Аминокислотный состав белков и пептидов. Хроматографическое распределение аминокислот. Гидролиз простого белка. Реакции осаждения белков. Определение содержимого общего белка в сыворотке крови

 

Аминокислоты – органические бифункциональные соединения, в состав которых входят карбоксильные группы –СООН и аминогруппы -NH₂.

Аминокислоты классифицируют по двум структурным признакам.

1.              В зависимости от взаимного расположения амино– и карбоксильной групп аминокислоты подразделяют на a-, b-, g-, d-, e– и т. д.

2.              По характеру углеводородного радикала различают алифатические (жирные) и ароматические аминокислоты. Приведенные выше аминокислоты относятся к жирному ряду. Примером ароматической аминокислоты может служить пара-аминобензойная кислота:

 

Номенклатура аминокислот

 

По систематической номенклатуре названия аминокислот образуются из названий соответствующих кислот прибавлением приставки амино– и указанием места расположения аминогруппы по отношению к карбоксильной группе.

Например:

Часто используется также другой способ построения названий аминокислот, согласно которому к тривиальному названию карбоновой кислоты добавляется приставка амино– с указанием положения аминогруппы буквой греческого алфавита. Пример:

Для a–аминокислот R-CH(NH₂)COOH, которые играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности животных и растений, применяются тривиальные названия.

Таблица. Важнейшие α– аминокислоты

 

 

Аминокислоты в зависимости от поступления в организм делятся на заменимые и незаменимые.

В таблице указаны незаменимые аминокислоты , присутствие которых в белках пищи обязательно; частично заменимые аминокислоты , которые в небольших количествах синтезируются в организме; условно заменимые аминокислоты, для синтеза которых необходимы незаменимые аминокислоты и, наконец, заменимые аминокислоты , потребность в которых может быть восполнена синтезом из других веществ.

Аминокислотный состав характеризует пищевую ценность белка . Чем выше содержание незаменимых аминокислот, тем больше пищевая ценность белка. Норма белков в питании составляет примерно 100 г в сутки .

Недостаток в течение длительного времени пищевых белков, богатых незаменимыми аминокислотами, приводит к заболеванию. Чтобы восполнить недостающие аминокислоты, ткани начинают гидролизовать свои собственные белки с помощью тканевых протеиназ. В результате у детей проявляется нарушение развития и функций организма. Белки тканей гидролизуются и в норме с целью их обновления, но процесс гидролиза и синтеза белков тканей в этом случае уравновешены.

 

Свойства аминокислот

Физические свойства.

Аминокислоты – твердые кристаллические вещества с высокой температурой плавления. Хорошо растворимы в воде, водные растворы электропроводны. Эти свойства объясняются тем, что молекулы аминокислот существуют в виде внутренних солей, которые образуются за счет переноса протона от карбоксила к аминогруппе:

Химические свойства.

 

Аминокислоты проявляют свойства оснований за счет аминогруппы и свойства кислот за счет карбоксильной группы, т.е. являются амфотерными соединениями. Подобно аминам, они реагируют с кислотами с образованием солей аммония:

H₂N–CH₂–COOH + HCl ® [H₃N⁺–CH₂–COOH] Cl^–

 

Как карбоновые кислоты они образуют функциональные производные:

а) соли

H₂N–CH₂–COOH + NaOH ® H₂N–CH₂–COO^– Na⁺ + H₂O

б) сложные эфиры

Ряд важных химических реакций a–аминокислот осуществляэтся в организме под действием различных ферментов, но с участием одного и того же кофермента пиридоксальфосфата.

Декарбоксилирование – путь образования биогенных аминов из a–аминокислот.

	декарбоксилаза	+        амин

Биогенные амины в организме выполняют важные биологические функции. Например, при декарбоксилировании гистидина получается биогенный амин – гистамин – обладает широким спектром биологического действия и имеет отношение к аллергическим реакциям организма.

Дезаминирование — это превращение аминокислот в соответствующие a —кетокислоты в результате отщепления аминогруппы в виде аммиака. Реакция сопровождается окислением, поэтому называется окислительным дезаминированием . Наиболее широко распространенной реакцией является окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты, катализируемое NAD—зависимой дегидрогеназой:

Например при окислительном дезаминировании a–глутаминовой кислоты образуется a–оксоглутаровая кислота

 

В лабораторных условиях дезаминирование осуществляется азотистой кислотой. При етом образуется соответствующая a–гидроксикислота и выделяется газообразный азот, по объему которого судят о количестве вступившей в реакцию a-аминокислоты (метод Ван-Слайка).

 

Трансаминирование — основной путь биосинтеза a–аминокислот из a–оксокислот. Донором аминогуппы служит a–аминокислота, а ее акцептором a–оксокислота. a-аминокислота при этом превращается в a–оксокислоту, а a–оксокислота – в a-аминокислоту с соответствующим строением радикалов.

 

a– аспарагиновая кислота                           a– оксоглутаровая кислота

          щавелеуксусная кислота                                      a– глутаминовая кислота

Межмолекулярное взаимодействие a–аминокислот приводит к образованию пептидов. При взаимодействии двух a–аминокислот образуется дипептид.

Межмолекулярное взаимодействие трех a–аминокислот приводит к образованию трипептида и т.д.

Фрагменты молекул аминокислот, образующие пептидную цепь, называются аминокислотными остатками, а связь CO–NH – пептидной связью.

 

Качественные реакции

Нингидриновая реакция.

Все свободные a–аминокислоты дают с нингидрином синюю или фиолетовую окраски. Реакция характерная для аминогруп, которые находятся в a–положении и используется для выявления a-аминокислот.

Ксантопротеиновая реакция

Используется для обнаружения ароматических и гетероциклических a–аминокислот (фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан). При действии концентрированой азотной кислоты на эти аминокислоты образуется нитросоединение окрашенное в желтый цвет. При добавлени к нему щелочи окраска становится оранжевой.

Реакция Фоля

Реакция используется для обнаружения сере содержащих аминокислот. При нагревании раствора белка с ацетатом свинца (СН₃СОО)₂Pb в щелочной среде образуется черный осадок сульфида свинца PbS, что указывает на присутствие в белках цистеина.

Реакция Адамкевича

Можно определить с помощью этой реакции триптофан. При добавлении к раствору белка концентрированой уксусной и серной кислот образуется красно-фиолетовое кольцо на границе соединения жидкостей.

Биуретовая реакция.

Используется для обнаружения пептидных связей в пептидах и белках. При добавлении к раствору белка гидроксида меди образуется красно-фиолетовая окраска.

 

Белки

Живой организм характеризуется высшей степенью упорядоченности составляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей как его фенотипические признаки, так и многообразие биологических функций. В этом структурно-функциональном единстве организмов, составляющем сущность жизни, белки (белковые тела) играют важнейшую роль, не заменяемую другими органическими соединениями.

Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название «протеины» (от греч. protos – первый, важнейший), по-видимому, более точно отражает первостепенное биологическое значение этого класса веществ. Принятые в отечественной литературе термины «белки» и «белковые вещества» связаны с обнаружением в тканях животных и растений веществ, имеющих сходство с белком куриного яйца. В наше время, когда абсолютно достоверно установлено, что наследственная информация сосредоточена в молекуле ДНК клеток любых живых организмов, не вызывает сомнения, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых реализуется генетическая информация. Без белков, в частности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может самовоспроизводиться, т.е. лишена способности передавать генетическую информацию.

Живая природа характеризуется рядом свойств, отличающих ее от неживой природы, и почти все эти свойства связаны с белками. Прежде всего для живых организмов характерны широкое разнообразие белковых структур и их высокая упорядоченность; последняя существует во времени и пространстве. Удивительная способность живых организмов к воспроизведению себе подобных также связана с белками. Сократимость, движение – непременные атрибуты живых систем – имеют прямое отношение к белковым структурам мышечного аппарата. Наконец, жизнь немыслима без обмена веществ, постоянного обновления составных частей живого организма, т.е. без процессов анаболизма и катаболизма (этого удивительного единства противоположностей живого), в основе которых лежит деятельность каталитически активных белков – ферментов.

Таким образом, белки (белковые вещества) составляют основу и структуры, и функции живых организмов. По образному выражению одного из основоположников молекулярной биологии Ф. Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом. Подсчитано, что в природе примерно 10¹⁰–10¹² различных белков, обеспечивающих существование около 10⁶ видов живых организмов различной сложности организации начиная от вирусов и кончая человеком. Из этого огромного количества природных белков известны точное строение и структура ничтожно малой части (см. далее). Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде над- и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.

В клетке Е.coli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается более 100000 разнообразных белков. Самое удивительное, что все природные белки состоят из небольшого числа сравнительно простых структурных блоков, представленных мономерными молекулами – аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому они могут образовывать громадное количество разнообразных белков. Число изомеров, которое можно получить при всевозможных перестановках указанного числа аминокислот в полипептиде, исчисляется огромными величинами. Так, если из 2 аминокислот возможно образование только двух изомеров, то уже из 4 аминокислот теоретически возможно образование 24 изомеров, а из 20 аминокислот – 2,4•10¹⁸ разнообразных белков.

Нетрудно предвидеть, что при увеличении числа повторяющихся аминокислотных остатков в белковой молекуле число возможных изомеров возрастает до астрономических величин. Ясно, что природа не может позволить случайных сочетаний аминокислотных последовательностей и для каждого вида характерен свой специфический набор белков, определяемый, как теперь известно, наследственной информацией, закодированной в молекуле ДНК живых организмов. Именно информация, содержащаяся в линейной последовательности нуклеотидов ДНК, определяет линейную последовательность остатков аминокислот в полипептидной цепи синтезируемого белка. Образовавшаяся линейная полипептидная цепь сама теперь оказывается наделенной функциональной информацией, в соответствии с которой она самопроизвольно преобразуется в определенную стабильную трехмерную структуру. Таким образом, лабильная полипептидная цепь складывается, скручивается в пространственную структуру белковой молекулы, причем не хаотично, а в строгом соответствии с информацией, содержащейся в последовательности аминокислотных остатков. Учитывая ведущую роль белков в живой природе и тот факт, что белки, составляя почти половину сухой массы живого организма, наделены удивительным разнообразием функций, изучение курса биохимии в медицинских высших учебных заведениях обычно начинают с этого класса органических веществ.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных для живых организмов, с некоторыми из которых мы познакомимся более подробно при дальнейшем изучении курса. Ниже рассматриваются главные и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, несвойственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.

Каталитическая функция. К 1995 г. было идентифицировано более 3400 ферментов. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химических реакций в биологических системах.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы-мишени.

Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию. В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохраняющий от потери крови при ранениях.

Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин – специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).

Структурная функция. Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в частности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.

Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разнообразными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормоны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во многих других клетках организма (см. далее). Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др. Некоторые гормоны являются производными аминокислот.

Питательная (резервная) функция. Эту функцию выполняют так называемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы метаболизма.

Можно назвать еще некоторые другие жизненно важные функции белков. Это, в частности, экспрессия генетической информации, генерирование и передача нервных импульсов, способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.

Таким образом, из этого далеко не полного перечня основных функций белков видно, что указанным биополимерам принадлежит исключительная и разносторонняя роль в живом организме. Если попытаться выделить главное, решающее свойство, которое обеспечивает многогранность биологических функций белков, то следовало бы назвать способность белков строго избирательно, специфически соединяться с широким кругом разнообразных веществ. В частности, эта высокая специфичность белков (сродство) обеспечивает взаимодействие ферментов с субстратами, антител с антигенами, транспортных белков крови с переносимыми молекулами других веществ и т.д. Это взаимодействие основано на принципе биоспецифического узнавания, завершающегося связыванием фермента с соответствующей молекулой субстрата, что содействует протеканию химической реакции. Высокой специфичностью действия наделены также белки, которые участвуют в таких процессах, как дифференцировка и деление клеток, развитие живых организмов, определяя их биологическую индивидуальность.

 

СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ

Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. Большинство белков хорошо растворимо в воде. Некоторые органические вещества, выделенные из хряща, волос, ногтей, рогов, костной ткани и нерастворимые в воде, также были отнесены к белкам, поскольку по своему химическому составу оказались близки к белкам мышечной ткани, сыворотки крови, яйца.

В мышцах, легких, селезенке, почках на долю белков приходится более 70–80% от сухой массы, а во всем теле человека – 45% от сухой массы (табл. 1.1) . В отличие от животных тканей в растениях содержится значительно меньше белков (табл. 1.2).

Для изучения химического состава, строения и свойств белков их обычно выделяют или из тканей, или из культивируемых клеток, или биологических жидкостей, например сыворотки крови, молока, мышц, печени, кожи и др. Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество представлен 50–54% углерода, 21–23% кислорода, 6,5–7,3% водорода, 15–17% азота и до 0,5% серы. В составе некоторых белков присутствуют в небольших количествах фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

Таким образом, помимо углерода, кислорода и водорода, входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков является азот, в связи с чем белки принято обозначать как азотсодержащие органические вещества. Содержание азота более или менее постоянно во всех белках (в среднем 16%), поэтому иногда определяют количество белка в биологических объектах по содержанию белкового азота.

 

Белки (полипептиды) – биополимеры, построенные из остатков a–аминокислот, соединенных пептидными (амидными) связями.

 

Формально образование белковой макромолекулы можно представить как реакцию поликонденсации a–аминокислот:

При взаимодействии двух молекул a–аминокислот происходит реакция между аминогруппой одной молекулы и карбоксильной группы – другой. Это приводит к образованию дипептида.

Из трех молекул a–аминокислот (глицин+аланин+глицин) образуется трипептид:

H₂N-CH₂CO-NH-CH(CH₃)-CO-NH-CH₂COOH

Аналогично происходит образование тетра-, пента- и полипептидов.

Молекулярные массы различных белков (полипептидов) составляют от 10 000 до нескольких миллионов. Макромолекулы белков имеют стеререгулярное строение, исключительно важное для проявления ими определенных биологических свойств.
Несмотря на многочисленность белков, в их состав входят остатки лишь 22 a-аминокислот.

 

ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ

В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям встречающихся в свободном состоянии в организме низкомолекулярных пептидов, выполняющих ряд специфических биологических функций. Короткие пептиды, содержащие до 10 аминокислот, принято называть олигопептидами; в то же время полипептиды и белки считаются взаимозаменяемыми, хотя термином «полипептиды» чаще обозначают продукты с мол. м. менее 10000. В некоторых биоактивных пептидах имеются необычные аминокислоты, не встречающиеся в природных белках, или производные обычных аминокислот (гормоны, антибиотики). Мнение о том, что пептиды могут играть роль промежуточных продуктов на пути синтеза белка, не подтвердилось, поскольку, как показано в главе 14, этот процесс во всех клетках у всех живых организмов осуществляется de novo матричным путем.

Природные пептиды, наделенные биологической активностью, в зависимости от характера действия и происхождения принято делить на 4 группы: 1) пептиды, обладающие гормональной активностью (вазопрессин, окси-тоцин, кортикотропин, глюкагон, кальцитонин, меланоцитстимулирующий гормон, рилизинг-факторы гипоталамуса и др.; см. главу 8); 2) пептиды, принимающие участие в процессе пищеварения (в частности, гастрин и секретин; см. главу 12); 3) пептиды, источник которых – α₂-глобулиновая фракция сыворотки крови (такие, как ангиотензин, брадикинин и каллидин); 4) нейропептиды.

В последнее время выяснены некоторые закономерности синтеза физиологически активных пептидов из биологически инертных предшественников – белков в результате процесса, называемого посттрансляционной модификацией (постсинтетические превращения белковой молекулы). Известно, например, что ангиотензины (представленные октапептидами), оказывающие выраженное сосудосуживающее действие, образуются из присутствующего в сыворотке крови неактивного белка ангиотензиногена в результате последовательного действия ряда протеолитических ферментов (ренина и особого фермента, участвующего в превращении неактивного ангиотензина I в активный ангиотензин II).

 

 

К группе вазоактивных (оказывающих влияние на тонус сосудов) пептидов относятся, кроме того, широко применяемые в медицинской практике брадикинин и каллидин.

Брадикинин представляет собой нонапептид:

H–Apг–Про–Про–Гли–Фен–Сер–Про–Фен–Apг–ОН.

Каллидин представлен декапептидом, образующимся из неактивного плазменного белка кининогена, и отличается от брадикинина присутствием на N-конце еще одного аминокислотного остатка (Лиз):

Н–Лиз–Арг–Про–Про–Гли–Фен–Сер–Про–Фен–Apг–ОН.

Совсем недавно из экстрактов ткани предсердия (но не из желудочков сердца) человека и животных были выделены биологически активные пептиды, регулирующие тонус сосудистой системы и электролитный обмен. Физиологический эффект их оказался противоположным влиянию системы ренин–ангиотензин–альдостерон. Он выражается в сосудорасширяющем действии, усилении клубочковой фильтрации и стимуляции выведения натрия и хлоридов за счет угнетения их реабсорбции в канальцах. Эти пептиды получили название а триопептидов (от лат. atrio – предсердие). Они построены из разного числа аминокислот (от 23 до 100), но обязательным условием для проявления биологического эффекта является наличие в молекуле 17-членной кольцевой структуры, образующейся за счет дисуль-фидной связи между остатками цистеина.

Внутриклеточным посредником действия атриопептидов оказался циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), синтез которого осуществляется в результате активирования мембранного фермента гуанилатциклазы; действие аденилатциклазы, напротив, тормозится под влиянием атриопеп-тидов.

Во всех животных тканях и в некоторых растениях широко распространен низкомолекулярный трипептид глутатион, функции которого пока не выяснены достаточно полно, хотя он открыт сравнительно давно. Глута-тион представляет собой атипичный трипептид (в котором в образовании одной из пептидных связей участвует не α-карбоксильная, а γ-карбок-сильная группа глутамата) следующего строения: γ-глутамил-цистеинил-глицин:

 

 

Цистеин является составной частью глутатиона, поэтому последний может находиться в восстановленной (SH) и в окисленной (S-S) формах (сокращенно обозначаются Г-SH и Г-S-S-Г), что, по-видимому, имеет отношение к биологической роли глутатиона в организме.

Интерес к природным пептидам в значительной степени обусловлен необычно высокой их биологической активностью. Они оказывают мощное фармакологическое действие на множество физиологических функций организма. В то же время были замечены низкая стабильность и быстрый распад их в организме при физиологических значениях рН среды. Все это способствовало развитию исследований как в области препаративного выделения природных пептидов из органов и тканей (включая получение биологически активных пептидов из предшественников методами ограниченного протеолиза ряда хорошо известных гормонов), так и в области химического синтеза. Получение ряда биологически активных нейропепти-дов из гормонов гипофиза, в частности эндорфинов и энкефалинов, наделенных мощным обезболивающим действием (путем связывания рецепторов определенных клеток мозга), в сотни и тысячи раз превосходящим аналгезирующий эффект морфина, описано в главе 8.

Из ткани мозга выделен также δ-пептид сна; ряд других нейропептидов принимает участие в биохимических механизмах памяти, страха, обучения и т.д. Для повышения стабильности пептидов при введении в организм предприняты попытки химического синтеза пептидов, в которых один или несколько аминокислотных остатков L-ряда замещают остатками D-аминокислот. Подобная замена, не вызывая снижения биоактивности, защищает пептид от воздействия протеиназ тканей, способствуя пролонгированию эффекта препарата.

Среди естественно встречающихся небольших пептидов следует указать на антибиотик грамицидин S, выделенный из Bacillus brevis и представляющий собой циклический декапептид:

 

 

Как видно, в структуре грамицидина S имеются 2 остатка орнитина (Орн), производные аминокислоты аргинина и 2 остатка неприродных D-изомеров фенилаланина. Стрелки указывают направление синтеза от NН₂-групп к СООН-группам каждого остатка, и вследствие цикличности грамицидин S не имеет конца.

Широкое применение, особенно в пищевой промышленности, в качестве заменителя сахара получил искусственный (генноинженерный синтез) ди-пептид, состоящий из L-изомеров аспарагиновой кислоты и метилового эфира фенилаланина, названный аспартамом:

 

Аспартам в сотни раз слаще сахара и легко распадается в организме на две свободные аминокислоты, абсолютно безвредные для организма; поэтому он рекомендован в качестве заменителя сахара больным диабетом. Это пример пептида, наделенного огромным биологическим эффектом.

 

Функции белков в природе универсальны:

Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химических реакций в биологических системах.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы-мишени.

Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков.

Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин – специфические белки мышечной ткани.

Структурная функция. Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в частности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др.

Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разнообразными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормоны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во многих других клетках организма. Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др.

Питательная (резервная) функция. Эту функцию выполняют так называемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию.

Разнообразные функции белков определяются a–аминокислотным составом и строением их высокоорганизованных макромолекул.

 

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

 

В зависимости от химического состава делят на простые и сложные белки.

Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Сложные белки – это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.

Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно

выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др.

 

Физико-химические свойства белков

Высаливание – это обратная реакция осаждения белков большими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов. Для высаливания чаще всего применяются такие соли: (NH₄)₂SO₄, NаСI, Nа₂SO₄, MgSO₄. При этих условиях белки, которые осаждаются, не испытывают глубокие структурные изменения и их осадки можно снова растворить в исходном растворителе, а молекула белка сохраняет свои предыдущие нативные свойства.

К обратным реакциям осаждения принадлежат реакции осаждения белков органическими растворителями ( спиртом, ацетоном) при условиях непродолжительного действия и низкой температуры.

Метод высаливания широко используется для фракционирования смеси белков, когда надо отделить один белок от другого (например, альбумины от глобулинов). Грубодисперсные белки-глобулины висаливаются значительно легче, чем альбумины полунасыщенным раствором сернокислого аммония, тогда как альбумины – насыщенным раствором.

 

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства.

Денатурация  – это нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50–60°С.

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией.

 

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH₂– и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче.

 

Молекулярная масса белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол. масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1•10^–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); s – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D – коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Измерение объема элюции (V_Э).

Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 – рибонуклеаза; 2 – химотрипсиноген; 3 -яичный альбумин; 4 – сывороточный альбумин; 5 – γ-глобулин; Х – белок с неизвестной молекулярной массой.

 

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка.

Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

1 – сывороточный альбумин; 2 – яичный альбумин; 3 – пепсин; 4 – химотрипсиноген; 5 – мио-глобин; 6 – цитохром с; Х – белок с неизвестной молекулярной массой.

 

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так называемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий определять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

 

Форма белковых молекул

О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультрацентрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представления о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только современные методы исследования позволили установить детали пространственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул. Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного анализа (высокое разрешение, порядка 0,2–0,3 нм) удалось в деталях расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказалось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и глобулины) являются асимметричными в указанных измерениях. Следует отметить, что не только физико-химические, но и биологические свойства белков (в свободном или в связанном друг с другом или с другими биополимерами состоянии) определяются их пространственной структурой.

 

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50–60°С.

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.

 

Денатурация белковой молекулы (схема).

а – исходное состояние; б – начинающееся обратимое нарушение молекулярной структуры; в – необратимое развертывание полипептидной цепи.

Денатурация и ренатурация рибонуклеазы (по Анфинсену).

а – развертывание (мочевина + меркаптоэтанол); б – повторное свертывание.

 

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы (рис. 1.13), включая биологическую активность. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или других биологически активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутствии солей и при соответствующем значении рН . При лиофилизации белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химическими веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

 

Изоэлектрическая и изоионная точки белков

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги) – почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо– и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

 

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Выяснение структурной организации белков считается одной из главных проблем современной биохимии. Оно имеет важное научно-практическое значение для понимания огромного разнообразия функций белков, выполняемых ими в живых организмах. Белковые молекулы представляют собой продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот), соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового синтеза (см. главу 14). Вопрос о том, каким образом соединяются между собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимавшихся химией белка.

Впервые А . Я . Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию, высказал предположение о существовании во всех белковых веществах одинаковых групп атомов и связей, аналогичных биурету NH₂—СО—NH—СО—NH₂. Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —NH—СО— (позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее вероятный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.

Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных СООН- и α-NН₂-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молекулы воды) можно представить следующим уравнением:

Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов складывается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH₂-группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил-аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала.

Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот может быть представлено в виде следующей схемы:

Химический синтез полипептидов и современные физико-химические методы исследования белков полностью подтвердили существование пептидных связей в структуре белка. Получены следующие экспериментальные доказательства полипептидной теории строения белка.

1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных СООН- и NH₂-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрованию доступны в основном свободные СООН- и NН₂-группы у N- и С-концевых аминокислот пептида.

2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются стехиометрические количества титруемых СООН- и NH₂-групп, что свидетельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом.

4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия в белках аналогичных связей.

5. Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептидную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при разрешении 0,15–0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные расстояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и N, но и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения белка является возможность синтеза чисто химическими методами полипептидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51 аминокислотный остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы – 124 аминокислотных остатка . Синтезированные белки обладали аналогичными природным белкам физико-химическими свойствами и биологической активностью.

Полипептидная теория строения не отрицает существования в молекуле белка и других связей, включая ковалентные (например, дисульфидные —S—S-связи) и нековалентные (например, водородные связи и др.). Они будут рассмотрены далее.

Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре», так и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости, и атомов водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом 109°28′. Во-вторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между атомами С и N в пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежуточным между простой (ординарной) связью (связь —С—N—, равная 0,147 нм) и двойной связью (связь —C=N—, равная 0,125 нм). Это создает предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Последняя в свою очередь дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей вращения и др.):

Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются полифункциональными, несущими свободные NH₂-, СООН-, ОН-, SH-группы и, как было указано, определяют структуру (пространственную) и многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (Н₂О), функциональные группы (в частности, NH₂– и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анионных и катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотношения ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или отрицательный (–) заряд с определенным значением изоэлектрической точки.

Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о существовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы: первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника современной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет в принципе расшифровать структурную организацию любого белка.

 

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Белковые молекулы представляют собой продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот), соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового синтеза.

Белки представляют собой сложные полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных СООН- и α-NН₂-групп аминокислот. Наименование пептидов складывается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH₂-группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил-аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала.

Первичная структура белка

 

К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Под первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Для определения первичной структуры отдельной, химически гомогенной полипептидной цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют аминокислотный состав, точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержащей одну свободную NH₂-группу и одну свободную СООН-группу.

 

Вторичная структура белка

Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию полипептидной цепи, т. е. способ свертывания, скручивания (складывание, упаковка) полипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конформацию.Есть два вида вторичной структуры: α-спираль и β-структура.

Наиболее вероятным типом строения глобулярных белков принято считать α-спираль. Закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке. Движущей силой в возникновении α-спиралей (так же как и β-структур) является способность аминокислот к образованию водородных связей. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. Шаг спирали (расстояние вдоль оси) равен 0,54 нм на виток, а на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм.

Стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями (определенный вклад вносят и главновалентные связи – пептидные и дисульфидные).

Другой тип конфигурации полипептидных цепей, обнаруженный в белках волос, шелка, мышц и в других фибриллярных белках, получил название β-структуры. В этом случае две или более линейные полипептидные цепи, расположенные параллельно или, чаще, антипараллельно, прочно связываются межцепочечными водородными связями между NH-и СО-группами соседних цепей, образуя структуру типа складчатого слоя .

 

 

 β-Структура полипептидных цепей.

Третичная структура белка

Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориентацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме.

В настоящее время получены бесспорные доказательства, что в стабилизации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей (пептидные и дисульфидные связи), основную роль играют так называемые нековалентные связи. К этим связям относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых радикалов аминокислот, так называемые гидрофобные взаимодействия и т.д.

 

 

 

Четвертичная структура белка

Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных нековалентными связями. (аналогичными тем, которые обеспечивают стабильность третичной структуры).

К настоящему времени субъединичная структура обнаружена у нескольких сотен белков.

 

ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

 

Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характерных физико-химических свойств, своеобразием аминокислотного состава и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой. Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина. Они составляют белковый компонент в структуре ряда сложных белков.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает 20–30%. Молекулярная масса гистонов намного больше нижнего предела молекулярной массы белков. Эти белки сосредоточены в основном в ядрах клеток в составе дезоксирибонуклеопротеинов и играют важную роль в регуляции экспрессии генов.

Проламины и глютелины. Это белки растительного происхождения, отличаются своеобразием аминокислотного состава и физико-химических свойств. Они содержатся в основном в семенах злаков (пшеница, рожь, ячмень и др.), составляя основную массу клейковины. Характерной особенностью проламинов является растворимость в 60–80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок.

Альбумины и глобулины. Эти белки относятся к белкам, широко распространенным в органах и тканях животных. Наиболее богаты ими белки сыворотки крови, молока, яичный белок, мышцы и др. В плазме крови человека в норме содержится около 7% белков, представленных преимущественно альбуминами и глобулинами. Альбумины и глобулины – это глобулярные белки, различающиеся по растворимости.

Различную растворимость альбуминов и глобулинов сыворотки крови раньше широко использовали в клинической практике для их фракционирования и количественного определения.

ХИМИЯ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ

 

Сложные белки, как было отмечено, содержат два компонента – простой белок и небелковое вещество. Последнее называют простетической группой (от греч. prostheto – присоединяю). Простетические группы, как правило, прочно связаны с белковой молекулой.

ХРОМОПРОТЕИНЫ

Хромопротеины (от греч. chroma – краска) состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины (содержат в качестве простетической группы железо), магнийпорфирины и флавопротеины (содержат производные изоаллоксазина). Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и диоксида углерода, окислительно-восстановительные реакции, свето-и цветовосприятие и др.

НУКЛЕОПРОТЕИНЫ

Нуклеопротеины состоят из белков и нуклеиновых кислот. Последние рассматриваются как простетические группы. В природе обнаружено 2 типа нуклеопротеинов, отличающихся друг от друга по составу, размерам и физико-химическим свойствам,– дезоксирибонуклеопротеины (ДНП) и рибонуклеопротеины (РНП). Названия нуклеопротеинов отражают только природу углеводного компонента (пентозы), входящего в состав нуклеиновых кислот. У РНП углевод представлен рибозой, у ДНП – дезоксирибозой. Термин «нуклеопротеины» связан с названием ядра клетки, однако ДНП и РНП содержатся и в других субклеточных структурах.

ЛИПОПРОТЕИНЫ

Этот класс сложных белков состоит из белка и простетической группы, представленной каким-либо липидом. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные жиры, свободные жирные кислоты, фосфолипиды, холестериды. Липопротеины широко распространены в природе: в растениях, тканях животных и у микроорганизмов – и выполняют разнообразные биологические функции. Они входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (структурированные липопро-теины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопротеинам относятся, кроме того, тромбопластический белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т.д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

ФОСФОПРОТЕИНЫ

К белкам этого класса относятся казеиноген молока, в котором содержание фосфорной кислоты достигает 1%; вителлин, вителлинин и фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца; овальбумин, открытый в белке куриного яйца; ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др. Большое количество фосфопротеинов содержится в клетках ЦНС. Фосфопротеины занимают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие широкого диапазона функций в метаболизме. Характерной особенностью структуры фосфопротеинов является то, что фосфорная кислота оказывается связанной сложноэфирной связью с белковой молекулой через гидроксильные группы β-оксиаминокислот, главным образом серина и в меньшей степени треонина. На одну молекулу белка обычно приходится 2–4 остатка фосфата.

ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Гликопротеины – сложные белки, содержащие, помимо простого белка или пептида, группу гетероолигосахаридов. В настоящее время их принято называть гликоконъюгатами. В состав гликоконъюгата входит углеводный компонент (гликановая фракция), ковалентно связанный с неуглеводной частью (агликановая фракция), представленной белком, пептидом, аминокислотой или липидом.

Повышенный интерес к науке об углеводах – гликобиологии – в настоящее время объясняется открытием существенной роли изменений структуры гликоконъюгатов в развитии таких болезней, как рак, иммунодефицит человека, ревматоидные артриты, астма и др. Оказалось, что нарушение реакции гликозилирования двух главных классов глико-конъюгатов (гликопротеинов и ганглиозидов) приводит или к накоплению предшественников этих веществ, или к синтезу «укороченных» сахарных цепей гликоконъюгатов. Более того, установлено, что во взаимодействии между некоторыми вирусами и клетками-мишенями главную роль играют углеводные компоненты. В частности, гликопротеин gp120 вируса иммунодефицита человека (содержит большой процент углевода) имеет высокое сродство к гликопротеину CD₄Т-лимфоцита. В этом взаимодействии, узнавании, являющемся высокоспецифичным, гликозилированные фрагменты, вероятнее всего, играют важную патогенетическую роль. Известно также, что при ревматоидных артритах часто синтезируются аномальные антитела (аномальные иммуноглобулины – все гликопротеины) с необычайно короткими сахарными цепями, что вызывает стимуляцию иммунной системы против самого организма. Из этих примеров видно, что, помимо гликобиологии, наступило время признания и таких наук, как гликопа-тология и гликотерапия.

Помимо гликопротеинов, различают также протеогликаны, состоящие из белка и гликозаминогликанов (прежнее название мукополиса-хариды); последние состоят из цепей сложных углеводов: аминосахаров, уроновых кислот, серной кислоты и отдельных моносахаридов. Типичными гликозаминогликанами являются гиалуроновая кислота, хондроитинсерная кислота и гепарин, химический состав, структура и функция которых подробно рассматриваются в главе 21.

К типичным гликопротеинам относят большинство белковых гормонов, секретируемые в жидкие среды организма вещества, мембранные сложные белки, все антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови, молока, овальбумин, интерфероны, факторы комплемента, группы крови, рецеп-торные белки и др. Из этого далеко не полного перечня гликопротеинов видно, что все они выполняют специфические функции: обеспечивают клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную активность опухолевых клеток, оказывают защитное и гормональное, а также антивирусное действие.

Химический состав гликопротеинов более или менее установлен, структура определена только у ряда из них. К полипептиду присоединяются гетероолигосахаридные цепи, содержащие от 2 до 10, реже 15 мономерных остатков гексоз (галактоза и манноза, реже глюкоза), пентоз (ксилоза, арабиноза) и конечный углевод, чаще всего представленный N-ацетилга-лактозамином, L-фукозой или сиаловой кислотой; в отличие от про-теогликанов гликопротеины не содержат уроновых кислот и серной кислоты.

Типы связей между углеводными компонентами и белками определены только у ряда гликопротеинов, аминокислотный состав и структура которых известны (иммуноглобулины, гормоны); они включают О-гликозидные связи (с ОН-группами серина, треонина и оксилизина), N-гликозидные связи (с амидными группами аспарагина, реже глутамина или ω-NH₂-группами лизина и аргинина) и эфирные гликозидные связи со свободными СООН-группами глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Синтез гликопротеинов осуществляется в рибосомах эндоплазматиче-ского ретикулума (в цистронах), затем присоединяются сахарные цепи (постсинтетическое гликозилирование), и далее белок транспортируется до биомембран клетки и включается в состав мембранных белков или секре-тируется.

Углеводные компоненты соединены ковалентно с азотом аспарагина молекулы белка. Однако предварительно олигосахаридная часть соединяется с липидным переносчиком – долихолфосфатом (липид, содержащий от 15 до 20 изопреновых остатков) и переносится на полипептидную цепь в эндоплазматическом ретикулуме, при этом транспортер освобождается:

Долихолфосфат (n = 15-30)

Синтезированные гликопротеины далее переносятся в аппарат Гольджи, где осуществляются окончательное гликозилирование и сортировка по назначению.

Структура одного из нескольких гетероолигосахаридных остатков в молекуле гликопротеинов, в частности иммуноглобулинов, может быть представлена в виде следующей схемы (использованы сокращения: Глю – глюкоза, NАцГлюА – N-ацетилглюкозамин; Гал – галактоза; Ман – манно-за; NАцНейр – N-ацетилнейраминовая кислота):

Рассмотрим известные к настоящему времени данные о синтезе, строении (структуре) и свойствах ряда гликопротеинов.

Интерфероны. Интерфероны – это ингибиторы размножения многих типов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (α, β и γ), некоторые из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных и человека от 25000 до 38000–40000). Они образуются в клетке в ответ на внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию (инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических α-интерфе-ронов синтезируется макрофагами, в то время как γ-интерферон продуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. «Лимфо-кины»). Показано также, что γ-интерферон в свою очередь повышает цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных клеток-киллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью и считаются основными защитными белками не только против вирусной инфекции, но и при опухолевых поражениях.

Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого белка-ингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилиро-вания.

Иммуноглобулины. Иммуноглобулины, или антитела, также относятся к классу гликопротеинов, выполняют защитную функцию, обезвреживая поступающие в организм чужеродные вещества – антигены любой химической природы. Синтезируются иммуноглобулины плазматическими клетками, образовавшимися из лимфоцитов. Учение об иммунитете оформилось в самостоятельную науку – иммунологию , изучающую структуру и функции антител вообще и иммуноглобулинов в частности. Мы представим современные сведения о некоторых физико-химических свойствах и структуре иммуноглобулинов человека (табл. 2.4). Различают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Детально изучены структура и функция IgG.

Разные классы иммуноглобулинов сильно различаются не только по молекулярной массе, но и по концентрации в крови; имеются данные, что различаются они и по биологическим свойствам.

Подробно изучена структура IgG. Он имеет Y-образную форму и тет-рамерное строение; состоит из двух идентичных легких L-цепей (от англ. light) и двух идентичных тяжелых Н-цепей (от англ. heavy) с мол. массой 23000–24000 и 50000–70000 соответственно. Известно также, что каждая из этих цепей имеет 2 типа доменов – вариабельные (V) участки, состоящие из 108 аминокислотных остатков, и константные (С) участки, состоящие из 110 и 350 аминокислотных остатков соответственно в L- и Н-цепях (рис. 2.5).

Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологических функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением альбуминов), трансферрин, церулоплазмин, гонадотропный и фолликуло-стимулирующие гормоны, некоторые ферменты, а также гликопротеины в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка (овомукоид). Углеводные компоненты, помимо информативной функции, значительно повышают стабильность молекул, в состав которых они входят, к различного рода химическим, физическим воздействиям и предохраняют их от действия протеиназ, определяя тем самым биологическую роль гликопротеинов. Являясь составной частью клеточной мембраны, гликопротеины участвуют, кроме того, в иммунологических реакциях, ионном обмене, процессах межклеточной адгезии и т.д.

Структура IgG человека. Показаны легкие (L) и тяжелые (Н) цепи, дисульфидные связи и вариабельные V (красные) и константные С (светлые) участки.

 

Фракционирование и очистка белков

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе (μ), которая равна половине суммы произведений концентрации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при использовании различных концентраций этанола при низкой температуре (от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей.

Рис. 1.2. Диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

Рис. 1.3. Абсорбционнаяхроматография (схема). Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

1 – нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 – окончание опыта.

компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

Рис. Хроматография на бумаге (схема).

А – восходящая хроматография; Б – нисходящая хроматография (вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо– или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие функциональные группы:

Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующие функциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V₀ – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; V_i – объем растворителя внутри геля, мл; K – коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V₀ , а первое – только после выхода объема V₀+ V_i.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V₀, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V₀+ К • V_i.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практических руководствах по биохимии).

Рис. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крестиками – зерна сефадекса; малые черные и красные кружки и треугольники – белки с различной молекулярной массой; А – колонка в начале работы; Б, В, Г – колонка в различные периоды времени. На графике элюции четко видно разделение белковых компонентов.

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле – 10, а в полиакрил-амидном геле – до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно при фракционировании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000– 100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая и т.д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка.

В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.

Не потерял своего значения и метод кристаллизации белков с использованием сульфата аммония, а также метод определения растворимости белка. Последний, предложенный еще Д. Нортропом , основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.