ЛЕКЦІЯ

ЛЕКЦІЯ

Морфологія і фізіологія вірусів.

Будова і класифікація вірусів

Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

 

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

 

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, – капсида. Разом вони формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими.

До них належать найдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, аденовіруси, ­паповавіруси.

 Проте більшість вірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками-глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

 

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багато­гранник (найчастіше ікосаедр – 20-гранник).

 

Усі відомі ДНК-геномні віруси ­мають складні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси, що містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

 

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких бактеріофагів. При цьому головка бактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у хвості, укладається спірально.

 

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси мозаїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (бактеріофаги), ниткоподібна (віруси Ебола, віруси бактерій). На рис представлені основні форми і структури найпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

 

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо:

(1)  Тип нуклеїнової кислоти, її структура, стратегія реплікації

(2) Розміри, морфологія, симетрія віріону, число капсомерів, наявність суперкапсиду. 

(3) Наявність специфічних ферментів, особливо РНК- і ДНК-полімераз, нейрамінідази

(4) Чутливість до фізичних і хімічних агентів, особливо ефіру

(5) Імунологічні властивості

(6) Природні механізми передачі

(7) Тропізм до господаря, його тканин і клітин

(8) Патологія, формквання включень

(9) Симптоматологія захворювань.

 

 За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді­ляють на ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20 родин містять віруси, патогенні для людини.

 

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10^-15 мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи). Віруси характеризуються надзвичайним розмаїттям форм геному. Він може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійним, циркулярним або фрагментованим.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих клітин, і забезпечують проникнення вірусу в клітину, мають РНК- і ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного геному, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – комплекс вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких віруси набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія вірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються, такий тип взаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси (СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які вимагають своєрідних прийомів для роботи з ними, не подібних до мікробіологічних. Вірусологічні дослідження проводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

 

За своїм ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи.

 І група:  збудники гарячки Ебола, Ласа, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, а також вірус гепатиту В (мавп).

 ІІ група –  арбовіруси, деякі аренавіруси, віруси сказу, віруси гепатиту А і В людини, ВІЛ.

 ІІІ група –  віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини.

ІV група –  аденовіруси, коронавіруси, герпесвіруси, реовіруси, онковіруси.

 

Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища

. Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.) чутливі до кислих значень рН.

         Головна властивість вірусу – представити   свій геном в клітині-господарі, для того, щоб відбулась його експресія (трансляція і транскрипція)

Репродукція вірусів.

Особливості її полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини.

Вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції.

Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та часі:

нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки – в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани.

Репродукція вірусів – унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.

 У репродукції вірусів виділяють ряд стадій.

До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину кілтини та їх роздягання (депротеїнізація).

Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним.

Неспецифічний визначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди.

Специфічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.

Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механізмом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які містять особливий блок з високою молекулярною масою – клатрин.

Мембрани інвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину – індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F- відfusion – злиття).

Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання віріонів – багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболони, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка – лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка.

Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий.

Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій – інформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. В однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми ДНК.

Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На материнській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.

 Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації ретровірусів (онкорнавірусів).

Їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна.

Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна.

У такому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією називають процес утворення інформаційних (матричних) РНК.

Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або РНК-залежні РНК-полімерази.

У ДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів – власні вірусспецифічні транскриптази.

На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках амінокислоти.

Складання віріонів – не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулуму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на цитоплазматичній мембрані.

Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом «вибуху», розриваючи її мембрану.

Складні віруси – брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

Вихід вірусу імунодефіциту людини з кклітини шляхом брунькування

 Визначення розмірів вірусів

 A.  Фільтрування

B.    Седиментація в ультрацентрифузі

C.  Спостереження в електронному мікроскопі

  Порівняльні розміри:

(1) Staphylococcus має діаметр 1000 nm.

(2) Бактеріофаги -10-100 nm.

(3) Діаметр молекули сироваткового альбуміну 5 nm, глобуліну – 7 nm, гемоцианін (23 nm).

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх компонентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практично підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис­товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт­ко­вий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до температури 4 °С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в стерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним шприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа­тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан­тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні ви­значають за титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно- і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Для виділення вірусів простого герпесу, натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин (кроликів) на скарифіковану рогівку ока. При дослідженні вірусів гепатиту А вводять досліджуваний матеріал через рот. При виділенні вірусів з нейротропними властивостями, таких як арбовіруси, віруси сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей (1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього матеріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріалу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок травматичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Цитопатична дія  вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Методи ідентифікації вірусів

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

Реакція гемадсорбції

 

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Облік реакції  гальмування гемаглютинації

 

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі систе­ми – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст­кого матеріалу, який містить 100 ТЦД₅₀, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідними компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бентонітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імунної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середовищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через 2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають нейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її можна ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – антитіло – комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.