Методична вказівка для студентів

Методична вказівка для студентів

(медичний факультет)

 

ЗАНЯТТЯ № 11 (практичне – 6 годин)

 

ТЕМИ.

1.Реакції осадження білків

3. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові

МЕТА: Вміти: якісно виявляти білок та амінокислоти в розчині та пояснювати його будову у зв’язку з хімічними та біологічними властивостями; виконати гідроліз простого білка; проаналізувати амінокислотний склад гідролізату за допомогою розподільної хроматографії на папері; провести осадження білків та визначати загальну кількість білка в сироватці крові.

 

ПРОФЕСІЙНА ОРІЄНТАЦІЯ СТУДЕНТІВ

Білки виконують в організмі ряд важливих функцій, однією з яких є пластична. Вони є будівельним матеріалом для клітин та тканин. Лікарська і харчова цінність білкових препаратів залежить від їх амінокислотного складу. Гідролізати білків різної природи, а також суміш певних амінокислот використовуються як лікарські препарати для парентерального харчування. Контроль за їх якістю базується на кількісному визначенні загального і амінного азоту, на якісному і кількісному аналізі окремих амінокислот.

Хроматографічний метод визначення вільних амінокислот широко застосовують в клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики окремих захворювань; у фармації – для контролю за якістю і кількістю фармпрепаратів (індивідуальних амінокислот, білкових гідролізатів і лікарських речовин, що складаються із суміші амінокислот).

 

БАЗОВИЙ РІВЕНЬ ЗНАНЬ ТА ВМІНЬ

1. Класифікація, будова та окремі представники амінокислот (курс хімії середньої школи).

2. Біологічна роль, будова та структура білків (курс хімії середньої школи).

 

ПРОГРАМА САМОПІДГОТОВКИ СТУДЕНТІВ

І. Реакції осадження білків.

1.      Загальна характеристика білків (хімічний склад та фізико-хімічні властивості). Використання фізико-хімічних властивостей білків при отриманні і очищенні білкових фармпрепаратів.

2.      Функції білків в організмі.

3.      Структурна організація білків.

4.      Первинна структура білка, методи її визначення (метод Сенджера, Едмана, секвенації).

(будова альфа-амінокислоти, пептидів).

5.      Вторинна, третинна, четвертинна структури білка (визначення, приклади). Доменні білки.

6.      Типи зв’язків, що утворюють структурні рівні білкової молекули: водневий, дисульфідний,  гідрофобний, іонний.

7.      Методи визначення вторинної, третинної та четвертинної структур білка.

8.      Вплив різних фізико-хімічних факторів (рН середовища, температури, радіації та ін.) на структуру та властивості білків.

9.      Будова та склад складних білків: фосфопротеїнів, ліпопротеїнів, нуклеопротеїнів, глікопротеїнів, хромопротеїнів, їх біологічна роль.

10.  Молекулярна маса білків, методи її визначення.

11.  Розчинність білків та фактори, що впливають на цей процес. Фактори стабілізації білкової молекули у розчині.

12.  Методи осадження білків з розчину. Висолювання білків. Фактори, що викликають зворотне осадження, суть їх дії.

13.  Денатурація та ренатурація білків. Фактори, що викликають незворотне осадження, суть їх дії.

14.  Значення реакцій осадження білків в медицині і фармації.

ІІ. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

1.  Основні білки плазми крові, їх фізико-хімічні властивості та функції.

2.  Білки як лікарські препарати.

3.  Причини та наслідки зміни вмісту загального білка плазми крові.

4.  Принцип біуретового та рефрактометричного методів визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

5.  Клініко-діагностичне значення визначення загального білка в сироватці крові.

 

Зразки тестових завдань та ситуаційних задач.

І.Тестові завдання.

1. Які з нижче перерахованих амінокислот є кислими:

A.  Тирозин, фенілаланін;

B.   Аспарагінова і глютамінова амінокислоти;

C.  Аспарагінова кислота і гліцин;

D.  Глютамінова кислота і гліцин;

E.   Метіонін, триптофан.

3.    До складу білка входять протеїногенні амінокислоти. У якому положенні в їх структурі обов’язково повинна бути аміногрупа?

A.  d-положенні;       

B.   b-положенні;

C.  g-положенні;

D.  a-положенні;         

E.   e-положенні.

5. Висолювання – це зворотне осадження білків з розчину під дією:

A.  Солей важких металів

B.   Концентрованих мінеральних кислот

C.  Насичених та напівнасичених солей лужних та лужноземельних металів.

D.  Алкалоїдів

E.   Високої температури

6. Вибрати основні типи вторинної структури природних білків:

A.  γ і β –спіраль;

B.   α – спіраль і β – структура;

C.  ∆ – спіраль;

D.  γ і ∆ – спіраль;

E.   β і γ структури.

 

ІІ. Ситуаційні задачі

1.      Розчин дає позитивну ксантопротеїнову реакцію. Що містить даний розчин?

2.      В пробірці відмічено позитивну нінгідринову реакцію. Які амінокислоти переважають в розчині?

3.      Розчин дає позитивну реакцію Фоля. Які амінокислоти переважають в розчині?

4.      Розчин, що міститься в пробірці, дає позитивну біуретову реакцію та Адамкевича. Що містить даний розчин?

5.      Гідролізат виділеного з молока білка дає позитивну біуретову реакцію та з амоній молібдатом. Який було виділено білок?

 

Відповіді на тести та ситуаційні задачі.

І.Тестові завдання.

 2. B; 3. D;  5. С; 6. В.

ІІ. Ситуаційні задачі

1.      Ароматичні амінокислоти;

2.      a-амінокислоти;

3.      Сірковмісні амінокислоти;

4.      Білок, що містить триптофан (або інші сполуки, до яких входить похідне індолу);

5.      Фосфопротеїни.

Джерела інформації:

Основні:

1. Зіменковський Б.С., Музиченко В.А. Біоорганічна хімія. – Львів: Кварт. – 2009. – 402 с.

2. Миронович Л.М. Біоорганічна хімія: Скорочений курс: Навчальний посібник. – Київ: Каравела, 2008. – 184 с.

3. Мардашко О.А., Миронович Л.М., Стапанова Г.Ф. Біологічна і біоорганічна хімія: Навчальний посібник. – Київ: Каравела, 2008. – 244 с.

4.  Губський Ю.І. Біоорганічна хімія. – Вінниця: Нова книга, 2004. – С. 18-69, 98-114, 114-126.
5.  http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/pharma_2/classes_stud/біологічна та біоорганічна хімія/медичний/і курс/українська/заняття 5. Амінокислоти. білки

 

Додаткові:

1.      Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И., Биоорганическая химия. – М., Медицина, 1991. –С.189-190, 326 с.

2.      Степаненко Б.Н., Курс органической химии. – М., Высшая школа. – 1979. – 296 с.

 

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ ЛАБОРАТОРНОЇ РОБОТИ ( 9⁰⁰ – 12⁰⁰)

Робота 1. Виявлення пептидного зв’язку в білку біуретовою реакцією.

Принцип реакції: Додавання до розчину біуретового реактиву призводить до утворення синьо-фіолетової комплексної сполуки білка або пептиду з купрумом (ІІ) гідроксидом, яка є якісною реакцією на пептидні зв’язки.

Хід роботи: В пробірку помістити 5 крапель яєчного білка, додати рівний об’єм 10 % розчину гідроксиду натрію та 1-2 краплі розчину сульфату міді. Спостерігаємо появу червоно-фіолетового забарвлення.

ІІ. Реакції осадження білків.

Робота 2. Проробити реакції зворотного осадження альбумінів та глобулінів

Висолювання – це зворотна реакція осадження білків великими концентраціями нейтральних солей лужних та лужноземельних металів. Для висолювання найчастіше застосовуються такі солі: (NH₄)₂SO₄, NаСI, Nа₂SO₄, MgSO₄. За цих умов білки, які осаджуються, не зазнають глибоких структурних змін і їх осади можна знову розчинити у вихідному розчиннику, а молекула білка зберігає свої попередні нативні властивості.

До зворотних реакцій осадження належать реакції осадження білків органічними розчинниками ( спиртом, ацетоном) за умов нетривалої дії і низької температури.

Метод висолювання широко використовується для фракціонування суміші білків, коли треба відокремити один білок від іншого (наприклад, альбуміни від глобулінів). Грубодисперсні білки-глобуліни висолюються значно легше, ніж альбуміни напівнасиченим розчином сірчанокислого амонію, тоді як альбуміни – насиченим розчином.

Принцип методу: Реакція висолювання зумовлена дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією його електричного заряду.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: Сироватка крові, насичений розчин сульфат амонію, сульфат амонію в порошку, 10 % розчин їдкого натрію, 1% розчин сульфату міді, паперові фільтри, лійки; піпетки, пробірки.

Хід роботи: У пробірку наливають 2-3 мл сироватки крові, додають рівний об’єм насиченого розчину сульфату амонію і перемішують. В осад випадають глобуліни, які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. У фільтрат, в якому залишились альбуміни, насипають кристалічний сульфат амонію доти, поки сіль перестане розчинятися. Спостерігають випадання в осад альбумінів (100 % насичення), які мають відносно невелику молекулярну масу і великий заряд. Осад альбумінів відфільтровують. Фільтрат перевіряють на відсутність білків за допомогою біуретової реакції. Осади альбумінів і глобулінів на фільтрі розчиняють в 3-5 мл води, щоб впевнитися, що висолювання носить зворотний характер.

Робота 3. Провести незворотне осадження (денатурацію) білків під впливом солей важких металів, концентрованих кислот, загальноалкалоїдних (осаджувальних)  реактивів, високої температури

І. Осадження солями важких металів

Принцип методу: Солі важких металів (міді, свинцю, срібла, ртуті) осаджують білки з розчинів, утворюючи солеподібні і комплексні сполуки, що розчинні у надлишку цих солей, але нерозчинні у воді.

Це пояснюється тим, що надлишок іонів металу, адсорбуючись, спричиняє перезарядку білкового комплексу, внаслідок чого в розчин переходить комплекс зміненого білка з металом. Це явище називається адсорбційною пептизацією.

Властивість білка міцно зв’язувати іони важких металів у вигляді нерозчинного осаду у воді використовується при отруєнні солями ртуті, міді, свинцю тощо. Рекомендують одразу ж після отруєння вживати білки молока або яєць, доки ці солі знаходяться ще в шлунку і не встигли всмоктатись. Після чого у хворого викликають блювоту, щоб вивести отруту.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка, 5 % розчин сульфату міді, 5 % розчин ацетату свинцю, 5 % розчин нітрату срібла, піпетки; пробірки.

Хід роботи: У три пробірки вносять по 5 крапель 1 % розчину яєчного білка. Додають у першу пробірку 2-3 краплі 5% розчину сульфату міді; в другу – 2 краплі розчину ацетату свинцю, в третю – 1-2 краплі 5 % розчину нітрату срібла. У всіх пробірках утворюється осад, нерозчинний у воді. Якщо потім в першу пробірку додати 5-10 крапель 1 % розчину сульфату міді спостерігають розчинення блідо-голубого осаду у надлишку реактиву. У другій пробірці, коли додати 5-10 крапель 5 % розчину ацетату свинцю, осад розчиняється теж. Якщо у третю пробірку добавити 5-10 крапель 5% розчину срібла, то розчинення осаду не відбувається.

ІІ. Осадження концентрованими органічними і мінеральними кислотами

Принцип методу: При дії на білок концентрованих мінеральних і органічних кислот відбувається денатурація білка внаслідок дегідратації та утворення комплексних солей білка з кислотами.

У надлишку всіх мінеральних кислот, крім азотної, осад білка розчиняється. Тому реакція осадження концентрованою азотною кислотою лежить в основі кількісного визначення білка за методом Робертса-Стольнікова-Брандберга.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка, концентровані азотна і сірчана кислоти, 10 % розчин сульфосаліцилової кислоти, 10% розчин трихлороцтової кислоти, піпетки, пробірки.

1.Осадження мінеральними кислотами.

а) Осадження азотною кислотою (проба Геллера)

Хід роботи: На 1 мл концентрованої азотної кислоти обережно нашаровують 1 мл розчину 1% розчину білка. На межі розділу двох рідин утворюється осад у вигляді білого кільця.

б)Осадження сірчаною кислотою.

Хід роботи: До 1 % мл розчину яєчного білка обережно по стінці пробірки додають кілька крапель концентрованої сірчаної кислоти. Випадає осад.

2. Осадження органічними кислотами: трихлороцтовою та сульфосаліциловою кислотами

Хід роботи: У дві пробірки вносять по 1 мл розчину білка першу додають 1 мл 20 % розчину сульфосаліцилової, а в другу – 1 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти. Випадає осад білка.

Осадження білків за допомогою трихлороцтової кислоти застосовують для повного видалення білків з біологічних рідин (наприклад, із сироватки крові), тому що вона осаджує тільки білки. Сульфосаліцилову кислоту використовують для якісного визначення білка у сечі.

ІІІ. Осадження білків загальноалкалоїдними (осаджувальними)  реактивами: Розчини білків можуть утворювати осади при взаємодії з загальноалкалоїдними (осаджувальними) реактивами (таніном, пікриновою кислотою, гексоціанофератом калію, фосфорно-вольфрамовою та фосфорно-молібденовою кислотами). Ця властивість білків до осадження алкалоїдними реактивами пояснюється наявністю азотистих груп як у білках, так і в алкалоїдах.

Принцип методу: Осадження білків алкалоїдними реактивами пояснюється утворенням нерозчинних солеподібних комплексів. У цих сполуках білок є катіоном (аміногрупа), а алкалоїдний (осаджувальний) реактив – аніоном, тому осаджувати білки необхідно у кислому середовищі (частинки білків перезаряджаються і переходять у стан катіонів). У лужному середовищі осад розчиняється.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1 % розчин яєчного білка, 10 % розчин пікринової кислоти, танін (насичений розчин), 5 % розчин червоної кров’яної солі, 1 % розчин оцтової кислоти, піпетки, пробірки.

Хід роботи: У три пробірки наливають по 1 мл 1 % розчину яєчного білка, додають по 0,5 мл 1 % розчину оцтової кислоти і по 2-3 краплі: у першу – 10 % розчину пікринової кислоти, у другу – насиченого розчину таніну, в третю – 1 % розчину червоної кров’яної солі. У всіх пробірках випадає осад.

В’яжучі лікарські препарати до складу яких входить танін, викликають слабку денатурацію білків на поверхні слизової оболонки або шкіри при запальних процесах, що створює своєрідну біологічну пов’язку і сприяє загоєнню.

IV. Денатурація білків під впливом високої температури

Більшість білків тваринного походження при нагріванні до 45-55⁰ С коагулюють.

Принцип методу: Це явище пояснюється тим, що висока температура руйнує гідрофобні та водневі зв’язки. Відбувається перебудова структури білкової молекули. Білок втрачає свої нативні властивості і розчинність.

Реакція денатурації перебігає поступово і прискорюється з підвищенням температури, тому короткочасне нагрівання може і не призвести до коагуляції.

Найбільш повна і швидка коагуляція має місце в ізоелектричній точці. Деякі білки, в складі яких багато дисульфідних зв’язків, стійких до високої температури, здатні до ренатурації і не втрачають своєї структури та функціональної активності після припинення дії високої температури (ферменти трипсин та рибонуклеаза).

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: 1% розчин яєчного білка; піпетки; пробірки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 1 мл розчину білка, нагрівають і спостерігають за утворенням осаду.

ІІІ. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові.

Робота 4. Визначити концентрацію білка в сироватці крові рефрактометричним методом.

Принцип методу: Метод рефрактометрії оснований на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення:= sin a / sin b

Величина показника заломлення сироватки крові залежить головним чином, від вмісту в ній білка. Інші складові частини сироватки крові мало впливають на ступінь рефракції. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: Сироватка крові, дистильована вода, рефрактометр, піпетки.

Хід роботи: Спочатку встановлюють нульову точку шляхом визначення показника заломлення дистильованої води. Для цього за допомогою дзеркала – 5 направляють промінь світла на шкалу, а за допомогою дзеркала – 6 освітлюють рефрактометричну камеру. Далі відкривають рефрактометричну камеру і піпеткою наносять на нижню призму 1-2 краплі дистильованої води. Закривають рефрактометричну камеру і маховиком – 2 межу світлотіні вводять у центр перехрестя окуляра. Маховиком – 3 повертають до зникнення забарвлення межі світлотіні. Після цього рефрактометричну камеру відкривають, витирають воду марлею і наносять на призму 1-2 краплі досліджуваної сироватки. Закривають камеру і спостерігають в окулярі зміщення межі світлотіні. Повертаючи маховик – 2, знову встановлюють межу світлотіні в центр перехрестя окуляра. На шкалі відмічають показник заломлення. Користуючись таблицею 3, визначають вміст білка в сироватці крові.

Таблиця 2. Визначення вмісту білка за показником заломлення

 

СЕМІНАРСЬКЕ ОБГОВОРЕННЯ ТЕОРЕТИЧНИХ ПИТАНЬ (12³⁰ – 14⁰⁹)

Вихідний рівень знань та вмінь

Студент повинен знати:

1.      Структуру пептидів та білків, їх властивості.

2.      Методи якісного визначення білка та амінокислот.

3.      Будову білка, рівні його структурної організації.

4.      Типи зв’язків в молекулі білка.

5.      Методи дослідження амінокислотного складу білків.

Студент повинен вміти:

1.       За допомогою кольорових якісних реакцій дослідити амінокислотний склад білків та їх гідролізатів.

Самостійна робота (14¹⁵ – 15⁰⁰)

 

Методичну вказівку склали:  доц. Василишин Н.А.

Обговорено і затверджено на засіданні кафедри

„27 ” 08 2013 р.  протокол № 1