Иммунитет. Виды иммунитета. Неспецифические факторы защиты организма. Антигены. Антигенная структура микробной клетки и вирусов.Иммуноглобулины. Характеристика основных класов иммуноглобулинов.

Иммунитет. Виды иммунитета. Неспецифические факторы защиты организма. Антигены. Антигенная структура микробной клетки и вирусов.Иммуноглобулины. Характеристика основных класов иммуноглобулинов.

Серологические реакции при бактериальных инфекциях

 

 

ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

Факторы защиты организма от инфекционных агентов и других инородных веществ разделяют на неспецифические и специфические.

К неспецифическим факторам принадлежат механические, физико-химические, клеточные, гуморальные, а также физиологичные защитные реакции, которые обеспечивают сохранение постоянства внутренней среды и возобновления нарушенных функций макроорганизма.

Неспецифическим фактором защиты является врожденный (видовой, или наследственный) иммунитет — невосприимчивость организма к определенным патогенным агентам, которая передается по наследству и свойственна определенному виду.

 

Приобретенный иммунитет принадлежит к специфическим факторам защиты от генетически инородных субстанций (антигенов); осуществляется иммунной системой организма.

 

Уровни защиты организма

Неспецифическая резистентность организма предопределена такими факторами защиты, как барьерная функция кожи, слизистых оболочек, лимфатических узлов, бактерицидными веществами жидкостей организма (слюна, сыворотка крови и др.), функцией выделения, температурной реакцией и др. Инородные тела и вещества обезвреживаются в основном механическими или физико-химическими механизмами.

Первым защитным барьером на пути проникновения бактерий в организм является кожа. В нормальном, неповрежденном состоянии ее защитная функция реализуется с помощью связанных между собой гормональных и клеточных механизмов. Гормоны кожи активизируют Т-лимфоциты, которые разрушают гетерогенные вещества (бактерии, вирусы, онкогены). Кожа здорового человека пагубно действует на ряд бактерий (гемолитический стрептококк, сальмонеллы брюшного тифа, паратифа и др.). Кислая среда пота связана с наличием в нем уксусной, молочной, жирных кислот, которые имеют бактерицидное действие на многие микроорганизмов. Мытье рук способствует не только механическому удалению микроорганизмов из поверхности кожи, но и увеличению ее бактерицидных свойств.

 

Строение кожи

 

Защитные функции имеют слизистые оболочки глаз, носа, рта, желудка и других органов. Подобно коже, антибактериальные функции слизистых оболочек предопределены непроницаемостью их для разных микроорганизмов и бактерицидным действием секретов. В слезной жидкости, мокроте, слюне, крови, молоке, тканях и органах есть лизоцим, который являет собой ацетилмурамидазу, а также секреторный иммуноглобулин А. Бактерии, которые проникают в слизистые оболочки, уничтожаются действием лизоцима. Носовая слизь бактерицидна для многих возбудителей. Недостаток лизоцима в слезной жидкости приводит к поражению роговицы; заживление ран при зализывании их животными связано с внесением у них лизоцима.

 

 

Есть и другие ингибиторы, которые производятся клетками органов и тканей и должны свойство подавлять микроорганизмы. Определено значение в неспецифической резистентности имеет гиалуроновая кислота, которая предотвращает проникновение возбудителей в ткани и органы. Очень выражены бактерицидные свойства относительно многих возбудителей, особенно микроорганизмов, которые влекут кишечные инфекции и пищевые токсикоинфекции,   имеет   желудочный сок.

Если микроорганизм преодолевает барьер, созданный кожей и слизистыми оболочками, защитную функцию выполняют лимфатические узлы, в которых задерживаются и обезвреживаются патогенные бактерии. В лимфатических узлах развивается воспаление, которое пагубно действует на возбудителей инфекционных   заболеваний.

Воспалительная реакция характеризуется высвобождением из тканей разных веществ (лейкотоксины, лейкопенический фактор, гистамин, серотонин и др.), под воздействием которых активируются лейкоциты; скопление их в зоне воспаления приводит к образованию защитного вала, который не дает распространяться бактериям в ткани, крови и органы. Воспаление предопределяет повышение температуры тела, возникновение ацидоза и гипоксии, которые пагубно действуют на микроорганизмы.

фагоцитоз

Большое значение в неспецифической защите организма играет  явление фагоцитоза,  которое впервые было открыто выдающимся отечественным ученым И.И. Мечниковим. Захватывание и переваривание бактерий осуществляется двумя типами клеток – микро- и макрофагами. К микрофагам относят полиморфноядерные нейтрофилы. Они принадлежат к так называемым «профессиональным фагоцитам». Полиморфноядерные лейкоциты – это непродолжительно существующая популяция клеток, которая первой появляется в очаге воспаления.  В результате их стимуляции через так называемый «дыхательный взрыв» накапливается большое количество метаболитив и гидролитических продуктов, направленных на уничтожение бактерий как в клетках, так и вне их. В определенных условиях возможно повреждение  окружающих тканей производными кислорода.

Гранулоциты выделяют более 10 ферментов (кислые протеиназы, миелопероксидазу, лактоферрин, щелочную фосфатазу, лизоцим и тому подобное) достаточных для деградации большинства липидов, полисахаридов и белков чувствительных бактерий. Нейтрофилы продуцируют основные метаболити арахидоновой кислоты (лейкотриены, простагландины), но менее активные, чем моноциты. 

Макрофаги образуют моноцитарно-фагоцитарну систему фагоцитов.

Эта система размещена везде: в соединительной ткани, вокруг базальных мембран кровеносных сосудов, в легких (альвеолярные макрофаги), в печенке (клетки Купфера) и тому подобное.

Макрофаги способны к миграции и целеустремленного хемотаксису. Вещества, которые определяют направление движения макрофагу, называют хемоантрактантами. К ним принадлежат: фрагменты системы комплемента, глобулины, лимфокиныы, продукты деградации фибрина, коллагена и клеток. Постепенное подключение разных хемоантрактантов обеспечивает постоянный прилив новых макрофагов из сосудистого русла. Большое значение для обезвреживания инородного антигена имеют факторы, которые тормозят миграцию макрофагов и задерживают их в очаге воспаления: интерферон, гиалуроновая кислота, лимфокины, иммунные комплексы, гепарин, глюкокортикоиды, цитостатики.

Усиливают же миграцию макрофагов нуклеинат натрия, левамизол, a-аминокапроновая кислота.

Чтобы состоялся фагоцитоз микроорганизм должен адсорбироваться на поверхности нейтрофила или макрофага. Считают, что распознавание макрофагами клеток-мишеней может быть связано со взаимодействием углеводсвязывающих белков (лектиноподобные молекулы). Известно, что принципиальным признаком лектина является способность связываться с определенным сахаром. На поверхности макрофагов обнаружены пока три типа лектиноподибних рецепторов, которые принимают участие в макрофагонадзоре, – маннозный, галактозный и фукозный. От них зависит и адсорбция бактерий на фагоците, которая может осуществляться тремя способами:

1.   Бактерии на своей поверхности несут лектины, которые связываются с комплементарными углеводами на  поверхности фагоцита.

2.   Лектины являются составной частью мембраны фагоцита и связывают углеводные остатки бактерий.

3.   Формирование мостиков между бактериями и фагоцитами осуществляется за счет связей лектин-углевод. (Эти химические структуры могут быть как на мембране фагоцита, так и на поверхности бактерии).

 

Частица, которая адсорбировалась на мембране фагоцита, начинает фазу поглощения путем активизации актин-миозиновой сократительной системы, которая приводит к образованию псевдоподий вокруг нее. По мере того, как близкоразмещенные рецепторы присоединяются к микробу, плазматическая мембрана надвигается на него, пока он не очутится в вакуоли (фагосоме). После того события разворачиваются быстро, и в течение минуты плазматические гранулы сливаются с фагосомой и впрыскивают в нее свое содержимое.

 

Уничтожение инородных клеток осуществляется за двумя механизмами – кислородзависимым и кислороднезависимым. При кислородзависимом механизме образуются биологически активные вещества, которые пагубно действуют на фагоцитмрованный субстрат: надпероксидный анион, пероксид водороды, гидроксильные радикалы и тому подобное. При кислороднезависимом механизме создаются оптимальные условия для функциювання катионных белков, которые разрушают бактериальную мембрану. Определеное значение здесь имеют лизоцим, лактоферин, низкое значение pH.

 

Таким образом, в фагоцитозе выделяют такие основные стадии :

     Приближение фагоцита и микроба в результате позитивного хемотаксису.

     Адгезия микроорганизма на поверхности фагоцита.

     Активация мембраны фагоцита, которая обусловливает поглощение микроорганизма.

     Внутриклеточное переваривание инородной частицы и удаление продуктов распада за пределы клетки.

 

 

Установлено, что частицы фагоцитируются , если они более гидрофобные, чем фагоциты. Например, микобактерии и листерии –  гидрофобны, потому они хорошо фагоцитируются. В то же время пневмококки и клебсиеллы более гидрофильные и потому слабо фагоцитируются.

Микроорганизмы создали целый ряд приспособлений, которые защищают их от этой линии защиты организма. Например, микобактерии туберкулеза и лепры, бруцеллы, попапвши в цитоплазму макрофага, способные даже размножаться (туберкулезные палочки подавляют слияние фагосом с лизосомами, оболочка возбудителя лепры стойка к действию ферментных систем фагоцита). Некоторые риккетсии способны покидать фагосомы и существовать непосредственно в цитоплазме, легионеллы подавляют механизм «дыхательного взрыва» и т.д.

Явление, когда микроорганизмы не перевариваются в фагоците, получило название незавершенного фагоцитоза.

Стимулируют фагоцитарну активность лейкоцитов антитела, компоненты комплемента, лимфокины, простагландины и др.

                                                                                                      

Video: Фагоцитоз

 

система   комплемента

Одновременно с фагоцитозом срабатывает другая мощная система защиты – система комплемента.

Комплемент- это сложный комплекс белков (около 20), которые формируют каскадную ферментную систему. Компоненты комплемента отражаются буквой С с указанием порядкового номера (С1, С2, С3…С9). В норме в сыворотке крови находятся важнейшие компоненты комплемента в неактивном состоянии. Одновременно там присутствуют и фракции, которые способны подавлять определенные активированные компоненты этой системы.

Сутью каскадной активации системы комплемента является то, что каждый из первых пяты компонентов в результате активации превращается в фермент, который расщепляет следующий компонент и предоставляет ему свойств фермента.

Каким же образом реагирует система комплемента при появлении в организме инородной генетической информации? Она активируется по разному  в зависимости от того, в организме ли уже синтезировались антитела на данный агент, таких антител   ли еще нет. Потому и говорят о классическом пути активации комплемента (при наличии антител) и альтернативном пути (при их отсутствии).

 

Альтернативный  путь активации

В организме постоянно, достаточно медленно в результате реакции с водой или незначительными количествами протеолитических ферментов плазмы С-3 фракция комплемента активируется, что обусловливает образование активного промежуточного продукта ее расщепления – С3b. В присутствии ионов Mg  C3b может образовать комплекс с другим компонентом системы комплемента- фактором В. Позже в этом комплексе фактор В разлагается фактором D (фермент плазмы крови) и возникает комплексная структура  C3bBb. C3bBb имеет  значительную ферментативную активность и является “C3-конвертазой”, которая разлагает компонент С3 на С3а и С3b. Ключевое значение для реагирования системы комплемента имеет образованный C3b. Если он образовался в достаточном количестве, то запускается весь последующий процесс активации, который завершается лизисом чужеридной клетки.

Однако в обычных условиях  С3bBb- конвертаза в растворах нестабильна и фактор В легко замещается другим компонентом – фактором H. В результате этого образуется комплекс доступный для атаки фактором I, который в конце концов инактивирует C3b. Пассивность C3b усиливается при наличии сиаловой кислоты, которая стабилизирует комплекс C3b-H. При наличии поверхности, которая не имеет сиаловой кислоты, C3b соединяется с фактором В и активируется. Поверхности, которые способствуют этой активации есть на стенках бактерий, на некоторых зараженных вирусами клетках, опухолях или клетках, в которых сиаловая кислота была разрушена нейраминидазой.

Некоторые микроорганизмы, попадая в организм, способны активировать C3bBb- конвертазу с образованием большого количества продуктов  розщепленя С3. C3bBb- конвертаза связывается углеводными участками микробной мембраны, которая защищает ее от фактора Н. Потом другое вещество, – белок пропердин присоединяется к связанной C3bBb-конвертазе, стабилизируя ее. Фиксированная на бактериальной мембране С3- конвертаза разлагает компонент С3. Продукт этого разложения C3b ковалентно связывается с мембраной. Один активный центр C3bBb  позволяет связаться с бактерией большому количеству молекул C3b. Эта последовательность реакций, которая обусловлена непосредственно микроорганизмами и не связанная с комплексом антиген – антитело, и приводит к расщеплению С3. Следующим этапом является активация компонента С5, который, взаимодействуя из C3b связанным с мембраной, становится субстратом для C3bBb и разлагается с выделением короткого пептида С5а. В то же время большой фрагмент C5b остается связанным с мембраной и последовательно связывает компоненты С6, С7, С8, образовывая комплекс, который способствует  правильной ориентации двух   или больше молекул последнего компонента С9. Это приводит к развертыванию молекул С9, их проникновению внутрь липидного бислоя мембраны и полимеризации в кольцеобразный мембраноатакующий комплекс (МАК). Этот комплекс формирует в мембране трансмембранный канал, через который за счет  высокого осмотического давления внутри клетки проникают ионы Na и воды, что и является причиной лизиса клетки.

Таким образом разрушаются бактерии, спирохеты, риккетсии, чужеридные клетки.

Параллельно альтернативный путь активации комплемента может запускаться  и антителами, которые покрывают сиаловую кислоту на клеточных мембранах или протеолитическими ферментами макрофагов.

 

Классический путь активации комплемента

Когда в организме синтезировались на возбудитель антитела в систему защиты включается классический путь активации комплемента. Можно думать, что антитело возникло как специфический фактор для реакции с теми микроорганизмами, которые не способны запустить альтернативнй путь активации комплемента.

Как известно некоторые антитела (IgG   и  IgM) в районе шарнирного участка имеют рецепторы к CIq компонента комплемента. Особенно активно связывает комплемент IgМ. Но эта  способность антител проявляется лишь после того, как они своими активными центрами соединятся с антигенами. Таким образом, антитело, взаимодействуя с микроорганизмом, связывает и активирует первый компонент комплемента  C1q. Последний объединяется из С1r и C1s в единственный комплекс. Активирован C1s взаимодействует со следующим компонентом комплемента С4, в результате расщепления которого образуются два его фрагмента: С4а  и  C4b. C4b  может связаться с комплекса антитело – С1 или с поверхностью микроорганизма. В  присутствии ионов  Mg   компонент С2 способен образовывать соединение из С4b, формируя субстрат для C1s. Возникает   комплекс C4b2a, который имеет выраженную конвертазную активность  по отношению к   С3. Этот  комплекс владеет такой же специфичностью, как и  упоминавшаяся нами предварительно конвертаза  альтернативного пути – С3bBb. Из этого момента весь процесс последующей активации комплемента происходит таким же образом, как и в альтернативном пути. Одна молекула C3b  присоединяется к комплексу  C4b2a  и  превращает его в фермент, который способен  расщепить компонент С5. В конце концов через последовательную активацию молекул С6, С7, С8, С9 возникает  мембраноатакуючий комплекс, который разрушает микробную мембрану.  Конвертаза   классического   пути        активации комплемента тоже, как и C3bBb, находится под контролем  соответствующих факторов (G, C4bp, CR1).

Таким образом, сценарий защиты организма выглядит так. Все начинается с активации комплемента по альтернативному пути. Конвертаза C3bBb  закрепляется на поверхности бактерии  и расщепляет значительное количество С3. Фрагмент С3а выделяется, а многочисленные молекулы C3b связываются с мембраной микроорганизма. Это  активирует следующий этап с образованием С5а и мембраноатакующего комплексуа В дальнейшем на сцену событий выходят  С3а и С5а. Они способствуют  высвобождению медиаторов  из тучных клеток и вместе с ними привлекают в очаг проникновения  микроба другие компоненты системы  комплемента и полиморфноядерные нейтрофилы. Все это обусловливает усиление кровотока, расширение мелких сосудов, а сокращение клеток эндотелия капилляров позволяет белкам плазмы выходить из сосудов. Нейтрофилы замедляют движение возле стенок капилляров, проникают в отверстия между  єндотелиальными клетками и  передвигаются за градиентом концентрации хемотаксичних факторов, пока не встретятся с бактерией, покрытой C3b. Дальше происходит связывание микроорганизма из C3b рецепторами нейтрофила, С3а  и  С5а  резко активируют клеточное дыхание, и мгновенно наступает разрушение бактериальной клетки.

Эти процессы  обусловливают  соответствующие симптомы: гиперемию, отек, боль. Так, гиперемия является следствием расширения капилляров, отек – результат экссудации белков плазмы. Описаны  проявления, а также накопления нейтрофилов, характерные для острой воспалительной реакции.

 

 

Следует заметить, что сам комплемент способен непосредственно  инактивировать некоторые вирусы и в отсутствии антител, например ряд ретровирусов. Это возможно потому, что некоторые вирусные белки являются рецепторами   C1q. Ряд данных свидетельствует, что вирусы могут  активировать комплемент и альтернативным путем.

Кроме перечисленных механизмов, распространение возбудителя может быть ограничено ферментами, которые высвобождаются из поврежденных тканей и активируют свертывающую систему крови. К таким веществам относят С – реактивный белок, сывороточный амилоид А – белок, a_{1 –} антитрипсин, _{2 –} макроглобулин, фибриноген, церулоплазмин и др.

С – реактивный белок при участии ионов кальция способен связываться с некоторыми микроорганизмами, в состав мембраны которых входит фосфорилхолин. Комплекс, который при этом образуется, активирует систему комплемента по классическому пути. При этом  С3b связывается с мембраной бактерии, которая легко фагоцитується, благодаря наличие на поверхности фагоцита рецепторов С3b.

г) Интерфероны

Особенное значение в системе неспецифической защиты организма предоставляется интерферонам. Различают три основных типа интерферонов: a -интерферон (лейкоцитарный), b-интерферон (фибробластный) и g-интерферон (иммунный). Каждый тип включает подтипы, которые различаются, например, по чувствительности к рН. 25 представителей семейства  α -интерферона и два подтипа b–интерферона гетерогенны и различаются по молекулярной массе и аминокислотными последовательностями. Гамма-интерферон не имеет подтипов.

Интерферону Альфа присущая антивирусное и антипролиферативное действие. Он подавляет пролиферацию мононуклеаров крови  в ответ на действие антигенов, митогенов за счет специфической цитотоксичности. Усиливает киллерну активность лимфоцитов в отношении опухолей. Может повышать продукцию лейкотриена В4, тормозить выделение  лейкотриєна С4, что можно использовать для подавления анафилактических и воспалительных реакций.

Бета-интерферон – регулирует  пролиферацию и функциональную активность макрофагов, усиливает их противоопухолевую активность, активирует естественные киллеры.

Гамма-интерферон – естественный регулятор иммунного ответа, владеет также противовирусной и противоопухолевой активностью, повышает выраженность (экспрессию) антигенов гистосовместимости  I  и  II классов. Синтез этого вида  интерферона происходит под воздействием  бактериальных и вирусных антигенов, лектинов. В определенной мере  влияют  на выделение  интерферона  ИЛ-2, лейкотриены  В4, С4, D4.

При вирусной инфекции клетки активно синтезируют  интерферон и секретуют его в межклеточное пространство, где он связывается со специфическими рецепторами соседних незараженных клеток. Интерферон непосредственно не действует на вирусы.  После его взаимодействия с рецепторами клеток наступает дерепресия и активация генов, которые локализованы у человека на 21 хромосоме. Это приводит к формированию 12 новых внутриклеточных белков, какие отсутствуют в клетках, на которых не подействовал интерферон. При этом резко, в десятки раз, увеличивается синтез двух новых ферментов: синтетазы и протеинкиназы. Синтетаза расщепляет мРНК, подавляя удлинение полипептидной цепи, в то же время активирует в этих клетках протеинкиназу, что находится там в неактивном состоянии. Протеинкиназа фофорилирует фактор иницииации, инактивирует  его и тем самым тормозит трансляцию  вирусного генома.

Таким образом, под воздействием интерферона  в клетках синтезируется два фермента, один из которых тормозит синтез вирусных белков, а второй расщепляет  вирусные РНК, что образовались. В конце концов вокруг очага вирусной  инфекции образуется барьер из неинфицированных клеток. Необходимо заметить, что интерфероны играют значительную роль в борьбе с вирусами, но не в предупреждении вирусных инфекций.

 

 

Факторы, которые  стимулируют  выделение интерферона. Первым  и наиболее важным интерфероногеном является вирусная инфекция. Интерферон производится практически при зараженные любым вирусом, как РНК- так и ДНК-содержащим, причем РНК-содержащие вирусы – хорошие индукторы, тогда как ДНК-геномные, за исключением поксвирусов – более слабые. Кинетика синтеза интерферона в общем одинакова для всех вирусов: его продукция  начинается приблизительно через 4 часа после заражения и достигает максимума, когда синтез вирусных  белков  происходит с максимальной скоростью, и потом снижается.

Вторым сильным стимулятором синтеза интерферона является двухцепочесная РНК. Это естественные двухцепочечные РНК, в том числе РНК реовирусив, репликативные формы РНК-вирусов, а также синтетические двухцепочечные полирибонуклеотиды. В то же время ни одинцепочечная РНК или  ДНК, ни двухцепочечная ДНК или гибридные РНК-ДНК не способны быть  интерфероногенами. Активные интерфероногены должны быть относительно стойкие к рибонуклеазе.

Следующим основным классом индукторов интерферона являются вирусы, которые неспособны реплицироваться.  Например, вирусы в непермиссивних клетках или инактивированные вирусы. Частично можно объяснить этот факт наличием  у этих вирусов двухцепочечной РНК, которая способна из них высвобождаться. Наверно потому, инактивированный ультрафиолетом реовирус  в  200  раз более эффективный как стимулятор интерферона по сравнению с неинактивированным, потому что в зараженной клетке первый распадается с высвобождением двухцепочечной РНК.

Недавно был открыт новый аспект индукции интерферона вирусами и их компонентами. Доказано, что некоторые структурные белки (белок фибрилл аденовируса и  гликопротеин HN вируса Сендай) владеют митогенной активностью относительно В-лимфоцитов и стимулируют образование  интерферона в клетках селезенки.

Другими интерфероногенами, которые запускают синтез небольшого  количества  интерферона могут быть бактериальные эндотоксины, возбудители трахомы, микоплазмы, простейшие, риккетсии, полимеры  полиакриловой кислоты, малеиновая кислота и прочее.

Еще  одну  важную группу стимуляторов выделения интерферона составляют метаболические  активаторы. В первую очередь к ним относят  митогены для нестимулируемых лимфоцитов и специфические антигены для иммунных лимфоцитов, промоторы   опухолевого роста (бутират, бромдезоксиуридин, дексаметазон, диметилсульфоксид), вещества, которые подавляют образование мРНК или синтез белка.

Действие интерферонов, как и гормонов, реализуется на плазматической мембране клетки при их соединенные с особенными рецепторами.  Четко установлено, что интерферон в середине   клетки, в которой он синтезируется, не владеет биологической активностью. Сначала он должен выделиться, а затем опять адсорбироваться  клетками.   

 

д ). Естественные киллеры

Вирусы, как известно, способны размножаться только в клетках хозяина, используя  их репродуктивные механизмы. Без сомнения, хозяин заинтересован уничтожить эти зараженные клетки до того, как вирус начнет в них размножаться. Как раз это контролируют  и осуществляют особенные клетки организма – естественные киллеры (ЕК). Они способны   распознавать вирусные антигены, которые  появляются на мембране инфицированных клеток. Благодаря это свойство, ЕК- клетки выбирают среди многообразия клеток только те, которые поражены вирусом.

Процесс происходит таким образом. Как только рецептор  естественного киллера связывается с клеткой зараженной вирусом, ЕК- клетка активируется и впрыскивает содержание своих гранул (белок перфорин)  в периплазматическое пространство инфицированной клетки. По своей структурой перфорин похож на С9 компонент комплемента и, как и он, может встраиваться в мембрану клетки-мишени. Там молекулы перфорина полимеризируются, при этом образуется трансмембранный канал, через который киллер вводит гранзимы, которые активируют клеточные каспазы, а эти в свою очередь клеточные эндонуклеазы, которые разрушают хромосому клетки. Клетка погибает путем апоптоза.

 

 

Естественные (нормальные)   киллеры – самостоятельная популяция мононуклеарных клеток, независимая от тимуса. Они содержатся в большом количестве в периферической крови, селезенке и других органах. Цитотоксичность ЕК, выделенных из этих органов – разная. Наибольшая  активность зафиксирована у лимфоцитов периферической крови, наименьшая – в клетках костного мозга. Считают, что естественные киллеры выполняют в организме разнообразные функции: контролируют рост первичных и метастатических опухолевых клеток, контролируют развитие  микробных и вирусных инфекций, производят медиаторы, принимают участие в имунорегулирующих процессах, контролируют пролиферацию и дифференциацию гемопоэтических клеток, начинают развитие трансплантационного иммунитета. Важно подчеркнуть, что естественные киллеры стойки к ионизирующей радиации  и не фагоцитуются.

 

Антигены и их общая характеристика.

 

Антигены – это биополимеры, естественные  или синтетические соединения, которые распознаются  лимфоидными клетками и способные вызывать иммунный ответ. Последний может проявляться  синтезом антител, гиперчувствительностью, иммунологической памятью, иммунологической толерантностью. Из определения следует, что антигены характеризуются двумя взаимосвязанными свойствами:  избирательно взаимодействуют со специализированными рецепторами лимфоцитов (антигенная специфичность) и тем самым вызывают синтез антител, и реагируют с ними. Антигенами являются белки, некоторые естественные и синтетические полипептиды, полисахариды и их комплексы с белками, липидами, нуклеиновые кислоты. Таким образом, антигены – это органические вещества микробного, растительного и животного происхождения, а также полученные синтетическим путем.

 

Основные свойства веществ – антигенов

      1. Химический состав. Вещества со сложным химическим строением имеют значительную антигенность. Наиболее выраженные антигенные  свойства присущие белкам. Теоретически с 20 основных аминокислот можно построить 1020  разных за антигенными свойствами полипептидов.

      2. Генетическая чужеродность. Известно, что каждый индивидуум имеет свой индивидуальный набор генов, а значит свой набор макромолекул – белков-антигенов. Иммунная система является тем цензором, контролером, который не допускает в организм вещества с другой генетической программой и следит за генетическим составом своей внутренней среды. В связи с чем существовало такое определение антигенов  – это вещества, которые несут на себе признаки чужеродной генетической информации.

      В то же время в собственном организме есть вещества и ткани, которые в период эмбрионного развития не контактировали с лимфоидной тканью, а поэтому лимфоидная система не “знает” об их существовании. И если при определенных патологических процессах эти вещества попадают в кровь, лимфоидная система реагирует на них как на инородные (хрусталик глаза, щитообразная железа, мозговая ткань, сперматозоиды, казеин и др.). Такие вещества являются антигенными для собственного организма и называются аутоантигенами. Кроме того, разнообразные процессы в организме могут приводить к частичным изменениям молекул собственного организма (вирусы, яды, химические вещества, ионизирующая радиация, температурный фактор), и они также становятся антигенами.

3. Макромолекулярность. Чем больше молекулярная масса вещества, чем более сложная ее структура, тем лучшим антигеном она является. Как правило, у хороших антигенов молекулярная масса составляет  десятки тысяч дальтон. Чем больше на поверхности антигену разнообразных конечных остатков аминокислот (-СООН, -ОН, -SО3Н),  моно- и дисахаров, так называемых детерминантных групп, тем лучшие антигенные свойства он  имеет.

4. Специфичность антигена. Как правило, любой антиген состоит из двух частей: высокомолекулярного носителя, который обеспечивает макромолекулярнисть, молекулярную массу (это белок или полисахарид) и детерминантной группы (эпитопа), от которой зависит специфичность антигена. На одном носителю может быть много эпитопов, и на каждый из них синтезируются отдельные антитела.

 

 

5. Большое значение для антигенных свойств вещества имеет стабильность конструкции молекулы, ее жёсткость. 

В состав микроорганизмов входят белки, полисахариды, соединения белков с полисахаридами и липидами, нуклеиновые кислоты. Сложностью химического строения  бактерий  обусловлена их мозаичность в антигенном отношении. В бактериальной клетке находятся  разнообразные антигены и гаптены.

 

Антигенная структура бактериальной клетки и вирусов.

      В бактериальных клетках различают: соматический – О, жгутиковый – Н и капсульный К антигены, каждый из которых стимулирует синтез специфических антител.

Соматический О-антиген. Ранее полагали, что О-антиген заключен в содержимом клет­ки, ее соме, поэтому и назвали его соматическим антигеном. Впоследствии оказалось, что этот антиген связан с бактериальной клеточной стенкой. О-антиген грамотрицательных бактерий связан с ЛПС клеточной стенки. Детерминантными группами этого сложного комплексного антигена являются концевые повторяющиеся звенья полисахаридных цепей, присоединенные к ее основной части. Состав Сахаров в детерминантных группах, так же как и их число, у разных бактерий неодинаковы. Чаще всего в них содержатся гексозы (галактоза, глюкоза, рамноза и др.), аминосахар (N-ацетилглюкозамин). О-антиген термостабилен: он сохраняется при кипячении в течение 1—2 ч, не разрушается после обработки формалином и этанолом. При иммунизации животных живыми культурами, имеющими жгути­ки, образуются антитела к О- и Н-антигенам, а при иммунизации кипяченой культурой образуются антитела только к О-антигену.

К-антигены (капсульные). Эти антигены хорошо изучены у эшерихий и сальмонелл. Они, так же как О-антигены, тесно свя­заны с ЛПС клеточной стенки и капсулой, но в отличие от О-ан-тигена содержат главным образом кислые полисахариды: глю-куроновую, галактуроновую и другие уроновые кислоты. По чувствительности к температуре К-антигены подразделяют на А-, В- и L-антигены. Наиболее термостабильными являются А-антигены, выдерживающие кипячение более 2 ч, В-антигены выдерживают нагревание при температуре 60 °С в течение часа, а L-антигены разрушаются при нагревании до 60 °С.

К-антигены располагаются более поверхностно, чем О-антигены, и часто маскируют последние. Поэтому для выявления О-антигенов необходимо предварительно разрушить К-анти­гены, что достигается кипячением культур. К капсульным анти­генам относится так называемый Vi-антиген. Он обнаружен у брюшнотифозных и некоторых других энтеробактерий, обла­дающих высокой вирулентностью, в связи с чем данный антиген получил название  антигена   вирулентности.

Капсульные антигены полисахаридной природы выявлены у пневмококков, клебсиелл и других бактерий, образующих выра­женную капсулу. В отличие от группоспецифических О-анти­генов они часто характеризуют антигенные особенности опреде­ленных штаммов (вариантов) данного вида, которые на этом основании подразделяются на серовары. У сибиреязвенных бацилл капсульный антиген состоит из полипептидов.

Жгутиковые Н-антигены. Как видно из названия, эти антигены входят в состав бактериальных жгутиков. Н-антиген представляет собой белок флагеллин. Он разрушается при нагревании, а после обработки фенолом сохраняет свои антигенные свойства.

Антигены бактериальных токсинов. Токсины бактерий обладают полноценными антигенными свойствами в том случае, если они  являются  растворимыми  соединениями  белковой  природы.

Ферменты, продуцируемые бактериями, в том числе факторы патогенности, обладают свойствами полноценных антигенов.

Протективные антигены. Впервые обнаружены в экссудате пораженной ткани при сибирской язве. Они обладают сильно выраженными антигенными свойствами, обеспечивающими иммунитет к соответствующему инфекционному агенту. Протективные антигены образуют и некоторые другие микроорганизмы при попадании в организм хозяина, хотя эти антигены не являются их постоянными компонентами

Знание антигенного строения бактерий необходимо для серологической идентификации микробной культуры, получение вакцинных препаратов, диагностических и лечебно-профилактических сывороток.

Схема антигенного строения бактерии

Антигены вирусов. В каждом вирионе любого вируса содержатся различные антигены. Одни из них являются вирусспецифическими. В состав других антигенов входят компоненты клетки хозяина (липиды, углеводы), которые включаются в его внешнюю оболочку. Антигены простых вирионов связаны с их нуклеокапсидами. По своему химическому составу они принадлежат к рибонуклеопротеидам или дезоксирибонуклеопротидам, которые являются растворимыми соединениями и поэтому обозначаются как S-антигены (solutio — раствор). У сложноорганизованных вирионов одни антигенные компоненты связаны с нуклеокапсидами, другие — с гликопротеидами внешней оболочки. Многие простые и сложные вирионы содержат особые поверхностные V-антигены — гемагглютинин и фермент нейраминидазу. Антигенная специфичность гемагглютинина у разных вирусов неоди­накова. Данный антиген выявляется в реакции гемагглютинации или ее разновидности — реакции гемадсорбции. Другая особенность гемагглютинина проявляется в антигенной функции вызывать образование антител — антигемагглютининов и вступать с ними в реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) .

Вирусные антигены могут быть группоспецифическими, если они обнаруживаются у разных видов одного и того же рода или семейства, и типоспецифическими, присущими отдельным штаммам одного и того же вида. Эти различия учитываются при идентификации вирусов.

Наряду с перечисленными антигенами в составе вирусных частиц могут присутствовать антигены клетки хозяина. Так, например, вирус гриппа, выращенный на аллантоисной оболочке куриного эмбриона, реагирует с антисывороткой, полученной к аллантоисной жидкости. Этот же вирус, взятый из легких инфицированных мышей, реагирует с антисывороткой к легким данных животных и не реагирует с антисывороткой к аллантоисной жидкости.

Антигены вируса гриппа

 

Гетерогенные антигены (гетероантигены). Общие антигены, обнаруженные у представителей различных видов микроорганизмов, животных  растений, называют гетерогенными. Например, гетерогенный антиген Форсмана содержится в белковых структурах органов морской свинки, в эритроцитах барана и сальмонеллах.

Существование общих гетероантигенов у животных и паразитирующих в их организме микроорганизмов можно рассматривать как следствие антигенной мимикрии паразита, т. е. способности разных патогенных микроорганизмов маскироваться в организме за счет общих антигенов. В результате подобной маскировки клетки иммунной системы организма недостаточно активно отвечают синтезом антител на инфекцию данными патогенными агентами.

Перекрестно реагирующие антигены (ПРА) обнаружены у ряда микроорганизмов и в тканях человека. К ним относится антиген слизистой оболочки кишечника человека, в частности у больных язвенным колитом, и общий антиген энтеро-бактерий. Гемолитические стрептококки группы А содержат ПРА, общие с аутоантигенами миокарда и клубочков почек, с чем связывают их способность провоцировать ревмокардит и гломерулонефрит. ДНК-содержащие вирусы и ядра клеток организма человека также несут в себе ПРА. Для паразита ПРА играют защитную роль, для организма хозяина они могут стать пусковым механизмом  аутоиммунного  заболевания.

 

Главный комплекс гистосовместительности (ГКГ)

 

Главный комплекс гистосовместительности (ГКГ) – это система генов, которая контролирует синтез антигенов,  что определяют несовместимость тканей при пересадках и индуктируют реакции отторжения трансплантантов. Эти антигены выполняют в организме и другие биологически важные функции. Они являются маркерами дифференциации Т-лимфоцитов, они содержатся на клетках-мишенях цитотоксических Т-лимфоцитов, размещаясь на В-клетках и макрофагах, обусловливают их взаимодействие с Т-хелперами. Продукты ГКГ выполняют функцию резервной генетической информации для воссоздания многообразия, образования С3-конвертаз, принимают участие в разнообразных иммунологических процессах.

      Поверхностные структуры цитомембран клеток, которые индуктируют реакции отторжения трансплантанта, получили название антигенов гистосовместительности, а гены, которые их кодируют – генов гистосовместительности – Н-генов (histocompatibility).

Гены первого и второго классов главного комплекса гистосовместительности (разные алели) кодируют лейкоцитарные антигены (HLA) двух классов. Антигены первого класса ГКГ размещены практически на всех клетках организма. Антигены второго класса ГКГ размещены на В-лимфоцитах, макрофагах, дендритных клетках, входят в состав рецепторов Т-хелперов, принимают участие в иммунном ответе,  клеточном распознавании и взаимодействии клеток иммунной системы.

Генетическая карта  главного комплекса  гистосовместимости

 

Учение о главном комплексе гистосовместимости (ГКГ) является стержневым в фундаментальной и прикладной иммунологии. Выше уже неоднократно упоминалось о молекулах ГКГ, в частности, при описании особенностей презентации чужеродного материала для распознавания Т-лимфоцитам при развитии иммунного ответа. Роль молекул ГКГ чрезвычайно важна. Набор этих молекул для каждого человека абсолютно специфичен, они делают нас индивидуальными во многих отношениях, вплоть до поведенческих реакций.

Первые работы, свидетельствующие о том, что у млекопитающих существуют гены, детерминирующие выраженность трансплантационной реакции отторжения, появились более 40 лет тому назад, с началом активной пересадки органов. Впоследствии эта группа генов получила название “главный комплекс гистосовместимости” (Major Histocompatibility Complex — МНС). Самим названием была подчеркнута их определяющая роль в развитии трансплантационного иммунитета. У человека этот комплекс генов получил название системы HLA (Human Leukocyte Antigen). Таким образом, аббревиатуры ГКГ, МНС и HLA для человека являются синонимами обозначения главного комплекса гистосовместимости.

Некоторые исследователи называют антигены ГКГ “иммунным паспортом, группой белой крови”, с помощью которых иммунная система способна различать “свое” от “чужого” Индивидуальный набор и свойства молекул ГКГ во многом определяют силу иммунного ответа конкретного человека на конкретный антиген.

Отметив, что клетки гомозиготных близнецов реагируют с набором тест-сывороток одинаково, а гетерозиготных — по разному, G. Dausset высказал подтвердившееся впоследствии предположение о генетической детерминированности антигенов гистосовместимости: т. е. о том, что каждый из генов, входящих в HLA-комплекс, имеет свое представительство в виде антигена гистосовместимости, экспрессируемого на мембране клетки.

В настоящее время ГКГ (HLA) человека является одним из наиболее хорошо изученных и вместе с тем наиболее сложных генетических структур в геноме человека.

Обозначение HLA-специфичностей включает три компонента:

1) аббревиатуру всей системы;

2) локус, содержащий данную специфичность;

3) номер антигена (например HLA-B12). В том случае, когда генетическая позиция антигена еще недостаточно ясна или недостаточно уточнена, перед его порядковым номером ставят символ “w” (workshop).

В настоящее время гены системы HLA класса I включают локусы В, С, Е, A, G, F (по направлению к теломере). Часть из них — локусы В, С и А — относят к так называемым “классическим”, кодирующим традиционные трансплантационные антигены. Что касается недавно открытых локусов Е, G, то биологическая функция их самих и их продуктов в настоящее время уточняется. Возможно, некоторые из них принимают участие в презентации антигена для распознавания интра-эпителиальными Т-лимфоцитами-киллерами, несущими гамма-, дельта-цепи в антиген-распознающем рецепторе; другие определяют взаимоотношения в системе “мать-плод” (например антигены локуса G).

В норме “классические” антигены системы HLA класса I присутствуют на всех ядерных клетках, отличаясь лишь степенью интенсивности их экспрессии. Доказано наиболее низкое содержание их на миокардиоцитах, скелетных мышцах, эндотелии роговицы; не установлено их присутствие на нитях трофобласта. Степень выраженности антигенов системы как I, так и II класса — непостоянна и зависит от воздействия, прежде всего, так называемых эндогенных факторов модификации иммунного ответа, к которым относят интерлейкины, интерфероны, опухольнекротизирующий фактор, простагландины и др.

Одной из важнейших характеристик генов системы HLA является их разнообразие и полиморфизм, т. е. существование в пределах каждого локуса большого количества различных специфичностей HLA-генов (или множественных аллельных вариантов), отличающихся между собой по аминокислотным последовательностям, входящим в вариабельный участок ДНК, что определяет их полиморфизм. В настоящее время описано более 40 специфичностей в локусе А, более 60 специфичностей в локусе В и около 20 — в локусе С (R. Lechler, 1994). Кроме того, показано, что некоторые специфичности (гены) имеют по несколько аллельных вариантов. Так, например, HLA-A2 специфичность имеет 12 аллелей, 6, а 7 аллелей. Наличие аллельного полиморфизма HLA молекул лежит в основе строгой индивидуализации набора трансплантационных антигенов у каждого конкретного человека, делая его неповторимым в этом плане.

Очень важным этапом в развитии учения о системе HLA и в понимании функции молекул HLA класса I стали работы, в которых было описано их тонкое строение.

На рис. представлено схематическое изображение структуры молекулы (антигена) HLA класса I (I. Roitt, 1994). По современным представлениям, молекула HLA класса I является гетеродимером, состоящим из тяжелой альфа-полипептидной цепи и нековалентно связанной с ней легкой бета-полипептидной цепи.

Рис. Схематическое изображение молекулы (антигена) HLA класса I (объяснение в тексте).

Альфа-цепи молекул класса I содержат приблизительно 340 аминокислотных остатков, которые формируют три внеклеточных домена (альфа 1, альфа2, альфаЗ), одну трансмембранную часть и внутрицито-плазматический “хвост”. Они кодируются генами локусов А, В и С комплекса расположенного на 6-ой хромосоме, и как упоминалось, являются высокополиморфными. Бета-цепь молекулы класса I представляет собой бета-2-микроглобулин, который состоит из внеклеточного домена, включающего 100 аминокислотных остатков, он кодируется геном, расположенным на хромосоме и является неполиморфным.

Таким образом, пептиды, презентируемые молекулами HLA класса I, несут информацию о цитозольных эндогенных белках, как нормальных, так и измененных либо в результате мутации, либо вследствие модификации вирусами, а также иными внутриклеточными паразитами. Поскольку “классические” антигены ГКГ класса I представлены, как уже упоминалось, на всех клетках организма, становится понятным насколько важен подобный цензорный механизм за измененными клетками организма, активацию цитотоксических Т-лимфоцитов-киллеров (CD8+ клетки).

После эндоцитоза чужеродный антиген подвергается деградации (протеолизу) в ранних и поздних эндосомах (лизосомах), в результате образуются пептиды. Однако “загрузка” этих пептидов в пептид-связывающую бороздку молекул класса II происходит не в эн-доплазматической сети. Дело в том, что хотя сборка молекул HLA класса II и происходит в эндоплазматической сети, но в этом компартменте клетки указанные молекулы имеют дополнительную цепь, названную инвариантной цепью (ИЦ), которая как бы “прикрывает” собой пептидсвязывающую бороздку. Такой комплекс — молекулы HLA класса II + инвариантная цепь — транспортируется через комплекс Гольджи в эндосомальный компартмент клетки, где находится пептид, образовавшийся из чужеродного антигена. Здесь под влиянием катепсинов В и D происходит разрушение инвариантной цепи и “загрузка” пептидов в открывшуюся пептидсвязывающую бороздку. На следующем этапе образовавшийся комплекс — молекула HLA класса II + пептид — транспортируется на поверхность клетки и представляется для распознавания Т-лимфоцитам-хелперам (CD4+ клеткам). Активированные таким образом Т-лимфоциты-хелперы в свою очередь участвуют в реализации иммунного ответа

Говоря об основной роли молекул HLA класса I и II в реализации иммунного ответа, следует подчеркнуть их необходимость для антигенной активации Т-клеток. В отличие от В-клеток, которые непосредственно распознают антиген за счет своих иммуноглобулиновых рецепторов, Т-клетки могут распознавать его только в том случае, если антиген в виде пептида экспрессирован на клеточной мембране в комплексе с собственной HLA-молекулой — феномен HLA-рестрикции (ограничение распознавания антигенных пептидов молекулами HLA).

Таблица. Краткая характеристика классических антигенов системы HLA класса I и II

Характеристика	Класс I	Класс II
Генетические локусы	HLA— А, В, С	HLA — DP, DQ, DR
Распределение в тканях	Все ядросодержащие клетки	В-лимфоциты,-макрофаги, дендритные клетки, активированные Т-лимфоциты, эпителиальные и эндо-телиальные клетки
Участие в презентации пептидов для Т-клеток	Для Т-киллеров (CD8+)	Для Т-хелперов (CD4+)
Связывание с поверхностными молекулами Т-кле-ток	С молекулой CD8	С молекулой CD4

 

Иммуноглобулины.

Характеристика основных классов иммуноглобулинов.

Наиболее критический момент в процессе иммунного ответа – это распознавание, выявление химического маркера, который свойственный “чужому” агенту в отличие от “своего”. Это задание положено на  особенные белки, которые отличаются удивительным разнообразием молекулярной структуры.  Основными распознающими белками являются антитела или  имуноглобулины (Ig). Существует пять классов иммуноглобулинов человека – G, M, А, E, D. Молекулы каждого класса состоят из тяжелых и легких полипептидных цепей. 

       Лёгкие полипептидные цепи (L) бывают двух видов либо κ, либо λ и одинаковые для всех классов иммуноглобулинов. Тяжелые цепи (Н) у каждого класса разные. От строения тяжелой цепи происходит название класса иммуноглобулинов.

У каждого иммуноглобулина – только один тип легких цепей или l, или k.  Таким образом,  структурные формулы каждого класса иммуноглобулина можна записать таким образом:

Ig G – g2l2,,g2k2

Ig M – (m2l2)5, (m2k2)5

Ig A – (a2l2)n , (a2k2)n,,

Ig E –  e2l2, e2k2

IgD – d2l2,  d2k2

Молекулы иммуноглобулинов разных классов построены из одних и тех же мономеров, имеющих по две тяжелых и по две легких цепи.

К мономерам относятся иммуноглобулины G и Е, к пентамерам — IgM, a IgA могут быть представлены мономерами, димерами и тетрамерами (см. рис. 15.3 и 15.4). Мономеры соеди­нены между собой так называемой соединительной цепью, или j-цепью (англ. joining — соединительный).

Разные классы иммуноглобулинов отличаются друг от друга биологическими свойствами. Прежде всего это относится к их способности связывать гомологичные антигены. В данной реак­ции у мономеров IgG и IgE участвуют два антигенсвязывающих участка (активных центра), обусловливающих бивалентность антител. При этом каждый активный центр связывается с одним из эпитопов поливалентного антигена, образуя сетевую струк­туру, которая выпадает в осадок. Наряду с бивалентными суще­ствуют моновалентные антитела, у которых функционирует лишь один из двух активных центров, способный связаться лишь с единичной антигенной детерминантой без последующего образования сетевой структуры иммунных комплексов. Такие анти­тела называются неполными, они выявляются в сыворотке крови с помощью реакции Кумбса.

Иммуноглобулины характеризуются различной авидностью, под которой понимают скорость и прочность связыва­ния с молекулой антигена. Авидность зависит от класса имму­ноглобулинов, содержащих разное количество мономеров. В этой связи наиболее выраженной авидностью обладают пентамеры иммуноглобулинов класса М. Авидность антител меняется в про­цессе иммунного ответа в связи с переходом от синтеза IgM к преимущественному синтезу IgG.

Разные классы иммуноглобулинов отличаются друг от друга по способности проходить через плаценту, связывать и активировать комплемент и др. За эти свойства отвечают отдельные домены Fc-фрагмента иммуноглобулина, образованные его тяжелой цепью. Так, например, цитотропность IgG определяется СЗ-доменом, связывание комплемента — С72-доменом и т. д.

Иммуноглобулины класса G (IgG) составляют около 80% сывороточных иммуноглобулинов (в среднем 12 г/л), с молеку­лярной массой 160 000 и скоростью седиментации 7S. Они обра­зуются на высоте первичного иммунного ответа и при повторном введении антигена (вторичный ответ). IgG обладают достаточно высокой авидностью, т. е. сравнительно высокой скоростью связывания с антигеном, особенно бактериальной природы. При связывании активных центров IgG с эпитопами антигена в области его Fc-фрагмента обнажается участок, ответственный за фиксацию первой фракции системы комплемента, с последующей активацией системы комплемента по классическому пути. Этим обусловливается способность IgG участвовать в защитных реакциях бактериолиза.  IgG  является единственным  классом  антител,  проникающим через плаценту в организм плода. Через некоторое время после рождения ребенка содержание его в сыворотке крови падает и достигает минимальной концентрации к 3—4 мес, после чего начинает возрастать за счет накопления собственных IgG, достигая нормы к 7-летнему возрасту. Из всех классов иммуно­глобулинов в организме больше всего синтезируется IgG. Около 48 % IgG содержится в тканевой жидкости, в которую он диф­фундирует из крови. IgG, так же как и иммуноглобулины других классов, подвергается катаболическому распаду, который происходит в печени, макрофагах, воспалительном очаге под дей­ствием протеиназ.

Иммуноглобулины класса М (IgM) первыми начинают синтезироваться в организме плода и первыми появляются в сыворотке крови после иммунизации людей большинством антигенов. Они составляют около 13% сывороточных иммуноглобулинов при средней концентрации 1 г/л. По молекулярной массе они значительно превосходят все другие классы иммуноглобулинов. Это связано с тем, что IgM являются пентамерами, т. е. состоят из 5 субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу, близкую к IgG. К IgM принадлежит большая часть нормальных антител — изогемагглютининов, которые при­сутствуют в сыворотке крови в соответствии с принадлежностью людей к определенным группам крови. Эти аллотипические варианты IgM играют важную роль при переливании крови. Они не проходят через плаценту и обладают наиболее высокой авидностью. При взаимодействии с антигенами in vitro вызывают их агглютинацию, преципитацию или связывание комплемента. В последнем случае активация системы комплемента ведет к лизису корпускулярных антигенов.

Иммуноглобулины класса A (IgA) встречаются в сыворотке крови и в секретах на поверхности слизистых оболочек. В сыворотке крови присутствуют мономеры IgA с константой седиментации 7S в концентрации 2,5 г/л. Данный уровень достигается к 10 годам жизни ребенка. Сывороточный IgA синтезируется в плазматических клетках селезенки, лимфатических узлов и слизистых оболочек. Они не агглютинируют и не преципити-руют антигены, не способны активировать комплемент по клас­сическому пути, вследствие чего не лизируют антигены.

Секреторные иммуноглобулины класса IgA(SlgA) отличаются от сывороточных наличием секреторного компонента, связанного с 2 или 3 мономерами иммуноглобулина А. Секреторный компонент является р-глобулином с молекулярной массой 71 000 D. Он синтезируется клетками секреторного эпи­телия и может функционировать в качестве их рецептора, а к IgA присоединяется при прохождении последнего через эпите­лиальные клетки.

Секреторные IgA играют существенную роль в местном им­мунитете, поскольку препятствуют адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистых оболочек рта, кишечника, респираторных и мочевыводящих путей. Вместе с тем SIgA в агрегированной форме активирует комплемент по альтернатив­ному пути, что приводит к стимуляции местной фагоцитарной защиты.

Секреторные IgA препятствуют адсорбции и репродукции вирусов в эпителиальных клетках слизистой оболочки, например при, аденовирусной инфекции, полиомиелите, кори.

 

 

 

 

Характеристика основных классов  иммуноглобулинов

 

 

Иммуноглобулины G

Иммуноглобулины М

 

Иммуноглобулины А

 

Использование иммунологических реакций в диагностике  инфекционных заболеваний. Реакции, что базируются на феноменах агглютинации и преципитации.

Реакции лизиса и связывания комплемента

 

 

Использование иммунологических реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

Реакции, что базируются на феноменах агглютинации и преципитации.

Все серологичные реакции используются  для:

1)  выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни;

2) определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна. По данным признакам она уступает другим серологи­ческим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным и, так как содержат антителя только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара

 

Рис. Развернутая реакция агглютинация

 

В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее применима в следующих направлениях:

а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и иммунизированного.  Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физиологическом) растворе двукратно и последовательно (например, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

 Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37  С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в определенном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туляремии -1:100.

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром  0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин, что позволяет ее применять как экспресс-метод выявления антигенов и антител. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.

Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

Рис. Проведение  реакции латекс-аглютинации

Учет реакции латекс агглютинации

Реакция коагглютинации (КОА) .Для постановки КОА  используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

 

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают  и через 2-5 мин. на тёмном фоне учитывают результаты.  На тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

 

 

Механизм реакции непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами  разной групповой  специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

 

 

 

Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов: в реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества.

Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике. В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови. С помощью специфических преципитуючих сывороток против белка человека, разных животных и птиц можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. Таким же образом определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Эта реакция применяется для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). Реакцию Ухтерлони  используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

Рис. Механизм  и положительный результат реакции кольцепреципитации

 

Рис. 15. Механизм реакций преципитации в агаре.

 

Методика определения количества иммуноглобулинов

в сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена. В зависимости от специфичности заключенных в геле антител в ходе иммунодиффузии возникает одна или несколько полос преципитации, длина «пробега» которых от «линии старта» пропорциональна концентрации антигена. К усовершенствованным вариантам относятся: двойная радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони) и простая радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. Основная функция геля — локализация преципитата, основана на том, что растворимые антигены и антитела легко диффундируют в геле, а образующиеся иммунные комплек­сы ввиду их большей величины задерживаются внутри ячеек геля, образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное рас­положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

 

 

Иммуноэлектрофорез является сочетанием двух методов – электрофореза в геле и следующей после него двойной иммунодифузии.

Для проведения реакции иммуноелектрофорезу используют стеклянные пластинки, предметные стёклышки, на которые наносят тонкий слой агара или агарози. Сначала антигены размещают в центре пластинки и разделяют их в электрическом поле. Потом в канавку, сделанную в агаре параллельно к линии раздела антигенов, вносят специфическую сыворотку. Диффундируя друг навстречу другу, антигены и антитела в месте контакта образуют дуги преципитации.

 

Реакции лизиса и связывания комплемента.

Для реакции лизиса необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий – бактериолизины, спирохет – спирохетолизины, эритроцитов – гемолизины, против других клеток – цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) – антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

 

Реакция связывания комплемента (РСК). Характерным отличием РСК от реакции агглютинации и преципитации есть участие в ней, кроме антигена и антитела, ингредиентов реакции гемолиза, которая выступает в виде индикаторной системы. Взаимодействие антигена с антителом не всегда предопределяет визуальные изменения, которые позволяют определить результат реакции. Однако известно, что при образовании комплекса антиген – антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана – гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза – реакция негативная.

 

 

 

Рис. РСК

Учет реакции связывания комплемента

(++++) – реакция резко положительная (полная задержка гемолиза, жидкость бесцветная, все эритроциты на дне),

(+++, ++) – реакция положительная (слабо окрашенная жидкость, осадок эритроцитов на дне пробирки),

(+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне незначительное количество эритроцитов),

(−) – отрицательная реакция (наблюдается полный гемолиз).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ
ИЛИ АНТИТЕЛ

В настоящее время широкое применение получили сероло­гические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, ра­диоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувстви­тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу)

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологи­ческом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва­риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеи-на и др.) — прямой   метод  Куне а.

В связи с трудностями приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических сывороток более доступным являет­ся непрямой метод Куне а. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей   антитела   против   кроличьих   глобулинов,   так  как большинство диагностических антисывороток приготовляется пу­тем иммунизации кроликов разными антигенами. При образо­вании комплексов антиген — антитело флюоресцирующие анти-глобулиновые антитела фиксируются на них. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чув­ствительности и специфичности не уступает другим иммунологи­ческим реакциям.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологичес­ким реакциям, с простотой и высокой чувствительностью оп­ределения. По сравнению с обычными иммунологическими ме­тодами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие поли­меры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают спо­собностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген — антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необ­ратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологичес­кого материла.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлю­лоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой катали­тической активностью, позволяющей с помощью соответствую­щих субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 1СР¹⁵ моль/л и ниже. Принципиально решена

проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител.

Наиболее широкое применение находит твердофазный имму-ноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинил-хлорида. Один из наиболее распространенных на практике ва­риантов ИФА основан на использовании меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе ин­кубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген — антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные фер­ментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определя­ют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антивидовых антител выявляют специфические иммунокомплек-сы. Данная схема является одной из наиболее распространен­ных в ИФА.

С целью максимального упрощения использования ИФА разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анали­за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед­ствие образования продукта ферментативной реакции.

Области применения и чувствительность ИФА аналогичны РИА. Однако ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабиль­ность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко под­дается автоматизации.

 

Источники информации:

Основные А.

1. 1. И.Л. Дикий и соавт. Микробиология. Харьков, 1999.-С. 89-99, 111-115.

2.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П.,2000. 

3. Кривошеин Ю.С. и др. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней. К, 1996.

4. Медицинская микробиология,вирусология и микробиология /Под ред.       А.А.Воробьева.М.2004.

 5. Медицинская микробиология./ Под ред.В.И. Покровского.М., 2001.

6. Л.Б.Борисов.Медицинская микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001

В. Дополнительные:

1. І.О. Ситник, С.І.Климнюк, М.С. Творко // Мікробіологія, вірусологія, імунологія, Тернопіль, 1998.-С.120-124, 129-132;

2. Тимаков В.Д., Левашев В.С. // Микробиология.-М., 1983.-С 145-205;

3. С.І.Климнюк І.О.Ситник, М.С.Творко Практична мікробіологія Тернопіль, “Укрмедкнига”, 2004.-С.125-157;