МОРФОЛОГІЯ І БІОЛОГІЯ ВІРУСІВ

 

Морфологія і біологія вірусів. Основні методи культивування вірусів.

Методи індикації вірусів.

Віруси Бактерій – бактеріофаги. Структура, класифікація. Форми взаємодії бактеріофагів з бактеріальною клітиною. Вірулентні і помірні фаги. Практичне використання бактеріофагів

Мікробіологічний контроль у стоматологічних приміщеннях.  Санітарно-бактеріологічне дослідження води, грунту, повітря. Санітарно-показові мікроорганізми

 

Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

За ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи. До першої групи належать збудники гарячки Ебола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, до другої входять арбо- і аренавіруси, віруси сказу, гепатитів А і В, ВІЛ. До третьої групи належать віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини. Четверта група представлена адено-, корона-, герпес-, рео- та онковірусами. Цей поділ певною мірою умовний, так як внаслідок генетичної мінливості можуть з’являтися штами вірусів з підвищеною вірулентністю.

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, – капсида. Разом вони формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими.

 До них належать найдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, аденовіруси, ­паповавіруси.

 Проте більшість вірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками-глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багато­гранник (найчастіше ікосаедр – 20-гранник).

Усі відомі ДНК-геномні віруси ­мають складні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси, що містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких бактеріофагів. При цьому головка бактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у хвості, укладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси мозаїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (бактеріофаги), ниткоподібна (віруси ебола, віруси бактерій). На рис  представлені основні форми і структури найпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

 

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо:

(1)  Тип нуклеїнової кислоти, її структура, стратегія реплікації

(2) Розміри, морфологія, симетрія віріону, число капсомерів, наявність суперкапсиду. 

(3) Наявність специфічних ферментів, особливо РНК- і ДНК-полімераз, нейрамінідази

(4) Чутливість до фізичних і хімічних агентів, особливо ефіру

(5) Імунологічні властивості

(6) Природні механізми передачі

(7) Тропізм до господаря, його тканин і клітин

(8) Патологія, формквання включень

(9) Симптоматологія захворювань.

 

 За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді­ляють на ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20 родин містять віруси, патогенні для людини (табл.).

 

 

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10^-15 мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи). Віруси характеризуються надзвичайним розмаїттям форм геному. Він може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійним, циркулярним або фрагментованим.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих клітин, і забезпечують проникнення вірусу в клітину, мають РНК- і ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного геному, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – комплекс вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких віруси набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія вірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються, такий тип взаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси (СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які вимагають своєрідних прийомів для роботи з ними, не подібних до мікробіологічних. Вірусологічні дослідження проводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

 

За своїм ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи.

 І група:  збудники гарячки Ебола, Ласа, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, а також вірус гепатиту В (мавп).

 ІІ група –  арбовіруси, деякі аренавіруси, віруси сказу, віруси гепатиту А і В людини, ВІЛ.

 ІІІ група –  віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини.

ІV група –  аденовіруси, коронавіруси, герпесвіруси, реовіруси, онковіруси.

 

Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища

. Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.) чутливі до кислих значень рН.

         Головна властивість вірусу – представити   свій геном в клітині-господарі, для того, щоб відбулась його експресія (трансляція і транскрипція)

Репродукція вірусів.

Особливості її полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини.

Вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції.

Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та часі:

нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки – в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани.

Репродукція вірусів – унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.

 

У репродукції вірусів виділяють ряд стадій.

До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину кілтини та їх роздягання (депротеїнізація).

Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним.

Неспецифічний визначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди.

Специфічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.

Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механізмом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які містять особливий блок з високою молекулярною масою – клатрин.

Мембрани інвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину – індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F- від fusion – злиття).

Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання віріонів – багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболони, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка – лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка.

Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий.

Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій – інформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. В однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми ДНК.

Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На материнській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.

Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації ретровірусів (онкорнавірусів).

Їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна.

Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна.

У такому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією називають процес утворення інформаційних (матричних) РНК.

 

Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або РНК-залежні РНК-полімерази.

 

У ДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів – власні вірусспецифічні транскриптази.

На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках амінокислоти.

Складання віріонів – не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулуму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на цитоплазматичній мембрані.

Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом «вибуху», розриваючи її мембрану.

Складні віруси – брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

 

 

 

Репродукція вірусів

Визначення розмірів вірусів

 

A.  Фільтрування

B.    Седиментація в ультрацентрифузі

C.   Спостереження в електронному мікроскопі

 Порівняльні розміри:

(1) Staphylococcus має діаметр 1000 nm.

(2) Бактеріофаги –10-100 nm.

(3) Діаметр молекули сироваткового альбуміну 5 nmб глобуліну – 7 nm, гемоцианін (23 nm.

 

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх компонентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практично підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

 

 

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

Бляшки на хоріоналантоїсній оболонці

 

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис­товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт­ко­вий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до температури 4 °С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в стерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним шприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа­тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан­тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні ви­значають за титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно- і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Зараження мишенят-сисунців у мозок при діагностиці Коксаки- інфекції

Для виділення вірусів простого герпесу, натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин (кроликів) на скарифіковану рогівку ока. При дослідженні вірусів гепатиту А вводять досліджуваний матеріал через рот. При виділенні вірусів з нейротропними властивостями, таких як арбовіруси, віруси сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей (1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього матеріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріалу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок травматичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

 

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліо­вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матері­алу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріп­лених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp‑2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їх рідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури органів. Вони представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові культури. З цією метою культури клітини вирощують у флаконах, пробірках, матрацах, які розташовуються горизонтально, щоб клітини могли прикріпитись до скла. Перед зараженням їх проглядають під мікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований моношар клітин. Для зараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють живильне середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у кожну пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а потім інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1-2 год для адсорбції вірусів на поверхні клітин. Після цього видаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для видалення неприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середовище (середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у термостаті при 37 °С протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи результати.

Внаслідок розмноження вірусів у культурі клітин у них виникають дегенеративні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). Ступінь їх вираження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особливостями клітин тощо. В одних випадках ці зміни виникають через декілька днів після зараження (віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька тижнів і навіть місяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження найчас­тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД₅₀ (ЦПД₅₀ – така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок, що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагностику захворювання.

При повній дегенерації клітинного моношару спостерігаються зміни в переважній більшості клітин. Вони гинуть, відокремлюються від скла. Окремі клітини, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми. Такий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам поліомієліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне відокремлення всіх клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, респіраторно-синци­тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому виникають багатоядерні гігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви­кликають утворення скупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круглоклітинна дегенерація). При репродукції риновірусів утворюються округлі клітини, які мають відростки, а при розмноженні герпесвірусів спостерігається формування подібних клітин однакового розміру, які розкидано по всьому моношарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний тип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної гарячки) не здатні викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для їх виявлення використовують феномен інтерференції, при якому клітинні культури паралельно заражають іншими вірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за чотири-плюсовою системою: (4+) – означає, що відбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх, (2+) – у 50 %, (+) – до 25 % клітин, (+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклітинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в цитоплазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеїнових кислот є важливим моментом при проведенні вірусологічної діагностики захворювань. Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), натуральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденовіруси, віруси грипу та інші.

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Цитопатична дія  вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Методи ідентифікації вірусів

 

 

 

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

 

 

 

Реакція гемадсорбції

 

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

 

Облік реакції  гальмування гемаглютинації

 

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі систе­ми – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст­кого матеріалу, який містить 100 ТЦД₅₀, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідними компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бентонітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імунної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середовищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через 2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають нейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її можна ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – антитіло – комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

 

Облік РЗК

 

У реакціях імунодифузії використовують принцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому середовищі, наприклад, агаровому гелі. У зоні оптимальних співвідношень антигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від кількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія відповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке покривають 1 % агарозою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну лунку вносять специфічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного імуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу гепатиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які роз­ташовані ближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. Після цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Вірус­ні антигени з негативним зарядом рухаються в напрямку до аноду, а антитіла сироватки – до катоду. Через 24 год в агаровому гелі спостерігають появу ліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити комплекси, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із специфічними антитілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш ефективним, ніж використання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації методу матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з антитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього додають 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють відповідне значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають під електронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у вірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. Існують численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після попереднього зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який дає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який зумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). Метод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для ідентифікації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них специфічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуоресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

РІФ

При реакції радіального гемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У присутності комплементу спостерігається лізис еритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони гемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсутності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як негативну. Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

 

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується у вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними противірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції є еритроцити, оброблені таніновою кислотою з адсорбованими на них молекулами противірусних антитіл (сенсибілізовані еритроцити), вірусні антигени і розчин електроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) розводять дво­кратно електролітом, після чого додають такий самий об’єм еритроцитарного анти­тільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом 30 хв при температурі 37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – “перевернута парасоль­ка”. При негативному результаті – щільний, компактний осад з рівними краями.

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали за­стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Непрямий ІФА

 

Облік ІФА

 

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер­оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджува­ну сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають ­субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас­тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди­фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergo­sorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (­фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично ­переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. ­Фіксова­ні блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають ра­діо­активно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції антиген-антитіло.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні ­зонди, що застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, ­штучно­го синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на від­міну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділи­ти дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним ­аналогом трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який зна­ходиться в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагують з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, ­свідченням чого є зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфіч­ний субстрат. Зонди з біо­тином можна виявити, використовуючи мічені флуоро­хромом антитіла проти ­біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. ­Смуги промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулі­нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобулінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де наступила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовувати мічені ізотопом антитіла .

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, за­стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’язану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної реакції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослі­дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ на основі виявлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

Виділення та титрування бактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бакте­рій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальніше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом дослідив канадський мікробіолог Ф. ­д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріофагом. На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бактеріофаги виявились основною моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного коду, впливу радіації на спадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда. Вони складаються з гексагональної головки, в якій ­міститься ДНК, хвостового відростка (стержня, оточеного білковим чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами. Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утво­рена капсомерами, які оточують одну щільно скручену мо­лекулу ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм служить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість ­морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з аналогом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка, що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується.

 

Будова бактеріофагу

 

Бактеріофаги

Хімічний склад фагів, як інших вірусів, представлений нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю ліпідів у оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК. За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних структур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість “внутрішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину.

Бактеріофаги на поверхні клітини

 

Адсорбція і проникнення фага в клітину

 

Реплікація фагів та їх  збирання

 

Вихід бактеріофагів

 

У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфек­ційні хвороби”, і викликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характеризується строгою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофітних мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на “свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близьких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокре­ма, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, додати декілька крапель відповідного бактеріофага, то через певний час ­відбувається просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорга­нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круглу форму і виникають внаслідок літичної дії бактеріофагів. Їх називають негативними колоніями або бляшками бактеріофагів.

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бактеріальною клітиною, вони поді­ляються на вірулентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всередину клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних практично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактеріофаги, частина клітин залишається неушкодженою ними, тому що спостерігається явище лізогенії – інтеграції генома бактеріофага в геном клітини.

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікроорганізми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких факторів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має велике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бактерій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість перетворення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізогенізації їх помірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафі­лококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріофагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі­онів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони зустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Для цього досліджуваний матеріал центрифугують, для осадження твердих частинок, а надосадову рідину в об’ємі 1 мл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який попередньо засіяний 1 мл 6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інкубації при температурі 37 °С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, розводять у 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 разів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та інкубують протягом доби при оптимальній температурі. Як контроль використовують культуру бактерій без бактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріофаг, середовище залишається прозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той час як у контрольній пробірці відбувається ріст бактерій (середовище стає мутним).

Для визначення наявності інфекційних бактеріофагів використовують метод Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в тому, що попередньо матеріал, який містить бактеріофаг, розводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^‑4. Після цього по 1 мл кожного розведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 % м’ясо-пептонного агару, додають 0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно перемішують і виливають у чашки Петрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 % м’ясо-пептонного агару. Чашки залишають на 30 хв при кімнатній температурі для застигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих стерильних плям – “негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом Граціа, після добової інкубації підраховують число “негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає кількості фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число фагових корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній множать на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10^-4 з’явилось 50 колоній, отже, титр фагів дорівнює: 50х10^-4 або 5х10^-5 в 1 мл.

Титрування фагів

 

Утворення бляшок

 

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд пробірок із м’ясо-пептонним бульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг

Титрування бактеріофагів за методом Аппельмана

Після цього в них додають по 0,05 мл індикаторних мікроорганізмів. Паралельно готують контрольні пробірки: одну – з культурою бактерій без фага, а другу – з бактеріофагом без мікробів. Посіви інкубують при 37 °С протягом 18-24 год і спостерігають за лізисом мікроорганізмів. Титром бактеріофага вважають найбільше його розведення, яке викликає повний лізис бактерій.

Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, їх можна використовувати для фагоіндикації – визначення виду відповідних бактерій в інфекційному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища.

Для цього у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.

З цією ж метою на щільне живильне середовище газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення бактеріофага, яке вказано на ампулі. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофага. Позитивний результат вказує на належність бактерій до певного виду.

Фаготипування бактерій проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. Цей метод грунтується на використанні специфічної чутливості бактерій до своїх бактеріофагів, яка свідчить про спільне (тотожнє) походження бактерій, що мають однаковий фаготип.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для цього чашку з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують 4 годинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню засіяного газону в кожний квадрат капають піпеткою певні бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють результати за допомогою лупи. Залежно від чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюють за чотири-плюсовою системою: від лізису, який зливається, до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фага є постійною ознакою, порівнюють фаготипи досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігові роблять висновок про виявлене джерело інфекції.

 

 

Санітарна мікробіологія. Екологiя мiкроорганiзмiв.

Мiкрофлора та санiтарно-показовi бактерiї грунту, води, повiтря, методи їх визначення.

 

Мікроорганізми повсюдно поширені у навколишньому середовищі. Вони є в грунті, воді, повітрі, на рослинах, харчових продуктах, предметах, в організмі людини і тварин. На відміну від рослин і тварин, мікроорганізми можуть використовувати в процесах метаболізму метан, водень, молекулярний азот, окис вуглецю і перетворювати їх у сполуки, що засвоюються рослинами і тваринами. Так, наприклад, гнильні мікроорганізми, розщеплюючи загиблі рослини і трупи тварин, повертають в атмосферу 90 % вуглекислого газу, який поглинається  рослинами.

У кругообігу азоту беруть участь азотфіксуючі бактерії родів Phizobium, Azotobacter, деякі актиноміцети, синьо-зелені водорості та ін. У грунті відбуваються процеси амоніфікації (гниття білків з утворенням аміаку) і нітрифікації (окислення солей амонію в азотнокислі сполуки, що забезпечує рослини легко засвоюваними сполуками азоту); під впливом денітрифікуючих бактерій (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa та ін.) здійснюється денітрифікація – розкладання азотно- й азотистокислих солей з виділенням вільного азоту, в результаті чого збе­рігається рівновага між вмістом молекулярного азоту в атмосфері і  зв’язаним  азотом  грунту, рослин і тварин.

Процеси розпаду безазотистих речовин називаються бродінням. Розрізняють бродіння спиртове (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces el lipsoides та ін.), маслянокисле (Clostridium butyricum.Clostridium lactis та ін.), молочнокисле (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis та ін.) і бродіння пептинових речовин (Flavobacterium pectinovorum та ін.). Названі реакції беруть участь у кругообігу вуглецю.

Кругообіг сірки, фосфору і заліза здійснюється сіркобактеріями, залізобактеріями та іншими видами мікроорганізмів.

Ферментативна активність мікроорганізмів забезпечує звільнення поверхні Землі від загиблих рослин і тварин, а також від екскрементів тварин і людини; вони мінералізуються з утворенням вуглекислого газу, аміаку, води, азотистої, азотної, сірчаної і фосфорної кислот, що використовуються в природі для синтезу складних органічних  сполук.

Як показник загального рівня бактеріального обсіменіння грунту, води, повітря, харчових продуктів, оточуючих предметів використовують мікробне число (загальна кількість мікроорганізмів в 1 мл досліджуваної рідини, 1 г твердої речовини, 1 м³ повітря, на 1 м² поверхні площі досліджуваного об’єкта або субстрату), яке визначають методом прямого підрахунку під мікроскопом або за допомогою мембранних.

Загальний рівень бактеріального забруднення і кількість санітарно-показових мікроорганізмів (бактерії групи кишкових паличок, ентерококи, стафілококи, стрептококи, термофіли) є непрямими показниками ймовірності потрапляння у навколишнє середовище патогенних   видів.

Мікрофлору навколишнього середовища вивчає санітарна мікробіологія, завданнями якої є: розробка методів мікробіологічних і вірусологічних досліджень грунту, води, повітря, предметів побуту, харчових продуктів та ін.; вивчення джерел забруднення навколишнього середовища мікрофлорою, що становить небезпеку для людини; дослідження життєдіяльності мікроорганізмів у навколишньому середовищі, особливо в умовах його хімічного і біологічного забруднення; визначення нормативів для гігієнічної оцінки об’єктів навколишнього середовища, в тому числі харчових продуктів (за мікробіологічними показниками); обгрунтування заходів для оздоровлення об’єктів навколишнього середовища і контроль за ефективністю їх виконання (якість водопостачання, робота підприємств харчової промисловості і громадського харчування, знезаражування стічних вод,  покидьків та ін.)

Складні взаємозв’язки мікроорганізмів із середовищем, які зумовлюють їх розмноження, розвиток і виживання, вивчає спеціальна біологічна наука екологія. Розрізняють екологію популяцій і екологію угруповань. Вивчення екології мікроорганізмів є основою для розуміння явищ паразитизму, механізму виникнення зоонозних захворювань, особливо тих, що характеризуються природною вогнищевістю, а також для розробки практичних заходів у боротьбі з різними   інфекційними   захворюваннями

 

Мікрофлора грунту

Учення про грунт створили С. М. Виноградський, В. В. Докучаев, П. А. Костичев, В. Р. Вільямс та інші вчені. Родючість грунту залежить не тільки від наявності неорганічних та органічних речовин, а й від різних видів мікроорганізмів, що зумовлюють якісний склад грунту. У грунті є необхідні для розвитку бактерій поживні ре­човини і волога, внаслідок чого їх кількість в 1 г грунту досягає величезних кількостей: від 200 млн у глинястому грунті до 5 млрд у чорноземному. В 1 г орного шару грунту міститься 1—10 млрд бактерій.

Мікрофлора родючого грунту складається з популяцій водоростей, актиноміцетів, нітрифікуючих, денітрифікуючих, целюлозорозкла-даючих бактерій, сіркобактерій, пігментних мікроорганізмів, грибів і найпростіших. Особливо велике значення мають азотфіксуючі бактерії, які можуть жити не тільки в коренях бобових, а й на тютюнових рослинах. У збагаченні грунту азотом важливу роль відіграють синьо-зелені водорості. Ступінь обсіменіння грунту мікроорганіз­мами залежить від його характеру та хімічного складу.

Найбільше (1 000 000 в 1 мм³) бактерій у верхньому шарі грунту— на глибині 5—15 см. У глибоких шарах (1,5—6 м) трапляються одиничні особини; їх виявлено і в артезіанській воді. У родовищах нафти живуть нафтові бактерії. Живлячись парафінами (відходи нафти), вони перетворюють частину нафти в густу асфальтоподібну масу, вна­слідок утворення якої закупорюються природні резервуари нафти. В орному шарі окультуреного грунту товщиною 15 см на площі 1 га може бути 5—б т бактеріальної маси

Основні представники мікрофлори грунту:

Нітрифікуючі, денітрифікуючі, азотфіксуючі бактерії, сірко-, залізобактерії, гриби, найпростіші.

 

З виділеннями людей і тварин у грунт попадають і деякий час там зберігаються збудники правця, газової гангрени, ботулізму, сибірки, черевного тифу, дизентерії, холери, окремі віруси.

Обсіменіння грунту мікроорганізмами залежить від ступеня забруднення його фекаліями і сечею, а також від характеру обробітку та удобрення. Наприклад, в орному шарі грунту в 2,5 раза більше мікроорганізмів, ніж у лісовому. У грунті довго зберігаються спори сапрофітів (В. cereus, В. megaterium та ін.).

Патогенні, що не утворюють спор, бактерії внаслідок нестачі потрібних поживних речовин, а також в результаті згубної дії світла, висихання, бактерій-антагоністів і фагів зберігаються у грунті від кількох діб до кількох місяців.

У здійсненні профілактичних заходів санітарна мікробіологія враховує властивість багатьох видів ґрунтових бактерій (В. subtilis, В. brevis, В. thermophilus та ін.) пригнічувати ріст і розмноження патогенних   і   умовно-патогенних   мікроорганізмів.

Звичайно грунт є несприятливим середовищем для більшості патогенних видів бактерій, вірусів, грибів, найпростіших. Проте як фактор передачі низки збудників інфекційних захворювань він відіграє важливу роль

Відбір проб грунту проводять у 4-5 точках вибраної ділянки на глибині 10-15 см. Лопатою викопують ямки глибиною 20 см. Над однією з бокових стінок ямки за допомогою пропаленого на вогні ножа зрізають верхній шар грунту. В стерильну банку беруть по 200-300 г із кожної точки, змішують, відбирають наважку в 30 г і вносять у колбу, що містить 300 см³ стерильної води. Суміш ретельно збовтують на протязі 10 хв, потім відстоюють 2-3 хв для осідання грубих частинок.

При необхідності брати пробу з глибших шарів грунту використовують спеціальний земляний бур Некрасова, який дає змогу відбирати проби на заданій глибині.

Із отриманої суспензії готують серійні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-6 і більше. По 1 см³ із останніх двох розведень вносять на дно двох стерильних чашок Петрі й заливають 15 см³ розтопленого й охолодженого до 45 С МПА. Після застигання середовища чашки інкубують 48 год при 28-30С. Із суми колоній, що виросли на двох чашках одного розведення, вираховують середнє арифметичне й визначають ЗМЧ. Наприклад: посіяно 1 см³ суспензії грунту з розведення 10⁴; на чашці з агаром виросло в середньому 70 колоній; отже ЗМЧ = 70 х 10⁴ = 7 х 10⁵ бактерій.

При визначенні титру БГКП по 1 см³ різних розведень грунту засівають у 9 см³ глюкозо-пептонного або лактозо-пептонного середовища. В разі розкладу вказаних цукрів до кислоти й газу висів роблять на середовище Ендо, темно-червоні колонії, що виросли, мікроскопують, ставлять пробу на оксидазу й вираховують титр БГКП так само, як і для води.

Титр ентерококів визначають шляхом посіву відповідних розведень на середовище Каліни або ДИФ-3; перфрінгенс-титр вираховують посівом розведень суспензії на середовище Вільсона-Блера; кількість грибів  на середовище Сабуро, актиноміцетів  на крохмально-аміачний агар. Для визначення титру термофільних бактерій різні розведення суспензії грунту вносять у чашки Петрі, заливають розтопленим і охолодженим МПА. Посіви інкубують 24 год при 60 С, підраховують кількість вирослих колоній і роблять перерахунок на 1 г грунту.

Оцінку ступеня забруднення грунту проводять шляхом визначення загального мікробного числа й кількісного аналізу основних індикаторних мікроорганізмів                                                                                                          

Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту

 

Санітарно-показові бактерії грунту: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium perfringens – показники фекального забруднення і термофільні мікроорганізми.

Колі індекс – кількість бактерій групи кишкової палички в 1 г грунту

Грунт вважається чистим, якщо його колі-індекс не перевищує 1000.

 

Мікрофлора води

1. автохтонна – актиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони;

2. заносна, при забрудненні водоймищ стічними водами – кишкові палички, ентерококи, клостридії, спірили, вібріони, ентеровіруси, ротавіруси.

 

Мікрофлора води річок залежить від ступеня їх біологічного забруднення та якості очистки стічних вод, які спускають у русла річок.

Мікроорганізми дуже поширені також у водах морів і океанів, де їх виявляли на різних глибинах (3700—10 000 м). До них належать галобактерії (рід Halobacterium) і галококи (рід Halococcus), які адаптувались до існування в умовах високих концентрацій солей. Галобактерії і галококи — хеморганотрофи, аероби, плеоморфні мік­роорганізми, утворюють пігменти різного кольору, індол, сірководень, оксидазу, каталазу, розріджують желатину.

Із морської води прибережної зони систематично висіваються галофільні вібріони — V. parahaemolyticus, V. angilolyticus, які спричинють у людей гострий гастроентерит, що виникає в результаті вживання у їжу малосольної риби, а також недостатньо термічно оброблених креветок і мідій.

Ступінь обсіменіння води організмами прийнято виражати сапробністю, під якою розуміють сукупність живих істот, які живуть у водах з великим скупченням тварин або рослинних решток. Розрізняють чотири зони сапробності.

Полісапробна зона— дуже забруднена вода, бідна на кисень і багата на органічні сполуки. Кількість бактерій в 1 мл доі сягає 1 млн і більше, переважають Е. соїі та анаеробні бактерії, які спричинюють процеси гниття і бродіння.

У мезосапробній зоні (зона помірного забруднення) мінералізуються органічні речовини з інтенсивним окисленням і вираженою нітрифікацією. Кількість бактерій в 1 мл становить сотні тисяч.

Олігосапробна зона характерна для чистої води. Кількість бактерій у ній незначна, в 1 мл налічується кілька десятків або сотень:; Е. соlі у цій зоні немає.

Катаробна зона— зона дуже чистої води (особливо в осінньо-зимовий період), вона розташована вдалині від населених пунктів і берегів.

Санітарно-показові бактерії води: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium perfringens – показники фекального забруднення.

 

 

 

Мікробіологічні показники безпеки питної води

(Наказ МОЗ України від 23.12.1996 р.)

 

Визначення ЗМЧ – по1 мл води різних розведень засівають у розтоплений і охолоджений МПА на чашках Петрі.

 

 

 

 

   Визначення БГКП проводять за методом мембранних фільтрів або за методом бродильних проб.

До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що обєднує роди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові, оксидазонегативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37 С. Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокровних тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відповідними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній  фекальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44,5 С. До E.coli відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S.faecalis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

При повноцінному санітарно-мікробіологічному дослідженні води визначають ЗМЧ, БГКП, E.coli, ентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (холерні вібріони, сальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають 500 см³ води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевою пробкою, покритою зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з водопровідних кранів проводять після обпалювання їх спиртовим факелом і наступного випускання води на протязі 10 хв. Проби хлорованої води беруть у флакони з дехлоратором (на 500 см³ води 2 см³ 1,5 % розчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Якщо дослідження проводять на виявлення не лише індикаторних а й патогенних мікроорганізмів, потрібно брати пробу обємом 2500 см³ води. Коли визначають ще й індекс коліфагів обєм проби збільшують до 3500 см³.

У відкритих водоймах проби беруть за допомогою батометра.

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає кількість мезофільних, мезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які виростають на МПА при 37 С протягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного бактерійного забруднення воду сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках виростало від 30 до 300 колоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду сіють у нерозведеному стані в обємі 1 см³. Проби з відкритих водойм, криниць, джерел і т.п. сіють після попереднього їх розведення від 10^-1 до 10^-3 і більше (особливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної води, в першу з них вносять 1 см³ досліджуваної води, ретельно перемішують, із цієї пробірки переносять 1 см³ у другу, потім у третю і всі наступні по 1 см³ попереднього розведення. Для виготовлення кожного розведення необхідно брати нову стерильну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в обємі 1 см³ вносять, рівномірно розкапуючи, на дно стерильної чашки Петрі, потім заливають її 10-12 см³ розтопленого й охолодженого до 45 С мясо-пептонного агару. Обережними круговими рухами змішують воду з агаром. Як правило, сіють не менше двох розведень і для кожного з них використовують дві чашки. Після застигання середовища посіви вирощують у термостаті при 37С протягом 24 год. Через добу підраховують число колоній у двох чашках і знаходять середнє арифметичне. При значній кількості колоній підрахунки проводять за допомогою спеціального приладу АПК (апарат для підрахунку колоній). Методика користування ним регламентована спеціальною інструкцією.

Відповідно до існуючих вимог звичайна водопровідна вода може містити не більше 100 мікробів. ЗМЧ відкритих водойм і криничної води не повинно перевищувати 1000.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок. Цей показник (індекс БГКП) визначають за допомогою методу мембранних фільтрів і бродильним методом. Мікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембранних фільтрів. Він значно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. Сутність методу полягає в концентруванні бактерій з певного обєму досліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні на середовищі Ендо при 37 С і підрахунку індексу БГКП в 1 дм³ води.

При аналізі водопровідної води необхідно фільтрувати не менш як 333 см³. При дослідженні води невідомої якості слід фільтрувати менші обєми: наприклад 3, 30, 100, 200 см³.

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні фільтри під 6 номерами: чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для дослідження води використовують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до 80 С дистильовану воду і ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кипятять тричі по 15 хв, кожного разу замінюючи воду. Після останнього кипятіння воду не зливають, фільтри залишають в ній до вживання.

Для фільтрування води використовують апарат Зейтца або прилад Рубльовської водопровідної станції.

Прилади оптирають ватним тампоном, змоченим спиртом, і фламбірують. Після охолодження їх монтують на колбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, прижимають його верхньою частиною приладу (стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією. У воронку (стакан), дотримуючись правил асептики, наливають досліджуваний обєм води й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у колбі Бунзена. Після закінчення фільтрування знімають воронку (стакан), мембранний фільтр беруть обпаленим на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так, щоб між агаром і фільтром не було бульбашок повітря. В одній чашці Петрі можна розмістити 3-4 фільтри. Чашки з фільтрами на середовищі Ендо вміщують у термостат догори, інкубують при 37С протягом 18-24 год.

 Визначення колі-титру та колі-індексу води

(метод мембранних фільтрів).

 

 Мікроорганізми на фільтрі (метод мембранних фільтрів).

Електронна фотографія.

 

Облік результатів проводять через добу. При відсутності будь-яких колоній або при рості лише плівчастих, зубчастих та інших колоній, не властивих для ешеріхій, видають негативний результат. Якщо виростають типові для коліформних бактерій колонії, з них виготовляють мазки. У випадках виявлення грамнегативних паличок залишок колонії пересівають у глюкозо-пептонне середовище й при позитивній бродильній пробі присутність БГКП вважають позитивною. Дослідження закінчують постановкою проби на оксидазу. Для цього знімають фільтр і кладуть його колоніями на фільтрувальний папір, змочений реактивом на виявлення оксидазної активності. При наявності оксидази колонії забарвлюються у синій колір. Коліформні бактерії не утворюють оксидази.

 

Мікрофлора повітря

Мікрофлора повітря дуже різноманітна. Склад її залежить від ступеня забрудненості повітря мінеральними й органічними зависями, температури, осадів, характеру місцевості, вологості та інших факторів. Чим вища концентрація у повітрі пилу, газів, кіптяви, тим більше в ньому бактерій. Кожна частинка пилу або диму може адсорбувати їх на своїй поверхні.

Над поверхнею гір, арктичних морів, океанів мікроорганізми трапляються рідко.

Мікрофлора повітря складається із найрізноманітніших видів мікроорганізмів, які надходять у нього з грунту, рослин і живих організмів. У повітрі часто трапляються пігментні сапрофітні бактерії (мікрококи, різні сарцини), В. subtilis, В. megaterium, В. cereus, актиноміцети,  плісеневі, дріжджові гриби та ін.

Кількість бактерій у повітрі коливається у великих діапазонах від кількох особин до багатьох десятків тисяч екземплярів в 1 м³. Так, наприклад, у повітрі Арктики міститься 2—3 особини на 20 м³; у промислових містах в 1 см³ повітря виявляється величезна кількість бактерій. У лісі, особливо хвойному, бактерій у повітрі дуже мало, бо на них згубно діють леткі речовини рослин — фітонциди, що мають бактерицидні властивості. Над Москвою на висоті 500 м в 1 м³ по­вітря було виявлено 1100—2700 бактерій, тоді як на висоті 2000 м — від 500 до 700. Спороносні види і плісеневі гриби було виявлено на висоті 20 км. Деякі мікроорганізми виявляють і на висоті 61—77 км. В 1 г пилу є до 1 млн. бактерій.

Залежно від пори року якісний і кількісний склад мікрофлори повітря змінюється. Якщо взяти загальну кількість мікроорганізмів у повітрі взимку за 1, то весною вона становитиме 1,7, влітку — 2, восени — 1,2

 

Основні представники мікрофлори повітря: актиноміцети, сарцини, мікрококи, бацили, гриби.

Патогенні мікроорганізми попадають в повітря від хворого і можуть тимчасово там знаходитись – збудники дифтерії, туберкульозу, коклюшу, скарлатини, менінгіту, ангіни, грипу, кору, аденовірусних інфекцій тощо.

Санітарно-показові мікроорганізми повітря: гемолітичні стрептококи і золотисті стафілококи.

Оцінку чистоти повітря закритих приміщень проводять на основі визначення загальної кількості мікробів в 1 м³  і наявності санітарно-показових бактерій. З цією метою проби повітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Кількість мікроорганізмів у робочих і жилих приміщеннях тісно пов’язана з санітарно-гігієнічним режимом. При скупченні людей, поганій вентиляції, слабкому природному освітленні, неправильному прибиранні приміщень кількість мікроорганізмів значно збільшується. Сухе прибирання, рідке миття підлоги, використання брудних ганчірок і щіток, сушіння їх у тому ж приміщенні створюють сприятливі умови для нагромадження в повітрі мікроорганізмів.

Віруси можуть розповсюджуватися повітряно-пиловим і повітряно-краплинним шляхом. При чханні, кашлі, розмові хвора людина виділяє у навколишнє середовище на відстань 1—1,5 м і більше разом з краплинками слизу, мокротиння патогенні віруси.

Мікроорганізми, що є в повітрі, можуть бути у трьох фазах бактеріального аерозолю — краплинній, краплинно-ядерній і пиловій. Під аерозолем розуміють фізичну систему із дрібних твердих або рідких часточок, що зависли в газовому середовищі.

Людина вдихає за добу в середньому 12 000—14 000 л повітря, причому 99,8 % мікроорганізмів, що є в ньому, затримуються в дихальних шляхах. Бактеріальний аерозоль (до 60 000 краплин різного розміру), що утворюється природним шляхом у просторі носової частини глотки, при чханні і кашлі виділяється в повітря.

Найбільше бактерій виділяється при чханні, менше — при кашлі, ще менше — при розмові. Характер бактеріального аерозолю залежить від в’язкості секрету, що виділяється з дихальних шляхів. Рідкий секрет подрібнюється на менші краплинки легше, ніж в’язкий. Біля бактеріовиділювача утворюється найбільш концентрований аерозоль, що складається з бактеріальних краплин розміром від 1 до 2000 мкм. Величина основної маси краплин коливається від 2 до 100 мкм. Крупні краплини величиною від 100 до 2000 мкм виділяються на відстань 2—3 м і більше і швидко осідають. Дрібні краплинки бактеріального аерозолю (1—10 мкм) можуть довго (протягом кількох годин і діб) бути в завислому стані.

Повітря — несприятливе середовище для бактерій і вірусів. Відсутність поживних речовин, вологи, оптимальної температури, згубна дія сонячного проміння і висушування не створюють умов для їх збереження. Однак і порівняно короткого перебуванням мікроорганізмів у повітрі цілком досить для того, щоб зумовити передачу патогенних видів мікроорганізмів від хворих осіб здоровим. Через повітря можуть передаватися разом з краплинами слизу й мокротиння при чханні, кашлі, розмові збудники хвороб — скарлатини, дифтерії, коклюшу, стафілококової, стрептококової і менінгококової інфекцій, ангіни, туберкульозу, гострого сальмонельозного гастроентериту, грипу, кору, натуральної і вітряної віспи, герпесу, епідемічного паротиту, краснухи, аденовірусних та інших захворювань. Повітряно-пиловим шляхом розповсюджуються спори сибірки, правця, гісто-плазмозу, грибів, збудники Ку-гарячки, орнітозу та ін.

 

Критерії оцінки мікробного забруднення повітря в приміщеннях лікарні

 

 

Санітарно-бактеріологічне дослідження повітря проводять у плановому порядку в дитячих закладах, лікарняних палатах, операційних, пологових залах тощо. При цьому визначають загальну кількість бактерій в 1 м3 повітря і наявність санітарно-показових мікроорганізмів (гемолітичних, стрептококів і золотистих стафілококів). Проби повітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Седиментаційний метод Коха використовують для визначення мікрофлори повітря закритих приміщень. Для цього чашки Петрі з МПА або спеціальними середовищами для стафіло- і стрептококів залишають відкритими у місцях взяття проб. Строки експозиції залежать від гаданого мікробного забруднення повітря: при великій кількості бактерій чашки відкривають на 5-10 хв, при малій – на 20-40 хв. Після експозиції чашки закривають і вміщують у термостат при 37 °С на 18 год, а потім ще добу витримують при кімнатній температурі. Підраховують кількість колоній і визначають число бактерій в 1 м3 повітря. За даними В.Л. Омельського, на площу в 100 см2 за 5 хв осідає стільки бактерій, скільки їх міститься в 10 л повітря.

Наприклад, на чашці з агаром при 5 хв експозиції виросла 21 колонія. Площа стандартної чашки Петрі складає біля 70 см2. Отже, на 100 см² виросло б 21·100:70=30 колоній, тобто та кількість бактерій, яка міститься в 10 л повітря. Отже, в 1 м3 їх буде 30·1000:10=3000.

Аспіраційний метод грунтується на ударній дії повітряного струменя об поверхню живильного середовища і прилипанні до нього бактерій. Дослідження проводять за допомогою апарата Кротова (Рис. 2). Повітря в кількості 100-250 л пропускають зі швидкістю 25 л/хв через клиноподібну щілину над чашкою з живильним середовищем. Електромотор приладу обертає чашку з постійною швидкістю, що рівномірно розподіляє втягнуті через щілину бактерії на всій площі середовища. Засіяну чашку інкубують при 37 °С протягом доби і ще 24 год при кімнатній температурі, підраховують кількість колоній. Знаючи об’єм пропущеного через апарат повітря і число колоній, легко вираховують кількість мікробів в 1 м³. Видову характеристику мікрофлори визначають після макро- і мікроскопічного дослідження колоній, виділення чистих культур і їх ідентифікації звичайними методами. Державних стандартів для оцінки бактеріального забруднення повітря ще не розроблено. Прийняті лише тимчасові допустимі норми кількості санітарно-показових бактерій в 1 м³ повітря лікарняних приміщень.

 

 

Колонії бактерій на МПА

Аппарат Кротова

після посіву мікрофлори повітря

седиментаційним методом.

 

Апарат Кротова складається з пристрою для відбору проб повітря, ротаметра, який регулює швидкість і кількість всмоктуваного повітря, та електромотора. Прилад включають у електромережу, знімають кришку, на спеціальний диск закріплюють відкриту чашку Петрі з живильним середовищем. Рукою надають їй інерційного руху за годинниковою стрілкою, закривають кришку апарата і включають мотор. Чашка обертається з постійною швидкістю 60 об/хв. Повітря із заданою швидкістю втягується через клиноподібну щілину плексигласової пластини, що закриває чашку Петрі з агаром. При цьому частинки аерозолю з мікроорганізмами рівномірно прилипають до живильного середовища. При дослідженні загального мікробного числа пропускають, як правило, 100 дм³ повітря зі швидкістю 25 дм³/хв. Якщо визначають кількість індикаторних бактерій (золотисті стафілококи, альфа- і бетта-гемолітичні стрептококи) обєм досліджуваного повітря збільшують до 300-500 дм³. Після взяття проби чашку з посівом повітря знімають, закривають її, й інкубують 18-24 год при 37 С і ще 24 год при кімнатній температурі.

Розрахунок загального мікробного числа проводять за формулою:

          

   а • 1000

X = ,

  V

де    а  кількість колоній, що виросли в чашці Петрі,

        V обєм пропущеного через прибор повітря в дм³,

        1000  заданий обєм повітря для визначення ЗМЧ.

 

Приклад розрахунку: через прилад пропущено 100 дм³ повітря; число колоній, що виросли  370. Отже кількість мікроорганізмів у 1 м³ повітря буде дорівнювати:

370 х 1000

X =  = 3700.

100

 

Фільтраційний метод. Для його використання запропоновані спеціальні прилади: Дяконова, Речменського, Кіктенко, ПАБ-1, ПОВ-1 та ін. Принцип їх дії зводиться до пропускання певного обєму повітря через рідину в приладі (або фільтр) з наступним висівом мірної кількості її на живильні середовища. При застосуванні фільтрів їх накладають на щільне живильне середовище. Підраховують число колоній, що виросли, та проводять відповідні перерахунки на весь обєм рідини в приладі й визначають число мікроорганізмів у 1 м³ повітря.

За допомогою цього методу можна провести дослідження повітря на присутність і тих патогенних мікроорганізмів, які не культивуються на живильних середовищах. Рідину, що поглинула бактерійні аерозолі повітря, можна використати для зараження лабораторних тварин або проведення спеціальних бактеріологічних та вірусологічних досліджень.

Безпосереднє виявлення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів (стафілококи, стрептококи, псевдомонади, інші грамнегативні бактерії), які викликають госпітальні інфекції, проводять при аналізі повітря хірургічних, акушерсько-гінекологічних та інших стаціонарів.

При виникненні внутрішньолікарняних інфекцій, спричинених стафілококами, проводять дослідження на виявлення джерела й шляхів їх розповсюдження. При цьому визначають ідентичність культур, виділених із повітря, інших обєктів оточуючого середовища, а також від хворих і медичного персоналу за допомогою фаготипування.

Державні стандарти для оцінки санітарно-бактеріологічних показників повітря ще не розроблені. Запропоновані лише тимчасові положення про допустиме нормування мікробного забруднення окремих лікарняних та інших приміщень. Так, у повітрі операційних, родильних залів, реанімаційних, перевязувальних і процедурних загальна кількість бактерій в 1 м³ до роботи не повинна перебільшувати 500, після роботи  1000; кількість S.anreus не більше 4, а гемолітичних стрептококів взагалі не повинно бути. У повітрі лікарняних палат взимку ЗМЧ не повинно перевищувати 3500, S.aureus  до 24, а гемолітичних стрептококів не більше 24. Влітку ці показники не повинні перевищувати відповідно 5000, 52 і 36.

 

Мікробіоценоз, біотоп, екологічна ніша.

Популяція – су купність особин одного виду, які проживають у певному біотопі.

Біотоп – ділянка обмеженої території з однорідними умовами існування.

Мікробіоценоз – сукупність популяцій мікроорганізмів, які проживають в одному біотопі.

Екосистема – система, в яку входять біотоп і мікробіоценоз.

Біосфера – жива оболонка землі, загальна сума всіх екосистем.