Коринебактерії

Коринебактерії. Мікробіологічна діагностика дифтерії.

Мікобактерії. Лабораторна  діагностика туберкульозу.

 

КОРИНЕБАКТЕРІЇ

До роду Corynebacterium належать грампозитивні бактерії з булавоподібним стовщенням на кінцях; вони поділяються на види, пато­генні для людини і тварин, патогенні для рослин і непатогенні.

До патогенних видів коринебактерій належить збудник дифтерії. Раніше дифтерія була грізним захворюванням у дітей, яке часто при­зводило до летального кінця. Завдяки запровадженню обов’язкової імунізації проти цієї інфекції захворюваність на дифтерію тепер зни­зилась до поодиноких випадків і летальний кінець спостерігається дуже   рідко.

ЗБУДНИК ДИФТЕРІЇ

 Відкриттю збудника дифтерії передували широкі клінічні, патологомор-фологічні, епідеміологічні та експериментальні дослідження, які значною мі­рою підготували грунт для його виявлення (Е. Клебс, 1883), виділення в чи­стій культурі (Ф. Леффлер, 1884), виготовлення токсину (Е. Ру і А. Ієрсен, 1888), антитоксичної сироватки (Е. Берінг, С Кітазато, 1890; Е. Ру, 1894) і дифтерійного анатоксину (Г. Рамон,   1923).

Дифтерія – гостре інфекційне захворювання, що викликається Corinebacterium diphtheriae і її токсином та проявляється характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника.

Бактерії викликають запалення дихальних шляхів шляхів, рідше уражають шкірні покриви. Токсин спричиняє дегенерацію периферичних нервів, серцевого м′яза і інших тканин. Захворювання відоме дуже давно.

Збудник – Corinebacterium diphtheriae; належить до роду коринебактерій. До цього роду входить ще біля 20 видів бактерій, патогенних для людей, тварин і рослин.

        

  Морфологія. Corynebacterium diphtheriae (лат. согупа — булава, diphthera — плівка, шкіра) — прямі або трохи зігнуті палички завдовжки 1—8 мкм і завширшки 0,3—0,8 мкм, полі­морфні, грампозитивні, краще забарвлюються біля полюсів, на яких розташовані метахроматичні гранули (зерна Бебеша — Ернста, полі-метафосфати). У коринебактерій дифтерії є на кінцях булавоподібні стовщення; іноді з’являються гіллясті і ниткоподібні форми, а також майже кокоподібні і дріжджоподібні. У мазках вони розташовуються під кутом, набуваючи вигляду розчепірених пальців, не утворюють спор, капсул і джгутиків.

У коринебактерій дифтерії виявлено фімбрії або подібні до них утвори, що надають мікроорганізмам адгезивної активності.

На ультратонких зрізах клітинна стінка має два шари: внутрішній осміофільний і зовнішній, що утворює мікрокапсулу. У період макси­мального виділення екзотоксину видно мембранні структури у вигляді органел, овалів, кілець. Цитоплазма гранулярна. Нуклеоїд заповнений тонкими осміофільними фібрилами. Метахроматичні гранули склада­ються із твердих зернистих утворів, оточених мембраною. При ста­рінні цитоплазма коринебактерій дифтерії набуває «зебровидної» (смугастої),   що   нерівномірно  забарвлюється,   форми. Дифтерійні палички в мазках розташовуються під кутом, у вигляді латинських літер V, X, Y, або утворюють скупчення, що нагадують купку розкиданих сірників. Волютинові зерна розташовуються, як правило, на полюсах мікробних клітин.

Псевдодифтерійні бактерії та дифтероїди розміщуються паралельно (у вигляді “частоколу”) і звичайно не мають зерен волютин.

 

Corynebacterium diphtheriae, забарвлення за Грамом

 

Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжево-червоного кольору на фоні жовтозелених тіл бактерійних клітин.

       

Дифтерійні палички ( заб. за Нейсером )

Дифтерійні палички ( заб. за Леффлером)

За культуральними властивостями коринебактерії дифтерії поді­ляються на біовари gravis і mitis.

Коринебактерії gravis на телуритовому агарі, що містить дефібри-новану кров і телурит калію, утворюють крупні шорсткі (R-форми) розеткоподібні колонії  чорного або сірого кольору. Вони ферментують декстрин, крохмаль і глікоген, у бульйоні утворюють поверхневу плівку і зернистий осад, звичайно високотоксичні і мають більш виражені  інвазивні  властивості.

Коринебактерії mitis на телуровому агарі ростуть з утворенням темних гладеньких (S-форми) блискучих колоній. Вони не ферментують крохмаль і глікоген, непостійно ферментують дек­стрин, спричиняють гемоліз еритроцитів усіх видів тварин, у бульйо­ні даюгь дифузне помутніння, менш токсичні та інвазивні.

Ферментативні властивості. Коринебактерії дифтерії не зсідають молоко, не розкладають сечовину, не виділяють індол, слабко утво­рюють сірководень, відновлюють нітрати в нітрити, а також телурит калію до металу, внаслідок чого колонії збудника дифтерії на телу­ровому агарі стають чорними або сірими. Коринебактерії дифтерії ферментують глюкозу і мальтозу, непостійно — галактозу, крохмаль, декстрин,   гліцерин.

Токсиноутворення. Коринебактерії дифтерії продукують у буль­йонних культурах сильні екзотоксини (гістотоксин, дермонекротизин, гемолізин). Токсигенність коринебактерій пов’язана з лізогенністю (наявністю у токсигенних штамах помірних фагів — профагів). Кла­сичний міжнародний еталонний штам Парк-Вільямс 8 — продуцент екзотоксину — також лізогенний і понад 85 років зберігає власти­вість токсиноутворення. Генетичні детермінанти токсигенності (tox⁺-гени) локалізовані в геномі профага, інтегрованого з нуклеоїдом коринебактерій дифтерії.

Дифтерійний екзотоксин складається із двох (А і В) поліпептидних ланцюгів, з’єднаних дисульфідним містком. Під впливом відновних агентів розщепляються дисульфідні зв’язки, що з’єднують А- і В-лан-цюги. А-ланцюг переходить у цитоплазму, а В-ланцюг залишається в мембрані ендосоми і спричиняє зв’язування токсину з рецепторами на поверхні клітин.

Дифтерійний токсин нестійкий, легко руйнується під впливом температури, світла і кисню повітря, але порівняно резистентний до діяння ультразвуку. Після додавання до токсину 0,3—0,4 % форма­ліну і наступного витримування при температурі 38—40 °С протягом З—4 тижнів він перетворюється в анатоксин, який має біль­шу стійкість щодо фізичних і хімічних дій, чим вихідний ток­син.

Коринебактерії дифтерії продукують бактеріоцини (коринецини), що надають їм деяких селективних переваг.

Антигенна структура. За допомогою реакції аглютинації у збуд­ника дифтерії виявлено  11  сероварів.

Токсини, що утворюються різними штамами gravis і mitis, не мають специфічності і повністю нейтралізуються стандартним дифте­рійним антитоксином.

Доведено, що в коринебактерій дифтерії є варіантоспецифічні термолабільні поверхневі білкові антигени (К-антигени) і групоспе-цифічні  термостабільні  соматичні   полісахаридні   антигени.

Серед коринебактерій розрізняють 15 фаговарів, за допомогою яких виявляють джерела інфекції: фаговари враховують також при ідентифікації виділених культур.

Резистентність. Коринебактерії дифтерії порівняно стійкі до впли­ву факторів зовнішнього середовища. На зсілій сироватці вони зали­шаються життєздатними близько року, при кімнатній температурі — до 2 місяців, на дитячих іграшках — кілька діб. Коринебактерії довго зберігаються у плівках хворих на дифтерію. Від дії темпера­тури 60 °С і 1 % розчину фенолу збудник дифтерії гине протягом 10   хв.

Патогенність для тварин. У природних умовах вірулентні корине­бактерії дифтерії виявлено у коней, корів, собак, інфікованих, оче­видно, від людей — хворих на дифтерію і носіїв. Проте свійські тва­рини не р джерелом зараження людини.

Із лабораторних тварин найбільш сприйнятливі морські свинки і кролі. При зараженні культурою або токсином коринебактерій у них розвивається типова картина токсикоінфекції з утворенням на місці введення запалення, набряку, некрозу. Внутрішні органи гіпере-мійовані, у надниркових залозах спостерігаються крововиливи. Доза 0,06 мкг токсину вбиває морську свинку масою 250 г.

 Патогенез захворювання: Вхідні ворота для збудника – слизові оболонки носоглотки, іноді очей, статевих органів (у жінок), пошкоджені шкірні покриви. Дифтерійна паличка колонізує тканини в місці проникнення, викликаючи розвиток місцевого фібринозного запалення. Подібний тип уражень відомий як дифтитритичне запалення.

Поширення плівок і перехід процесу на дихальні шляхи може викликати асфіксію. Системні прояви обумовлені дією токсину, що вражає нервову систему (переважно периферичні симпатичні вузли), серце і судини, надниркові залози і нирки. Ферменти C. diphtheriae (гіалуронідаза, нейрамінідаза, фібринолізин) забезпечують проникнення збудника в різні тканини.

Резервуар інфекції – людина (хворий, реконвалесцент, бактеріоносій); максимальну епідемічну небезпеку становлять хворі люди. Реконвалесценти виділяють дифтерійну паличку на протязі 15-20 діб. Основний шлях передачі повітряно-краплинний; також можливе зараження через предмети, використовувані хворими і інфікованими харчовими продуктами (найчастіше молоко).

Клінічні прояви дифтерії:

Дифтерія носа

 

 

Дифтерійні плівки на мигдаликах

 

 

Дифтерія ротоглотки і гортані

 

 

         Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для дослідження є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше виділення з ока, вуха, рани, піхви, ураженої ділянки шкіри. На вимогу епідеміолога досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (молоко, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікування натще або через 2 год після прийому їжі.

       Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені 5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. Досліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами, намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними рухами, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпателем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

       Якщо необхідно провести первинну бактеріоскопію на вимогу лікаря, матеріал беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки, ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

       Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких надписують номер, дату і час відбору, прізвище лікаря. Вони повинні бути доставлені до лабораторії не пізніше 3-х год після взяття матеріалу. Якщо схема забору передбачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направляють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють  через 20-23 год, в холодну пору в сумках із грілками.

        Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановського-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які при звичайних методах культивування не ростуть).

       Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен валютину, забарвлених за методами Леффлера і Нейссера, було основою лабораторної діагностики дифтерії та виявлення бактеріоносійства. Тепер, у зв’язку з мінливістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія досліджуваного матеріалу не рекомендується.

       Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипових колоній на кров’яно-телуритових середовищах та при перевірці чистоти виділених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.                

     Бактеріологічне дослідження. Клінічний матеріал засівають на кров’яний агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори. Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до дії телуриту калію, тому їх ріст на телуритових середовищах може пригнічуватись. Для виявлення дифтерійного бактеріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в посівному матеріалі може міститись невелика кількість дифтерійних паличок, ріст яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою. При цьому допускається використання і транспортного середовища.

            Кров’яно-телуриновий агар. До 100 мл 2 % розплавленого й охолодженого до 50 °С живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі шаром товщиною 3-4 мм.

     У C. diphtheriae виділяють три біовари – gravis, mitis, intermedius

     •Бактерії біовару gravis – короткі, неправильної форми, з невеликою кількістю метахроматичних гранул.

     •Биовар mitis утворює довгі зігнуті поліморфні палички, що містять багато волютинових зерен (тільця Бебеша-Еріста)

     •Бактерії біовару intermedius найбільш великі з бочкоподібними контурами, для них характерні поперечні перегородки, що розділяють клітину на декілька сегментів.  На даний час біовар intermedius відносять в групу gravis.

ріст на кровяному агарі (біовар intermedius)

 

    Біовар gravis                                                         Біовар mitis

(ріст на кровяному агарі)

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцеринову суміш готують шляхом додавання 20 мл стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холодильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34 мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

       Транспортне напіврідке середовище. До 100 мл перевару Хоттінгера або м’ясо-пептонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, стерилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 % телуриту калію. Середовище розливають у пробірки по 5 мл. При можливості використовують і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

       Посів від одного хворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка), а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із шкіри, ока, вуха та інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засівати матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігрівають у термостаті 15-20 хв.

       При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в окрему ділянку кров’яного агару площею 2х1 см, потім аналогічно на кров’яно-телуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час повертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Така техніка посіву дозволяє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосередньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засіяні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-24 год.

       На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують характер колоній. Якщо ріст відсутній на обох середовищах роблять повторний забір матеріалу. Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих колоній можна і не проводити.

       Культуральні властивості. Колонії дифтерійних паличок на кров’яному агарі білуватого або жовтуватого кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно вони мають маслянисту консистенцію, хоч деякі можуть утворювати крихкі шорсткі R-колонії.

       На кров’яно-телуритових середовищах колонії C.diphtheriae через 24 год росту мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають темносірого або чорного кольору з металевим блиском, рівними або злегка фестончастими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-форми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею. За структурою 48-годинних колоній на телуринових середовищах і деякими ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культурально-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

      Якщо типовий ріст відсутній, з інших, сумнівних, колоній готують мазки. При виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджівта ін., дослідження на дифтерію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що дифтерійні бактерії, які утворили нетипові колонії на середовищах з інгібіторами росту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм та характерне розташування.

       При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсигенності та ідентифікації.          

       Токсигенні властивості. досліджують не менше як у 2-х ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середовище для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C. diphtheriaе, необхідно при  множинному рості підозрілих колоній дослідити токсигенні властивості біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише однієї колонії її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не прожарюючи петлю, – у пробірку з середовищем Пізу. Якщо застосовували транспортне середовище,

висів із нього роблять на щільні кров’яно-телуритові середовища.

       На третій день при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й позитивній пробі на цистиназу виділену культуру визначають як токсигенну С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще на протязі доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший вид коринебактерій.

 Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглеводневі середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби на виявлення уреази, піразинамідази та нітратнедуктази.

       На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргументований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    

               Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токсину з антитоксином в агаровому гелі. В місцях оптимального кількісного співвідношення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном називають Елек-тестом.

       Пробу на токсигенність, як правило, проводять із чистими культурами. Можна визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її повторюють з виділеною чистою культурою.

       Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних мікробів (ВТДМ) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною протидифтерійною сироваткою, і висушені.

       На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски з антитоксином (не більше чотирьох на одну чашку). На відстані 0,5 см від диску навколо нього засівають культури у вигляді “бляшок” діаметром 7-8 мм, чергуючи “бляшки” досліджуваної культури і контрольного штаму.

       Результати враховують через 18-24 і 48 год. Критерієм специфічності преципітатів є злиття ліній преципітації досліджуваної культури з лініями токсигенного штаму. В такому разі виділену культуру вважають токсигенною.

      При відсутності стандартних паперових дисків можна використати смужки фільтрувального паперу, просочені дифтерійним антитоксином. Їх виготовляють безпосередньо в лабораторії. Нарізані за вказаними розмірами і простерилізовані в автоклаві при 121°С протягом 30 хв паперові смужки змочують 0,25 мл очищеного дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 мл. В такому разі на чашку з відповідним середовищем накладають змочену антитоксином смужку паперу, підсушують, відкривши чашку на 15-20 хв у термостаті й перевернувши її догори дном. Після цього з обох боків смужки засівають культури “бляшками”, чергуючи досліджувані і контрольні штами.

       Для визначення токсигенности збудника дифтерії можна використати також і інші середовища (АГВ, мартенівський агар тощо), рецепти виготовлення яких приведені в “Інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії”, Київ (1999).

       Впродовж багатьох років токсигенність дифтерійних бактерій визначали підшкірним або внутрішньошкірним введенням культури двом гвінейським свинкам, одній з яких напередодні вводять 100-1000 МО антитоксичної протидифтерійної сироватки. Тепер цей метод бактеріологічні лабораторії практично майже не використовують із-за його дороговизни та значної затримки відповіді.

 

Вивчення токсигенності внутрішкірним введенням культури

гвінейській свинці.

                                      

       Останнім часом розроблено дуже чутливий і високоспецифічний метод визначення гену дифтерійного токсину шляхом полімеризації ланцюгової реакції. Він оснований на визначенні ділянки ДНК C. diphtheriaе, де локалізований ген дифтерійного токсину, за допомогою ДНК-полімерази. Метод має переваги перед традиційним визначенням токсигенності: високу чутливість, швидкість отримання результатів (4-6 год), не потребує виділення чистої культури.

 Але для його проведення необхідні спеціальна апаратура, дорогі реактиви й відповідне приміщення, а тому може бути проведений лише в спеціалізованій лабораторії. Всі нетоксигенні штами дифтерійних бактерій, які виділені від хворих та бактеріоносіїв, необхідно направляти до Українського центру держсанепіднагляду (де є така лабораторія) для остаточного визначення токсигенних властивостей C. diphtheriaе.                                              

    Ферментативні властивості. Визначення цистинази (проба Пізу). C. diphtheriaе, C. ulcerans,   C. Pseudotuberculosis виділяють фермент цистиназу, псевдодифтерійні бактерії та інші дифтероїди його не продукують.

       Виділену культуру засівають уколом в середовище з цистином, розлите стовпчиком у вузькі пробірки. Цистиназопозитивні бактерії розщеплюють цистин із виділенням сірководню, який із оцтовокислим свинцем, що входить до середовища, утворює сірчанокислий свинець, в результаті чого середовище забарвлюється в темно-коричневий колір. C. diphtheriaе викликає не лише потемніння середовища по ходу уколу а й утворює навколо нього “хмаринку” темно-коричневого кольору на відстані 1 см від поверхні.

Результати враховують через 20-24 год інкубування в термостаті.

       Визначення уреази (проба Заксе). Дифтерійні бактерії цього ферменту не утворюють. Позитивну пробу на уреазу дають лише деякі інші види коринебактерій. Для постановки проби виділену культуру сіють на бульйон із сечовиною. Уреаза розкладає сечовину, змінює рН середовища, що супроводжується його почервонінням. Якщо фермент не виділяється, зміна забарвлення бульйону не відбувається.

       Визначення піразинамідази проводять шляхом гідролізу піразинаміду до піразинової кислоти та амонію. Для цього в стерильну пробірку вливають 0,25 мл стерильної дистильованої води, в якій готують густу завись виділеної культури, потім вносять одну діагностичну таблетку Rosko 598-21.  Інкубують протягом 4-х год при 37 °С, після чого добавляють одну краплю щойно приготовленного 5 % водного розчину сульфату амонійного заліза. При наявності ферменту суспензія набуває червоного або оранжевого кольору.

Патогенні коринебактерії не виділяють піразинамідазу, а отже й не змінюють кольору суспензії.  Цукролітичні ферменти визначають шляхом посіву повної петлі виділеної культури в кожну пробірку вкороченого строкатого ряду Гіса (глюкоза, сахароза, розчинний крохмаль). Результати враховують через 24 год інкубування в термостаті. Розщеплення крохмалю може затримуватись до 48 год.

             Визначення нітратредуктази є додатковим тестом для ідентифікації С. belfanti i C. ulcerans, які не утворюють цього ферменту. У пробірку з бульйоном, до якого додають 0,1 % KNO3, засівають досліджувану культуру, інкубують в термостаті протягом доби. Обов’язково ставлять контроль з незасіяним середовищем. В разі  наявності нітратредуктази при додаванні до засіяного бульйону 3-х крапель реактиву Касаткіна виникає червоне забарвлення. Середовище в контрольній пробірці кольору не змінює.

       Для ідентифікації коринебактерій останнім часом використовують паперові індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем із набору “Б” для ідентифікації ентеробактерій (фірма “ІмБіо”, м.Нижній Новгород). У 4-х пробірках готують густу завись досліджуваної культури і в кожну з них занурюють диск із відповідним вуглеводом чи іншим реактивом. Після інкубування в термостаті облік виділення уреази проводять через 40-120 хв, а визначення цукролітичної активності – через 5-24 год. При наявності уреази білий диск із сечовиною стає рожево-малиновим, при відсутності – залишається білим. Диски з глюкозою та сахарозою при наявності відповідних ферментів вже через 5-6 год змінюють колір з червоного на жовтий. При визначенні амілази в пробірку з відповідним субстратом додають індикаторний диск з йодом. Якщо ферменту немає – з’являється темно-синє забарвлення, якщо є – колір розчину

залишається без змін. 

Лікування: Оскільки патогенез порушень обумовлений дією токсину, то основу специфічної терапії складе протидифтерійна кінська сироватка (антитоксин), що містить не менше 2000 міжнародних антитоксичних одиниць активності (МЕ) в 1 мл. Антитоксин вводять внутрішньом’язево  або внутрішньовенно в дозах, відповідних тяжкості захворювання (від 20000 до 100000 ЕД).

Профілактика: Для імунопрофілактики застосовують дифтерійний анатоксин, розроблений Р. Рамоном. Препарат – токсин, позбавлений отруйних властивостей оброблений 0,4% розчином формаліну і витриманий в термостаті  при температурі 40°С протягом 30 діб, але він зберіг імуногенність. Очищений і концентрованний препарат входить до складу комбінованих вакцин – АКДС, АДС, АДС-м.

                                                                                   

 

Збудники туберкульозу

       Мікобактерії туберкульозу (Mycobacterium tuberculosis) людини відкрив у 1882 р. Р. Кох. Цей же вчений розробив питання патогенезу й імунітету.

Важливою подією було виготовлення живої вакцини проти туберкульозу, завдяки чому стало можливим широке здійснення специфічної профілактики. Введення у практику антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів озброїло сучасну медицину могутніми засобами боротьби з туберкульозом.

Морфологія. Мікобактерії туберкульозу — тонкі прямі або трохи зігнуті палички завдовжки 1—4 мкм і завширшки 0,3—10,6 мкм, іноді з незначним здуттям на кінцях, нерухомі, грампозитивні, не утворю­ють спор і капсул, поліморфні . Виявлено паличкоподібні, ниткоподібні, гіллясті, кокоподібні, фільтрівні та L-форми мікобактерій. У зв’язку з йисоким вмістом міколової кисло­ти мікобактерії туберкульозу погано забарвлюються звичайними ме­тодами, але добре — за Цілем — Нельсеном.

Основними особливостями збудників туберкульозу — М. tuber­culosis, М. africans (проміжний вид) і М. bovis — є кислотостійкість і повільний ріст на живильних середовищах. Кислотостійкійсть повязана з наявністю у туберкульозних мікобактерій великої кількості міколової   кислоти   і   ліпідів.

Доведено існування фільтрівних форм туберкульозних мікобакте­рій; при введенні в організм морської свинки вони перетворюються у типові кислотостійкі і видимі в світловий мікроскоп бактерії, які можуть спричиняти генералізований інфекційний процес. ^Виявлено також абацилярні G-форми (дрібні утворення), які здебільшого вини­кають за несприятливих умов. Цитоплазма молодих культур гомогенна, старих — зерниста.

Серед туберкульозних мікобактерій є зернисті кислотоподатливі форми, які забарвлюються за Грамом у фіолетовий колір,— зерна Муха і кислотостійкі фрагменти мікобактерій туберкульозу — осколки Шпленгера.

Культивування. Мікобактерії туберкульозу — аероби, оптимальна температура їх росту 37 °С, крайні температурні границі 24—42 °С, реакція середовища майже нейтральна (рН 6,4—7,0), можуть рости при діапазоні рН 6,0—8,0. Збудник туберкульозу росте на елективних середовищах: зсілій сироватці крові, гліцериновому агарі, гліцерино­вій картоплі, у гліцериновому бульйоні та яєчних середовищах (Пет­рова, Левенштейна — Йєнсена, Виноградова та ін.).  ЇХ можна культиівувати на сйнтєтичному середовищі Сотена, що містить аспарагін, гліцерин, цитрат заліза, фосфат калію і  інші речовини.

Мікобактерії туберкульозу потребують відповідної концентрації вітамінів (біотин, нікотинова кислота, рибофлавін та ін.). На гліце­риновому (2—3 %) агарі ледь помітний ріст їх спостерігається через 8—10 діб після висівання, а через 2—3 тижні утворюється сухий наліт блідо-жовтого кольору. Оптимальний ріст (на 6—8-му добу) мікобак­терії туберкульозу спостерігається на яєчному середовищі Петрова, що складається з яєчного жовтка, м’ясного екстракту, агару, гліце­рину та генціанового фіолетового.

На густих живильних середовищах утворюються шорсткі підви­щені густі колонії з потовщеною або зморшкуватою поверхнею і тон­кими нерівними краями. У гліцериновому (4—5 %) агарі мікобактерії туберкульозу через 10—15 діб утворюють тонку ніжну плівку, яка поступово потовщується, стає ламкою, набираючи горбисто-зморшкува­того вигляду і жовтуватого кольору; бульйон залишається прозори м.

Колонії мікобактерій туберкульозу дисоціюють із типових R-форм в атипові S-форми. Окремі штами в старих культурах виробляють жовтий  пігмент.

Хімічна структура. Мікобактерії туберкульозу складаються з ту-беркулополісахаридів, які надають їм властивостей антигенів або гаптенів; туберкулопротеїнів, що беруть участь в імунних процесах та алергічних реакціях; туберкулоліпідів і восків, що локалізовані в клітинних стінках і відповідають за високу резистентність до фізич­них та хімічних діянь і вірулентність, забезпечують захист мікобакте­рій від фагоцитозу, повільний ріст у живильних середовищах і кисло­тостійкість. За розчинністю в органічних речовинах воски поділяють на 4 фракції (А, В, С, D), що містять ефіри, міколову кислоту та інші компоненти. Із них на особливу увагу заслуговує корд-фактор (трега-лоза-6, диміколат), який не має імуногенності, але виконує функцію гаптену, зумовлює вірулентність, склеювання мікобактерій та їх ріст у вигляді кіс і джгутиків. Корд-фактор мікобактерій туберкульо­зу руйнує мітохондрії клітин інфікованого організму, порушує фун­кцію дихання і фосфорилювання, пригнічує міграцію лейкоцитів, спричиняє  утворення  хронічних  гранулем.

      Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і суглобів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних препаратів. Першовідкривач туберкульозної палички – Р. Кох  (1843 – 1910).

 

      В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium tuberculosis і  M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняє M. avium. В країнах Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsassii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін. Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобактерій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів мікобактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

      Патогенез захворювання. Джерело інфекції – хвора людина. Зараження туберкульозом відбувається повітряно- краплинним і повітряно- пиловим шляхом, іноді перорально ( при вживанні харчових продуктів інфікованних мікобактеріями туберкульозу).       Інкубаційний період.Від кількох тижнів до кількох років.

      Токсиноутворення. Мікобактерії туберкульозу не продукують екзотоксин.Вони містять токсичні речовини, що вивільняються при розпаді клітин. Токсин мікобактерій туберкульозу складається з альбумінів і нуклеопротеїдів. Вірулентні бактерії на відміну від невірулентних містять.

      Імунітет. Людина має природну резистентність до туберкульозної інфекції. Імунітет при туберкульозі нестерильний, його в широких маштабах відтворюють штучним способом (введення вакцини БЦЖ).

        Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведення мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і постановки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збудника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

      Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномозкова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, путктати, рідше кров, патологічний матеріал отримують також при бронхоскопії.                    

      Хворий збирає харкотиння в чисту баночку або кишенькову плювальницю. Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12-24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклеюють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважають потенційно патогенним.

      Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отримують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки. Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомогою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину предметного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібріну обережно розправляють на пердметному склі. Сечу центрифугують і мазки виготовляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходитися у сечі здорових людей.

      Морфологія. Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсена або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно поза клітинами.

 

Збудник туберкульозу у мазках із харкотиння і сечі

 

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію, потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульозні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення L-форм мікробактерій застосовують переважно фазово-контрастну і люмінесцентну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку після перегляду не менше 100 полів зору, обов’язково вказуючи кількість бактерій у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити діагноз туберкульозу.

       Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: мікобактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу. Окрім того за цим методом неможливо відрізнити збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи збагачення – гомогенізації та флотації.

   

  Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавляють рівний об’єм 1 % розчину NaOH, щільно закривають гумовою пробкою і струшують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану рідину центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують 2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

      Метод флотації. Прислану порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують як описано вище. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять у водяну баню при 55 0С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу), струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобактеріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дистильовану воду, щоб цей шар піднявся у  горлечко колбочки чи флакона. Стерильною пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло, яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі 60 0С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріалу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

      Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою гомогенізації або флотації.     Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріоскопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу    20-100 і більше мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості мікобактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення змінених варіантів, особливо       L-форм.

      Культуральні властивості. Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз містять супутню мікрофлору (окрім крові, спинномозкової рідини). Тому виділити чисту культуру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення стороніх мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють 20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кислоти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 0С протягом 18-20 год. Потім оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізують, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

      Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середовищем Левенштейна-Йенсена  (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попереднє, але в ньому аспарагін замінено на глутатінат натрію.                                                                   

     

Ці середовища рекомендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петраньяні, Павловського, Сотона.

 

   

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим парафіном для попередження висихання середовища.

      Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 0С протягом 3-4 тижнів. Ті пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою,  пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім вертикально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторонньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до 5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто негативну відповідь щодо туберкульозу.

      Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі, шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної капусти або бородавки (рис.9). Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам.

            S-форма колоній жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів мікобактерій. Але під впливом  антибактеріальних препаратів  M. tuberculosis також може утворювати м’які, вологі, пігментовані S-форми колоній. Необхідно відмічати швидкість і рясність росту.

      Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд ніжної плівки, яка з часом товщає, грубішає, становиться крихкою і випадає в осад. Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

      Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу досліджуваний матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікрофлору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування, швидше виростають колонії.

      Прискорені методи культивування. Щоб значно швидше отримати ріст мікобактерій туберкульозу запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової. Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець (звичайні скельця розрізають навпів по довжині). Висушені мазки беруть стерильним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кислоти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видалення кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким середовищем Сотона

або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють 10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 0С. Через 3-4 доби скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем-Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препаратах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора. Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день.

       Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школьнікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощування культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за методом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів. 

      Щоб виявити L-форми мікобактерій туберкульозу посів матеріалу після відповідної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 0С протягом 1-2 міс. Ріст L-форм нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи. Виготовлені мазки досліджують під  фазово-контрастним мікроскопом, за допомогою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх можна виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомогою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені антитіла проти антигенів L-форм.

      Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уреази, нікотинамідази.

    Найвідмітніша ознака M. tuberсulosis – ніациновий тест – здатність синтезувати значну кількість нікотинової кислоти (ніацину).

Каталазна активність відносно слабка і втрачається при 68 0С. Для швидкої диференціації збудників туберкульозу людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і 1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на цьому середовищі не ростуть.

      Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних проб і виявленні корд-фактора. Останній визначають методом мікрокультур Прайса а також на основі міцного зв’язування таких барвників як нейтральний червоний або нільський голубий. При нанесені на мазок розчину NaOH туберкульозні палички зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють відповідне забарвлення.

      Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних матеріалах як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст шлунка, тканини тощо. Ці об’єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необмежений час і в будь-який момент можуть бути досліджені. Серед них найбільшої уваги заслуговує молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції.    Він оснований на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть якщо в матеріалі знаходиться  всього 5-10 мікробних клітин за допомогою олігонуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у циклотермостаті, які потім можна ідентифікувати методом гельелектрофорезу. Результати досліджень отримують через 3-4 години.

      Антигенні властивості. Антигени туберкульозної палички складаються з білкових фракцій, ліпідів, фосфатидів і полісахаридів.Антигенна структура різних видів мікобактерій туберкульозу подібна. Туберкуліновий протеїн має виражені алергенні властивості. Специфічні антигени можна швидко виявити за допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла,

адсорбовані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

      Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберкульозних паличок через кожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

      Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий. При прямому способі безпосередньо сіють  відповідно роброблений матеріал на середовища з різними концентраціями антибіотиків чи інших хіміопрепаратів. Він ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявлють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на середовище з протитуберкульозними препаратами сіють попередньо виділені культури мікобактерій. В обох випадках обов’язковий контроль — посів на таке саме середовище без туберкулостатиків.

      У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської стійкості мікобактерій:

      1) культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

      2) мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

      3) глибинні посіви в напівантетичні середовища.

      У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну (без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних тіл в 1мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній, культуру вважають стійкою. Резистентність даного штаму виражають тією максимальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається ріст, наближений до росту в контролі.

                Біологічний метод діагностики туберкульозу – зараження гвінейських свинок – є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих

тварин складає всього декілька бактерійних клітин.

 Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотонічного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Такий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках, коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніазиду та інших хіміопрепаратів.

      Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільшених лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів. Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних результатах тварин умертвляють через 3-4 міс, гістологічно досліджують перенхіматозні органи і роблять посіви на елективні середовища.

 

Розтин гвінейської свинки з метою дослідження внутрішніх органів.

 

      Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій туберкульозу. В таких випадках потрібно зробити декілька послідовних заражень, оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякісний перебіг туберкульозу, який при реверсії L-форм може перейти в генералізований процес.

      Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, заражаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тваринах – це своєрідний “золотий стандарт” при діагностиці туберкульозу.

       Серологічна діагностика. Для виявлення протитуберкульозних антитіл спочатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комплементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати реакції непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізовані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із туберкульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів додають 20 мл естракту мікобактерій, витримують при 37 0С протягом 2-х год і відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигена. Перед постановкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усунення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1 : 2 до 1 :272.

Діагностичним титром вважають розведення 1 : 8. При туберкульозі РНГА буває позитивною у 70-90 % випадків.

 

Хороші результати дає також імуноферментний аналіз, імуноблотинг і реакція агрегат-гемаглютинації для визначення циркулюючих імунних комплексів.    

      Ще точнішим є радіоімунний метод, але із-за високої вартості діагностикумів і відсутності радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

      Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налагодити випуск моноклональних антитіл до різних антигенів мікобактерій. З їх допомогою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій а також відповідні їм антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

 

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специфічним  діагностичним тестом.

 

Проба Манту

Проведення проби Манту

                Його використовують для визначення інфікованості населеня туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків, відбору осіб, яким потрібно проводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність а також із метою діагностики туберкульозу та визначення активності процесу. Для постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропонував перший препарат, так  званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або АТК).

Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого типів, вирощених у гліцериновому бульйоні протягом 5-6 тижнів. Культуру стерилізують  текучою парою 30 хв, випарюють при 70 0С до 1/10 первісного об’єму, фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починабчи з 1934 р. і для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений  препарат туберкуліну, який назвали РРD–S (Purified protein derivative – Seibert).Через 5 років М.А. Ліннікова виготовила очищений туберкулін під назвою ППД-Л.

Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухих очищений туберкулін по 50000 ТО в ампулі і ППД-Л у стандартному розведенні в ампулах по 3 мл. У 0,1 мл розчину міститься одна доза (2 ТО).

         Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шприцом в об’ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя.

Перед ін’єкцією шкіру протирають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх уводять у поверхневий шар шкіри паралельно до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: негативна проба – повна відсутність папули; сумнівна – папула розміром 2-4 мм або лише гіперемія будь-якого розміру; позитивна – папула діаметром 5 мм і більше; гіперергічна – у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих – 21 мм і більше.

 

           Застосовують атенуйований штам M. Bovis; так звані бацили Кальметта-Герена (БЦЖ). Імунізацію проводять внутрішньошкірним введенням 0,1 мл вакцини всім новонародженим. Після вакцинації на деякий час відмовляються від постановки шкірних проб для попередження гіперергіних ускладнень (некротичні реакції). Реакцію проводять у віці 7, 12, 17, 22, 17-30 років особам з від′ємними реакціями Манту.

 

Мікобактеріози

     У навколишньому середовищі існує багато атипових потенційно патогенних мікобактерій. Частина з них виділяється від людей і тварин

при різноманітних захворюваннях легень, шкіри, лімфатичних вузлів, інших тканин і органів. Вони отримали загальну назву мікобактеріози.

Роль умовно-патогенних мікобактерій в інфекційній патології людини зростає з кожним роком. У цю групу захворювань не входять туберкульоз і проказа, хоч деякі з них мають подібний перебіг. Існуючі методи лікування туберкульозу і мікобактеріозів різні у зв’язку з чим мікробіологічна ідентифікація збудників набуває особливого значення.

      За класифікацією Раньйона атипові мікобактерії поділяються на 4 групи: фотохромогенні, скотохромогенні, нефотохромогенні та швидкоростучі.

      До фотохромогенних мікобактерій належать Mycobacterium kansassii,     M. marinum, M. ulcerans, M. simiaе, M. szulgai. Вони кислотостійкі, утворюють жовто-оранжевий пігмент на світлі, викликають туберкульозоподібні захворювання легень, лімфаденіти, ураження шкіри і підшкірної клітковини. M. ulcerans, наприклад, спричиняє виразку Бурулі.

      Скотохромогенні мікобактерії (M. scrofulaceum, M. aquaе, M. flavescens та ін.) утворюють жовто-оранжевий пігмент у темноті, викликають шийні лімфаденіти у дітей, рідше патологічні процеси в легенях.

          Нефотохромогенні види M. avium, M. intracellulare, M. xenopi – мають дуже слабку пігментацію колоній, або вони зовсім не забарвлені, викликають туберкульозоподібні захворювання легень, шкіри, нирок, кісток і суглобів, небезпечні для хворих з імунодифіцитами, особливо при ВІЛ-інфекції. Вони викликають туберкульоз у птахів і рідко у людини (M. avium).

          До групи швидкоростучих мікобактерій віднесені M. fortuitum,  M. friеdmanii, M. malmoense, M. smegmatis, M. phlei. Вони причетні до виникнення абсцесів після ін’єкцій у накроманів, запалення навколо імплантованих об’єктів (наприклад, протезів серцевих клапанів). Ураження легень і лімфаденіти у дітей викликає M. malmoense. Практичне значення в плані диференціації різних видів мікобактерій має M. smegmatis, особливо при лабораторній діагностиці захворювань сечостатевої системи.

        Мікробіологічна діагностика. Матеріалом для дослідження служить харкотиння, вміст виразок та інших уражень шкіри, пунктати лімфатичних вузлів, промивні води бронхів, сеча та ін. Лабораторні дослідження проводять за тими ж принципами і методами, що й при туберкульозі.

      Після первинної мікроскопії матеріал сіють на середовища Левенштейна-Йенсена, Фінна і обов’язково на середовище з саліцилатом натрію. Перед посівом патологічний матеріал обробляють 15-20 хв 2-5 % розчином сірчаної кислоти або 10 % розчином фосфату натрію протягом 18-20 год при 37 0С. Атипові мікобактерії більш чутливі до такої обробки, ніж палички туберкульозу. Якщо обробляти харкотиння малахітовим зеленим або генціановим фіолетовим – виділення збудників мікобактеріозів збільшується в 3-4 рази.

      Для ідентифікації атипових мікобактерій запропоновано багато тестів. Однак у бактеріологічних лабораторіях практичних медичних установ використати їх просто неможливо. Найчастіше для встановлення виду збудника враховують колір колоній, швидкість росту субкультур, ріст при різних температурах і особливо на середовищі з саліцилатом натрію, визначення каталази, синтезу ніацину та ін. Практично всі види атипових мікобактерій дають ріст на середовищі з саліцилатом натрію, в той час як збудники туберкульозу на ньому не ростуть. Ніацин синтезує лише M. tuberculosis, а збудники мікобактеріозів не утворюють нікотинової кислоти.

      Розроблені методи ідентифікації атипових мікобактерій в реакціях преципітації і фаголізису. Серологічні реакції для діагностики мікобактеріозів, особливо такі як РЗК, РІФ,  РНГА, можна буде використовувати при умові виготовлення специфічних тест-систем.

Великі можливості для визначення збудників цих захворювань відкриває впровадження ланцюгової полімеразної реакції.

 

Лепра (проказа)

                                                                  

      Лепра – первинно-хронічна генералізована інфекційна хвороба людини, яка характеризується специфічними ураженнями шкіри, слизових оболонок, периферичних нервів і внутрішніх органів. Збудник захворювання – Mycobacterium leprae. Окрім того, у щурів лепру викликає M. lepraemurium, морфологічно і тінкторіально дуже подібна до паличка прокази людини.   

 

      Розрізняють дві основні клінічні форми хвороби: туберкулоїдну і лепроматозну.

     Остання має більш тяжкий прогресуючий перебіг. Прокажений виділяє збудника при кашлі, чханні і розмові, оскільки він у великій кількості знаходиться у слизовій оболонці носоглотки. Зараження людей відбувається частіше повітряно-краплинним способом при тісному контакті з хворими на проказу.

При лабораторній діагностиці лепри використовують переважно бактеріоскопічний метод дослідження, значно рідше біопробу на мишах і броненосцях-армадилах та алегрічну пробу з лепроміном.

      Матеріалом для дослідження служать зіскоби слизової оболонки носа, скарифікати з уражених ділянок шкіри, особливо з надбрівних дуг, мочок вушних раковин, підборіддя а також біоптати лепром і ліфматичних вузлів.

      Зіскоб слизової оболонки з обох боків носової перегородки проводять металевою ложечкою до появи краплі крові. Для взяття скарифікату шкіру в місці ураження зажимають двома пальцями в складку, впродовж якої скальпелем роблять невеликий розріз глибиною 1-2 мм. Зіскоб зі стінок надрізу переносять на предметне скло. Виготовлені мазки забарвлюють за Цілем-Нільсеном або за методом Семеновича-Марциновського. При проведені гістологічних досліджень біоптатів частину зрізів також фарбують одним із вказаних методів для виявлення мікобактерій.

      Морфологія.У мазках лепрозні бактерії мають вигляд рубіново-червоний прямих або ледь зігнутих паличок з округленими кінцями.

 При мікроскопії гістологічних зрізів видно їх скупчення всередині клітин, де палички розташовуються паралельно, нагадуючи пачки сигар. Це дає змогу диференціювати їх від мікобакте рій туберкульозу, які за своїми морфологічними і тінкторіальними властивостями подібні до збудника лепри

               При посівах лепрозних матеріалів на елективні для мікобактерій середовища ріст відсутній. Гвінейські свинки не чутливі до M. lepraе.

      Біологічну пробу ставлять на мишах (особливо чутлива японська танцююча миша). Гомогенат досліджуваного матеріалу вводять у подушечку задньої лапки тварин, імунологічну реактивність яких понижують введенням Т-імунодепресантів. У позитивних випадках на місці інокуляції матеріалу через декілька місяців виникає інфільтрат, що місить гранулеми із розташованими всередині клітин мікобактеріями. При зараженні броненосців (армадил) у них розвиваються типові множинні вузли (лепроми) в тканинах і органах, де мікроскопічно виявляють багато лепрозних бактерій.

      Алергічну пробу з лепроміном використовують, в основному, для диференціації лепроматозної від туберкулоїдної форм прокази.

Алерген готують із простерилізованих в автоклаві гомогенатів уражених тканин, що містять величезну кількість мікобактерій. Лепромін уводять внутрішньошкірно в середній третині передпліччя в об’ємі 0,1мл.

      Через 48 год у позитивних випадках розвивається п’ятно гіперемії або папула (реакція Фернандеса). Значно пізніше (1-2 міс.) може утворитися бугорок, часто з некрозом (реакція Міцуди).                          

      У хворих на лепроматозну форму алергічна проба буде негативна, а у хворих на туберкулоїдну форму та здорових людей – позитивна. Отже лепромінова проба діагностичного значення не має, її використовують лише для визначення клінічної форми хвороби і прогнозу.

                                                                                                                       

                                                         

       Джерела інформації: 

Основні А.  1. Пяткін К Д., Кривошеїн Ю.С. «Мікробіологія», Київ.: «Вища школа», 1992, С. 274–294.

2. Климнюк С.І., Ситник І.О.,  Творко М.С.Широбоков В.П. «Практична мікробіологія», Тернопіль.: «Укрмедкнига», 2004, С. 257-363, 272-284.

 

Додаткові В: 1. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П.,2000. 

2. Кривошеий Ю.С. и др. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней. К, 1996. 

3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология.– М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– С. 309-317, 406-414.

 

                                                                 

  Матеріали для самопідготовки підготува:  доц. Ткачук Н.І., ас. Романюк Л.Б.