ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ АНАЛІЗУ. ВСТАНОВЛЕННЯ ТОТОЖНОСТІ БАГАТОКОМПОНЕНТНИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ МЕТОДОМ ТШХ.

 

Теоретичні основи хроматографічних методів.

Хроматографія – це процес, який базується на багатократному повторенні актів сорбції і десорбції речовини при переміщенні її в потоці рухомої фази вздовж нерухомого сорбента.

Речовина рухомої фази неперервно поступає в контакт з новими ділянками сорбента і частково сорбується, а сорбована речовина контактує із свіжими порціями рухомої фази і частково   десорбується.

При постійній температурі адсорбція збільшується із зростанням концентрації розчину або тиску газу. Залежність кількості поглинутої речовини від концентрації розчину або тиску газу при постійній температурі називається ізотермою адсорбції.

а математично ця залежність може бути виражена рівнянням Ленгмюра:

 

 

 

 

де n – кількість адсорбованої речовини при рівновазі;

n_∞ – максимальна кількість речовини, яка може бути адсорбована на даному сорбенті;

b – постійна;

с – концентрація.

В області невеликих концентрацій ізотерма лінійна. Дійсно, при bc << 1 (1+ bc) ® 1, тоді

Це рівняння лінійної адсорбції. Воно відповідає рівнянню Генрі (Г – коефіцієнт Генрі). Ізотерма адсорбції може бути також вгнутою, S – подібною і.т.д., що пов’язано з утворенням полімолекулярних шарів на поверхні сорбента, неоднорідністю поверхні сорбента.

 

Класифікація хроматографічних методів.

Різні методи хроматографії можна класифікувати за агрегатним станом фаз, способу їх відносного переміщення, апаратурному оформленні процесу.

1.                            За фізичною природою нерухомої і рухомої фаз

Рухома фаза	Рідинна	Газова
Нерухома фаза	Тверда (рідинно-адсорбційна)	Тверда газоадсорбційна
	Рідина (рідино-рідинна)	Рідина (розподільча газорідинна)

2.                            В залежності від механізму сорбції

а) молекулярна (взаємодія між нерухомою фазою (сорбентом) і компонентами розділюваної суміші – міжмолекулярні сили типу Ван-дер-Ваальса);

б) хемоморбційна (іонообмінна, осадова, комплексоутворювача або лігандообмінна, ох-red). Причиною сорбції в хемосорбційній хроматографії є відповідні хімічні реакції.

3.                За способом хроматографування:

–                     фронтальна;

–                     проявна (елюентна) – найбільш вживана;

–                     витісняльна.

4.                За технікою виконання:

–                     колонкова (нерухома фаза в колонці);

–                     площинна: а) паперова (нерухома фаза – папір);

                  б) тонкошарова (нерухома фаза – сорбент на скляні, – металеві, полімерній підложці пластинці).

 

Нерухома фаза	Газоподібна	Рідинна
Тверда	Газо–адсорбційна хроматографія	Рідинно-адсорбційна колоночна, тонкошарова, іонообмінна, осадова
Рідина	Розподільча газо-рідинна хроматографія	Розподільна рідино-рідинна хроматографія

 

 

По способу відносного переміщення фаз розрізняють фронтальну, проявну, витісняльну хроматографію

    

Фронтальний метод. Використовують порівняно рідко (при очистці від домішок, або для виділення з суміші найбільш слабо сорбованої речовини).

 

 

 

 

 

 

Проявний (елюентний) метод. Компоненти аналізованої суміші розділяються на зони: речовина, яка краще сорбується займає верхню зону колонки, а та, що гірше сорбується – нижню. Тому, А скоріше виходитиме (вимивається або елююється) з колонки і її пік на хроматограмі є раніше, а та, що сильніше сорбується, виходитиме пізніше.

 

 

 

 

 

 

 

Витісняльний метод. Промивним розчином речовини Д., яка сорбується краще від А,В. Концентрація розчину при хроматографуванні не змінюється, але часто є накладання зони речовини А і зони речовини В, оскільки вони не розділяються розчинником.

В хроматографії найчастіше використовують проявний (елюентний метод), при якому газ або розчин, який виходить з колонки, аналізується неперервно.

Типова вихідна крива (хроматограма) приведена.

 

нульова лінія

висота піку (площа)

ширина піку

час або об’єм утримування t або Vr

 

 

Повнота розділення двох компонентів кількісно може бути виражена критерієм розділення К:

Dl – відстань між максимумами піків розділюваних елементів;

m_0,5(1) і m_0,5(2) – ширина хроматографічного піку 1 і 2 компоненту на половині висоти.

При К = 1 розділення буде достатньо повним.

Якщо піки взаємно перекриваються, то визначення ширини піку кожної речовини є неможлтвою, тоді розглядають ступінь розділення Y:

; h₂ – висота піку з меншою концентрацією речовини;

h_min – висота мінімуму.

 

 

 

 

У хроматографії: якісний аналіз базується на визначенні часу утримування, а кількісний – на визначенні висоти або площі піку.

Відомо декілька теорій хроматографічного процесу. Суттєве значення має метод теоретичних тарілок і кінетична теорія.

Метод Мартіна і Сінджа (теоретинчих тарілок). Колонка скляна і ділиться умовно на ряд елементарних ділянок – тарілок. Рівновага на кожній тарілці сорбент – рухома фаза встановлюється дуже швидко. Кожна нова порція газу – носія викликає зміщення цієї рівноваги, внаслідок чого частина речовини переноситься на наступну тарілку, на якій, в свою чергу, свтановлюється рівновага і відбувається перехід речовини на іншу тарілку. Тому, речовина розподіляється по декількох тарілках, але на середніх тарілках його концентрація виявляється максимальною порівняно з сусідніми тарілками. Розподіл речовинивздовж шару сорбента підчиняється рівнянню:

х – відстань від початку колонки до точки, в якій концентрація рівна С;

х₀ – координата центра смуги;

Н – висота, еквівалентна теоретична тарілка (ВЕТТ)

l – довжина шару сорбента, на якій проведено поглинання і розміщено n теоретичних тарілок, при цьому n = l/Н

ефективність колонки тим вища, чим менша висота ВЕТТ і більше число теоретичних тарілок.

Кінетична теорія хроматографії головну увагу надає кінетиці процесу, зв’язуючи висоту ВЕТТ з процесами дифузії, повільним встановленням рівноваги і нерівномірністю процесу. Висота ВЕТТ зв’язана із швидкістю потоку рівнянням Ван-Деємтера:

де А(вихрова дифузія), В(поздовжня дифузія), С(сорбція-десорбція) – const, a U – швидкість рухомої фази.

Константа А зв’язана з дією вихрової дифузії, яка залежить від розміру частинок, густини або щільності заповнення колонки;

В зв’язана з коефіцієнтом дифузії молекул в рухомій фазі, ця складова враховує поздовжню дифузію;

С характеризує кінетику процесу сорбція – десорбція, масопередачу та інші ефекти.

При невеликій швидкості потоку висота,еквівалентної теоретичної тарілки зменшується, а потім починає зростати. Оскільки ефективність колонки тим вища, чим менша висота ВЕТТ, то оптимальна швидкість рухової фази буде рівна швидкості, яка відповідає точці мінімуму цієї кривої.

Щоб знайти цю точку, продиференціюємо рівняння

H = A + B/U + CU:

 

Тоді  

 

 

 

 

 

Отже, кінетична теорія дає основу для оптимізації хроматографічного процесу.

 

Головні вузли хроматографічного обладнання:

–                               дозатор (відтворюваність розміру проби і постійність умов її введення в колонку).

–                               колонка (1-2-3 м і 50 м; прямі, спіральні, …)

–                               детектор

                        набивні (з адсорбентом)

Колонки

                        капілярні

металеві (сталь, Сu, латуні)

скляні

фтрорпластові

Колонки обов’язково термостатуються!

 

Вимоги до адсорбенту (Al₂O₃, силікагелі, активоване вугілля, пористі капіляри на основі спиролу, дивінібензоу, синтетичні цеоліти ):

1.                            необхідна селективність.

2.                            хімічна інертність до компонентів суміші.

3.                            Доступність.

Детектор призначений для виявлення  змін в складі гау (чи рідини) який пройшов через колонку. Покази детектора перетворюються в електричний сигнал і передаються реєструючому приладу.

Головними характеристиками детектора є:

–                     чутливість

–                     межі детектування

–                     інерційність

–                     діапазон лінійності I = f (c)

диференціальні (відображають миттєву зміну          концентрації), часто застосовуються

Інтегральні (сумують зміну концентрації за цілий проіжок часу), застосовуються не часто

До групи иференціальних детекторів належать:

–                     катарометр (детектор по теплопровідності);

–                     ПИД;

–                     детектор по лектропровідності;

–                     полум’яно-фотометричні та їн. в залежності від:

1.                властивостей системи;

2.                агрегатного стану фаз;

3.                інші причини

 

Газова хроматографія

Рухомою фазою в газовій хроматографії є газ аьо пара. В залежності від стану нерумої фази газова хроматографія поділяється на газоадсорбційну (ГАХ), коли нерухомою фазою є рідина, а точніше плівка рідини на поверхні частинок твердого сорбента.

При проведенні газової хроматографії в нагрітій до певної температури потік газу-носія вводять аналізовану пробу. Компоненти проби випаровуються і разом з потоком газу поступають в термостатовану колонку з нерухомою фазою (адсорбентом). В колонці протікають багатократні процеси адсобції і десорбції на твердому носії або розчинення і виділення в рідуій плівці суміші газоподібних речовин. Роздлення складної суміші тут визначається коефіцієнтами адсорбції або розподілу аналізованих речовин між фазами. На виході з колонки суміш розділяється на індивідуальні речовини, які поступають з потоком газу на детектор.

Як рухома фаза Н₂, Не, N₂. Ar, CO₂. Газ-носій не взаємодіє з розділюваними речовинами і нерухомою фазою. Процес розділення базується на відмінностях в леткості і розчинності (адсорбованості) розділюваних компонентів. Через хроматографічну колонку швидше рухається той компонент, розчинність якого в нерухомій фазі менша, а леткість (пружність парів) при даній температурі t⁰ більша.

Кількісний аналіз можна провести тільки в тому випадку, якщо речовина термостійка, тобто випаровується відтворювано й і вимивається по колонці без розкладу. При розкладі речовини на хроматограмі з’являються несправжні піки, які належать продуктам розкладу.

 

 

 

 

 

 

Схема будь якого газового хроматографа включає:

 

 

 

дозатор      самописець-

           реєстратор сигналу

                                      регулятор току  

                                                                                            колонка                          

                            газ-носій                           термостат       

Детектори

1.     По теплопровідності (катарометр) – універсальний детектор, госій широко використовуваний.

Вимірюєтья опір нагрітої дротини, що поміщена у потік газу.

Температура дротини і її опір змінюються в залежності від концентрації компонентів проби. Які вимиваються з колонки

Калориметр – універсальний, але малочутоивий (10^-2-10^-3%). На чутлмвість калориметра впливає теплопровідність газу-носія, тому необхідно використовувати гази-носії з максимально можливою теплопровідністю (Не,Н₂).

2.     ПІД

3 вивід в атмосферу                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                            4 – збираючий електрод                                                                                                                                                                                                                   4                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          катод                                                                                                                                                                                                                                                                                                         2 Н₂                  6 повітря                                                                                                                       1 з колонки газ-носій                                                 

Газ, який входить з колонки змішується з Н₂ і поступає у форсунку пальника детектора. Іонізовані частинки, які утворюються заповнюють міжелектродний простір, в результаті чого опір знижуються, а струм збільшується. Стабільність і чутливість ПІД  залежить від вибору швидкості потоку всіх використовуваних газів (газ – носій » 30-50 мл/хв; Н2 » 30 мл/хв, повітря » 300 – 500 мл/хв). ПІД реагує практично на всі сполуки, крім Н₂, інертних газів, О₂, N₂, оксидів нітрогену, S, C, а також води. Цей детектор має широку область лінійності (6 – 7 порядків), тому він придатний для визначення “слідів” речовин.

3.     ДЕЗ        

 

 

 

 

 

 

В камері газ – носій опромінюється постійним потоком b-електронів, оскільки це є

В детекторі відбувається реакція вільних електронів з молекулами певних типів з утворенням стабільних аніонів

В іонізованому газі-носії (N₂, He) в якості негативнозаряджених частинок присутні тільки електрони. В присутності сполуки, яка може захоплювати електрони, іонізаційний струм детектора зменшується. Цей детектор дає відклик на сполуки, які містять Hal, P, S, NO₃^–, Pb, O. На більшість вуглеводів він не реагує.

 

 

Кількісний аналіз в газовій хроматографії.

Базується на вимірюванні різних параметрів піку, які залежать від концентрації хроматографованої речовини:

– висоти

– ширини

– площі

– утримуваного об’єма

– добутку утримуваного об’єму на висоту піку.

Метод нормування. Приймають суму всіх параметрів піків (S h, або SS, або S ширин) за 100%. Тоді відношення висоти окремого піку до суми висот або відношення площі одного піку до суми площ, помножене на 100 буде характеризувати W(комп.) (%) в суміші. Зрозуміло, що такий метод передбачає існування однакової залежності величини вимірюваного параметру від концентрації всіх компонентів суміші.

В методі нормування з колібрувальними коефіцієнтами за 100% прийм. сума параметрів піків з врахуванням чутливості детектора. Відмінності в чутливості детектора враховуються за допомогою поправкових коефіцієнтів для кожного компонента. Один з домінуючих компонентів суміші вважають порівняльним і поправковий коефіцієнт для нього приймають рівним одиниці. Калібрувальні (градуювальні) коефіцієнти К_і розраховують за формулою:

К_ст = 1 (приймають)

С_і – концентрація компоненту і в модельній суміші із стандартною речовиною

С_ст – стандартної речовини

П_ст і П_і – параметри піків речовини – стандарту й речовини і.

За 100% приймають суму виправлених параметрів К_іП_і і результат аналізу розраховується так, як і в методі нормування

Перевага: 1) не має потреби точності дозування зразка проби;

                  2) не абсолютна тотожність умов аналізу при повторних визначеннях.

3. Метод абсолютної калібровки (найбільш точний).

Експериментально визначають залежність висоти або площі піку від концентрації речовини і будують градуювальні графіки. Далі визначають ті ж характеристики піків в аналізованій суміші і за градуювальним графіком знаходять концентрацію аналізованої речовини. (Основний метод визначення домішок).

Перевага: не вимагає розділення всіх компонентів проби, а тільки тих, які необхідно визначити.

4. Метод внутрішнього стандарту.

Базується на введенні в аналізовану суміш точно відомої кількості стандартної речовини. В якості стандартної речовини вибирають речовину, близьку за фізико-хімічними властивостями до компонентів суміші, але не обов’язково компонент суміші. Після хроматографування вимірюють параметри піків аналізованого компонента і стандартної речовини. Якщо стандартна речовина не входить в склад аналізованої суміші, W_{компон.} (в %) розраховують по формулі:

Q_i i Q_ст. – параметри піків і речовини і стандарту відповідно;

r – відношення маси внутрішнього стандарту до маси проби.

Перевага: 1) врахування режиму роботи приладу (t°, V_{газу носія}).

                    2) підвищена точність внаслідок незалежності відвідтворюваності.

 

Вимоги до внутрішнього стандарту:

1. Добре розчинний в пробі і хімічно інертний до компонентів аналізованої суміші, нерухомої фази і тв. носія.

2.     Внутрішній стандарт вибирають з числа сполук, близьких до об’єктів аналізу по структурі і леткості.

3.     Внутрішній стандарт в пробі підбирають так, щоб відношення площ піків стандарту і визначуваної речовини було близьке до 1.

4.     Пік внутрішнього стандарту на хроматограмі повинен розміщуватись в безпосередній близькості до піків сполук – об’єктів аналізу, не накладаючись ні на них, ні на піки інших речовин.

5.     Внутрішній стандарт не повинен містити домішок, які накладаються з піками визначуваних речовин-компонентів проби.

6.     Якщо визначають в пробі дві і більше речовин, що значно відрізняються часами утримування, то доцільно використовувати 2 і більше внутрішніх стандарти.

 

Високоефективна рідинна хроматографія.

Рідинна хроматографія – це метод розділення і аналізу складних сумішей, в якому рухомою фазою є рідина. Він застосовується для розділення більш широкого кола речовин, ніж ГХ, оскільки більшість речовин є нелеткими, багато які з них є нестійкими при високих температурах (особливо ВМС) і розкладаються при переведенні в газоподібний стан. В РХ розділення найчастіше відбувається при кімнатній t°.

 

Теоретичні уявлення.

Базується на адсорбції з розчину. Адсорбційна рівновага між розчином і адсорбентом підчиняється рівнянню ізотерми адсорбції Ленгмюра, в області розведених розчинів ізотерма лінійна. Селективність адсорбції залежить від природи сил взаємодії між адсорбованими речовинами і адсорбентом.

Ефективність хроматографічної колонки залежить, головним чином, від процесів дифузії і масопереносу в обох фазах і визначається, як і в газовій хроматографії, висотою еквівалентною теоретичній тарілці (ВЕТТ) Н. З лінійною швидкістю рухомої фази U і деякими іншими величинами ВЕТТ зв’язана рівнянням

H = 2Rr(1 – Rr)Uts,

де

де t_m – середній час між десорбцією і повторною адсорбцією молекули речовини, коли вона рухається із швидкістю рухомої фази U;

t_s – середній час перебування молекули в нерухомій фазі.

Таким чином, з ростом лінійної швидкості руху рухомої фази ВЕТТ зростає і, відповідно, ефективність колонки зменшується.

В класичному варіанті РХ в скляну колонку l = 1-2 м, заповнену сорбентом (розмір частинок ³ 100 мкм), вводять аналізовану пробу і пропускають елюент. Швидкість проходження елюента під дією сили тяжіння мала, а тривалість аналізу велика. Внаслідок використання сорбентів з розміром зерен 10-30 мкм, поверхнево- і об’ємно-пористих сорбентів з розміром частинок 5-10 мкм, насосів, чутливих детекторів відбувся перехід від класичної до ВЕРХ. Швидкий масоперенос при високій ефективності розділення дозволяє використати ВЕРХ для розділення і визначення молекул (адсорбційна і розподільча хроматографія), для розділення і визначення іонів (іонообмінна, іонна, іон-парна хроматографія), для розділенні макромолекул (ексклюзийна або гель-хроматографія). Методами афінної і лігандообмінної хроматографії розділяють БА молекули і оптичні ізомери.

Адсорбційна хроматографія

                                                 

             Нормативно-фазова                        обернено фазова

             хроматографія                                 хроматографія

          – полярний адсорбент                     – неполярний адсорбент

          – неполярна рухома фаза                – полярна рухома фаза.

Вибір рухомої фази завжди важливіший, ніж вибір нерухомої.

Нерухома фаза повинна утримувати розділювані речовини. Рухома фаза, тобто розчинник, повинна забезпечити різну ємкість колонки і ефективне розділення за оптимальний час.

Нерухома фаза – пористі тонкодисперсні матеріали з питомою поверхнею більше 50 м²/г.

 

                            полярні                    неполярні

    SiO₂, Al₂O₃, Me_xO_y, флоросил       графітована сажа, кизельгур,

                            і т.д.                          диатоміт.

           а також з привитими               (Не маютьселективності

           полярними групами                  до полярних молекул).

    (Для розділення неполярних –NH₂

     і малополярних, середньоїполярності речовин).

Вказані сорбенти наносяться на поверхнево-пористі носії.

Рухома фаза. Від неї залежить:

–                   селективність розділення;

–                   ефективність колонки;

–                   швидкість руху хроматограмної смуги.

Вимоги до рухомої фази:

1)                повинна розчиняти аналізовану пробу;

2)                мала в’язкість (Д_диф. компонентів проби достатньо високі);

3)                можливе виділення з неї розділених компонентів;

4)                інертна по відношенню до матеріалів всіх частин хроматографа;

5)                відповідає вимогам вибраного детектора;

6)                            безпечна;

7)                            дешева.

Як було сказано, елююча сила рухомої фази – розчинника впливає на розділення.

Елююча сила розчинника показує, у скільки разів енергія сорбції даного елюєнта більша, ніж енергія сорбції елюента, вибраного в якості стандарту, наприклад, н-гептану. Розчинники (елюенти) ділять на слабкі і сильні.

Слабкі елюенти мало адсорбуються нерухомою фазою, тому Д сорбата високі.

Сильні елюенти сильно адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт розподілу сорбованих речовин (сорбата) низькі.

Наприклад: SiO₂ – нерухома фаза.

Сила розчинників збільшується в ряду:

пентан (0) < CCl₄ (0,11) < C₆H₆ (0,25) < CHCl₃ (0,26) < CH₂Cl₂ (0,32) < ацетон (0,47) < діоксан (0,49) < ацетонітрил (0,5) < етанол < метанол.

В якості міри відносної полярності приймають шкалу Гільдебранда.

Розміщення розчинників у відповідності із зростанням їх елюючої сили називають елюотропним рядом. В рідинній адсорбційній хроматографії елюотропний ряд Снайдера має вигляд: пентан (0) < н-гексан (0,01) < циклогексан (0,04) < CCl₄ (0,18) < бензол (0,32) < CHCl₃ (0,38) < ацетон (0,51), етанол (0,88) <  вода, СН₃СООН  (дуже велика).

Для обернено-фазової хроматографії на С₁₈ елюотропний ряд має вигляд: метанол (1,0) <  ацетонітрил (3,1), етанол (3,1) < ізопропанол (8,3) < н-пропанол (10,1) < діоксан (11,7).

Часто застосовують не окремі розчинники, а їх суміші. Незначні кількості доданих інших розчинників, особливо води, істотно збільшують елюючу силу елюента.

При розділенні багатокомпонентних сумішей одна рухома фаза в якості елюента може не розділити всі компоненти проби за достатньо оптимальний час. Тоді використовують метод ступінчатого або градієнтного елюювання. Для збільшення сили елюента в процесі хроматографування послідовно застосовують все більш сильні елюенти. Це дозволяє елюювати все більш сильно утримувані речовини за менший час.

Існують емпіричні правила, які допомагають при виборі елюента. Сорбція, як правило, зростає з ростом числа подвійних зв’язків і ОН-груп в сполуках. Сорбція зменшується в ряду органічних сполук: кислоти > спирти > альдегіди > кетони > складні ефіри > ненасичені вуглеводні > насичені вуглеводні.

Для розділення речовин різної полярності і для розділення сполук різних класів застосовують нормально-фазову хроматографію: з неполярних рухомих фаз сполуки різних класів виходять з колонки з полярним адсорбентом за різний час (час утримування сполук з різними функціональними групами збільшується при переході від неполярних сполук до слабкополярних). Для дуже полярних молекул t_R дуже великі і аналіз при використанні неполярного елюента неможливий. Для зменшення часу утримування полярних сорбатів переходять до полярних елюентів. В обернено-фазовому варіанті нерухома обернена фаза сильніше адсорбує неполярні компоненти з полярних елюентів, наприклад з води. Знижуючи полярність елюента додаванням менш полярного розчинника (метанол), можна зменшити утримування компонентів.

 

Розподільча хроматографія.

Метод розподільчої, або рідинно-рідинної, хроматографії базується на розподілі речовини між двома фазами, які не змішуються, подібно до багатократної ступінчастої екстракції.

Рідку нерухому фазу наносять на пористий достатньо інертний сорбент, як у газорідинній хроматографії, і і заповнюють ним колонку. При пропусканні рідкої рухомої фази через колонку суміш розділяється на компоненти головним чином за рахунок їх різної розчинності в рідкій нерухомій фазі відповідно до тих самих механізмів, які були у газорідинній хроматографії. За звичай розчинність компонентів проби в нерухомій і рухомій фазах, які володіють різною полярністю, дуже відрізняється. Якщо розчинність проби вища в нерухомій фазі, то час утримування компонентів значно зростає, якщо розчинність вища в рухомій фазі, то час утримування може бути близьким до t_m – часу утримування несорбованого компонента. Щоб досягти розділення, в рухому фазу, насичену нерухомою, включають третій компонент, який знижує відмінності у полярності нерухомої і рухомої фаз. Наприклад, до суміші з неполярного (гексан) і полярного (вода) розчинників додають спирт. Тільки в цьому випадку вдається підібрати оптимальні умови для розділення компонентів суміші.

Звичайно полярний розчинник (вода, спирт) фіксований на твердому носії – силікагелі, діатоміті, целюлозі, Al₂O₃. Рухомою фазою в цьому випадку є неполярні розчинники – ізооктан, бензол і т.д. Такі системи використовують в нормально-фазовій розподільчій хроматографії.

Якщо неполярний розчинник зафіксувати на носії, а в якості рухомої фази використати полярні розчинники (вода, спирт, буферні розчини, сильні кислоти), то такий варіант називають обернено-фазовою розподільчою хроматографією. Нанесені рідкі фази мають великий недолік – вони швидко змиваються рухомою рідкою фазою з поверхні носія, особливо при використанні ВЕРХ. Тому рідкі фази “пришивають” до носія. В якості носіїв нерухомих рідких фаз для нормально-фазової розподільчої хроматографії використовують силікагелі з пришитими нітрильними, амінними та ін. групами. В обернено-фазовому варіанті розподільчої хроматографії використовують силікагелі з привитими алкілсилильними групами від С₂ до С₂₂.

 

Головні вузли рідинного хроматографа:

–                   система подачі рухомої фази (насос, дегазатор, система для створення градієнту концентрації рухомої фази, вимірювачі тиску).

V_рух.ф. = 0,1 – 10 мл/хв  р = до 400 атм.

–                   система введення проби (петля);

–                   колонка в термостаті; (10, 15, 25 см з діаметром 4-5,5 мм) (5-6 см і діаметром 1-2 мм).

–                   детектор;

–                   реєструючий пристрій.

Для неперервного контролю складу елюата, який витікає з колонки, використовують детектори:

–                   диференціальні рефрактометри; (чутл. ~ 10^–6 г, 10^х – 10^х+4);

–                   УФ-детектор (10^–9 г; (10^х – 10^х+5) (254 нм);

–                   фотометри і ДФ;

–                   флуоресцентні (більш чутливі в 100 разів);

–                   кондуктометричний (0,01 мкг/мл – 100 мг/мм).

 

Застосування ВЕРХ:

Адсорбційна:

–                   вуглеводні;

–                   поліциклічні вуглеводні;

–                   пластифікатори;

Розподільча:

–                   пластифікатори;

–                   вуглеводні;

–                   пестициди;

–                   ароматичні вуглеводні і кислоти;

–                   стероїди;

Іонообмінна:

–                   амінокислоти;

–                   наркотичні і болетамувальні засоби;

–                   фторовані вуглеводні ;

–                   компоненти масел (вазелінового).

 

Застосування хроматографічного методу доцільно тому, що при цьому відбувається безперервне збагачення, що викликано наступними причинами.

Застосування хроматографічних методів для попереднього розділення сумішей, що містять органічні пероксидні сполуки, і для прямого визначення останніх безумовно зменшує ускладнення, що виникають за рахунок близькості властивостей компонентів.

Застосування хроматографічних методів (паперова, тонкошарова,газорідинна і рідинна хроматографія високого тиску), що відрізняються високою ефективністю поділу і надійністю ідентифікації, як і в інших областях структурного аналізу, наприклад протеїнів, полісахаридів і ліпідів[1], Зазвичай дає дуже хороші результати. Хроматографічні методи визначення продуктів хімічної деструкції барвників дозволяють мати справу з мікро – або навіть ультрамікроб кількостями аналізованих сполук і значно спрощують і прискорюють всю експериментальну роботу. Успішний результат аналізу залежить від наступних факторів.

Застосування хроматографічних методів при елюіроваванні з метою витіснення менш міцно утримуваних іонів.

Застосування хроматографічного методу розділення хоча і не дозволяє (з причин, викладених вище) виділити в чистому вигляді сірчисті сполуки, все ж дає можливість отримати концентрати сірчистих з’єднань і тим самим вивчити їх властивості хоча б у загальному вигляді, що у багатьох випадках буває важливим. Сходу на активного окису алюмінію і деяких інших адсорбентах і дослідженню цих концентратів присвячені роботи С.

Застосування хроматографічних методів адсорбції з метою витіснення менш міцно утримуваних іонів.

Головним напрямком застосування хроматографічного методу було і залишається поділ складних сумішей речовин, елементів на компоненти.

Головним напрямком застосування хроматографічного методу було і залишається поділ складних сумішей органічних і неорганічних речовин.

Таким чином, застосування хроматографічних методів особливо перспектив не кінетичних методах аналізу, так як це збільшує їх селективність.

 

Взагалі кажучи, застосування хроматографічного методу не обмежується лише поділом й аналізом суміші речовин. Останнім часом хроматографія широко використовується і як метод.

Враховуючи, що застосування хроматографічного методу виявляється доцільним лише в тих випадках, в яких аналіз або отримання чистого препарату не можуть бути здійснені більш швидкими методами, корисно було б у ряді випадків спробувати обгрунтувати необхідність використання хроматографічного методу. У цих цілях на початку опису робіт по хроматографічного розділення сумішей елементів кожної групи наведені гранично короткі дані про хімічні властивості та методи визначення елементів з тим, щоб в якійсь мірі пояснити, наприклад, причини розходження в числі робіт з розділення елементів тієї чи іншої підгрупи. У межах прийнятого вибору матеріалу в статті по можливості наводяться дані по застосуванню іонообмінної хроматографії для аналізу руд і мінералів, силікатів,сплавів та ін.

У книзі описано застосування основних хроматографічних методів (газової, рідинної колонкової, паперової, тонкошарової та іонообмінної хроматографії) для аналізу чотирьох складових навколишнього середовища: повітря, води, грунту та скидів.

Таким чином, тільки застосування хроматографічного методу розділення на папері дозволяє точно встановити зміст келліна в препараті Авісан і в рослинній сировині.

Схема хроматермографа ХТ-2М. В даний час область застосування хроматографічних методів все більше розширюється. Внаслідок їх ефективності та високої чутливості вони єодними з найбільш перспективних методів для контролю ступеня чистоти газів.

Таким чином, практика застосування адсорбційно-комплексообра-зовательного хроматографічного методу показує, що з усіх можливих варіантів використання комплексоутворюючих речовин для розділення сумішей даний метод представляє найбільші можливості через різноманіття створення селективних колон і здійснення найрізноманітніших завдань, пов’язаних з поділом сумішей. Само собою зрозуміло, що метод не обмежиться рамкамирозділення сумішей речовин неорганічної природи; безумовно, він знайде широке застосування і в органічній хімії.

Як було зазначено у вступі, застосування хроматографічного методу до аналізу в гомологічних рядах викликано головним чином двома причинами. По-перше, проблема аналізу таких рядів являє собою дуже важкий приклад адсорбційного аналізу, по-друге, будь-який інший метод аналізу таких сумішей відсутня. Можна сказати без перебільшення, що немає навіть хорошого методу якісного аналізу в гомологічних рядах, особливо в тому випадку, коли кількості речовин малі і не можна провести фракційну розгонку в високоефективних колонках. Крім того, розгонка не може бути застосована для з’єднань, що розкладаються при нагріванні або утворюють Азеотропна суміші.

У практиці аналізу залишків пестицидів із застосуванням хроматографічних методів найчастіше визначають кілька пестицидів, часто не знаючи, якими з них забруднена проба.

Це,природно, було підготовлено застосуванням високоавтоматизованих хроматографічних методів у газовій і колоночної рідинної хроматографії.

Зміна форми піків при збільшенні розміру введеної проби. Ця залежність визначає ті чи інші можливості застосування даного хроматографічного методу в аналізі.

В даний час практично жодне кінетичне дослідження не обходиться без застосування хроматографічних методів, особливо широке поширення набула газо-рідинна хроматографія, що володіє високою чутливістю і великою універсальністю. Все більше впроваджуються в кінетичні дослідження різні варіанти термографічних і калориметричних методів, які практично незамінні при дослідженні реакцій у твердій фазі і при низьких температурах.

Враховуючи наближеність нашої оцінки, треба все ж вважати, що застосування звичайних хроматографічних методів для визначення теплот адсорбції на неоднорідних поверхнях слід робити з великою обережністю.

 

При дослідженні швидкості утворення метанолу на цинк-хромовому каталізаторі при атмосферному тиску із застосуванням високочутливого хроматографічного методу аналіза21отримана залежність (4), близька до запропонованої Тьомкіна-Чередні – ченко.

Хроматографічне розділення радіоактивних цирконію та ніобію на аніони еспатіт – ТМ при висоті колонки. Правда, у випадку освіти по процесу, що належить до першої групи, застосування хроматографічного методу обмежено. Метод хроматографії часто застосовується в поєднанні з іншими методами.

У даному розділі описуються хімічні та фізико-хімічні методи аналізу алюмінієвих і магнієвих сплавів із застосуванням хроматографічного методу поділу елементів.

Освіта азометинових барвників при цьому зазвичай супроводжується побічними процесами, чисті речовини вдалося виділити лише із застосуванням хроматографічного методу з подальшою екстракцією і перекристалізацією.

Можна без перебільшення сказати, що сучасна хімія, і в першу чергу хімія природних сполук, зобов’язана своїми досягненнями насамперед застосуванню хроматографічних методів розділення. Однак хроматографія полімерів являє собою специфічну область,розвиток якої пов’язане з певними труднощами. З одного боку, навіть молекули однорідного полімеру, що розрізняються молекулярною вагою, можуть володіти різною хроматографії-чеський рухливістю. З іншого боку, відмінність в розчинності або здатності сорбуватися на застосованому носії між різними полімерами може бути недостатнім для хроматографічного розділення, яке ускладнюється ще більше схильністю поділюваних речовин до міжмолекулярної асоціації та утворення колоїдних розчинів.

Застосування термічного чинника дуже розширює можливості хроматографії, по не слід вважати, що при цьому відпадає необхідність у виборі адсорбенту і правильному підборі інших параметрів досвіду; додавання цього фактора до решти відкриває нові вельми корисні для практики можливості застосування хроматографічного методу.

Завдання поділу проби на окремі компоненти є однією з центральних, бо, як правило, аналізовані проби являють собою багатокомпонентні суміші. Тому застосування хроматографічних методів для аналізу навколишнього середовища представляє великий практичний інтерес. Труни – перша у світовій літературі монографія, спеціально присвячена хроматографії цього методу аналізу навколишнього середовища. Перевагою її є широта охоплення об’єктів аналізу і використовуваних методів. У книзі описані основні хроматографічні методи, застосовувані для аналіз повітря, вод і грунтів на вміст різноманітних забруднювачів: стовпчик хроматографія (в тому числі і іонообмінна), рідинна тонкошарова хроматографія, рідинна паперова хроматографія, газова колонкової хроматографії. Тому, провівши порівняння різних хроматографічних методів аналізу, книга дозволяє вибрати оптимальний. Це, можливо, найбільш важливе, але не єдине переваг у настільки широкої за тематикою книги. Слід зазначити також практичний характер книги, яка містить велику кількість різних методик.

У хроматографії різноманітність вирішуваних завдань забезпечується практично необмеженим вибором нерухомих фаз, що дозволяє підбирати природу утримуючого поля максимально відповідною параметрам, що відрізняє макромолекули полідисперсного речовини один від одного. Навіть напівемпіричних застосування хроматографічних методів призвело до настільки відчутним практичним результатам, що безперервно зменшується число дослідників, які скептично ставляться до хроматографії як до строгого фізико-хімічному методу аналізу полімерів.

Газохроматографічний елементний аналіз але порівняно з класичним ваговим методом характеризується в деяких випадках меншою точністю; проте він цілком придатний для швидкого вирішення багатьох наукових і технічних завдань. При застосуванні хроматографічних методів в елементному аналізі різко підвищується продуктивність і з’являється можливість створення відносно простих автоматичних та напівавтоматичних аналітичних приладів.

 

Неаналітичних застосуванню газо-рідинної хроматографії присвячено низку монографій та оглядів. Тут розглянемо лише деякі застосування хроматографічного методу.

У цій главі дана коротка теорія хроматографії в цілому, а також обговорено різні методи аналізу і застосування, вже розроблені в цій швидко розвивається області. В кінці глави описано застосування хроматографічних методів до приватних питань аналізу високополімерних матеріалів що утворюються з них продуктів.

Можливі бінарні комбінації фаз у хромато-розподільчому методі. Слід зазначити деяку аналогію між розподілом і хроматографією: якісною характеристикою в обох методах служить коефіцієнт розподілу. Використання розподілу разом з хроматографією володіє і рядом переваг перед застосуванням тільки хроматографічних методів.

Створення приладів контролю якості в більшості випадків знаходиться ще в стадії випробування дослідних зразків і партій, вибору найбільш раціональних конструкцій і методів використання. Нижче будуть коротко викладені деякі питання, пов’язані із застосуванням приладів, заснованих на вимірі діелектричної проникності та застосуванні хроматографічних методів.

Хроматографія в чому подібна іншим фізико-хімічним методам поділу. Подібно до того, як в процесі перегонки використовується різниця температур кипіння, а при екстракції різниця в розчинності поділюваних речовин, так застосування хроматографічного методу грунтується на різній здатності поділюваних речовин адсорбуватися на поверхні твердого адсорбенту. Наприклад, струшування розчину суміші, що складається з А – краще адсорбується компонента і В – гірше адсорбується компонента, з відповідним чином подрібненим адсорбентом призводить до їх часткового поділу. Адсорбована суміш порівняно з початковим розчином виявляється багатшою компонентом А, а що залишається рідина – біднішими цим компонентом. Повторюючи цю операцію як з відокремленої від адсорбенту рідиною, так і з вимиває з адсорбенту сумішшю компонентів, у результаті отримують чисті компоненти А і В.

Хроматографія в чому подібна іншим фізико-хімічним методам поділу. Подібно до того, як в процесі перегонки використовується різниця температур кипіння, а при екстракції різниця в розчин поділюваних речовин, так застосування хроматографічного методу оснований на різній здатності поділюваних речовин адсорбуєтьсяватися на поверхні твердого адсорбенту. Наприклад, розчину суміші, що складається з А-краще адсорбується компонента і В-гірше адсорбується компонента, з відповідним образо подрібненим адсорбентом призводить до їх часткового поділу. Адсорбована суміш порівняно з початковим розчином надаєте. А, а що залишається рідина-бідніше цим компонентом Повторюючи цю операцію кілька разів як з відокремленої від адсорбент рідиною, так і з вимиває з адсорбенту сумішшю компонентів, у результаті отримують чисті компоненти А і В.

 

Історія питання

   Хроматографічний метод аналізу розроблений російським ботаніком М. С. Кольором в 1903 р. З допомогою цього методу йому вдалося розділити хлорофіл на складові забарвлені речовини. При пропущенні екстракту хлорофілу через колонку, заповнену порошком крейди, і промиванні петролейним ефіром він отримав кілька забарвлених зон і назвав ці зони хроматограмою (від грецького “хроматос” – колір), а метод – хроматографією. Н. А. Ізмайлов та М. С. Шрайбер у 1938 р. розробили новий вид хроматографії, що отримав назву тонкошарової. Ними були розділені алкалоїди, екстраговані з лікарських рослин на оксиді алюмінію, нанесеному на скло.

 Відправною точкою бурхливого розвитку багатьох методів хроматографічного аналізу є робота лауреатів Нобелівської премії A. Мартіна і Р. Сінджа, ними був запропонований і розроблений метод розподільної хроматографії (1941р.). У 1952 р. А. Мартіном і Л. Джеймсом були отримані перші результати в області газорідинної хроматографії. Ці роботи викликали величезне число досліджень, спрямованих на розвиток методу газової хроматографії.

 За короткий час були вдосконалені конструкції систем введення проб, створені чутливі детектори. Метод газової хроматографії – перший з хроматографічних методів, які отримали інструментальне забезпечення. Починаючи з 70-х років відбувається бурхливий розвиток рідинної хроматографії. До теперішнього часу розроблені теорія хроматографічного процесу і безліч хроматографічних методів аналізу.

 Серед різноманітних методів аналізу хроматографія відрізняється найвищим ступенем інформативності завдяки одночасній реалізації функцій поділу, ідентифікації та визначення. Крім того, метод використовується і для концентрування. Хроматографічний метод аналізу універсальний і застосовний до різноманітних об’єктів дослідження (нафта, лікарські препарати, речовини рослинного і тваринного походження, біологічні рідини, харчові продукти та ін.) Хроматографія відрізняється високою вибірковістю і низькою межею виявлення. Ефективність методу підвищується при його поєднанні з іншими методами аналізу, автоматизацією і комп’ютеризацією процесу поділу, виявлення та кількісного визначення.

 

Класифікація методів хроматографії

   Різні методи хроматографії можна класифікувати за агрегатним станом фаз, механізму поділу, апаратурному оформлення процесу (за формою) і за способом переміщення рухомої фази і хроматографуючої суміші.

За агрегатним станом фаз розрізняють  рідинну і газову хроматографію.

 Поділ речовин протікає по різному механізму, в залежності від природи сорбенту і речовин аналізованої суміші.

По механізму взаємодії речовини та сорбенту розрізняють сорбційні методи, засновані на законах розподілу (адсорбційна, розподільча, іонообмінна хроматографія та ін), гель-фільтрація (проникаюча хроматографія), засновані на відмінності в розмірах молекул поділюваних речовин. На практиці часто реалізуються одночасно кілька механізмів поділу.

За технікою виконання хроматографію підрозділяють на стовпчик, коли поділ речовин проводиться у спеціальних колонках, і площинну: тонкошарову і паперову. У тонкошарової хроматографії поділ проводиться в тонкому шарі сорбенту, у паперовій – на спеціальному папері.

 Відповідно до режиму введення проби в хроматографічну систему розрізняють  фронтальну, елюентную і витіснювальний хроматографію. Якщо розчинену суміш безперервно вводити в хроматографічну колонку, то в чистому вигляді можна виділити тільки одне, найбільш слабко сорбуються речовина. Всі інші вийдуть з колонки у вигляді суміші. Цей метод називають фронтальним. У елюентном режимі через колонку пропускають рухливу фазу (елюент), вводять пробу, потім знову пропускають рухливу фазу (ПФ). У процесі руху по колонці компоненти суміші поділяються на зони. Ці зони по черзі виходять з колонки, розділені зонами чистого розчинника.

У витіснювальний методі після введення проби і попереднього поділу слабоактивних елюентом складу елюента змінюється таким чином, що він взаємодіє з нерухомою фазою (НФ) кожного з компонентів аналізованої суміші. Внаслідок цього новий елюент витісняє компоненти, які виходять з колонки в порядку зростання взаємодії з НФ. У цьому методі не досягається досить повне розділення через часткове перекривання зон.

 Найбільшого поширення набув елюентний режим хроматографування, що дозволяє отримувати в чистому вигляді всі компоненти проби.

 У рідинної хроматографії застосовують ізократіческій і градієнтний режим подачі елюента. У ізократіческом режимі складу елюента протягом аналізу не змінюється, а в градієнтному режимі складу елюента змінюється за певною програмою.

 Розглянемо особливості окремих найбільш широко застосовуваних видів хроматографії.

Рідинно-адсорбційна хроматографія на колонці

 Поділ суміші речовин в адсорбційної колонці відбувається в результаті відмінності їх у сорбуємість на даному адсорбент (відповідно до закону адсорбційного заміщення, встановленого М. С. Кольором).

 Адсорбентами є пористі тіла з сильно розвиненою внутрішньою поверхнею, що утримують рідини за допомогою міжмолекулярних і поверхневих явищ. Це можуть бути полярні й неполярні неорганічні і органічні сполуки. До полярним адсорбенту відносяться силікагель, оксид алюмінію, карбонат кальцію, целюлоза, крохмаль і ін.. Неполярні сорбенти – активоване вугілля, порошок гуми і безліч інших, отриманих синтетичним шляхом.

 До адсорбенту висувають такі вимоги:

 – Вони не повинні вступати в хімічні реакції з рухомою фазою і розділяються речовинами;

 – Повинні мати механічну міцність;

 – Зерна адсорбенту повинні бути однаковою мірою дисперсності.

 При виборі умов для хроматографічного процесу враховують властивості адсорбенту і адсорбованих речовин.

 У класичному варіанті рідинної колонкової хроматографії (ЖКГ) через хроматографічну колонку, що представляє собою скляну трубку діаметром 0,5 – 5 см і довжиною 20 – 100 см, заповнену сорбентом (НФ), пропускають елюент (ПФ). Елюент рухається під дією сили тяжіння. Швидкість його руху можна регулювати наявними внизу колонки краном. Аналізуючу суміш поміщають у верхню частину колонки. У міру просування проби по колонці відбувається поділ компонентів. Через певні проміжки часу відбирають фракції виділився з колонки елюента, який аналізують будь-яким методом, що дозволяє вимірювати концентрації визначених речовин.

 Колоночна адсорбційна хроматографія в даний час застосовується, головним чином не як самостійний метод аналізу, а як спосіб попереднього (іноді і кінцевого) розділення складних сумішей на більш прості, тобто для підготовки до аналізу іншими методами (у тому числі і хроматографічними). Наприклад, на колонці з окисом алюмінію поділяють суміш токоферолів, пропускають елюент і збирають фракцію a-токоферолу для подальшого визначення фотометричним методом.

 

Високоефективна рідинна хроматографія

 Хроматографічне розділення суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективної рідинної хроматографією (ВЖХ)

 Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинної колонкової хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малої, так з великою молекулярною масою.

 Залежно від типу застосовуваного сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюента (варіант прямого фази) і на неполярних сорбенті з використанням полярного елюента – так звана обернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).

 При переході елюента до елюент рівновагу в умовах ОфВЖХ встановлюється у багато разів швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними і водно-спиртовими елюентом, ОфВЖХ отримала в даний час велику популярність. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.

Апаратура для ВЖХ

 Комплект сучасного обладнання для ВЖХ, як правило, складається з двох насосів 3, 4, керованих мікропроцесором 5, і по дають елюент за певною програмою. Насоси створюють тиск до 40 МПа. Проба вводиться через спеціальний пристрій (інжектор) 7 безпосередньо в потік елюента. Після проходження через хроматографічну колонки 8 речовини детектируются високочутливим проточним детектором 9, сигнал якого реєструється і обробляється мікро-ЕОМ 11. При необхідності, в момент виходу піку автоматично відбираються фракції.

Колонки для ВЖХ виконують з нержавіючої сталі з внутрішнім діаметром 2-6 мм і довжиною 10-25 см. Колонки заповнюють сорбентом (НФ). Як НФ використовуються силікагель, оксид алюмінію або модифіковані сорбенти. Модифікують зазвичай силікагель, впроваджуючи хімічним шляхом в його поверхню різні функціональні групи.

Детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента проводиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміна будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази і пов’язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинної хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світопоглинання або світлопропускання виходить розчину (фотометричні та флуоріметрічні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал і електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін

 Безперервно сигнал реєструється самописцем.  Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піка на хроматограмі використовують для цілей ідентифікації речовини, висоту або площа піка – для цілей кількісного визначення.

 

Якісний аналіз

Найважливіші характеристики хроматограми – час утримування t r  і пов’язаний з нею утримуваний об’єм – відбивають природу речовин, їх здатність до сорбції на матеріалі нерухомої фази і, отже, при сталості умов хроматографування є засобом ідентифікації речовини. Для даної колонки з певними швидкістю потоку і температурою час утримування кожного з’єднання постійно (рис), де t R (a) – час утримування компонента А аналізованої суміші з моменту введення в колонку до появи на виході з колонки максимуму піку, t R (BC) – час утримування внутрішнього стандарту (спочатку відсутнє в аналізованій суміші речовина), h – висота піку (мм), a 1 / 2 – ширина піку на половині його висоти, мм.

 Для ідентифікації речовини за хроматограмі зазвичай використовують стандартні зразки або чисті речовини. Порівнюють час утримування невідомого компонента t Rx з часом утримування t RCT відомих речовин. Але більш надійна ідентифікація з вимірювання відносного часу утримування

При цьому в колонку спочатку вводять відома речовина (внутрішній стандарт) і вимірюють час його утримування t R (BC), потім хроматографічно поділяють (хроматографіруют) досліджувану суміш, в яку заздалегідь додають внутрішній стандарт. Відносний час утримування визначають за формулою.

Кількісний аналіз

 В основі цього аналізу лежить залежність висоти піку h або його площі S від кількості речовини. Для вузьких піків краще вимір h, для широких розмитих – S. Площа піку вимірюють різними способами: множенням висоти піка (h) на його ширину (а 1 / 2), виміряну на половині його висоти; за допомогою інтегратора. Електричними або електронними інтеграторами постачені сучасні хроматографи.

 Для визначення вмісту речовин у пробі використовують в основному три методи: метод абсолютної градуювання, метод внутрішньої нормалізації і метод внутрішнього стандарту.

Метод абсолютної градуювання заснований на попередньому визначенні залежності між кількістю введеного речовини і площею або висотою піка на хроматограмі. У хроматограму вводять певну кількість градуювальної суміші і визначають площі або висота отриманих піків. Будують графік залежності площі або висоти піку від кількості введеної речовини. Аналізують досліджуваний зразок, вимірюють площу або висоту піка визначається компонента і на підставі градуювального графіка розраховують його кількість.

Метод внутрішньої нормалізації заснований на приведенні до 100% суми площ всіх піків на хроматограмі. 

 Цей метод дає інформацію тільки про відносне змісті компонента в суміші, але не дозволяє визначити його абсолютну величину.

Метод внутрішнього стандарту заснований на порівнянні обраного параметра піка аналізованого речовини з тим же параметром стандартного речовини, введеного в пробу у відомій кількості. У досліджувану пробу вводять певну кількість такого стандартного речовини, пік якого досить добре відділяється від піків компонентів досліджуваної суміші.

  В останніх двох методах потрібне введення поправочних коефіцієнтів, які характеризують чутливість використовуваних детекторів до аналізованих речовин. Для різних типів детекторів і різних речовин коефіцієнт чутливості визначається експериментально.

 У рідинної адсорбційної хроматографії використовується також аналіз фракцій розчинів, зібраних в момент виходу речовини з колонки. Аналіз може бути проведений різними фізико-хімічними методами.

 Рідинну адсорбційну хроматографію застосовують в першу чергу для поділу органічних речовин. Цим методом вельми успішно вивчають склад нафти, вуглеводнів, ефективно розділяють – транс-і цис-ізомери, алкалоїди та ін За допомогою ВЖХ можна визначати барвники, органічні кислоти, амінокислоти, цукру, домішки пестицидів і гербіцидів, лікарських речовин та інших забруднювачів у харчових продуктах.

Іонообмінна хроматографія

Іонообмінна хроматографія (ІХ) є різновидом рідинної хроматографії і в апаратурному оформленні нічим не відрізняється від інших видів рідинної колонкової хроматографії. В основі іонообмінної хроматографії лежить процес обміну між іонами аналізованого розчину (ПФ) і рухливими іонами того ж знака іонообмінника (НФ).

 Як іонообмінників або іонітів зазвичай використовують синтетичні полімерні речовини, звані іонообмінними смолами. Вони складаються з матриці (R) і активних груп, що містять рухливі іони. У залежності від знаку обмінюваних іонів розрізняють катіоніти і аніоніти. Катіоніти містять кислотні групи різної сили, такі як сульфогрупи, карбоксильні, оксіфенільние. Аніоніти мають у своєму складі основні групи, наприклад аліфатичні або ароматичні аміногрупи різного ступеня заміщення (аж до четвертинних).

 Іоніти можуть перебувати в Н-формі та ОН – формі, а також у сольовий формі. В Н-формі катіоніти і ОН-формі аніоніти містять здатні до обміну іони водню та гідроксилу відповідно, у сольових формах іони водню замінені катіонами металу, аніони гідроксилу – аніонами кислот.

 Залежно від сили кислотних і основних груп у іонітах розрізняють сильнокислотного (R-SOзН) і слабокислотні (R-СООН) катіоніти; сильноосновними (RN (СНз) зон) і слабоосновние (R-NНзОН).

 Сильнокислотного і сильноосновними іоніти здатні до іонного обміну в широкому діапазоні рН.

 Процес іонного обміну протікає стехіометрічно. Наприклад:

R-SO 3 H + Na + = RSO 3 Na + H +

R (NНз) зон + Сl – = R (NНз) зСl + ОН –

 Це іонообмінне рівновагу характеризується константою іонного обміну:

[H +] [RSO 3 Na] [OH -] [RN (CH 3) 3 Cl

K H + / Na +=______________; K OH – / Cl – = _________________

[Na +] [RSO 3 H] [Cl -] [RN (CN 3) 3 OH]

 На підставі констант іонного обміну побудовані ряди спорідненості іонів до даного іоніту, що дозволяють передбачати можливості іонообмінних розділень.

 У залежності від спорідненості до фіксованих іонів нерухомої фази колективні іони переміщуються вздовж хроматографічної колонки з різними швидкостями; чим вище спорідненість, тим більше обсяг утримування компонента. При поділі органічних кислот і підстав важливу роль грає ступінь їхньої дисоціації.

 Для двох речовин, що мають різні константи обміні, розраховують фактор поділу або коефіцієнт розподілу, який характеризує селективність іоніти

 Наприклад, константи іонного обміну солей заліза (III) і кобальту (II) на сильнокислотного катионит марки КУ-2 становлять 3726 і 286 відповідно.

Таким чином, можна зробити висновок, що катионит КУ-2 більш селективен до іонів заліза (III).

 Важливою кількісною характеристикою іонітів є їх обмінна ємність. Повна обмінна ємність визначається кількістю еквівалентів іонів, обмінюваних одним грамом сухого іоніту. Чим більше обмінна ємність, тим більшу пробу можна ввести в колонку з іонітом.

 При підготовці іонітів до роботи їх переводять у відповідну форму. Так, для перекладу катіоніту в Н-форму через колонку з набряклим іонітом пропускають розчин сильної кислоти, надлишок якої відмивають водою. Потім повільно пропускають розчин суміші іонів. Кожен катіон затримується на іоніте згідно зі своєю сорбуємість. Далі пропускають відповідний елюент. Наприклад, катіони лужних металів легко елюіруются 0,1 М HCl. При цьому іони водню обмінюються на сорбовані катіони, які разом з розчином виходять з колонки у відповідності з константами іонного обміну. На виході з колонки фракції збирають в окремі судини і визначають зміст будь-яким підходящим методом.

 Іоніти застосовуються для деионизации (знесолення) води, очищення цукрових сиропів від мінеральних солей; в препаративної хімії – для концентрування розчинів; для визначення іонів заліза (III), міді і свинцю у вині, кальцію і магнію в молоці; різних металів в біологічних рідинах. Крім того, іонний обмін використовують для перекладу іонів у форму, зручну для кількісного визначення. Наприклад, кухонну сіль в розсолі можна визначити, пропустивши пробу через колонку з катионитом, і виділилася в еквівалентній кількості кислоту відтитрувати лугом:

R-SOзН + NaCI = R – SO з Na + НСl.

 Іонообмінну хроматографію застосовують для розділення фенолів, карбонових кислот, аміноцукрів, пуринових, піримідинових та інших підстав. Часто іоніти використовують для попереднього розділення складних сумішей на менш складні. На іонному обміні засновано отримання іонітні молока для дитячого харчування. Іонний обмін використовують для очищення натуральних соків від іонів важких металів. Іонообмінні смоли застосовують для отримання іонообмінних мембран.

 

Тонкошарова хроматографія

   Тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з найбільш простих і ефективних експрес-методів розділення і аналізу речовин у харчових продуктах, біологічних рідинах і інших об’єктах, що не вимагають складного устаткування. У той же час метод має високу вибірковість і чутливістю (низькою межею виявлення). Цим методом можна визначити 10-20 мкг речовини з точністю до 5-7%.

 У залежності від природи НФ тонкошарова хроматографія може бути адсорбційної і розподільної. Найбільш широко застосовується в ТШХ перший варіант поділу.

 Нерухома тверда фаза (оксид алюмінію, силікагель і ін) тонким шаром наноситься на скляну, металеву (алюмінієва фольга) або пластмасову пластинку, закріплюється шар за допомогою крохмалю або гіпсу (іноді використовують платівки з незакріпленим шаром). Для хроматографування можуть використовуватися готові пластинки, що випускаються промисловістю, розміром 5х15 або 20х20 см.

 На відстані 2 см від краю пластинки на стартову лінію за допомогою мікропіпетки або микрошприца наносять проби аналізованого розчину (діаметр плям 3-5 мм). Після випаровування розчинника край платівки поміщають в скляну камеру, на дно якої налитий розчинник (ПФ) в кількості, достатній для утворення шару глибиною 0,5 см. Камеру закривають кришкою.

 Вибір розчинника (ПФ) залежить від природи сорбенту і властивостей аналізованих сполук. Наприклад, поділ хлорорганічних пестицидів на платівці з силікагелем проводять у середовищі гексану. Часто застосовують суміші розчинників з двох або трьох компонентів. Так, при хроматографування амінокислот використовують суміш Н-бутанолу з оцтовою кислотою і водою, при аналізі неорганічних іонів – водні буферні розчини, що створюють постійне значення рН.

 При хроматографування розчинник рухається знизу вгору (висхідний варіант) вздовж шару сорбенту і з різною швидкістю переносить компоненти суміші, що призводить до їх просторового розділення. Після закінчення хроматографічного процесу платівку виймають з камери, відзначають лінію фронту розчинника (зазвичай близько 10 см) і висушують.

 Якщо компоненти суміші пофарбовані, то вони чітко видно на пластині після поділу. Нефарбовані з’єднання виявляють різними способами. Якщо пластину помістити в камеру з парами йоду, то чітко проявляються коричневі плями для органічних сполук з неграничними зв’язками. Хроматограму можна проявити, обприскуючи її будь-яким реагентом, що дає з компонентами проби забарвлені сполуки. До складу нанесеного шару в готові пластини часто вводять люмінофор. При опроміненні такої пластини ультрафіолетовим (УФ) світлом вона флуоресціює, а розділені компоненти проби видно у вигляді темних плям. Речовини, що мають власну флуоресценцію, також виявляють в УФ – світлі (наприклад, пестициди).

 Ідентифікацію речовин на хроматограмі здійснюють за характером забарвлення плям, параметру утримування R f і за допомогою стандартних речовин (свідків).

При стандартних умовах величина R f є постійною величиною, характерною для даного з’єднання. Але практика показує, наскільки важко створювати сталість всіх факторів, від яких залежить відтворюваність значень R f. На величину R f впливає якість і активність сорбенту, його вологість, товщина шару, якість розчинників та інші фактори, не завжди піддаються достатньому контролю.

Тому поряд з величиною R f ідентифікацію проводять по “свідка”.  Стандартне речовина (свідок), наявність якого припускають в аналізованій суміші, наносять на лінію стандарту поруч з досліджуваної пробій. Таким чином, стандартне речовина хроматографується в тих же умовах. Після хроматографування і детекції плям порівнюють величини R f визначається речовини і “свідка”.

Якісний аналіз після поділу компонентів суміші методом ТШХ часто використовують для визначення складу харчових продуктів. Так, на рис. 3.3.2 представлена ​​хроматограмма жиру, виділеного з м’ясного фаршу різного складу. Хроматографування проводили на пластинках з силікагелем в системі гександіетіловий ефір (у співвідношенні 3:1), плями детектувала 10% розчином фосфорно-молібденової кислоти, ідентифікували за блакитному кольору зон на жовтому фоні платівки. Як видно з хроматограми, за даних умов відбулося розділення фосфоліпідів і тригліцеридів. За характерному складу компонентів м’яса та печінки можна зробити висновок про натуральність м’ясного фаршу в пробах 1-2, і добавках до нього печінки в пробах 3-5.

 Кількісне визначення в ТХС може бути проведене безпосередньо на платівці, йди після видалення речовин з платівки. При безпосередньому визначенні на платівці вимірюють тим чи іншим способом площа плями (наприклад, за допомогою міліметрової кальки) і за заздалегідь побудованому градуювальним графіком знаходять кількість речовини. Залежність між масою речовини q і площею S на хроматограмі носить нелінійний характер і є логарифмічною:

S = a lg q + в,

 де а і в емпіричні константи. Ця залежність лінійна для кількостей речовини від 1 до 80-100 мкг.

Для побудови градуювального графіка на пластинку наносять розчини, що містять різні кількості стандартного речовини, хроматографіруют, виявляють зони і вимірюють їх площі (рис. 3.3.3).

 Більш точний денситометрических метод визначення речовин на хроматограмі (помилка – 1-2%). У методі денситометрії проводять вимірювання оптичного поглинання виявленої хроматограми скануючим променем у минаючому чи відбитому світлі на спеціальних приладах-денситометрах.

Тонкошарова хроматографія знаходить застосування при дослідженні деяких видів харчових продуктів на безпеку. Наприклад, для визначення токсинів (афлатоксинів, мікотоксинів, патуліну та ін) в арахісі, у зернових, овочах, фруктах, напоях; для визначення пестицидів (ДДТ та ін) в рослинних і тваринних продуктах, визначення гістаміну як показника псування риби. Крім того, ТШХ часто поєднують з газовою хроматографією, електрофорезом та іншими методами.

 

Хроматографія на папері

 По механізму поділу розрізняють розподільну, адсорбційну, осадову та інші види паперової хроматографії (БХ). У розподільній рідина-рідинної хроматографії папір, приготовлена ​​зі спеціальних сортів бавовни, виконує роль носія нерухомої рідкої фази (НФ), в якості якої часто виступає вода, адсорбована парами паперу. У такому випадку гідрофільна папір використовується для нормально-фазової хроматографії.

 Розчинниками (ПФ) є спирти (метанол, етанол, н-пропанол, бутанол), прості ефіри (етиловий, метиловий), кетони (ацетон, ацетил-ацетон), ефіри органічних кислот (Метилацетат, етилацетат), піридин, хлороформ. Частіше використовуються суміші розчинників. Так, для поділу неорганічних неполярних речовин вживають системи:

 – Ацетон: НCl: Н 2 О (в різних співвідношеннях);

– Н-бутанол, насичений НСl (різної концентрації);

 – Н-бутанол: 0,1 М НNОз – ацетилацетон.

 Для розділення деяких органічних речовин використовують метод звернених фаз. У цьому методі для надання папері гідрофобного характеру її просочують нафталіном, парафіном, розчином каучуку, силіконом і ін Такий папір є носієм для неполярних розчинників як НФ. Як ПФ застосовують суміші кислот з нижчими спиртами.

 Паперова хроматографія використовується, наприклад, для розділення й ідентифікації полінасичених жирних кислот при вивченні складу ліпідів, виділених з тварин тканин. Папір просочують 5% розчином силікону, як ПФ використовують 85% розчин оцтової кислоти.

Поділ речовин в розподільній БХ здійснюється завдяки розбіжності у швидкостях руху компонентів при багаторазовому повторенні актів екстракції та сорбції. Швидкість переміщення компонентів залежить від їх коефіцієнтів розподілу (як і в методі екстракції).

 По напрямку руху елюента (ПФ) розрізняють висхідну, спадну і радіальну (кругову) хроматографію.

 Якщо елюент рухається по паперу вгору, метод називають висхідною (а) паперової хроматографією; при його русі зверху вниз – низхідною (б) паперової хроматографією. Дуже швидко можна здійснити хроматографічний аналіз методом радіальної (в) паперової хроматографії, в якому використовується паперове коло (г) з гнотом, опущеним у елюент.

Іноді при складному складі проби не вдається розділити її компоненти з допомогою одного розчинника. Тоді застосовують двовимірну хроматографію. У кут квадратного аркуша хроматографічного паперу наносять хроматографічного паперу наносять розчин проби і хроматографіруют спочатку в одному елюент, потім, повернувши хроматограму на 90, – в іншому. Перший елюент виробляє попереднє розділення компонентів проби, другий остаточне

Для проведення хроматографії на папері використовують скляні герметизовані камери. Всередині камери у верхній (спадний варіант) або нижньої її частини (висхідний варіант) поміщають посудину для рухомої фази (човник).

 Радіальну хроматографію можна здійснити в чашці Петрі. Детекцию зон, ідентифікацію та кількісне визначення в БХ проводять також, як і в методі тонкошарової хроматографії.

 Методом розподільчої рідинної паперової хроматографії успішно аналізують суміші катіонів у неорганічний якісному аналізі, суміші амінокислот і інших органічних кислот, пептидів, пестицидів, фенолів, барвників, синтетичних поверхнево-активних речовин.

 

Гель-проникаюча (молекулярно-ситова) хроматографія

 Гель-проникаюча хроматографія (ЦПХ) являє собою метод поділу молекул, заснований на розходженні з розмірів.

 Як НФ в ЦПХ використовують частки, що мають певні розміри пор. Це різного роду гелі (м’які, напівтверді і тверді). Як ПФ служать водні або органічні елюент. Принцип поділу молекул в ЦПХ полягає в тому, що молекули аналізованих речовин розподілені між нерухомим розчинником в порах сорбенту і розчинником, що протікає через шар НФ. Молекули, які мають розміри, що дозволяють їм проникати в пори сорбенту при русі вздовж колонки, частину часу втрачають на перебування в порах. Молекули, що мають розміри, що перевищують розміри пір, не проникають в сорбент і вимиваються з колонки зі швидкістю руху елюента. Молекули, які проникають в пори всіх розмірів, рухаються найбільш повільно. Зниження швидкості руху речовин вздовж колонки тим більше, ніж в більше число пір здатні дифундувати розподіляються частки.

 Таким чином, за допомогою ЦПХ можна розділити суміші речовин залежно від розмірів їх молекул.  Вихід речовин з колонки відбувається у порядку зменшення їх молекулярної маси. Так можна розділити поліпептиди, білки та інші макромолекули.

 Гель-проникаюча хроматографія на колонці використовується для очищення пестицидів, а також жиророзчинних вітамінів перед їх визначенням методом ВЖХ.

 

Електрофорез

 Метод аналізу, що базується на здатності заряджених частинок до пересування в зовнішньому електричному полі називають електрофорезом (від “електро” і грецького phoresis – перенесення).

 Електроліз відноситься до методів розділення без перетворення речовин, на основі заряду частинок. За технікою виконання метод аналогічний хроматографії, тому і розглядається в цьому розділі.

Нерідко під електрофорезом розуміють переміщення колоїдних частинок або макромолекул, на відміну від фореза – переміщення неорганічних іонів малого розміру.

 Пересування частинок при електрофорезі залежить від ряду факторів, основними з яких є: напруженість електричного поля; величина електричного заряду; швидкість і розмір частки; в’язкість, рН і температура середовища, а також тривалість електрофорезу.

 Електрофорез можна проводити як у вільному розчині (фронтальний електрофорез), так і на носіях (зональний електрофорез). Останній варіант переважно, оскільки носії сприяють стабілізації електрофоретичних зон. В якості носіїв використовують: фільтрувальний папір, силікагель, крохмаль, оксид алюмінію, полівінілхлорид, агарових і поліакріламідний гелі та ін

 Електрофоретичне поділ здійснюють на папері, в тонкому шарі сорбенту, колонці чи в блоці (який часто формують із суспензії крохмалю у відповідному електроліті).

 Апаратура для електрофорезу виконується за єдиною схемою: джерело струму, камера для електрофорезу, два електроди, що з’єднують камеру з джерелом струму і пристосування для збору та ідентифікації розділених речовин (останній блок у деяких випадках відсутня). Для електрофорезу використовують як готові набори апаратури (універсальний прилад для імуноелектрофорез та електрофорезу білків на папері і крохмалі, набір для електрофор  за в поліакриламідному гелі угорської фірми Реана), так і набори, що складаються експериментатором з окремих приладів.

 Електрофоретична камера складається з двох кювет, в які поміщають графітові електроди і розчин провідної рідини (буферний розчин). Вище кювет знаходиться підставка для носія паперу. Суміш речовин, що підлягають розподілу, наносять на просочену проводить рідиною папір. Папір підсушують, поміщають на підставку, кінці занурюють у кювети, потім камеру щільно закривають кришкою. Після просочування паперу проводить рідиною підключають електричний струм. Після закінчення електрофорезу папір підсушують. Якісну і кількісну оцінку здійснюють, застосовуючи методи, використовувані в паперовій хроматографії, наприклад, прояв білків за допомогою барвників, кількісну оцінку – методом денситометрії.

 Важливою сферою застосування електрофорезу є аналіз білків сироватки крові, амінокислот гідролізатів білків, нуклеїнових кислот і т.п. У кислотному буферному розчині амінокислота знаходиться у вигляді катіона NHз + …… COOH, який буде переміщатися до катода, в той час як у лужному буфері амінокислота перетворюється на аніон NH 2 …. COO -, і буде рухатися до анода . У ізоелектричної точці амінокислота знаходиться в розчині у вигляді біполярного іона NH 3 + …… COO – і не буде пересуватися в електричному полі.

З огляду на те, що окремі білки і амінокислоти мають різні ізоелектрична точки, при певному значенні рН вони будуть рухатися з різною швидкістю. Підбираючи відповідні буферні розчини для встановлення певної швидкості руху і розчинності речовин, можна використовувати електрофорез для їх розділення. Метод дозволяє розділяти речовини, відмінність в ізоелектричній точці яких складає до 0,02 одиниць рН. Градієнт рН в 0,02 одиниці часто досягають додатком амфоліти, що представляють собою готову суміш аліфатичних поліамінаполікарбонових кислот.

 Електрофоретичне поділ білків широко використовується для оцінки якості м’яса і м’ясних продуктів, для диференціювання виду м’яса і риби. Метод також застосовується для виявлення нем’ясних добавок (білків молока, сої, яєць) в м’ясних продуктах. За допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі можна охарактеризувати зміна білків у процесі дозрівання сирів (ріс.3.5.2).

 В даний час використовують високоефективний капілярний електрофорез, наприклад, для аналізу вітамінів в дієтичних продуктах (жиророзчинні А, Е, К, Д; водорозчинних – B 1, B 2, B 6, B 12, С, нікотинаміду); і для визначення аніонів ( сульфат – хлорид-, йодид-) у молочних продуктах.

 

Газова хроматографія

 У газовій хроматографії (ГХ) як ПФ використовують інертний газ (азот, гелій, водень), званий газом-носієм. Пробу подають у вигляді пари, нерухомою фазою служить або тверда речовина – сорбент (газо-адсорбційна хроматографія) або висококиплячих рідина, нанесена тонким шаром на твердий носій (газорідинна хроматографія). Розглянемо варіант газорідинної хроматографії (ГЖХ). В якості носія використовують кизельгур (діатоміт) – різновид гідратованого силікагелю, часто його обробляють реагентами, які переводять групи Si-OH в групи Si-О-Si (CH 3) 3, що підвищує інертність носія по відношенню до розчинників. Такими є, наприклад, носії “хромосорб W” і “газохромQ”. Крім того, використовують скляні мікрошарікі, тефлон і інші матеріали.

 Нерухому рідку фазу наносять на твердий носій. Ефективність розділення в газорідинної хроматографії залежить головним чином від правильності вибору рідкої фази. При цьому корисним виявилося старе правило: “подібне розчиняється в подібному”. Відповідно до цього правила для розділення суміші двох речовин вибирають рідку фазу, близьку за хімічною природою одному з компонентів. Підготовлений носій поміщають в спіральні колонки, що мають діаметр 2 – 6 мм і довжину до 20 м (набивні колонки). З 1957 року стали застосовувати запропоновані Голео капілярні колонки, що мають діаметр 0,2 – 0,3 мм і довжину в кілька десятків метрів. У випадку капілярних колонок рідка фаза наноситься безпосередньо на стінку цього капіляра, яка виконує роль носія. Застосування капілярних колонок сприяє підвищенню чутливості та ефективності поділу багатокомпонентних сумішей.

Газ – носій з балона 1 з постійною швидкістю пропускають через хроматографічну систему. Пробу вводять микрошприца в дозатор 2, який нагрітий до температури, необхідної для повного випаровування хроматографуючої речовини. Пари аналізованої суміші захоплюються потоком газу – носія і надходять у хроматографічну колонку, температура якої підтримується на необхідному для проведення аналізу рівні (вона може бути незмінною, або за необхідність змінюватися в заданому режимі). У колонці аналізована суміш ділиться на компоненти, які по черзі надходять в детектор.  Сигнал детектора фіксується реєстратором (у вигляді піків) і обробляється обчислювальним інтегратором.

 У ГХ використовують детектори, які перетворять в електричний сигнал зміни фізичних або фізико-хімічних властивостей газового потоку, що виходить з колонки, в порівнянні з чистим газом – носієм. Існує безліч детекторів, проте широке застосування знаходять тільки ті з них, які мають високу чутливість і універсальністю. До таких належать: катарометра (детектор по теплопровідності); полум’яно-іонізаційний детектор (ПІД), в якому водневе полум’я служить джерелом іонізації органічної сполуки; детектор електронного захоплення (ЕЗД); термоіонні детектор (ТІД), який володіє високою селективністю до органічних речовин, містить фосфор, азот і сірку. Інтерес до цього детектора помітно зріс у зв’язку із заміною хлорвмісних пестицидів на фосфорсодержащие отрутохімікати, що використовуються в сільському господарстві і попадають потім у харчові продукти.

 Катарометра дозволяє визначити концентрації речовин в межах 0,1 – 0,01%, ПІД – 10 -3 – 10 -5% “; ЕЗД – 10 -6 – 10 -10%. Сучасні детектори дозволяють визначати навіть пікограмів (10 -12 г) речовини в пробі.

 Якісний і кількісний аналіз в методі ГХ проводять так само, як і в ВЖХ.

 Газорідинна хроматографія знаходить широке застосування для розділення, ідентифікації та кількісного визначення складних багатокомпонентних систем, таких як нафта, біологічні рідини, харчові продукти, парфумерно-косметичні вироби та багато інших. Метод відрізняється високою чутливістю, експресність; для аналізу не потрібно великої кількості досліджуваного зразка.

 Серед різноманітних хроматографічних методів газова і високоефективна рідинна хроматографія є найбільш перспективними для вирішення складних завдань у практиці харчового аналізу.

 Так, до числа завдань, які можуть бути дозволені у харчовому аналізі за допомогою цих методів, входять:

 – Визначення хімічної природи речовин, які обумовлюють характерний аромат свіжих продуктів;

 – Контроль за станом продуктів у процесі обробки та зберігання;

 – Об’єктивна оцінка показників, що характеризують якість вихідної сировини і готових виробів з нього;

 – Встановлення та усунення причин, що викликають небажані зміни продуктів у процесі їх виготовлення;

 – Встановлення факту фальсифікації продукту та інші.

Методами ГХ і ВЖХ ідентифікують і визначають леткі речовини, що беруть участь у формуванні смаку і аромату багатьох харчових продуктів або відповідають за їх псування. Наприклад, визначають леткі жирні кислоти, характерні для якісного м’яса; або кислоти, які утворюються при зміні нормального процесу бродіння квашеної капусти і обумовлюють сторонні відтінки її запаху. Методи використовуються для визначення нікотину, нітрозаміни (в рибі і копченостях); харчових добавок (барвники, консерванти, антиокислювачі); забруднювачів навколишнього середовища (пестициди, афлатоксини, залишки лікарських препаратів, вітаміни) та ін На рис. 3.6.2 представлена ​​хроматограмма поділу афлатоксинов в молоці.

 Дуже цінними є методи ГХ і ВЖХ у встановленні фактів фальсифікації споживчих товарів. Так, жовтий барвник у макаронних виробах може створити враження про високу вартість продукту. Наявність такого барвника можна підтвердити методом ВЖХ. Визначення антоціанів та глікозидів, що відповідають за колір вина, дозволяє виявити натуральність вина. Підробки коньяку також можна розпізнати за допомогою ГХ.

 Методом ВЖХ ідентифікують і визначають небілковий азот, наприклад, сечовину, яку додають при фальсифікації білкових продуктів з метою збільшення азотистих речовин. Виявлення амінокислоти оксипроліну, присутньої, головним чином, в білках сполучної тканини, тобто в дешевій сировині, дозволяє виявити факт заміни їм повноцінного білка м’яса.  Жири, що визначаються за трігліцерідному складу методом ГХ, можуть дати інформацію про кількість жиру і добавках стороннього жиру. За визначенням жирно-кислотного складу можна зробити висновок про заміну какао-масла гідрожіром в шоколаді і т.п.

 Слід зазначити, що в даний час деякі види хроматографії використовують не як самостійні методи аналізу, а як методи попереднього випробування, або як методи підготовки проби до подальшого визначення іншими методами, в тому числі хроматографічними.

 Так, при визначенні амінокислот в гідролізаті білків м’яса або крові методом БХ, проводять попереднє очищення гідролізату на колонках з іонітами.  Аналогічно роблять при визначенні летючих підстав і вільних жирних кислот в м’ясі та рибі.

 Методом ТШХ встановлюють наявність в досліджуваному зразку хлорорганічних пестицидів, кількісне визначення яких потім проводять методом ГЖХ.

Особливо ефективним виявилося застосування незалежної аналітичної ідентифікації та визначення продуктів хроматографічного розділення при поєднанні ГХ і ВЖХ з іншими методами дослідження: інфрачервоної спектроскопії та мас-спектрометрією. Методом мас-спектрометрії можна проводити безперервний аналіз компонентів суміші, причому для невеликих кількостей речовин.  Такий комбінований (гібридний) метод отримав назву хромато-мас-спектрометрії. Наприклад, визначення пестицидів, залишків лікарських речовин (пеніцилінів, сульфаніламідів тощо) проводять, використовуючи комплекс: ГХ (або ВЖХ) – мас-спектрометрія. Можливо поєднання хроматографії з методами ядерного магнітного резонансу, полум’яної (фотометрії, абсорбційної спектрометрії та ін.)

 Застосування хроматографії поряд з іншими фізико-хімічними методами, а також їх взаємне поєднання, є тенденцією в розробці методик дослідження якості споживчих товарів.

Відбувається перегляд державних стандартів. Так, у 1997-1998 р.р. введені нові стандарти з дослідження якості води питної (ГОСТ Р51209-98), на вміст хлорорганічних пестицидів і етилового спирту та горілки (ГОСТ 30536-97), які регламентують визначення вмісту токсичних мікродомішок методами газорідинної хроматографії. На рис. 3.6.4 представлена ​​хроматограмма токсичних мікродомішок горілки і етилового спирту, з якої видно, що методом ГЖХ з використанням капілярної колонки можливо роздільне визначення всіх компонентів (на відміну від методик попереднього ГОСТ).

 Методи хроматографії володіють великою аналітичної ємністю, і, як вже було зазначено вище, знаходять саме широке застосування.

 

Кожен газовий хроматограф складається з таких блоків.

1. Блок підготовки газу-носія. Призначення – постачання, очищення, регулювання та вимірювання витрати газу-носія (елюента).

 2.  Дозатор проби. Призначення – в ведення в потік газу-носія порції аналізованої суміші. Суміш може бути газоподібна, рідка або тверда. В двох останніх випадках вона повинна переводитися в пароодібний стан перед змішуванням з газом-носієм за допомогою електронагріву.

3.  Хроматографічні колонки. Призначення – розділення багатокомпонентної суміші на бінарні суміші газу-носія з розділеними компонентами аналізованої суміші. Інколи розділення компонентів повинно проходити при підвищених температурах. У цьому випадку блок хроматографічних колонок комплектується системою термостатування.

4.  Детектор  – пристрій, який перетворює фізико-хімічні властивості речовини, що поступає в нього з хроматографічної колонки, в електричний сигнал. Блок детекторів також обладнується термостатом.

5.  Реєстратор  – записує сигнал детектора у графічному чи цифровому вигляді.

 

 

         Потік газу-носія, що пройшов стабілізацію і очищення від води та вуглеводнів в блоці підготовки (1), через пристрій для введення проби (2) вводиться досліджувана суміш (газоподібна проба подається через газовий кран-дозатор, а рідка – мікрошприцом через випарник). Потік газу-носія переносить суміш речовин проби в хроматографічну колонку (3), де здійснюється їх розділення за рахунок багаторазового повторювання процесів сорбції компонентів суміші з потоку сорбентом і десорбції їх в потік свіжої порції газу-носія. Ефект розділення досягається за рахунок різної швидкості руху компонентів вздовж колонки, яка зумовлена різними сорбційними властивостями складових аналізованої суміші.

Внаслідок цього з хроматографічної колонки послідовно виходять бінарні суміші газу-носія та окремих компонентів проби, що розділені проміжками практично чистого газу-носія, які далі потрапляють в детектор (4). Детектор фіксує залежність фізичних властивостей суміші (теплопровідність, електропровідність, поглинання світла і т.д.) від концентрації компонентів. Електричний сигнал детектора зображується у вигляді хроматограми за допомогою реєстраційного пристрою (5) (самописець, комп’ютер).

 

Ідентифікація лікарських речовин методом тонкошарової хроматографії.

 

Точну наважку порошку розтертих таблеток (0,31 г “Аскофен”, 0,42 г “Цитрамон”, 0,13 г “Парацетамол-325”) поміщають у мірний стакан місткістю 50 мл, додають 20 мл суміші метанол-хлороформ (4:6) і перемішують протягом 5-10 хв. Отриману суспензію фільтрують через паперовий фільтр у мірну колбу місткістю 25 мл, промиваючи фільтр з осадом 5 мл суміші метанол: хлороформ (4:6). Об’єм отриманого розчину доводять до мітки сумішшю метанол: хлороформ (4:6).

Паралельно готують розчин стандартного взірця речовини свідка (СВРС) кофеїну. У мірну колбу місткістю 25 мл поміщають 0,025 г стандартного взірця кофеїну, додають 10 мл суміші метанол-хлороформ (4:6), розчин яють і доводять об’єм розчину цією сумішшю до мітки.

На лінію стандарту хроматографічної пластинки типу “Сорбфіл – УФ” наносять по 5 мкг досліджуваних розчинів (фільтрати лікарських препаратів, які містять кофеїн, парацетамол) і 5 мкг розчину СВРС кофеїну. Пластинку з нанесеними речовинами висушують на повітрі протягом 5 хв та поміщають в хроматографічну камеру із сумішшю розчинників: розчин аміаку концентрований – ацетон – хлороформ – бутанол (10:30:30:40).

Коли фронт розчинників пройде 12 см від лінії стандарту, пластинку виймають з камери і висушують у витяжній шафі протягом 10 хв.

Потім пластинку переглядають в УФ-світлі з довжиною хвилі 254 нм. На хроматограмі досліджуваних розчинів повинні проявитися:

–                                 плями кофеїну на рівні плями кофеїну на хроматограмі розчину СВРС кофеїну;

–                                 плями парацетамолу на рівні плями парацетамолу на хроматоргамі препарату “Парацетамол-325”;

–                                 плями ацетилсаліцилатної кислоти на одному рівні на хроматограмах препаратів “Аскофен” і “Цитрамон”.

Контури проявлених плям обводять простим олівцем на хроматограмах і розраховуються фактори рухливості (R_f) ацетилсаліцилатної кислоти, парацетамолу і кофеїну.

Схема хроматограми і розрахунки R_f заносяться у протокол, робиться висновок про присутність у досліджуваних лікарських засобах ацетилсаліцилової кислоти, парацетамолу і кофеїну.

 

ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ

а) Основні: 1. Гайдукевич О.М., Болотов В.В. та ін. Аналітична хімія. – Харків “Основа”, 2000.–С.382-390.

2. Кузьма Ю.Б., Чабан Н.Ф., Ломницька Я.Ф. Аналітична хімія

б) Додаткові: 1. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. ч. 2. – М.: Высшая школа, 1982. – С. 261-277.

2. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия. Ч.2. – М.: Высшая школа, 2001. – С.402-445.

3. Основы аналитической химии: Ч.2 / Под ред. акад. Ю.А.Золотова. – М.: “Высшая школа”, 2002.

4.Яшин Я.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. – М.:Химия, 1976. – 215с.

5. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. – М.:Высшая школа, 1968. – 280с.

6. Харрис В., Хэбгуд Г. Газовая хроматография с программированием температуры. – М.:Мир, 1968. – 340с.