Методи культивування бактерій і визначення її кількості у досліджуваному матеріалі

 

Методи культивування бактерій. Поживні середовища і їх характеристика. Типи nі механізми живлення бактерій.

Основні принципи і методи виділення чистих культур. Виділення чистих nкультур аеробних бактерій. Створення анаеробних умов.

Культуральні властивості мікроорганізмів. nФерменти бактерій та їх значення для ідентифікації збудників.

 

Культивування мікроорганізмів. Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, nдослідження їх різноманітних властивостей, nтривалого зберігання використовують живильні середовища.  Вони повинні відповідати певним стандартам, nстворюючи оптимальні умови  для росту, nрозмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

В першу чергу бактерії потребують nазоту, вуглецю  та водню для побудови nвласних білків. Водень і кисень  для nклітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, nтваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова nмука, казеїн), а також  білкові nгідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса n- плаценту, кров’яні nзгустки, дріжджі. Отже, до складу  nсередовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і води, а також nростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать nекстракти з білків тваринного  й nрослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними nхарчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати – кров, nсироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової nтканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити nіони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію,  мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допустимим є вживання речовин, nякі усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі nамінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму nрН середовища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну в’язкість, nгустину Залежно (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, прозорими й nобов’язково nстерильними.

Численні потреби мікроорганізмів nзумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій nіснують  спеціальні середовища. Частину nїх готують у  лабораторіях безпосередньо nперед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й nнові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити nнайвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають nстандартний склад.

 

Класифікація живильних середовищ

 

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні nсередовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 %  та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє nсобою  волокнистий матеріал, який nдобувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), nбілків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та nагаропептин.  Агар розчиняється у воді nпри підвищеній температурі, а, застигаючи,  nнадає  середовищу драглеподібної nконсистенції та стійкості до ферментних  nсистем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого nрозповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних nсередовищ   використовують також желатин n(10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Середовища поділяються на природні nй штучні. Як природні використовують nзгорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні nсередовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що nзабезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на nчотири основні групи.

Перша група – універсальні (прості) середовища. nДо них належать прості середовища: м’ясо-пептонний бульйон n(МПБ) та м’ясо-пептонний nагар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для nкультивування багатьох видів бактерій.

 

МПА

 

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли nмікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний,  сироватковий агари,  сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та nасцит-агар.

Кров’яний агар

Третя група – елективні середовища. Їх використовують для цілеспрямованого nвиділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх nмікробів.  Створюючи такі середовища, nвраховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від nінших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, nсередовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії, середовище Плоскірева – для nдизентерійних паличок, середовище Мюллера- для тифо-паратифозних бактерій. nГарний ріст стафілококів спостерігаєтся на  nсередовищах, у складі яких є  до n10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить nфуразолідон.

Додавання антибіотиків до складу nживильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група – диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють nвизначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну nдиференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, nпептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих nвластивостей тощо.

Середовище Ендо.

 

Середовище Левіна

 

Середовища Гіса

 

На поверхні nщільного поживного середовища мікрорганізми можуть утворювати суцільний, густий nріст або ізольовані nколонії. Колонія –  це видимі nнеозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного nсередовища. Як правило, кожна колонія nформується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить nоднорідний. Утворення її є проявом  nкультуральних властивостей бактерій.

Характеристика колоній – важлива складова частина nроботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду  притаманні свої особливі  колонії.

 

 

 

Характеризувати nколонії можна за різними nознаками. За величиною (діаметром) вони поділяються на великі (4-6 мм і більше), nсередні (2-4 мм), дрібні (1-  2 мм), карликові nабо точкові (менше 1 мм). Форма nколоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна n(амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і nмутними.

За рельєфом  і nконтуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, nкуполоподібні, каплеподібні, конусоподібні. плоскоопуклі, плоскі, що стеляться nпо поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска nсерединою.

Різні види колоній

 

Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а nпотім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою nабо блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі nколонії позначають як S-форми (smooth – гладенький), а шорсткі –  nR-форми (rough – шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також nможе бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, nмати радіальну посмугованість  тощо.

Переважна більшість nмікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак nдеякі з них  формують кольорові колонії. nЇх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, nзолотисті, сині, червоні тощо.

Структуру колоній досліджують у nпрохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, nзернисті, ниткоподібні і чи волокнисті, які характеризуються наявністю nпереплетених ниток у товщі колоній.  

При доторканні до колонії петлею nможна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або nслизова, суха, крихка тощо.

На рідких живильних середовищах nбактерії також можуть рости по-різному. хоча особливості проявів росту бідніші, nніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне nпомутніння середовища, колір його при цьому може не  змінюватись або набуває кольору пігменту. nТакий характер росту найчастіше спостерігається у більшості nфакультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення nосаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, nслизистим та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим або ставати nмутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад  має сірувато-білий або жовтуватий колір. nПодібним чином ростуть,  як правило, nанаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється nутворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. nСередовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію nдо поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка nу вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або nзбовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, nслизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається nй щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що nвиробляється мікроорганізмами.

 

ТИПИ І МЕХАНІЗМИ ЖИВЛЕННЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів вивчає nбіохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й nзабезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.

Бактерії є складними живими nорганізмами, в яких відбуваються  nрізноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, nпродукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, nвідповідають за регуляцію  функціональної активності клітин, їх високу nпластичність і здатність адаптуватись до умов зовнішнього середовища.

Хімічний склад nбактерій. Як і всі живі  істоти, бактерійна клітина складається з nчотирьох основних елементів – азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає n45-   55 % сухого залишку клітини, кисень n- 25-30 %, азот – 8-15 % і водень – 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з nякого побудовано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, nліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.

Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. nВона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або зв’язаному стані. nВільна вода є середовищем, в якому відбувається  nрозмаїття біохімічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) nвнаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона nвиступає розчинником  багатьох речовин, nщо надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.

Зв’язана вода – також необхідний компонет цитоплазми, nпроте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призводить до її nзагибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає nвиходити  з неї, цитоплазма зморщується, nвідшаровується від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.

Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується  з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, nвуглеводів, полісахаридів, низькомолекулярних органічних речовин і солей.

У  клітині nнараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів

 

Хімічний склад клітини

 

Білок nскладає до 55 % сухого залишку клітини. Його представлено простими та складними nбілками. Прості білки  називають протеїнами. За своїм складом вони nсуттєво не відрізняються від білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса nміститься в цитоплазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці nграмнегативних  мікробів, нуклеоїді. nТоксини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза nє простими білками.

Складні білки – nпротеїди свою назву отримали за nздатність сполучатися з іншими речовинами. Так, білки, зв’язані  з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами – глікопротеїди, ліпідами – ліпопротеїди, залізом, міддю-  хромопротеїди. nВони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нуклеопротеїди забезпечують суперспіралізацію nнуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й nвиконують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; nліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бактеріальних ендотоксинів, отже, nвірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну  функцію клітини, є переносниками кисню.

Тонкі фізико-хімічні дослідження nдозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних nбілкових молекул 1850 видів.

Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою n(ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. Їх вміст коливається в межах 25-30 % nсухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, nтранспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК – форма, що nутворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної nінформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. nРибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від nРНК еукаріотів  за константою nседиментації. Транспортні РНК  здатні зв’язуватись nіз амінокислотами, що накопичуються в цитоплазмі, й доставляти їх до рибосом, nна яких відбувається процес біосинтезу.

Вуглеводи nстановлять 12-20 % сухого залишку. Їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, оліго-та nполіозидами, полісахаридами, іншими сполуками. Їх роль у забезпеченні nжиттєдіяльності клітини важко переоцінити, так як  вони входять до складу будь-яких структур nклітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. nПолісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони nзумовлюють антигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) nвластивості.

Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли nв основу розробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. nОсобливості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вакцини, nспецифічні діагностичні сироватки.

У клітині міститься  nв середньому до 10 % ліпідів. Однак в nокремих груп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується до n40 %. У грамнегативних бактерій в зв’язку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 nразів більше, ніж у грампозитивних.

В середньому в клітині є до 22 млн молекул  різноманітних ліпідів. Представлено їх, в nосновному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних nкислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні nвластивості  клітини (кислотостійкість), nїї токсичні функції,  беруть участь у nметаболізмі.

Важливою складовою частиною nбудь-якої мікробної клітини є мінеральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і nможуть  знаходитись у вільному стані в nцитоплазмі. Без них не обходяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у nмікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх nпохідні  за рахунок здатності утворювати nмакроергічні (багаті на енергію) зв’язки постачають nклітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєдіяльності nбактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й nкальцій  здатні активувати багато nферментів; залізо – невід’ємний складник цитохромів.

Клітинний nметаболізм. Сукупність усіх біохімічних   перетворень у клітині називається nметаболізмом. Він відбувається за двома nосновними напрямками. Перший забезпечує синтез складних клітинних сполук із nбільш простих. Тому він одержав назву біосинтез, nконструктивний метаболізм або  анаболізм. Однак переважна  більшість реакцій синтезу й розпаду потребує nенергетичного забезпечення. Тому енергетичний nметаболізм або катаболізм представляє nсобою потік реакцій, які супроводжуються накопиченням електрохімічної енергії, nщо потім викорстовується клітиною.

Конструктивний та енергетичний метаболізм  – тісно пов’язаний між nсобою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і одні й ті ж речовини nвикористовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи – амфіболічними.

Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. nВони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для nпобудови  власних структур. Саме цим nзумовлюється убіквітарність їх розповсюдження.

Конструктивний метаболіз прокаріотів. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись nпостійний обмін речовин з навколишнім середовищем. У клітину ззовні мусить nнадходити  пластичний матеріал, з якого nвона  синтезує всі необхідні їй молекули.

У конструктивному метаболізмі nпровідна роль належить сполукам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. nЗалежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві nгрупи: автотрофи і гетеротрофи.

Типи nметаболізму бактерій

 

Автотрофи (autos – сам, trophe – nживлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з CO₂ nяк єдиного джерела вуглецю.  Гетеротрофи (heteros -інший) – мікроорганізми, джерелом nвуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні  споживати  nбудь-які прості й складні вуглецеві сполуки – цукри, амінокислоти, nбагатоатомні спирти, парафіни та ін.

Ступінь вираження гетеротрофії у nбактерій може бути найрізноманітніша.  nНайвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити nтільки всередині  живих клітин (рикетсії, nхламідії). Їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі nмікрорганізми називають облігатними n(суворими) паразитами.

Однак багато мікробів можна nвирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, nпептиди, вітаміни, фрегменти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних nрости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, nназивають  факультативними паразитами.

Більшість бактерій, що населяють nземну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих nорганізмів не залежать  і живляться за nрахунок мертвих органічних залишків.

Мікроорганізмам необхідний азот nдля синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні nбактерії здатні засвоювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), nінші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило,  засвоюють азот у відновленій формі – це солі nамонію, сечовини, органічні сполуки  n(амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) nтакож можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони  відновлюються до аміаку за допомогою nферментів нітратредуктази й нітритредуктази.

Дикі штами бактерій здатні nсинтезувати всі необхідні їм речовини з обмеженого числа органічних сполук, nнаприклад, глюкози та солей амонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми  n(варіанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних nїм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живильних nсередовищах. Їх називають ауксотрофними nорганізмами.

Джерела енергії та nдонори електронів. Залежно  від джерела енергії, що засвоюють мікробні nклітини, їх поділяють на фототрофи і nхемотрофи.

Фототрофні бактерії здатні використовувати енергію сонячного nсвітла. Їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патогенних для людини nсеред них   немає.  Інші прокаріоти, які  одержують енергію за рахунок окисно-відновних nреакцій в субстратах, називаються хемотрофами. n

Для здійснення різноманітних nреакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних nперетворень віддають електрони, називаються донорами. Молекули, які одержують nелектрони, називаються акцепторами.

Мікроорганізми, для яких джерелом nелектронів є неорганічні сполуки типу Н₂, Н₂S, NH₃^{+ n}, Fe ⁺² та інші, називаються літотрофами (litos – камінь). Інші бактерії, для яких донором nелектронів  виступають органічні nречовини, називаються органотрофами.

Залежно від способу одержання nенергії, донора електронів та джерела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 nосновних типів прокаріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й nфотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, nхемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемооргано-автотрофи й nхемоорганогетеротрофи.

Мікроорганізми, які здатні nвикликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів.

Бактерії, яким притаманний один nіз спосібів живлення, позначають як облігатні,  nа ті, які використовують два джерела енергії, – міксотрофи.

Для здійснення своїх метаболічних nперетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні nсполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн), nвітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору nнеможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він  nнеобхідний компонент фосфоліпідів, коферментів.

Мікроорганізми  засвоюють сірку з природних джерел, де вона nзнаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної nсірки, а потреби у фосфорі задовільняються за рахунок  засвоєння неорганічних фосфатів.

Усі необхідні йони металів nклітина одержує за рахунок неорганічних сполук. Деякі елементи (магній, nкальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в nінших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у nклітині надзвичайно різноманітна, так як вони входять до складу  основних клітинних метаболітів, виконуючи nжиттєво важливі функції.

При культивуванні бактерій крім nбілків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього nсередовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів nросту.  Вони включаються до складу клітинних nметаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі nвітаміни (біотин,  тіамін, пантотенова nкислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та nпіримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.

  n Надходження речовин у nклітину.

Незважаючи на досягнення nмікробіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клітині nостаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення nметаболітів назовні не з’ясовано. Встановлено, що мікробам nпритаманний  голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні nречовини тільки в розчиненому вигляді . 

Однак деякі субстрати не nрозчиняються у воді (білки, полісахариди), або  nутворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому nвипадку клітинні екзоферменти, які виділяються  nв навколишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплюючи nїх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.

Виділяють декілька механізмів nпроникнення  речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли nстворюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та nзовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії.

Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків – пермеаз, які nмістяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає nенергетичного забезпечення.

Однак більшість поживних nречовин,  метаболітів, іонів проникають у nклітину за допомогою активного транспорту. nЙого також забезпечують білки-пермеази, але вони є  високоспецифічними й здатні переносити тільки nпевні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує  клітина, тому можливий перенос і проти nградієнта концентрації речовини. Якщо цьому процесу передує певна хімічна nмодифікація  молекули, його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також механізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних nіонів.

Конструктивний nметаболізм. Обмін білків у мікроорганізмів nвідбувається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до nамінокислот і біосинтетичні процеси, пов’язані з конструюванням nнових молекул.  Перший напрямок nзабезпечують ферменти екзопротеази, що виділяються в навколишнє середовище,  та ендопротеази, які нагромаджуються в nклітині. Кінцеві продукти -амінокислоти, – що утворюються під час цього nпроцесу, можуть зазнавати дезамінування та декарбоксилювання, перетворюючись на nаміак, вуглекислий газ, оксикислоти.

Біосинтетичні процеси відбуваються nза участю готових амінокислот, які трансамінуються або перамінуються. Деякі nмікрорганізми здатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно nзазначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму людини, здатні nсинтезувати незамінні амінокислоти – лізин, метіонін, триптофан.

Вуглеводний обмін забезпечуєтся nабо гідролітичним розщепленням молекул з утворенням глюкози й мальтози або nфосфоролізом. І в одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються nвивільненням енергії. Це відбувається при бродінні –  окисно-відновних реакціях анаеробного nрозщеплення органічних речовин, головним чином, вуглеводів. Метаболіти, які nутворюються під час бродіння, використовуються для біосинтетичних процесів. nПродуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, nмурашина), спирти (етиловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, nводень. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, nрозрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види nбродіння. При бродінні вивільняється  nнезначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 nмолекулу субстрату утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).

Синтез вуглеводів відбувається nабо з вуглекислого газу (автотрофи), або за рахунок  вуглецемістких органічних сполук.

Як було зазначено, ліпіди nмікроорганізмів представлено насиченими та ненасиченими жирними кислотами, nфосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. nМікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за nучастю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою nклітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включаються до складу nфосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших nліполітичних ферментів.

Ферменти nмікроорганізмів. Усі біосинтетичні процеси  та інші метаболічні перетворення в клітині nвідбуваються  за участю особливих  високоактивних біологічних каталізаторів, які nназиваються ферментами.  Вони належать до n6 класів: гідролази (забезпечують реакції розщеплення за участю води), nоксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть nучасть  у процесах дихання), ізомерази n(здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси nізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних nсубстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеплення хімічних груп nнегідролітичним шляхом),  лігази n(відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахуноко енергії nАТФ).

Здатність утворювати певні nферменти кодується клітинним геномом і є постійною ознакою бактерій. Так як nбактеріальна клітина займає невеликий об’єм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів nсинтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої nгрупи постійно присутні в бактерії  в nпевних концентраціях. Вони зумовлюють першочергові біосинтетичні потреби nклітин.

Клітина виділяє  ферменти в навколишнє середовище (екзоферменти). Там вони здійснюють   контактне позаклітинне  перетравлювання речовин або пошкоджують nтканини організму господаря. Ендоферменти  локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в nпериплазматичному просторі.

Класифікація nферментів бактерій

 

 

Роль ферментативної діяльності nмікроорганізмів важко переоцінити. Вони мають загальнобіологічне значення. nВідома участь бактерій  у кругообізі nречовин у природі, формуванні родовищ корисних копалин (нафта, вугілля, поклади nсірки). Мікроорганізми – прекрасні санітари довкілля. Вони здатні nбіодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє nсередовище.

Людина поставила мікробні nферменти собі на службу. Їх широко використовують у різних галузях хімічної, nхарчової, фармацевтичної, парфумерної  nпромисловостей, сільському господарстві, медицині.

Протеазами видаляють волосяний nпокрив зі шкір тварин, знімають желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що nзабезпечують бродіння,  використовуються nдля одержання бутанолу, ацетону, необхідних для проведення хроматографічних nдосліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти – кефір, nйогурт, кисляк, кумис – також продукти діяльності бактерій бродіння.

Мікроорганізми використовуються у nвиноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла,  силосуванні кормів, квашенні овочів. Із nдріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як nживильне середовище використовують парафіни – відходи нафти.

За допомогою мікроорганізмів та nїх ферментних систем в медичній промисловості одержують  гормони гідрокортизон, преднізолон, nрізноманітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують вітаміни (В_12­). nЗі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу і стрептокіназу, які nруйнують тромби в кровоносних судинах.

Оскільки здатність утворювати nферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко nвикористовується в лабораторній практиці для ідентифікації бактерій. Її nпроводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, nліполітичних та інших ферментів.

Енергетичний nметаболізм прокаріотів.  За своїм об’ємом реакції, що nзабезпечують клітину внутрішньою енергією, значно  перевищують  nбіосинтетичні процеси.

Мікроорганізми можуть nвикористовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні nкористуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтезуючі бактерії) та nхімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова nенергії.

Явище  нагромадження  nенергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту nпротонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, nа електрони передаються на відповідні молекули- акцептори.

Протягом своєї еволюції бактерії nвиробили три способи одержання енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.

При бродінні в анаеробних умовах nу певних окислювально-відновних реакціях утворюються нестабільні молекули, nфосфатна група яких  містить багато nвільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти n(АДФ), яка перетворюється в  АТФ. Реакції, nв яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстратного фосфорилювання. nВідновлювач, який при цьому утворюється, (НАД·Н₂, відновлений  фередоксин), переносить  електрони на ендогенний акцептор (піруват, nацетальдегід) або звільняється у вигляді водню.

Окислення  відбувається внаслідок переносу електронів nчерез спеціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембрані. Він nскладається  з набору переносників і в nбільшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до Н₂О.

Основою фотосинтетичних процесів nу представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними nпігментами: флавопротеїнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять nнегемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення nенергії.

Енергія, яку генерує клітина, nзапасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню – Dmн⁺  або в молекулах АТФ.

Прокаріоти містять декілька nсполук із високоенергетичними фосфатними зв’язками – ацилфосфати, nфосфоенолпіруват, аденозинфосфосульфат, а також сполуки з тіоефірним зв’язком n- ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. nПеренос її веде до розриву зв’язку, з’єднуючого з молекулою, nотже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєднання nтакої групи до молекули акцептора підвищує рівень його вільної енергії, nпереводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних nреакціях.

Найголовніше місце в переносі nхімічної енергії належить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та nмембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється nфосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергічних nзв’язки, nякі при гідролізі звільняють  31,8 nкДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі nрозміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки кілтини, де необхідна nенергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля n10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.

На прикладі  E. coli визначено, скільки nнеобхідно енергії,  щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль nАТФ, із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль – на синтез ДНК nі РНК, 2 ммоль – для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання nжиттєдіяльності  – осмос, рух клітини nтощо.

Іншою універсальною клітинною nенергією є енергія трансмембранного потенціалу Dmн⁺. Це nздійснюється за допомогою спеціальної «петлі», локалізованої в цитоплазматичній nмембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої nсторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а nпротони  вивільняються в зовнішнє nсередовище.

При такому переносі  назовні клітини накопичуються іони водню, nсередовище підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває nбільш лужного характеру. Виникає орієнтований поперек ЦПМ градієнт іонів водню. nОскільки Н⁺ – хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення nз обох сторін ЦПМ викликає створення  не nтільки концентраційного градієнта часток, але й орієнтованого поперек мембрани nелектричного поля. Напруга потенціалу Dmн⁺  досягає n200-250 мВ.

Енергія трансмембранного nпотенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного nАТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного nфосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може nпроходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідролізі АТФ зростає  енергія Dmн⁺ на ЦПМ.

Таким чином, дані реакції є nприродними механізмами, які з’єднують процеси окислення з фосфорилюванням. nЕнергія, яка накопичується на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні nпотреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює nрух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та nіонів через мембрану, а енергія АТФ  – nсинтетичні процеси в клітині.

Але ні енергія Dmн+, ні АТФ не можуть nнагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже nтривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії nпрокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахаридів, nліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, nвкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

РІСТ І РОЗМНОЖЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Будь-яка жива істота здатна до nросту та розмноження. Під ростом розуміють координоване nвідтворення бактеріальних структур і відповідно збільшення маси мікробної nклітини. Розмноження – це здатність nмікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у nпопуляції на одиницю об’єму середовища

Розмноження бактерій – складний nпроцес, пов’язаний nіз синхронною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення nгенетичного матеріалу – ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку nвідбувається реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним nшляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої  в місці з’єднання мезосоми з цитоплазматичною nмембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розходяться. Кожна nз них є матрицею, на якій  за принципом nкомплементарності  синтезуються їх копії,  які згодом об’єднуються у двониткову nДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами nпо 1-2 тис. нуклеотидів, які пізніше зшиваються ферментом лігазою. Залежно від nумов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.

Паралельно з реплікацією nпочинається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної nмембрани. Потім вона оточується пептидогліканом. Під час реплікації та nутворення перегородки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких nскладатимуться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клітини відділяються одна від nіншої, а в грамнегативних  мікробів  синтезується додатково зовнішня мембрана. nЯкщо клітини зберігають зв’язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи nпаличкоподібних форм.

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий – такий тип, при якому утворюються багатоклітинні nпалички і коки. При синхронному nреплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються nодноклітинні організми. Третій тип – із випереджаючим nподілом нуклеоїду, при якому  утворюються nбагатонуклеоїдні форми бактерій.

Як правило, бактерії nрозмножуються простим поділом, що відбувається в різних площинах. Це спричиняє, nнаприклад,  утворення   різних морфологічних типів кокоподібних nмікроорганізмів – диплококів,  nстафілококів, тетеракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмножуватись nшляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення nклітин, подібних до спор, конідій.

Облігатні внутрішньоклітинні nпаразити – хламідії – розмножуються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, nініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого nформується  нове покоління  елементарних тілець. Тривалість циклу складає n40-48 годин.

Мікоплазми також можуть nутворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією nабо брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись  і простим бінарним поділом.

Швидкість розмноження бактерій nзалежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, nйого рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у nгеометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія nподвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години – 16, nчерез 4 – 256, через 15 – мільйони. Через 35 год їх об’єм nстановитиме  до 1000 м³, а маса – понад 400 т.

При внесенні у живильне nсередовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і nрозмножуються, досягаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть nвичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти обміну і nне додавати необхідні речовини, то можна одержати періодичну культуру (популяція в обмеженому просторі). nМікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з nгенетично обмеженим ростом.

Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від  часу культивування, називається кривою росту.

Розрізняють чотири основні фази nросту періодичної культури: початкову n(або лаг-) фазу, експоненціальну (або логарифмічну) фазу, стаціонарну та фазу відмирання.

Початкова або лаг-фаза охоплює nпроміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В nцей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 nразів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість nфази 1-2 год.

Експоненціальна n(логарифмічна)  фаза характеризується nпостійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у nгеометричній прогресії.  Вона залежить nвід віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 nхв, стрептококи – 30 хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу – n5-18 год. Час,  протягом якого відбувається поділ мікроба, nназивається часом генерації. nТривалість фази – 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, nколи число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих nмікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит nживильних речовин у середовищі, низький парціальний  тиск кисню, накопичення токсичних продуктів nобміну. Однак кількість біомаси в цей період  nсягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну (М-) концентрацію, а величину біомаси – терміном вихід або урожай. Ця ознака є  nспецифічною й характерною  для nкожного  виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) nсупроводжується різким зменшенням  числа nживих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у середовищі, nнагромадження кислот, автоліз під впливом  nвласних ферментів.

Поділ мікроорганізмів за nтемпературним оптимумом

 

Отже, у періодичній культурі nумови культивування весь час змінюються: густина мікробів  зростає, а запаси живильних речовин nзменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі nекспоненціальнго росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони nнайбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, nпродукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, nінших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням nпопуляцій бактерій, що ростуть, оновленням  nживильного середовища, додатковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме nза такими принципами працюють хемостати і турбідостати – прилади, які nдозволяють проводити безперервне культивування у промислових і лабораторних nумовах.

 Ріст мікробів на твердих живильних середовищах nвідбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно nвища.

 

Поділ бактерій за типом nдихання

n     nОблігатні nаероби (збудники туберкульозу, чуми, холери)

n     nОблігатні nанаероби (збудники правця, ботулізму, газової анаеробної nінфекції, бактероїди, фузобактерії)

n     nФакультативні nанаероби (стафілококи, ешеріхії, сальмонели, шигели та інші)

n     nМікроаерофіли n(молочнокислі, азотфіксуючі бактерії)

n     Капнеїчні (збудник бруцельозу бичачого типу)

 

Дихання бактерій. Це один із шляхів біологічного окислення, який nвідбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням nенергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні  та неорганічні сполуки) служать донорами nелектронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають nнеорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим nакцептором електронів виступає кисень, у інших  n– неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без nучасті  кисню. У 1863 р. він запропонував nтерміни «аероб» та «анаероб».

Сьогодні, залежно від умов nодержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп.  Облігатні  аероби – мікроорганізми, для nоптимальнгоо росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники nтуберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ nвони ростуть, як правило, у вигляді плівки.

 

 

 Облігатні анаероби – бактерії, які ростуть при nвідсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони nодержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не nвиносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є  збудники правця, ботулізму, газової nанаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть nбути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні nсередовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за nрахунок поглинання кисню або заміни його індиферентиними газами (азотом, nводнем).  Факультативні nанаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов nсередовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні nпроцеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу nфакультативних анаеробів формують численні представники родини  кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, nшигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли n- особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може nбути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група nпредставлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. Капнеїчними nназивають такі мікроорганізми, які nпотребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками nє  збудники бруцельозу бичачого типу.

В облігатних аеробів кисень nвикористовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються nцитохромоксидазами та оксигеназами. В клітинах факультативних анаеробів  також є  nцитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які nкаталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

Система Газ-пак для nстворення анаеробних умов

 

Детальне вивчення механізмів nдихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були nанаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в nатмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб  відбулось переключення механізму бродіння на nаеробне дихання,  достатньо було 0,2 n%  кисню в атмосфері (на сьогодні його nконцентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до nзміни характеру атмосфери із відновлювальної  nна окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери nіснував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв’язана. n

Бактеріологічне nдослідження

Бактеріологічний метод nдослідження є найважливішим у практичній діяльнос­ті будь-якої мікробіологічної nлабораторії. Від правильного його виконання ­залежить визначення етіологічного nчинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування nінфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох nвипадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді необхідно nвстановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

 Тому перед освоєнням основних принципів і nметодів виділення чистих культур необхідно оволодіти технікою посівів і nпересівів бактерій в рідкі й на щільні живильні середовища.

Техніка nпосівів мікроорганізмів. Посіви проводять nяк з метою виділення збудників із досліджуваного матеріалу від хворих, так і nдля нагромадження чистих культур з метою подальшого їх вивчення та nідентифікації. Техніка nпосівів у рідкі та на щільні живильні середовища має свої особливості.

 

 

Техніка посівів мікроорганізмів

 

Video

Video

Video

 

У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне nсередовище (щільне або рідке), в іншій – досліджуваний матеріал. Пробірки затискають nвеликим та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом nпробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахиленими, nі потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби з nповітря та навколишніх предметів з однієї не потрапили в іншу. Корки з пробірок nвиймають, тримаючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома іншими пальцями правої nруки, як олівець, тримають бактеріологічну петлю або піпетку, якими nрозподіляють досліджуваний матеріал.

Спочатку nстерилізують петлю у верхній ­частині полум’я газового пальника. Пробірки nвідкривають і край їх проносять через полум’я пальника. Петлю опускають у nпробірку, де є до­сліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись стінки, nохолоджують. У подальшому петлю опускають у пробірку і набирають матеріал. Якщо nвін знаходиться у рідкому стані, для посіву достатньо краплі рідини, яка nзатримується в кільці бактеріологічної петлі. Коли використовують мікроби, що nвиросли на поверхні середовища, обережно плавним рухом набирають невелику nкількість їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середовище. Петлю повільно nвиймають з пробірки, не торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку з nсередовищем. Штриховими рухами від однієї стінки пробірки до іншої, починаючи з nнижньої частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні nагару знизу догори.

Петлю nвиймають з пробірки, корки і краї пробірок проносять через полум’я і nзакривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.

При nпосіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом занурюють у nрідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на стінці nпробірки й омивають середовищем.

Матеріал, nякий набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, вилива­ють у живильне nсередовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку обе­режно, щоб не nзамочити корок, струшують або обертають, затиснувши в ­долонях.

Для nпосіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі невелику nкількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню nсередовища біля краю чашки.

 Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб nзнищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з nмісця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню агару, nде було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по nрешті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву тривали від краю до nкраю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один до одного. nЦим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для одержання nізольованих колоній.

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо наносять на nповерхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою. Стерильний шпатель nпроносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними nкруговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розпо­діляють матеріал nрівномірно по поверхні середовища.

 

 

Video

Video

 

При посіві тампоном чашку дещо nвідкривають однією рукою, тампоном торкаються поверхні агару біля краю чашки і nпочинають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно nматеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи nтампон. Після проведення nпосіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до nпопереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного nсередовища пробірку з м’ясо-пептонним агаром, nжелатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у праву і роблять укол nдо дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.

Video

 

Посів матеріалу в товщу живильного nсередовища. Перед посівом матеріал повинен бути в nрідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл nматеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цього матеріал nзаливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50 °С МПА. Обережно nпохитуючи чашку, круговими рухами по поверхні стола перемішують в ній матеріал, nдосягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до nповного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід nвідділити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це nможна досягнути за допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному nі біологічному роз’єднанні бактерій.

 

Методи виділення чистих культур, засновані на nмеханічному принципі

 

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, був одним nіз найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів. nВін полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить nмікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом nдостатньо кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати nкількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

 

Цього недоліку не має метод nКоха (метод пластинчастих розведень). nР. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або nагар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох nпробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше nвиливався на стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно nкультивувалось при оптимальній температурі. У його товщі утворювались nізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже nживильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури nбактерій.

Метод Дригальського є більш досконалим методом, який широко розповсюджений в повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню сере­довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять nдосліджуваний матеріал. За допомогою металевого або скляного шпателя його nретельно втирають у середовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і nобережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи nшпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – в nтретій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або nпрожарюють у полум’ї пальника. На по­верх­ні середовища в першій чашці nспостерігаємо, як правило, суцільний ріст бакте­рій, у другій – густий ріст, а nв третій – ріст у вигляді ізольованих колоній.

Колонії за методом Дригальського

 

Метод штрихових посівів

 

Метод штрихових посівів сьогодні nвикористовується в мікробіологічних лабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, nнабирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища nбіля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його nпаралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при nоптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії nмікробів.

 

 

n

Ізольовані колонії  різних бактерій

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів nтампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку nПетрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами nвтирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень nКоха, Дригальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють nізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне nсередовище перетворюються в чисту культуру

 

Методи виділення чистих культур, засновані на nбіологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає nцілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних nклітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні:

1. За типом дихання. Всі мікроорганізми за типом дихання поділяються nна дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae nтощо) та анаеробні (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, nClostridium perfringens та ін.). Якщо матеріал, з якого слід виділити nанаеробні збудники, попередньо прогріти, а потім культивувати в анаеробних nумовах, то виростуть саме ці бактерії.

2. За спороутворенням. Відомо, що деякі мікроби (бацили і nклостридії) здатні до спороутворення. Серед них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів nзовнішнього середовища. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії nтермічного фактора, а потім інокулятивно перенесений в живильне середовище. nЧерез деякий час на ньому виростуть саме ті бактерії, які здатні до nспороутворення.

3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium ntuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідок особливостей їх хімічної nбудови стійкі до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, nхаркотиння при туберкульозі попередньо обробляють рівним об’ємом 10 % розчину nсірчаної кислоти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора nгине, а мікобактерії внаслідок їх резистентності до кислот, виростають.

Холерний nвібріон (Vibrio сholerae), навпаки, є галофільною бактерією, тому для nстворення оптимальних умов росту його висівають на середовища, які містять луг n(1 % лужна пептонна вода). Вже через 4-6 год на поверхні середовища з’являються nхарактерні ознаки росту у вигляді ніжної голубуватої плівки.

4. Рухомість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) nмають тенденцію до повзучого росту і здатні швидко розповсюджуватись по nповерхні дещо вологого середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у nкраплинку конденса­ційної рідини, яка утворюється при охолодженні стовпчика nскошеного агару. ­Через 16-18 год вони розповсюджуються на всю поверхню nсередовища. Якщо взяти матеріал з верхньої частини агару, будемо мати чисту nкультуру збудників.

5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків nта інших протимікробних засобів. Внаслідок nособливостей метаболізму бактерій вони можуь мати різну чутливість до деяких nхімічних чинників. Відомо, що стафілококи, аеробні бацили, що утворюють спори, nстійкі до дії 7,5–10 % хлориду натрію. Ось чому для виділення цих збудників nвикористовують елективні живильні середовища (жовтково-сольовий агар, nманіт-сольовий агар), які містять саме цю речовину. Інші бактерії при такій nконцентрації хлориду натрію практично не ростуть.

6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для nгальмування росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, nнавпаки, додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє інгібуванню росту nбактеріальної флори, якщо треба виділити гриби. Додавання фуразолідону в певних nконцентраціях до живильного середовища створює селективні умови для росту nкоринебактерій і мікрококів.

7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені nшкірні покриви. Деякі nпатогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої nкількості ферментів агресії здатні проникати через непошкоджену шкіру. Для nцього шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають nдосліджуваний матеріал, який містить збудника і велику кількість стороньої nмікрофлори. За деякий час тварину забивають, а з крові або внутрішніх органів nвиділяють ­мікроби.

8. Чутливість лабораторних тварин до nзбудників інфекційних захворювань. Окремі nтварини проявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів. Наприклад, при nбудь-якому способі введення Streptococcus pneumoniae білим мишам у них nрозвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна картина nспостерігається при зараженні гвінейських свинок збудниками туберкульозу (Mycobacterium ntuberculosis).

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими nпоняттями як штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом nрозуміють мікроби одного виду, які виділено з різних джерел, або з одного й nтого ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – це nмікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на n(в) живильному середовищі.

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та nїх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних nмікроорганізмів nскладається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) nу стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. nЙого вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим nознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких nвипадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній nдіагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. nПосів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за nдопомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки nзакривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять nу термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – nодержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають nна рідкі живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного сере­довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія – це видимі неозброєним оком nскупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, nкожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх nсклад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є nпроявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що nвиросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер nкраїв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі nдосліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. nСтруктуру колоній дослі­джують у прохідному світлі при малому збільшенні nмікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, nякі характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи nбактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої nособливі колонії.

 

Характеристика колоній за різними ознаками

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За nвеличиною (діаметром) їх поділяють на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм), карликові або точкові n(менше 1 мм). nФорма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна n(амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і nмутними.

За nрельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на nплоскі, опуклі, куполоподібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, nплоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з nприпіднятою у вигляді соска се­рединою.

Поверхня nколоній може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, nгладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth – nгладенький), а шорсткі – R-форми (rough – шорсткий, нерівний).

Форма nшорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, nбородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.

 

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно–молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

При nдоторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, nв’язка або слизова, суха, крихка тощо.

З nпідозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив­чен­ня nморфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо­мість nбактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике nдіагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки nдосліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні nсередовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним nсередовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами nпоміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

Сьогодні, nяк правило, бактеріологи намагаються користуватись стандартними сухими nживильними середовищами, які випускає мікробіологічна промисловість. Такі nсередовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіологічних досліджень nі стандартизувати їх.

На nрідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча nособливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії nздатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не nзмінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчас­тіше nспостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може nбути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середовище над ним може nзалишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, nосад має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як nправило, анаеробні бактерії.

Пристінковий nріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх nстінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

На nтретій день (ІІІ етап дослідження) nвивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її nідентифікацію.

Спочатку nзвертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять nмазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. nЯкщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та nтинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що nкультура чиста.

 

Внутрішньоклітинне розміщення гонококів

Джгутики

Забарвлення за nГрамом

Бактеріальні спори

Капсули бактерій

РІФ

У nдеяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна nзробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх nморфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення nвиду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною nідентифікацією.

Однак nцих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених nмікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні. nНайчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолі­тичні, гемолітичні nвластивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, nплазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітрити тощо. nДля цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають nмікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). nВизначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається nбіохімічною ідентифікацією.

Для nдослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні властивості) nвикористовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у молоці nвиражається розчиненням згустка казеїну, який утворено бактеріями, що згортають nмолоко.

Середовища nіз желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду nнатрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз проявляється nрозрідженням стовпчика середовища.

 

Середовища із желатином для nдослідження розщеплення білків

 Протеоліз nжелатину у різних  бактерій

Оскільки nдеякі види бактерій відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю nознаку можна враховувати при їх ідентифікації.

Пептолітичні nвластивості (здатність розщеплювати пептони – продукти неповного гідролізу nбілка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засівають nмікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів – аміа­ку, nсірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та nпритискають пробкою червоний лакмусовий папірець. В атмосфері аміаку він nнабуває синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату nсвинцю, який за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, nзмочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол nможна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченого 12 % nрозчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває рожевого nкольору. Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим методом nпробкою пробірки притискають папірець, просякнутий спеціальним індикатором n(спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір nйого змінюється на бузково-рожевий або малиновий. В іншому варіанті визначення nіндолу до 48-годинної бульйонної культури бактерій додають 1-2 мл сірчаного nефіру, а потім – реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв nз’являється яскраве малинове кільце.

 

Визначення  індолу з реактивом Ерліха

Визначення виділення індолу   різними  nбактеріями (реактив nЕрліха)

 

У мікробіологічній практиці широко використовуються nдиференційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозволяють nвиявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну nдиференціацію бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого nвиділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Ці середовища є nелективними для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються nвони у сухому вигляді, тому їх приготування в лабораторіях не потребує багато nчасу.

Середовище nЕндо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, nзнебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище має слабке рожеве nзабарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють nлактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-червоний колір з nметалевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на nцьому середовищі безбарвні.

Ріст  колоній  nE. coli  на середовищі Ендо

До nскладу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат nкалію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий nколір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарвлення, а nлактозонегативні – рожевий відтінок.

 

       Колонії лактозопозитивних бактерій на середовищі nЛевіна

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у nскладі агар із солями жовчних кислот лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, nфосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний nчервоний. Мікроорганізми, що розщеплюють лактозу, утворюють колонії рожевого nкольору, а ті, що її не ферментують – безбарвні.

        бактоагар Плоскірєва

У мікробіологічній практиці часто виникає потреба nдослідити ферментацію не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовують nсередовища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.

Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію nхлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та nін.). До нього додають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). nВстановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з nрізними вуглеводами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – nзапаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. nСтерилізують парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після nпосіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають появу червоного nзабарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи nз поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу. Отже, nможливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовише Гісса: nмікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь) або бактерії nрозкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи nкислоти і газу.

Враховуючи, nщо мікроорганізми по-різному діють на вуглеводи (розкладають або не nрозкладають), при кінцевому обліку результатів спостерігають пробірки із nзміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а nтакий ряд називають строкатим рядом Гісса.

Строкатий nряд Гісса

Зараз nу більшості випадків користуються набором сухих середовищ для визначення цукролітичних nферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої nгрупи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою nкислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності nгазу спостерігаються бульбашки або розриви живильного середовища у товщі агару. nПри підкисленні середовища з індикатором ВР воно стає синім, а при nпідлужнюванні – червоним (бромкрезоловий пурпурний при утворенні кислоти дає nдещо фіолетове та лимонно-жовте забарвлення, а бромтимоловий синій – nзеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають відповідно інтенсивно nфіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

Випускаються nтакож сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького.

Середовище nРессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та nіндикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утворився nстовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею nспочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії nферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього nсередовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому nвипадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спосте­рігають nза появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною nОлькеницького

Трицукровий nагар із сечовиною Олькеницького – більш складне середовище порівняно з nпопереднім. Він дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози, глюкози, nутворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До складу nсередовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, nкомплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор nфеноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір.

При nрозщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середовище в жовтий колір. nОскільки глюкоза наявна в невеликих концентраціях (0,1 %), в аеробних умовах n(скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через n18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому nутворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного nкольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються nкислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, nякі розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці n(жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 nразів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще невичерпані, nтому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за рахунок nрозщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув рН у лужну nсторону).

       Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, nводень) при ферментації цукрів, з’являються розриви середовища або відбувається nскупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.

Сірководень nмікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячуючи ферменту тіосульфатредуктазі. nВзаємодіють із сірководнем солі заліза, які, вступаючи з ним у реакцію, nутворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного кольору в nстовпчику.

Уреаза, nяку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, nпід впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності уреазопозитивних nштамів провести облік ферментації цукрів неможливо. В таких випадках необхідно nвикористовувати інші середовища.

За nостанні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використовувати nспеціальні тест-системи для визначення різноманітних властивостей бактерій: n“Roche”, “API”, “Enterotest”, пластини та диски індикаторні біохімічні. Вони nзручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноманітних nознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів.

Тест nсистеми  nRoche

Гемолітична nактивність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх вірулентності, nтому її визначення стало рутинною процедурою будь-якої спеціалі­зованої лабораторії. nЗ цією метою використовують кров’яний МПА. Його готують з розтопленого та nохолодженого до 45-50 °С живильного агару, до якого додають 5-10 % nдефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров’ю nретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у чашки Петрі. nЯкщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів посіву nутворюються зони просвітління на матовому червоному фоні. За кольором гемолізу n(безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (a, b, g тощо).

Зони nгемолізу навколо колоній

 

Визначення nтипу гемолізинів за кольором

 

Альфа-гемоліз                        Бета-гемоліз                             Гамма-гемоліз

 

Щоб nвиявити ліполітичні властивості мікробів, до складу живильних середовищ вводять nліпіди або жироподібні субстанції – твіни. Бактерії за таких умов утворюють nрайдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

 

ДНК-азний  nтест   

 

 

Лецитиназний nтест   Staphylococcus aureus

 

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу nсередовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. nФіксуючи час зміни кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження nредукуючої активності.

Декарбоксилазну активність nбактерій оцінюють на спеціальних середовищах з амінокислотами (лізином, nорнітином, глютаміновою кислотою та ін.) і відповідними індикаторами.

З метою встановлення видової належності бактерій часто nвивчають їх антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними nвластивостями. ­Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні nсубстанції. Зокрема, представники родини ентеробактерій (ешеріхії, сальмонели, nшигели) містять оболонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний nК-антиген. Вони не­однорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох nваріантах. Їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. nТаке визначення виду бактерій носить назву серологічної nідентифікації. Його відносять до одного з головних методів nвстановлення виду виділеної культури. Найчастіше використовується орієнтовна nреакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні nдіагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), а потім у nкожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За nдекілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації.

 

 

 

 

 

Реакція аглютинації на склі ­

 

Утворення аглютинату (пластівців) nсвідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної nсироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності nпозитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті n(реакція аглютинації Грубера).

При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію nпроводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на nвизначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції nпреципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та nпапірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи nлабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які nвикликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз nтощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як nоб’єкти – найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливим при nвиділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального nпрепарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків n(метод дифузії в агар, диско-дифузійний метод). Для цього на поверхню спеціального nщільного живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру nмікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками. nПосіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони nзатримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон nвизначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких nштамів.

 

 

 

Визначення чутливості до антибіотикі диско-дифузійним методом

 

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, nантигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний nвисновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або n“Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій

 

У лабораторній практиці часто доводиться працювати з nанаеробними мікроорганізмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж nаероби, частіше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу nкисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними nскладніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.

Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники nвід токсичного впливу атмосферного кисню. Тому матеріал із вогнищ гнійної nінфекції рекоменду­ється забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час nміж взяттям матері­алу та посівом його на живильне середовище повинен бути nмаксимально коротким.

Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують nспеціальні живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький nокисно-відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – nрезазурин, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При nйого зростанні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: nрезазурин забарвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в nголубий. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ для nкультивування анаеробних мікробів.

Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в nсередовище не менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє nзменшенню надхо­дження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням nсвіжих (не пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних nсередовищ.

Слід врахувати, що через особливості бродильного типу nметаболізму анаеробних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти nі вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий nнастої, соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, nтриптон. Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, nменадіон, цільна або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекулярний nкисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умовою nкультивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд методів n(механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.

Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне nсередовище його обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого nкисню. З цією метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а nпотім швидко охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження nпроникненя кисню в середовище його заливають шаром стерильної вазелінової олії nабо парафіном.

3. Стовпчик живильного nсередовища у пробірках повинен бути достатньо високим (10-12 см). Кисень, як правило, nдифундує в товщу стовпчика на глибину до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для nкультивування анаеробних мікробів.

4. Евакуаційно-замісний nметод полягає у використанні анаеростатів. Вони представляють собою герметичні nметалеві або пластмасові банки, з яких можна викачати кисень і замінити його nінертним газом (гелій, азот, аргон).

 

 

 

 

Евакуаційно-замісний метод  створення nанаеробних умов

 

 

Допускається використання nтрикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 % диоксиду nвуглецю та 10 % водню. Деколи nдопустимим вважається використання природного газу. Для поглинання кисню, який nзалишається в анаеростаті, використовують паладієві каталізатори. З метою nпоглинання водяної пари використовують хлорид кальцію, силікагель тощо, які nпоміщають на дно анаеростата.

 

Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних nпоглинати кисень. З цією метою допустимим є застосування лужного розчину nпірогалолу. При цьому враховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл nємності герметичної посудини, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N nрозчину гідроксиду натрію.

Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na₂S₂O₄). nДля зв’язування кисню в 1 л nповітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжого 20 % розчину Na₂S₂O_{4 n}і 16 мл 50 % гідроксиду калію.

2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст nоблігатно-анаеробних бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем nокисно-відновного потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн n(0,03-0,0,5 %), тіо­гліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), nсульфід натрію, аскорбінову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.

Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки nпаренхіматозних органів тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин n(картопля, інші коренеплоди).

Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища nвимірюють або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, nнейтральний червоний, феносафранін).

3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які nдозволяють створити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних nпластикових пакетах тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating nBox”.

 

Газогенеруючі системи для створення анаеробних умов

 

До її складу nвходять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу n(таблетки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий nкаталізатор, який поглинає кисень.

Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого nзнаходиться шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” nнадрізають но­жицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у nмікроанаеро­статі. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, nякий виділяється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота nпродукується при взаємодії бікарбонату натрію з лимонною кислотою.

 

 

 

Біологічні методи. 1. Метод Фортнера. Метод полягає в nспільному культивування на одному середовищі аеробних і анаеробних nмікроорганізмів. Спочатку по діаметру чашки вирізають полоску агару шириною до n0,5-1,0 см. nЗ одного боку засівають досліджуваний метралі, що містить анаеробні збудники, а nз іншого – мікроби, що є індикатором анаеробних умов (Serratia marcescens або n“чудесна паличка”). Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За nдеякий час на поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і nанаеробних мікробів. При поглинанні кисню Serratia marcescens дає ріст nблідо-рожевих або безбарвних колоній, а при порушеннях герметичності – nяскраво-червоні. На іншій половині чашки виростають колонії анаеробних nмікробів.

2. Метод Хеннеля (“годинникових скелець”). Він є своєрідною nмодифікацією попереднього. Матеріал, що містить анаеробні збудники, засівається nна поверхню живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху він nпокривається “годинниковим склом”, заповненим шаром МПА і засіяним Serratia nmarcescens. Аеробні мікроби, поглинаючи кисень, створюють умови для nсприятливого росту анаеробних збудників.

У високо спеціалізованих лабораторіях користуються nспеціальною анаеробною технікою, яка включає використання живильних середовищ nбез кисню із відновлювачами, виконання посівів і пересівів в атмосфері інертних nгазів, вуглекислоти тощо.

За останні роки створено стаціонарні анаеробні бокси, які nмістять все необхідне для створення анаеробних умов культивування, включаючи nтермостати. Як правило, такі камери заповнюються трикомпонентною газовою nсумішшю. Бактеріолог працює в камері, перебуваючи зовні, застосовуючи гумові nрукавиці, вмонтовані в неї. Таке устаткування має незаперечні переваги, які nполягають у тому, що повністю виключається контакт кисню з досліджуваним nматеріалом.

 

Виділення та ідентифікація анаеробних nмікроорганізмів

 

Враховуючи сучасний розвиток мікробіологічної науки, виділяти nта ідентифікувати культури анаеробних мікроорганізмів можна аналогічно аеробним nбактеріям. Обов’язковим при цьому є дотримання на всіх nетапах дослідження умов анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну nгазову суміш (у певному співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи nсистему “Gas Generating Box”.

 

Стаціонарний анаеробний бокс

 

Однак збудники правця, ботулізму, nгазової анаеробної інфекції можна виділяти та ідентифікувати за іншою схемою.

На першому nетапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості nклінічного матеріалу, роблять мазок і забарвлюють його за методом Грама. Після цього матеріал засівають на nсередовище Кітта-Тароцці та молоко. Попередньо середовище регенерують на nкиплячій водяній бані протягом 10-20 хв і охолоджують. Безпосередньо після nпосіву матеріалу середовище нагрівають на водяній бані при 80°С протягом 20 хв nдля знищення вегетативних неспорових форм мікробів. Середовища ставлять у nтермостат і при температурі 37 °С культивують 1-3 доби.

На другому етапі nвивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння, ­утворення осаду та газу на nсередовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Оскіль­ки середовище nКітта-Тароцці зверху залите шаром вазелінової олії для запобігання доступу nкисню, в нього занурюють пастерівську піпетку, набирають рідину, з якої готують nмазок, фарбуючи його за методом Грама. Під мікроскопом у мазку можна бачити nвеликі грампозитивні паличкоподібні бактерії. Після цього проводять посів nматеріалу за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольо­ваних nколоній.

За методом Вейнберга готують декілька вузьких високих пробірок (3-4) з nрозтопленим і охолодженим до 42-45 °С цукровим м’ясо-пептонним агаром. Можливе використання nсередовища Вільсон-Блера. Матеріал із середовища Кітта-Тароцці вносять у першу nпробірку за допомогою пастерівської піпетки й ретельно перемішують, потім nпереносять у другу, а далі – в третю. Для застигання агару їх швидко nохолоджують під струменем холодної водопровідної води. За рахунок цього живі nмікробні клітини фіксуються в певних ділянка агару. Після застигання агару nпробірки культивують при оптимальній температурі протягом 1‑2 діб для nутворення ізольованих колоній.

Створення nанаеробних умов за методом Вейнберга

 

Вміст кожної пробірки можна, крім того, всмоктати у nпастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи, щоб не було бульбашок nповітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, nякий ­закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді nкапіляра. Після nзаповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для nкультивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. nДля того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, nрозламують, ­колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, переносять у nвідповідне середовище.

Для nвиділення ізольованих колоній за методом Цейсслера nматеріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі nпастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять nпосів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають nдругу чашку, а потім і третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять nв анаеростат, в якому створюють анаеробні умови, а потім – у термостат при nтемпературі 37 °С на 2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, nякі виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, nвеличина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній nготують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у nсередовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний nчас при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту nчистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту nі проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних nмікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, nбіохімічними та біологіч­ними ознаками. Обов’язково використовують визначення nтоксигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації nна лабораторних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості nмікроорганізмів.

Таким чином, на підставі вивчення різноманітних властивостей nмікроорганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду.

 

Середовища nдля культивування анаеробних мікроорганізмів

 

Середовище nКітта-Тароцці готують на основі бульйону Хоттінгера, до якого додають nшматочки бичачої печінки або мяса. Стерилізують його при 1 атмосфері протягом n30 хв. nАктивна реакція середовища – 7,4-7,6. Після посіву матеріалу середовище nзаливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см.

Анаеробний кров’яний агар готують на основі еритрит-агару. До nйого складу входять також спеціальні добавки: середовище 199 (10 %), гемін (10 nмкг/мл), твін-80 (0,1 %), метадіон (10 мкг/мл), цитратна кров (до 5 %) тощо. nПісля стерилізації його розливають у чашки Петрі. Використовують не пізніше, як nчерез 2 год після виготовлення.

Жовтковий агар. У розтоплене і охолоджене до 56-60 °С середовище на nоснові еритрит-агару додають суспензію курячого жовтка (20 %), глюкозу (0,2 %), nгемін (10 мкг/мл) і розливають у чашки Петрі. Середовище використовують для nвизначення лецитиназної активності збудників, зокрема C. perfringens. nПри наявності лецитинази навколо колоній утворюються зони помутніння.

Комерційне середовище для контролю стерильності. Його можна використову­вати як транспортне. Для nполіпшення росту анаеробних бактерій до його складу можна вводити спеціальні nдобавки, такі як середовище 199, гемін, твін-80, метадіон, цитратна кров тощо.

Середовище Вільсон-Блера. Його готують на основі розтопленого nй охолодженого до 60 °С 1 % цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 nмл 10 мл стерильного 20 % розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 % розчину хлориду nзаліза. Готове середовище не стерилізують.

Його використовують для прискореної діагностики газової nанаеробної інфекції, викликаної Clostridium рerfringens. Вже через 1-2 nгод спостерігають зміну середовища: воно чорніє внаслідок відновлення сульфіту nнатрію в сульфат, який взаємодіє з хлоридом заліза, утворюючи сульфід заліза. nЗ’являються також розриви агару внаслідок інтенсивного газоутворення.

Лакмусове молоко. Готують середовище із свіжого молока. Попередньо його nкип’я­тять і залишають у прохолодному місці на одну добу. Знімають верхній шар nжиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують, і 10 % розчином бікарбонату nнатрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10 % nлакмусової настойки та ідентичну кількість 10 % розчину бікарбонату натрію, щоб nпіна молока набула синьо-фіолетового відтінку. При підлужуванні молока воно nстає синьо-фіолетовим, при підкислюванні – рожевим аж до червоного.

 

Ідентифікація nмікроорганізмів за допомогою бактеріофагів

 

Бактеріофаги мають виражену nлітичну дію на мікроорганізми. Цю особливість використовують для визначення їх виду. З цією метою у дві nпробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. nПотім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки nінкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність nбульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість nмікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.

 

 

Літична дія бактеріофагів

Можна з цією метою використати щільне живильне середовище, на nяке газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок nна них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного nрозведення бактеріофагу, яке вказане на ампулі. Посіви інкубують в термостаті nпри 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які nсвідчать про літичну дію бактеріофагу. Позитивний результат свідчить про nналежність бактерій до певного виду.

Фаготипування мікроорганізмів проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації nдля визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці nстафілококових, кишкових та інших інфекцій.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) nзбудників. Для цього дно чашки з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів nподіляють на квадрати. Вирощують чотиригодинну бульйонну культуру nдосліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють nрівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку nпідсушують у термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню агару в nкожний квадрат капають піпеткою бактеріофаги відповідних розведень. Посіви nставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 nгод, після чого оцінюють результати. Облік результатів проводять на темному nфоні за допомогою лупи. Залежно від ступеня чутливості культури до nбактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюється за чотириплюсовою nсистемою: від лізису, який зливається до його відсутності.

 

 

 

 

                        Фаготипування мікроорганізмів

Враховуючи, що чутливість nбактерій до фагу є достатньо постійною ознакою, порівнюють фаготиии nдосліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного nджерела інфекції. При їх nзбігу роблять висновок про виявлене джерело інфекції.

 

Визначення бактеріоциногенності мікроорганізмів

 

Бактеріоцини є речовинами антибіотичної природи, які продукуються nрізними бактеріями. Вони мають досить вузький спектр протимікробної дії, nспрямований проти філогенетично близьких збудників. Цей тест використовують з nепідемі­ологічною метою для виявлення джерела інфекції, а також для nідентифікації певних груп бактерій.

 

 

Вивчення бактеріоциногенності иікроорганізмів

Для визначення бактеріоциноварів nна поверхню агару в чашці Петрі у вигляді смужки по діаметру засівають nбактеріологічною петлею культуру збудника. Чашку інкубують у термостаті при оптимальній температурі nпротягом 24-48 год, потім мікроорганізми вбивають за допомогою УФВ або парів nхлороформу. Культуру обережно знімають з поверхні агару за допомогою nшліфувального скла, і до неї перпендикулярно штрихами бактеріологічною петлею nпідсівають 4-годинні бульйонні культури індикаторних штамів. Після n18-24-годинної інкубації при опти­мальній температурі оцінюють чутливість nіндикаторних штамів до бактеріоцинів за величиною зон затримки росту. Такий nпідхід дозволяє визначити бактеріо­цинотип досліджуваних мікроорганізмів.

Для визначення чутливості досліджуваного штаму до певних nбактеріоцинів у щільне живильне середовище уколом засівають індикаторні nбактерії, які продукують певні типи бактеріоцинів. Після інкубування в nтермостаті мікроби, які виросли, інактивують за допомогою парів хлороформу або nультрафіолетового опромінення. Потім на поверхню чашки заливають розтоплений і nохолоджений до 45°С МПА, змішаний з 0,2 мл 4‑годинної бульйонної культури nдосліджуваного штаму. Після того, як агар за­стигне, чашку знову поміщають у nтермостат і інкубують при оптимальній температурі протягом доби. За діаметрами nзон затримки росту культури оцінюють чутливість її до бактеріоцинів.

 

Молекулярно-генетичні методи

Для виявлення та ідентифікації бактерій, вірусів, грибів і nнайпростіших ­останнім часом почали широко використовувати nмолекулярно-генетичні методи.

Реакція гібридизації ДНК і РНК (реакція nгенних зондів). nПослідовність нуклеотидів ДНК і РНК є унікальною для геномів всіх nмікроорганізмів. Будь-яку ділянку нуклеїнової кислоти можна визначити за nдопомогою комплементарної копії ДНК чи РНК, міченої ферментом або радіоактивною nміткою (ДНК- і РНК-зонди). Такі зонди отримані для більшості патогенних nбактерій і вірусів. За їх допомогою проводять ідентифікацію ДНК або РНК nзбудників бактеріальних і вірусних інфекцій у клінічному матеріалі. Реакція nмолекулярної гібридизації є дуже чутливою і високоспецифічною. Вона дає змогу nвиявляти ДНК або РНК в дуже малих кількостях (1-10 пг).

Методика реакції генних зондів зводиться до того, що виділені nз патологічного матеріалу ДНК або РНК збудників денатурують і наносять на nспеціальні мембрани з нітроцелюлози.

 Після чого вносять ДНК- або РНК-зонди, nвитримують певний час, роблять багаторазову промивку, щоб видалити реагенти, що nне проре­агували. Якщо використовували зонди з радіоактивною міткою, результат ­визначають nза допомогою g-лічильника. У випадку, коли зонд мічений ферментом n(наприклад, пероксидазою), то до такого зонда додають субстрат (наприклад, nортофенілдіамін). Ферментація субстрату призводить до зміни кольору, який можна nспостерігати неозброєним оком.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – один із найновіших методів nвиявлення та ідентифікації бактерій і вірусів у досліджуваних матеріалах. nПринцип реакції базується на багаточисленному копіюванні (селективній nампліфікації) до­сліджуваної ДНК ферментом ДНК-полімеразою. Утворені копії ДНК nідентифікують за допомогою методу електрофорезу.

 

Схема полімеразної ланцюгової реакції

 

Реакцію проводять в три етапи. На першому етапі при nтемпературі 95 °С проходить денатурація двониткової молекули ДНК, її nрозплетення і розходження ­ниток.

На nдругому етапі (ренатурація) відбувається гібридизація праймерів, тобто nутворення дволанцюгових комплексів праймер-матриці, які необхідні для nініціювання синтезу ДНК. Температура суміші при цьому знижується до 55 °С.

На nетапі синтезу (75 °С) проходить подовження комплементарних ниток ДНК за nдопомогою ферменту ДНК-полімерази. Проводять 15-35 циклів синтезу.

Багаторазове nповторення приводить до збагачення ДНК у досліджуваному матеріалі.

Метод nПЛР дуже чутливий. Його використовують для виявлення будь-якого інфекційного nагента, якщо відома нуклеотидна послідовність гена (або його фрагмен­та), nспецифічного виключно до даного збудника. Доцільно використовувати ПЛР у тих nвипадках, коли бактерії чи віруси мають високу мінливість і знаходяться у до­сліджуваному nматеріалі в малій кількості (навіть одна молекула геномної ДНК).

Зараз ПЛР належить до високоефективного nмолекулярно-генетичного ­методу, який доступний багатьом лабораторіям. nТривалість дослідження становить 2‑3 години. Особливо доцільно nвикористовувати його при визначенні та ідентифікації збудників туберкульозу, nсифілісу, гонореї, мікоплази, вірусів СНІДу, герпесів, гепатитів, рота- та ентеровірусів.

Стерилізація – повне знищення nвегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на певних предметах, nматеріалах, живильних середовищах.

Види стерилізації:

•        nПрожарювання в nполум’ї пальника

•        nкип’ятіння

•        nТекучою парою

•        nПарою під тиском в nавтоклаві

•        nСухим жаром

•        nПастеризація

•        nТиндалізація

•        nХімічна

•        nХолодна n(механічна)

 

СТЕРИЛІЗАЦІЯ МЕХАНІЧНИМ СПОСОБОМ

 

Тиндалізація – стерилізація на nводяній бані, при температурі 58-60°С протягом години 5-6 днів nпідряд.

Пастеризація – одноразове nпрогрівання матеріалу до температури нижче 100 °С, при якій знищуються, в першу nчергу вегетативні форми мікроорганізмів.

Дезинфекція – сукупність фізичних, nімічних і механічних способів знищення вегетативних і спорових форм патогенних nі умовно-патогенних мікроорганізмів.

Види дезинфекції:

•        nПрофілактична

•        nВ епідемічному nвогнищі

•        nХімічна n(хлоровмісні препарати, альдегіди, спирти і т.д.)

•        nФізична n(спалювання, дія жару, тиску, використання ультразвуку)

Антисептика – комплекс nлікувально-профілактичних заходів, спрямованих на знищення або пригнічення nросту мікробів у рані, на поверхні шкіри чи слизових оболонок.

Асептика – система профілактичних nзаходів, спрямованих проти проникнення мікробів у рану, тканини, органи nхворого.

 

 

Основні методи стерилізації

Головний nнапрям у боротьбі з інфекційними хворобами – профілактичний. У зв’язку з цим у nдіяльності лікувальних закладів велике значення має попередження попадання nзбудників захворювань в організм людини або інші об’єкти. Це проводиться добре nрозробленими й апробованими методами мікробної деконтамінації. Основні з них – nстерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

 

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне nзнищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, матеріалах, nу живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, nперев’язочний і шовний матеріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторіях – живильні середовища, nпробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому перед стерилізацією необхідно nвміти підготувати інструменти, посуд, пробірки, піпетки, перев’язочний матеріал nта інше.

Інструменти nобробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують у проточній воді, nпотім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж розчині 0,5-1 хв, nпрополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у сухожаровій шафі при n80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, nфлакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загортають у папір по n25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилізаційні коробки n(бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця затикають ватою, nобгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали по 10-15 штук. nЖивильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закривають пробками.

У nлабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою nтемпературою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує nбагато способів стерилізації з допомогою високої температури. Ефективність nтакої стерилізації при нагріванні характеризується показником D – ­часом, який nнеобхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення популяції nбактерій (на 90 %). Його величина вимірюється, як правило, у ­хвилинах.

Прожарювання в полум’ї пальника – швидкий й абсолютно надійний спосіб. Ним nстерилізують бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця.

Кип’ятіння nпротягом 40 хв у спеціальних стерилізаторах використовують для обробки хірургічних nінструментів, шприців, голок, гумових трубок. Для підвищення температури nкипіння й усунення жорсткості води додають 1 % бікарбонату натрію. Цей метод не nзабезпечує повної стерилізації, оскільки спори деяких видів бацил і клостридій nвитримують кип’ятіння протягом декількох годин.

Сухожарова nшафа

 

Стерилізацію nсухим жаром у сухожаровій шафі nпроводять при 160 °С протягом 120-150 хв, або при 180 °С – 45-60 хв після nдосягнення заданої температури (рис. 15). Стерилізують переважно скляний посуд. nПеревага цього методу над іншими полягає в тому, що не пошкоджується скло, не nвідбувається корозії металевих інструментів. Його можна використати для nстерилізації термостійких порошків та інших речовин. Одним з недоліків даного nметоду є достатньо тривалий строк стерилізації. Крім того, при високих nтемпературах може відбутися обвуглювання і загоряння ватних пробок, паперу, в nякий загорнутий посуд.

 

 

 

Стерилізація nпарою під тиском – найнадій­ніший метод повного знищення бактерій та їх спор. Він nдосягається дією пари, температура якої під тиском вища, ніж при кип’ятінні. nТаку стерилізацію проводять в автоклаві. Стерилізація парою під тиском більш nефективна, ніж дія сухого жару.

Існують різноманітні nелектричні автоклави, які відрізняються між собою за розмірами, формою, nрозташуванням (вертикальні та горизонтальні), вони можуть бути з ручним nкеруванням, напівавтоматичні й автоматичні.

         Конструктивно всі типи nавтоклавів представляють собою двостінний міцний металевий котел циліндричної nформи з кришкою, яка герметично закривається, що дозволяє витримати високий nтиск (рис. 16). Внутрішня частина автоклаву є стерилі­заційною камерою (1), в nяку вміщують матеріал, що стерилізується. Вона має спеці­альний кран для виходу nповітря (2) і манометр (3) із запобіжним клапаном (4). Манометр визначає nробочий тиск пари в камері, а запобіжний клапан сприяє виходу надлишку пари з nметою запобігання розриву автоклава. Дистильовану воду в водопарову камеру nзаливають через спеціальну лійку (6), стежачи за її рівнем у спеці­альній nводомірній трубці (7). Пара із водопарової камери поступає в стерилізаційну nкамеру через спеціальні отвори в її верхній частині. Сучасні автоклави мають nманометри і автоматичні регулятори включення і відключення струму, тримаючи ­заданий nтиск, а отже й задану температуру всередині автоклава. Робота з ним вимагає nсуворого дотримання правил безпеки, які викладені в інструкції до кожного nавтоклава.

Основні nправила роботи з автоклавом

1. Перед початком nроботи слід ретельно оглянути автоклав, його контрольно-вимірювальну апаратуру, nперевірити пружність резинової прокладки, кріплення кришки стерилізаційної nкамери.

2. Через спеціальну nлійку до рівня відмітки на водомірній трубці в автоклав заливають дистильовану nводу і закривають кран.

3. nНеобхідний матеріал вміщують у стерилізаційну камеру і закривають герметично nкришкою автоклава. Бажано стежити, щоб предмети не розташовувались в автоклаві nдуже тісно, оскільки між ним повинна проходити пара. В іншому випадку вони nможуть залишитись нестерильними через відсутність нагріву до необхідної nтемператури.

4. Відкривають кран, nякий з’єднує стерилізаційну камеру з оточуючим середовищем, і включають nелектричний нагрів.

5. Після того, як почався nпроцес утворення пари, необхідно видалити повітря із стерилізаційної камери. nДля цього пару і конденсат відводять у спеціальну посудину з водою або в nканалізацію. Чисту пару, яка виходить з автоклава з рівномірним шиплячим nзвуком, протягом 10 хв пропускають через камеру, а потім закривають nпаровідвідний кран.

6. Доводять тиск nпари до рівня, якого вимагає режим стерилізації. Для цього враховують nспіввідношення показників тиску манометра і температури кипіння води (табл. 1).

7. По завершенні nциклу стерилізації автоклав відключають. Тиск в автоклаві поступово падає і nзрівнюється з атмосферним. Тоді відкривають випускний кран і поступово nвипускають надлишок пари у посудину з водою. Недотримання цих правил може nпризвести до різкого зниження тиску, внаслідок чого рідина в пробірках, колбах, nякі стерилізувались, бурхливо закипає, змочуючи ватно-марлеві пробки і навіть nвиштовхуючи їх. Така ситуація порушує стерильність матеріалу.

В автоклаві при 120 n°С протягом 20 хв стерилізують прості живильні середовища (МПБ, МПА), nізотонічні розчини, білизну, перев’язочний матеріал, а при 134 °С – nзнешкоджують заразні матеріали, відпрацьовані культури бактерій протягом 40 хв. nСередовища з вуглеводами не витримують такої обробки, оскільки вони nкарамелізуються, у зв’язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Стерилізація текучою парою (100 °С) проводиться в автоклаві з незагвинченою nкришкою. При нагріванні пара проникає між вкладеними об’єктами й стерилізує їх. nТаким способом обробляють середовища з вуглеводами. Оскільки одноразова дія nпари не вбиває спори, застосовують дробну стерилізацію – 3 дні підряд по 30 хв. nТі спори, які не загинули при першому нагріванні, проростають до наступного дня nу вегетативні клітини й гинуть при другій і третій обробці.

Для тих речовин, які nне витримують 100 °С (білкові рідини, вітаміни, деякі ліки), застосовують тиндалізацію n– стерилізацію на водяній бані при температурі 58-60 °С протягом години 5-6 nднів підряд. Однак цей метод зараз широко не застосовується, оскільки вимагає nзначних затрат часу на його проведення.

Пастеризацією вважають одноразове прогрівання матеріалу до nтемператури нижче 100 °С, при якій знищуються, в першу чергу, вегетативні форми nмікроорганізмів. Цей спосіб вперше запропонував Л. Пастер для знищення nбезспорових форм мікробів, переважно патогенних і умовно-патогенних видів. nСпори при цьому залишаються живими, а мікроорганізми, що залишились, стають nпомітно ослабленими. Метод широко використовують у харчовій промисловості, коли nпри кип’ятінні можуть втратитись органолептичні властивості продуктів. Так nпроводять термічну обробку молока, пива, вина, різних соків при 70 °С nпротягом 30 хв або при 80 °С – 5-10 хв. Пастеризовані продукти зберігаються на nхолоді.

Згортання n(ущільнення) сироватки і яєчних середовищ з одночасною їх стерилізацією nпроводять у спеціальних згортувачах Коха з електричним піді­грівом (рис. 17). nАсептично приготовлені сироватки та яєчні середовища у нахиленому положенні nпрогрівають однократно при 80-90 °С одну годину. При підозрі на мікробну nконтамінацію їх прогрівають при тій же температурі три дні підряд.

Механічні методи nстерилізації широко використовуються nв мікробіологічних лабораторіях. Особливо за тих умов, коли підвищена nтемпература може зруйнувати субстрати. Це стосується рідких середовищ і рідин, nякі містять білки, вітаміни, антибіотики, вуглеводи, леткі речовини тощо. Метод nможна застосувати для очищення бактеріальних токсинів, бактеріофагів від nмікроорганізмів. Однак цей метод вважається менш надійним порівняно із nкласичною стерилізацією.

Фільтр

 

 

Залежність між надлишковим тиском nпари, температурою кипіння води  і nтривалістю стерилізації

Механічна (холодна) стерилізація проводиться nза допомогою фільтрування через дрібнопористі антибактеріальні чи антивірусні фільтри. nЇх створюють із спеціальних матеріалів, пронизаних порами, які мають різну nформу та йдуть через фільтр звивисто. Фільтри можна виготовляти із позитивно nзарядженого матеріалу, тоді бактерії, що несуть на поверхні негативний заряд ще nй взаємодіють з ним електростатично, а не тільки механічно внаслідок різного nдіаметру бактерій і пор. Щоб попередньо перевірити якість фільтрів, nвикористовують дрібні тест-мікроорганізми (Serratia marcescens або Pseudomоnas naeruginosa). Фільтрат висівають на живильне середовище і витримують при nоптимальній температурі протягом 5 днів. При відсутності росту тест-бактерій nможна застосовувати фільтр для стерилізації.

Промисловість різних nкраїн випускає найрізноманітніші фільтри, які різняться за матеріалом nвиготовлення й діаметром пор. Мембранні або колоїдні фільтри, які виготовляють nіз нітроцелюлози, представляють собою диски діаметром до 35 мм. Нижче наведено nхарактеристики різних фільтрів.

 

Типи фільтрів

Інший тип фільтрів, які виготовляють з інфузорної землі (діатоміту або кізельгуру), одержав назву свічок Беркефельда. За своїм зовнішнім виглядом вони подібні до циліндрів, nзамкнутих з одного з кінців. Свічки маркують літерами V, N i W, що відповідає nдіаметру пор в межах відповідно 8-12, 5-7 і 3-4 мкм.

Випускаються ще й стерилізуючі nфільтри із скла „Пірекс” у вигляді двошарових дисків. Поділяють фільтри за nрозміром пор на три основних типи: С, М і Р. Розмір пор у них відповідно nстановить понад 1,7, від 1 до 1,7 і менше 1 мкм.

Перед роботою фільтр nзакріпляють у спеціальному тримачі. Зокрема, азбестові пластинки вміщують між nциліндричною й опорною частиною металевого корпусу апарата Зейтца. Обидві nчастини з’єднують гвинтами. Зібраний фільтр вставляють у гумовий корок колби nБунзена з боковим відростком. Повністю вмонтований фільтр загортають у папір і nстерилізують в автоклаві. Рідину для фільтрування наливають у металевий nциліндр, з’єднують боковий відросток колби з вакуумним насосом, щоб створити nвакуум у колбі й прискорити фільтрування. Фільтрат у колбі буде стерильним.

Хімічним nспособом стерилізують вироби з гумових і полімерних матеріалів. nДля цього використовують 6 % розчин перекису водню, в який занурюють вироби на n6 год при 18 °С і на 3 год при 50 °С. Можна застосувати розчин дексона з nекспозицією 45 хв при 18 °С. Після закінчення стерилізації вироби двічі nпрополіскують у стерильній дистильованій воді, кожного разу змінюючи її, та nпереносять корнцангом у стерильний бікс.

Інструменти для nендоскопії й автоматичні піпетки можна також стерилізувати спиртом.

Газовий метод стерилізації nпарами формальдегіду, хлороформу, b-пропіолактону, окисом етилену, окисом пропілену, метилброміду, озоном nвикористовують для знезараження ендоскопічних інструментів, апаратів для nштучного кровообігу, радіоелектронного обладнання, пластмасових виробів, nкетгуту тощо. Ефективною зарекомендувала себе суміш окису етилену і бромистого nметилу в спів­відношенні 1:1,44. Для проведення стерилізації газом nвикористовують спеці­альні щільні камери, які герметично закриваються. Для nкожного діючого фактора розроблено свої режими стерилізації. Після завершення nпроцедури газова суміш викачується з камери і замінюється стерильним повітрям. nПредметами, які було простерилізовано вказаним способом, рекомендується nкористуватись не раніше, ніж через 24 год, для того, щоб видалився весь газ.

Одним із методів nстерилізації є застосування різних типів опромінення. У практиці nвикористовуються для цього електрони, гамма-промені, ультрафіолетові nпромені, радіочастотне опромінення.

Електронні прискорювачі nдозволяють фокусувати електрони у вузький спря­мо­ваний пучок високої nпотужності. Цей метод використовують для стерилізації в промис­лових масштабах nхірургічного перев’язочного і шовного матеріалів ще на етапі їх виробництва. nНедоліком даного методу стерилізації є низька проникність променів.

До гамма-опромінення nчутливі вегетативні та спорові форми різноманітних бактерій, грибів, дріжджів, nвіруси. Опромінення потужністю 2,5 Мрад використовується для знезараження nантибіотиків, вітамінів, стероїдних та інших гормонів, пластмасового nодноразового устаткування (чашок Петрі, шприців), хірургічного перев’язочного nта шовного матеріалів тощо.

Стерилізацію за nдопомогою ультрафіолетового опромінення проводять для знешкодження бактерій в nповітрі операційних, палат, боксів, мікробіологічних лабораторій тощо. Для nцього використовують спеціальні бактерицидні лампи різної потужності – БУВ-15, nБУВ-30 та ін. Однак слід пам’ятати, що мікроби можуть бути захищені від дії nультрафіолетового опромінення численними органічними речовинами, пилом та nіншими факторами. Вегетативні форми бактерій у 3-10 разів більш чутливі до УФО, nніж спори.

Методи nрадіочастотного опромінення на сьогодні починають інтенсивно розроблятись, nособливо у харчовій промисловості. Складність їх полягає в небезпеці для nобслуговуючого персоналу (наприклад, перешкоди систем зв’язку, різна частота nопромінення, яка застосовується для знешкодження мікроорганізмів).

Для перевірки nефективності стерилізації, надійності роботи автоклавів застосовують хімічний nта біологічний контроль. Відомі хімічні речовини з певною температурою nплавлення: бензонафтол – 110 °С, антипірин – 115 °С, сірка – 119 °С, nбензойна кислота – 120-122 °С, манноза і сечовина – 132-133 °С. Саме при таких nтемпературах найчастіше здійснюють стерилізацію. Хімічні речовини вміщують у nскляні трубки, додають невелику кількість анілінового барвника (сафранін, nфуксин або метиленовий синій), запаюють і кладуть між об’єктами, що nстерилізуються. Рівномірне забарвлення препарату в колір барвника в трубці nсвідчить про належну температуру в автоклаві, а отже й надійність стерилізації. nДля біологічного контролю стерилізації в автоклав вміщують спеціальні біотести n– смужки фільтрувального паперу, марлі тощо, на яких знаходяться спори бактерій nз відомою термостійкістю, спори відомої чисельності та ін.

Вони розкладаються в nбіксах, які підлягають стерилізації. Після завершення циклу в пробірки з nсмужками заливають живильне середовище та інкубують при оптимальній nтемпературі. Відсутність проростання спор бактерій свідчить про ефективну nстерилізацію.

У таблиці 4 наведено nосновні способи стерилізації різних медичних об’єктів.

 

Спори бактерій, які найчастіше nвикористовують як індикатори

Способи стерилізації nмедичних об’єктів

Контролі nстерилізації

 

Дезінфекція. Дезінфекція – це nсукупність заходів для повного, часткового або селективного знищення потенційно nпатогенних для людини збудників на різних об’єктах довкілля з метою nпопередження передачі збудника від джерела інфекції до сприйнятливого організму.

Оскільки мікроорганізми мають різну чутливість до дезінфікуючих засобів, nвиділяють чотири ступені дезінфекції: A, B, C, D. Дезінфекційні заходи ступеня A передбачають знищення аспорогенних nформ мікробів, рикетсій, мікоплазм, най­простіших. Заходи ступеня B використовуються для nліквідації грибів, деяких вірусів, бактерій, що мають підвищену стійкість n(стафілококи, мікобактерії). Боротьба із збудниками особливо небезпечних nінфекцій (чуми, холери, висипного тифу, меліоїдозу, сапу) вимагає заходів nступеня С. Знищення спор мікроорганізмів і найпростіших – заходів ступеня D.

Заходи дезінфекції, що використовуються в клініках, мікробіологічних, nвірусологічних та інших лабораторіях досить різноманітні. Їх умовно можна поділити nна 2 групи: фізичні та хімічні.

До першої групи можна віднести спалювання використаного nперев’язочного матеріалу, відходів, сміття, пропалювання в полум’ї пальника, дію nсухого жару, автоклавування за різних режимів, використання ультразвуку. Ефективними заходами є кип’ятіння предметів особливо з nповерхнево активними речовинами, дезінфекція повітря за допомогою nультрафіолетового опромінення. Постійно використовуються такі елементарні nзаходи, як вологе прибирання, миття, очищення, витріпування ковдр, простирадл nтощо. Такі заходи хоча й не знищують мікроорганізмів, однак сприяють суттєвому nзниженню їх популяцій на різних об’єктах.

Потужним nкомплексом дезінфекційних заходів виступають численні хімічні препарати – nдезінфектанти. До них пред’являють певні вимоги: 1) протимікробний ефект nширокого спектра дії; 2) висока розчинність у воді, здатність утворювати з nводою або повітрям активні та стійкі суспензії, емульсії, аерозолі; 3) nздатність не втрачати протимікробних властивостей при наявності в середовищі nорганічних домішок; 4) низька токсичність; 5) відсутність алергізуючої дії; 6) nвідсутність пошкоджуючого ефекту щодо предметів, які ними обробляються; 7) nдоступність сировини, з якої виготовляються дезінфектанти, її дешевизна тощо.

Існує nдекілька сотень дезінфікуючих засобів різних груп. Серед них алкоголі, nальдегіди, четвертинно-амонієві сполуки. Найширше використання знай­шли nхлоромісткі препарати. До них належать 0,2-1,0 % хлорне вапно, яке виготовляють nex tempore з 10 % освітлених розчинів цієї речовини; 0,2-1,0 % розчини nхлораміну В або Т; 5 % водні розчини гіпохлориду кальцію; 0,05-0,1 % розчин nтрихлоізоцианурової кислоти (диконіту); 0,1-0,2 % розчин сульфохлорантину. nОкислювачі представлені 1-10 % розчином перекису водню, фенолами та їх nпохідними – 3-5 % розчинами лізолу, карболової кислоти, фенолу. До групи nпрепаратів із солей важких металів належать мертиолят натрію, сулема. Широке nзастосування набули 2-3 % розчин формальдегіду, 3-10 % розчин крезолу та інші. nВикористовуються в практиці й газоподібні дезінфектанти – 40 % водний розчин nформальдегіду, суміші окису етилену з вуглекислим газом (1:10) і окису етилену nз бромідметилом (1:1).

На nпрактиці виділяють поточну та заключну дезінфекцію. nПоточну дезінфекцію проводять для зменшення мікробної контамінації у вогнищах nінфекції. Їй підлягають ліжка, постільна і натільна білизна, рушники, матраци, nподушки, меблі, килими, посуд, інструменти, прилади, що знаходяться на поверхні nрізних об’єктів, повітря, виділення, стічні води тощо.

Зокрема, nповерхні столів, вікон, стелі, стіни, меблі дезінфікують протиранням і миттям з nдопомогою дезінфікуючих розчинів, постільну та іншу білизну перуть у цих nрозчинах. Ліжка, матраци, подушки обробляють у спеціальних камерах nтермохімічними методами, м’які меблі – за допомогою спеціальних аерозолів, nпосуд – зануренням у дезінфікуючі розчини. Обробка виділень і стічних вод nпроводиться термічними і хімічними методами. Повітря приміщень можна nдезінфікувати пропусканням через спеціальні антибактеріальні фільтри, як це nроблять в палатах гнотобіологічної ізоляції, або опромінюючи його nультрафіолетовими променями. Медичні інструменти, прилади спочатку очищають, nдезінфікують, а потім, у разі потреби, стерилізують відомими способами.

Заключна nдезінфекція проводиться з метою знищення збудників інфекційних захворювань у nприміщенні, де перебував інфекційний хворий, і предметах, з якими він був у nконтакті. Така ситуація складається після виписування його з інфекційного nстаціонару, переводу із соматичного відділення в інфекційне тощо.

Для nзабезпечення догляду за проведенням дезінфікуючих заходів розроблену спеціальну nсистему контрою. Вона включає в себе: а) зовнішній і внутрішній контроль nвідділами дезінфекції санітарно-епідеміологічних станцій та лабораторій лікувально-профілактичних nзакладів, який здійснюється візуальним, бактеріологічним, біологічним, хімічним nта іншими методами; б) бактеріологічний контроль проводять, виявляючи у nвогнищах інфекції індикаторних бактерій: при кишкових захворюваннях – кишкові nпалички, при крапельних інфекціях, туберкульозі – стафілококи, у nлікувально-профілактичних закладах – умовно-патогенні мікроорганізми; контроль nздійснюється 1 раз у місяць – один раз у квартал залежно від рангу лабораторії; nв) забір контрольних проб (10-30 штук) проводять не раніше, ніж через 30-45 nхвилин після закінчення дезінфекції; площа змивів не повинна бути меншою, ніж n200 см²; г) змиви беруть стерильними ватними тампонами і засівають nна живильні середовища з дотриманням всіх правил асептики з метою запо­­бігання nконтамінації сторонньою флорою; для виділення бактерій групи киш­кової палички nі золотистих стафілококів користуються спеціальними наборами ­живильних nсередовищ і схемами ідентифікації, визначених відповідними ­інструкціями.

Дезінфікуючі заходи вважаються ефективними, якщо у nпробах не визначаються бактерії групи кишкової палички, умовно-патогенні nмікроби, золотисті стафілококи.