Высокоэффективная жидкостная хроматография. Определение предельно допустимого содержания примесей в субстанции лекарственного вещества.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Определение предельно допустимого содержания примесей в субстанции лекарственного вещества.

 

         В классическом варианте жидкостной хроматографии в стеклянную колонку длиной 1-2 м, заполненную сорбентом (размер частичек ≥100 мкм), вводят анализируемую пробу и пропускают элюэнт. Скорость продвижения элюэнта под действием силы тяготения мала, а анализ очень длительный. Вследствие использования сорбентов с размером зерен 10-30 мкм, поверхностно- и объемно-пористых сорбентов с размером частичек 5-10 мкм, насосов высокого давления и чувствительных детекторов состоялся переход от классической жидкостной хроматографии к ВЭЖХ. Быстрый массоперенос при высокой эффективности разделения разрешает использовать ВЭЖХ для разделения и определения молекул (адсорбционная и распределительная хроматография), для разделения и определения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзивная или гель-хроматография). Методами афинной и лигандообменной хроматографии разделяют БА молекулы и оптические изомеры.

         ВЭЖХ – фармакопейный метод анализа, рекомендованный для контроля качества субстанций, лекарственного растительного сырья, готовых лекарственных средств за рядом показателей качества (тождественность, содержание примесей, количественное определение, однородность содержания, растворение).

 

Высокоэффективная жидкостная хроматография.

         Жидкостная хроматография – это метод разделения и анализа сложных смесей, в котором подвижной фазой является жидкость. Он применяется для разделения более широкого спектра веществ, чем ГХ, поскольку большинство веществ – нелетучие, многие из них – неустойчивы при высоких температурах (в особенности ВМС) и разлагаются при переведении в газообразное состояние. В ЖХ разделение наиболее часто происходит при комнатной t°.

 

Теоретические представления.

         Базируется на адсорбции из раствора. Адсорбционное равновесомие между раствором и адсорбентом подчиняется уравнению изотермы адсорбции Ленгмюра, в области разбавленных растворов изотерма линейная. Селективность адсорбции зависит от природы сил взаимодействия между адсорбированными веществами и адсорбентом.

         Эффективность хроматографической колонки зависит, главным образом, от процессов диффузии и массопереноса в обоих фазах и определяется, как и в газовой хроматографии, высотой эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ) Н. С линейной скоростью подвижной фазы U и некоторыми другими величинами ВЭТТ связана уравнением

H = 2Rr(1 – Rr)Uts,

где

где t_m – среднее время между десорбцией и повторной адсорбцией молекулы вещества, если она двигается со скоростью подвижной фазы U;

t_s – среднее время пребывания молекулы в неподвижной фазе.

         Таким образом, с ростом линейной скорости движения подвижной фазы ВЭТТ возрастает и, соответственно, эффективность колонки уменьшается.

         В классическом варианте ЖХ состоит из стеклянной колонки l=1-2 г, заполненной сорбентом (размер частичек (100 мкм), вводят анализируемую пробу и пропускают элюент. Скорость прохождения элюента под действием силы тяжести маленькая, а продолжительность анализа большая. Вследствие использования сорбентов с размером зерен 10-30 мкм, поверхностно- и объемно-пористых сорбентов с размером частичек 5-10 мкм, насосов, чувствительных детекторов состоялся переход от классической к ВЭЖХ. Быстрый массоперенос при высокой эффективности разделения разрешает использовать ВЭЖХ для разделения и определения молекул (адсорбционная и распределительная хроматография), для разделения и определения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделении макромолекул (эксклюзионная или гель-хроматография). Методами аффинной и лигандообменной хроматографии разделяют БА молекулы и оптические изомеры.

Адсорбционная хроматография

                                                

                                        Фазовая                        обратно фазовая

                              хроматография                      хроматография

          – полярный адсорбент                     – неполярный адсорбент

          – неполярная подвижная фаза        – полярная подвижная фаза.

         Выбор подвижной фазы всегда важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, то есть растворитель, должна обеспечить разную емкость колонки и эффективное разделение за оптимальное время.

 

 

 

Неподвижная фаза – пористые тонкодисперсные материалы с удельной поверхностью большее 50 м²/г.

 

                            полярные                    неполярные

    SiО₂, Al₂O₃, Me_xO_y, флоросил       графитованая сажа, кизельгур,

                            и т.д.                          диатомит.

           а также с привитими               (Не имеют селективности

           полярными группами                  к полярным молекулам).

         Указанные сорбенты наносятся на поверхностно-пористые носители.

Подвижная фаза. От нее зависит:

–                   селективность разделения;

–                   эффективность колонки;

–                   скорость движения хроматограмной полосы.

Требования к подвижной фазе:

1)                должна растворять анализируемую пробу;

2)                маленькая вязкость (Д_диф. компонентов пробы достаточно высокие);

3)                возможно выделение из нее разделенных компонентов;

4)                инертная по отношению к материалам всех частей хроматографа;

5)                отвечает требованиям выбранного детектора;

6)                безопасная;

7)                дешевая.

         Как было сказано, сила элюенции подвижной фазы – растворителя влияет на разделение.

         Сила элюенции растворителя показывает, в сколько раз энергия сорбции данного элюента больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например, н-гептана. Растворители (элюенты) делят на слабые и сильные.

         Слабые элюенты мало адсорбируются неподвижной фазой, поэтому Д сорбата высокие.

         Сильные элюенты сильно адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициент распределения сорбированных веществ (сорбата) низкие.

Например: SiО₂ – Неподвижная фаза.

Сила растворителей увеличивается в ряду:

пентан (0) < CCl₄ (0,11) < C₆H₆ (0,25) < CHCl₃ (0,26) < CH₂Cl₂ (0,32) < ацетон (0,47) < диоксан (0,49) < ацетонитрил (0,5) < этанол < метанол.

         В качестве меры относительной полярности принимают шкалу Гильдебранда.

         Размещение растворителей в соответствии с возрастанием их силы элюенции называют элюотропным рядом. В жидкостной адсорбционной хроматографии элюотропный ряд Снайдера имеет вид: пентан (0) < н-гексан (0,01) < циклогексан (0,04) < CCl₄ (0,18) < бензол (0,32) < CHCl₃ (0,38) < ацетон (0,51), этанол (0,88) < вода, СН₃СООН  (очень большая).

         Для обратно-фазовой хроматографии на С₁₈ элюотропный ряд имеет вид: метанол (1,0) <  ацетонитрил (3,1), этанол (3,1) < изопропанол (8,3) < н-пропанол (10,1) < диоксан (11,7).

         Часто применяют не отдельные растворители, а их смеси. Незначительные количества добавленных других растворителей, в особенности воды, существенным образом увеличивают элюирующую силу элюента.

         При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за достаточно оптимальное время. Тогда используют метод ступенчатого или градиентного элюирования. Для увеличения силы элюента в процессе хроматографирования последовательно применяют все более сильные элюенты. Это разрешает элюировать все более сильно удерживаемые вещества за меньшее время.

         Существуют эмпирические правила, которые помогают при выборе элюента. Сорбция, как правило, возрастает с ростом числа двойных связей и ОН-групп в соединениях. Сорбция уменьшается в ряду органических соединений: кислоты > спирты > альдегиды > кетоны > сложные эфиры > ненасыщенные углеводороды > насыщенные углеводороды.

         Для разделения веществ разной полярности и для разделения соединений разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: из неполярных подвижных фаз соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время (время удержания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным). Для очень полярных молекул t очень большое и анализ при использовании неполярного элюента невозможен. Для уменьшения времени удержания полярных сорбатов переходят к полярным элюентам. В обратно-фазовом варианте неподвижная обратная фаза более сильно адсорбирует неполярные компоненты из полярных элюентов, например из воды. Снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя (метанол), можно уменьшить содержания компонентов.

 

Распределительная хроматография.

         Метод распределительной, или жидкостно-жидкостной, хроматографии базируется на распределении вещества между двумя фазами, которые не смешиваются, подобно к многократной ступенчатой экстракции.

         Жидкую неподвижную фазу наносят на пористый достаточно инертный сорбент, как в газожидкостной хроматографии, и заполняют ним колонку. При пропускании жидкой подвижной фазы через колонку смесь разделяется на компоненты главным образом за счет их разной растворимости в жидкой неподвижной фазе соответственно одних и тех же механизмов, которые были в газожидкостной хроматографии. Обычно растворимость компонентов пробы в неподвижной и подвижной фазах, которые владеют разной полярностью, очень отличается. Если растворимость пробы выше в неподвижной фазе, то время удержания компонентов значительно возрастает, если растворимость выше в подвижной фазе, то время удержания может быть близкой к t_m – времени удержания несорбированного компонента. Чтобы достичь разделения, в подвижную фазу, насыщенную неподвижной, включают третий компонент, который снижает различия в полярности неподвижной и подвижной фаз. Например, к смеси неполярного (гексан) и полярного (вода) растворителей прибавляют спирт. Только в этом случае удается подобрать оптимальные условия для разделения компонентов смеси.

         Обычно полярный растворитель (вода, спирт) фиксирован на твердом носителе – силикагели, диатомите, целлюлозе, Al₂O₃.

 

Силикагель

 

Al₂O₃

 

         Подвижной фазой в этом случае есть неполярные растворители – изооктан, бензол и т.д. Такие системы используют в нормально-фазовой распределительной хроматографии.

 

         Если неполярный растворитель зафиксировать на носителе, а в качестве подвижной фазы использовать полярные растворители (вода, спирт, буферные растворы, сильные кислоты), то такой вариант называют обратно-фазовой распределительной хроматографией.

 

 

         Нанесенные жидкие фазы имеют большой недостаток – они быстро смываются подвижной жидкой фазой из поверхности носителя, в особенности при использовании ВЭЖХ. Поэтому жидкие фазы “пришивают” к носителю. В качестве носителей неподвижных жидких фаз для нормально-фазовой распределительной хроматографии используют силикагели с пришитыми нитрильными, аминными и др. группами. В обратно-фазовом варианте распределительной хроматографии используют силикагели с привитыми алкилсильными группами от С₂ к С₂₂.

 

Главные узлы жидкостного хроматографа

–                   система подачи подвижной фазы (насос, дегазатор, система для создания градиента концентрации подвижной фазы, измерители давления).

V_рух.ф. = 0,1-10 мл/мин  р = до 400 атм.

–                   система введения пробы (петля);

–                   колонка в термостате; (10, 15, 25 см с диаметром 4-5,5 гг) (5-6 см и диаметром 1-2 гг).

–                   детектор;

–                   регистрирующее устройство.

         Для непрерывного контроля состава элюата, который вытекает из колонки, используют детекторы:

–                   дифференциальные рефрактометры; (чуствительность ~ 10-6 г, 10^х – 10^х+4);

–                   УФ-детектор (10^-9 г; (10^х – 10^х+5) (254 нм);

–                   фотометры и ДФ;

–                   флуоресцентные (более чувствительные в 100 раз);

–                   кондуктометрический (0,01 мкг/мл – 100 мг/мм).

 

Применение ВЭЖХ:

Адсорбционная:

–                   углеводные;

–                   полициклические углеводороды;

–                   пластификаторы;

Распределительная:

–                   пластификаторы;

–                   углеводные;

–                   пестициды;

–                   ароматические углеводороды и кислоты;

–                   стероиды;

Ионообменная:

–                   аминокислоты;

–                   наркотические и болеуталяющие средства;

–                   фторованые углеводороды;

–                   компоненты масел (вазелинового).

 

Ионообменная хроматография

         Основателем ионообменной хроматографии считается У. Самуэльсон, который, начиная с 1939 г., опубликовал серию работ по разделению катионов, анионов методами ионообменной хроматографии. Термодина­мическая теория метода развита Б.П. Никольским. Г. Щтаудингер пока­зал возможность сополимеризации стирола и дивинилбензола, что от­крыло пути получения ионообменников на основе полимерных цепей, сшитых поперечными связями, с введением в них ионогенных групп.

         Сущность метода. Метод ионообменной хроматографии основан на использовании явления ионного обмена между неподвижной твердой фазой – ионообменником (сорбентом) и подвижной жидкой фазой – раствором, содер­жащим ионы, обмениваемые с ионами сорбента.

         Ионный обмен – это гетерогенный процесс, при котором сорбент и находящийся с ним в контакте раствор обратимо и стехиометрически обменивается одноименно (одного и того же знака) заряженными ионами.

В качестве сорбентов используют ионообменники – иониты, пред­ставляющие собой обычно нерастворимые в воде твердые фазы. Иониты состоят из матрицы, в которой распределены ионогенные группы, включающие фиксированные, прочно связанные в матрице, ионы, и менее прочно связанные противоионы (т.е. ионы противоположного знака), способные к отщеплению от ионита и к переходу в раствор. Эти проти­воионы могут обмениваться с одноименными (катионы – с катионами, анионы – с анионами) ионами раствора.

Иониты, обменивающиеся катионами раствора, называются катионитами (катионообменниками)

 

 а иониты, обменивающиеся анионами раствора, – анионитами (анионообменниками).  

         Известны также амфотерные иониты (амфолиты способные об­мениваться с раствором как катионами, так и анионами.

Разделение ионов осуществляется за счет различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с ионитом.

         В рассматриваемом случае катионит в Н-форме (в Н⁺-форме, в ки­слой форме) состоит из матрицы R (основы органического полимера – полимерной смолы) и ионогенной группы –SO₃^–H⁺. Отрицательно заря­женные группы –SO₃^– прочно связаны ковалентной связью с матрицей и в условиях ионного обмена отщепляться не могут. Напротив, противоио­ны – положительно заряженные катионы водорода Н⁺ – могут отщепляться от исходной ионогенной группы. Их замещают катионы металла Mеⁿ⁺, которые переходят из раствора в фазу сорбента и удерживаются в ионогенной группе –SO₃^–Meⁿ⁺. В целом осуществляется катионный обмен, при котором катионы металла Ме⁺, ранее входящие в состав подвижной фазы – раствора, остаются на катионите, а катионы водорода Н⁺ перехо­дят в раствор и уносятся подвижной фазой.

         Анионный обмен происходит аналогично. В рассматриваемом случае анионит в основной форме, т.е. содержащей гидроксильные группы ОН^–, состоит также из матрицы R и ионогенной группы –N(CH₃)₃⁺OH^–.

         Эта группа включает положительно заряженный катион –N(CH₃)₃⁺, прочно связанный в матрице ковалентной связью и не способный к отщепленню в условиях ионного обмена, и отрицательно заряженный противоион ОН^–, который, напротив, способен к отщеплению от ионогенной группы и к обмену с анионами А^– раствора. В результате такого обмена анионы А^– переходят в ионогенную группу анионита и удерживаются в ней, а группы ОН^–, перешедшие в раствор в подвижную фазу, уносятся вместе с нею. В целом происходит анионный обмен.

         Кроме ионитов, обладающих кислотно-основными свойствами, из­вестны также сорбенты, проявляющие окислительно-восстановительные и комплексообразующие свойства.

         Для катионитов в основном характерна следующая последователь­ность сорбируемости катионов:

Li⁺<H⁺<Na⁺<K⁺, NH₄⁺; <Rb⁺<Сs⁺<Аg⁺<Тl⁺<Нg²⁺<Сd²⁺< Mn²+ < Mg²⁺ < Zn²⁺ < Сu²⁺ < Ni²⁺ < Co²⁺ < Ca²⁺ < Sr²⁺ < Рb²⁺< Ba²⁺ < A1³⁺< Sc³⁺<Y³⁺<Eu³⁺ <Sm³⁺<Nd³⁺<Ce³⁺ <La³⁺<< Pu⁴⁺.

         Наименьшим сродством к катиониту обладают катионы лития и во­дорода, наибольшим – катионы плутония.

         Для сильноосновных анионитoв последовательность сорбируемости анионов можно представить рядом:

ОН^– < F^– < пропионат< ацетат <формиат< JO₃^– < НСO₃^– <Сl^–<NO₂^– < ВrO₃^–, HSO₃^– <CN^– <Br^– < NO₃^– < СlO₃^–<HSO₄^–<фенолят<J^–<SCN^–< СlO₄^–.

         Наибольшим сродством к анионитам обладают йодид-, тиоцианат-, перхлорат-ионы, наименьшим – гидроксильные фуппы и фторид-ионы.

         Ионообменная хроматография используется для разделения электролитов, их очистки от примесей, извлечения и концентрирования, количе­ственного определения, получения кислот, оснований, солей, для выде­ления редкоземельных металлов, для очистки сахара, при анализе многих лекарственных препаратов—таких, как атропина сульфат, мезатон, па­паверина гидрохлорид, сальсолина гидрохлорид, скополамина гидробро­мид, тифен, фенадон, хинина гидрохлорид, эфедрина гидрохлорид и др.

         Определение лекарственных препаратов. Для определения в препаратах содержащихся в них лекарственных веществ, представляющих собой соли органических оснований — гидрохлориды, гидробромиды (папаверина, сальсолина, хинина гидрохлориды), методами ионообменной хроматографии используют катионообменники, например, катионит СДВ-3.

 

 

 

Тонкослойная хроматография

         Одним из наиболее распространенных методов адсорбционной хроматографии является тонкослойная хроматография – сокращенно ТСХ – разновидность плоскостной хроматографии, при которой адсорбент ис­пользуют в виде тонкого слоя на пластинке.

Принцип и основные понятия метода ТСХ. На чистую плоскую поверхность (пластинку из стекла, металла, пластмассы) тем или иным способом наносят тонкий слой сорбента, который чаще всего закрепляет­ся на поверхности пластинки. Размеры пластинки могут быть различны­ми (длина и ширина — от 5 до 50 см, хотя это и не обязательно). На по­верхности пластинки осторожно, чтобы не повредить слой сорбента, на­мечают (например, карандашом) линию старта (на расстоянии 2–3 см. от нижнего края пластинки) и линию финиша растворителя.

Схема разделения компонентов А и В методом ТСХ

        

На линию старта пластинки наносят (микрошприцом, капилляром)

Микрошприц

Капилляр

 

 

пробу – небольшое количество жидкости, содержащей смесь разделяе­мых веществ, например, двух веществ А и В в подходящем растворителе. Дают возможность испариться растворителю, после чего пла­стинку погружают в хроматографической камере в жидкую фазу ПФ, представляющую собой специально подобранный для данного случая растворитель или смесь растворителей.

 

 

 

 

         Под действием капиллярных сил ПФ самопроизвольно перемещается вдоль НФ от стартовой линии до линии фронта растворителя, увлекая с собой компоненты А и В пробы, которые перемещаются с различной скоростью. В рассматриваемом слу­чае сродство компонента А к НФ меньше сродства к той же фазе компо­нента В, поэтому компонент А перемещается быстрее компонента В. По­сле достижения за время t подвижной фазой (растворителем) линии фронта растворителя хроматографирование прерывают, пластинку извле­кают из хроматографической камеры, высушивают на воздухе и опреде­ляют положение пятен веществ А и В на поверхности пластинки. Пятна (зоны) обычно имеют овальную или круглую форму. В рассматриваемом случае пятно компонента А переместилось от линии старта на расстояние l_A, пятно компонента В – на расстояние l_В, а растворитель прошел рас­стояние L.

         Иногда одновременно с нанесением пробы разделяемых веществ на линию старта наносят небольшие количества вещества-стандарта, а так­же веществ-свидетелей (тех, которые предположительно содержатся в анализируемой пробе).

Для характеристики разделяемых компонентов в системе вводят ко­эффициент подвижности R_f (или R_f -фактор):

R_f =l_i/L      

где l_i, и L — путь, пройденный i-м компонен­том и растворителем соответственно; Расстояния l_i отсчитывают от линии старта до центра пятна, соответст­вующего компонента.

         Обычно коэффициент подвижности лежит в пределах Rf= 0–1. Оп­тимальное значение составляет 0,3–0,7. Условия хроматографирования подбирают так, чтобы величина R_f отличалась от нуля и единицы.

         Коэффициент подвижности является важной характеристикой сис­темы сорбент-сорбат. Для воспроизводимых и строго постоянных усло­вий хроматографирования R_f = const.

         Коэффициент подвижности Rf зависит от целого ряда факторов: природы и качества растворителя, его чистоты; природы и качества сор­бента (тонкого слоя), равномерности его зернения, толщины слоя; актив­ности сорбента (содержания в нем влаги); техники эксперимента (массы образца, длины L пробега растворителя); навыка экспериментатора и т. д. Постоянство воспроизведения всех этих параметров на практике иногда бывает затруднительным. Для нивелирования влияния условий проведе­ния процесса вводят относительный коэффициент подвижности R_S,

R_S = l / l_S = R_f / R_f(cт)

где Rf – l/L; R_f(ст) = l_ст/l_ст – расстояние от линии старта до центра пятна стандарта.

         Относительный коэффициент подвижности r_s является более объек­тивной характеристикой подвижности вещества, чем коэффициент под­вижности Rf.

 

Бумажная хроматография (хроматография на бумаге)

 

         Распределительная хроматография осно­вана на использовании различий в растворимости распределяемого веще­ства в двух контактирующих несмешивающихся жидких фазах. Обе фазы – ПФ и НФ – представляют собой жидкие фазы. При перемещении жид­кой ПФ вдоль жидкой же НФ хроматографируемые вещества непрерывно перераспределяются между обеими жидкими фазами.

         К распределительной хроматографии относится бумажная хромато­графия (или хроматография на бумаге) в ее обычных вариантах. В этом методе вместо пластинок с тонким слоем сорбента, употребляемых при ТСХ, применяют специальную хроматографическую бумагу, по которой, пропитывая ее, перемещается жидкая ПФ во время хроматографирования от линии старта до линии финиша растворителя.

         Различают нормальнофазовую и обращеннофазовую бумажную хро­матографию.

 

         В варианте нормальнофазовой бумажной хроматографии жидкой НФ является вода, сорбированная в виде тонкого слоя на волокнах и находя­щаяся в порах гидрофильной бумаги (до 25% по массе). Эта связанная вода по своей структуре и физическому состоянию сильно отличается от обычной жидкой воды. В ней и растворяются компоненты разделяемых смесей.

        

         Роль ПФ, перемешающейся по бумаге, играет другая жидкая фаза, например, органическая жидкость с добавлением кислот и воды. Жидкую органическую ПФ перед хроматографированием насыщают водой для того, чтобы ПФ не растворяла в себе воду, сорбированную на волокнах гидрофильной хроматографической бумаги.

 

         Хроматографическая бумага выпускается промышленностью. Она должна отвечать ряду требований: готовиться из высококачественных волокнистых сортов хлопка, быть однородной по плотности и толщине, по направлению ориентирования волокон, химически чистой и инертной по отношению к НФ и разделяемым компонентам.

 

         В нормальнофазовом варианте в качестве ПФ чаще всего применяют жидкие смеси, составленные из различных растворителей. Классическим примером такой ПФ является смесь уксусной кислоты, н-бутанола и воды в объемном отношении 1:4:5. Используют и такие растворители, как этилацетат, хлороформ, бензол и т. д.

В варианте обращеннофазовой бумажной хроматографии жидкая НФ представляет собой органический растворитель, тогда как в роли жидкой ПФ выступает вода, водные или спиртовые растворы, смеси ки­слот со спиртами. Процесс проводят с использованием гидрофобной хро­матографической бумаги. Бе получают обработкой (пропиткой) бумаги нафталином, силиконовыми маслами, парафином и т. д. Неполярные и малополярные органические растворители сорбируются на волокнах гид­рофобной бумаги и проникают в ее поры, образуя тонкий слой жидкой НФ. Вода не удерживается на такой бумаге не смачивает ее.

Техника бумажной хроматографии в общих чертах такая же, как и в методе ТСХ. Обычно на полоску хроматографической бумаги на линию старта наносят кашпо анализируемого раствора, содержащего смесь раз­деляемых веществ. После испарения растворителя бумагу ниже линии старта погружают в ПФ, располагая бумагу вертикально (подвешивая ее). Закрывают камеру крышкой и проводят хроматографирование до тех пор, пока ПФ не достигнет обозначенной на бумаге линии фронта рас­творителя. После этого процесс прерывают, бумагу сушат на воздухе и проводят детектирование пятен и идентификацию компонентов смеси.

Бумажная хроматография подобно методу ТСХ применяется как в качественном, так и в количественном анализе.

 

Гель-хроматография

         Метод ситовой (эксклюзионной) хроматографии представляет собой один из вариантов жидкостной распределительной хроматографии. Он основан на использовании в качестве НФ пористых веществ – так назы­ваемых молекулярных cuт, размеры пор которых могут быть больше или меньше размеров частиц разделяемых компонентов. Частицы с размера­ми, меньшими размеров пор сорбента, проникают вместе с растворите­лем ПФ в эти поры и могут удерживаться в них, тогда как более крупные частицы не могут проникнуть в поры из-за своих размеров и уносятся с ПФ. Происходит разделение мелких и крупных частиц. Крупные частицы элюируются, таким образом, первыми. Более мелкие частицы, попавшие в поры НФ, элюируются после крупных частиц.

 

Методом ситовой хроматографии можно разделять высокомолеку­лярные и низкомолекулярные вещества, проводить обессоливание рас­творов, удалять примеси из газов, жидкостей и т. д.

         В качестве НФ применяют пористые стекла, уголь, продукты пиро­лиза пластмасс, силикаты натрия или кальция, различные гели. Ситовая хроматография, в которой в качестве НФ применяют гели, называется гель-хроматография (гель-проникающая хроматография).

         Гели представляют собой вещества, способные к набуханию и имеющие поры разного размера. В зависимости от поставленных задач применяют гидрофильные и гидрофобные гели. К гидрофильным гелям относятся декстрановые (сефадексы, малселекты), полиакриламидные (биогели), оксиалкилметакрилатные (сфероны) и некоторые другие гели. К гидрофобным гелям относятся некоторые сефадексы, полистиролъные (стирогель, порагель), поливинилацетатные гели, пористый силикагель, пористоестекло (порасил).

         Процессы разделения компонентов смеси в гель-хроматографии проводят либо в хроматографических колонках, заполненных сорбентом – гелем, либо на стеклянных пластинках, покрытых тонким закреплен­ным слоем геля (метод восходящей хроматографии), с использованием окрашенного стандарта, предварительно наносимого на линию старта и перемещающегося вместе с ПФ.

         Эксклюзионная (size-exclusion – исключение по размерам), или ситовая (молекулярно-ситовая), или гель-хроматография – особый вид жидкостной хроматографии, основанный на различии между размерами частиц разделяемых компонентов и пор неподвижной фазы. Аналиты распределяются между растворителем внутри пор сорбента и растворителем, протекающим между его частицами. Сорбенты играют роль молекулярных сит. Они проницаемы только для частиц определенного размера.

         Таким образом, неподвижной фазой является тот же растворитель, заполнивший поры, а роль твердого наполнителя состоит лишь в формировании пор определенного размера, т.е. понятие «сорбент» в эксклюзионной хроматографии весьма условно.

         Употребляемые термины – гель-фильтрационная и гель-проникающая хроматография – отражают характер используемых элюентов. В первом случае – это водные растворители, во втором – органические (тетрагидрофуран, дихлорметан, толуол). В гель-фильтрационной хроматографии проводят разделение водорастворимых веществ на гидрофильных сорбентах. Выбор подвижной фазы определяется ее способностью растворять образец.

         Фактор, контролирующий удерживание – размер пор геля. Поскольку элюент не взаимодействует с образцом, он не влияет на удерживание. Удерживание может быть повышено при использовании геля с более высоким пределом эксклюзии (больший размер пор) и понижено при использовании – более низкого предела экскдюзии (меньший размер пор).

 Принципиальные особенности метода:

– Продолжительность анализа в конкретно используемой системе известна заранее.

– Порядок элюирования предсказуем: первыми из колонки элюируются молекулы с большей молекулярной массой, последними – с меньшей.

– Ширина пиков независимо от времени элюирования одинакова.

– И, наконец, компоненты элюируются без потерь, поскольку в этом виде хроматографии отсутствуют какие-либо взаимодействия сорбента с аналитом.

Классификация гелей:

Используемые в гель-хроматографии сорбенты (гели) могут быть классифицированы по различным признакам:

В зависимости от природы материала геля: неорганические (пористые силикагели, стекла) и органические (поливинилацетаты, полистирол, алкилированные сшитые декстраны

а) По совместимости с водными или неводными элюентами: гидрофильные (декстраны, сшитые эпихлоргидрином – сефадексы; сополимеры акриламида и бисакриламида – биогель Р; агарозные гели – сефарозы) и органофильные (сополимеры стирола и дивинилбензола – порагель, меркогель). Гидрофильные гели используют для разделения полисахаридов, белков и совместимы с водными элюентами.

б) По жесткости матрицы: мягкие, полужесткие и жесткие. Последние имеют фиксированный размер пор и высокую механическую прочность и используются в ВЭЖХ.

в) По способности к набуханию: ксерогели (набухающие) и аэрогели (ненабухающие).

г) По способу приготовления их можно подразделить на гомогенные, полугетерогенные и гетерогенные. Гомогенные готовят сшиванием линейных полимеров. Плотность матрицы этих гелей зависит от молекулярной массы исходного линейного полимера. Гомогенные гели прозрачны, набухают в растворителях. Степень набухания обратно пропорциональна плотности матрицы. Плотность матрицы определяет рабочий диапазон геля. С уменьшением плотности увеличивается эксклюзионный предел геля, уменьшается механическая прочность частиц.

         Гетерогенные гели готовят сополимеризацией, ранние стадии которой сопровождаются осаждением полимера; полугетерогенные образуются в процессе суспензионной сополимеризацией в присутствии растворителя.        Для ВЭЖХ в качестве сорбентов используют пористые стекла, частицы силикагеля или полимеры. Размер частиц сорбента 5 – 10 мкм. Использование пористых стекол и силикагеля характеризуется быстрым установлением равновесия. Однако они проявляют адсорбционную активность, и поверхность таких сорбентов предварительно обычно дезактивируют силанизацией.

 

         Особое место в жидкостной хроматографии занимает аффинная (affinity – сродство), или биоспецифическая хроматография – наиболее распространенный метод выделения и очистки биологически активных веществ, предназначенных для целей молекулярной биологии и медицины. Их исследование имеет принципиальное значение для контроля оптической чистоты производимых лекарственных средств.

         Научные основы метода заложены в 1951 г. в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности аффинной хроматографии (АХ) были получены еще в 1910 г. Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы. Метод основан на уникальной способности биологически активных соединений к молекулярному распознаванию и образованию специфических и обратимо диссоциирующих комплексов с комплементарными адсорбционными центрами, иммобилизованными на поверхности стационарной фазы. Фермент узнает свой субстрат, антиген – антитело, гормон – рецептор.

         Процесс разделения веществ с использованием АХ включает несколько самостоятельных этапов:

– выбор матрицы для АХ и ее активация;

– иммобилизация на поверхности активированной матрицы биологически активных соединений, называемых аффинными лигандами, или аффиантами, в качестве которых могут быть белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, витамины, аминокислоты и т.д.;

– хроматографический анализ, в процессе которого и происходит специфическое и обратимое комплексообразование аффианта со строго определенным биологически активным соединением;

– и, наконец, разрушение образовавшегося комплекса и элюирование специфически адсорбированного вещества.

Матрицы для сорбента в аффинной хроматографии

         Идеальная матрица, применяемая для иммобилизации биологически активных веществ, должна обладать высокой механической прочностью и проницаемостью; большой удельной поверхностью и нерастворимостью в подвижных фазах; высокой гидрофильностью и биосовместимостью; химической реакционной способностью, позволяющей легко вводить в качестве лигандов различные биомолекулы; обеспечивать легкость получения производных при комнатной температуре в водной среде.

Типичные матрицы для АХ

Агароза (структурная единица – D-галактоза), характеризуется высокой жесткостью, обеспечивающей стабильность скорости потока подвижной фазы, обладает достаточной пористостью, что необходимо при удерживании белковых молекул с молекулярными массами до нескольких миллионов.

Супероза (для ВЭЖХ) – агарозный гель; характеризуется высокой степенью сшивки и низкой неспецифической адсорбцией. Используется в сочетании с водными средами в диапазоне рН 3 – 14. Совместима также с такими подвижными фазами, как этиленгликоль, этанол. Тетрагидрофуран, ацетон, хлористый метилен.

Целлюлоза – высокопористая матрица со сферическими гранулами. Превосходит по реакционной способности другие полимеры

Декстраны – полисахариды, состоящие из a-1,6-глюкозы, сшитые эжпихлоргидрином . Коммерческий продукт – Сефадекс

Полиакриламид (биогель Р) – биологически инертен и не подвержен микробной актаке. Рабочий диапазон рН 1 – 10.

Трисакрил – высоко гидрофильный материал; три гидроксиметильные группы в его молекуле и одна алкиламидная обеспечивают высокую гидрофильность. Используется при разделении биологичнеских макромолекул – белков, клеток. Он стабилен при низких и высоких температурах, а также при низких значениях рН; меньшая стабильность при высоких рН объясняется медленным гидролизом амидных связей.

Полиакриламид-агарозные гели (Ультрагели) обладают жесткой структурой, мало подвержены действию давления, поэтому могут обеспечивать высокие скорости потока подвижной фазы.

 

         Высокоэффективная жидкостная хроматография, обеспечивающая быстрое и легкое получение данных по составу смесей, является ценным разделительным и аналитическим методом. В этом отношении она аналогична газовой хроматографии. Однако в газовой хроматографии необходимо, чтобы компоненты анализируемой смеси были переведены в парообразное состояние. Этого трудно добиться во многих случаях, а в ряде случаев невозможно. Жидкостную хроматографию можно использовать для разделения веществ, которые растворимы в каком-либо растворителе, таких как нуклеотиды, нуклеозиды, антибиотики, витамины, пищевые добавки, косметические средства, лекарственные препараты, гигиенические средства, продукты органического синтеза, пестициды, биологические жидкости и т.д.

 

Антибиотики

 

 

Витамины

Косметические средства

 

 

Пестициды

        

         Высокоэффективная жидкостная хроматография является незаменимым методом при проведении исследований в различных областях органической, физической и аналитической химии, биохимии и фармакологии.

 

         Жидкостной хроматограф оснащен спектрофотометрическим детктором ультрафиолетового и видимого диапазонов. Возможен изократический и градиентный четырехкомпонентный режим элюирования.

 

 

 

         Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — один из эффективных методов анализа и разделения сложных смесей. Принцип хроматографического разделения также лежит в основе ряда технологических процессов. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии. Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3-5 мкм, сейчас до 1.8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 минут). Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других. По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную,эксклюзионную, лигандообменную и другие. Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное – распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степениионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ. На практике, наибольшее распространение получила «обращённофазовая» (распределительная) хроматография, в которой неподвижная фаза не полярна, а подвижная полярна.

         Жидкостная хроматография– вид хроматографии, в которой подвижной фазой (элюентом) служит жидкость. Неподвижной фазой может быть твердый сорбент, твердый носитель с нанесенной на его поверхность жидкостью или гель. Различают колоночную жидкостную хроматографию, в которой через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси в-в в потоке элюента (под давлением или под действием силы тяжести), и тонкослойную жидкостную хроматографию, в к-рой элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу.

         Жидкостная хроматография — это хроматография, в которой подвижной фазой является жидкость.

         Жидкостная хроматография разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счёт их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счёт различной растворимости в подвижной фазе — элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твёрдого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счёт обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента — ионита. Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая.

         Жидкостная хроматография как метод была открыта в 1903 году русским учёным Михаилом Цветом, который использовал для разделения растительных пигментов на их составляющие колонки, заполненные порошком мела. Предложенный Цветом метод жидкостной хроматографии был незаслуженно забыт и почти не применялся более 30 лет.

         Жидкостная хроматография применяется как аналитическая и препаративная. В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм); давление для прокачивания элюента до 3.10⁷ Па (ее называют также хроматографией высокого давления). Варианты ВЭЖХ – микроколоночная хроматография на наполненных колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. К жидкостной хроматографии обычно относят также гидродинамическую хроматографию, где неподвижная фаза отсутствует.

         По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой Жидкостная хроматография делится на осадочную хроматографию, адсорбционную, распределительную, ионообменную хроматографию (в т. ч. ионную хроматографию), ион-парную, лигандообменную, эксклюзионную (ситовую) и аффинную хроматографию (биоспецифическую).Осадочная жидкостная хроматография основана на различной растворимости осадков, образующихся при взаимодействии компонентов анализируемой смеси с реагентом-осадителем. Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от относительной полярности сорбента и элюента подразделяется на нормально-фазную и обращенно-фазную. В первом случае адсорбция веществ происходит на полярном сорбенте из неполярного элюента благодаря донорно-акцепторному взаимодействию или образованию водородных связей. Во втором – на поверхности гидрофобизир. сорбента из полярного элюента. В распределительной жидкостной хроматографииразделение основано на распределении веществ между двумя жидкими фазами: неподвижной, нанесенной на поверхность носителя, и подвижной элюентом. В зависимости от полярности жидких фаз возможны нормально-фазный и обращeнно-фазный варианты. К распределительной жидкостной хроматографии относится и экстракционная, в которой неподвижной фазой служит органический экстрагент, нанесенный на твердый носитель, а подвижной – водный раствор разделяемых соединений. В ионообменной жидкостной хроматографи разделение основано на различной способности разделяемых ионов к р-ции ионного обмена с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. В зависимости от знака заряда фиксир. ионов различают катиониты (закреплен анион) и аниониты (закреплен катион). Разделение ионов регулируют подбором оптим. значений рН элюента и его ионной силы. Вариант ионообменной жидкостной хроматографии – ионная хроматография, в которой разделенные анионы (катионы) детектируют в виде к-т (соотв. оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, а высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью. Ион-парную жидкостную хроматографию можно рассматривать как комбинацию адсорбционной и ионообменной; в качестве неподвижной фазы используют гидрофобизир. адсорбент, а подвижной – водно-органический элюент с добавлением поверхностно-активных ионогенных соединений (ион-парных реагентов), напр. додецилсульфата Na или триметилцетиламмоний бромида. Разделение основано на удерживании ион-парного реагента на гидрофобной поверхности адсорбента с образованием ионита, который и проводит разделение ионогенных соединений. Возможно также образование ионных пар разделяемых ионов с ион-парным реагентом, которые затем удерживаются на гидрофобизир. поверхности адсорбента. Лигандообменная жидкостная хроматография основана на различной способности разделяемых соединений образовывать комплексы с катионами переходных металлов – Cu(II), Ni(II), Zn(II), Cd(II), Co(II) и др. – и фиксированными группами (лигандами) неподвижной фазы. Часть координац. сферы ионов металла занята молекулами воды или др. слабыми лигандами, которые могут вытесняться молекулами разделяемых соединений. Наиболее эффективна для разделения оптических изомеров.

         Аффинная жидкостная хроматография основана на образовании прочной связи со специфическими группами неподвижной фазы (лигандами, аффинантами). Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты, токсинов – рецепторы, белков – антитела и т. д. Особенно эффективна в биотехнологии и биомедицине для выделения ферментов, белков, гормонов.

         В эксклюзионной жидкостной хроматографи разделение основано на различиях в размерах молекул; молекулы малых размеров проникают в сравнительно тонкие поры сорбента и задерживаются в них, крупные молекулы либо не проникают в поры, либо проникают лишь в широкие поры и проходят колонку с незначительным удерживанием. Поверхность сорбента и состав элюента подбирают так, чтобы исключить или уменьшить энергию адсорбц. взаимодействия (однако иногда при разделении олигомеров удобнее использовать адсорбц. механизм). Применяют для разделения олигомеров и полимеров (в т. ч. биологических).

 

         Современный жидкостной хроматограф включает емкости для элюентов, насосы высокого давления, дозатор, хроматографическую колонку, детектор, регистрирующий прибор, систему управления и мат. обработки результатов. Элюенты подаются в насос через фильтр, задерживающий пылевые частицы (больше 0,2 мкм); иногда через элюенты пропускают небольшой ток гелия для удаления растворенного воздуха и предотвращения образования пузырьков в детекторе (особенно в случае водных и полярных элюентов). В микроколоночной хроматографии объемные скорости потока элюента ниже: 10-1000 мкл/мин. В случае градиентного элюирования используют неск. насосов, которые управляются программатором и подают в камеру смешения 2-3 компонента элюента, оставляя постоянной общую скорость потока. Регистрацию хроматограмм и обработку данных проводят с помощью самописца или мини-ЭВМ, которая также рассчитывает количественные характеристики и, в некоторых случаях, качественный состав смесей. Микропроцессор обеспечивает автоматический ввод пробы, изменение по заданной программе состава элюента при градиентном элюировании, поддержание температуры колонки.

 

         С помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности. Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых к-т, углеводов, липидов, гормонов и т. д.; изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов; диагностики в медицине; анализа продуктов химии и нефтехимии синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод; изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химичеких процессов.

 

 

 

 

 

         В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимероволигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции. Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающей среды, в криминалистике. Хроматография как метод разделения веществ предложена.

 

 

 

Определение содержания специфических примесей в субстанции и лекарственных средствах, которые содержат метамизола натриевую соль (анальгин).

 

        

         0,1 г (точная навеска) анальгина помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл и растворяют в метаноле, доводят объем раствора метанолом до метки, перемешивают и сразу наносят на пластинку (исследуемый раствор).

         На линию старта хроматографической пластинки размером 10х10 с закрепленным слоем силикагеля (связывающий компонент – гипс, флуоресцентный индикатор – 254 нм) обозначают четыре точки. В эти точки наносят: 1 – 10 мкл (0,1 мкг) раствора стандартного образца вещества-свидетеля (СОВС 4- аминоантипирина; 2 – 10 мкл исследуемого раствора (100 мкг анальгина); 3 – 10 мкл (0,5 мкг) раствора СОВС антипирина; 4 – 10 мкл раствора 4-аминоантипирина (0,25 мкг), антипирина (0,5 мкг) и анальгина (100 мкг).

         Пластинку с нанесенными пробами немедленно сушат в потоке воздуха на протяжении 1 мин, после чего сразу же помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей бензол – спирт метиловый (7:3) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет 70 мм от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат в потоке воздуха до исчезновения запаха растворителей и просматривают в УФ при длине волны 254 нм.

         На хроматограмме исследуемого раствора (точка 2) кроме основного пятна допускается наличие не более двух дополнительных пятен, расположенных на уровне пятен из точек 1 (не больше 0.25 % 4-аминоантипирина) и 3 (не больше 0,5 % антипирина) и не превышающих соответствующие пятна по величине и интенсивности поглощения.

         Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста „Проверка пригодности хроматографической системы”.

Примечание. 1. Приготовление раствора СОВС 4-аминоантипирина. 0,025 г (точная навеска) стандартного образца 4-аминоантипирина помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл, растворяют в 5 мл спирта метилового, доводят объем раствора спиртом метиловым до метки, перемешивают (раствор А 4-аминоантипирина).

         0,5 мл раствора А 4-аминоантипирина помещают в мерную колбу вместительностью 50,0 мл и доводят объем раствора спиртом метиловым до метки, перемешивают.

         Строк годности раствора – не больше 30 мин.

2. Приготовление раствора СОВС антипирина. 0,050 г (точная навеска) стандартного образца антипирина помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл, растворяют в 5 мл спирта метилового, доводят объем раствора спиртом метиловым до метки, перемешивают (раствор А антипирина).

         0,5 мл раствора А антипирина помещают в мерную колбу вместительностью 50,0  мл и доводят объем раствора спиртом метиловым до метки, перемешивают.

         Строк годности раствора – не больше 30 мин.

3. Приготовление раствора 4-аминоантипирина, антипирина и анальгина. В мерную колбу вместительностью 50,0 мл помещают 0,50 г анальгина, прибавляют 25 мл спирта метилового, растворяют при перемешивании, прибавляют 0.5 мл раствора А антипирина, 0,5 мл раствора А 4-аминоантипирина, доводят объем раствора спиртом метиловым до метки и перемешивают.

         Строк годности раствора – не больше 30 мин.

4. Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если:

–                     на хроматограммах, полученных из точек 1 и 3 четко видно пятна;

–                     на хроматограмме, полученной из точки 4 видно четко три пятна.

 

Определение содержания специфических примесей в субстанции кофеина.

         0,2 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл, растворяют в смеси растворителей метанол – хлороформ (4:6) и доводят объем раствора той же смесью растворителей до метки, перемешивают (исследуемый раствор).

         0,5 мл исследуемого раствора помещают в мерную колбу вместительностью 100,0 мл и  доводят объем исследуемого раствора смесью растворителей метанол – хлороформ (4:6) до метки и перемешивают (раствор сравнения).

         На линию старта хроматографической пластинки размером 10х20 с закрепленным слоем силикагеля (связывающий компонент – гипс, флуоресцентный индикатор – 254 нм) наносят в точку 1 10 мкл (200 мкг кофеина) испытанного раствора и в точку 2 10 мкл (1 мкг кофеина) раствора сравнения. Пластику помещают в камеру со смесью растворителей раствор аммиака концентрированный – ацетон – хлороформ – бутанол (10:30:30:40). Когда фронт растворителей пройдет 15 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и пересматривают в УФ с длиной волны 254 нм.

         На хроматограмме исследуемого раствора любое пятно, кроме основной, не должно быть интенсивнее за пятно на хроматограмме раствора сравнения (не больше 0,5 %).

Примечание. 1. Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если:

–                     на хроматограмме, полученной из точки 2 четко видно пятно.

 

Определение содержания специфических примесей в субстанции глицина.

 

         0,1 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл растворяют в воде и доводят объем раствора до метки, перемешивают (исследуемый раствор (а)).

         1,0 мл исследуемого раствора (а) помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл и доводят объем раствора до метки водой и перемешивают (исследуемый раствор (b)).

         0,01 г (точная навеска) стандартного образца глицина помещают в мерную колбу вместительностью 10,0 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают (раствор сравнения (а)).

         1,0 мл исследуемого раствора (а) помещают в мерную колбу вместительностью 200,0 мл и доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор сравнения (b)).

         0,01 г (точная навеска) стандартного образца глицина и 0,1 г (точная навеска) стандартного образца аланина помещают в мерную колбу вместительностью 25,0 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают (раствор сравнения (с)).

         На линию старта хроматографической пластинки размером 10х20 с закрепленным слоем силикагеля наносят 5 мкл (50 мкг) исследуемого раствора (а), 5 мкл (5 мкг) исследуемого раствора (b), 5 мкл (5 мкг) раствора сравнения (а), 5 мкл (0,25 мкг) раствора сравнения (b) и 5 мкл (2 мкг глицина и 2 мкг аланина) раствора сравнения (с). Пластинку помещают в камеру со смесью растворителей кислота уксусная ледяная – вода – бутанол (20:20:60). Когда фронт растворителей пройдет 2/3 длины пластинки вынимают из камеры, сушат при температуре 80°С около 30 мин, обрабатывают раствором нингидрина и нагревают при температуре от 100 до 105 °С на протяжении 15 мин.

         На хроматограмме исследуемого раствора (а) любое пятно, кроме основного, не должно быть интенсивнее за пятно на хроматограмме раствора сравнения (b) (не больше 0,5 %).

Примечание. 1. Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если:

–                     на хроматограмме, полученной из раствора сравнения (b), четко видно пятно;

–                     на хроматограмме, полученной из раствора сравнения (с)  видно два четко разделенные пятна;

–                     на хроматограммах, полученных из исследуемого раствора (b) и  раствора сравнения (а) четко видно пятна и коэффициенты подвижности R_f  для них должны быть одинаковы.

2. Приготовление раствора нингидрина. 0,2 г нингидрина помещают в мерную колбу вместительностью 100,0 мл и растворяют в смеси растворителей кислота уксусная разбавлена – бутанол (5:95), доводят объем раствора этой же смесью до метки и перемешивают.

         Раствор применяют свежеприготовленным.

 

 

 

 

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

а) Основные: 1. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия. Ч.2. – М.: Высшая школа, 2001. – С.402-445.

2. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. ч. 2. – М.: Высшая школа, 1982. – С. 261-277.

б) Дополнительные: 1. Основы аналитической химии: Ч.2 / Под ред. акад. Ю.А.Золотова. – М.: “Высшая школа”, 2002.

2.Яшин Я.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. – М.:Химия, 1976. – 215с.

3. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. – М.: Высшая школа, 1968. – 280с.

4. Харрис В., Хэбгуд Г. Газовая хроматография с программированием температуры. – М.: Мир, 1968. – 340с.