ЛЕКЦИЯ 2
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ВИРУСОВ
СТРОЕНИЕ И КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
Известно тысячи видов разнообразных вирусов человека, животных, насекомых, растений, бактерий. Они играют чрезвычайно большую роль в природе: выступают как фактор, который объединяет сложные живые системы органического мира, служат переносчиками генетической информации. Именно с помощью вирусов сделаны фундаментальные открытия по расшифровыванию структуры нуклеиновых кислот, механизмов репликации ДНК и синтеза белка. Фундаментальное изучение вирусов и бактериофагов увенчалось грандиозными успехами генной инженерии. Следовательно, они дают ключ к пониманию функционирования нуклеиновых кислот и сущности жизни.
Свыше 500 вирусов вызывают разнообразные заболевания человека. Грипп, инфекционные гепатиты, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки Эбола и Ласса, бешенство, полиомиелит, СПИД.
Вирусы – неклеточные формы живых существ, которые характеризуются малыми размерами, отсутствием собственных белоксинтезирующих иэнергиегенерирующих систем, а также облигатным внутриклеточным паразитизмом.
Структура вирусов. Отдельная вирусная частица получила название вирион. Он состоит из одной молекулы нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белкового футляра, что ее окружает, – капсида. Вместе они формируют нуклеокапсид. Капсиды образованы из белковых субъединиц (полипептидов), которые называются капсомерами. Их количество стабильно для каждого вида вирусов и используется в качестве таксономического признака. Вирусы с таким типом строения называют простыми.
К ним принадлежат мельчайшие из патогенных вирусов человека : полиовирус, аденовирусы, -паповавирусы.
Однако большинство вирусов имеют еще одну оболочку – суперкапсидную, которая содержит липиды. Она пронизана вирусспецифическими белками-гликопротеидами, которые на поверхности оболочки образуют особенные стуктуры, которые называются шипами. Такие вирусы называют сложными или оболочечными. Структурной единицей суперкапсидной оболочки является пепломер. К ним принадлежат вирусы бешенства, герпеса, гриппа, енцефалитов, иммунодефицита человека и др.
Вирионы характеризуются понятиям симметрии. Тип симметрии зависит от способа заключения нуклеиновой кислоты и, соответственно, расположения капсомеров вокруг нее. Выделяют изометрический (или кубический), спиральный и смешанный типы симметрии. Кубический тип характеризуется тем, что капсомеры образуют много-гранник (чаще всего икосаэдр – 20-гранник).
Все известные ДНК-геномние вирусы имеют сложные капсиды (аденовирусы, герпесвирусы, парвовирус), а также некоторые вирусы, которые содержат РНК, – пикорнавирус, тогавирусы.
В вирионе со спиральной симметрией молекула нуклеиновой кислоты закручена вместе с капсомерами в тугую спираль. Такой тип симметрии имеют вирусы мозаичной болезни табака, гриппа, кори, эпидемического паротита и др.
Комбинированный тип симметрии наблюдается у некоторых бактериофагов. При этом головка бактериофага имеет кубический тип симметрии, а нуклеопротеид, размещенный в хвосте, заключается спирально.
Форма вирусов может быть самой разнообразной: палочковидная (вирусы мозаичной болезни табака), шаровидная (вирусы бешенства), сферическая (вирусы гриппа, папилломы), кубоидальная (вирусы натуральной оспы), головчастая или сперматозоидная (бактериофаги), нитевидная (вирусы Ебола, вирусы бактерий). На рис представлены основные формы и структуры самых распространенных РНК- и ДНК-геномних вирусов.
Классификация вирусов. В основе современной классификации вирусов лежат признаки, которые характеризуют тип нуклеиновой кислоты, их морфологию, особенности репродукции, антигенные свойства и тому подобное:
((1) Тип нуклеиновой кислоты, ее структура, стратегия репликации
((2) Размер, морфология, симметрия вириона, число капсомеров, наличие суперкапсида.
((3) Наличие специфических ферментов, особенно РНК- и ДНК-полимераз, нейраминидазы
((4) Чувствительность к физическим и химическим агентам, особенно эфиру
((5) Иммунологические свойства
((6) Естественные механизмы передачи
((7) Тропизм к хозяину, его тканям и клеткам
((8) Патология, формирование включений
((9) Симптоматология заболеваний.
По наличию нуклеиновой кислоты их разделяют на ДНК-геномные и РНК-геномные вирусы. Из 71 известного семейства вирусов 20 семейств содержат вирусы, патогенные для человека.
Химический состав вирусов. Вирусы содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая представляет от 1 до 40 % массы вириона. Вирусные геномы содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков. Их масса достигает 10-15 мг, что в 1 млн раз меньше, чем в клетки, а длина – до
Белки вирусов (70-90 % массы вириона) разделяются на структурные и неструктурные. Структурными называют такие белки, которые входят в состав зрелых внеклеточных вирионов. Они выполняют ряд важных функций: защищают нуклеиновую кислоту от внешнего повреждения, взаимодействуют с мембранами чувствительных клеток, и обеспечивают проникновение вируса в клетку, имеют РНК- и ДНК-полимеразну активность и др. Неструктурные белки не входят в состав зрелых вирионов, однако образуются во время их репродукции. Они обеспечивают регуляцию экспрессии вирусного генома, являются предшественниками вирусных белков, способные подавлять клеточный биосинтез. В зависимости от расположения в вирионе, белки разделяются на капсидные, суперкапсидные, матриксные, белки сердцевины и ассоциируют с нуклеиновой кислотой.
Липиды содержатся в сложных вирусах и входят в состав суперкапсидной оболочки, образовывая ее двойной липидный слой. Они стабилизируют вирусную оболочку, обеспечивают защиту внутренних слоев вирионов от гидрофильных веществ внешней среды. Вирусы имеют до 15-35 % липидов. Липопротеиды – комплекс вирусных суперкапсидних белков и липидов клеточной мембраны которые вирусы приобретают при выделении из клетки во время репродукции.
Молекулы углеводов входят в состав гликопротеинов, гликолипидов, достигая 3,5-9 %. Они играют важную роль, обеспечивая защиту соответствующих молекул от действия клеточных протеаз.
Разные группы вирусов имеют неодинаковую стойкость к действию факторов внешней среды. Самые чувствительные к ним вирусы, которые имеют липопротеиновую оболочку. Например, вирусы гриппа, парагриппа, эпидемического паротита инактивируются на поверхностях за несколько часов, однако аденовирусы сохраняют инфекционные свойства несколько дней. Чувствительность вирусов к действию рентгеновского и ультрафиолетового облучения зависит от величины генома вирусов: чем меньший геном, тем резистентней вирус к облучению. Вирусы, которые имеют липопротеидную оболочку, чувствительны к эфиру, хлороформу и дезоксихолату натрию, других растворителей липидов и детергентов.
Важной особенностью вирусов является их чувствительность к концентрации водородных ионов. Часть из них устойчива к кислым значениям рН (2,2-3,0). К ним принадлежат вирусы, которые вызывают кишечные инфекции, проникая в организм алиментарным путем (вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО). Вирусы, которые попадают в организм через верхние дыхательные пути (риновирусы, вирусы гриппа и др.), чувствительные к кислым значениям рН.
Взаимодействие вирусов и клетки. Различают несколько типов взаимодействия. При продуктивной инфекции вирус функционирует в клетке автономно, а его репродукция происходит независимо от репродукции клеточного генетического аппарата. При этом образуется новое поколение инфекционных вирусов.
Если цикл репродукции вирусов блокируется на одной из стадий, а инфекционные вирионы не образуются, такой тип взаимодействия помечают как абортивный.
Когда с клеткой взаимодействуют онкогенные РНК- и ДНК-геномные вирусы (СПИДа, лейкоза), нуклеиновая кислота интегрируется в клеточную хромосому и существует там в виде провируса. В результате может вызываться изменение наследственных свойств клетки. Такой тип взаимодействия называют вирогенией.
Следовательно, вирусы являются особенными инфекционными агентами, которые требуют своеобразных приемов для работы с ними, не сходных с микробиологическими. Вирусологические исследования проводят в специально оборудованных вирусологических лабораториях.
По своей степени опасности для человека вирусы разделяют на четыре группы.
І группа: возбудители лихорадки Єбола, Лакомая, Марбурга, Мачупо, натуральной оспы, а также вирус гепатита В (обезьян).
ІІ группа – арбовирусы, некоторые аренавирусы, вирусы бешенства, вирусы гепатита В и С человека, ВИЧ.
ІІІ группа – вирусы гриппа, полиомиелита, енцефаломиокардита, осповакцины.
ІV группа – аденовирусы, коронавирусы, герпесвирусы, реовирус, онковирусы.
Главное свойство вируса – представить свой геном в клетке-хозяине, для того, чтобы состоялась его экспрессия (трансляция и транскрипция)Репродукция вирусов.
Особенности ее заключаются в том, что геномы представлены как РНК, так и ДНК, они разнообразны по структуре и форме, почти все вирусные РНК способны реплицироваться независимо от ДНК клетки.
Вирусам присущий дизъюнктивный способ репродукции.
Последний заключается в том, что синтез генома и белков вируса разорван в пространстве и времени :
нуклеиновые кислоты реплицируются в ядре клетки, белки – в цитоплазме, а сбор целых вирионов может происходить на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны.
Репродукция вирусов — уникальная система воссоздания чужеридной информации в клетках эукариотов и обеспечивает абсолютное подчинение клеточных структур потребностям вирусов.
В репродукции вирусов выделяют ряд стадий.
К ранним принадлежит адсорбция вирусов на поверхности клетки, проникновения (пенетрации) их внутрь клетки и их раздевание (депротеинизации).
Поздние стадии (стратегия вирусного генома) включают синтез вирусных нуклеиновых кислот, синтез белка, сбор вирионов и выход вирусных частей из клетки.
Прикрепление вирусов к поверхности клетки обеспечивается двумя механизмами: неспецифическим и специфическим.
Неспецифический определяется силами электростатического взаимодействия, которое возникает между химическими группами на поверхности вирусов и клеток, которые несут разные заряды.
Специфический механизм (обратная и необратная адсорбция) предопределяется комплементарными вирусными и клеточными рецепторами. Они могут иметь белковую, углеводную, липидную природу. Например, рецептором для вирусов гриппа является сиаловая кислота. Число рецепторов на участках адсорбции может достигать 3000. На поверхности вирусов рецепторы, как правило, расположенные на дне углублений и щелей.
Проникновение вирусов внутрь клетки происходят по механизму рецепторного эндоцитоза (вариант виропексиса) на специальных участках клеточных мембран, которые содержат особенный блок с высокой молекулярной массой, – клатрин.
Мембраны инвагинуються, и образуется покрытая клатрином внутриклеточная вакуоля. Их число может достигать 2000. Вакуоля, объединяясь, образует рецептосомы, а последние сливаются с лизосомами. Поверхностные белки вирусов взаимодействуют с мембранами лизосом, а их нуклеопротеид выходит в цитоплазму.
Однако существует еще один механизм проникновения вирусов в клетку – индукция слияния мембран. Она происходит благодаря особенному вирусному белку слияния (F – от fusion – слияние).
В результате этого процесса вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а геном его проникает в клетку. Такой белок идентифицирован у вирусов гриппа, парагриппа, рабдовируса и др.
Раздевание вирионов – многоступенчатый процесс, во время которого высвобождается их нуклеиновый аппарат, исчезают защитные оболочки, которые тормозят экспрессию генома. Происходит оно в специализированных участках – лизосомах, аппарате Гольджи.Поздние стадии репродукции направлены на синтез вирусных нуклеиновых кислот и белка.
Механизм репликации (образования вирусных геномов, которые являются точной копией предшественника) зависит от особенностей нуклеиновой кислоты. У разных видов вирусов он неодинаков.
Выделяют 6 основных классов репликации вирусов.
В двунитевых ДНК-содержащих вирусов (герепесвирусы, аденовирусы, вирусы натуральной оспы) сначала происходит деспирализация ДНК и расхождение ее нитей. На одной из них по принципу комплементарности синтезируется новая нить ДНК, на второй – информационная (матричная) РНК (иРНК или мРНК). Этот процесс длится, пока в клетках не образуется достаточное количество нуклеиновых кислот. В однониточных ДНК-геномных вирусов процесс происходит при условии образования промежуточной формы ДНК.
Репликация у вирусов, которые содержат РНК, происходит за подобными закономерностями. На материнской РНК синтезируется иРНК, а матрицей для синтеза вирусного генома служат промежуточные формы РНК.
Существенно отличается от предыдущих механизм репликации ретровирусов (онкорнавируса).
Их процесс репродукции тесно связан с репродукцией клетки-хозяина.
Сначала на РНК-содержащем геноме вируса происходит синтез нити ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Через некоторое время синтезируется комплементарна нить ДНК, которая в дальнейшем интегрирует в геном клетки-хозяина.
В таком состоянии вирус длительное время сохраняется в клетке. Позже эта нить ДНК служит матрицей для образования вирусной РНК.
Транскрипцией называют процесс образования информационных (матричных) РНК.
Она происходит с помощью специальных ферментов, которые называются ДНК- или РНК-зависимой РНК-полимеразой.
У вирусов ДНК эти ферменты клеточного происхождения, а у вирусов РНК – собственные вирусспецифические транскриптазы.
На стадии трансляция происходит считывание генетической информации с матричной РНК и перевод ее в последовательность аминокислот. Происходит процесс в рибосомах. Молекулы РНК продвигаются в рибосомах в соответствии с последовательностью триплетного кода, который распознают транспортные РНК. Последние несут на специальных участках аминокислоты.
Сборка вирионов – не до конца изученный процесс. В его основе лежит возможность специфического распознавания нуклеиновых кислот и вирусных белков при достижении их определенной концентрации. Подсчитано, что для образования одной вирусной части необходимо около 10 тысяч молекул белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот. Простые вирионы складываются на мембранах эндоплазматического ретикулума. У сложных вирусов он начинается в аналогичных участках, а заканчивается на цитоплазматической мембране.
Простые вирусы оставляют клетку, как правило, путем “взрыва”, разрывая ее мембрану.
Сложные вирусы – почкованием. При этом клетка длительное время может оставаться жизнеспособной, пока полностью не истощится, продуцируя вирусных потомков.
Выход вируса иммунодефицита человека из клетки путем почкования
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ВИРУСОВ
A. Фильтрование
B. Седиментация в ультрацентрифуге
C. Наблюдение в электронном микроскопе
Сравнительные размеры:
(1) Staphylococcus имеет диаметр 1000 nm.
(2) Бактериофаги – 10-100 nm.
(3) Диаметр молекулы сывороточного альбумина 5 nm, глобулина – 7 nm, гемоцианин (23 nm).Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций
Лабораторная диагностика вирусных инфекций может осуществляться двумя основными направлениями. Первый – выявление и идентификация вирусов или их компонентов в организме больного (вирусологическая диагностика). Второе направление – выявление специфических противовирусных антител в сыворотке крови (серологическая диагностика). Поскольку антитела появляются не сразу после проникновения вирусов в организм, а потом их титр в течение некоторое время растет, диагностическую ценность имеет определение прироста титра антител. Именно поэтому все иммунологические реакции относятся с парными сыворотками, первая из которых берется у больного в начале заболевания, а вторая – через 2-3 недели. Поскольку применение этого метода практически подтверждает перенесение заболевания, его еще называют ретроспективной диагностикой. Практически для всех вирусных инфекций реакции, которые используются с этой целью, считаются позитивными, если в опыте выявлен четырехкратный и больше прирост титра антител.
Третья группа методов – экспресс-диагностика вирусных инфекций. Использование этих чувствительных и надежных иммунологических тестов позволяет значительно ускорить лабораторную диагностику заболеваний.
Выявление вирусов. Для выделения вирусов, необходимых для дальнейшего их исследования с целью идентификации, очень важно провести правильный забор, быструю транспортировку материала в лабораторию, рациональный выбор тест-системы (куриные эмбрионы, культуры клеток, лабораторные животные).
Во многих случаях исследуемый материал (фекалии, смывы из ротоглотки, носовых ходов и тому подобное) может содержать бактериальную флору, которая при дальнейшем заражении тест-систем будет искажать результаты исследований, включая их гибель. Поэтому в лабораториях используют методы уничтожения бактерий в доставленных образцах. Надежным методом является обработка материала антибиотиками пенициллином и стрептомицином в концентрации 500-1000 ОТ/мл, в случае простых вирусов – эфиром. Допустимым считается использование специальных антибактериальных фильтров или центрифугирование материала при невысоких скоростях. В этом случае бактерии опускаются с осадком на дно. Супернатант подлежит дальнейшему ультрацентрифугуванню, и его потом используют для заражения.
Заражение куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы 6-12-дневного возраста являются удобной моделью для выделения и дальнейшей идентификации вирусов. После заражения их инкубируют в термостате при температуре 36-38 °С в течение нескольких дней.
Существует два способа заражения куриных эмбрионов – открытый и закрытый.
Для выделения вирусов в куриных эмбрионах их можно заражать на хорионалантоисню – оболочку, в алантоисную полость, полость амниона, желточный мешок и тому подобное. При заражении на хорионалантоисную оболочку после снятия скорлупы над воздушным мешком осторожно отслаивают верхний и нижний листки подскарлупной оболочки и наносят материал на соответствующую оболочку.
В алантоисную полость материал вводят закрытым способом через небольшое отверстие в скорлупе на глубину 10-
При заражении в амниотическую полость используют эмбрионы старшего возраста. Заражение можно проводить открытым и закрытым способами. При первом после нахождения хорионалантоисной оболочки в ней делают отверстие, захватывают стерильным пинцетом амниотическую оболочку и вводят материал с вирусами. При закрытом способе вируссодержащий материал вводят на глубину до 20-
Для заражения в желточный мешок используют 3-8-дневные эмбрионы, потому что в них желточный мешок занимает значительную часть полости яйца. Заражение проводят закрытым способом. Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 2-4 суток. Потом их охлаждают к температуре 4 °С в течение одних суток для максимального сужения сосудов. Вскрывают эмбрионы в стерильных условиях, предварительно обработав скорлупу йодом и спиртом. Материал из полостей эмбриона отсасывают стерильным шприцем. В случае необходимости исследуют оболочки и сам эмбрион, которые после вынимания помещают в стерильные чашки Петри.
Некоторые вирусы (натуральной оспы, простого герпеса) имеют характерное цитопатическое действие, которое проявляется образованием особенных бляшек на поверхности хорионалантоисной оболочки. Они выпуклые, имеют мелкие размеры, беловатые. Таким образом, определить наличие вирусов в материале с куриных эмбрионов можно по их цитопатическому действию. Однако большинство вирусов репродуцируются в нем без внешних проявлений поражения. Тогда для индикации вирусов применяют реакцию гемагглютинации. Принцип ее заключается в том, что вирусы способны, адсорбируясь на мембране эритроцитов, вызывать их агглютинацию. Количество вирионов в эмбрионе определяют по титру гемагглютинации – наибольшим разведением материала, при котором еще выявляют склеивание эритроцитов. Титровать вирусы можно также при культивировании их на кусочках хорионалантоисной оболочки. Для этого в стерильные лунки плексигласових пластин вносят кусочки скорлупы, на которой находится невредимая хорионалантоисная оболочка. Потом в этих лунках делают разведение материала, который содержит вирусы. Их закрывают специальными стерильными пластинами из фольги, и культивируют вирусы в течение двух-трех суток при температуре 35-37 °С. Позже в каждую лунку вносят 0,5 % завись эритроцитов курицы и спустя некоторое время при условии наличия вирусов наблюдают выпадение осадка эритроцитов в виде перевернутого зонтика.
Заражение лабораторных животных. Многочисленные лабораторные животные широко используются в вирусологии для выделения и идентификации вирусов, получения специфических противовирусных сывороток, изучения разнообразных аспектов патогенеза вирусных заболеваний, разработки способов борьбы с заболеваниями и их профилактики. Чаще всего используют белых мышей разного возраста, белых крыс, гвинейских свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс, обезьян и других.
Существуют разнообразные способы заражения животных в зависимости от тропизма вирусов: в рот, в дыхательные пути (ингаляционно, через нос), накожный, внутрикожный, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутребрюшинно, внутрисердечный, на скарифицированую роговицу, в переднюю камеру глаза, в мозг.
Для выделения вирусов простого герпеса, натуральной оспы используют заражение лабораторных животных (кроликов) на скарифицированую роговицу глаза. При исследовании вирусов гепатита А вводят исследуемый материал через рот. При выделении вирусов с нейротропными свойствами, таких как арбовирусы, вирусы бешенства, Коксаки целесообразно заражать белых мышей (1-2-дневных сосунков) в мозг. Для этого материал предварительно обрабатывают антибиотиками для деконтаминации от бактерий. Отбирают группу мышей-сосунков (6 штук) и вводят в мозг до 0,02 мл материала немного выше орбитального горба. Животных, которые погибли в течение 24 год после введения материала, бракуют, считая, что их гибель наступила в результате травматических повреждений. За остальными животными наблюдают, выявляют появление клинических признаков заболевание (2-4 недели). Их убивают, придерживаясь правил работы с инфицированными животными, а органы исследуют на наличие вирусов.
Репродукция вирусов в культурах клеток. Этот метод широко используют для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Этому способствовала разработка методов культивирования клеток в условиях in vitro и создание искусственных питательных сред для них, открытия антибиотиков, которые используются для угнетения размножения посторонней микрофлоры и тому подобное. Теперь в любой вирусологической лаборатории есть специальные линии культур клеток, которые высокочувствительные к большинству вирусов, способных вызывать заболевание у человека. К ним принадлежат перепрививаемые культуры клеток HeLa, HЕp – 2, Vero, KB, первично-трипсинизированые культуры эмбрионов человека, почек обезьян, фибробластов эмбриона курицы и тому подобное.
Первично-трипсинизированые культуры клеток получают из любых тканей животного или человека путем их дезинтеграции ферментативной обработкой. Для этого полученные ткани измельчают на небольшие кусочки и доливают к ним 0,25 % раствор трипсина. Дезинтеграцию (разрушение связей между клетками) можно проводить при температуре 37 °С или 4 °С. После этого суспензию центрифугують, полученные клетки помещают в специальные среды, а их количество определяют при подсчете в камере Горяева.
Существенным недостатком таких сред считается их нестандартность, ведь качественный и количественный состав компонентов, которые входят в их состав, может изменяться.
Для получения первично-трипсинизированых культур чаще всего в лабораториях используют почки эмбрионов человека (для выделения вирусов кори, аденовирусов), почки макаки-резус (для выделения полиовируса, аденовирусов, вирусов кори, паротита, гепатита А), почки африканской зеленой обезьяны (культивирование полио-вирусов, тогавирусов, флавивирусов), клеток куриных эмбрионов (культивирование разнообразных арбовирусов), почки эмбриона свиньи (выделения вирусов гриппа, аденовирусов, пикорнавируса, реовируса) и другие.
Одним из недостатков первично-трипсинизированых линий культур клеток есть невозможность длительное время поддерживать их в лабораторных условиях, ведь они способны выдерживать только до 10 пассажей in vitro.
Другой группой культур клеток являются перевиваемые клетки. Они представляют собой культуры клеток, которые приобрели способность к неограниченному росту и размножению. Их получают из злокачественных опухолей или из нормальных человеческих или животных тканей, которые имеют измененный кариотип. Они широко используются в лабораторной практике, поскольку способны быстро и интенсивно размножаться в пробирках и чувствительные ко многим вирусам. Их получают из центральных банков тканевых культур.
Эти культуры выращивают, как правило, в виде однослойных культур, прикрип-лених к поверхности стекла, в специальных матрасах, флаконах или пробирках. Чаще всего используют линии культур клеток HeLa (карцинома шейки матки), HЕp‑2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH (почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой обезьяны), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК-32 (почка сирийского хомяка) и другие.
Для поддержания линий клеток отбирают те из них, которые имеют типичную морфологию, четко отделены одна от другой, не имеют вакуолей и включений.
Третьей группой являются диплоидные клетки. Они представляют собой культуры клеток одного типу, имеют диплоидный набор хромосом и способны выдерживать при этом до 100 пересевов в условиях лаборатории. Они являются удобной моделью для получения вакцинных препаратов вирусов, поскольку свободные от контаминации инородными вирусами, сохраняют исходный кариотип во время пассажей, не имеют онкогенной активности. В то же время они чрезвычайно прихотливые к условиям культивирования, из-за чего их редко используют в практике обычных вирусологических лабораторий. Чаще всего пользуются линиями культур, которые получены из фибробластов эмбриона человека (WI – 38, MRC – 5, MRC – 9, IMR – 90), коров, свиней, овец и другие.
Культуры клеток хранят в замороженном состоянии. Для этого сначала получают монослой клеток 4-6-дневного возраста, а потом суспендируют их в питательной среде, чтобы получить концентрацию клеток до 106 в 1 мл. Для стабилизации клеток в состав среды добавляют 10-20 % сыворотки крови и глицерин. Полученную суспензию разливают в стерильных условиях в ампулы и постепенно замораживают к – 20 °С. Хранят клетки в специальных сосудах с жидким азотом при температуре – 196 °С. Доказано, что при таких условиях жизнеспособность культур клеток не изменяется в течении неопределенного времени. В случае необходимости культуры быстро размораживают, используя водяную баню, при температуре 37-38 °С.
Для заражения тканевых культур используют монослой культуры. Перед заражением их просматривают под микроскопом, отбирают пробирки, где есть красиво сформированный монослой клеток. Для зараження используют 6-8 пробирок и такое же количество хранят для контроля. Непосредственно перед экспериментом меняют питательную среду в пробирках, промывая их раствором Хенкса. Инокулируют в каждую пробирку 0,2 мл исследуемого материала, а потом инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 1-2 год для адсорбции вирусов на поверхности клеток. После этого удаляют материал, опять промывают культуру раствором Хенкса для удаления неприкрепленных вирусов и токсичных субстратов и добавляют питательную среду (среда 199 или среда Игла из 2 % сыворотки крови крупного рогатого скота или гидролизат лактальбумина). Пробирки культивируют в термостате при 37 °С в течение 1-2 недель, постоянно просматривая их и фиксируя результаты.
В результате размножения вирусов в культуре клеток у них возникают дегенеративные изменения, которые обозначаются как цитопатическое действие вирусов (ЦПД). Степень их выражения определяется видом вирусов, их инфицирующей дозой, физиологичными особенностями клеток и тому подобное. В одних случаях эти изменения возникают через несколько дней после заражения (вирусы полиомиелита, ЕСНО, гриппу), в других – через несколько недель и даже месяцев (аденовирусы, вирусы гепатита А). Для заражения чаще используют дозы вирусов, которые равняются 1000-10 000 ЦПД50 (ЦПД50 – такая цитопатическая доза вирусов, которая вызывает дегенеративные изменения в 50 % пробирок, которые содержат зараженные культуры клеток).
Выявлять вирусы в культуре тканей можно по феномену бляшкообразования. В последнее время исследуют образование бляшек под бентонитовым питательным покрытием. Предварительно готовят десятикратные разведения исследуемого материала, которым заражают соответствующие культуры клеток. После 30-минутной инкубации их отмывают стерильным фиpозчином и заливают бентонитовым покрытием, которое содержит бентонитовый гель, раствор Эрла, нативную бычью сыворотку, гидрокарбонат натрия, дистиллированную воду и растворы антибиотиков для угнетения посторонней микрофлоры. Адсорбируясь на поверхности клеток, бентонит предоставляет монослой клеток молочного цвета. В результате такого покрытия репродукция вирусов ограничивается только первично инфицированными клетками, а ЦПД проявляется формированием очагов клеточной дегенерации в виде бляшек.
По морфологическим изменениям в культуре клеток можно выделить несколько типов проявления цитопатического действия. Ее особенности позволяют провести предварительную диагностику заболевания.
При полной дегенерации клеточного монослоя наблюдаются изменения в подавляющем большинстве клеток. Они погибают, отделяются от стекла. Отдельные клетки, которые остаются живыми, изменяют свою морфологию, в них заметный пикноз ядра и цитоплазмы. Такой тип действия свойственный пикорнавирусу – вирусам полиомиелита, Коксаки, ЕСНО. Для частичной дегенерации не характерное отделение всех клеток от стекла.
Для возбудителей кори, эпидемического паротита, парагриппа, респираторно-синци-тиальних вирусов характерный симпластобразующий тип ЦПД. При этом возникают многоядерные гигантские клетки (симпласты или синцитий). Аденовирусы вызывают образования скоплений больших округлых клеток, которые напоминают гроздья (округлоклеточную дегенерацию). При репродукции риновирусов образуются округлые клетки, которые имеют отростки, а при размножении герпесвирусов наблюдается формирование подобных клеток одинакового размера, которые разбросаны по всему монослою. Онкогенные вирусы стимулируют клеточную пролиферацию (пролиферативный тип изменений), при которой наблюдается формирование нескольких слоев клеток.
Отдельные вирусы (вирусы краснухи, крымской геморрагической лихорадки) не способны вызывать видимых дегенеративных проявлений со стороны клеток. В таких случаях для их выявления используют феномен интерференции, при котором клеточные культуры параллельно заражают другими вирусами, способными вызывать ЦПД.
Степень выражения дегенеративных изменений оценивают по чотири-плюсовой системе: (4+) – значит, что происходит деструкция всех клеток, (3+) – в 75 % их, (2+) – в 50 %, (+) – до 25 % клеток, (+) – ЦПД проявляется в отдельных клетках.
Достаточно часто как проявление цитопатического действия вирусы образуют внутриклеточные включения. Они могут локализоваться как внутриядерно, так и в цитоплазме клеток. Их образование, форма, величина, наличие у них вирусных нуклеиновых кислот является важным моментом при проведении вирусологической диагностики заболеваний. Такие включения образуют вирусы бешенства (тельца Бабеша-Негри), натуральной оспы (тельца Гварниери), простого герпеса (тельца Липшютца), аденовирусы, вирусы гриппа и другие.
Включения выявляют при световой микроскопии, окрашивая препараты с помощью метода Романовського-Гимзы. С этой целью культуры клеток сначала выращивают на специальных стеклянных пластинках или пластинках из прозрачной слюды. Позже, после получения монослоя клеток, их заражают исследуемым материалом, который содержит вирусы, и спустя некоторое время окрашивают полученные культуры.
Часто для выявления включений используют метод иммунофлуоресценции. Часто для выявления внутриядерных или внутрицитоплазматических включений используют отпечатки тканей или органов, соскоб клеток или гистологические срезы из тканей погибших.
