Тема 8. Мікробний антагонізм. Основи хіміотерапії. Хіміотерапевтичні препарати. Антибіотики. Методи визначення антиб

Тема 8. Мікробний антагонізм. Основи хіміотерапії. Хіміотерапевтичні препарати. Антибіотики. Методи визначення антибiотикочутливостi бактерiй. Основнi принципи рацiональної хiмiотерапiї iнфекцiйних хвороб.

Тема 9. Морфологія та ультраструктура вірусів. Основнi методи культивування вiрусiв. Індикація вірусної репродукції.

За характером взаємовідношень з рослинним і тваринним світом мікроорганізми поділяють на дві групи: сапрофіти і паразити. До сапрофітів відносять мікроорганізми, що не мають властивості спри­чиняти захворювання. Групу паразитів становлять види, які присто­сувалися до життя за рахунок організмів рослин, тварин і людини.

 

Співжиття мікроорганізму з макроорганізмом, або симбіоз, трап­ляється  в  кількох формах.

Коменсалізм — симбіоз організмів, при якому один із них живе за рахунок іншого, не завдаючи йому шкоди. До мікроорганізмів-коменсалів належить переважна більшість представників нормальної мікрофлори   організму  людини.

Мутуалізм — така форма симбіозу, при якій обидва зв’язаних один з одним організми мають із свого співжиття взаємну вигоду. Наприклад, симбіоз бульбочкових бактерій з бобовими рослинами характеризується типовим мутуалізмом. Бульбочкові бактерії жи­вуть у коренях рослин, а бобові рослини, в свою чергу, використову­ють для живлення азотисті сполуки, що виробляються бактеріями з  атмосферного  азоту.

Типовим прикладом мутуалізму можуть бути численні лишайники (арктичний оленячий мох та ін.), що складаються з зеленої або синьо-зеленої водорості і гриба — аскоміцету або базидіоміцету. Водорості синтезують поживні речовини (фотосинтез), а гриби виконують захис­ну функцію і забезпечують водорості водою та мінеральними солями.

Деякі види бактерій із групи кишкової мікрофлори перебувають у симбіозі з організмами тварин, у яких вони існують. Ці мікроорга­нізми -мутуалісти живляться рештками їжі, що надходять у нижні відділи кишечника, а продуковані ними вітаміни використовуються тваринами для біокаталітичних реакцій.

Паразитизм — симбіоз, при якому один організм (паразит) живе за рахунок іншого (хазяїна) і завдає йому шкоди. Деякі мікроорганіз-ми-паразити спричиняють інфекційні захворювання рослин і тварин.

Хвороботворні види мікроорганізмів називаються патоген­ними. В процесі свого еволюційного розвитку вони пристосувались до паразитичного типу живлення у тканинах і рідинах тваринного організму. Сприйнятливий інфікований організм відповідає на про­никнення патогенного мікроорганізму неспецифічними і специфіч­ними біологічними реакціями, які виражаються в атипових або ти-по-вих проявах захворювання, а також у найрізноманітніших захисних пристосуваннях.

У свій час Я. Генле (1878), а потім Р. Кох (1882) сформулювали три умови, за яких мікроорганізм може бути визнаний збудником захворювання: 1) мікроорганізм-збудник має виявлятися в усіх ви­падках при цьому захворюванні і не траплятися ні в здорових, нї у хворих на інші захворювання; 2) мікроорганізм-збудник повинен бути виділений з організму хворого в чистій культурі; 3) чиста куль­тура виділеного мікроорганізму повинна спричиняти те саме захво­рювання у сприйнятливих тварин. Тепер ця тріада значною мірою втратила своє значення.

Для виникнення і розвитку інфекційного процесу потрібні три ланки: 1) наявність патогенного мікроорганізму; 2) проникнення його у сприйнятливий макроорганізм; 3) певні умови середовища, в якому відбувається  взаємодія  мікро-  та  макроорганізму.

Взаємовідношення збудника із сприйнятливим макроорганізмом відбуваються у складних умовах паразитоценозу, тобто в різних спів­відношеннях з іншими бактеріями, вірусами, грибами і найпрості­шими. Наслідки проникнення в організм людини патогенних видів залежать не тільки від реактивності макроорганізму, а й від нормаль­ної мікрофлори тіла людини, яка може проявляти себе як антагоні­стично, так і синергетично.

Поряд із патогенними є порівняно велика група мікроорганізмів, що дістали назву умовно-патогенних; вони живуть на шкірі, в кишках, дихальних шляхах, сечостатевих органах. За нор­мальних фізіологічних умов життя умовно-патогенні бактерії не спричиняють захворювань, але при перевтомі організму, перегрі­ванні, охолодженні, інтоксикації, діянні іонізуючого випромінювання, зниженні природної резистентності вони стають здатними спричиняти низку   аутоінфекцій.

В основі відкриття антимікробної дії лежить явище бактеріального антагонізму. Воно характеризується тим, що один вид мікроорганізмів (бактерії, актиноміцети, гриби, водоростей) здатний пригнічувати або  затримувати ріст інших.

 

Яскравою формою антагонізму, широко розповсюдженою у світі мікробів, є утворення специфічних продуктів обміну, що пригнічують розвиток організмів інших видів. Такі речовини одержали назву  антибіотиків  (грец. anti – проти, bios – життя).  Ввів цей термін у 1942 р. З. Ваксман. За його визначенням це хімічні речовини, що утворюються мікробами, і здатні пригнічувати ріст або руйнувати бактерії та інші мікророганізми.

 

Антибіотики – це хіміотерапевтичні засоби, що утворюються мікроорганізмами або отримані з інших.

природних джерел, а також їх похідні та синтетичні продукти, що мають здатність

вибірково пригнічувати в організмі хворого збудників захворювань.

 

Антибіотики широко використовуються у клініці, мають високу терапевтичну ефективність і порівняно низьку токсичність для організму людини.  При проведенні мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб у бактеріологічних і вірусологічних лабораторіях, а також при вивченні дії певних медикаментозних препаратів часто вдаються до зараження піддослідних тварин. Знання факторів неспецифічного захисту дозволяє зрозуміти механізми захисту організму від збудників інфекційних захворювань.

 

Антагонізм – пригнічення однієї популяції іншою. Мікроби-антагоністи виділяють антибіотики, бактеріоцини, жирні кислоти, які викликають загибель інших видів або затримують їх розмноження.

Рис. 1. Визначення антагоністичних властивостей досліджуваних штамів (isolate) бактерій до тест-мікроорганізмів (Ec – E. coli, Pf – P. flourescens, Bs – B. subtilis, Se – S. epidermidis, and Ef – E. faecalis).

 

Хіміотерапевтичні засоби можна класифікувати за багатьма ознаками:

1.           походженням (неорганічні, біоорганічні речовини та їх синтетичні аналоги, органічні речовини абіогенної природи),

2.           хімічною будовою, спрямованістю дії (протибактеріальні, протигрибкові, противірусні, протипаразитарні),

3.           метою застосування (профілактичні, терапевтичні, багатоцільові та ін.),

4.           механізмом дії.

 

Хіміотерапевтичні препарати:

1.           галогенові (хлорамін, хлорцин, пантоцид), (йодоформ, йодикол, розчин Люголя);

2.           окисники (перекис водню, перстерил, дезоксон-1); солі важких металів (ртуті, срібла, міді, цинку, свинцю, вісмуту);

3.           нітрофурани (фурацилін, фурадонін, фуразолідон, фурапласт);

4.           барвники (похідні хіноліну, хіноксаліну);

5.           альдегіди (формальдегід, лізоформ, цитраль);

6.           кислоти (бензойна, саліцилова, борна, бікармінт, цигерол);

7.           поверхнево-активні речовини;

8.           сульфаніламідні препарати (сульфадимезин, фталазол, сульгін, сульфадиметоксин, бісептол

 

Хіміотерапевтичний індекс – відношення максимальної дози препарату, що переноситься хворим (Dosis tolerantia), до мінімальної лікувальної (Dosis curativa). Цей показник не повинен бути меншим 3.

Mеханiзми дiї основних хiмiопрепаратiв надзвичайно різноманітні і залежать від хімічної природи діючої речовини.

 

Препарати спричиняють

1.     деструктивні ефекти,

2.     окислювальну,

3.     мембраноатакуючу,

4.     антиметаболічну,

5.     антиферментну та іншу дію.

 

Антибіотиками (anti – проти, bios – життя) називають речовини мікробного, рослинного або тваринного походження, їх напівсинтетичні та синтетичні аналоги і похідні, що вибірково пригнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин.

Залежно від кінцевого наслідку впливу на бактерії, їх поділяють на препарати з бактеріостатичним (гальмування росту та розмножненння) та бактерицидним (загибель мікробів) типом дії.

Бактеріостатична дія препарату– препарат затримує ріст і розмноження бактерій.

Бактерицидна дія препарату – препарат зумовлює загибель мікроорганізмів.

Антибіотики мають характерні особливості, що відрізняють їх від інших продуктів життєдіяльності.

1.Висока біологічна активність. Антибіотичні речовини спричинюють біологічний ефект у дуже низьких концентраціях.  (Пеніцилін у концентрації 0,000001 г/мл має виражену бактерицидну дію на бактерії).

2.Виражена вибіркова специфічність. Кожний антибіотик проявляє активність тільки  по відношенню до певних груп організмів, не завдаючи шкоди іншим. Так, бензилпеніцилін затримує ріст грампозитивних  бактерій (стафілококів, стрептококів) і практично не діє на грамнегативні мікроби, гриби.

Біологічну активність антибіотиків оцінюють в умовних одиницях, які містяться в 1 мл розчину (од/мл) або 1 мг препарату (од/мг). За одиницю антибіотичної активності приймають мінімальну кількість препарату, здатну затримати ріст певного числа клітин стандартного штаму тест-мікробів в одиниці об’єму живильного середовища.

Одиницею активності пеніциліну є мінімальна кількість препарату, здатна затримувати ріст  штама Staphylococcus aureus 209 у 50 мл живильного бульйону.

Одиниця активності  стрептоміцину – мінімальна кількість речовини, яка затримує ріст E. coli  в 1 мл живильного бульйону.

Колонії Streptomycetes, що продукують стрептоміцин

Хіміотерапевтичний індекс – відношення максимальної дози препарату, що переноситься хворим (Dosis tolerantia), до мінімальної лікувальної (Dosis curativa). Цей показник не повинен бути меншим 3.

Хіміотерапевтичні препарати: галогенові (хлорамін, хлорцин, пантоцид), (йодоформ, йодикол, розчин Люголя); окисники (перекис водню, перстерил, дезоксон-1); солі важких металів (ртуті, срібла, міді, цинку, свинцю, вісмуту); нітрофурани (фурацилін, фурадонін, фуразолідон, фурапласт); барвники (похідні хіноліну, хіноксаліну); альдегіди (формальдегід, лізоформ, цитраль); кислоти (бензойна, саліцилова, борна, бікармінт, цигерол); поверхнево-активні речовини; сульфаніламідні препарати (сульфадимезин, фталазол, сульгін, сульфадиметоксин, бісептол).

 

Бактеріостатична дія препарату– препарат затримує ріст і розмноження бактерій.

Бактерицидна дія препарату – препарат зумовлює загибель мікроорганізмів.

 

Класифікації антибіотиків

 

 

 

 

 

Механізм дії антибіотиків

 

 

 

 

Напівсинтетичні пеніциліни

 

 

Варіанти цефалоспоринів

 

 

До препаратів, що використовуються в лікарській практиці, ставляться певні вимоги:

– висока вибірковість антимікробного ефекту в дозах, нетоксичних для організму;

– відсутність або повільний розвиток резистентності збудників до препарату під час його застосування;

– збереження антимікробного ефекту в рідинах організму, ексудатах, тканинах, відсутність або низький рівень зв’язування білками сироватки крові, інактивації тканинними ферментами;

– всмоктуванння, розподіл препарату, що забезпечує терапевтичні концентрації в крові, тканинах, рідинах, які швидко досягаються і підтримуються протягом  тривалого періоду; створення високих концентрацій препарату в сечі,  жовчі, калі, вогнищах ураження;

– зручна лікарська форма, яка забезпечує  максимальний ефект, і залишається стабільною  при звичайних умовах зберігання.

 

РЕЗИСТЕНТНІСТЬ МІКРОРГАНІЗМІВ ДО АНТИБІОТИКІВ

 

Під резистентністю мікроорганізмів до антибактеріальних засобів розуміють збереження їх здатності до розмноження в присутності  таких концентрацій цих речовин, які створюються  при введенні терапевтичних доз.

 

Типи стійкості бактерій до антибіотиків

      Перший тип – природна стійкість, яка визначається  властивостями даного виду або роду мікроорганізмів.      (Стійкість   грамнегативних   бактерій до  бензилпеніциліну, бактерій – до протигрибкових, грибів – до антибактеріаль- них препаратів).

     Другий тип – набута стійкість.

Вона може бути первинною і вторинною.

Термін “набута стійкість” застосовують у випадках, коли в чутливій до  даного  препарату  популяції  мікроорганізмів  знаходять резистентні варіанти.  Вона виникає, в основному, внаслідок мутацій, що відбуваються в геномі клітини.

Первинна стійкість (як результат мутації) виявляється  в окремих клітинах популяції через її гетерогенність до початку лікування антибіотиками.

Вторинна стійкість формується також за рахунок мутацій може зростати  при контакті бактерій з антибіотиками. Мутації ненаправлені та не пов’язані  із дією антибіотиків. Останні відіграють лише роль селекціонуючих агентів.  Вони елімінують чутливі особини популяції і, відповідно, починають переважати резистентні клітини.

Залежно від швидкості виникнення мутантів набута вторинна стійкість  буває двох типів:        стрептоміциного     й      пеніцилінового.

Стрептоміциновий тип виникає як “одноступенева мутація“, коли швидко відбувається утворення мутантів з високою стійкістю після одно-двократного  контакту мікроба з антибіотиком. Ступінь її не залежить від концентрації препарату (стрептоміцину, рифампіцину, новобіоцину). 

Пеніциліновий тип резистентності формується  поступово, шляхом “багатоступеневих мутацій”. Селекція стійких варіантів при цьому відбувається повільно (пеніцилін, ванкоміцин, левоміцетин, поліміксин, циклосерин)

 

Резистентність мікробів до антибіотиків забезпечується генами, які локалізуються або у хромосомі, або у складі позахромосомних елементів спадковості (транспозони, плазміди).

Хромосомні мутації – найчастіша причина зміни рецептора, мішені, з якою взаємодіють ліки. Так, білок Р10 на 30s субодиниці бактеріальної рибосоми є рецептором для прикріплення стрептоміцину. У бактерій, стійких до дії еритроміцину, може пошкоджуватись сайт на 50s субодиниці рибосоми внаслідок метилювання 23s рРНК.

 

R-плазміди можуть містити від одного до десяти і більше різних генів лікарської резистентності, що робить мікроб нечутливим до переважної більшості антиібіотиків, які використовуються в клініці. Деякі з них (кон’югативні, трансмісивні) здатні передаватись від одного бактеріального штаму до іншого не тільки в межах одного виду, але й часто різних видів і навіть родів мікробів. Крім кон’югації можлива передача детермінант стійкості  за допомогою трансдукції (у стафілококів), а також трансформації.

Плазміди резистентності

 

     

У деяких мікроорганізмів описано ще один клас мігруючих генетичних елементів – транспозони. Часто такі елементи виявляються у стафілококів, ентеробактерій (транспозон Tn551 несе маркери резистентності до еритроміцину, Tn552 – до пеніциліну, Tn554 – до еритроміцину і спектино-міцину).  Небезпека їх полягає в тому, що вони можуть інтегруватись як з кон’югативними R-плазмідами, так і з трансдукуючими r-факторами.

 

Плазміди кодують синтез ферментів, які руйнують антибіотики. Наприклад, стафілококи, які резистентні до пеніциліну, цефалоспоринів, продукують

b-лактамазу.

Грамнегативні бактерії (штами Proteus, Klebsiella, Escherichia) також здатні синтезувати цей фермент, який розщеплює ампіцилін, деякі цефалоспорини (цефалотин, цефалоридин, цефазолін та ін.).

 

Резистентні до левоміцетину бактерії синтезують хлорамфенікол-ацетилтрансферазу, штами, стійкі до аміноглікозидів, – ферменти аденілування, фосфорилювання, ацетилювання, які направлено проти відповідних антибіотиків.

 

 

Виникнення резистентних форм

 

Попередити формування антибіотикостійких  популяцій можна за рахунок  використання комбінацій двох антимікробних сполук або антибіотиків з препаратами, які підвищують адсорбцію і проникнення їх у мікробну клітину, здатних інтенсифікувати їх поділ, поліпшувати доступ  препарату до бактерій.

При наявності стійких форм бактерій в організмі можна  застосувати препарати з іншим механізмом дії; елімінацію плазмід сполуками, які діють на ДНК мікробів та їх мембрани,  використанням антибіотиків зі сполуками, що блокують ферменти, які руйнують препарати (пеніциліни, цефалоспорини, аміноглікози- ди, хлорамфенікол), підвищують адсорбцію та проникнення  антимікробних препаратів у клітину і підвищують природну чутливість  останніх.

Комбінована дія антибіотиків

Ефект тетрацикліну на деколоризацію зубної емалі

Побічний ефект після прийому ріфампіну

Результат лікування ангіни антибіотиками

 

Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків:

1.     диско-дифузійний метод;

2.     методу серійних розведень на рідкому поживному середовищі;

3.     прискорені методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків

 

Диско-дифузійний метод

є найпростішим якісним методом і широко використовується для епідеміологічного контролю резистентності. Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків потрібно визначати тільки у чистій культурі. Для виготовлення інокулюму 5-10 однорідних колоній суспензують у 2 мл рідкого середовища або фізіологічного розчину. Бактеріальну суспензію (103-105 КУО/мл залежно від виду мікробів) в об’ємі 1 мл рівномірно розподіляють по поверхні середовища при похитуванні чашки, надлишок рідини видаляють піпеткою. Чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, а потім на поверхню засіяного газону на однаковій віддалі кладуть диски з антибіотиками. Результати враховують через 24 та 48 год після інкубування при оптимальній температурі, вимірюючи діаметри зон затримки росту (Рис. 2). Оцінку результатів проводять за спеціальними таблицями, які містять граничні значення діаметрів зон затримки росту для резистентних, помірно резистентних та чутливих штамів, а також значення мінімальної пригнічуючої (інгібуючої) концентрації (МПК, МІК) антибіотиків для стійких і чутливих штамів. Одержані значення діаметрів зон затримки росту порівнюють з контрольними значеннями таблиць (Табл. 7) і відносять досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості: чутливі, помірно резистентні, резистентні.

 

Video

 

Рис. 2. Диско-дифузійний метод

 

 Зони затримки росту мікроорганізмів

 

 

R = резистнтний, I = помірно резистентний, S = чутливий

 

Метод серійних розведень на рідкому поживному середовищі

Готують ряд (8-10 і більше) пробірок з двократними послідовними розведеннями препарату. Середовище (МПБ, перевар Хоттінгера) попередньо розливають у пробірки по 2 мл. У першу додають 2 мл розчину антибіотика певної концентрації, перемішують і переносять до наступної пробірки, продовжуючи розведення до передостанньої пробірки, з якої видаляють 2 мл суміші. Остання пробірка служить контролем росту культури. У тому ж бульйоні, який використовують для розведення антибіотиків, готують суспензію добової агарової або бульйонної культури бактерій. Потім до кожної пробірки з розведеннями, а також до контрольної додають по 0,2 мл виготовленої суспензії, з розрахунку 105-106 мікробних тіл в 1 мл середовища залежно від виду збудника. Пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год. Визначають наявність або відсутність росту в середовищі з різними розведеннями препарату. Остання пробірка, в якій спостерігають затримку росту культури (прозорий бульйон), відповідає МПК або МБсК (мінімальній бактеріостатичній концентрації) препарату відносно даного мікроба і вказує на ступінь його чутливості. Якщо ріст з’являється в усіх пробірках, досліджуваний штам резистентий до максимальної концентрації препарату, яку було взято в дослід. Відсутність росту бактерій в усіх пробірках, крім контрольної, свідчить, що МПК препарату нижча, ніж та, що використовується в досліді. Для визначення бактерицидного ефекту антибіотика з декількох останніх пробірок, в яких немає ознак росту, роблять висів на сектори агару в чашках Петрі. Через 24-48 год інкубації при оптимальній температурі відмічають ту найменшу концентрацію препарату в пробірці, посів з якої не дав росту. Її приймають за мінімальну бактерицидну концентрацію (МБцК). Про ступінь чутливості мікроорганізмів роблять висновок за МБсК.

 

Таблиця 1. Схема визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень

 

 

 

 

Рис. 3. Метод серійних розведень на рідкому поживному середовищі

 

Video

 

Прискорені методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків базуються на:

1.     визначенні змін ферментативної активності мікроорганізмів

2.     визначенні кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потенціалу під час росту бактерій

3.     цитологічній оцінці змін морфології бактеріальних клітин

Використовуються автоматизовані комп’ютерні системи (Рис. 4) (Autobac MS-2, Cobas Micro та ін.)

Рис. 4. Система “Biomic” для прискореного визначення антибіотикочутливості.

 

Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків. Використовуючи звичайні методи, відповідь може бути отримана через 18-20 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури. Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяжкому перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержання даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базуються, прискорені методи передбачають:

• визначення змін ферментативної активності мікроорганізмів під впливом антибіотиків;

• визначення кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потенціалу під час росту бактерій у живильному середовищі;

• цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом антибіотиків.

До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність антибіотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості до дії антибіотика не відбувається розкладання глюкози при культивуванні у середовищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище забарвлюється у фіолетовий колір внаслідок зсуву рН у лужну сторону. Зміна червоного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кислоти внаслідок росту штаму, резистентного до дії антибіотика. Якщо до середовища додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими вже через 2-2,5 год від початку дослідження.

Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу середовища в процесі росту мікроорганізмів, про що свідчить зміна кольору резазурину, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений до 50 °С агар засівають досліджуваною культурою бактерій із розрахунку 200 млн. мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубують при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикатором і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % розчин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічення росту навколо дисків залишаються безбарвними.

Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження зменшується до 3-5 год.

Утворення інволюційних форм бактерій під впливом антибіотиків досліджують під фазово-контрастним чи антоптральним мікроскопом у спеціальних мікрокапсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій препарату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистентності досліджуваного штаму на поверхні агару виростають нормальні мікроколонії.

Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків збігаються з тими, які дають класичні методи.

За останні роки розроблено численні модифікації методу серійних розведень у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в об’ємі 0,25 мл.

Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з планшетів з ліофільно висушеними розведеннями антибіотика, куди вноситься по 0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіотикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індикатора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної густини середовища.

Визначати чутливість бактерій до антибіотиків можна й за допомогою автома­тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2, Sceptor та ін.). При їх використанні результати отримують вже через 3-10 год. Одна з їх переваг полягає в тому, що вони дозволяють отримувати результати одночасно до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних лабораторіях, вони добре корелюють з іншими методиками і за їх допомогою можна не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епідеміологічний контроль резистентності.

Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота виявлення резистентних штамів може бути знижена внаслідок повільного росту стійких варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівняння росту (або загибелі) бактеріальних клітин у присутності антибіотиків з контролем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які гинуть, від тих, що повільно розмножуються.

До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібіторних концентрацій препаратів на ультраструктуру бактеріальних клітин. Вони призводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає неправильну інформацію про чутливість збудників.

Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіотикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості.

Усі методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків мають свої перева­ги і свої недоліки. Тому постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотри­ман­ням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних.

У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності пояснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трактування одержаних лабораторних даних.

Причиною таких ситуацій може бути використання при посіві не чистої культури бактерій, а патологічного матеріалу. Тому визначається не чутливість інфекційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харкотиння, виділень з ран, сечі тощо.

Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіотиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що руйнують препарати. Одним з найдослідженіших ферментів є бета-лактамаза, яка руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька методичних прийомів, що дозволяють швидко визначити її активність. Один з них полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2´2 см, що знаходиться в чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей папір наносять петлею агарову культуру мікробів і розтирають її, формуючи бляшку діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну.

Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній темпе­­ра­турі. При наявності бета-лактамази на темно-синьому фоні спостерігається яскра­во виражена чітка зона просвітління навколо бляшки, що містить агарову культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї бляшки нечіткі.

Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяжких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати концентрацію антибіотиків у біологічних рідинах, зокрема, сироватці крові, сечі. Для цього використовують метод серійних розведень (табл. 16) на рідкому середовищі з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, включаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарвним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння середовища і поява рожевого забарвлення.

Можна використати також фенол-сироваткове середовище з індикатором фено­ловим червоним. У цьому випадку при відсутності росту мікроорганізмів сере­до­вище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває жовтого кольору.

Виходячи із даних таблиці, розчин стандарту пеніциліну затримує ріст тест-мік­ро­бів у концентрації 0,025 ОД/мл, а досліджувана сироватка – в розведенні 1:8. Отже, вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД/мл´8).

 

Визначення концентрації пеніциліну в сироватці крові

 

 

 

Основні принципи раціональної антибіотикотерапії.

З метою запобігання розвитку ускладнень при застосуванні антибіотиків необхідно застосовувати їх раціонально, дотримуючись певних правил.

Необхідно мати обгрунтовані показання до їх призначення і вибирати найактивніший і найменш токсичний препарат. Антибіотики, найефективніші при певному виді інфекції, до яких чутлива більшість штамів даного збудника, називаються препаратами першого вибору.

Альтернативні препарати призначаються тоді, коли препарати першої групи неефективні або коли штам виділеного збудника найчутливіший саме до них.

Препарати резерву використо–вують лише в крайніх випадках (при неефективності першої та другої груп антибіотиків); як правило, вони викликають багато ускладнень. Обов’язково перед початком лікування, до першого введення антибіотика, необхідно взяти матеріал для бактеріологічного аналізу та визначення чутливості збудника до антимікробних агентів (антибіотикограма). Важливим є введення оптимальних доз препарату з раціональною частотою та урахуванням тяжкості інфекційного процесу, а також вибір ефективного способу його введення (per os, внутрішньо-м’язово, внутрішньовенно та ін.). Тривалість курсу антибіотикотерапії залежить від виду збудника, обраного протимікробного препарату, локалізації інфекційного процесу, стану захисних сил організму і в середньому коливається від 5 до 21 дня. Необхідно призначати препарат до явного одужання хворого і ще протягом 3 днів після цього – для профілактики рецидиву захворювання. Важливим є бактеріологічний контроль за виліковуванням і моніторинг з метою профілактики негативних побічних реакцій і ускладнень.

 

Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

За ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи. До першої групи належать збудники гарячки Ебола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, до другої входять арбо- і аренавіруси, віруси сказу, гепатитів А і В, ВІЛ. До третьої групи належать віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини. Четверта група представлена адено-, корона-, герпес-, рео- та онковірусами. Цей поділ певною мірою умовний, так як внаслідок генетичної мінливості можуть з’являтися штами вірусів з підвищеною вірулентністю.

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, – капсида. Разом вони формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими.

 До них належать найдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, аденовіруси, ­паповавіруси.

 Проте більшість вірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками-глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багато­гранник (найчастіше ікосаедр – 20-гранник).

Усі відомі ДНК-геномні віруси ­мають складні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси, що містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких бактеріофагів. При цьому головка бактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у хвості, укладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси мозаїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (бактеріофаги), ниткоподібна (віруси ебола, віруси бактерій). На рис  представлені основні форми і структури найпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

 

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо:

(1)  Тип нуклеїнової кислоти, її структура, стратегія реплікації

(2) Розміри, морфологія, симетрія віріону, число капсомерів, наявність суперкапсиду. 

(3) Наявність специфічних ферментів, особливо РНК- і ДНК-полімераз, нейрамінідази

(4) Чутливість до фізичних і хімічних агентів, особливо ефіру

(5) Імунологічні властивості

(6) Природні механізми передачі

(7) Тропізм до господаря, його тканин і клітин

(8) Патологія, формквання включень

(9) Симптоматологія захворювань.

 

 За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді­ляють на ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20 родин містять віруси, патогенні для людини (табл.).

 

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10^-15 мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи). Віруси характеризуються надзвичайним розмаїттям форм геному. Він може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійним, циркулярним або фрагментованим.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих клітин, і забезпечують проникнення вірусу в клітину, мають РНК- і ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного геному, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – комплекс вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких віруси набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія вірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються, такий тип взаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси (СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які вимагають своєрідних прийомів для роботи з ними, не подібних до мікробіологічних. Вірусологічні дослідження проводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

 

За своїм ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи.

 І група:  збудники гарячки Ебола, Ласа, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, а також вірус гепатиту В (мавп).

 ІІ група –  арбовіруси, деякі аренавіруси, віруси сказу, віруси гепатиту А і В людини, ВІЛ.

 ІІІ група –  віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини.

ІV група –  аденовіруси, коронавіруси, герпесвіруси, реовіруси, онковіруси.

 

Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища

. Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.) чутливі до кислих значень рН.

         Головна властивість вірусу – представити   свій геном в клітині-господарі, для того, щоб відбулась його експресія (трансляція і транскрипція)

Репродукція вірусів.

Особливості її полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини.

Вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції.

Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та часі:

нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки – в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани.

Репродукція вірусів – унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.

 

У репродукції вірусів виділяють ряд стадій.

До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину кілтини та їх роздягання (депротеїнізація).

Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним.

Неспецифічний визначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди.

Специфічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.

Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механізмом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які містять особливий блок з високою молекулярною масою – клатрин.

Мембрани інвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину – індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F- від fusion – злиття).

Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання віріонів – багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболони, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка – лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка.

Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий.

Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій – інформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. В однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми ДНК.

Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На материнській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.

Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації ретровірусів (онкорнавірусів).

Їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна.

Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна.

У такому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією називають процес утворення інформаційних (матричних) РНК.

 

Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або РНК-залежні РНК-полімерази.

 

У ДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів – власні вірусспецифічні транскриптази.

На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках амінокислоти.

Складання віріонів – не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулуму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на цитоплазматичній мембрані.

Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом «вибуху», розриваючи її мембрану.

Складні віруси – брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

 

 

 

Репродукція вірусів

Визначення розмірів вірусів

 

A.  Фільтрування

B.    Седиментація в ультрацентрифузі

C.  Спостереження в електронному мікроскопі

 Порівняльні розміри:

(1) Staphylococcus має діаметр 1000 nm.

(2) Бактеріофаги –10-100 nm.

(3) Діаметр молекули сироваткового альбуміну 5 nmб глобуліну – 7 nm, гемоцианін (23 nm.

 

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх компонентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практично підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

 

 

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

Бляшки на хоріоналантоїсній оболонці

 

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис­товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт­ко­вий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до температури 4 °С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в стерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним шприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа­тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан­тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні ви­значають за титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно- і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Зараження мишенят-сисунців у мозок при діагностиці Коксаки- інфекції

Для виділення вірусів простого герпесу, натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин (кроликів) на скарифіковану рогівку ока. При дослідженні вірусів гепатиту А вводять досліджуваний матеріал через рот. При виділенні вірусів з нейротропними властивостями, таких як арбовіруси, віруси сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей (1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього матеріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріалу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок травматичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

 

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліо­вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матері­алу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріп­лених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp‑2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їх рідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури органів. Вони представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові культури. З цією метою культури клітини вирощують у флаконах, пробірках, матрацах, які розташовуються горизонтально, щоб клітини могли прикріпитись до скла. Перед зараженням їх проглядають під мікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований моношар клітин. Для зараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють живильне середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у кожну пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а потім інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1-2 год для адсорбції вірусів на поверхні клітин. Після цього видаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для видалення неприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середовище (середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у термостаті при 37 °С протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи результати.

Внаслідок розмноження вірусів у культурі клітин у них виникають дегенеративні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). Ступінь їх вираження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особливостями клітин тощо. В одних випадках ці зміни виникають через декілька днів після зараження (віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька тижнів і навіть місяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження найчас­тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД₅₀ (ЦПД₅₀ – така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок, що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагностику захворювання.

При повній дегенерації клітинного моношару спостерігаються зміни в переважній більшості клітин. Вони гинуть, відокремлюються від скла. Окремі клітини, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми. Такий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам поліомієліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне відокремлення всіх клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, респіраторно-синци­тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому виникають багатоядерні гігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви­кликають утворення скупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круглоклітинна дегенерація). При репродукції риновірусів утворюються округлі клітини, які мають відростки, а при розмноженні герпесвірусів спостерігається формування подібних клітин однакового розміру, які розкидано по всьому моношарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний тип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної гарячки) не здатні викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для їх виявлення використовують феномен інтерференції, при якому клітинні культури паралельно заражають іншими вірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за чотири-плюсовою системою: (4+) – означає, що відбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх, (2+) – у 50 %, (+) – до 25 % клітин, (+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклітинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в цитоплазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеїнових кислот є важливим моментом при проведенні вірусологічної діагностики захворювань. Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), натуральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденовіруси, віруси грипу та інші.

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Цитопатична дія  вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

Реакція гемадсорбції

Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів.

Виділення та титрування бактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бакте­рій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальніше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом дослідив канадський мікробіолог Ф. ­д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріофагом. На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бактеріофаги виявились основною моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного коду, впливу радіації на спадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда. Вони складаються з гексагональної головки, в якій ­міститься ДНК, хвостового відростка (стержня, оточеного білковим чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами. Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утво­рена капсомерами, які оточують одну щільно скручену мо­лекулу ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм служить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість ­морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з аналогом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка, що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується.

 

Будова бактеріофагу

 

Бактеріофаги

Хімічний склад фагів, як інших вірусів, представлений нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю ліпідів у оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК. За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних структур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість “внутрішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину.

Бактеріофаги на поверхні клітини

 

Адсорбція і проникнення фага в клітину

 

Реплікація фагів та їх  збирання

 

Вихід бактеріофагів

 

У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфек­ційні хвороби”, і викликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характеризується строгою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофітних мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на “свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близьких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокре­ма, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, додати декілька крапель відповідного бактеріофага, то через певний час ­відбувається просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорга­нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круглу форму і виникають внаслідок літичної дії бактеріофагів. Їх називають негативними колоніями або бляшками бактеріофагів.

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бактеріальною клітиною, вони поді­ляються на вірулентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всередину клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних практично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактеріофаги, частина клітин залишається неушкодженою ними, тому що спостерігається явище лізогенії – інтеграції генома бактеріофага в геном клітини.

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікроорганізми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких факторів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має велике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бактерій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість перетворення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізогенізації їх помірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафі­лококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріофагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі­онів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони зустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Для цього досліджуваний матеріал центрифугують, для осадження твердих частинок, а надосадову рідину в об’ємі 1 мл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який попередньо засіяний 1 мл 6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інкубації при температурі 37 °С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, розводять у 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 разів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та інкубують протягом доби при оптимальній температурі. Як контроль використовують культуру бактерій без бактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріофаг, середовище залишається прозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той час як у контрольній пробірці відбувається ріст бактерій (середовище стає мутним).

Для визначення наявності інфекційних бактеріофагів використовують метод Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в тому, що попередньо матеріал, який містить бактеріофаг, розводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^‑4. Після цього по 1 мл кожного розведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 % м’ясо-пептонного агару, додають 0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно перемішують і виливають у чашки Петрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 % м’ясо-пептонного агару. Чашки залишають на 30 хв при кімнатній температурі для застигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих стерильних плям – “негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом Граціа, після добової інкубації підраховують число “негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає кількості фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число фагових корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній множать на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10^-4 з’явилось 50 колоній, отже, титр фагів дорівнює: 50х10^-4 або 5х10^-5 в 1 мл.

Титрування фагів

 

Утворення бляшок

 

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд пробірок із м’ясо-пептонним бульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг

 

Титрування бактеріофагів за методом Аппельмана

Після цього в них додають по 0,05 мл індикаторних мікроорганізмів. Паралельно готують контрольні пробірки: одну – з культурою бактерій без фага, а другу – з бактеріофагом без мікробів. Посіви інкубують при 37 °С протягом 18-24 год і спостерігають за лізисом мікроорганізмів. Титром бактеріофага вважають найбільше його розведення, яке викликає повний лізис бактерій.

Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, їх можна використовувати для фагоіндикації – визначення виду відповідних бактерій в інфекційному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища.

Для цього у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.

З цією ж метою на щільне живильне середовище газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення бактеріофага, яке вказано на ампулі. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофага. Позитивний результат вказує на належність бактерій до певного виду.

Фаготипування бактерій проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. Цей метод грунтується на використанні специфічної чутливості бактерій до своїх бактеріофагів, яка свідчить про спільне (тотожнє) походження бактерій, що мають однаковий фаготип.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для цього чашку з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують 4 годинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню засіяного газону в кожний квадрат капають піпеткою певні бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють результати за допомогою лупи. Залежно від чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюють за чотири-плюсовою системою: від лізису, який зливається, до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фага є постійною ознакою, порівнюють фаготипи досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігові роблять висновок про виявлене джерело інфекції.

 

Джерела інформації:

А. Основні:

 

1. Дикий І.Л., Холупяк І.Ю., Шевельова Н.Ю. та ін. Мікробіологія Харків, вид-во НФаУ “Оригінал”, 2006 р. – 432 с

2. І. О. Ситник, С. І. Климнюк, М. С. Творко Мікробіологія, вірусологія, імунологія. Тернопіль, “Укрмедкнига”, 2009. –392 с.

3.Микробиология. Руководство к лабораторным занятиям под ред. М. Л. Дикого, Киев, 2004. – 583 с.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник // Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. – 449с.

 

В. Додаткові:

1. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія під ред.. В. П. Широбокова// Вінниця: Нова Книга, 2011.- 952 с.