Методическое указание для студентов

Методическое указание для студентов

(медицинский факультет)

 

ЗАНЯТИЕ № 5 (практическое – 6 часов)

 

ТЕМЫ: 1. Аминокислотный состав белков и пептидов. Хроматографическое распределение аминокислот.

2. Гидролиз простого белка. Реакции осаждения белков.

3. Определение содержимого общего белка в сыворотке крови.

 

ЦЕЛЬ: Уметь качественно определять белок и аминокислоты в растворе и объяснять его строение в связи с химическими и биологическими свойствами; выполнять гидролиз простого белка; проанализировать аминокислотный состав гидролизата с помощью распределительной хроматографии на бумаге; провести осаждение белков и определять общее количество белка в сыворотке крови.

 

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

Белки выполняют в организме ряд важных функций, одной из которых есть пластическая. Они являются строительным материалом для клеток и тканей. Врачебная и пищевая ценность белковых препаратов зависит от их аминокислотного состава. Гидролизате белков разной природы, а также смесь определенных аминокислот используются как врачебные препараты для парентерального питания. Контроль за их качеством базируется на количественном определении общего и аминного азота, на качественном и количественном анализе отдельных аминокислот.

Хроматографический метод определения свободных аминокислот широко применяют в клинико-биохимических лабораториях для диагностики отдельных заболеваний; в фармации – для контроля за качеством и количеством фармпрепаратов (индивидуальных аминокислот, белковых гидролизатов и врачебных веществ, которые состоят из смеси аминокислот).

 

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

1. Классификация, строение и отдельные представители аминокислот (курс химии средней школы).

2. Биологическая роль, строение и структура белков (курс химии средней школы).

 

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ СТУДЕНТОВ

И. Аминокислотный состав белков и пептидов. Хроматографическое распределение аминокислот.

1.              Биологическая роль и классификация аминокислот.

2.              Строение аминокислот. Амфотерность.

3.              Химические свойства аминокислот:

а) декарбоксилирование

б) дезаминирование

в) взаимодействие с кислотами

г) взаимодействие с основами

4.              Качественные реакции на отдельные аминокислоты:

а) нингидриновая реакция;

б) ксантопротеиновая реакция;

в) выявление карбоксильных и аминогрупп в глицине;

г) Фоля;

    д) Адамкевича

5.              Аминокислотный состав белков, методы его исследования.

6.              Виды хроматографии (адсорбционная, распределительная, ионообменная, афинная, гель-хроматография), их суть.

7.              Хроматография восходящая, нисходящая, радиальная, одномерная, двохмерная.

8.              Принцип распределительной хроматографии на бумаге.

9.              Значение метода хроматографии в медицине и фармации.

ІІ. Гидролиз простого белка. Реакции осаждения белков.

1.              Общая характеристика белков (химический состав и физико-химические свойства).

2.              Функции белков в организме.

3.              Структурная организация белков.

4.              Первичная структура белка, методы ее определения (метод Сенджера, Едмана, секвенации).

5.              Выучить все альфа-аминокислоты, уметь писать полипептиды.

6.              Вторичная, третичная, четвертичная структуры белка (определения, примеры). Доменные белки.

7.              Типы связей, которые образовывают структурные уровни белковой молекулы: водородная, дисульфидная,  гидрофобная, ионная.

8.              Методы определения вторичной, третичной и четвертичной структур белка.

9.              Влияние разных физико-химических факторов (рН среды, температуры, радиации и др.) на структуру и свойства белков.

10.          Строение и состав ссложных белков: фосфопротеинов, липопротеинов, нуклеопротеинов, гликопротеинов, хромопротеинов, их биологическая роль.

11.          Молекулярная масса белков, методы ее определения.

12.          Растворимость белков и факторы, которые влияют на этот процесс.

13.          Факторы стабилизации белковой молекулы в растворе.

14.          Методы осаждения белков из раствора.

15.          Высаливание белков. Факторы, которые вызывают оборотное осаждение, суть их действия.

16.          Денатурация белков. Факторы, которые вызывают необоротное осаждение, суть их действия.

17.          Что такое ренатурация белков?

18.          Значение реакций осаждения белков в медицине и фармации.

19.          Как используются физико-химические свойства белков при получении и очищении белковых фармпрепаратов?

 

ІІІ. Определение содержимого общего белка в сыворотке крови.

1.              Основные белки плазмы крови, их физико-химические свойства и функции.

2.              Белки как врачебные препараты.

3.              Причины и следствия изменения содержимого общего белка плазмы крови.

4.              Принцип биуретового и рефрактометрического методов определения содержимого общего белка в сыворотке крови.

5.              Клинико-диагностическое значение определения общего белка в сыворотке крови.

 

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ ( 9⁰⁰ – 12⁰⁰)

И. Аминокислотный состав белков и пептидов. Хроматографическое распределение аминокислот.

Работа 1. Выявления a-аминокислот в реакции с нингидрином.

Белки, полипептиды и свободные a-аминокислоты дают с нингидрином синюю или фиолетовую окраски. Реакция характерная для аминогруп, которые находятся в a-положении и используется для выявления a-аминокислот, разделенных хроматографическим методом.

Принцип реакции.

При нагревании белка с водным раствором нингидрина a-аминокислоты образовывают соединения синей или фиолетовой окраски.

 

В пробирку поместить 4 капли 1%-ного раствора глицина и прибавить 2 капли 0,1%-ного раствора нингидрина. Содержимое пробирки осторожно нагреть. Наблюдаем появление розово-фиолетовой окраски, которое с течением времени изменяется на синее.

 

Работа 2. Выявление карбоксильних групп в глицине.

В пробирку поместить 5 капель 1% раствора глицина и прибавить 1 каплю метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). Прибавить 5 капель формалина. Появится красная окраска (кислая среда). Эта реакция используется для количественного определения карбоксильных групп (формольное титрование) в a-аминокислотах.

 

Работа 3. Выявление аминогрупп в глицине.

В пробирку поместить 5 капель 1%-ного раствора глицина и 5 капель 5%-ного раствора нитрата натрия. Прибавить 2 капли концентрированной уксусной кислоты. Осторожно встряхнуть смесь. Наблюдается выделения газа (N₂). Реакцию используют для количественного определения аминогрупп в аминокислотах.

 

Работа 4. Выявления ароматических аминокислот ксантопротеиновой реакцией.

Ксантопротеиновая реакция характерная для ароматических аминокислот: тирозина, триптофана, фенилаланина. Желтая окраска наблюдается в случаях, когда концентрированная азотная кислота попадает на кожу, ногти, которые в большом количестве содержат эти аминокислоты.

Принцип реакции

Реакция обусловлена нитрированием бензольного кольца циклических аминокислот и образованием нитросоединений желтого цвета, который при добавлении аммиака переходит в оранжевый.

Ход работы.

В пробирку вносят 5 капель 1% раствора тирозина или яичного белка прибавляют 1 каплю концентрированной азотной кислоты. Смесь нагреть к появлению желтого цвета. Пробирку охладить и прибавить по каплям водный раствор аммиака к появлению оранжевой окраски.

 

Работа 5. Выявления серосодержащих аминокислот в белке реакцией Фоля.

Реакция Фоля открывает серосодержащие аминокислоты цистин и цистеин. Метионин этой реакции не дает потому, что сера в нем связанная метильною группой.

Принцип реакции

В процессе кипячения белка с щелочью от цистеина и цистина легко отцепляется сера в виде сероводорода, который с ацетатом свинца образовывает осадок сернистого свинца черного или серого цвета.

Ход работы

В пробирку вносят 3-5 капель 1% раствора яичного белка и прибавляют 5 капель 30% раствора едкого натрия и одну каплю 10% раствора ацетата свинца (или реактива Фоля). Нагревают и наблюдают за появлением черной или серой окраски.

 

Работа 6. Выявление триптофана в белке (реакция Адамкевича).

Реакция Адамкевича есть характерной для белков в молекуле которых содержится аминокислота триптофан или других соединений, которое содержит в своем составе индольное кольцо.

Принцип реакции

Добавление к раствору триптофана концентрированной уксусной и серной кислот приводит к образованию красно-фиолетового кольца.

В пробирку поместить 2-3 капли раствора белка, прибавить 1-2 капли концентрированной уксусной кислоты и осторожно по стенке внести 2-3 капли серной кислоты. Спустя некоторое время на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо.

 

Работа 7. Выявления пептидной связи в белке биуретовой реакцией.

В пробирку поместить 5 капель яичного белка, прибавить равный объем 10% раствора гидроксида натрия и 1-2 капли раствора сульфата меди. Наблюдаем появление красно-фиолетовой окраски.

 

Работа 8. Проделать реакции обратного осаждения альбуминов и глобулинов

Высаливание – это обратная реакция осаждения белков большими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов. Для высаливания чаще всего применяются такие соли: (NH₄)₂SO₄, NаСI, Nа₂SO₄, MgSO₄. При этих условиях белки, которые осаждаются, не испытывают глубокие структурные изменения и их осадки можно снова растворить в исходном растворителе, а молекула белка сохраняет свои предыдущие нативные свойства.

К обратным реакциям осаждения принадлежат реакции осаждения белков органическими растворителями ( спиртом, ацетоном) при условиях непродолжительного действия и низкой температуры.

Метод высаливания широко используется для фракционирования смеси белков, когда надо отделить один белок от другого (например, альбумины от глобулинов). Грубодисперсные белки-глобулины висаливаются значительно легче, чем альбумины полунасыщенным раствором сернокислого аммония, тогда как альбумины – насыщенным раствором.

Принцип метода

Реакция высаливания обусловленная дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией его электрического заряда.

Ход работы

В пробирку наливают 2-3 мл сыворотки крови, прибавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадают глобулины, которые имеют относительно большую молекулярную массу и небольшой заряд. Осадок отфильтровывают. В фильтрат, в котором остались альбумины, насыпают кристаллический сульфат аммония до тех пор, пока соль перестанет растворяться. Наблюдают выпадение в осадок альбуминов (100% насыщение), которые имеют относительно небольшую молекулярную массу и большой заряд. Осадок альбуминов отфильтровывают. Фильтрат проверяют на отсутствие белков с помощью биуретовой реакции. Осадки альбуминов и глобулинов на фильтре растворяют в 3-5 мл воды, чтобы убедиться, что высаливание носит обратный характер.

 

Работа 9. Провести необратимое осаждение (денатурацию) белков под влиянием солей тяжелых  металлов, концентрированных кислот, алкалоидных реактивов, высокой температуры.

 

 Осаждение солями тяжелых  металлов

Принцип метода

Соли тяжелых металлов (меди, свинца, серебра, ртути) осаждают белки из растворов, образовывая солеподобные и комплексные соединения, которые растворимые в избытке этих солей, но нерастворимые в воде.

Это объясняется тем, что излишек ионов металла, адсорбируясь, служит причиной перезарядки белкового комплекса, вследствие чего в раствор переходит комплекс измененного белка с металлом. Это явление называется адсорбционной пептизацией.

Свойство белка крепко связывать ионы тяжелых  металлов в виде нерастворимого осадка в воде используется при отравлении солями ртути, меди, свинца и т.п.. Рекомендуют сразу же после отравления употреблять белки молока или яиц, пока эти соли находятся еще в желудке и не успели всосаться. После чего в больного вызывают рвоту, чтобы вывести яд.

Ход работы

В три пробирки вносят по 5 капель 1% раствора яичного белка. Прибавляют в первую пробирку 2-3 капли 5% раствора сульфата меди; в другую – 2 капли раствора ацетата свинца, в третью – 1-2 капли 5% раствора нитрата серебра. Во всех пробирках получается осадок, нерастворимый в воде. Если потом в первую пробирку прибавить 5-10 капель 1% раствора сульфата меди наблюдают растворение бледно-голубого осадка в излишке реактива. Во второй пробирке, когда прибавить 5-10 капель 5% раствора ацетата свинца, осадок растворяется тоже. Если в третью пробирку добавить 5-10 капель 5% раствора серебра, то растворения осадка не происходит.

 

Осаждения концентрированными органическими и минеральными кислотами

Принцип метода

При действии на белок концентрированных минеральных и органических кислот происходит денатурация белка вследствие дегидратации и образование комплексных солей белка с кислотами.

В излишке всех минеральных кислот, кроме азотной, осадок белка растворяется. Поэтому реакция осаждения концентрированной азотной кислотой лежит в основе количественного определения белка за методом Робертса-Стольникова-Брандберга.

 

А.Осаждение минеральными кислотами.

а) Осаждение азотной кислотой (проба Геллера)

Ход работы

На 1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно наслаивают 1 мл раствора 1% раствора белка. На границе раздела двух жидкостей получается осадок в виде белого кольца.

б)Осаждение серной кислотой.

Ход работы

До 1% мл раствора яичного белка осторожно по стенке пробирки прибавляют несколько капель концентрированной серной кислоты. Выпадает осадок.

 

Б. Осаждение органическими кислотами: трихлоуксусной и сульфосалициловой кислотами

Ход работы

В две пробирки вносят по 1 мл раствора белка в первую прибавляют 1 мл 20 % раствора сульфосалициловой, а в другую – 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

Осаждения белков с помощью трихлоруксусной кислоты применяют для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови), так как она осаждает только белки. Сульфосалициловую кислоту используют для качественного определения белка в моче.

 

В. Осаждение белков алкалоидными реактивами

Растворы белков могут образовывать осадки при взаимодействии с алкалоидными реактивами (танином, пикриновой кислотой, гексоцианофератом калия, фосфорновольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислотами). Это свойство белков к осаждению алкалоидными реактивами объясняется наличием азотистых групп как в белках, так и в алкалоидах.

Принцип метода

Осаждение белков алкалоидными реактивами объясняется образованием нерастворимых солеподобных комплексов с основными азотистыми группами. В этих соединениях белок есть катионом, а алкалоидный реактив – анионом, поэтому осаждать белки необходимо в кислой среде (частички белков перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадок растворяется.

Ход работы

В три пробирки наливают по 1 мл 1% раствора яичного белка, прибавляют по 0,5 мл 1% раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую – 10% раствора пикриновой кислоты, в другую – насыщенного раствора танина, в третью – 1% раствора красной кровяной соли. Во всех пробирках выпадает осадок.

Вяжущие врачебные препараты в состав которых входит танин, вызывают слабую денатурацию белков на поверхности слизистой оболочки или кожи при воспалительных процессах, которые создает своеобразную биологическую повязку и оказывает содействие заживлению.

Г. Денатурация белков под влиянием высокой температуры

Большинство белков животного происхождения при нагревании до 45-55⁰ С коагулируют.

Принцип метода

Это явление объясняется тем, что высокая температура разрушает гидрофобные и водородные связи. Происходит перестройка структуры белковой молекулы. Белок теряет свои нативные свойства и растворимость.

Реакция денатурации перебегает постепенно и ускоряется с повышением температуры, поэтому кратковременное нагревание может и не привести к коагуляции.

Наиболее полная и быстрая коагуляция имеет место в изоэлектрической точке. Некоторые белки, в составе которых много дисульфидных связей, стойких к высокой температуре, способные к ренатурации и не теряют своей структуры и функциональной активности после прекращения действия высокой температуры (ферменты трипсин и рибонуклеаза).

Ход работы. В пробирку вмещают 1 мл раствора белка, нагревают и наблюдают за образованием осадка.

 

III. Определение содержимого общего белка в сыворотке крови.

 

Работа 10. Определить концентрацию белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом

Принцип метода

Метод рефрактометрии основан на неодинаковой способности разных сред преломлять луч света, который проходит через них. Отношения синуса угла падения света к синусу угла преломления есть постоянной величиной и называется показателем преломления:= sin ( / sin (

Величина показателя преломления сыворотки крови зависит главным образом, от содержимого в ней белка. Другие составные части сыворотки крови мало влияют на степень рефракции. Для определения показателя преломления используют специальные приборы – рефрактометры.

Исследуемый материал, реактивы, оснащения

Сыворотка крови, дистиллированная вода, рефрактометр, пипетки.

Ход работы:

Пользуясь таблицей , определяют содержимое белка в сыворотке крови.

Таблица 2. Определение содержимого белка за показателем преломления

 

СЕМИНАРСКОЕ ОБСУЖДЕНИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ВОПРОСОВ (12³⁰ – 14⁰⁰)

Образцы тестовых задач и ситуационных задач.

И.Тестовые задачи.

1. Гистидин – α-аминокислота, которая входит в состав белков. Производным которого гетероцикла есть гистидин:

A.            Индола;               

B.             Пирана;      

C.             Имидазола;

D.            Пиримидина;       

E.             Пиридину;

2. Которые из нижеперечисленных аминокислот есть кислыми:

A.            Тирозин, фенилаланин;

B.             Аспарагиновая и глутаминовая аминокислоты;

C.             Аспарагиновая кислота и глицин;

D.            Глутаминовая кислота и глицин;

E.             Метионин, триптофан.

3. Выбрать верный ответ. Белки это:

A.            Органические соединения, производные углеводородов, которые имеют в своем составе карбоксильну группу

B.             Биоорганические высокомолекулярные соединения, сложного строения, построенные из остатков α-L-аминокислот, которые соединены амидными (пептидными) связями;

C.             Соединения, которые имеют циклическое строение молекулы

D.            Соединения, к которым входят несколько гидроксильных групп

E.             Производные ароматических углеводородов

4. Высаливание – это оборотное осаждение белков из раствора под действием:

A.            Солей тяжелых металлов

B.             Концентрированных минеральных кислот

C.             Насыщенных и полунасыщенных солей щелочных и щелочноземельных металлов.

D.            Алкалоидов

E.             Высокой температуры

 

 

ІІ. Ситуационные задачи

1.              Раствор дает положительную ксантопротеиновую реакцию. Что содержит данный раствор?

2.              В пробирке отмечена положительнуя нингидриновая реакция. Какие аминокислоты преобладают в растворе?

3.              Раствор дает положительную реакцию Фоля. Какие аминокислоты преобладают в растворе?

4.              Раствор, который содержится в пробирке, дает положительную биуретовую реакцию и Адамкевича. Что содержит данный раствор?

 

Ответа на тесты и ситуационные задачи.

И.Тестовые задачи.

1. C; 2. B; 3. В; 4.С.

ІІ. Ситуационные задачи

1.              Ароматические аминокислоты;

2.              a-аминокислоты;

3.              Серосодержащие аминокислоты;

4.              Белок, которые содержит триптофан (или другие соединения, к которых входит производные индола);

 

 

Исходный уровень знаний и умений

 

Студент должен знать:

1.              Структуру пептидов и белков, их свойства.

2.              Методы качественного определения белка и аминокислот.

3.              Строение белка, структурная организация.

4.              Типы связей в молекуле белка.

5.              Исследовательские приемы аминокислотного состава белков.

 

Студент должен уметь:

1.               С помощью цветных качественных реакций исследовать аминокислотный состав белков и их гидролизатов.

2.              Выполнить гидролиз простого белка.

3.              Определить аминокислотный состав белков хроматографическим методом.

4.              Определить содержимое белка в сыворотке крови.

 

Источники информации:

Основные:

1. http://intranet.tdmu.edu.ua/ В помощь студентам/Материалы для подготовки студентов к практическим занятиям/Кафедра общей химии/биологическая и биоорганическая химия/ медицинский факультет/ 1 курс/русский/№05.Белки

2. http://intranet.tdmu.edu.ua/ В помощь студентам/Презентации лекций/Кафедра общей химии/ русский /медицинский факультет/ 1 курс/ биологическая и биоорганическая химия /№05. Аминокислоты. Пептиды. Белки.

3. Биоорганическая химия: учеб. для вузов /Н. А. Тюкавкина, Ю. И. Бауков. – 3-е изд. перераб. и доп. – М.: Дрофа, 2004. – С.314-369

4. Артёмова Э. К. Основы обшей и биоорганической химии: учебное пособие / Э. К. Артёмова, Е. В. Дмитриев. – М.: КНОРУС, 2011. – С. 141-163.

 

Дополнительные:

1. Черных В.П. и др., Органическая химия, книга2, Харьков, Основа, 1995, с.358-371, 383-395.

2. Черных  В.П.  и  др. “Органическая  химия”.  Книга3.  Харьков. “Основа”, 1997, с.196-233.

 

 

Методическое указание составила: доц. Кирилив М.В..

 

Обсуждено и утверждено на заседании кафедры

„” июня 2013 р.  протокол №