ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ: КАТАБОЛИЗМ, АНАБОЛИЗМ. СТАДИИ КАТАБОЛИЗМА. Общие пути превращений белков, углеводов, липидов.

Живой организм и его функционирование находятся в постоянной зависимости от окружающей среды. Интенсивность обмена с внешней средой и скорость внутриклеточных процессов обмена веществ поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма. Обмен веществ в организме человека протекает не хаотично; он интегрирован и тонко настроен. Все превращения органических веществ, процессы анаболизма и катаболизма тесно связаны друг с другом. В частности, процессы синтеза и распада взаимосвязаны, координированы и регулируются нейрогормональными механизмами, придающими химическим процессам нужное направление. В организме человека, как и в живой природе вообще, не существует самостоятельного обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот.

 

Все превращения объединены в целостный процесс метаболизма, подчиняющийся диалектическим закономерностям взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между отдельными классами органических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются физиологическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних классов органических веществ другими в условиях блокирования какого-либо процесса при патологии. Еще Кребс и Корнберг отмечали, что, несмотря на огромное разнообразие пищевых веществ (белки, жиры, углеводы), число химических реакций, обеспечивающих их превращения (распад) и образование энергии, «удивительно мало». Эти закономерности свойственны как организму животных и человека, так и микроорганизмам и растениям. В настоящее время экспериментально обосновано существование четырех главных этапов распада молекул углеводов, белков и жиров, которые интегрируют образование энергии из основных пищевых источников.

 

На II этапе мономерные молекулы (гексозы, глицерин, жирные кислоты и аминокислоты) подвергаются дальнейшему распаду, в процессе которого образуются богатые энергией фосфатные соединения и ацетил-КоА. В частности, при гликолизе гексозы расщепляются до пировиноград-ной кислоты и далее до ацетил-КоА. Этот процесс сопровождается образованием ограниченного числа богатых энергией фосфатных связей путем субстратного фосфорилирования. На этом этапе высшие жирные кислоты аналогично распадаются до ацетил-КоА, в то время как глицерин окисляется по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты и далее до ацетил-КоА. Для аминокислот ситуация на II этапе несколько отлична. При преимущественном использовании аминокислот в качестве источника энергии (при дефиците углеводов или при сахарном диабете) некоторые из них непосредственно превращаются в метаболиты лимоннокислого цикла (глутамат, аспартат), другие – опосредованно через глутамат (пролин, гистидин, аргинин), третьи – в пируват и далее в ацетил-КоА (аланин, серин, глицин, цистеин). Наконец, ряд аминокислот, в частности лейцин, изо-лейцин, расщепляется до ацетил-КоА, а из фенилаланина и тирозина, помимо ацетил-КоА, образуется оксалоацетат через фумаровую кислоту. Как видно, II этап можно назвать этапом образования ацетил-КоА, являющегося по существу единым (общим) промежуточным продуктом катаболизма основных пищевых веществ в клетках. На III этапе ацетил-КоА (и некоторые другие метаболиты, например α-кетоглутарат, оксалоацетат) подвергаются окислению («сгоранию») в цикле ди- и трикарбоновых кислот Кребса. Окисление сопровождается образованием восстановленных форм НАДН + Н⁺ и ФАДН₂.

На IV этапе осуществляется перенос электронов от восстановленных нуклеотидов на кислород (через дыхательную цепь). Он сопровождается образованием конечного продукта – молекулы воды. Этот транспорт электронов сопряжен с синтезом АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. Необходимо отметить, что, помимо взаимных переходов между разными классами веществ в организме, доказано существование более сложных форм связи. В частности, интенсивность и направление любой химической реакции определяются ферментами, т.е. белками, которые оказывают непосредственное влияние на обмен липидов, углеводов и нуклеиновых кислот. В свою очередь синтез любого белка-фермента требует участия ДНК и всех 3 типов рибонуклеиновых кислот: тРНК, мРНК и рРНК. Если к этому добавить влияние гормонов, а также продуктов распада какого-либо одного класса веществ (например, биогенных аминов) на обмен других классов органических веществ, то становятся понятными удивительная согласованность и координированность огромного разнообразия химических процессов, совершающихся в организме. Помимо прямых переходов метаболитов этих классов веществ друг в друга, существует тесная энергетическая связь, когда энергетические потребности могут обеспечиваться окислением какого-либо одного класса органических веществ при недостаточном поступлении с пищей других. Важность белков (в частности, ферментов, гормонов и др.) в обмене всех типов химических соединений слишком очевидна и не требует доказательств. Ранее было отмечено большое значение белков и аминокислот для синтеза ряда специализированных соединений (пуриновые и пиримиди-новые нуклеотиды, порфирины, биогенные амины и др.). Кетогенные аминокислоты, образующие в процессе обмена ацетоуксусную кислоту (ацетоацетил-КоА), могут непосредственно участвовать в синтезе жирных кислот и стеринов. Аналогично могут использоваться гликогенные аминокислоты через ацетил-КоА, но после предварительного превращения в пируват. Некоторые структурные компоненты специализированных липидов, в частности фосфоглицеринов, имеют своим источником аминокислоты и их производные, например серин, этаноламин, сфингозин и холин. Необходимо подчеркнуть, что превращение углеродных скелетов кетогенных или гликогенных аминокислот в жирные кислоты является необратимым процессом, хотя нельзя исключить возможности частичного синтеза глутамата и опосредованно других аминокислот из продуктов распада жирных кислот – ацетил-КоА – через цикл трикарбоновых кислот, включающий α-кетоглутарат. В то же время из глицерина нейтральных жиров через пируват полностью осуществляется синтез углеродных скелетов некоторых гликогенных аминокислот.

Специфические пути катаболизма                                                                  Взаимосвязь белков, жиров и углеводов.

Продукты гидролиза пищевых и тканевых триацилглицеролов, в частности высшие жирные кислоты, участвуют непосредственно в образовании сложных белков – липопротеинов плазмы крови. В составе липопротеинов, являющихся, таким образом, транспортной формой жирных кислот, они доставляются в органы-мишени, в которых жирные кислоты служат или источником энергии (сердечная и поперечно-полосатая мускулатура), или предшественниками синтеза тканевых триацилглицеролов с последующим их отложением в клетках ряда органов (депо липидов). Получены доказательства синтеза глюкозы из большинства аминокислот. Для некоторых аминокислот (аланин, аспарагиновая и глутами-новая кислоты) связь с глюконеогенезом является непосредственной, для других она осуществляется через побочные метаболические пути. Следует особо подчеркнуть, что три α-кетокислоты (пируват, оксалоацетат и кетоглутарат), образующиеся соответственно из аланина, аспартата и глу-тамата, не только служат исходным материалом для синтеза глюкозы, но являются своеобразными кофакторами при распаде ацетильных остатков всех классов пищевых веществ в цикле Кребса для получения энергии. Синтез незаменимых аминокислот из продуктов обмена углеводов и жиров в организме животных отсутствует. Клетки животных не содержат ферментных систем, катализирующих синтез углеродных скелетов этих аминокислот. В то же время организм может нормально развиваться исключительно при белковом питании, что также свидетельствует о возможности синтеза углеводов из белков. Процесс синтеза углеводов из аминокислот получил название глюконеогенеза. Он доказан прямым путем в опытах на животных с экспериментальным диабетом: более 50% введенного белка превращается в глюкозу. Как известно, при диабете организм теряет способность утилизировать глюкозу, и энергетические потребности покрываются за счет окисления аминокислот и жирных кислот. Доказано также, что исходными субстратами для глюконеогенеза являются те аминокислоты, распад которых сопровождается образованием прямо или опосредованно пировиноградной кислоты (например, аланин, серин, треонин и цистеин). Более того, имеются доказательства существования в организме своеобразного циклического процесса – глюкозоаланинового цикла, участвующего в тонкой регуляции концентрации глюкозы в крови в тех условиях, когда в период между приемами пищи организм испытывает дефицит глюкозы. Источниками пирувата при этом являются указанные аминокислоты, образующиеся в мышцах при распаде белков и поступающие в печень, в которой они подвергаются дезаминированию. Образовавшийся аммиак в печени обезвреживается, участвуя в синтезе мочевины, которая выделяется из организма. Дефицит мышечных белков затем восполняется за счет поступления аминокислот пищи. Энергетическая ценность пищи оказывает определенное влияние на белковый обмен, контролируемый азотистым балансом. Так, если потребляемая энергия пищи ниже минимального уровня, то наблюдается увеличение экскреции азота, и, наоборот, при увеличении энергетической ценности пищи экскреция азота с мочой снижается.

http://www.youtube.com/watch?v=p-lFJVOkFwk

С позиций термодинамики метаболизм представляет собой совокупность процессов, в которой реакции, потребляющие энергию из внешней среды (эндэргонические), сопрягаются с энергодающими (экзэргоническими) реакциями, что позволяет живым существам оказывать постоянное сопротивление нарастанию энтропии. Выяснение биохимических механизмов, приводящих к генерации различных форм биологической энергии, является предметом биоэнергетики. Источником энергии служат реакции, в ходе которых соединения, содержащие атомы углерода в высо-ковосстановленном состоянии, подвергаются окислению , а специальные дыхательные переносчики присоединяют протоны и электроны (восстанавливаются) и в таком виде транспортируют атомы водорода к дыхательной цепи.

Роль АТФ в биоэнергетике

I. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Процессы катаболизма в клетках животных сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. В результате этих реакций происходит освобождение энергии, которая необходима организмам в процессах жизнедеятельности для осуществления различных видов работы. Небиологические системы могут совершать работу за счёт тепловой энер-

гии, биологические системы функционируют в изотермическом режиме и для осуществления процессов жизнедеятельности используют химическую энергию. Изучением превращений энергии, сопровождающих химические реакции, занимается биоэнергетика, или биохимическая термодинамика.

СВОБОДНАЯ ЭНЕРГИЯ И ЗАКОНЫ ТЕРМОДИНАМИКИ

Живые организмы с точки зрения термодинамики – открытые системы. Между системой и окружающей средой возможен обмен энергии, который происходит в соответствии с законами термодинамики.

1. Законы термодинамики

Первый закон – закон сохранения энергии; его можно сформулировать так: общая энергия системы и окружающей среды – величина постоянная.

Внутри рассматриваемой системы энергия может переходить от одной её части к другой или превращаться из одной формы в другую.

Второй закон гласит, что все физические и химические процессы в системе стремятся к необратимому переходу полезной энергии в хаотическую, неуправляемую форму. Мерой перехода или неупорядоченности системы служит величина, называемая энтропией (S), она достигает максимума, когда система приходит в истинное равновесие с окружающей средой.

2. Свободная энергия

Каждое органическое соединение, поступающее в организм извне или входящее в состав живой материи, обладает определённым запасом внутренней энергии (Е). Часть этой внутренней энергии может быть использована для совершения полезной работы. Такую энергию системы называют свободной энергией (G).

При постоянных температуре и давлении соотношение между изменением свободной энер гии системы (ΔG) и изменением энтропии (ΔS) можно представить следующим уравнением: ΔG = ΔН – TxS, где ΔН – изменение энтальпии (внутренней энергии или теплоты, содержащейся в системе); Т – абсолютная температура. В условиях, при которых протекают биохимические реакции, АН приблизительно равно ΔЕ (изменению внутренней энергии системы в результате реакции). Для биологических систем измерение свободной энергии производят обычно при стандартных условиях, когда рН 7,0, температура 25 ?C, все растворы находятся в концентрации 1 моль/л, а все газы при давлении в 1 атм.

Рис. Общая схема обмена веществ и энергии. 1 – пищеварение; 2 – катаболизм; 3 – анаболизм; 4 – распад структурно-функциональных компонентов клеток; 5 – экзергонические реакции; 6, 7 – эндерго-нические реакции; 8 – выведение из организма.

 

При стандартных условиях все функции обозначают как ΔG⁰‘, ΔS⁰‘ и ΔН⁰‘. Изменение стандартной свободной энергии (ΔG⁰‘) можно вычислить, зная константу равновесия (K’eq) химической реакции.

3. Эндергонические и экзергонические реакции

Направление химической реакции определяется значением AG. Если эта величина отрицательна, то реакция протекает самопроизвольно и сопровождается уменьшением свободной энергии. Такие реакции называют экзергоничес-кими. Если при этом абсолютное значение AG велико, то реакция идёт практически до конца, и её можно рассматривать как необратимую.

Если AG положительно, то реакция будет протекать только при поступлении свободной энергии извне; такие реакции называют эн-дергоническими.

Если абсолютное значение AG велико, то система устойчива, и реакция в таком случае практически не осуществляется. При AG, равном нулю, система находится в равновесии (табл.).

Таблица. Соотношение между величинами K’_eq и ΔG⁰‘ и направлением химических реакций

 

4. Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов в организме

В биологических системах термодинамически невыгодные (эндергонические) реакции могут протекать лишь за счёт энергии экзер-гонических реакций. Такие реакции называют энергетически сопряжёнными. Многие из этих реакций происходят при участии аденозинтрифосфата (АТФ), играющего роль сопрягающего фактора.

Рассмотрим подробнее энергетику сопряжённых реакций на примере фосфорилирования глюкозы.

Реакция фосфорилирования глюкозы свободным фосфатом с образованием глюкозо-6-фосфата является эндергонической:

(1) Глюкоза+ Н₃РО₄ → Глюкозо-6-фосфат + Н₂О (ΔG = +13,8 кДж/моль).

Для протекания такой реакции в сторону образования глюкозо-6-фосфата необходимо её сопряжение с другой реакцией, величина свободной энергии которой больше, чем требуется для фосфорилирования глюкозы.

(2) АТФ → АДФ + Н₃РО₄ (ΔG = -30,5 кДж/моль).

При сопряжении процессов (1) и (2) в реакции, катализируемой гексокиназой (см. раздел 7), фосфорилирование глюкозы легко протекает в физиологических условиях; равновесие реакции

сильно сдвинуто вправо, и она практически необратима:

(3) Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ (ΔG = -16,7 кДж/моль).

 

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ФОСФАТОВ. ЦИКЛ АТФ-АДФ

В живых организмах существует целая группа органических фосфатов, гидролиз которых приводит к освобождению большого количества свободной энергии. Такие соединения называют высокоэнергетическими фосфатами (табл.).

Как видно из таблицы, разные фосфорилированные соединения обладают разным запасом свободной энергии. К группе высокоэнергетических фосфатов, помимо АТФ, относят енолфосфаты, ангидриды и фосфогуанидины. Соединения, расположенные в нижней части таблицы, составляют группу низкоэнергетических фосфатов.

 

Таблица. Свободная энергия гидролиза некоторых органических фосфатов

 

Центральное место среди этих соединений занимает АТФ (рис.).

Рис. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

 

В молекуле АТФ две высокоэнергетические (макро-эргические) связи β и γ; они обозначены на рисунке знаком ~ (тильда).

АТФ – молекула, богатая энергией, поскольку она содержит две фосфоангидридные связи (β, γ). При гидролизе концевой фосфоангидридной связи АТФ превращается в АДФ и ортофосфат P_i. При этом изменение свободной энергии составляет -7,3 ккал/моль. При условиях, существующих в клетке в норме (рН 7,0, температура 37°C), фактическое значение ΔG⁰‘ для процесса гидролиза составляет около -12 ккал/моль. Величина свободной энергии гидролиза АТФ делает возможным его образование из АДФ за счёт переноса фосфатного остатка от таких высокоэнергетических фосфатов, как, например, фосфоенолпируват или 1,3-бисфосфоглицерат; в свою очередь, АТФ может участвовать в таких эндергонических реакциях, как фосфорилирование глюкозы или глицерина. АТФ выступает в роли донора энергии в эндергонических реакциях многих анаболических процессов. Некоторые биосинтетические реакции в организме могут протекать при участии других нуклеозидтрифос-фатов, аналогов АТФ; к ним относят гуанозин-трифосфат (ГТФ), уридинтрифосфат (УТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Все эти нуклеотиды, в свою очередь, образуются при использовании свободной энергии концевой фосфатной группы АТФ. Наконец, за счёт свободной энергии АТФ совершаются различные виды работы, лежащие в основе жизнедеятельности организма, например, такие как мышечное сокращение или активный транспорт веществ.

Таким образом, АТФ – главный, непосредственно используемый донор свободной энергии в биологических системах. В клетке молекула АТФ расходуется в течение одной минуты после её образования. У человека количество АТФ, равное массе тела, образуется и разрушается каждые 24 ч.

Использование АТФ как источника энергии возможно только при условии непрерывного синтеза АТФ из АДФ за счёт энергии окисления органических соединений (рис.).

Рис. Цикл АТФ-АДФ.

 

Цикл АТФ-АДФ – основной механизм обмена энергии в биологических системах, а АТФ – универсальная «энергетическая валюта». Между циклом лимонной кислоты и орнитиновым циклом мочевинообразования имеются сложные связи, определяющие в известной степени скорость реакций, зависимую от энергетических потребностей клетки и концентраций конечных продуктов метаболизма. Как было показано, фумаровая кислота образуется в процессе распада аргинино-янтарной кислоты, синтез которой в свою очередь требует наличия аминокислоты аспартата. Образовавшаяся фумаровая кислота (из предшественника аминокислоты аспартата) далее вступает в цикл лимонной кислоты и под действием двух ферментов этого цикла: фумаратгидратазы и малатдегидрогеназы – превращается в оксалоацетат, который при участии специфической трансаминазы вновь превращается в аспартат, т.е. получается своеобразный аспартат-аргининоянтарный шунт цикла лимонной кислоты, соединенного с циклом мочевинообразования С энергетической точки зрения, превращение углеводов в жиры следует рассматривать как накопление и депонирование энергии, хотя синтез жира сопровождается затратой энергии, которая вновь освобождается при окислении жиров в организме. Глицерин, входящий в состав триацилглицеролов и фосфоглицеринов, может легко образоваться из промежуточных метаболитов гликолиза, в частности из глицераль-дегид-3-фосфата. Следует, однако, подчеркнуть, что основным путем превращения углеводов в жиры является путь образования высших жирных кислот из ацетил-КоА, который образуется при окислительном декар-боксилировании пирувата. Последняя реакция практически необратима, поэтому образования углеводов из высших жирных кислот почти не происходит. Таким образом, синтез углеводов из жиров в принципе может происходить только из глицерина, хотя в обычных условиях реакция протекает в обратную сторону, т.е. в сторону синтеза жиров из глицерина, образующегося при окислении углеводов. Ацетил-КоА, образующийся в процессе обмена углеводов, жиров и ряда аминокислот, служит пусковым субстратом как для синтеза жирных кислот (а следовательно, и липидов вообще), так и для цикла трикарбоновых кислот. Для окисления ацетил-КоА в этом цикле требуется оксалоацетат, который является вторым ключевым субстратом в цикле Кребса. Оксалоацетат может синтезироваться из пировиноградной кислоты и СО₂ благодаря реакции карбокси-лирования или образоваться из аспарагиновой кислоты в процессе транс-аминирования с α-кетоглутаратом. Две молекулы ацетил-КоА, конденсируясь, образуют ацетоуксусную кислоту (ацетоацетат), которая является источником других кетоновых тел в организме, в частности β-оксимасляной кислоты (β-оксибутирата) и ацетона. Следует подчеркнуть, что ацетоуксусная и β-оксимасляная кислоты часто рассматриваются как транспортные формы активной уксусной кислоты, доставляющие ее для окисления в цикле Кребса в периферических тканях. Эти же реакции конденсации двух молекул ацетил-КоА составляют начальные этапы синтеза холестерина, в свою очередь являющегося предшественником гормонов стероидной природы, витамина D₃, а также желчных кислот. Последние в виде парных желчных кислот выполняют важную функцию эмульгаторов при переваривании липидов пищи в кишечнике, а также функцию транспортеров, способствуя всасыванию высших жирных кислот. Следует указать также на использование галактозы и частично глюкозы для биосинтеза цереброзидов и гликолипидов, выполняющих важные и специфические функции в деятельности ЦНС. В этом синтезе участвуют не свободные моносахариды, а гексозамины (галактозамин и глюкозамин), биосинтез которых в свою очередь требует доставки амидного азота глутамина, интегрируя тем самым обмен углеводов, липидов и белков. В последние годы накоплено немало экспериментальных данных, свидетельствующих о существовании в живых организмах множества регулирующих механизмов, осуществляющих метаболический контроль и обеспечивающих как взаимопревращения белков, липидов и углеводов, так и интеграцию энергии. Не отрицая значение других типов регуляции метаболизма, следует подчеркнуть, что движущей силой во взаимопревращениях веществ и интенсивности метаболизма, вероятнее всего, является энергетическое состояние клетки, в частности уровень АТФ (точнее, отношение АМФ/АТФ). Так, при низких концентрациях АМФ и высоких концентрациях АТФ (состояние, которое принято обозначать «энергонасыщенностью») в клетках происходит резкое снижение глико-литического распада глюкозы, обусловленное действием этих нуклеотидов на ключевой фермент гликолиза – фосфофруктокиназу и на фосфатазу фруктозо-6-фосфата. В результате в клетках накапливается не только фруктозо-6-фосфат, но и его предшественник – глюкозо-6-фосфат. Последний, являясь положительным модулятором фермента гликогенсинтазы, стимулирует синтез полисахарида – гликогена. При низких концентрациях АТФ (соответственно при высоком уровне АМФ) в клетках отмечаются стимулирование гликолиза и окисление пирувата в лимоннокислом цикле, что способствует обеспечению клеток энергией. Однако при низких концентрациях АМФ имеет место снижение скорости цикла трикарбоновых кислот, обусловленное торможением активности изоцитратдегидрогеназы, соответственно наблюдается снижение скорости синтеза АТФ и накопление изолимонной кислоты. Последняя, как известно, повышает активность другого фермента – ацетил-КоА-карбоксилазы, которая в свою очередь катализирует I стадию превращения ацетил-КоА в жирную кислоту. Благодаря этим обстоятельствам клетка переводит образовавшуюся при гликолизе молекулу ацетил-КоА с энергетического пути на путь синтеза липидов и их отложения в депо. В то же время при восстановлении скорости утилизации АТФ, что обычно наблюдается при синтезе жирных кислот, соответствующее повышение уровня АМФ способствует снижению концентрации лимонной кислоты и соответственно торможению синтеза липидов. Перечисленными примерами абсолютно не исчерпывается все многообразие взаимопревращений органических веществ, которые постоянно совершаются в живых организмах. Здесь приведены лишь главные, магистральные каналы и пути превращения общих классов веществ и указаны ключевые субстраты и ферментные системы, обеспечивающие постоянство химических компонентов и тканей и динамичность живых структур. Таким образом, скорость распада одних питательных веществ и биосинтеза других прежде всего определяется физиологическим состоянием и потребностями организма в энергии и метаболитах. Благодаря динамичности и координации метаболической активности обеспечивается макро- и микроскопическое постоянство всех форм живого. Выяснение фундаментальных проблем структуры и функций отдельных биомолекул может служить основой для раскрытия как молекулярных механизмов химических процессов, лежащих в основе состава и функций отдельных клеток и целостного организма, так и процессов, обеспечивающих биологическую индивидуальность живых организмов. Любые нарушения этого динамического статуса организма сопровождаются развитием патологии, тяжесть и продолжительность которой будут определяться степенью повреждения структуры и функций отдельных молекулярных и надмолекулярных компонентов клеток.

Живые организмы находятся в постоянной и неразрывной связи с окружающей средой. Эта связь осуществляется в процессе обмена веществ. Обмен веществ включает 3 этапа: поступление веществ в организм, метаболизм и выделение конечных продуктов из организма.

Поступление веществ в организм происходит в результате дыхания (кислород) и питания. В ЖКТ продукты питания перевариваются (расщепляются до простых веществ). При переваривании происходит гидролиз полимеров (белков, полисахаридов и других сложных органических веществ) до мономеров, всасывающихся в кровь и включающихся в промежуточный обмен.

Промежуточный обмен (внутриклеточный метаболизм) включает 2 типа реакций: катаболизм и анаболизм.

Катаболизм – процесс расщепления органических молекул до конечных продуктов. Конечные продукты превращений органических веществ у животных и человека – СО₂, Н₂О и мочевина. В процессы катаболизма включаются метаболиты, образующиеся как при пищеварении, так и при распаде структурно-функциональных компонентов клеток.

Реакции катаболизма сопровождаются выделением энергии (экзергонические реакции).

Анаболизм объединяет биосинтетические процессы, в которых простые строительные блоки соединяются в сложные макромолекулы, необходимые для организма. В анаболических реакциях используется энергия, освобождающаяся при катаболизме (эндергонические реакции).

I. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Процессы катаболизма в клетках животных сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. В результате этих реакций происходит освобождение энергии, которая необходима организмам в процессах жизнедеятельности для осуществления различных видов работы. Небиологические системы могут совершать работу за счёт тепловой энер-

гии, биологические системы функционируют в изотермическом режиме и для осуществления процессов жизнедеятельности используют химическую энергию. Изучением превращений энергии, сопровождающих химические реакции, занимается биоэнергетика, или биохимическая термодинамика.

СВОБОДНАЯ ЭНЕРГИЯ И ЗАКОНЫ ТЕРМОДИНАМИКИ

Живые организмы с точки зрения термодинамики – открытые системы. Между системой и окружающей средой возможен обмен энергии, который происходит в соответствии с законами термодинамики.

1. Законы термодинамики

Первый закон – закон сохранения энергии; его можно сформулировать так: общая энергия системы и окружающей среды – величина постоянная.

Внутри рассматриваемой системы энергия может переходить от одной её части к другой или превращаться из одной формы в другую.

Второй закон гласит, что все физические и химические процессы в системе стремятся к необратимому переходу полезной энергии в хаотическую, неуправляемую форму. Мерой перехода или неупорядоченности системы служит величина, называемая энтропией (S), она достигает максимума, когда система приходит в истинное равновесие с окружающей средой.

2. Свободная энергия

Каждое органическое соединение, поступающее в организм извне или входящее в состав живой материи, обладает определённым запасом внутренней энергии (Е). Часть этой внутренней энергии может быть использована для совершения полезной работы. Такую энергию системы называют свободной энергией (G).

При постоянных температуре и давлении соотношение между изменением свободной энер гии системы (ΔG) и изменением энтропии (ΔS) можно представить следующим уравнением: ΔG = ΔН – TxS, где ΔН – изменение энтальпии (внутренней энергии или теплоты, содержащейся в системе); Т – абсолютная температура. В условиях, при которых протекают биохимические реакции, АН приблизительно равно ΔЕ (изменению внутренней энергии системы в результате реакции). Для биологических систем измерение свободной энергии производят обычно при стандартных условиях, когда рН 7,0, температура 25 ?C, все растворы находятся в концентрации 1 моль/л, а все газы при давлении в 1 атм.

Рис. Общая схема обмена веществ и энергии. 1 – пищеварение; 2 – катаболизм; 3 – анаболизм; 4 – распад структурно-функциональных компонентов клеток; 5 – экзергонические реакции; 6, 7 – эндерго-нические реакции; 8 – выведение из организма.

 

При стандартных условиях все функции обозначают как ΔG⁰‘, ΔS⁰‘ и ΔН⁰‘. Изменение стандартной свободной энергии (ΔG⁰‘) можно вычислить, зная константу равновесия (K’eq) химической реакции.

3. Эндергонические и экзергонические реакции

Направление химической реакции определяется значением AG. Если эта величина отрицательна, то реакция протекает самопроизвольно и сопровождается уменьшением свободной энергии. Такие реакции называют экзергоничес-кими. Если при этом абсолютное значение AG велико, то реакция идёт практически до конца, и её можно рассматривать как необратимую.

Если AG положительно, то реакция будет протекать только при поступлении свободной энергии извне; такие реакции называют эн-дергоническими.

Если абсолютное значение AG велико, то система устойчива, и реакция в таком случае практически не осуществляется. При AG, равном нулю, система находится в равновесии (табл. 6-1).

Таблица 6-1. Соотношение между величинами K’_eq и ΔG⁰‘ и направлением химических реакций

 

4. Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов в организме

В биологических системах термодинамически невыгодные (эндергонические) реакции могут протекать лишь за счёт энергии экзер-гонических реакций. Такие реакции называют энергетически сопряжёнными. Многие из этих реакций происходят при участии аденозинтрифосфата (АТФ), играющего роль сопрягающего фактора.

Рассмотрим подробнее энергетику сопряжённых реакций на примере фосфорилирования глюкозы.

Реакция фосфорилирования глюкозы свободным фосфатом с образованием глюкозо-6-фосфата является эндергонической:

(1) Глюкоза+ Н₃РО₄ → Глюкозо-6-фосфат + Н₂О (ΔG = +13,8 кДж/моль).

Для протекания такой реакции в сторону образования глюкозо-6-фосфата необходимо её сопряжение с другой реакцией, величина свободной энергии которой больше, чем требуется для фосфорилирования глюкозы.

(2) АТФ → АДФ + Н₃РО₄ (ΔG = -30,5 кДж/моль).

При сопряжении процессов (1) и (2) в реакции, катализируемой гексокиназой (см. раздел 7), фосфорилирование глюкозы легко протекает в физиологических условиях; равновесие реакции

сильно сдвинуто вправо, и она практически необратима:

(3) Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ (ΔG = -16,7 кДж/моль).

 

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ФОСФАТОВ. ЦИКЛ АТФ-АДФ

В живых организмах существует целая группа органических фосфатов, гидролиз которых приводит к освобождению большого количества свободной энергии. Такие соединения называют высокоэнергетическими фосфатами (табл.).

Как видно из таблицы, разные фосфорилированные соединения обладают разным запасом свободной энергии. К группе высокоэнергетических фосфатов, помимо АТФ, относят енолфосфаты, ангидриды и фосфогуанидины. Соединения, расположенные в нижней части таблицы, составляют группу низкоэнергетических фосфатов. Центральное место среди этих соединений занимает АТФ (рис.).

 

Таблица. Свободная энергия гидролиза некоторых органических фосфатов

Рис. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

В молекуле АТФ две высокоэнергетические (макро-эргические) связи β и γ; они обозначены на рисунке знаком ~ (тильда).

АТФ – молекула, богатая энергией, поскольку она содержит две фосфоангидридные связи (β, γ). При гидролизе концевой фосфоангидридной связи АТФ превращается в АДФ и ортофосфат P_i. При этом изменение свободной энергии составляет -7,3 ккал/моль. При условиях, существующих в клетке в норме (рН 7,0, температура 37°C), фактическое значение ΔG⁰‘ для процесса гидролиза составляет около -12 ккал/моль. Величина свободной энергии гидролиза АТФ делает возможным его образование из АДФ за счёт переноса фосфатного остатка от таких высокоэнергетических фосфатов, как, например, фосфоенолпируват или 1,3-бисфосфоглицерат; в свою очередь, АТФ может участвовать в таких эндергонических реакциях, как фосфорилирование глюкозы или глицерина. АТФ выступает в роли донора энергии в эндергонических реакциях многих анаболических процессов. Некоторые биосинтетические реакции в организме могут протекать при участии других нуклеозидтрифос-фатов, аналогов АТФ; к ним относят гуанозин-трифосфат (ГТФ), уридинтрифосфат (УТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Все эти нуклеотиды, в свою очередь, образуются при использовании свободной энергии концевой фосфатной группы АТФ. Наконец, за счёт свободной энергии АТФ совершаются различные виды работы, лежащие в основе жизнедеятельности организма, например, такие как мышечное сокращение или активный транспорт веществ.

Таким образом, АТФ – главный, непосредственно используемый донор свободной энергии в биологических системах. В клетке молекула АТФ расходуется в течение одной минуты после её образования. У человека количество АТФ, равное массе тела, образуется и разрушается каждые 24 ч.

Использование АТФ как источника энергии возможно только при условии непрерывного синтеза АТФ из АДФ за счёт энергии окисления органических соединений (рис.).

Рис. Цикл АТФ-АДФ.

 

Цикл АТФ-АДФ – основной механизм обмена энергии в биологических системах, а АТФ – универсальная «энергетическая валюта».

 

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ

Под окислением понимают отщепление электронов, а под восстановлением – присоединение электронов. Окисление донора электронов всегда сопровождается восстановлением акцептора электронов. Этот принцип окислительно-восстановительных процессов применим и к биохимическим системам. В любой окислитель-но-восстановительной реакции участвует акцеп-тор электронов (окислитель) и донор электронов (восстановитель). Например:

(1) Си + О → Cu²⁺O^2-.

Суммарную реакцию (1) можно условно разделить на 2 полуреакции (2), (3):

(2) Cu – 2e → Cu²+. (3) О + 2е → О^2-.

В каждой из них участвует окисленная и восстановленная форма одного соединения; их называют сопряжённой парой, или редокс-парой.

Разные редокс-пары обладают различным сродством к электрону. Те, у которых это сродство меньше, отдают электрон тем, у кого оно больше. Мерой сродства редокс-пары к электрону служит окислительно-восстановительный потенциал, или редокс-потенциал (Е₀‘), величина которого непосредственно связана с изменением свободной энергии. Величину Е₀‘ выражают в вольтах; чем она меньше (отрицательнее), тем меньше сродство вещества к электронам. Чем больше сродство, тем больше восстановительный потенциал.

Редокс-потенциалы Е₀‘ связаны с изменением свободной энергии уравнением Нернста:

AG⁰‘ = – nF ΔЕ₀ ‘

где- число перенесённых в реакции электронов; F – постоянная Фарадея (23 061 ккал В^-1моль^-1); ΔЕ_о‘ – разность редокс-потенциалов электрон-донорной и электрон-акцепторной пар.

Величина ΔЕ_о‘ – стандартная величина окислительно-восстановительного потенциала; её определяют в стандартных условиях, когда концентрации всех веществ равны 1 М, давление газов составляет 1 атм, а рН 7,0

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ КАТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Энергия освобождается в процессе ферментативного окисления метаболитов специфическими дегидрогеназами. В реакциях дегидрирования электроны и протоны переходят от органических субстратов на коферменты NAD- и FAD-зависимых дегидрогеназ. Электроны, обладающие высоким энергетическим потенциалом, передаются от восстановленных коферментов NADH и FADH₂ к кислороду через цепь переносчиков, локализованных во внутренней мембране митохондрий. Восстановление молекулы О₂ происходит в результате переноса 4 электронов. При каждом присоединении к кислороду 2 электронов, поступающих к нему по цепи переносчиков, из матрикса поглощаются 2 протона, в результате чего образуется молекула Н₂О.

Окисление органических веществ в клетках, сопровождающееся потреблением кислорода и синтезом воды, называют тканевым дыханием, а цепь переноса электронов (ЦПЭ) – дыхательной цепью.

Электроны, поступающие в ЦПЭ, по мере их продвижения от одного переносчика к другому теряют свободную энергию. Значительная часть этой энергии запасается в форме АТФ, а часть энергии рассеивается в виде тепла. Кроме того, электроны с высоким энергетическим потенциалом, возникающие при окислении различных субстратов, могут быть использованы в реакциях биосинтеза, для которых помимо АТФ требуются восстановительные эквиваленты, например NADPH.

ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТКЕ

Свободное окисление протекает при участии свободнорадикальных форм кислорода, которые образуются в процессе одноэлектронного восстановления кислорода и прежде всего супероксид-аниона кислорода.

 

Обычно эти реакции своднорадикального окисления протекают в активном центре соответствующих ферментов, а промежуточные продукты не появляются во внешней среде. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) в ней также возможно одно-электронное восстановление кислорода, объясняющееся тем, что его сродство к убихинону выше, чем к цитохромоксидазе. Эти процессы приводят к образованию супероксид-аниона кислорода. Этот радикал может образовываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимодействия кислорода с ионами металлов переменной валентности (чаще всего с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках и такими ферментами, как ксантиноксидаза или НАДФН-оксидаза. Образование супероксид-аниона кислорода имеет важное биологическое значение. Он является высокореакционным соединением, которое вследствие высокой гидрофильности не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. Его превращения приводят к образованию ряда активных окислителей. Он способен активировать NO-синтазу, которая образует в тканях NO-радикал, обладающий свойствами вторичного посредника (активирует растворимую гуанилатциклазу, продукт которой – цГМФ – проявляет вазодилататорные свойства). С другой стороны, супероксид-анион способен снижать содержание NO-радикала, превращая его в пероксинитрит ONOOH. Живые клетки имеют системы защиты от повышенной продукции свободных радикалов. Фермент супероксиддисмутаза превращает супероксид-анион кислорода в менее реакционноспособный и более гидрофобный пероксид водорода Н₂О₂. Пероксид водорода является субстратом каталазы и глутатионзависимых пероксидаз, которые катализируют его превращение в молекулу воды. Однако пероксид водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-анион ОСl^– ферментом миелопероксидазой.

Взаимопревращения свободных радикалов и их основные функции в тканях

http://www.youtube.com/watch?v=i3WZ2pyI-qM&playnext=1&list=PLD9620432F9A4D353

Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-радикал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные мембранные липиды) и в результате цепных реакций приводить к множественным нарушениям мембран и к гибели клеток. Важным дополнением этих реакций является способность NO-радикала при взаимодействии с супероксид-анионом образовывать пероксинитрит, который может индуцировать так называемый апоптоз (запрограммированная гибель клеток), а в ходе своего спонтанного распада превращаться в гидроксил-радикал. Последний может образовываться также из гипохлорит-аниона в присутствии ионов железа. Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлораминового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белок ферритин, связывают железо. Перекисное окисление липидов, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, способен прерывать широко известный гидрофобный антиоксидант α-токоферол (витамин Е). Его высокая концентрация в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами. Полное подавление перекисных процессов в тканях, по-видимому, нецелесообразно, свободные радикалы обладают полезными свойствами. Они индуцируют апоптоз, участвуют в формировании клеточного иммунитета. Образование гидроперекисей жирнокислотных цепей полиненасыщенных фосфолипидов повреждает бислой и, стимулируя работу фосфолипаз, способствует высвобождению жирных кислот из состава мембранных липидов. Полиненасыщенная арахидоновая кислота является обычной мишенью для свободнорадикальной атаки. Этот процесс может стимулировать ферментативные превращения ее по одному из двух путей – липоксигеназному или циклооксигеназному. В результате в клетке образуются важные биологические регуляторы: простагландины, лейкотриены, тромбоксаны. Лизофосфолипиды, образующиеся при отщеплении модифицированной жирной кислоты, могут быть восстановлены до исходного состояния с использованием другой жирной кислоты (в форме ацил-КоА). Таким образом может регулироваться жирнокислотный состав липидных молекул в клеточной мембране. Высокореакционные свободные радикалы кислорода, характеризующиеся высоким окислительным потенциалом и способностью к быстрым превращениям, могут индуцировать цепные реакции. В настоящее время признается важная роль свободнорадикальных процессов в развитии возрастных и патологических состояний в тканях. Свободнорадикальные превращения вовлекаются в механизмы, повышающие выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, а снижение генерации свободных радикалов в организме способствует ослаблению клеточного иммунитета. Однако усиленная генерация свободных радикалов сопровождает патологические состояния (болезнь Паркинсона, Альцгеймера) и сам процесс биологического старения.

АЭРОБНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПИРУВАТА

Клетки, недостаточно снабжаемые кислородом, могут частично или полностью существовать за счет энергии гликолиза. Однако большинство животных и растительных клеток в норме находится в аэробных условиях и свое органическое «топливо» окисляет полностью до СО₂ и Н₂О. В этих условиях пируват, образовавшийся при расщеплении глюкозы, не восстанавливается до лактата, а постепенно окисляется до СО₂ и Н₂О в аэробной стадии катаболизма, при этом первоначально происходит окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетил-КоА.

 

ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПИРУВАТА

Окислительное декарбоксилирование пирувата происходит в матриксе митохондрий. Транспорт пирувата в митохондриальный мат-рикс через внутреннюю мембрану митохондрий осуществляется при участии специального белка-переносчика по механизму симпорта с Н+ (рис.).

Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты

 

Превращение пирувата в ацетил-КоА описывают следующим суммарным уравнением:

СН₃-СО-СООН + NAD⁺ + HSKoA → СН₃-СО ^~ SKоА + NADH + H⁺ + СО₂.

В ходе этой реакции происходит окислительное декарбоксилирование пирувата, в результате которого карбоксильная группа удаляется в виде СО₂, а ацетильная группа включается в состав ацетил-КоА. Один атом водорода оказывается в составе NADH, а другой в виде H⁺ поступает в среду. Реакция необратима, поскольку AG^0′= -33,5 кДж/моль.

Рис. Катаболизм основных пищевых веществ. 1-3 – пищеварение; 4-8 – специфические пути катаболизма; 9-10 – заключительный (общий путь) катаболизма; 11 – ЦПЭ; 12 – окислительное фосфори-лирование.

Матрикс Рис. Транспорт пирувата через митохондриальную мембрану.

1. Строение пируватдегидрогеназного комплекса

Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата катализирует сложноорганизованный пируватдегидрогеназный комплекс.

В пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) входят 3 фермента: пируватдекарбоксилаза (Е₁), дигидролипоилтрансацетилаза (Е₂) и дигидро-липоилдегидрогеназа (Е₃), а также 5 коферментов: тиаминдифосфат (ТДФ), липоевая кислота, FAD, NAD+ и KoA. Кроме того, в состав комплекса входят регуляторные субъединицы: протеинкиназа и фосфопротеинфосфатаза (табл.).

Строение

Все эти ферменты и коферменты объединены в мультиферментную систему, содержащую разные количества каждого из ферментов и имеющую молекулярную массу более 6х10⁶.

В центре комплекса располагается дигидро-липоилтрансацетилаза (Е₂), образуя его ядро. К дигидролипоилтрансацетилазе присоединены молекулы: пируватдекарбоксилазы (Е₁) и дигид-ролипоилдегидрогеназы (Е₃).

Пируватдекарбоксилаза содержит прочно связанный с белковой частью ТДФ, а дигидро-липоилдегидрогеназа – FAD.

Липоиллизиновые группы центрального фермента (Е₂) функционируют как поворотные «кронштейны», переносящие атомы водовода и ацетильные группы от одной ферментной молекулы комплекса к другой.

2. Окислительное декарбоксилирование пирувата

Превращение пирувата в ацетил-КоА включает 5 стадий (рис.).

Стадия I. На этой стадии пируват соединяется с ТДФ в составе Е₁ и подвергается декарбоксилированию.

Пируват + E₁-ТДФ → Гидроксиэтил-ТДФ + СО₂.

В результате этой реакции образуется производное ТДФ с гидроксиэтильной группой при тиазоловом кольце (рис.).

Стадия II. Дигидролипоилтрансацетилаза (E₂) катализирует перенос атома водорода и ацетильной группы от ТДФ на окисленную форму липоиллизиновых групп с образованием аце-тилтиоэфира липоевой кислоты (рис.).

Стадия III. Hа стадии III KoA взаимодействует с ацетильным производным Е₂, в результате чего образуются ацетил-КоА и полностью восстановленный липоильный остаток, про-стетическая группа Е₂ (рис.).

Стадия IV. Hа стадии IV дигидролипоилдегид-рогеназа (Е₃) катализирует перенос атомов водорода от восстановленных липоильных групп на FAD – простетическую группу фермента Е₃.

Рис. Последовательность реакций, катализируемых ПДК. I – Е1 катализирует декарбоксилирование пирувата и перенос С₂-фрагмента на ТДФ; II – Е₂ катализирует окисление гидроксиэтильной группы и перенос С₂-фрагмента на липоевую кислоту (ЛК); III – ацетилированная дигидролипоилтрансацетилаза взаимодействует с KoA с образованием восстановленной формы липоевой кислоты и ацетил-КоА; IV – окисленная форма транс-ацетилазы регенерируется при участии Е₃; V – окисленная форма Е3 регенерируется при участии NAD⁺.

Рис. Тиаминдифосфат (ТДФ) и гидроксиэтил-ТДФ.

Рабочей частью ТДФ служит тиазоловое кольцо, к которому присоединяется продукт декарбоксилирования пирувата – гидроксиэтил.

Рис. Липоевая кислота в составе дигидролипоилтрансацетилазы (Е₂).

Липоевая кислота или липоильная группа могут существовать в окисленной (дисульфидной ЛК-SS) и восстановленной (ЛК-(SН)₂) формах. В составе дигидролипоилтрансацетилазы липоевая кислота связана с белком через остаток лизина амидной связью. Липоевая кислота играет роль витамина или фактора роста у некоторых микроорганизмов, тогда как высшие животные способны её синтезировать.

Стадия V. Hа стадии V восстановленный FADH₂ передаёт водород на NAD⁺ с образованием NADH.

Пируватдегидрогеназный комплекс характеризуется большим отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, который обеспечивает наряду с восстановлением кофер-мента (NADH) образование высокоэнергетической тиоэфирной связи в ацетил-КоА.

Структурное объединение 3 видов ферментов создаёт возможности для координации отдельных этапов сложной ферментативной реакции. Все промежуточные продукты реакции окислительного декарбоксилирования пирувата прочно связаны с комплексом, что увеличивает суммарную скорость процесса и сводит к минимуму побочные реакции.

Пируватдегидрогеназный комплекс, как и все белки, участвующие в реакциях ЦТК, кодируется ядерной ДHK. Транспорт субъединиц ПДК в митохондрии происходит сложным путём за счёт энергии АТФ или трансмембранного электрохимического потенциала при участии белков теплового шока, или шаперонов, предотвращающих их преждевременный фолдинг до поступления в митохонд-риальный матрикс или внутреннюю мембрану митохондрий.

 

3. Связь окислительного декарбоксилирования пирувата с ЦПЭ

Окислительное декарбоксилирование пирувата сопровождается образованием NADH, поставляющим электроны в дыхательную цепь и обеспечивающим синтез 3 молей АТФ на 1 моль пирувата путём окислительного фосфорилирования.

Так как отношения AДФ/ATФ и NADH/NAD⁺ в клетке относительно постоянны, ускорение утилизации АТФ приводит к повышению концентрации AДФ и ускорению окисления NADH в дыхательной цепи. Повышение концентрации NAD⁺, в свою очередь, стимулирует окислительное декарбоксилирование пирувата. Напротив, повышение концентрации АТФ и NADH снижает скорость этого процесса. Таким образом, изменения отношений AДФ/ATФ и NADH/ NAD⁺ – важнейшие сигналы, отражающие энергетические потребности клетки и регулирующие скорость окислительного декарбоксилирования пирувата. Каталитическая активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается, когда в клетках имеется достаточно «топлива» в виде жирных кислот и ацетил-КоА.

 

ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦИКЛ КРЕБСА)

Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Г. Кребсом.

 

Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что цикл трикарбо-новых кислот является тем центром, в котором сходятся практически все метаболические пути. Таким образом, цикл Кребса – общий конечный путь окисления ацетильных групп (в виде ацетил-КоА), в которые превращается в процессе катаболизма большая часть органических молекул, играющих роль «клеточного топлива»: углеводов, жирных кислот и аминокислот.

Образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата в митохондриях ацетил-КоА вступает в цикл Кребса. Данный цикл происходит в матриксе митохондрий и состоит из восьми последовательных реакций (рис. 10.9). Начинается цикл с присоединения ацетил-КоА к оксалоацетату и образования лимонной кислоты (цитрата). Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода) и двух декарбоксилирований (отщепление СО₂) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса превращается в оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т.е. в результате полного оборота цикла одна молекула ацетил-КоА сгорает до СО₂ и Н₂О, а молекула окса-лоацетата регенерируется. Рассмотрим все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса.

Цикл лимонной кислоты (цитратный цикл, цикл Кребса, цикл трикарбоновых кислот, ЦТК) – заключительный этап катаболизма, в котором углерод ацетильного остатка аце-тил-КоА окисляется до 2 молекул СО₂. Атомы водорода, освобождающиеся в окислительно-восстановительных реакциях, доставляются в ЦПЭ при участии NAD- и FAD-зависимых де-гидрогеназ, в результате чего происходят синтез воды и окислительное фосфорилирование АДФ. Связь между атомами углерода в аце-тил-КоА устойчива к окислению. В условиях организма окисление ацетильного остатка происходит в несколько этапов, образующих циклический процесс из 8 реакций (рис.).

Рис. Общая схема цитратного цикла.

Цифры 1-8 обозначают реакции цитратного цикла. Цикл начинается с того, что ацетильный остаток конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется шестиуглеродное соединение – цитрат. На образование цитрата в каждом обороте цикла расходуется одна молекула оксалоаце-тата; в результате завершения цикла происходит регенерация оксалоацетата. Таким образом, одна молекула оксалоацетата может многократно использоваться для окисления ацетильных остатков.

1. Последовательность реакций цитратного цикла

Образование цитрата

В реакции образования цитрата углеродный атом метильной группы ацетил-КоА связывается с карбонильной группой оксалоацетата (рис. 6-24); одновременно расщепляется тиоэфирная связь и освобождается коэнзим А (AG^0′= -37,6 кДж/моль).

Равновесие реакции в клетке сильно сдвинуто вправо, о чём свидетельствует отрицательная величина стандартной свободной энергии. Реакция сопровождается потерей большого количества энергии в виде теплоты. Катализирует реакцию цитрат синтаза, фермент, локализованный в матриксе митохондрий.

Превращение цитрата в изоцитрат

Вторая реакция цитратного цикла – обратимое превращение цитрата в изоцитрат (рис.). Фермент, катализирующий эту реакцию, назван аконитазой по промежуточному продукту, цис-аконитовой кислоте, которая предположительно образуется в реакции. Однако это соединение не обнаруживается в свободном виде, так как не отделяется от активного центра фермента до завершения реакции.

Окислительное декарбоксилирование изоцитрата

Эту реакцию катализирует изоцитратдегидро-геназа. Существуют 2 формы изоцитратдегидро-геназы: одна содержит в качестве кофермента NAD+, вторая – NADP+. NAD-зависимый фермент локализован в митохондриях и участвует в ЦТК; NADP-зависимый фермент, присутствующий и в митохондриях, и в цитоплазме, играет иную метаболическую роль. В результате действия этого фермента на изоцитрат образуется α-кетоглутарат (см. рис.).

 

Реакция, катализируемая NAD-зависимой изоцитратдегидрогеназой, – самая медленная реакция цитратного цикла. AДФ – аллостерический активатор фермента.

Окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата

В этой реакции α-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием в качестве конечных продуктов сукцинил-КоА, СО₂ и NADH + H⁺. В результате этой реакции образуется сукцинил-КоА (см. рис.).

Реакцию катализирует α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, который по структуре и функциям сходен с пируватдегидрогеназным комплексом (ПДК). Подобно ПДК, он состоит из 3 ферментов: α-кетоглутаратдекарбоксилазы, дигидролипоилтранссукцинилазы и дигид-ролипоилдегидрогеназы. Кроме того, в этот ферментный комплекс входят 5 коферментов: тиаминдифосфат, кофермент А, липоевая кислота, NAD⁺ и FAD. Существенное отличие этой ферментной системы от ПДК – то, что она не имеет сложного механизма регуляции, какой характерен для ПДК. В частности, в этом комплексе отсутствуют регуляторные субъединицы. Равновесие реакции окислительного декарбок-силирования α-кетоглутарата сильно сдвинуто в сторону образования сукцинил-КоА, и её можно считать однонаправленной.

Превращение сукцинил-КоА в сукцинат

Сукцинил-КоА – высокоэнергетическое соединение. Изменение свободной энергии гидролиза этого тиоэфира составляет AG^0′= -35,7 кДж/моль. В митохондриях разрыв тиоэфирной связи сукцинил-КоА сопряжён с реакцией фосфорилирования гуанозиндифосфата (ГДФ) до гуанозин-трифосфата (ГТФ).

Сукцинил-КоА → Сукцинат (ΔG⁰ = -10,36 кДж/моль).

Эту сопряжённую реакцию (см. рис.) катализирует сукцинаттиокиназа. Промежуточный этап реакции – фосфорилирование молекулы фермента по одному из гистидиновых остатков активного центра. Затем остаток фосфорной кислоты присоединяется к ГДФ с образованием ГТФ.

С ГТФ концевая фосфатная группа может переноситься на АДФ с образованием ATФ; эту обратимую реакцию катализирует нуклеозид-дифосфаткиназа.

ГТФ + АДФ ↔ ГДФ + АТФ.

Образование высокоэнергетической фосфо-ангидридной связи за счёт энергии субстрата (сукцинил-КoA) – пример субстратного фос-форилирования.

Дегидрирование сукцината

Образовавшийся на предыдущем этапе сук-цинат превращается в фумарат под действием сукцинатдегидрогеназы (см. рис.). Этот фермент – флавопротеин, молекула которого содержит прочно связанный кофермент FAD.

Сукцинат дегидрогеназа прочно связана с внутренней митохондриальной мембраной. Она состоит из 2 субъединиц, одна из которых связана с FAD. Кроме того, обе субъединицы содержат железо-серные центры; одна – Fe₂S₂, а другая – Fe₄S₄. В железо-серных центрах атомы железа меняют свою валентность, участвуя в транспорте электронов.

 

Образование малата из фумарата

Образование малата происходит при участии фермента фумаратгидратазы. Этот фермент более известен как фумараза.

Фумараза – олигомерный белок, состоящий из 4 идентичных полипептидных цепей. Он расположен в матриксе митохондрий. Фумаразу относят к ферментам с абсолютной субстратной специфичностью: она катализирует гидратацию только транс-формы фумарата.

Дегидрирование малата

В заключительной стадии цитратного цикла малат дегидрируется с образованием оксало-ацетата (см. рис.). Реакцию катализирует NAD-зависимая малатдегидрогеназа, содержащаяся в матриксе митохондрий.

Равновесие малатдегидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево. Тем не менее, в интак-тных клетках эта реакция идёт слева направо, потому что продукт реакции, оксалоацетат, активно используется в цитратсинтазной реакции. В цитозоле содержится изоформа малат-дегидрогеназы, также NAD-зависимая, но не принимающая участие в цитратном цикле. Обе изоформы малатдегидрогеназы – димеры.

2. Общая характеристика и энергетическое значение цитратного цикла

Образованием оксалоацетата завершается один оборот цитратного цикла. В одном обороте цикла лимонной кислоты в 2 реакциях де-карбоксилирования (превращение изоцитрата в α-кетоглутарат и α-кетоглутарата в сукцинил-КоА) происходит образование 2 молекул СО₂. В 4 реакциях цитратного цикла происходит дегидрирование с образованием восстановленных коферментов: 3 молекул NADH+H⁺ и 1 молекулы FADH₂ в составе сукцинатдегидрогеназы.

Наконец, на один оборот цикла затрачивается 2 молекулы воды: одна – на стадии образования цитрата, вторая – на стадии гидратации фумарата.

Восстановленные коферменты (3 молекулы NADH и 1 молекула FADH₂), образованные в цикле лимонной кислоты, отдают электроны в ЦПЭ на кислород – конечный акцептор электронов. Восстановленный кислород взаимодействует с протонами с образованием воды.

На каждую молекулу NADH при образовании молекулы воды в процессе тканевого дыхания синтезируются 3 молекулы ATФ, а на каждую молекулу FADH₂ – 2 молекулы АТФ (рис. 6-25).

Таким образом, каждый оборот цикла лимонной кислоты сопровождается синтезом 11 молекул АТФ путём окислительного фосфо-рилирования. Одна молекула АТФ образуется путём субстратного фосфорилирования.

В итоге на каждый ацетильный остаток, включённый в цитратный цикл, образуется 12 молекул

3. Регуляция общего пути катаболизма

Скорость синтеза АТФ строго соответствует энергетическим потребностям клетки. Это достигается согласованной регуляцией всех этапов заключительного пути катаболизма, включающего превращение пирувата в ацетил-КоА, цитратный цикл и ЦПЭ. В большинстве тканей, где главная функция общего пути катаболизма – обеспечение клетки энергией, важную роль в регуляции играет дыхательный контроль.

Увеличение скорости утилизации АТФ для совершения различных видов работы увеличивает концентрацию АДФ, что ускоряет окисление NADH в ЦПЭ и, следовательно, повышает скорость реакций, катализируемых NAD-зависимыми дегидрогеназами. Окисление пирувата и ацетил-КоА может происходить только в том случае, если электроны и протоны от NADH и FADH₂ поступают в ЦПЭ. Таким образом, отношения AДФ/ATФ и NADH/NAD⁺ – главные модуляторы скорости реакций общего пути катаболизма (ОПК).

Рис. Схема взаимосвязи общего пути катаболизма и ЦПЭ.

Как известно, скорость метаболических путей, которые должны обеспечивать постоянный уровень конечных продуктов, таких, как АТФ, регулируется на уровне реакций, катализируемых регуляторными ферментами. На заключительном этапе катаболизма наиболее важные регуляторные ферменты – пируватдегидроге-назный комплекс, цитратсинтаза, изоцитратде-гидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс.

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса. Регуляция на уровне ПДК имеет важное значение для обеспечения цитратного цикла «топливными» молекулами ацетил-КоА.

Образование ацетил-КоА из пирувата – необратимый ключевой этап метаболизма. Животные не способны к превращению ацетил-КоА в глюкозу. Активность пируватдегидрогеназного комплекса регулируется различными способами: доступностью субстратов, ингибированием продуктами реакции, аллостерически и путём ковалентной модификации.

Ковалентная модификация ПДК осуществляется фосфорилированием и дефосфорили-рованием. В состав ПДК входят 2 регуляторных субъединицы. Одна из них, киназа ПДК, фос-форилирует ПДК в определённых участках по остаткам серина. При фосфорилировании ПДК инактивируется. Другая регуляторная субъединица, фосфатаза, дефосфорилирует фермент, превращая его в активную форму (рис.).

При повышении концентрации AДФ ПДК находится в нефосфорилированной активной форме. Этот эффект усиливается в некоторых клетках при повышении концентрации внутриклеточного Са²⁺, который активирует фосфатазу ПДК. Такой механизм активации ПДК особенно важен в мышцах и жировой ткани.

Продукты пируватдегидрогеназной реакции (ацетил-КоА и NADH) аллостерически активируют киназу ПДК. Активированная киназа фосфорилирует и инактивирует ПДК. Таким образом, при накоплении NADH и ацетил-КоА тормозится превращение пирувата в ацетил- КоА.

Рис. Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса.

ПДК аллостерически активируется АДФ, NAD⁺, КоА, Cа²⁺ и пируватом; ацетил-КоА, NADH и АТФ активируют киназу и ингибируют ПДК. Фосфатаза активируется Cа²⁺.

Такая ситуация создаётся, например, в печени при голодании: из жировых депо в печень поступают жирные кислоты, из которых образуется ацетил-КоА. В присутствии высокомолекулярных жирных кислот ингибирование ПДК усиливается. Пируват при этом не окисляется и может быть использован для синтеза глюкозы.

Пируват аллостерически активирует нефос-форилированную форму ПДК, действуя согласованно с другими субстратами – NAD и KoA. Активация ПДК происходит также под влиянием инсулина. Один из эффектов инсулина – повышение концентрации внутримитохондриального Са²⁺. При повышении концентрации Са²⁺ ПДК активируется (см. рис.). Этот механизм особенно важен в жировой ткани, где ацетил-КоА необходим для синтеза жирных кислот. В клетках миокарда ПДК активируется адреналином, однако это влияние адреналина не связано с изменением концентрации цАМФ.

Регуляция цитратного цикла. В большинстве случаев скорость реакций в метаболических циклах определяется их начальными реакциями. В ЦТК важнейшая регуляторная реакция – образование цитрата из оксалоацетата и аце-тил-КоА, катализируемая цитратсинтазой. Эта реакция ускоряется при повышении концентрации оксалоацетата – субстрата реакции и тормозится продуктом реакции – цитратом. Когда отношение NADH/NAD⁺ снижается, скорость окисления малата в оксалоацетат возрастает. Повышение концентрации оксалоацетата ускоряет цитратсинтазную реакцию. Скорость реакции снижается при повышении концентрации АТФ, сукцинил-КоА и длинноцепочечных жирных кислот. Однако точный механизм влияния этих метаболитов на цитратсинтазу недостаточно ясен (рис.).

Изоцитратдегидрогеназа, олигомерный фермент, состоит из 8 субъединиц. Присоединение изоцитрата к первой субъединице вызывает кооперативное изменение конформации других, увеличивая скорость присоединения субстрата. Фермент аллостерически активируется AДФ и Са²⁺, которые присоединяются к ферменту в разных аллостерических центрах. В присутствии AДФ конформация всех субъединиц меняется таким образом, что связывание изоцитрата происходит значительно быстрее. Таким образом, при концентрации изоцитрата, которая существует в митохондриальном матриксе, небольшие изменения концентрации AДФ могут вызвать значительное изменение скорости реакции. Увеличение активности изоцитратдегидрогеназы снижает концентрацию цитрата, что, в свою очередь, уменьшает ингибирование цитратсинтазы продуктом реакции. При повышении концентрации NADH активность фермента снижается.

α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, имеющий сходное строение с пируватдегидро-геназным, в отличие от последнего, не имеет в своём составе регуляторных субъединиц. Главный механизм регуляции α-кетоглутарат-дегидрогеназного комплекса – ингибирование реакции NADH и сукцинил-КоА.

α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, как и изоцитратдегидрогеназа, активируется Са²⁺, а при повышении концентрации АТФ скорости обеих реакций снижаются.

Рис. Регуляция общего пути катаболизма. 1 – ПДК активируется пируватом, NAD⁺, KoA; ингибируется NADH и ацетил-КоА; 2 – цитратсинтаза (реакция ускоряется при повышении концентрации оксалоацетата и замедляется при повышении концентрации цитрата, NADH, АТФ и сукцинил-КоА); 3 – изоцитратдегидрогеназа аллостерически активируется АДФ, ионами кальция, ингибируется NADH; 4 – a-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс ингибируется NADH, АТФ и сукцинил-КоА, а активируется ионами кальция.

 

В регуляции цитратного цикла существует множество дополнительных механизмов, обеспечивающих необходимый уровень метаболитов и их участие в других метаболических путях.

Компартментализация ферментов, участвующих в реакциях окислительного декар-боксилирования пирувата и цикла лимонной кислоты, играет важную роль в регуляции этих процессов.

Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для анионов и катионов, в том числе и для промежуточных продуктов цитратного цикла, которые могут быть перенесены через мембрану только при участии специальных белков. Поэтому ферменты цитратного цикла имеют больше возможностей для взаимодействия с продуктами предыдущих реакций, чем в случае свободного удаления этих продуктов из митохондрий.

Доступность субстратов возрастает также в результате образования ферментных комплексов. Малатдегидрогеназа и цитратсинтаза образуют непрочные комплексы, в которых цитратсинтаза может использовать оксалоацетат, непосредственно образующийся малатдегидрогеназой.

В ПДК и α-кетоглутаратдегидрогеназном комплексе субстраты непосредственно передаются от одного фермента к другому: только трансацилаза может взаимодействовать с промежуточным продуктом, связанным с ТДФ, а дигидролипоилдегидрогеназа – с дигидроли-поевой кислотой.

NAD⁺, NADH, КоА, ацетил-КоА и сукцинил-КоА не имеют транспортных белков в мембране митохондрий. Поэтому эти соединения не могут пройти через митохондриальную мембрану.

Накопление ацил-КоА производных, таких как ацетил-КоА или сукцинил-КоА, в митохон-дриальном матриксе ингибирует другие реакции, для которых необходим KoA.

Тесная связь цитратного цикла и ЦПЭ поддерживается благодаря использованию в этих реакциях общего фонда NAD⁺ и NADH.

В. АНАБОЛИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ЦИТРАТНОГО ЦИКЛА

Цикл лимонной кислоты – один из амфиболических путей метаболизма. В нём осуществляются не только окислительные превращения энергетических субстратов до конечных продуктов СО₂ и Н₂О, но и происходит образование субстратов для других метаболических путей (рис.).

Некоторые промежуточные продукты цикла лимонной кислоты: α-кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат могут использоваться для синтеза заменимых аминокислот.

Убыль промежуточных продуктов цикла восполняется в реакциях, катализируемых специфическими ферментами. В нормальных условиях реакции, отвлекающие промежуточные продукты из цикла и восполняющие их убыль, находятся в состоянии динамического равновесия, так что концентрация этих продуктов в митохондриях остаётся постоянной.

Реакции, обеспечивающие пополнение фонда промежуточных продуктов ЦТК, называются анаплеротическими (пополняющими). Важнейшая из них – реакция синтеза оксалоацетата из пирувата. Эту реакцию катализирует митохонд-риальный фермент – пируваткарбоксилаза.

CH₃ – CO – COOH + CO₂ + АТФ->

HOOC – CO – CH₂ – COOH + АДФ + H₃PO₄.

Пируваткарбоксилаза – сложный олигомер-ный фермент. Молекула фермента содержит 4 простетические группы, представленные биотином, который ковалентно связан амидной связью с ε-аминогруппами остатков лизина, находящегося в активном центре фермента (рис.).

Рис. Использование метаболитов ЦТК в синтезе различных соединений. Синтез заменимых аминокислот (1, 2, 3), глюкозы (4, 5, 6), жирных кислот (7), гема (8).

Рис. Простетическая группа пируват карбоксилазы.

 

Карбоксильная группа биотина образует амидную связь с ε-аминогруппой лизина в активном центре фермента. СО₂ активируется, образуя N-карбоксипроизводное биотина.

Если для цикла лимонной кислоты не хватает оксалоацетата или какого-нибудь другого промежуточного продукта, то карбоксилирование пирувата ускоряется. В этой реакции в качестве источника энергии используется АТФ.

Реакция протекает в 2 стадии. На первой стадии происходит активация СО₂ путём присоединения к одному из атомов азота в молекуле биотина. Эта реакция сопряжена с гидролизом АТФ.

АТФ + СО₂+ Е-биотин + Н₂О → AДФ + Н₃РО₄ + Е-биотин-СОО^– + 2 Н⁺.

На второй стадии активированная карбоксильная группа переносится на пируват.

Е-биотин-СОО^– + Пируват → Е-биотин + Окса-лоацетат.

Пируваткарбоксилаза – регуляторный фермент. Если концентрация ацетил-КоА увеличивается, то он действует как аллостерический активатор пируваткарбоксилазы, ускоряя образование окса-лоацетата. Таким образом, избыток ацетил-КоА способствует активации цитратного цикла.

Метаболиты цитратного цикла используются не только как субстраты синтеза углеродного скелета ряда соединений, но и являются донорами водорода для образования восстановленных коферментов, участвующих в реакциях синтеза жирных кислот, стероидов и других веществ (см. разделы 8, 10, 11). Два метаболита цитратного цикла могут дегидрироваться при участии NADP-зависимых дегидрогеназ: малата и изоцитрата. Например, малат может поступать из митохондрий в цитозоль клетки. В цитозоле находится NADP-зависимая дегидрогеназа (малик-фермент), катализирующая реакцию:

Малат и изоцитрат обеспечивают образование около половины общего фонда NADPH, используемого в восстановительных синтезах; вторая половина образуется в пентозофосфатном пути превращения глюкозы.

Г. ГИПОЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ

Все живые клетки постоянно нуждаются в АТФ для осуществления различных видов жизнедеятельности.

Клетки мозга потребляют большое количество АТФ для синтеза нейромедиаторов, регенерации нервных клеток, поддержания необходимого градиента Na⁺ и K⁺, для проведения нервного импульса; почки используют АТФ в процессе ре-абсорбции различных веществ при образовании мочи; в печени происходит синтез гликогена, жиров, белков и многих других соединений; в миокарде постоянно совершается механическая работа, необходимая для циркуляции крови; скелетные мышцы в покое потребляют незначительные количества АТФ, но при физической нагрузке эти потребности возрастают в десятки раз (табл. 6-6).

Вместе с тем запасов АТФ в клетках практически не существует. Так, в условиях прекращения синтеза АТФ в миокарде его запасы истощаются за несколько секунд.

Как мы уже знаем, для постоянного синтеза АТФ клеткам необходим приток метаболитов как субстратов дыхания и кислорода как конечного акцептора электронов в реакциях окисления, сопряжённых с синтезом АТФ.

Нарушения какого-либо этапа метаболизма, приводящие к прекращению синтеза АТФ, гибельны для клетки.

Состояния, при которых синтез АТФ снижен, объединяют термином «гипоэнергетические». Причинами гипоэнергетических состояний могут быть голодание, гиповитаминозы В₁, РР, В₂; гипоксия.

Гипоксия может возникнуть: при недостатке кислорода во вдыхаемом воздухе; при заболеваниях лёгких и нарушении лёгочной вентиляции; при нарушениях кровообращения, вызванных заболеваниями сердца, спазмом и тромбозом сосудов, кровопотерей. Причинами гипоксии могут быть также наследственные или приобрё-тенные нарушения структуры гемоглобина.Частой причиной гипоэнергетических состояний могут быть нарушения процессов использования кислорода в клетках.

Причинами этих нарушений могут быть:

•  действие ингибиторов и разобщителей в ЦПЭ;

•  железодефицитные анемии;

•  снижение уровня гемоглобина и других железосодержащих белков (цитохромов, FeS-белков), в результате чего нарушаются перенос электронов и синтез АТФ;

•  наследственные дефекты ферментов ЦПЭ и цитратного цикла.

Примерно 13 из 100 белков, участвующих в окислительном фосфорилировании, кодируются митохондриальной ДНК: 7 субъединиц комплекса I, субъединица комплекса III, 3 субъединицы комплекса IV и 2 субъединицы комплекса V, а также необходимые компоненты их трансляции. Остальные митохондриальные белки синтезируются в ядре.

Ядерная ДНК кодирует более 70 субъединиц белков, участвующих в окислительном фосфори-лировании. Нарушения окислительного фосфо-рилирования в основном связаны с мутациями в митохондриальной ДНК, которые случаются примерно в 10 раз чаще, чем в ядерной. Ткани с высокой потребностью в АТФ (ЦНС, скелетные мышцы, миокард, почки и печень) наиболее чувствительны к нарушениям окислительного фосфорилирования.

Дефекты митохондриальной ДНК наследуются по материнской линии, так как митохондрии из клеток сперматозоидов не проникают в оплодотворённую яйцеклетку. Мутации митохондриальной ДНК – частая причина, так как митохондрии не имеют такой же эффективной системы репарации ДНК, как ядро. Даже у здоровых индивидуумов соматические мутации снижают с возрастом возможности окислительного фосфорилирования. В этих случаях способность к синтезу АТФ ниже тканеспецифического уровня нормальных клеток.

 

Таблица. Скорость потребления О₂ и АТФ в некоторых тканях

Общее уравнение одного оборота цикла Кребса:

Ацетил-КоА → 2CO₂ + КоА + 8e⁻

 

Регуляция цикла

 

Цикл Кребса регулируется «по механизму отрицательной обратной связи», при наличии большого количества субстратов (ацетил-КоА, оксалоацетат), цикл активно работает, а при избытке продуктов реакции (NADH, ATP) тормозится. Регуляция осуществляется и при помощи гормонов, основным источником ацетил-КоА является глюкоза, поэтому гормоны, способствующие аэробному распаду глюкозы, способствуют работе цикла Кребса. Такими гормонами являются: инсулин и адреналин. Глюкагон стимулирует синтез глюкозы и ингибирует реакции цикла Кребса.

Как правило работа цикла Кребса не прерывается за счёт анаплеротических реакций, которые пополняют цикл субстратами: Пируват + СО₂ + АТФ = Оксалоацетат (субстрат Цикла Кребса) + АДФ + Фн.

Функции

Интегративная функция — цикл является связующим звеном между реакциями анаболизма и катаболизма.

Катаболическая функция  — превращение различных веществ в субстраты цикла:

Жирные кислоты, пируват,Лей,Фен — Ацетил-КоА.

Арг, Гис, Глу — α-кетоглутарат.

Фен, тир — фумарат.

Анаболическая функция  — использование субстратов цикла на синтез органических веществ:

Оксалацетат — глюкоза, Асп, Асн.

Сукцинил-КоА — синтез гема.

CО₂ — реакции карбоксилирования.

Водорододонорная функция  — цикл Кребса поставляет на дыхательную цепь митохондрий протоны в виде трех НАДН.Н⁺ и одного ФАДН₂.

Энергетическая функция  — 3 НАДН.Н⁺ дает 7.5 моль АТФ, 1 ФАДН₂ дает 1.5 моль АТФ на дыхательной цепи. Кроме того в цикле путем субстратного фосфорилирования синтезируется 1 ГТФ, а затем из него синтезируется АТФ посредством трансфосфорилирования: ГТФ + АДФ = АТФ + ГДФ.

Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление («сгорание») одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД⁺ и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов в дыхательной цепи (в цепи дыхательных ферментов), локализованной в мембране митохондрий. Образовавшийся ФАДН₂ прочно связан с СДГ, поэтому он передает атомы водорода через KoQ. Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ. Из 4 пар атомов водорода 3 пары переносят НАДН на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуется 3 молекулы АТФ (в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего, следовательно, 9 молекул АТФ (см. главу 9). Одна пара атомов от сукцинатдегидрогеназы-ФАДН₂ попадает в систему транспорта электронов через KoQ, в результате образуется только 2 молекулы АТФ. В ходе цикла Кребса синтезируется также одна молекула ГТФ (субстратное фосфорилирование), что равносильно одной молекуле АТФ. Итак, при окислении одной молекулы ацетил-КоА в цикле Кребса и системе окислительного фосфорилирования может образоваться 12 молекул АТФ.

Если подсчитать полный энергетический эффект гликолитического расщепления глюкозы и последующего окисления двух образовавшихся молекул пирувата до СО₂ и Н₂О, то он окажется значительно большим. Как отмечалось, одна молекула НАДН (3 молекулы АТФ) образуется при окислительном декарбоксилировании пирувата в ацетил-КоА. При расщеплении одной молекулы глюкозы образуется 2 молекулы пирувата, а при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих 2 оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется 30 молекул АТФ (следовательно, окисление молекулы пирувата до СО₂ и Н₂О дает 15 молекул АТФ). К этому количеству надо добавить 2 молекулы АТФ, образующиеся при аэробном гликолизе, и 6 молекул АТФ, синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН, которые образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в дегидрогеназной реакции гликолиза. Следовательно, при расщеплении в тканях одной молекулы глюкозы по уравнению С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ —> 6СО₂ + 6Н₂О синтезируется 38 молекул АТФ. Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным процессом, чем анаэробный гликолиз. Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН в дальнейшем при окислении могут давать не 6 молекул АТФ, а только 4.

http://www.youtube.com/watch?v=3OmMOcbTqE4&feature=related

Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН не способны проникать через мембрану внутрь митохондрий. Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого глицеролфосфатного челночного механизма (рис.). Цитоплазматический НАДН сначала реагирует с цитоплазматическим дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализи-руется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфатдегидрогеназой:

Дигидроксиацетонфосфат + НАДН + Н⁺ <=> Глицерол-3-фосфат + НАД⁺.

Рис. Глицеролфосфатный челночный механизм. Объяснение в тексте.

Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через митохонд-риальную мембрану. Внутри митохондрии другая (митохондриальная) глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент) снова окисляет глицерол-3-фосфат до диоксиацетонфосфата:

Глицерол-3-фосфат + ФАД <=> Диоксиацетонфосфат + ФАДН₂.

Восстановленный флавопротеин (фермент-ФАДН₂) вводит на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования, а диоксиаце-тонфосфат выходит из митохондрий в цитоплазму и может вновь взаимодействовать с цитоплазматическим НАДН + Н⁺. Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН + Н⁺), вводимая в дыхательную цепь с помощью глицеролфосфатного челночного механизма, дает не 3, а 2 АТФ.

Рис. Малат-аспартатная челночная система для переноса восстанавливающих эквивалентов от цитозольного НАДН в митохондриальный матрикс.

В дальнейшем было показано, что с помощью данного челночного механизма лишь в скелетных мышцах и мозге осуществляется перенос восстановленных эквивалентов от цитозольного НАДН + Н⁺ в митохондрии. В клетках печени, почек и сердца действует более сложная малат-ас-партатная челночная система. Действие такого челночного механизма становится возможным благодаря присутствию малатдегидрогеназы и ас-партатаминотрансферазы как в цитозоле, так и в митохондриях. Установлено, что от цитозольного НАДН + Н⁺ восстановленные эквиваленты сначала при участии фермента малатдегидрогеназы переносятся на цитозольный оксалоацетат. В результате образуется малат, который с помощью системы, транспортирующей дикарбоновые кислоты, проходит через внутреннюю мембрану митохондрии в матрикс. Здесь малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД⁺ восстанавливается в НАДН + Н⁺, который может теперь передавать свои электроны в цепь дыхательных ферментов, локализованную на внутренней мембране митохондрии. В свою очередь образовавшийся оксалоацетат в присутствии глутамата и фермента АсАТ вступает в реакцию трансаминирования. Образующиеся аспарат и α-кетоглутарат с помощью специальных транспортных систем способны проходить через мембрану митохондрий. Транспортирование в цитозоле регенерирует оксалоацетат, что вызывает к действию следующий цикл. В целом процесс включает легкообратимые реакции, происходит без потребления энергии, «движущей силой» его является постоянное восстановление НАД⁺ в цитозоле гли-церальдегид-3-фосфатом, образующимся при катаболизме глюкозы. Итак, если функционирует малат-аспартатный механизм, то в результате полного окисления одной молекулы глюкозы может образоваться не 36, а 38 молекул АТФ.

 

БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ: БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ТКАНЕВОЕ ДЫХАНИЕ. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ. ХЕМИОСМОТИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ. ИНГИБИТОРЫ И РАЗОБЩИТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

 

БИОЭНЕРГЕТИКА

С позиций термодинамики метаболизм представляет собой совокупность процессов, в которой реакции, потребляющие энергию из внешней среды (эндэргонические), сопрягаются с энергодающими (экзэргоническими) реакциями, что позволяет живым существам оказывать постоянное сопротивление нарастанию энтропии. Выяснение биохимических механизмов, приводящих к генерации различных форм биологической энергии, является предметом биоэнергетики. Источником энергии служат реакции, в ходе которых соединения, содержащие атомы углерода в высо-ковосстановленном состоянии, подвергаются окислению , а специальные дыхательные переносчики присоединяют протоны и электроны (восстанавливаются) и в таком виде транспортируют атомы водорода к дыхательной цепи.

Роль АТФ в биоэнергетике

I. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Процессы катаболизма в клетках животных сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. В результате этих реакций происходит освобождение энергии, которая необходима организмам в процессах жизнедеятельности для осуществления различных видов работы. Небиологические системы могут совершать работу за счёт тепловой энер-

гии, биологические системы функционируют в изотермическом режиме и для осуществления процессов жизнедеятельности используют химическую энергию. Изучением превращений энергии, сопровождающих химические реакции, занимается биоэнергетика, или биохимическая термодинамика.

СВОБОДНАЯ ЭНЕРГИЯ И ЗАКОНЫ ТЕРМОДИНАМИКИ

Живые организмы с точки зрения термодинамики – открытые системы. Между системой и окружающей средой возможен обмен энергии, который происходит в соответствии с законами термодинамики.

1. Законы термодинамики

Первый закон – закон сохранения энергии; его можно сформулировать так: общая энергия системы и окружающей среды – величина постоянная.

Внутри рассматриваемой системы энергия может переходить от одной её части к другой или превращаться из одной формы в другую.

Второй закон гласит, что все физические и химические процессы в системе стремятся к необратимому переходу полезной энергии в хаотическую, неуправляемую форму. Мерой перехода или неупорядоченности системы служит величина, называемая энтропией (S), она достигает максимума, когда система приходит в истинное равновесие с окружающей средой.

2. Свободная энергия

Каждое органическое соединение, поступающее в организм извне или входящее в состав живой материи, обладает определённым запасом внутренней энергии (Е). Часть этой внутренней энергии может быть использована для совершения полезной работы. Такую энергию системы называют свободной энергией (G).

При постоянных температуре и давлении соотношение между изменением свободной энер гии системы (ΔG) и изменением энтропии (ΔS) можно представить следующим уравнением: ΔG = ΔН – TxS, где ΔН – изменение энтальпии (внутренней энергии или теплоты, содержащейся в системе); Т – абсолютная температура. В условиях, при которых протекают биохимические реакции, АН приблизительно равно ΔЕ (изменению внутренней энергии системы в результате реакции). Для биологических систем измерение свободной энергии производят обычно при стандартных условиях, когда рН 7,0, температура 25 ?C, все растворы находятся в концентрации 1 моль/л, а все газы при давлении в 1 атм.

Рис. Общая схема обмена веществ и энергии. 1 – пищеварение; 2 – катаболизм; 3 – анаболизм; 4 – распад структурно-функциональных компонентов клеток; 5 – экзергонические реакции; 6, 7 – эндерго-нические реакции; 8 – выведение из организма.

 

При стандартных условиях все функции обозначают как ΔG⁰‘, ΔS⁰‘ и ΔН⁰‘. Изменение стандартной свободной энергии (ΔG⁰‘) можно вычислить, зная константу равновесия (K’eq) химической реакции.

3. Эндергонические и экзергонические реакции

Направление химической реакции определяется значением AG. Если эта величина отрицательна, то реакция протекает самопроизвольно и сопровождается уменьшением свободной энергии. Такие реакции называют экзергоничес-кими. Если при этом абсолютное значение AG велико, то реакция идёт практически до конца, и её можно рассматривать как необратимую.

Если AG положительно, то реакция будет протекать только при поступлении свободной энергии извне; такие реакции называют эн-дергоническими.

Если абсолютное значение AG велико, то система устойчива, и реакция в таком случае практически не осуществляется. При AG, равном нулю, система находится в равновесии (табл.).

Таблица. Соотношение между величинами K’_eq и ΔG⁰‘ и направлением химических реакций

 

4. Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов в организме

В биологических системах термодинамически невыгодные (эндергонические) реакции могут протекать лишь за счёт энергии экзер-гонических реакций. Такие реакции называют энергетически сопряжёнными. Многие из этих реакций происходят при участии аденозинтрифосфата (АТФ), играющего роль сопрягающего фактора.

Рассмотрим подробнее энергетику сопряжённых реакций на примере фосфорилирования глюкозы.

Реакция фосфорилирования глюкозы свободным фосфатом с образованием глюкозо-6-фосфата является эндергонической:

(1) Глюкоза+ Н₃РО₄ → Глюкозо-6-фосфат + Н₂О (ΔG = +13,8 кДж/моль).

Для протекания такой реакции в сторону образования глюкозо-6-фосфата необходимо её сопряжение с другой реакцией, величина свободной энергии которой больше, чем требуется для фосфорилирования глюкозы.

(2) АТФ → АДФ + Н₃РО₄ (ΔG = -30,5 кДж/моль).

При сопряжении процессов (1) и (2) в реакции, катализируемой гексокиназой (см. раздел 7), фосфорилирование глюкозы легко протекает в физиологических условиях; равновесие реакции

сильно сдвинуто вправо, и она практически необратима:

(3) Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ (ΔG = -16,7 кДж/моль).

 

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ФОСФАТОВ. ЦИКЛ АТФ-АДФ

В живых организмах существует целая группа органических фосфатов, гидролиз которых приводит к освобождению большого количества свободной энергии. Такие соединения называют высокоэнергетическими фосфатами (табл.).

Как видно из таблицы, разные фосфорилированные соединения обладают разным запасом свободной энергии. К группе высокоэнергетических фосфатов, помимо АТФ, относят енолфосфаты, ангидриды и фосфогуанидины. Соединения, расположенные в нижней части таблицы, составляют группу низкоэнергетических фосфатов.

 

Таблица. Свободная энергия гидролиза некоторых органических фосфатов

 

Центральное место среди этих соединений занимает АТФ (рис.).

Рис. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

 

В молекуле АТФ две высокоэнергетические (макро-эргические) связи β и γ; они обозначены на рисунке знаком ~ (тильда).

АТФ – молекула, богатая энергией, поскольку она содержит две фосфоангидридные связи (β, γ). При гидролизе концевой фосфоангидридной связи АТФ превращается в АДФ и ортофосфат P_i. При этом изменение свободной энергии составляет -7,3 ккал/моль. При условиях, существующих в клетке в норме (рН 7,0, температура 37°C), фактическое значение ΔG⁰‘ для процесса гидролиза составляет около -12 ккал/моль. Величина свободной энергии гидролиза АТФ делает возможным его образование из АДФ за счёт переноса фосфатного остатка от таких высокоэнергетических фосфатов, как, например, фосфоенолпируват или 1,3-бисфосфоглицерат; в свою очередь, АТФ может участвовать в таких эндергонических реакциях, как фосфорилирование глюкозы или глицерина. АТФ выступает в роли донора энергии в эндергонических реакциях многих анаболических процессов. Некоторые биосинтетические реакции в организме могут протекать при участии других нуклеозидтрифос-фатов, аналогов АТФ; к ним относят гуанозин-трифосфат (ГТФ), уридинтрифосфат (УТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Все эти нуклеотиды, в свою очередь, образуются при использовании свободной энергии концевой фосфатной группы АТФ. Наконец, за счёт свободной энергии АТФ совершаются различные виды работы, лежащие в основе жизнедеятельности организма, например, такие как мышечное сокращение или активный транспорт веществ.

Таким образом, АТФ – главный, непосредственно используемый донор свободной энергии в биологических системах. В клетке молекула АТФ расходуется в течение одной минуты после её образования. У человека количество АТФ, равное массе тела, образуется и разрушается каждые 24 ч.

Использование АТФ как источника энергии возможно только при условии непрерывного синтеза АТФ из АДФ за счёт энергии окисления органических соединений (рис.).

Рис. Цикл АТФ-АДФ.

 

Цикл АТФ-АДФ – основной механизм обмена энергии в биологических системах, а АТФ – универсальная «энергетическая валюта».

 

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ

Под окислением понимают отщепление электронов, а под восстановлением – присоединение электронов. Окисление донора электронов всегда сопровождается восстановлением акцептора электронов. Этот принцип окислительно-восстановительных процессов применим и к биохимическим системам. В любой окислитель-но-восстановительной реакции участвует акцеп-тор электронов (окислитель) и донор электронов (восстановитель). Например:

(1) Си + О → Cu²⁺O^2-.

Суммарную реакцию (1) можно условно разделить на 2 полуреакции (2), (3):

(2) Cu – 2e → Cu²+. (3) О + 2е → О^2-.

В каждой из них участвует окисленная и восстановленная форма одного соединения; их называют сопряжённой парой, или редокс-парой.

Разные редокс-пары обладают различным сродством к электрону. Те, у которых это сродство меньше, отдают электрон тем, у кого оно больше. Мерой сродства редокс-пары к электрону служит окислительно-восстановительный потенциал, или редокс-потенциал (Е₀‘), величина которого непосредственно связана с изменением свободной энергии. Величину Е₀‘ выражают в вольтах; чем она меньше (отрицательнее), тем меньше сродство вещества к электронам. Чем больше сродство, тем больше восстановительный потенциал.

Редокс-потенциалы Е₀‘ связаны с изменением свободной энергии уравнением Нернста:

AG⁰‘ = – nF ΔЕ₀ ‘

где- число перенесённых в реакции электронов; F – постоянная Фарадея (23 061 ккал В^-1моль^-1); ΔЕ_о‘ – разность редокс-потенциалов электрон-донорной и электрон-акцепторной пар.

Величина ΔЕ_о‘ – стандартная величина окислительно-восстановительного потенциала; её определяют в стандартных условиях, когда концентрации всех веществ равны 1 М, давление газов составляет 1 атм, а рН 7,0

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ КАТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Энергия освобождается в процессе ферментативного окисления метаболитов специфическими дегидрогеназами. В реакциях дегидрирования электроны и протоны переходят от органических субстратов на коферменты NAD- и FAD-зависимых дегидрогеназ. Электроны, обладающие высоким энергетическим потенциалом, передаются от восстановленных коферментов NADH и FADH₂ к кислороду через цепь переносчиков, локализованных во внутренней мембране митохондрий. Восстановление молекулы О₂ происходит в результате переноса 4 электронов. При каждом присоединении к кислороду 2 электронов, поступающих к нему по цепи переносчиков, из матрикса поглощаются 2 протона, в результате чего образуется молекула Н₂О.

Окисление органических веществ в клетках, сопровождающееся потреблением кислорода и синтезом воды, называют тканевым дыханием, а цепь переноса электронов (ЦПЭ) – дыхательной цепью.

Электроны, поступающие в ЦПЭ, по мере их продвижения от одного переносчика к другому теряют свободную энергию. Значительная часть этой энергии запасается в форме АТФ, а часть энергии рассеивается в виде тепла. Кроме того, электроны с высоким энергетическим потенциалом, возникающие при окислении различных субстратов, могут быть использованы в реакциях биосинтеза, для которых помимо АТФ требуются восстановительные эквиваленты, например NADPH.

ФЕРМЕНТЫ И КОФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЯХ

Перенос электронов от окисляемых субстратов к кислороду происходит в несколько этапов. В нём участвует большое количество промежуточных переносчиков, каждый из которых способен присоединять электроны от предыдущего компонента и передавать следующему. Так возникает цепь окислительно-восстановительных реакций, в результате чего происходят восстановление О₂ и синтез Н₂О. В дыхательную цепь митохондрий входит большое число переносчиков (рис.).

 

Рис. Митохондриальная цепь переноса электронов. Комплекс I содержит FMN и не менее пяти железо-серных белков (FeS). Комплекс III включает две разные формы цитохрома b (с максимумами поглощения 562 и 566), один FeS-белок и цитохром с₁. Комплекс IV содержит цитохромы а и а₃ и два иона меди. Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа). Комплекс V – АТФ-синтаза.

За исключением убихинона (КоQ), все компоненты ЦПЭ – белки. В составе этих белков содержатся различные небелковые компоненты: FMN, Fе в составе железо-серных белков и в составе порфириновых колец, ионы Cu.

1. Первичные акцепторы водорода

Первичные акцепторы водорода окислительно-восстановительных реакций относят к 2 типам де-гидрогеназ: никотинамидзависимым, содержащим в качестве коферментов производные никотиновой кислоты, и флавинзависимым, содержащим производные рибофлавина.

Никотинамидзависимые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов NAD⁺ или NADР⁺ (см. раздел 2). NAD⁺ и NADР⁺ – производные витамина РР. Эти коферменты входят в состав активных центров дегидрогеназ, но могут обратимо диссоциировать из комплекса с апофер-ментами и включаются в состав фермента в ходе реакции. Субстраты NAD- и NADР-зависимых дегидрогеназ находятся в матриксе митохондрий и в цитозоле. Рабочей частью никотинамидных коферментов служит никотинамид (рис.).

Рис. Структурные формулы рабочей части коферментов NAD⁺ и NADP⁺. В окисленной форме никотинамид-ные коферменты обозначают как NAD⁺ и NADP⁺, так как они несут положительный заряд на атоме азота пиридинового кольца. В реакциях дегидрирования из двух атомов водорода, отщепляемых от окисляемого субстрата, никотинамидное кольцо присоединяет ион водорода и два электрона в форме гидрид-иона (:Н^–). Второй ион переходит в среду. В обратной реакции NADH (NADPH) выступают в качестве доноров электронов и протонов.

Большинство дегидрогеназ, поставляющих электроны в ЦПЭ, содержат NAD⁺. Они катализируют реакции типа:

R-CHOH-R₁ + NAD⁺ ↔ R-CO-R₁ + NADH + H⁺.

Таким образом, NAD⁺, присоединяя протоны и электроны от различных субстратов, служит главным коллектором энергии окисляемых веществ и главным источником электронов, обладающих высоким энергетическим потенциалом, для ЦПЭ.

NADРН не является непосредственным донором электронов в ЦПЭ, а используется почти исключительно в восстановительньгх биосинтезах. Однако возможно включение электронов с NADPH в ЦПЭ благодаря действию пиридиннуклеотид трансгидрогеназы, катализирующей реакцию:

NADPH + NAD⁺ ↔ NADP⁺ + NADH.

Флавиновые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов FAD или FMN. Эти коферменты образуются в организме человека из витамина В₂. Флавиновые коферменты прочно связаны с апоферментами. Рабочей частью FAD и FMN служит изоаллоксазиновая сопряжённая циклическая система (рис.).

Рис. Структурные формулы рабочей части коферментов FAD и FMN. В ходе реакции FAD и FMN присоединяют 2 электрона и, в отличие от NAD⁺, оба теряемых субстратом протона.

 

FAD служит акцептором электронов от многих субстратов в реакциях типа:

R-CH₂-CH₂-R₁ + E (FAD) ↔ R-CH=CH-R₁ + E (FADH₂),

где Е – белковая часть фермента.

Большинство FAD-зависимых дегидрогеназ – растворимые белки, локализованные в матриксе митохондрий. Исключение составляет сукци-натдегидрогеназа, находящаяся во внутренней мембране митохондрий. К FMN-содержащим

ферментам принадлежит NADH-дегидрогена-за, которая также локализована во внутренней мембране митохондрий; она окисляет NADH, образующийся в митохондриальном матриксе.

2. Цепь переноса электронов от NADH и FADH₂ на кислород

Перенос электронов от NADH к О₂ включает ряд переносчиков, которые локализованы во внутренней мембране митохондрий. За исключением убихинона и цитохрома С, это сложные белковые комплексы.

NADH-дегидрогеназа (NADH-Q-редуктаза, комплекс I) состоит из нескольких полипептидных цепей. Роль простетической группы играет FMN. Единственный субстрат фермента – NADH, с которого 2 электрона и протон переносятся на FMN с образованием FMNH₂. Второй протон поглощается из матрикса. Реакция протекает по уравнению:

NADH + H⁺ + Е (FMN) → NAD⁺ + Е (FMNH₂).

 

С FMNH₂ электроны переносятся затем на ряд железо-серных белков (FeS), играющих роль второй простетической группы в молекуле NADН-дегидрогеназы. Атомы железа в этих белках (негемовое железо) собраны в несколько групп, так называемых железо-серных центров. FeS-центры входят в состав многих белков (флавопротеинов, цитохромов), участвующих в окислительно-восстановительных реакциях. Известны 3 типа FeS-центров (FeS, Fe₂S₂, Fe₄S₄), в которых атом железа связан с атомом серы остатков цистеина или неорганической серы. Строение железо-серных центров показано на рис.

Рис. Строение железо-серных центров. I – FeS-центр; атом железа связан координационными связями с четырьмя атомами серы, принадлежащими четырём остаткам цистеина в белке. II – Fe₂S₂-центр; каждый из двух атомов железа связан координационными связями с двумя атомами неорганической серы и двумя остатками цистеина в белке; III – Fe₄S₄-центр; четыре атома железа связаны с четырьмя атомами серы и четырьмя остатками цистеина в белке. Атомы железа в FeS-центрах могут находиться в окисленном (Fe³+) или восстановленном (Fe²+) состоянии.

NADН-дегидрогеназа содержит несколько центров типа Fe₂S₂ и Fe₄S_4. Атомы железа в таких центрах могут принимать и отдавать электроны поочерёдно, переходя в ферро- (Fe²+) и ферри-(Fe³+) состояния. От железо-серных центров электроны переносятся на кофермент Q (убихинон) (рис.).

Рис. Структура убихинона (кофермента Q). n – число изопреноидных звеньев. Убихинон может принимать один электрон и превращаться в семихинон или 2 электрона и полностью восстанавливаться в гидрохинон (убихинол).

Обозначение этого жирорастворимого хинона происходит от первой буквы английского названия хинона (quinone), а название убихинон отражает его широкую распространённость в природе (ubiquitous – вездесущий). Молекулы убихинона в зависимости от источника, из которого они выделены, различаются длиной углеводородной цепи, которая у млекопитающих содержит 10 изопреноидных звеньев и обозначается как Q₁₀. В процессе переноса электронов с NADН-дегидрогеназы через FeS на убихинон он обратимо превращается в гидрохинон. Убихинон выполняет коллекторную функцию, присоединяя электроны от NADН-дегидрогеназы и других флавинзависимых дегидрогеназ, в частности, от сукцинатдегидрогеназы. Убихинон участвует в реакциях типа:

Е (FMNH₂) + Q → E (FMN) + QH₂.

Цитохромы или гемопротеины присутствуют во всех типах организмов. В клетках эукариотов они локализованы в митохондриальных мембранах и в ЭР. Известно около 30 различных цитохромов. Все цитохромы в качестве простетической группы содержат гем (см. раздел 1). Их многообразие обусловлено:

• различием боковых цепей в структуре гема;

• различием в структуре полипептидных цепей;

• различием в способе связи полипептидных цепей с гемом.

В зависимости от способности поглощать свет в определённой части спектра все цитохромы делят на группы а, b, с. Внутри каждой группы отдельные виды с уникальными спектральными свойствами обозначают цифровыми індексами ^{(b, b}1^{, b}2 ^{и т.д.).}

Структурные особенности разных видов цитохромов определяют различие в их окислительно-восстановительных потенциалах. В ЦПЭ участвуют 5 типов цитохромов (a, a₃, b, с, с₁).

За исключением цитохрома с, все цитохромы находятся во внутренней мембране митохондрий в виде сложных белковых комплексов (табл.).

Таблица. Компоненты митохондриальной цепи переноса электронов

 

QН₂-дегидрогеназа (коэнзим Q-цитохром с-редуктаза, комплекс III) состоит из 2 типов цитохромов (b₁ и b₂) и цитохрома с₁. QН₂-дегидрогеназа переносит электроны от убихинола на цитохром с. Внутри комплекса III электроны передаются от цитохромов b на FeS-центры, на цитохром с₁, а затем на цитохром с. Группы гема, подобно FeS-центрам, переносят только по одному электрону. Таким образом, от молекулы 2 электрона переносятся на 2 молекулы цитохромов b. В качестве промежуточного продукта в этих реакциях переноса электронов возможно образование свободного радикала семихинона. В цитохромах типа b гем не связан ковалентно с белком, а в цитохромах с₁ и с он присоединяется к белку при помощи тиоэфир-ных связей (рис.).

Рис. Структура гема цитохромов b, с, с₁.

 

Эти связи образуются путём присоединения 2 цистеиновых остатков к винильным группам гема.

Цитохром с – периферический водорастворимый мембранный белок с молекулярной массой 12 500 Д, имеющий одну полипептидную цепь из 100 аминокислотных остатков, и молекулу гема, ковалентно связанную с полипептидом.

Цитохромоксидаза (комплекс IV) состоит из 2 цитохромов типа аа_3, каждый из которых имеет центр связывания с кислородом. Цитохромы а и а₃ имеют характерную железопорфириновую простетическую группу, называемую гемом А и отличающуюся от гема цитохромов с и с₁ (рис. 6-10). Он содержит формильную группу вместо одной из метильных групп и углеводородную цепь вместо одной из винильных групп.

Другая особенность комплекса а-а₃ – наличие в нём ионов меди, связанных с белковой частью в так называемых СиА-центрах. Перенос электронов комплексом a-а₃, включает реакции:

Cu⁺ ↔ Cu²⁺ + е,

Fe²⁺ ↔ Fe³⁺ + e.

Комплекс цитохромов а-а₃ непосредственно реагирует с молекулярным кислородом.

ОРГАНИЗАЦИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В МИТОХОНДРИЯХ

Основные переносчики электронов встроены во внутреннюю мембрану митохондрий и организованы в 4 комплекса, расположенных в определённой последовательности (векторно). В этой последовательности их стандартные окислительно-восстановительные потенциалы становятся более положительными по мере приближения к кислороду Каждое звено этой цепи специфично в отношении донора и акцептора электронов.

На первом этапе дегидрогеназы катализируют отщепление водорода от различных субстратов. Если субстратами служат α-гид-роксикислоты малат, изоцитрат, 3-гидрокси-бутират, водород переносится на NAD+. Образовавшийся NADH в дыхательной цепи, в свою очередь, окисляется NADH-дегидро-геназой (комплекс I).

Если субстратом служат такие соединения, как сукцинат или глицерол-3-фосфат, акцептором водорода служат FAD-зависимые дегидрогеназы. От NADH и FADH₂ электроны и протоны передаются на убихинон и далее через цепь цитохромов к молекулярному кислороду.

До сих пор точно неизвестно, каким образом расположены все переносчики электронов дыхательной цепи. Однако установлено, что в расположении дыхательных комплексов существует определённая асимметрия: некоторые из белков-переносчиков находятся ближе к той стороне внутренней мембраны, которая обращена к матриксу, а другие – к противоположной; некоторые белки пронизывают мембрану насквозь.

ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ АДФ

Так как электроны всегда стремятся переходить от электроотрицательных систем к электроположительным, их транспорт по ЦПЭ к кислороду сопровождается снижением свободной энергии.

Вместе с тем в дыхательной цепи можно выделить 3 участка, в которых перенос электронов сопровождается относительно большим снижением свободной энергии Эти этапы способны обеспечить энергией синтез АТФ, так как количество выделяющейся свободной энергии приблизительно равно энергии, необходимой для синтеза АТФ из AДФ и фосфата. Экспериментально было подтверждено, что процесс переноса электронов по ЦПЭ и синтез АТФ энергетически сопряжены.

Первый процесс – перенос электронов от восстановленных коферментов NADH и FADH₂ через ЦПЭ на кислород – экзергонический. Например:

NADH + H⁺ + 1/2 O₂ → NAD⁺ + H₂O + 52 ккал/моль(=220 кДж/моль).

Второй процесс – фосфорилирование AДФ, или синтез АТФ, – эндергонический:

АДФ + Н₃РО₄+7,3 ккал/моль (30,5 кДж/моль) = АТФ + Н₂О.

Синтез АТФ из АДФ и Н₃РО₄ за счёт энергии переноса электронов по ЦПЭ называют окислительным фосфорилированием.

МЕХАНИЗМ СОПРЯЖЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Каким же образом осуществляется сопряжение этих двух процессов? Наиболее обоснованный ответ на этот вопрос даёт хемиосмотическая теория Митчелла, предложенная им в 1961 г. Основные положения были подтверждены и разработаны детально совместными усилиями многих исследователей в последующие годы.

1. Протонный градиент и электрохимический потенциал

Перенос электронов по дыхательной цепи от NADH к кислороду сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. На эту работу затрачивается часть энергии электронов, переносимых по ЦПЭ.

Протоны, перенесённые из матрикса в межмембранное пространство, не могут вернуться обратно в матрикс, так как внутренняя мембрана непроницаема для протонов. Таким образом, создаётся протонный градиент, при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше, а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несёт положительный заряд, и вследствие этого появляется разность потенциалов по обе стороны мембраны: отрицательный заряд на внутренней стороне и положительный – на внешней. В совокупности электрический и концентрационный градиенты составляют электрохимический потенциал ΔμН⁺ – источник энергии для синтеза АТФ. Так как наиболее активный транспорт протонов в межмембранное пространство, необходимый для образования ΔμН⁺, происходит на участках ЦПЭ, соответствующих расположению комплексов I, III и IV, эти участки называют пунктами сопряжения дыхания и фосфорилирования (рис.).

 

Рис. Сопряжение дыхания и синтеза АТФ в митохондриях. I – NADH-дегидрогеназа; II – сукцинат дегидрогеназа; III – QH₂-дегидрогеназа; IV – цитохромоксидаза; V – ЛТФ-синтаза. Энергия протонного потенциала (электрохимического потенциала ΔμН⁺) используется для синтеза АТФ, если протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы.

 

Механизм транспорта протонов через митохондриальную мембрану в пунктах сопряжения недостаточно ясен. Однако установлено, что важную роль в этом процессе играет KoQ. Наиболее детально механизм переноса протонов при участии KoQ изучен на уровне комплекса III (рис.).

Рис. Сопряжение переноса электронов через дыхательный комплекс III с транспортом H⁺ через мембрану. Восстановленный убихинон (QH₂) взаимодействует с Fe³⁺ гема b₁ и, восстанавливая его, освобождает протон в водную фазу, превращаясь в семихинон (HQ*). Электрон от гема b₁ переносится на Fe³⁺ гема b₂. HQ* отдаёт второй электрон на FeS-центр, расположенный ближе к наружной поверхности мембраны; при этом второй протон оказывается в межмембранном пространстве; электрон передаётся на цитохром с₁, а далее на цитохром с. Окисленный Q диффундирует к внутренней стороне мембраны, где получает электрон от гема b₂ и протон из матрикса, превращаясь в HQ*. HQ* получает электрон от комплекса I и протон из матрикса; в мембране образуется QH₂, и весь процесс повторяется сначала.

 

KoQ переносит электроны от комплекса I к комплексу III и протоны из матрикса в межмембранное пространство, совершая своеобразные циклические превращения, называемые Q-циклами. Донором электронов для комплекса III служит восстановленный убихинон (QH₂), а акцептором – цитохром с. Цитохром с находится с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий; там же располагается активный центр цитохрома с₁, с которого электроны переносятся на цитохром с.

В мембране существует стационарный общий фонд Q/QH₂, из которого каждая молекула QH₂ в одном цикле обеспечивает перенос протонов из матрикса в межмембранное пространство и электронов, которые в конечном итоге поступают на кислород. На работу, совершаемую при выкачивании протонов, расходуется часть свободной энергии, которая освобождается при переносе электронов по градиенту редокс-по-тенциала. Энергия электрохимического потенциала (ΔμН⁺) используется для синтеза АТФ, если протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы.

2. Строение АТФ-синтазы и синтез АТФ

АТФ-синтаза (Н+-АТФ-аза) – интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из 2 белковых комплексов, обозначаемых как F₀ и F₁ (рис.).

Рис. Строение и механизм действия АТФ-синтазы. А – F₀ и F₁ – комплексы АТФ-синтазы. В состав F₀ входят полипептидные цепи, которые образуют канал, пронизывающий мембрану насквозь. По этому каналу протоны возвращаются в матрикс из межмембранного пространства; белок F₁ выступает в матрикс с внутренней стороны мембраны и содержит 9 субъединиц, 6 из которых образуют 3 пары α и β («головка»), прикрывающие стержневую часть, которая состоит из 3 субъединиц γ, δ и ε. γ и ε подвижны и образуют стержень, вращающийся внутри неподвижной головки и связанный с комплексом F₀. В активных центрах, образованных парами субъединиц α и β, происходит связывание AДФ, неорганического фосфата (Р) и АТФ. Б – Каталитический цикл синтеза АТФ включает 3 фазы, каждая из которых проходит поочерёдно в 3 активных центрах: 1 – связывание АДФ и Н₃РО₄; 2 – образование фосфоангидридной связи АТФ; 3 – освобождение конечного продукта. При каждом переносе протонов через канал F0 в матрикс все 3 активных центра катализируют очередную фазу цикла. Энергия электрохимического потенциала расходуется на поворот стержня, в результате которого циклически изменяется конформация α- и β-субъединиц и происходит синтез АТФ.

Гидрофобный комплекс F₀ погружён в мембрану. Он служит основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране. Комплекс F₀ состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны переносятся в матрикс.

Комплекс F₁ выступает в митохондриальный матрикс. Он состоит из 9 субъединиц (3α, 3β, γ, ε, δ). Субъединицы α и β уложены попарно, образуя «головку»; между α- и β-субъединицами располагаются 3 активных центра, в которых происходит синтез АТФ; γ-, ε-, δ- субъединицы связывают комплекс F₁ с F₀.

Повышение концентрации протонов в межмембранном пространстве активирует АТФ-синтазу. Электрохимический потенциал ΔμН⁺ заставляет протоны двигаться по каналу АТФ-синтазы в матрикс. Параллельно под действием ΔμН⁺ происходят конформационные изменения в парах α, β-субъединиц белка F₁, в результате чего из AДФ и неорганического фосфата образуется АТФ. Электрохимический потенциал,

генерируемый в каждом из 3 пунктов сопряжения в ЦПЭ, используют для синтеза одной молекулы АТФ.

3. Коэффициент окислительного фосфорилирования

Окисление молекулы NADH в ЦПЭ сопровождается образованием 3 молекул АТФ; электроны от FAD-зависимых дегидрогеназ поступают в ЦПЭ на KoQ, минуя первый пункт сопряжения. Поэтому образуются только 2 молекулы АТФ. Отношение количества фосфорной кислоты (Р), использованной на фосфорилирование AДФ, к атому кислорода (О), поглощённого в процессе дыхания, называют коэффициентом окислительного фосфорилирования и обозначают Р/О. Следовательно, для NADH Р/О = 3, для сукцината Р/О = 2. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза АТФ, фактически эта величина меньше.

4. Дыхательный контроль

Окисление субстратов и фосфорилирование AДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов в ЦПЭ. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду.

С другой стороны, расход АТФ и превращение его в AДФ увеличивает окисление субстратов и поглощение кислорода. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации AДФ называют дыхательным контролем. Механизм дыхательного контроля характеризуется высокой точностью и имеет важное значение, так как в результате его действия скорость синтеза АТФ соответствует потребностям клетки в энергии. Запасов АТФ в клетке не существует. Относительные концентрации АТФ/АДФ в тканях изменяются в узких пределах, в то время как потребление энергии клеткой, т.е. частота оборотов цикла АТФ и AДФ, может меняться в десятки раз.

Общее содержание АТФ в организме 30-50 г, но каждая молекула АТФ в клетке «живёт» меньше минуты. В сутки у человека синтезируется 40-60 кг АТФ и столько же распадается. Увеличение концентрации AДФ немедленно приводит к ускорению дыхания и фосфорилирования.

 

ТРАНСПОРТ АТФ И АДФ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ

В большинстве эукариотических клеток синтез основного количества АТФ происходит внутри митохондрии, а основные потребители АТФ расположены вне её. С другой стороны, в матриксе митохондрий должна поддерживаться достаточная концентрация AДФ. Эти заряженные молекулы не когут самостоятельно пройти через липидный слой мембран. Внутренняя мембрана непроницаема для заряженных и гидрофильных веществ, но в ней содержится определённое количество транспортёров, избирательно переносящих подобные молекулы из цитозоля в матрикс и из матрикса в цитозоль.

В мембране есть белок АТФ/AДФ-антипортер, осуществляющий перенос этих метаболитов через мембрану (рис.).

Рис. Схема трансмембранного переноса веществ за счёт энергии АцН. Потоки различных веществ (АТФ, AДФ, Н₃РО₄, Са²⁺) проходят через специфические транспортёры, при этом затрачивается энергия электрохимического потенциала мембраны.

 

Молекула АДФ поступает в митохондриальный матрикс только при условии выхода молекулы АТФ из матрикса.

Движущая сила такого обмена – мембранный потенциал переноса электронов по ЦПЭ. Расчёты показывают, что на транспорт АТФ и AДФ расходуется около четверти свободной энергии протонного потенциала. Другие транспортёры тоже могут использовать энергию электрохимического градиента. Так переносится внутрь митохондрии неорганический фосфат, необходимый для синтеза АТФ. Непосредственным источником свободной энергии для транспорта Са²⁺ в матрикс также служит протонный потенциал, а не энергия АТФ.

Биологические виды энергии. Энергетические превращения в живой клетке подразделяют на две группы: локализованные в мембранах и протекающие в цитоплазме. В каждом случае для «оплаты» энергетических затрат используется своя «валюта»: в мембране это ΔμН⁺ или ΔμNa⁺, а в цитоплазме – АТФ, креатинфосфат и другие макроэргические соединения. Непосредственным источником АТФ являются процессы субстратного и окислительного фосфорилирования. Процессы субстратного фосфорилирования наблюдаются при гликолизе и на одной из стадий цикла трикарбоновых кислот (реакция сукцинил-КоА —> сукцинат; см. главу 10). Генерация ΔμН⁺ и ΔμNa , используемых для окислительного фосфорилирования, осуществляется в процессе транспорта электронов в дыхательной цепи энергосопрягающих мембран.

Энергия разности потенциалов на сопрягающих мембранах может обратимо превращаться в энергию АТФ. Эти процессы катализируются Н⁺-АТФ-синтазой в мембранах, генерирующих протонный потенциал, или Na⁺-АТФ-синтазой (Na⁺-АТФазой) в «натриевых мембранах» алкалофильных бактерий, поддерживающих ΔμNa⁺ . На рис представлена схема энергетики живых клеток, использующих ΔμН⁺ в качестве мембранной формы конвертируемой энергии. На схеме видно, что свет или энергия субстратов дыхания утилизируется ферментами фотосинтетической или дыхательной редокс-цепи (у галобактерий – бактериородопсином). Генерируемый потенциал используется для совершения полезной работы, в частности для образования АТФ. Будучи макроэргическим соединением, АТФ выполнняет функцию аккумулирования биологической энергии и ее последующего использования для выполнения клеточных функций. «Макроэргичность» АТФ объясняется рядом особенностей его молекулы.

Химическая формула молекулы АТФ

Это прежде всего высокая плотность зарядов, сконцентрированная в «хвосте» молекулы, обеспечивающая легкость диссоциации терминального фосфата при водном гидролизе. Продукты этого гидролиза представляют собой АДФ и неорганический фосфат и далее – АМФ и неорганический фосфат. Это обеспечивает высокую величину свободной энергии гидролиза терминального фосфата АТФ в водной среде.

Взаимозаменяемость различных видов биологической энергии при выполнении клеточной работы

Красной стрелкой показана взаимозаменяемость в клетке двух клеточных видов энергии – АТФ и ΔμН⁺, для которых имеются также специальные буферные системы: креатинфосфат для АТФ (клетки животных) и градиент ионов Na (алкалофильные бактерии).

Тканевое дыхание и биологическое окисление. Распад органических соединений в живых тканях, сопровождающийся потреблением молекулярного кислорода и приводящий к выделению углекислого газа и воды и образованию биологических видов энергии, называется тканевым дыханием.

Тканевое дыханне – процесс поглощения тканями кислорода,

Который идет на окисление субстратов, и выделения СО₂  и Н₂О с образованием энергии

Схема строения дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий человека

http://www.youtube.com/watch?v=-_8aYKcQZ_Q&feature=related

Впервые сущность дыхания объяснил А.-Л. Лавуазье (1743-1794), обративший внимание на сходство между горением органических веществ вне организма и дыханием животных. Постепенно становились ясными принципиальные различия между этими двумя процессами: в организме окисление протекает при относительно низкой температуре в присутствии воды, и его скорость регулируется обменом веществ. В настоящее время биологическое окисление определяется как совокупность реакций окисления субстратов в живых клетках, основная функция которых – энергетическое обеспечение метаболизма. В развитие концепций биологического окисления в XX в. важнейший вклад внесли А.Н. Бах, О. Варбург, Г. Крепс, В.А. Энгельгардт, В.И. Палладин, В.А. Белицер, С.Е. Северин, В.П. Скулачев.

Потребление кислорода тканями зависит от интенсивности реакций тканевого дыхания. Наибольшей скоростью тканевого дыхания характеризуются почки, мозг, печень, наименьшей – кожа, мышечная ткань (в покое). Уравнение (2) описывает суммарный результат многоступенчатого процесса, приводящего к образованию молочной кислоты  и протекающего без участия кислорода:

С₆Н₁₂О_б = 2С₃Н₆О₃ + 65 кДж/моль. (2)

Этот путь отражает, по-видимому, энергетическое обеспечение простейших форм жизни, функционировавших в бескислородных условиях. Современные анаэробные микроорганизмы (осуществляющие молочнокислое, спиртовое и уксуснокислое брожение) получают для жизнедеятельности энергию, производимую в процессе гликолиза или его модификаций.

Использование клетками кислорода открывает возможности для более полного окисления субстратов. В аэробных условиях продукты бескислородного окисления становятся субстратами цикла трикарбоновых кислот (см. главу 10), в ходе которого образуются восстановленные дыхательные переносчики НАДФН, НАДН и флавиновые коферменты. Способность НАД⁺ и НАДФ⁺ играть роль промежуточного переносчика водорода связана с наличием в их структуре амида никотиновой кислоты. При взаимодействии этих кофакторов с атомами

 водорода имеет место обратимое гидрирование (присоединение атомов водорода):

Рис. Порядок расположения комплексов дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий

Субстраты тканевого дыхания подразделяются на 2 группы:

1.                НАД-зависимые – субстраты цикла Кребса изоцитрат, α-кетоглутарат и малат. Это также пируват, гидроксибутират и β–гидрокси-ацил~КоА, глутамат и некоторые другие аминокислоты. Водород от НАД-зависимых субстратов c помощью НАД-зависимых дегидрогеназ передаётся на I-й комплекс дыхательной цепи.

2.                ФАД-зависимые – сукцинат, глицерол-3-фосфат, ацил~КоА и некоторые другие. Водород от ФАД-зависимых субстратов передаётся на II-й комплекс дыхательной цепи.

При дегидрировании субстратов  НАД-зависимыми дегидрогеназами образуется восстановленная форма НАД (НАДH∙H⁺).

 

Указана окисленная форма кофермента НАД⁺. Этот кофермент является динуклеотидом (никотинамид–аденин–динуклеотид): в состав одного нуклеотида входит витамин РР (никотинамид), другой представляет собой АМФ. Способность кофермента играть роль промежуточного переносчика водородов связана с наличием в его структуре витамина РР. В электронно-протонной форме процесс обратимого гидрирования-дегидрирования может быть представлен уравнением (R- остальная часть кофермента):

 

НАДH∙H⁺ может образовываться не только в митохондриях, но и в цитозоле клетки при протекании определённых процессов метаболизма. Однако цитоплазматический кофермент не может проникать в митохондрии. Водород восстановленного кофермента должен быть сначала перенесен на субстраты, которые могут проникать в митохондрии. Такими «Н₂-переносящими субстратами» являются:

Оксалацетат → малат

Ацетоацетат → β-гидроксибутират

Дигидроксиацетон фосфат → глицерол-3-фосфат

НАДH∙H⁺ затем окисляется 1-м комплексом дыхательной цепи. Рассмотрим работу этого комплекса.

 

I комплекс цепи тканевого дыхания – НАДH∙H⁺-убихинон-оксидодуктаза.

 

Первый комплекс является самым большим в дыхательной цепи (представлен 23-30 субъединицами). Он катализирует перенос водорода от НАДH∙H⁺ на убихинон.

 

Рис. Первый комплекс дыхательной цепи

 

В его состав входят кофермент ФМН (флавинмононуклеотид) и железосерные белки, содержащие негеминовое железо. Функция этих белков заключается в разделении потока протонов и электронов: электроны переносятся от ФМН∙Н₂ к внутренней поверхности внутренней мембраны митохндрий (обращенной к матриксу), а протоны – к внешней поверхности внутренней мембраны и затем высвобождаются в митохондриальный метрикс. При транспорте протонов и электронов редокс-потенциал первого комплекса снижается на 0,38 v, что вполне достаточно для синтеза АТФ. Однако в самом комплексе АТФ не образуется, а высвобождающаяся в результате работы комплекса энергия аккумулируется (см. ниже образование электро-химического потенциала) и частично рассеивается в виде тепла. По своему строению ФМН – мононуклеотид, в котором азотистое основание представлено изоаллоксазиновым ядром рибофлавина, а пентозой является рибитол (иными словами, ФМН – это фосфорилированная форма витамина В₂).

 

Функция ФМН заключается в акцепции 2 атомов водорода от НАДH∙H⁺ и передачи их железосерным белкам. Водород (2 электрона и 2 протона) присоединяется к атомам азота изоаллоксазинового кольца, при этом происходит внутримолекулярная перегруппировка двойных связей с образованием промежуточного семихинона – соединения свободнорадикальной природы (на схеме представлено суммарное уравнение реакции, где R – остальная часть молекулы)

II комплекс цепи тканевого дыхания – сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза.

 

Этот комплекс имеет меньшую молекулярную массу и также содержит железосерные белки. Сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза катализирует перенос водорода от сукцината на убихинон. В состав комплекса входит кофермент ФАД (флавин-аденин-динуклеотид) и фермент сукцинатдегидрогеназа, который является одновременно ферментом цикла Кребса. Ацил~SКоА, 3-фосфо-глицерат и диоксиацетон фосфат также являются ФАД-зависимыми субстратами тканевого дыхания и с помощью этого кофермента контактируют со вторым комплексом.

Энергия включения водорода субстратов во II комплекс цепи тканевого дыхания рассеивается в основном в виде тепла, так как на этом участке цепи редокс-потенциал снижается незначительно и этой энергии для синтеза АТФ мало.

Процесс восстановления ФАД протекает аналогично таковому ФМН. Кофермент Q или убихинон – гидрофобное соединение, является компонентом клеточных мембран, содержится в большой концентрации, относится к группе витаминов. относится к группе витаминов. Убихинон (коэнзим Q). Убихинон – небольшая липофильная молекула, по химическому строению представляющая собой бензохинон с длинной боковой цепью (число изопреноидных единиц колеблется от 6 у бактерий до 10 у млекопитающих). В дыхательной цепи коэнзим Q является своеобразным депо (пулом) водорода, который он получает от различных флавопротеинов. Липофильный характер молекулы убихинона обуславливает его способность свободно перемещаться в липидной фазе митохондриальной мембраны, перехватывая протоны и электроны не только от I и II комплексов дыхательной цепи, но и захватывая из митохондриального матрикса протоны. При этом убихинон восстанавливается с образованием промежуточного свободнорадикального продукта – семихинона. Восстановленная форма убихинона – убихинол – передаёт протоны и электроны на III комплекс дыхательной цепи.Цитохромоксидаза имеет высокую степень сродства к кислороду и может работать при его низких концентрациях. аа_{3 –} состоит из 6 субъединиц каждая из которых содержит гем и атом меди. 2 субъединицы составляют цитохром а, а остальные 4 относятся к цитохрому а_3. Между НАД и ФП, b-c, a-a3 имеет место max перепад ОВП. Эти пункты являются местом синтеза АТФ (местом фосфорилирования АДФ).

III комплекс цепи тканевого дыхания – убихинол-цитохром С-оксидоредуктаза. В состав III комплекса входят цитохромы b и с₁, относящиеся к группе сложных белков хромопротеинов. Простетическая группа этих белков окрашена (chroma – краска) и близка по химическому строению к гему гемоглобина. Однако в противоположность гемоглобину и оксигемоглобину, в которых железо должно быть только в 2-х валентной форме, железо в цитохромах при работе дыхательной цепи переходит от двух- к трёхвалентному состоянию (и обратно). Как видно из названия, III комплекс переносит электроны от убихинола на цитохром С. Вначале электроны поступают на окисленную форму цитохрома b (Fe³⁺), который при этом восстанавливается (Fe²⁺), затем восстановленный цитохром b передаёт электроны окисленной форме цитохрома с, который также восстанавливается и, в свою очередь, передаёт электроны цитохрому С. митохондриальной мембраны от III комплекса к IV и обратно. При этом 1 молекула цитохрома С, попеременно окисляясь и восстанавливаясь, переносит 1 электрон.

IV комплекс дыхательной цепи – цитохромоксидаза.

 Комплекс назван оксидазой из-за способности непосредственно взаимодействовать с кислородом. У млекопитающих этот крупный (~ 200 kD) трансмембранный белок состоит из 6-13 субъединиц, из которых некоторые кодируются митохондриальной ДНК. В состав IV комплекса входят 2 хромопротена – цитохром а и цитохром а₃. В отличие от других цитохромов, цитохромы а и а₃ каждый содержат не только атом железа, но и атом меди. Медь в составе этих цитохромов при транспорте электронов также попеременно переходит в окисленное (Cu²⁺) и восстановленное (Cu⁺) состояние. Цитохромоксидаза катализирует одноэлектронное окисление 4-х восстановленных молекул цитохрома с и при этом одновременно осуществляет полное (4-х электронное) восстановление молекулы кислорода: 4 цитохрома с (Fe²⁺) + 4 H⁺ + O₂ 4 цитохрома с (Fe³⁺) + H₂O. Протоны для образования молекул воды поступают из матрикса. Следует заметить, что эта реакция весьма сложна и протекает через промежуточные стадии образования свободных радикалов кислорода. Окислительно-восстановительный потенциал IV комплекса является самым большим (+0,57 v), его энергии вполне достаточно для синтеза 3-х молекул АТФ, однако большая часть этой энергии используется на «перекачивание» протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. В связи с активным транспортом протонов цитохром с-оксидаза получила название «протонного насоса». 

Таким образом, тканевое дыхание представляет собой процесс транспорта электронов и протонов от НАД- или ФАД-зависимых субстратов на кислород, а также протонов, поставляемых матриксом митохондрий. При транспорте падает редокс-потенциал, что сопровождается высвобождением заключённой в субстратах тканевого дыхания энергии. Полное восстановление молекулярного кислорода воздуха в дыхательной цепи сопровождается образованием воды.

 Свободное и разобщенное дыхание. Теории сопряжения ОФ.

Окислительное фосфорилирование – один из механизмов образования АТФ

Транспорт электронов в дыхательной цепи сопряжён (связан) с образованием протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ. Этот процесс называется окислительным фосфорилированием. Иными словами, окислительное фосфорилировние – это процесс, в котором энергия биологического окисления превращается в химическую энергию АТФ. Образование протонного градиента (генерирование электрохимического потенциала). Хемиосмотическая теория Митчелла.

 

Ингибиторы цепи тканевого дыхания – это яды.

Ингибиторы дыхательной цепи являются ядами. Они в равной степени тормозят и дыхание, и фосфорилирование, соотношение Р/О при этом не изменяется. Наиболее популярными являются следующие ингибиторы: ротенон (растительный токсин, применяемый индейцами Амазонии при ловле рыбы, а также используемый в качестве инсектицида), амитал (аминобарбитал – производное барбитуровой кислоты), антимицин А (антибиотик) и цианиды. Ротенон и амитал тормозят перенос водорода от ФМН к убихинону; антимицин А тормозит транспорт электронов от цитохрома b к цитохрому с₁; CN^–, CO, H₂S – ингибиторы цитохромоксидазы Следует различать ингибиторы цепи тканевого дыхания и разобщители окислительного фосфорилирования.

 

Структура и функция протонной АТФ-азы. Механизм разобщения.

Свободная энергия электрохимического протонного градиента митохондриальной мембраны используется для синтеза АТФ с помощью протон-переносящей АТФ-синтазы (она также называется протонным насосом, АТФ-азой, F₁Fo-АТФ-азой, V комплексом дыхательной цепи). АТФ-синтаза является самым крупным, по форме напоминающим гриб, структурным компонентом внутренней митохондриальной мембраны. АТФ-синтаза представлена 2 большими полиферметными белками – F₁ (шляпка гриба) и Fo (ножка), каждый из которых, в свою очередь, состоит из нескольких неоднородных полипептидов.

Рис. 5.6. Модель грибовидного комплекса АТФ-синтазы. V комплекс.Fо – не растворимый в воде трансмембранный белок, главной частью которого является канал для транслокации протонов. Fo означает «фактор О» (от слова олигомицин – антибиотик, продуцируемый Streptomyces). Олигомицин ингибирует транспорт протонов через «ножку» Fо, реагируя с единственным остатком глутаминовй кислоты на одной из субъединиц. Блокада транспорта протонов приводит к потере способности АТФ-азы синтезировать АТФ.

 

F₁ – водорастворимый периферический мембранный белок, состоящий из 5 субъединиц. Если отделить (например, мочевиной) F₁ от Fо, то первый сможет только гидролизовать АТФ, но потеряет способность эту молекулу синтезировать.

Синтез АТФ катализирует β-субъединица белка F₁. Этот синтез осуществляется спонтанно, т.е. без затраты энергии. Происходит это следующим образом (рис.5.7): F₁ имеет 3 химически идентичных, но конформационно различно взаимодействующих αβ-протомеров: О (open) – с открытой конформацией, характеризующейся очень низкое сродство к лигандам и каталитически неактивной; L (loose) – легко связывающей лиганды и каталитически неактивной; T (tight) – жёстко связывающей лиганды и каталитически активной.

 

Рис. Работа «молекулярной турбины» – фактора F₁. В состав F₁ входит γ-субъединица, способная вращаться подобно тому, как вращается турбина в воде («молекулярная турбина»). Вращение γ-субъдиницы обуславливает конформационные изменения в αβ-протомерах. Связывание АДФ с неорганическим фосфатом происходит на участке L. После этого происходит вращение γ-субъединицы на 120˚ (на рис. против часовой стрелки). Это вращение требует затраты энергии, которая аккумулируется при генерации электро-химического потенциала и подпитывается протонным переносом через канал Fo. При вращении γ-субъединицы происходят конформационные изменения αβ-протомеров, в результате чего L-участок преобразуется в T, а T – в O. В Т-участке осуществляется синтез АТФ, а из О-участка (вследствие вращения «турбины») высвобождается АТФ. Таким образом, энергия электро-химического потенциала требуется не для синтеза АТФ, а для удаления её из активного центра V комплекса. Эта энергия расходуется также на транспорт АТФ из матрикса через митохондриальные мембраны в цитоплазму клетки, а АДФ – в обратном направлении (на работу фермента АТФ-транслоказы). Львиная доля энергии протонного потенциала расходуется на транспорт ионов кальция. Доставка субстратов тканевого дыхания также осуществляется за счёт этой энергии. Измерение «силы протонного потенциала» показало, что 1 молекула АТФ может образоваться за счёт окисления НАДН∙Н⁺ первым комплексом дыхательной цепи, 1 молекула АТФ – за счёт окисления убихинола третьим комплексом и 1 молекула – при окислении цитохрома с четвёртым комплексом. Именно в этих местах падение редокс-потенциала превышает 0,2 v, при таком перепаде освобождается энергия, вполне достаточная для синтеза молекулы АТФ (для синтеза АТФ необходимо затратить 42 кДж/моль). Таким образом, при окислении НАД-зависимых субстратов может образоваться 3 молекулы АТФ, а при окислении ФАД-зависимых – 2 молекулы АТФ (транспорт электронов начинается со второго комплекса дыхательной цепи). Следует заметить, что ещё в 30-х годах академик В.А. Энгельгардт обнаружил, что при тканевом дыхании на 1 молекулу кислорода расходуется 3 молекулы фосфата, т.е. отношение Р/О=3 (при использовании НАД-зависиымых субстратов тканевого дыхания). Если в среду инкубации митохондрий добавлялся сукцинат, коэффициент Р/О=2. Эти показатели были названы В.А. Белицером и Е.Т. Цыбаковой коэффициентами фосфорилирования, а I, III и IV комплексы дыхательной цепи – пунктами сопряжения (связи между процессами окисления и фосфорилирования). Согласно подсчётам известного российского биохимика В.П. Скулачёва, в сутки у человека может синтезироваться более 30 кг (!) АТФ: поскольку в сутки у человека образуется 400 мл воды (22 моля), а коэффициент Р/О=3 (66 молей АТФ), то умножая на молекулярную массу АТФ (507), получаем 707 х 66 = 33 462 (т.е.>33 кг) Транспорт электронов и протонов – сопряжённые процессы. Транспорт электронов (окисление НАДН∙Н⁺ и ФАДН₂ кислородом) и окислительное фосфорилирование (синтез АТФ) в норме тесно связаны Это называется сопряжением окисления и фосфорилирования. В состоянии покоя, когда окислительное фосфорилирование минимально, электрохимический градиент внутренней митохондриальной мембраны достигает величины, при которой прекращается дальнейший перенос протонов. Тем самым ингибируется транспорт электронов. Однако обнаружены вещества, например, 2,4-динитрофенол (ДНФ), которые разобщают эти процессы (ДНФ получил печальную известность как препарат для снижения массы тела). Присутствие во внутренней митохондриальной мембране агентов (ионофоров), увеличивающих их проницаемость для Н⁺, разобщает окислительное фосфорилирование от процесса транспорта электронов, поскольку при этом нарушается генерирование электро-химического потенциала и, следовательно, синтез АТФ. ДНФ является липофильной слабой кислотой, поэтому легко проходит через мембрану (снаружи внутрь митохондрии), ослабляя естественный ток протонов, идущий в противоположном направлении. Путь транспорта электронов, не связанный с синтезом АТФ, называется свободным, нефосфорилирующим, окислением. При свободном окислении энергия не аккумулируется, а высвобождается в виде тепла. Это имеет физиологическое значение при охлаждении организма. Частичное разобщение окисления и фосфорилирования наблюдается при многих заболеваниях, так как митохондрии являются наиболее чувствительными клеточными органеллами к действию различных повреждающих факторов. Нарушение их структуры, приводящее к частичному или полному распаду внутренней митохондриальной мембраны, неизбежно будет способствовать обратному току протонов и нарушать энергопродукцию. Поэтому особое значение приобретает стабилизация митохондриальных мембран биоантиоксидантами (витаминами Е, А и аскорбатом) при любой патологии. В ряде случаев некоторые пункты фосфорилирования могут «выключатся» – такое состояние называется разобщением окислительного фосфорилирования – и в этом случае P/O снижается: для НАД-зависимых субстратов – ниже 3; для ФАД-зависимых субстратов – ниже 2-ух. И исходя из 1-го закона термодинамики в разобщенных митохондриях увеличивается теплообразование. (Это происходит за счет того, что та энергия электронов, которая должна была быть использована для синтеза АТФ в «выключенном» пункте фосфорилирования, рассеивается в виде тепла). Процесс разобщения окислительного фосфорилирования лежит в основе лихорадки, вызванной бактериями, вирусами и другими агентами. Разобщение резко усиливается при охлаждении организма. Работа митохондрий при «выключенных» всех пунктах фосфорилирования называется сопряженной, в противном, выше описанном случае, разобщенной и дыхание при этом называется свободным. В качестве разобщителей окислительного фосфорилирования выступают слабые гидрофобные кислоты (ЖК), тиреоидные гормоны, лекарства(дикумарин, динитрофенол). ДЦ имеет механизмы шунтирования: сброс электронов и протонов по протяжению с НАД на цитохромы, или с НАД на межмембранные дегидрогеназы, на наружную мембрану и гладкую ЭПС (микросомальную цепь). Такой перенос характерен для печени. При воздействии какого-либо блокатора, возникает блок в 1-ом комплексе ДЦ, происходит накопление НАД.Н2 и становится реальной угроза гипоксии, печень может погибнуть. Чтобы этого не произошло происходит сброс НАД.Н2 с митохондрий ДЦ на микросомальную ДЦ через цитохром b_5.

Регуляция процесса окислительного фосфорилирования.

Экспериментальные исследования показали, что добавление в ячейку полярографа с инкубируемыми митохондриями АДФ резко стимулировало потребление митохондриями кислорода. Накопление АДФ – регуляторный сигнал, вызывающий стимуляцию тканевого дыхания, т.е. усиление окисления субстратов тканевого дыхания. Это имеет большое физиологическое значение, так как увеличение концентрации АДФ в клетке является свидетельством низкой концентрации АТФ (соотношение адениловых нуклеотидов в клетке постоянно), следовательно, указывает на энергетическое её голодание. Отсюда вытекает и необходимость большего потребления субстратов. Помимо регуляторной роли соотношения АДФ/АТФ, в контроле скорости фосфорилирования участвуют НАД-зависимые коферменты: высокое соотношение НАДН∙Н⁺/НАД⁺, так же как и увеличение соотношения АТФ/АДФ будет снижать интенсивность тканевого дыхания. Способность генерации энергии присуща всем тканям но для того, чтобы они все зароботали, необходимо сильное охлаждение организма. Поэтому в организме есть ткань, которая обеспечивает термогенез в обычных условиях. Это бурая жировая ткань (БЖТ). Ее особенно много у новорожденных (от затылка до крестца, вдоль всей спины). У взрослого она локализуется в в определенных местах: между лопаток, в паху. Ярко выраженной способностью к теплопродукции обладает бурая жировая ткань новорождённых (а её много в организме зимнеспящих животных), которая отличается от типичной жировой ткани тем, что содержит много триацилглицеролов. Кроме того, в митохондриях этой ткани так много цитохромов, что она приобретает бурый цвет. Митохондрии бурой жировой ткани содержат разобщающий белок термогенин (димер 32 кД), который действует подобно каналу, контролирующему проводимость протонов во внутренней митохондриальной мембране. Поток протонов через этот канал ингибируется физиологическими концентрациями пуриновых нуклеотидов (АДФ, АТФ, ГДФ и др), но это ингибирование может быть устранено свободными жирными кислотами. Компоненты этой системы подчиняются гормональному контролю, в частности, норадреналину, который через систему цАМФ активирует гормончувствительную липазу, расщепляющую триацилглицеролы бурого жира с освобождением свободных жирных кислот. БЖТ имеет большое количество митохондрий, т. к. митохондрии содержат цитохромы, то это и придает этой ткани бурый цвет. Особенностью митохондрий БЖТ является отсутствие АТФ-азы, НmD⁺ генерируется в обычном режиме, но нет инструмента НmD(аденилаттранслаказы), трансформирующего ⁺ —> АТФ. Вместо нее НmDесть белок термогенин, который шунтирует ⁺ с наружной мембраны во НmDвнутрь и одновременно способствует рассеиванию энергии ⁺ в виде тепла, так и происходит подогрев тканей. БЖТ охватывает крупные кровеносные сосуды и согревает кровь, а потом эта кровь согревает перефирические участки тела.Это и есть несократительный термогенез. Механизм сократительного термогенеза связан с окислительным фосфорилированием. При охлаждении организма, активизируется симпатическая нервная система, в овет на это происходит выброс адреналина, под действием которого идет гликолиз, через аденилатциклазный механизм. Образующиеся при этом ЖК разобщают окислительное фосфорилирование и (согласно 1-му закону термодинамики) теплопродукция увеличивается. Именно поэтому, после принятия жирной пищи наступает состояние температурного комфорта.
Движение электронов через электронтраспортную систему дыхательных ферентов сопровождается одновременно «перекачиваем» протонов из матрикса в межмебранное пространство. Эта передислокация протонов осуществляется I, III и IV комплексами дыхательной цепи. Английский биохимик Питер Митчелл предложил рассматривать внутреннюю мембрану митохондрий как конденсатор, который со стороны матрикса заряжается отрицательно (благодаря направленному току электронов), а со стороны межмембранного пространства – положительно. Следовательно, при тканевом дыхании совершается осмотическая работа по концентрации протонов в межмембранном пространстве и возникает разность электрических потенциалов, т.е. генерируется электро-химический (или протонный) потенциал:

При этом в молекулу НАД⁺ (НАДФ⁺) включаются 2 электрона и один протон, а второй протон остается в среде.

Во флавиновых коферментах (ФАД или ФМН), активной частью молекул которых является изоаллоксазиновое кольцо, в результате восстановления чаще всего наблюдается присоединение 2 протонов и 2 электронов одновременно:

Восстановленные формы этих кофакторов способны транспортировать водород и электроны к дыхательной цепи митохондрий или иных энергосопрягающих мембран.

http://www.youtube.com/watch?v=1engJR_XWVU&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=_PgjsfY71AM&feature=related

Организация и функционирование дыхательной цепи. В клетках эукариот дыхательная цепь расположена во внутренней мембране митохондрий, у дышащих бактерий – в цитоплазматической мембране и специализированных структурах – мезосомах, или тилакоидах. Компоненты дыхательной цепи митохондрий в порядке убывания окислительно-восстановительного потенциала можно расположить, как показано в табл.

 

 

 

 

Молярные соотношения компонентов дыхательной цепи являются постоянными, ее компоненты встроены в митохондриальную мембрану в виде 4 белково-липидных комплексов: НАДН-КоQН₂-редуктаза (комплекс I), сукцинат-КоQ-редуктаза (комплекс II), КоQН₂-цитохром c-редуктаза (комплекс III) и цитохром а-цитохромоксидаза (комплекс IV) (рис. 9.7).

Если субстратом окисления служат α-кетокислоты, в переносе электронов на НАД⁺ участвуют липоатсодержащие дегидрогеназы. В случае окисления пролина, глутамата, изоцитрата и других субстратов перенос электронов происходит непосредственно на НАД⁺. Восстановленный НАД в дыхательной цепи окисляется НАДН-дегидрогеназой, содержащей железосерный белок (FeS) и ФМН и прочно связанной с дыхательной цепью.

Взаимное расположение компонентов дыхательной цепи с

указанием мест фосфорилирования и специфических ингибиторов

KoQ (убихинон), необходимый компонент дыхательной цепи, является производным бензохинона с боковой цепью, которая у млекопитающих чаще всего представлена 10 изопреноидными единицами (см. главу 7). Как любой хинон, KoQ способен находиться и в восстановленном, и окисленном состоянии. Это свойство определяет его роль в дыхательной цепи – служить коллектором восстановительных эквивалентов, поставляемых в дыхательную цепь через флавиновые дегидрогеназы. Содержание его значительно превосходит содержание других компонентов дыхательной цепи.

Убихинон (кофермент Q) – производное изопрена:

Дополнительным участником дыхательной цепи является железосерный белок FeS (негемовое железо). Он участвует в окислительно-восстановительном процессе, протекающем по одноэлектронному типу. Первый участок локализации FeS находится между ФМН и KoQ, второй – между цитохромами b и c₁. Это соответствует тому факту, что со стадии ФМН путь протонов и электронов разделяется: первые накапливаются в митохондриальном матриксе, а вторые идут на гидрофобные переносчики – KoQ и цитохромы.

Структура цитохрома с

http://www.youtube.com/watch?v=StXlo1W3Gvg&feature=related

Строение дыхательной цепи интенсивно исследуется. В числе последних достижений молекулярной биохимии – установление тонкой структуры дыхательных ферментов с помощью рентгеноструктурного анализа. С помощью электронного микроскопа с наивысшим доступным в настоящее время разрешением можно «увидеть» структуру цитохромоксидазы.

http://www.youtube.com/watch?v=YndC0gS3t6M&feature=related

Таким образом, тканевое дыхание «заряжает» митохондриальную мембрану, а окислительное фосфорилирование «разряжает» ее.

Сопряжение цепи транспорта электронов и фосфорилирования ADP посредством протонного градиента

http://www.youtube.com/watch?v=_PgjsfY71AM&feature=related

 

Разность электрических потенциалов на митохондриальной мембране, создаваемая дыхательной цепью, которая выступает в качестве молекулярного проводника электронов, является движущей силой для образования АТФ и других видов полезной биологической энергии (см. рис. 9.6). Механизмы этих превращений описывает хемиосмотическая концепция превращения энергии в живых клетках. Она была выдвинута П. Митчеллом в 1960 г. для объяснения молекулярного механизма сопряжения транспорта электронов и образования АТФ в дыхательной цепи и быстро получила международное признание. За развитие исследований в области биоэнергетики П. Митчеллу в 1978 г. была присуждена Нобелевская премия. В 1997 г. П. Бойеру и Дж. Уокеру была присуждена Нобелевская премия за выяснение молекулярных механизмов действия главного фермента биоэнергетики -протонной АТФ-синтазы.

П. Мітчелл

http://www.youtube.com/watch?v=3rO26W1xG9U&feature=related

Структура компонентов комплекса I, обеспечивающего функционирование «протонной помпы» при окислении NADH

Схематическое изображение цитохромоксидазы с разрешением

0,5 нм (а) и ее активного центра с разрешением 2,8 нм (б)

Согласно хемиосмотической концепции, движение электронов по дыхательной цепи является источником энергии для транслокации протонов через митохондриальную мембрану. Возникающая при этом разность электрохимических потенциалов (ΔμH⁺) приводит в действие АТФ-синтазу, катализирующую реакцию

АДФ + Р_i = АТФ. (3)

В дыхательной цепи есть только 3 участка, где перенос электронов сопряжен с накоплением энергии, достаточным для образования АТФ на других этапах возникающая разность потенциалов для этого процесса недостаточна. Максимальная величина коэффициента фосфорили-рования, таким образом, составляет 3, если реакция окисления идет с участием НАД, и 2, если окисление субстрата протекает через флавиновые дегидрогеназы. Теоретически еще одну молекулу АТФ можно получить в трансгидрогеназной реакции (если процесс начинается с восстановленного НАДФ):

НАДФН + НАД⁺ = НАДФ⁺ + НАДН + 30 кДж/моль. (4)

 

Обычно в тканях восстановленный НАДФ используется в пластическом обмене, обеспечивая разнообразные синтетические процессы, так что равновесие трансгидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево.

Перенос электронов внутри комплекса II

Эффективность окислительного фосфорилирования в митохондриях определяется как отношение величины образовавшегося АТФ к поглощенному кислороду: АТФ/О или Р/О (коэффициент фосфорилирования). Экспериментально определяемые значения Р/О, как правило, оказываются меньше 3. Это свидетельствует о том, что процесс дыхания не полностью сопряжен с фосфорилированием. Действительно, окислительное фосфорилирование в отличие от субстратного не является процессом, в котором окисление жестко сопряжено с образованием макроэргов. Степень сопряжения зависит главным образом от целостности митохондриальной мембраны, сберегающей разность потенциалов, создаваемую транспортом электронов. По этой причине соединения, обеспечивающие протонную проводимость (как 2,4-динитрофенол), являются разобщителями. Несопряженное дыхание (свободное окисление) выполняет важные биологические функции. Оно обеспечивает поддержание температуры тела на более высоком уровне, чем температура окружающей среды. В процессе эволюции у гомойотерм-ных животных и человека сформировались специальные ткани (бурый жир), функцией которых является поддержание постоянной высокой температуры тела за счет регулируемого разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриальной дыхательной цепи. Процесс разобщения контролируется гормонами.

В норме скорость митохондриального транспорта электронов регулируется содержанием АДФ. Выполнение клеткой функций с затратой АТФ приводит к накоплению АДФ, который в свою очередь активирует тканевое дыхание. Таким образом, клеткам свойственно реагировать на интенсивность клеточного метаболизма и поддерживать запасы АТФ на необходимом уровне. Это свойство называется дыхательным контролем. За сутки человек потребляет около 550 л (24,75 моля) кислорода. Если считать, что в тканевом дыхании за этот период восстанавливается 40 г атомов кислорода (20 молей), а величину Р/О принять за 2,5, то в митохондриях должно синтезироваться 100 молей, или около 50 кг АТФ! При этом часть энергии окисления субстратов расходуется на совершение полезной работы, не превращаясь в АТФ. Приведенные данные показывают, как важно организму поддержание процессов жизнедеятельности.

 

Ингибиторы дыхательной цепи

Изучению последовательности переноса электронов способствовало исследование действия специфических ингибиторов, блокирующих определённые этапы этого процесса (рис.).

Рис. Места действия ингибиторов ЦПЭ. Ингибиторы NADH-дегидрогеназы: ротенон – высокотоксичное вещество, содержащееся в некоторых водорослях и являющееся ядом для рыб; амитал – лекарственный препарат из группы барбитуратов. Ингибитор QH₂-дегидрогеназы – антимицин А, токсичный антибиотик, продуцируемый одним из штаммов Streptomyces. Ингибиторы цитохромоксидазы – цианид, СО, H₂S. Цианид наиболее токсичен для человека; он присоединяется к Fe³⁺ цитохромоксидазы и блокирует перенос электронов к кислороду.

Переносчики электронов, стоящие в цепи непосредственно перед блокированным этапом, становятся более восстановленными, а стоящие после этого этапа – более окисленными. Это можно обнаружить при помощи спектрофотометра, так как у окисленных и восстановленных форм переносчиков разные спектры поглощения.

 

РАЗОБЩЕНИЕ ДЫХАНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Некоторые химические вещества (протонофоры) могут переносить протоны или другие ионы (ионофоры) из межмембранного пространства через мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы.

В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В результате разобщения количество АТФ снижается, а увеличивается. В этом случае скорость окисления NADH и FADH₂ возрастает, возрастает и количество поглощённого кислорода, но энергия выделяется в виде теплоты, и коэффициент Р/О резко снижается. Как правило, разобщители – липофильные вещества, легко проходящие через ли-пидныгй слой мембраны. Одно из таких веществ – 2,4-динитрофенол (рис.), легко переходящий из ионизированной формы в неионизированную, присоединяя протон в межмембранном пространстве и перенося его в матрикс.

Рис. Механизм разобщения дыхания и фос-форилирования. Протонированная форма 2,4-ди-нитрофенола переносит протоны через внутреннюю мембрану митохондрий и препятствует образованию протонного градиента.

Примерами разобщителей могут быть также некоторые лекарства, например дикумарол – антикоагулянт или метаболиты, которые образуются в организме, билирубин – продукт катаболизма гема, тироксин – гормон щитовидной железы. Все эти вещества проявляют разобщающее действие только при их высокой концентрации.

ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНАЯ ФУНКЦИЯ ЦЕПИ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ

Hа синтез молекул АТФ расходуется примерно 40-45% всей энергии электронов, переносимых по ЦПЭ, приблизительно 25% тратится на работу по переносу веществ через мембрану. Остальная часть энергии рассеивается в виде теплоты и используется теплокровными животными на поддержание температуры тела. Кроме того, дополнительное образование теплоты может происходить при разобщении дыхания и фосфорилирования. Разобщение окислительного фосфорилирования может быть биологически полезным. Оно позволяет генерировать тепло для поддержания температуры тела у новорождённых, у зим-неспящих животных и у всех млекопитающих в процессе адаптации к холоду. У новорождённых, а также зимнеспящих животных существует особая ткань, специализирующаяся на теплопродукции посредством разобщения дыхания и фосфорилирования – бурый жир. Бурый жир содержит много митохондрий. В мембране митохондрий имеется большой избыток дыхательных ферментов по сравнению с АТФ-синтазой. Около 10% всех белков приходится на так называемый разобщающий белок (РБ-1) – термогенин. Бурый жир имеется у новорождённых, но его практически нет у взрослого человека. В последние годы появились факты, свидетельствующие о существовании в митохондриях разных органов и тканей млекопитающих разобщающих белков, похожих по своей структуре на РБ-1 бурой жировой ткани. По своей структуре термогенин близок к ATФ/AДФ-антипортеру, но не способен к транспорту нуклеотидов, хотя сохранил способность переносить анионы жирных кислот, служащих разобщителями (рис.).

Рис. Механизм разобщающего действия жирных кислот. 1- выкачивание протонов дыхательной цепью; 2 – протонирование аниона жирной кислоты; 3 – диффузия протонированной жирной кислоты к внутренней поверхности мембраны; 4 – диссоциация RCOOH с образованием RCOO^– и иона Н⁺; 5 – перенос RCOO^– посредством АТФ/АДФ-антипортера или разобщающего белка к наружной поверхности митохондри-альной мембраны.

 

Hа внешней стороне мембраны анион жирной кислоты присоединяет протон и в таком виде пересекает мембрану; на внутренней стороне мембраны диссоциирует, отдавая протон в матрикс и тем самым снижает протонный градиент. Образующийся анион возвращается на наружную сторону мембраны с помощью ATФ/AДФ-антипортера.

При охлаждении стимулируется освобождение норадреналина из окончаний симпатических нервов. В результате происходят активация липазы в жировой ткани и мобилизация жира из жировых депо (см. раздел 8). Образующиеся свободные жирные кислоты служат не только «топливом», но и важнейшим регулятором разобщения дыхания и фосфорилирования.

Заключительный этап катаболизма – основной источник доноров водорода для цепи переноса єлектронов

Углеводы, жирные кислоты и большинство аминокислот окисляются в конечном счёте через цикл лимонной кислоты до СО₂ и Н₂О. Прежде чем эти вещества вовлекаются в заключительный этап катаболизма, их углеродный скелет превращается в двухуглеродный фрагмент в форме ацетил-КоА. Именно в этой форме большая часть «топливных» молекул включается в цикл лимонной кислоты.

Ацетил-КоА образуется в специфических реакциях катаболизма жирных кислот и некоторых аминокислот. Однако главным источником ацетил-КоА служит пиро-виноградная кислота, образующаяся в реакциях катаболизма глюкозы и некоторых аминокислот.

Превращение пирувата в ацетил-КоА происходит при участии набора ферментов, структурно объединённых в пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК). Ацетильный остаток -ацетил-КоА далее окисляется в цикле лимонной кислоты до СО₂ и Н₂О. В этих реакциях окисления принимают участие NAD- и FAD-зависимые дегидрогеназы, поставляющие электроны и протоны в ЦПЭ, по которой они передаются на О₂.

 

В реакциях свободного окисления участвуют также кислород и восстановленные дыхательные переносчики (чаще всего НАДФН). Акцептором электронов является цитохром Р-450 (иногда цитохром b₅). Окисление субстрата протекает по следующей схеме: SH + O₂–> SOH. (5)

 

Молекула цитохрома Р – 450

Механизм действия оксигеназ включает изменение валентности входящих в их состав ионов двухвалентных металлов (железа или меди). Диоксигеназы присоединяют к субстрату молекулярный кислород, активируя его за счет электрона атома железа в активном центре (железо при этом становится трехвалентным). Оксигенация протекает как атака субстрата образующимся супероксид-анионом кислорода. Одной из биологически важных реакций такого типа является превращение β-каротина в витамин А. Монооксигеназы требуют участия в реакции НАДФН, атомы водорода которого взаимодействуют с одним из атомов кислорода, поскольку только один электрон связывается с субстратом. К широко распространенным монооксигеназам относятся разнообразные гидроксилазы. Они принимают участие в окислении аминокислот, оксикислот, полиизопреноидов.

 

В процессе свободного окисления вследствие особенностей используемых цепей передачи электронов не происходит образования АТФ; биологическая роль этих процессов заключается в метаболизме ряда природных и ксенобиотических субстратов. В последнем случае свободное окисление выполняет важную функцию модификации чужеродных соединений. К последним относятся лекарственные средства, гербициды, продукты загрязнения окружающей среды, в возрастающем количестве попадающие в организм с водой, пищей и атмосферным воздухом. Как правило, они имеют гидрофобные свойства. Многие из них являются канцерогенными. Их гидроксилирование в ходе свободного окисления облегчает последующую деструкцию и выведение из организма

ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТКЕ

Свободное окисление протекает при участии свободнорадикальных форм кислорода, которые образуются в процессе одноэлектронного восстановления кислорода и прежде всего супероксид-аниона кислорода.

 

Обычно эти реакции своднорадикального окисления протекают в активном центре соответствующих ферментов, а промежуточные продукты не появляются во внешней среде. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) в ней также возможно одно-электронное восстановление кислорода, объясняющееся тем, что его сродство к убихинону выше, чем к цитохромоксидазе. Эти процессы приводят к образованию супероксид-аниона кислорода. Этот радикал может образовываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимодействия кислорода с ионами металлов переменной валентности (чаще всего с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках и такими ферментами, как ксантиноксидаза или НАДФН-оксидаза. Образование супероксид-аниона кислорода имеет важное биологическое значение. Он является высокореакционным соединением, которое вследствие высокой гидрофильности не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. Его превращения приводят к образованию ряда активных окислителей. Он способен активировать NO-синтазу, которая образует в тканях NO-радикал, обладающий свойствами вторичного посредника (активирует растворимую гуанилатциклазу, продукт которой – цГМФ – проявляет вазодилататорные свойства). С другой стороны, супероксид-анион способен снижать содержание NO-радикала, превращая его в пероксинитрит ONOOH. Живые клетки имеют системы защиты от повышенной продукции свободных радикалов. Фермент супероксиддисмутаза превращает супероксид-анион кислорода в менее реакционноспособный и более гидрофобный пероксид водорода Н₂О₂. Пероксид водорода является субстратом каталазы и глутатионзависимых пероксидаз, которые катализируют его превращение в молекулу воды. Однако пероксид водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-анион ОСl^– ферментом миелопероксидазой.

Взаимопревращения свободных радикалов и их основные функции в тканях

http://www.youtube.com/watch?v=i3WZ2pyI-qM&playnext=1&list=PLD9620432F9A4D353

Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-радикал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные мембранные липиды) и в результате цепных реакций приводить к множественным нарушениям мембран и к гибели клеток. Важным дополнением этих реакций является способность NO-радикала при взаимодействии с супероксид-анионом образовывать пероксинитрит, который может индуцировать так называемый апоптоз (запрограммированная гибель клеток), а в ходе своего спонтанного распада превращаться в гидроксил-радикал. Последний может образовываться также из гипохлорит-аниона в присутствии ионов железа. Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлораминового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белок ферритин, связывают железо. Перекисное окисление липидов, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, способен прерывать широко известный гидрофобный антиоксидант α-токоферол (витамин Е). Его высокая концентрация в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами. Полное подавление перекисных процессов в тканях, по-видимому, нецелесообразно, свободные радикалы обладают полезными свойствами. Они индуцируют апоптоз, участвуют в формировании клеточного иммунитета. Образование гидроперекисей жирнокислотных цепей полиненасыщенных фосфолипидов повреждает бислой и, стимулируя работу фосфолипаз, способствует высвобождению жирных кислот из состава мембранных липидов. Полиненасыщенная арахидоновая кислота является обычной мишенью для свободнорадикальной атаки. Этот процесс может стимулировать ферментативные превращения ее по одному из двух путей – липоксигеназному или циклооксигеназному. В результате в клетке образуются важные биологические регуляторы: простагландины, лейкотриены, тромбоксаны. Лизофосфолипиды, образующиеся при отщеплении модифицированной жирной кислоты, могут быть восстановлены до исходного состояния с использованием другой жирной кислоты (в форме ацил-КоА). Таким образом может регулироваться жирнокислотный состав липидных молекул в клеточной мембране. Высокореакционные свободные радикалы кислорода, характеризующиеся высоким окислительным потенциалом и способностью к быстрым превращениям, могут индуцировать цепные реакции. В настоящее время признается важная роль свободнорадикальных процессов в развитии возрастных и патологических состояний в тканях. Свободнорадикальные превращения вовлекаются в механизмы, повышающие выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, а снижение генерации свободных радикалов в организме способствует ослаблению клеточного иммунитета. Однако усиленная генерация свободных радикалов сопровождает патологические состояния (болезнь Паркинсона, Альцгеймера) и сам процесс биологического старения.