культивирования их используют специальные питательные среды и аппараты (анаеростати), в которых создаются анаэробные условия за счет поглощения кислорода или замены его індиферентиними газами (азотом, водородом).  Факультативные анаэробы (факультативные аэробы) приспособились, в зависимости от условий среды (наличия или отсутствия кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот. Группу факультативных анаэробов формируют многочисленные представители семьи  кишечных бактерий (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафилококки и некоторые другие бактерии. Микроаэрофилы – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост. Эта группа представлена молочнокислыми, азотфиксирующими бактериями. Капнеичными называют такие микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа. Типичными представителями являются  возбудители бруцеллеза бычьего типа.

У облигатных аэробов кислород используется в качестве конечный акцептор электронов в реакциях, что катализируются цитохромоксидазами и оксигеназами. В клетках факультативных анаэробов  также есть  цитохромоксидази, однако у облигатных анаэробов ферментов, которые катализируют взаимодействие с молекулярным кислородом, нет.

Детальное изучение механизмов дыхания у бактерий довело, что первыми микроорганизмами на земном шаре были анаэробы, так как до возникновения фотосинтезирующих эукариотов содержание кислорода в атмосфере был незначительным сравнительно с настоящим. По расчетам, чтобы  состоялось переключение механизма брожения на аэробное дыхание,  достаточно было 0,2 %  кислорода в атмосфере (на сегодня его концентрация составляет 21 %). В свою очередь рост содержания кислорода привел к изменению характера атмосферы из обновительного  на окислительное за счет соответствующих реакций. В условиях бескислородной атмосферы существовал дефицит акцепторов электронов, а с появлением кислорода эта проблема была розвязана.

 

 

Основные питательные среды для культивирования анаэробов: сахарный агар, сахарный кровяной агар Цейсслера, среда Китт-Тароцци, среда Вильсона-Блера, тиогликолевая среда.

 

Биологический метод создания анаэробных условий Фортнера:

Посев делают на сахарном кровяном агаре, который разделён посредине на две половины. На одной половине делают посев анаэробов, на второй – аэробов. Чашку  герметизируют парафином и ставят в термостат. Сначала растут аэробы. Когда весь кислород используется –  начинается рост анаэробов.

Для создания анаэробных условий тоже используется метод Хеннеля (часовых стеклышек).

 

 

               

 

Рис. 19. Анаэростаты.

 

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.

Генетика бактерий и вирусов – наука, что изучает механизмы наследования генетических признаков и их фенотипические проявления.

  Она основана блестящими экспериментами Грегора Менделя в 60-х годах прошлого века. Законы Менделя были подтверждены опытами Г.де Фриза, К. Кларренса, Е. Чермака. Значительный вклад в развитие учения об изменчивости микроорганизмов внесли К. Негели (основатель теории плеоморфизма – о безграничной изменчивости бактерий), Р. Кох и Ф. Кон, которые выдвинули идеи мономорфизма, которые утверждали постоянство и неизменность бактериальных признаков, присущих определенным видам.
 Значительный взнос в изучение законов изменчивости микроорганизмов сделали Л. Пастер, И. Мечников, Л. Ценковский, Г. Вавилов, Г. Тимофеев-Ресоцкий. В 1944 г. О. Ейвери, К. Маклауд, М. Мак-Ккарти довели, что именно ДНК является веществом, которое хранит генетическую информацию. Д. Уотсон и Ф. Крик, М. Уилкинсон в 1953 г. расшифровали генетический код, установив особенности механизмов синтеза белка.

F. Crick и  J. Watson – открыватели структуры ДНК

 

 

 

История развития молекулярной биотехнологии

 

 

Организация генетического материала бактерии

  Как известно, генетический аппарат прокариотов построен из двоспиральной нити ДНК, которая складывается с 3х109 пар нуклеотидов и замкнутая в кольцо. Она суперспирализирована благодаря полиаминам (спермина, спермидина), ионам магния и на электронных микрофотографиях имеет форму ожерелья.

 
   ДНК E. coli

 

 

ДНК состоит из пуринових (аденин, гуанин) и пиримидиновых (тимин, цитозин) нуклеиновых основ – гетероциклических азотистых соединений, в состав которых входит сахар дезоксирибоза.

Строение ДНК

 

Соединяет полимеры фосфорная кислота. Между цепями существуют ковалентные и водородные связи, потому молекулы легко распадаются. Количество адениновых основ равняется тиминовым, а гуаниновых – цитозиновым.
  Хромосома в функциональном отношении разделяется на фрагменты, которые называются генами. Ген – элементарная единица наследственности, что контролирует синтез специфической полипептидного цепи (структурный ген) или деятельность структурных генов (регулятор гена, оператор гена). Представлен он небольшими участками геномной или эписомной ДНК. Каждый ген состоит из триплетов (кодонов) нуклеиновых основ, которые кодируют одну аминокислоту.
 Гены, которые отвечают за синтез соединения, помечают строчными буквами латинского алфавита, которые отвечают названию соединения. Например his+ – гистидиновый ген leu+ – лейциновый ген. Гены, которые контролируют резистентность к антибиотикам, другим препаратам, отражаются буквой r (resistance – стойкость). Чувствительные к препаратам бактерии отражаются буквой s (sensitive – чувствительный). По этому принципу обозначения kanr, risr значит резистентные к канамицина и ристомицина штаммы, а kans, riss – чувствительные. Фенотип батерий отражается аналогично генотипу, однако прописными буквами.
 Совокупность генов нуклеоида и позахромосомных факторов наследственности предопределяют генотип бактериальной клетки. Фенотип – индивидуальное проявление генотипа в конкретных условиях существования.
 Существует определенный механизм, с помощью которого последовательность нуклеотидов в гене определяет последовательность аминокислот в белке.

  Сначала ДНК клетки деспирализируется, и на одной из ее нитей, как на матрице, фермент ДНК-зависммая РНК-полимераза по принципу комплементарности формирует полирибонуклеотидную цепь, которая называется информационной или матричной РНК (іРНК, мРНК). Эта стадия синтеза белка называется транскрипция (transcriptio – переписываю). 

  Информационная РНК переносится клеткой в цитоплазму, где расположены рибосомы Начинается начинающий этап – трансляция (translatio – перенесение). Именно в этот период на рибосомах происходит считывание генетического кода іРНК и построение полипептидных цепей.

 В цитоплазме клетки всегда существуют особенные специфические нуклеиновые кислоты, которые называются транспортными РНК (тРНК). На одном из концов они имеют триплет нуклеотидов (антикодон), а на другом – место для соединения с соответствующей аминокислотой (кодон). Они доставляют необходимую аминокислоту к рибосомам, на которой происходит элонгация (elongatio – удлинение) полипептидной цепи.
 Генетическая информация клетки может быть закодирована как хромосомными генами, так и генами, которые находятся в внехромосомном состоянии, то есть отмежеванные от хромосомы, но способные к длительной поддержке и воссозданию в такой форме. Они обнаружены у бактерий многих родов. Позахромосомные элементы наследственности представлены плазмидами, транспозонами, Is-элементами и фагами.
 Мельчайшими по своим размерам являются Is-последовательности (insertion sequenses – вставленные последовательности).

Они складываются с 1000 пар нуклеотидов и не несут других генов, кроме генов, которые отвечают за их перемещение в разные участки бактериальной ДНК. Во всех случаях они связаны с хромосомной или плазмидной нуклеиновой кислотой и не способные к самостоятельной репликации.

Функции:

    Координирующая: взаимодействие транспозонов, плазмид, умеренных фагов между собой и хромосомой бактерии, обеспечивая их репликацию.

    2. Регуляторная: вызывают инактивацию генов, или служат промоторами (участки ДНК, которые регулируют экспрессию клеточных генов).

    3. Индуктируют мутации за типом делеции или инверсии

  Транспозоны (transposition – перемещение) являются нуклеотидными последовательностями, которые кроме генов, которые отвечают за транспозицию, могут нести гены, кодирующие другие функции. Длина их достигает 2000-20000 нуклеотидних основ.

 

 Они могут существовать самостоятельно в виде кольцевой молекулы ДНК, не способной к репликации, или быть включенными в состав бактериальных геномов и плазмид. Они могут нести информацию о синтезе, например, бактериальных энтеротоксинов, ферментов, разрушающих антибиотики.
 Транспозоны обнаружены в клетках дрожжей, бактерий, растений, насекомых, позвоночных и даже людей. Важнейшее их свойство – способность к миграции с одним репликоном к другому. За счет этого они выполняют функции:

 

    1. Регуляторная.

    2. Кодирующая.

    3. Индуктируют генные мутации за типом делеции или инверсии.

    4. Включение их в репликон сопроводжается аберациями (структурными перестройками) в ДНК этих репликонов; чаще всесго проявляются инсерции, делеции, инверсии

  Плазмиды      – кольцевые молекулы ДНК молекулярной массой до 106-108 Д с 1,5-400 тыс. пар основ. Они могут существовать в цитоплазме в свободном состоянии или быть интегрированными с клеточной хромосомой. Тогда их называют эписомами. Плазмиды содержат в своем составе tra-оперон (transfer – перенос), который обеспечивает их способность к передаче, и гены, которые кодируют какой-то признак. Их называют трансмиссивными, если они самостоятельно передаются другим клеткам с помощью конъюгации, и нетрансмиссивными, когда не имеют собственного аппарата передачи, а переносятся вместе трансмиссивными или при трансдукції. Они могут существовать в клетке в нескольких копиях.

 

 

Виды плазмид

    1. Трансмиссивные (конюгация).

    2. Нетрансмиссивные (трансдукция)

    3. “Криптичные”.

    4. Монокопийные

    5.Мультикопийные

Плазмиды выполняют регуляторную и кодирующую функции. Регуляторный эффект их заключается в способности представлять собственные репликоны при нарушении функционирования клеточных генов; кодирующая роль – во внесении в клетку новых признаков, которые предоставляют ей определенных преимуществ при взаимодействии с организмом хозяина.

Сегодня известно несколько десятков многообразных плазмід. Среди них детальнее всего изучен плазмиды F, Col, R, Ent, Hly, бактериоциногенности, биодеградации. Плазмиды F обеспечивают перенос бактериальной хромосомы при конъюгации. R-плазмиды являются факторами множественной резистентности к лекарственным средствам. Они кодируют стойкость до 10 антибиотиков и солей тяжелых металлов (Ni, Cu, Hg). Col-плазмиды обеспечивают синтез колицинов – белков с летальной активностью против колиформных микроорганизмов. Hly-плазмиды предопределяют образование гемолизинов у золотистых стафилококков, Ent-плазмиды обеспечивают энтеротоксигенную активность штаммов кишечной палочки. Плазмиды биодеградации предоставляют микроорганизмам способность утилизировать необычные субстраты: Cam-плазмида – камфору, Oct-плазмида – октана и тому подобное.

Функциональные свойства плазмид

 

О плазмидной локализации гена могут свидетельствовать высокие темпы потери признака спонтанно, а также усиление ее под воздействием повышенной температуры, химических веществ (акридиновые красители), общая потеря и общее приобретение нескольких признаков.
  Способствовать проявлениям изменчивости бактерий могут некоторые умеренные и дефектные бактериофаги. За своими биологическими свойствами они подобные к плазмидам, могут самостоятельно существовать в цитоплазме бактериальных клеток. При интеграции с хромосомой микроба они могут предоставлять ему новые признаки.
 Таким образом, плазмиды убикитарные. Они не имеют решающего значения для обеспечения существования бактериальных клеток, однако играют не важнейшую роль ли в создании разнообразия генетического материала при естественном отборе.

 

Изменчивость микроорганизмов

  Одним из основных признаков любой живой структуры является ее изменчивость. Не стали исключением в этом плане многочисленные представители микробного царства.

  Различают два вида изменчивости микроорганизмов: ненаследственную или модификационную и наследственную или генотипическую.

 Модификационная изменчивость заключается в изменении многообразных свойств микроорганизмов под воздействием факторов окружающей среды, однако она не задевает генетический аппарат клетки наследственно не передается. Она предопределяется адаптационными механизмами бактериальной клетки, ее способностью призвичаюватись к условиям окружающей среды за счет активации генов, которые находятся в “немом” состоянии.
 Подлежат модификациям самые разнообразные свойства бактерий. Исследовано изменения морфологических признаков в результате старения клетки, появление вытянутых, согнутых палочек вульгарного протею под воздействием фенола, изменение морфологии холерного вибриона в результате действия глицерина. Под воздействием пеніциліну, лизоцима, специфических иммунных сывороток граммположительные и грамнегативні бактерии могут терять свою клеточную стенку, превращаясь в L-формы. Клетка при этом теряет свою типичную морфологию, приобретает шаровидную форму, в ней могут появляться мелкие зерна, вакуоли. После прекращения действия агента они приобретают привычный вид.

 Следовательно, модификационные изменения непродолжительные, характеризуют степень приспособления бактерий к новым условиям существования, они являются нормой реакции клетки, удостоверяя потенциальную способность генотипа реагировать на измененные условия существования.

  При генотипній изменчивости микроорганизмов многообразные признаки бактерий наследуются и передаются потомкам. Она может развиваться в результате мутаций и рекомбинаций.

 Мутациями называют любые изменения последовательности нуклеотидов гена, которые изменяют его структуру, а соответственно, и функционирование, но не связанные с рекомбинационным процессом. Считается, что мутационный процесс лежит в основе эволюции микроорганизмов в природе. Последовательность нуклеотидів может измениться либо при замене одной пары основ на другую в результате ошибки во время репликации или при разрыве ДНК со следующим выпадением или инверсией фрагменту, который лежит между точками разрыва, либо в результате вставки какого-то нового фрагменту.

 Классифицировать мутации можно с разных точек зрения. За своим проявлением их можно разделить на морфологические, физиологичные, биохимические и другие в зависимости от вида признака, который изменился в результате мутации. Среди морфологических признаков может измениться расцветка или характер колонии бактерий. Другая группа – это мутации стойкости. После них микроорганизм приобретает способность, например, переносить токсичные концентрации веществ, которые подавляют рост диких штаммов (резистентность к антибиотикам). К биохимическим мутациям принадлежат проявления ауксотрофности и прототрофности.
 За своим происхождением мутации разделяют на спонтанные и индуктируемые. Спонтанные мутации происходят с частотой 105-1012 без вмешательства экспериментатора, при, якобы, оптимальных условиях существования микробов. Они возникают в результате действия каких-то не установленных окружающих факторов.
 Индуктируемые мутации возникают под воздействием действия на клетку установленных мутагенных факторов. Частота их на несколько порядков выше, чем спонтанных.

 За локализацией мутации подіяють на нуклеоидные, которые возникают в нуклеоиде клетки, и цитоплазматическиеі, которые возникают в позахромосомных элементах наследственности – плазмидах; за количеством генов, которые мутировали, – на генные и хромосомные, за величиной – на большие (хромосомные) и малые (точечные).
 Хромосомные мутации чаще бывают инверсиями (фрагмент ДНК в молекуле переворачивается на 180°), дупликациями (удвоение участка хромосомы), делециями (выпадение части хромосомы), дислокациями (происходит изменение локализации участка ДНК).

 Точечные мутации чаще наблюдаются как делеция, вставка фрагменту ДНК (инсерция) или замена основ. Если наблюдают замену пуриновых основ на пуриновую, а пиримидиновых на пиримидиновые, такую мутацию называют транзицией. При условии замены пуриновой основы на пиримидиновую и наоборот, мутация называется трансверсией.
 Любая мутация, что изменяет генотип дикого штамма, называется прямой мутацией. Если в результате мутации возобновляется исходный генотип дикого штамма, она называется обратною. Однако, когда возобновляется фенотип дикого штамма, но мутация происходит в локусе, не зацепленному прямой мутацией, такой тип изменений получил название супресорной мутации. Она может быть внутригенной и позагенною. Плейотропными называют такие мутации, которые ведут к изменению двух и больше признаков.

Мутации есть еще таких видов:

    1. Прямая мутация

    2. Обратная (обратная) мутация или реверсия

    3. Супресорная мутация (внутригенная, позагенная). Ведет к возобновлению фенотипа а не генотипа.

    4. Плейотропная мутация (изменение 2-ох и больше свойств клетки)

    5. Мутация нонсенс (делает кодон несуразным – не кодирует ни одной аминокислоты)   

  Увеличивать частоту мутационного процесса могут особенные факторы, которые называют мутагенами. Самый доступный мутаген – ультрафиолетовое излучение с длиной волны 2600 А°. Оно вызывает особенные повреждения – образование димеров тимина и замену основ. Ионизирующее облучение (рентгеновские лучи, г-лучи) также влечет мутации разной природы. Большую группу составляют химические мутагены. Самый безопасный из них – азотистая кислота, которая дезаминирует аденин. N-нитрозометилмочевина является супермутагеном и канцерогеном, способным вызывать разные типы мутаций. Не уступают ей за своей активностью нитрозогуанидин, этилметансульфонат. Высокую мутагенную активность имеют акридини, аналоги основ (5-бромурацил), которые включаются в состав ДНК между основами, вызывая сдвиг рамки считывания. К биологическим мутагенам принадлежит перекись водорода, что образуется при метаболизме внутри клеток, лекарственные препараты, такие как нитрофураны, некоторые антибиотики (митомицин С). 

Классификация мутагенов

    Физические:

    1. УФО (л-2600 А) – самое сильное мутагенное действие; образуются димери тимина, замена основ

    2. Ионизирующее облучение (рентгеновское, гамма-лучи)

    Химические:

     1. Азотистая кислота (самый доступный и безопасный)

     2. N-нитрозометилмочевина – супермутаген, канцероген

     3. Этилметансульфонат

     4. Акридини

     5. Нитрозогуанидин

     6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-аминопурин)

     7. Лекарственные препараты (нитрофурани, некоторые антибиотики

    Биологические: перекись водорода вирусы, фаги

Действие разных мутагенов на бактерии

Своеобразной формой генотипической изменчивости бактерий является явление диссоциации. Его можно наблюдать при культивировании микроорганизмов на плотных питательных средах. Изолированные колонии микроорганизмов определенного вида образуют на поверхности среды колонии двух типов – S-формы (smooth – гладкий и блестящий) и R-формы (rough – шершавый). Колонии первого типа – гладкие и блестящие, блестящие, с ровными краями. Колонии R-типа, напротив, мутные, шершавые, с неравным зазубренным краем. Оказалось, что некоторые свойства микроорганизмов, невзирая на то, что они принадлежат к одному и тому же виду, также отличаются. Да, клетки S-формы колоний, нормальной морфологии, вызывают диффузное помутнение бульйону, биохимически они более активные, полноценные в антигенном отношении, более вирулентные, их выделяют, как правило, в остром периоде заболевания. Возбудители чувствительные к бактериофагам и стойкие к фагоцитам, бактрицидної действию сыворотки крови.

 Микроорганизмы, которые образуют R-формы колоний, имеют более слабую биохимическую активность, менее чувствительные к действию бактериофагов и имеют менее выраженные вирулентные свойства. Исключением являются возбудители туберкулеза, сибирки, чумы.

 Исследования довели, что такие изменения происходят в результате мутаций в генах, которые детерминируют синтез отдельных компонентов мембран бактерий.

 Считается, что диссоциация предоставляет микробам определенных селективных преимуществ при существовании в организме хозяина, и в то же время она утруждает диагностику инфекционных болезней, в первую очередь, дизентерии и эшерихиозов.

R и S формы колоний

Свойства микробов S-колоний

    Клетки нормальной морфологии

    Диффузное помутнение бульйона

    У подвижных видов есть жгутики

    У капсульных вариантов есть капсулы

    Биохимически более активные

    Полноценные в антигенном отношении

    У патогенных видов – вирулентные

    Выделяются в остром периоде болезни

    Чувствительные   к бактериофагам

    Менее чувствительные к фагоцитозу

Однако на протяжении своей эволюции бактериальные клетки произвели определенные механизмы, которые обеспечивают стабильность генетического кода, оберегают его от мутаций или ликвидируют их негативные последствия. Они называются репарациями. Репаративные процессы распространены у микробов и контролируются с помощью специальных генов.

 Выделяют виды репараций: фотореактивация, темновая и SOS-реактивация.

Фотореактивация защищает клетку от негативного действия ультрафиолетовой радиации, которая вызывает образование тиминовых димеров. На солнечном свету ( образуются особенные ферменты, которые разрушают связки между пиримидиновыми димерами.

Феномен темновой репарации сложнее предыдущего. Его сущность заключается в том, что особенные ферменты находят мутованный участок ДНК и вырезают его. С помощью ДНК-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ комплементарно возобновляется исходная структура молекулы, и ферменты лигазы сшивают ее с материнской нитью.

Для получения мутантов разработаны методы, основанные на выявлении разницы в скорости роста бактерий, разной способности их к выживанию и тому подобное.

SOS-реактивация

    При множественных повреждениях участка с мутациями переводятся в неактивное состояние, а их роль исполняет невредимый участок ДНК

Методы выявления мутантов

    За разницей в скорости роста (занял на минимальную среду; Мутанты вырастают)

    Разная способность к выживанию

    Метод реплик Ледерберг

 

Чаще всего используют метод реплик Ледербергов. Для этого чистую культуру бактерий, на которую действовал мутагенный фактор, засевают на полноценную плотную питательную среду из расчета, чтобы выросло 100-200 изолированных колоний. После этого с помощью штампа-репликатора, покрытого бархатом, диаметром несколько меньше чашки Петри колонии переносят на минимальную питательную среду.

Метод реплик для выявления ауксотрофних мутантов

На нем вырастают только колонии прототрофних организмов. Сравнивая их расположение с исходной материнской чашкой, находят колонии, образованные мутантами бактерий. Их отсевают на питательные среды для получения чистой культуры и изучают морфологические, культуральные, антигенные, биохимические, биологические и другие свойства.

 

Генетические рекомбинации

  Рекомбинации – особенные феномены наследственной изменчивости микроорганизмов, которые не связаны с мутационным процессом. Рекомбинанти, что при этом возникают, наследуют некоторые признаки обеих “родительских” клеток, ведь происходит экспрессия гена реципиента и части генома донора. Генетические рекомбинации создают неисчерпаемый источник многообразных комбинаций генов, которые природа использует в процессе эволюции. Считается, что способность клеток к рекомбинациям детерминируется особенными rec-генами (recombination – рекомбинация).

  Выделяют три основных вида генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция и конъюгация.

 Трансформация – процесс гибридизации в результате переноса генетических детерминант от бактерии потому что бактерии с помощью изолированной ДНК.

  Впервые на явление трансформации обратил внимание Ф. Гриффитс в 1928 г., изучая пневмококки (Streptococcus pneumoniae), которые образуют капсулу в организме, а на агаре растут в виде гладких (S-форма) и блестящих колоний. При введении белым мышам убитых нагреванием вирулентных капсульных пневмококков ІІІ типа вместе с авирулентными бескапсульными пневмококками ІІ типа (R-форма) лабораторное животное через несколько дней погибало, а из ее крови высевались живые капсульные пневмококки ІІ серотипу. Следовательно, происходила глубокая перестройка генетического аппарата клетки, которая приобретала способность синтезировать капсулу.

Опыт Ф. Гриффитса

Это значит, что авирулентный штамм превратился в вирулентный, что из мертвых клеток выделился какой-то агент, который предоставлял возможность живым клеткам образовывать полисахарид капсулы. И этот признак передавался наследственно.

 В 1944 г. О. Евери, К. Маклеод и М. Маккарти смоделировали этот феномен in vitro, выделили и очистили трансформирующий агент. Им оказалась молекула ДНК. Трансформация происходит только в тех клетках, которые способны к ней. Такое состояние определяется понятием компетентности, природа которой окончательно не выяснена. Считается, что она предопределяется наличием особенного белка – компонента клеточной мембраны, способного расщеплять некоторые структурные элементы клеточной поверхности. Таким образом высвобождаются рецепторные участки, с которыми взаимодействует ДНК. Состояние компетентности формируется на определенных стадиях развития бактериальной клетки.

 Механизм явления трансформации заключается в том, что сначала на поверхности реципиента клетки адсорбируется небольшой фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 часть хромосомы донора клетки). Впоследствии он проникает внутрь клетки, где одна нить ДНК переваривается эндонуклеазами, а другая – монтируется в клеточную хромосому. Наступает последняя фаза процесса – экспрессия рекомбинантов. Такой процесс интеграции происходит очень быстро. Исследовано, что для появления рекомбинантов достаточно пяти-десятиминутного контакта реципиента клетки с донорской ДНК, а сам процесс завершается через 2 часа.

Трансформирующую активность ДНК можно приостановить химическими мутагенами, ультрафиолетовым, ионизирующим облучением и, особенно, ферментом ДНК-АЗОЮ, что убедительно свидетельствует об участии ДНК в этом процессе.

  Способность к трансформации обнаружена у многих микроорганизмов – представителей родов Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia и других. За ее помощью можно передать резистентность к антибиотикам, способность метаболізувати многообразные вещества, капсулоутворення и тому подобное. Феномен трансформации можно использовать для анализа наследования определенных признаков бактериальной клеткой, получение путем гибридизации микроорганизмов с новыми свойствами

 При конъюгации в результате физического контакта между донорами бактерий и реципиентами бактерий происходит передача генетического материала через особенные вирости, которые называются секс-пили.

конъюгация

Впервые это явление исследовали Д. Ледерберг и E. Тейтум на модели кишечной палочки (1946). Необходимым условием для процесса конъюгации является наличие в клетке-доноре особенного фактора, который называется F-фактор (fertility – плодовитость). Он есть кон’югативною плазмідою, что существует автономно в цитоплазме бактерии. Складывается она из генов переноса и генов, которые кодируют определенные признаки клетки. Бактерии с F-факторами отражаются как F⁺-, а без него – F^–– клетки. F-фактор детерминирует образование половых ворсинок, следовательно, способность клеток к конъюгации. Половые ворсинки – особенные трубчатые вирости на поверхности клетки. Они полые, длина их в несколько раз превышает величину бактерии.

 Процесс конъюгации начинается с того, что с помощью половых ворсинок донор клетки касается реципиента клетки, фиксирует ее и притягивает к себе. После этого плазмида начинает реплицироватся, и одна ее нить передается в реципиентный штамм, а другая остается на городе. Происходит комплементарний синтез другой нити ДНК. Таким образом F⁺-фактор имеют уже две бактерии. Клетка, которая получила конюгативную плазмиду F, приобретает способность синтезировать половые ворсинки на поверхности, следовательно, может сама вступать в конъюгацию. Частота этого процесса – 10-6-10-8. В некоторых случаях F-плазміда способна интегрировать с хромосомой. Если такая интеграция стабильна, образуются клоны клеток, в которых все бактерии способны вступать в конъюгацию с достаточно высокой частотой – 10-1-10-4. Такой штамм называют штаммом Hfr (high frequency of recombination – высокая частота рекомбинаций). В отличие от F+-клітин в Hfr-донорах F-фактор интегрирован с хромосомой бактерий. Когда такие клетки вступают в конъюгацию с F–штаммами, к ним передается только одна нить ДНК. Длится процесс 60-90 минут, а скорость переноса составляет до 5C104 пар нуклеиновых основ за одну минуту. Таким образом, в реципиенте клетки экспресируется собственный геном и часть генома донора.

 Порой в клетках Hfr может происходить отщепление F-фактора и он переходит в автономное существование в цитоплазме, захватив с собой сегменты хромосомы хозяина клетки. Такой F-фактор называется F-генота, а клетка, что его несет, клеткой FE. В ее хромосоме есть дефект, соответствующий потерянному фрагменту.

 

  Таким образом, от бактерии к бактерии можно перенести многообразные свойства донорского штамма. Кроме того, перерывая процесс конъюгации через определенные промежутки времени и изучая новые свойства, которые приобрела реципиент клетки, можно определить локализацию генов на хромосоме, то есть провести ее картирования. 

 

 Явление конъюгации исследовано для многих представителей микробного царства – кишечных и синегнойных палочек, сальмонел и других. Установлено, что процесс конъюгации может происходить не только в пределах одного вида, но и между разными родами бактерий. С медицинской точки зрения заслуживает на внимание факт передачи с помощью конъюгации фактора множественной врачебной резистентности (R), который предопределяет стойкость бактерий ко многим антибиотикам.

 Трансдукция. В 1952 г. Н. Циндер и Д. Ледерберг, изучая процесс конъюгации между разными штаммами сальмонел, обратили внимание, что иногда обмен генетическим материалом происходит не в результате конъюгации, а в результате высвобождения из родительских штаммов умеренного бактериофага. Явление обмена генетической информацией у бактерий путем переноса фагами фрагментов ДНК от донора клетки к реципиенту клетки получило название трансдукції.

 Она часто происходит в энтеробактерий, псевдомонадах, стафилококках и бациллах. Считают, что большинство видов микроорганизмов несут в своем геноме профаг, потому трансдукция может быть чрезвычайно распространенным явлением в микробном мире.

 Выделяют три основных вида трансдукції: специфическую, общую или генерализированую и абортивную.

 

Процесс трансдукции отличается от лизогенной конверсии, которую также обеспечивают умеренные бактериофаги. При последней клетка приобретает новые свойства за счет экспрессии в ней собственных генов фага. Ярким примером такого явления является перенос tox+ генов дифтерийных фагов в дифтерийные палочки, в результате чего они приобретают токсигенные свойства. Аналогичное явление наблюдается у возбудителей ботулизма, стафилококков.
 При абортивной трансдукции фагова ДНК и гены донора бактерии не интегрируются в хромосому реципиента, а остаются в цитоплазме. Во время деления клетки они передаются только одной из дочерних клеток, а впоследствии просто элиминируются из нее.

 Явление ненаследственной и наследственной изменчивости наблюдается также у вирусов. Модификациям подлежат состав белков капсиду, суперкапсиду, который предопределяется влиянием клеточных компонентов при репродукции вирионов.

 Как проявление генотипической изменчивости, у вирусов обнаружены также феномены мутаций и рекомбинаций. В результате мутаций могут изменяться размеры бляшек под агаровым покрытием, нейровирулентность вирусов для животных, чувствительность их к действию химиотерапевтических препаратов. Благодаря мутациям, которые возникли при пассажах вирусов через мозг кроликов, получен фиксированный вирус, а при пассажах через мозг цыплят – штамм Флюри, которые используются при создании антирабических вакцин для активной профилактики бешенства. При заражении чувствительной клетки одновременно несколькими вирусами наблюдаются проявления многочисленных генетических рекомбинаций: множественная реактивация, пересортування генов, крос-реактивация, гетерозиготность, транскапсидация. Они встречаются также in vivо, что позволяет по-новому оценить некоторые стороны развития вирусных инфекций.

Практическое значение генетики бактерий

  Генетические феномены нашли широкое практическое применение в разных отраслях науки, техники, медицины, фармацевтической промышленности, биотехнологии, сельского хозяйства.

 Благодаря применению генетических методов, получены высокоактивные штаммы бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, которые продуцировали в 200-1000 раз и больше аминокислот, органических кислот, ферментов, витаминов, кормового белка, сравнительно с выходными, а также вакцинные штаммы микроорганизмов и вирусов. Использование многообразных мутагенов (ультрафиолетовое и радиоактивное облучение, химические вещества) позволило создать мутантний штамм гриба Penicillium chryzogenum, который в диком состоянии продуцировал 100 од/мл пеницилина, а после направленной селекции – 10000 од/мл.
 Установлено, что некоторые микроорганизмы, например, Fuzarium monilifore, синтезируют биологически активные субстанции типа фитогормонов, гиберелинов, биоинсектицидов и других, которые являются эффективными стимуляторами роста и развития высших растений. Генетические подходы позволили проводить целеустремленный селекционный процесс для получения продуцентов этих веществ.

 Существенный вклад вносит генетика в уменьшение загрязнения окружающей среды: очистка стоковых вод, переработка отходов и побочных продуктов сельскохозяйственного производства и промышленности, предложив специально селекционированные с этой целью микроорганизмы

 Стремительное развитие биологической науки ярко проявилось в становлении генной и клеточной инженерии – совокупность экспериментальных методов, с помощью которых переносят гены от одного организма к другому. Она родилась в 1972 г., когда американским исследователям П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коену удалось получить гибрид вируса мартышки SV-40 и бактериофага л.

 Еще до недавнего времени возможность конструирования живых организмов с заданными свойствами казалась недосягаемой. Для осуществления этого фантастического эксперимента необходимо получить соответствующий ген, присоединить его к специальному вектору – проводника, чтобы не быть уничтоженным клеточными ферментами, ввести в другую клетку и заставить там работать. Для всех этих операций необходимое участие специальных ферментов (их известно уже несколько сотен), которые способны разрезать донорскую ДНК и ДНК вектора в определенных участках на отдельные фрагменты. Другие ферменты необходимы для присоединения соответствующих генов к ДНК. Для расшифровки строения генов используют методы биохимического синтеза при участии ферментов ревертаз. Как векторы используют бактериальные плазмиды, бактериофаги, некоторые вирусы. Они способны реплицироваться в реципиенте клетки и содержат один или несколько маркеров, которые позволяют распознавать рекомбинантные клетки.

 

О высокой эффективности генно-инженерных методов получения химически чистых биологически активных веществ свидетельствует такой факт. Чтобы получить 5 мг соматотропина, был использован мозг 500 000 овец на протяжении 5 лет, в то время как аналогичное количество гормона дают 9 л бульйонной суспензии кишечной палочки.

 Генная инженерия предоставила возможность получить инсулин, простагландины, энкефалины, интерферон, интерлейкины, гормоны, многообразные ферменты, исчислении химически чистые углеводы – глюкозу, ксилит и тому подобное.

Некоторые гормоны человека, которые продуцируются рекомбинантными микроорганизмами

 Медицинская наука стоит на пороге разработки методов генной хирургии. Например, у человека порой встречается врожденная недостаточность фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). В таком случае она склонна к подагре, часто наблюдается боль в суставах, развивается мочекамяная болезнь. Эксперименты на животных убедительно довели, если вмонтировать ген, ответственный за синтез этого фермента, в ретровирус и ввести его в спинной мозг белых мышей, они начинают синтезировать ГГФРТ. Клонирован из макрофагов человека ген фактора некроза опухолей в кишечной палочке при введении ее белым мышам с саркомами вызывает их разрушение.

 
 Широкие перспективы открывает генная инженерия на пути создания высокоэффективных средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. Введение в геном кишечных палочек, вирусов вісповакцини, дрожжей некоторых генов вирусов гепатита В, ящур позволили разработать субодинические вакцины.

 

СФЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ

 

Таким образом, микробиологическая наука позволяет создать стройную систему взаимоувязанных отраслей биотехнологии, которые имеют уникальное преимущество – они основаны на функционировании естественных систем, которые подчиняются интересам человека.

 

ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ

    Способы увеличения информации:

    – двукратное считывание одієї іРНК из других инициирующих кодонов

    – сдвиг рамки трансляции

    – сплайсинг  (вырезание інтронів)

    – транскрипция из участков ДНК, которые перекрываются

 

У вирусов могут быть:

    Модификации (изменение состава белков капсиду, суперкапсиду под воздействием клеток)

    Мутации (размер бляшек под агаровым покрытием, нейровірулентність для животных, чувствительность к действию хіміотерапевтичних агентов, ts-мутации – температурочутливі – вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах

    Рекомбинации

 

ВИДЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ

               1. Рекомбинация: Обмен генами (межгенная) и их частями (внутригенная)

Скрещивание близких за свойствами вирусов при одновременном культивировании.

Например, вирусы полиомиелита ( увеличена и уменьшенная  чувствительность к гуанідіну, разная нейровірулентність), вирусы гриппа (разная нейровірулентність для мышей, но одна пневмотропність), гибридизация вирусов оспы кролика и  вируса вісповакцини

               2. Множественная реактивация: вирусная инфекция вызывается при заражении вирионами с поврежденным геномом, поскольку функцию этого гену выполняет вирус, в который ген не повреженно. Потомки – невредимые вирусы

               3.  Пересортувание генов:  между вирусами, которые имеют сегментированные геномы (вирусы гриппа человека, кочок, свиней, буньявируси, аренавирусы, реовирусы). Гибридные формы называют реасортанти.

 

               4. Гетерозиготнисть: одновременной репродукции нескольких вирионов, разных за наследственными свойствами, образуются вирионы, которые содержат определенный геном одного из родительских штаммов и часть геному другого вируса (т.н. диплоїдні или поліплоїдні вирусы). Такое объединение не наследуется, но позволяет дать потомков с разными свойствами.

               Это вирусы гриппа, болезни Ньюкасл

               5. Транскапсидация: часть чужерідного генетического матерілау, заключенного внутри капсиду другого вируса, способна переноситься в стабильной форме в чувствительные к основному вирусу клетки.

Аденовирусы человека не размножаются в клетках мартышек. Но при одновременном культивировании аденовирусов и вирусов SV-40 под одним капсидом образуется вирус, что содержит геномы обидвох вирусов, который способен размножаться в клетках мартышек.

               6. Крос-реактивация (спасание маркера): реактивація инактивированного геному неинактивированным (подобно множественной реактивації)

 

 

ВИДЫ НЕГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ

    1. Фенотипове смешивание

    2. Негенетическая реактивація

    3. Комплементация

    4. Стимуляция

    5. Интерференция

 

 

 

Фильм «Биотехнология» 

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/video/med_bio/index.php?name_film=biot