ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ. ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Генетика бактерий и вирусов – наука, которая изучает механизмы наследования генетических признаков и их фенотипические проявления.
Она подтверждена блестящими экспериментами Грегора Менделя в 60-х годах прошлого века. Законы Менделя были подтвержденные опытами Г. где Фриза, К. Клорренса, Е. Чермака. Значительный вклад в развитие учения о изменчивости микроорганизмов внесли К. Негели (основатель теории плеоморфизма – о безграничной изменчивости бактерий), Р. Кох и Ф. Кон, которые выдвинули идеи мономорфизма, которые утверждали постоянство и неизменность бактериальных признаков, присущих определенным видам.
Значительный вклад в изучение законов изменчивости микроорганизмов сделали Л. Пастер, И. Мечников, Л. Ценковський, М. Вавилов, М. Тимофеев-Ресоцький. В 1944 г. О. Ейвери, К. Маклауд, М. Маковой Карте доказали, что именно ДНК является веществом, которое хранит генетическую информацию. Д. Уотсон и Ф. Крик, М. Уилкинсон в 1953 г. расшифровали генетический код, установив особенности механизмов синтеза белка.
Гены, которые отвечают за синтез соединения, выделяют строчными буквами латинского алфавита, которые отвечают названию соединения. Например, his+ – гистидиновый ген, leu+ – лейциновый ген. Гены, которые контролируют резистентность к антибиотикам, другим препаратам, обозначаются буквой r (resistance – стойкость). Чувствительные к препаратам бактерии обозначаются буквой s (sensitive – чувствительный). По этому принципу обозначения kanr, risr означает резистентные к канамицину и ристомицину штаммы, а kans, riss – чувствительные. Фенотип батерий обозначается аналогично генотипу, однако прописными буквами.
Совокупность генов нуклеоида и внехромосомных факторов наследственности предопределяют генотип бактериальной клетки. Фенотип – индивидуальное проявление генотипа в конкретных условиях существования. Существует определенный механизм, с помощью которого последовательность нуклеотидов в гене определяет последовательность аминокислот в белке.
Сначала ДНК клетки деспирализуется, и на одной из ее нитей, как на матрице, фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза по принципу комплементарности формирует полирибонуклеотидную цепь, которая называется информационной или матричной РНК (иРНК, мРНК). Эта стадия синтеза белка называется транскрипция (transcriptio – переписываю).
Информационная РНК переносится клеткой в цитоплазму, где расположенные рибосомы. Начинается следующий этап – трансляция (translatio – перенесение). Именно в этот период на рибосомах происходит считывание генетического кода иРНК и построение полипептидных цепей.
В цитоплазме клетки всегда существуют особенные специфические нуклеиновые кислоты, которые называются транспортными РНК (тРНК). На одном из концов они имеют триплет нуклеотидов (антикодон), а на другом – место для соединения с соответствующей аминокислотой (кодон). Они доставляют необходимую аминокислоту к рибосоме, на которой происходит элонгация (elongatio – удлинение) полипептидной цепи.
Генетическая информация клетки может быть закодирована как хромосомными генами, так и генами, которые находятся во внехромосомном состоянии, то есть отграничены от хромосомы, но способны к длительному поддержанию и воссозданию в такой форме. Они выявлены у бактерий многих родов. Внехромосомные элементы наследственности представлены плазмидами, транспозонами, Is -елементами и фагами.
Мельчайшими за своими размерами является Is -последовательности (insertion sequenses – вставленные последовательности). Они состоят из 1000 пар нуклеотидов и не несут других генов, кроме генов, которые отвечают за их перемещение в разные участки бактериальной ДНК. Во всех случаях они связаны с хромосомной или плазмидной нуклеиновой кислотой и не способны к самостоятельной репликации.
Функции:
Координирующая: взаимодействие транспозонов, плазмид, умеренных фагов между собой и хромосомой бактерии, обеспечивая их репликацию.
2. Регуляторная: вызывают инактивацию генов, или служат промоторами (участки ДНК, которые регулируют экспрессию клеточных генов).
3. Индуцируют мутации по типу делеции или инверсии
Транспозоны (transposition — перемещение) являются последовательностями нуклеотидов, которые кроме генов, которые отвечают за транспозицию, могут нести гены, кодирующие другие функции. Длина их достигает 2000-20000 основ нуклеотидов.
Они могут существовать самостоятельно в виде кольцевой молекулы ДНК, не способной к репликации, или быть включенными в состав бактериальных геномов и плазмид. Они могут нести информацию о синтезе, например, бактериальных энтеротоксинов, ферментов, разрушающих антибиотики.
Транспозоны выявлено в клетках дрожжей, бактерий, растений, насекомых, позвоночных и даже людей. Важнейшее их свойство – способность к миграции с одного репликона к другому. За счет этого они выполняют функции:1. Регуляторная.
2. Кодирующая.
3. Индукцируют генные мутации по типу делеции или инверсии.
4. Включение их в репликон сопровождается абберациями (структурными перестройками) в ДНК этого репликона; чаще всего проявляются инсерции, делеции, инверсии
Плазмиды – кольцевые молекулы ДНК молекулярной массой до 106-108 Д с 1,5-400 жал пар основ. Они могут существовать в цитоплазме в свободном состоянии или быть интегрированными с клеточной хромосомой. Тогда их называют эписомами. Плазмиды содержат в своем составе tra-оперон (transfer – перенос), который обеспечивает их способность к передаче, и гены, которые кодируют какой-то признак. Их называют трансмиссивными, если они самостоятельно передаются другим клеткам с помощью конъюгации, и нетрансмиссивными, когда не имеют собственного аппарата передачи, а переносятся вместе трансмиссивными или при трансдукции. Виды плазмид
1. Трансмиссивные (конъюгация).
2. Нетрансмиссивные (трансдукция)
3. “Криптические”.
4. Монокопийные
5.Мультикопийные
Плазмиды выполняют регуляторную и кодирующую функции. Регуляторный эффект их заключается в способности представлять собственный репликон при нарушении функционирования клеточных генов; кодирующая роль – внесение в клетку новых признаков, которые предоставляют ей определенные преимущества при взаимодействии с организмом хозяина. Сегодня известно несколько десятков разнообразных плазмид. Среди них детальнее всего изучено плазмиды F, Col, R, Ent, Hly, бактериоциногенности, биодеградации. Плазмиды F обеспечивают перенос бактериальной хромосомы при конъюгации. R -плазмиды являются факторами множественной резистентности к лекарственным средствам. Они кодируют стойкость до 10 антибиотикам и солей тяжелых металлов (Ni, Cu, Hg). Col -плазмиды обеспечивают синтез колицинов – белков с летальной активностью против колиформных микроорганизмов. Hly -плазмиды предопределяют образование гемолизина у золотистых стафилококков, Ent -плазмиды обеспечивают ентеротоксигенную активность штаммов кишечной палочки. Плазмиды биодеградации предоставляют микроорганизмам способность утилизировать необычные субстраты : Cam -плазмида – камфору, Oct -плазмида – октану и тому подобное.
Функциональные свойства плазмид
О плазмидной локализации гена могут свидетельствовать высокие темпы потери признака спонтанно, а также усиление ее под воздействием повышенной температуры, химических веществ (акридина, красителей), общая потеря и общее приобретение нескольких признаков.
Способствовать проявлениям изменчивости бактерий могут некоторые умеренные и дефектные бактериофаги. По своим биологическим свойствам они подобны плазмидам, могут самостоятельно существовать в цитоплазме бактериальных клеток. При интеграции с хромосомой микроба они могут предоставлять ему новые признаки Таким образом, плазмиды убиквитарные. Они не имеют решающего значения для обеспечения существования бактериальных клеток, однако играют или не важнейшую роль в создании разнообразия генетического материала при естественном отборе.
Изменчивость микроорганизмов Одним из основных признаков любой живой структуры есть ее изменчивость. Не стали исключением в этом плане многочисленные представители микробного царства.
Различают два вида изменчивости микроорганизмов: ненаследственную или модификационную и наследственную или генотипную. Модификационная изменчивость заключается в изменении разнообразных свойств микроорганизмов под воздействием факторов окружающей среды, однако она не задевает генетический аппарат клетки наследственно не передается. Она предопределяется адаптационными механизмами бактериальной клетки, ее способностью приспосабливаться к условиям окружающей среды за счет активации генов, которые находятся в “немом” состоянии.
Следовательно, модификационные изменения непродолжительные, характеризуют степень приспособления бактерий к новым условиям существования, они являются нормой реакции клетки, удостоверяя потенциальную способность генотипа реагировать на измененные условия существования. При генотипной изменчивости микроорганизмов разнообразные признаки бактерий наследуются и передаются потомкам. Она может развиваться в результате мутаций и рекомбинаций. Мутациями называют любые изменения последовательности нуклеотидов гена, которые изменяют его структуру, а соответственно, и функционирование, но не связаны с рекомбинационным процессом. Считается, что мутационный процесс лежит в основе эволюции микроорганизмов в природе. Последовательность нуклеотидов может измениться или при замене одной пары основ на другую в результате ошибки во время репликации или при разрыве ДНК со следующим выпадением или инверсией фрагмента, который лежит между точками разрыва, или в результате вставки какого-то нового фрагмента.
Классифицировать мутации можно с разных точек зрения. За своим проявлением их можно разделить на морфологические, физиологичные, биохимические и другие в зависимости от вида признака, который изменился в результате мутации. Среди морфологических признаков может измениться расцветка или характер колонии бактерий. Другая группа – это мутации стойкости. После них микроорганизм приобретает способность, например, переносить токсические концентрации веществ, которые подавляют рост диких штаммов (резистентность к антибиотикам). К биохимическим мутациям принадлежат проявления ауксотрофности и прототрофности.
По своему происхождению мутации разделяют на спонтанные и индуцируемые. Спонтанные мутации происходят с частотой 105-1012 без вмешательства экспериментатора, при, якобы, оптимальных условиях существования микробов. Они возникают в результате действия каких-то не установленных окружающих факторов.
Индуцируемые мутации возникают под воздействием действия на клетку установленных мутагенных факторов. Частота их на несколько порядков выше, чем спонтанных.
По локализации мутации разделяют на нуклеоидные, которые возникают в нуклеоиде клетки, и цитоплазматические, что возникают во внехромосомных элементах наследственности – плазмидах; по количеству генов, которые мутировали, – на генные и хромосомные, по величине – на большие (хромосомные) и малые (точечные).
Хромосомные мутации чаще бывают инверсиями (фрагмент ДНК в молекуле переворачивается на 180°), дупликациями (удваивание участка хромосомы), делециями (выпадение части хромосомы), дислокациями (происходит изменение локализации участка ДНК).
Точечные мутации чаще наблюдаются как делеция, вставка фрагмента ДНК (инсерция) или замена основ. Если наблюдают замену пуриновых основ на пурина, а пиримидиновых на пиримидин, такую мутацию называют транзицией. При условии замены пуриновой основы на пиримидиновую и наоборот, мутация называется трансверсией. Любая мутация, которая изменяет генотип дикого штамма, называется прямой мутацией. Если в результате мутации возобновляется исходный генотип дикого штамма, она называется обратной. Однако, когда возобновляется фенотип дикого штамма, но мутация происходит в локусе, не затронутом прямой мутацией, такой тип изменений получил название супрессорной мутации. Она может быть внутригенной и внегенной. Плейотропными называют такие мутации, которые ведут к изменению двух и больше признаков.Нонсенс-мутация (делает кодон несуразным – не кодирует ни одной аминокислоты)
Увеличивать частоту мутационного процесса могут особенные факторы, которые называют мутагенами. Самый доступный мутаген – ультрафиолетовое излучение с длиной волны 2600 А°. Оно вызывает особенные повреждения – образования димеров тимина и замену основ. Ионизирующее облучение (рентгеновские лучи, γ-лучи) также вызывает мутации разной природы. Большую группу складывают химические мутагены. Самый безопасный из них – азотистая кислота, которая дезаминирует аденин. N -нитрозометилсечовина является супермутагеном и канцерогеном, способным вызывать разные типы мутаций. Не уступают ей за своей активностью нитрозогуанидин, етилметансульфонат. Высокую мутагенную активность имеют акридини, аналоги основ (5-бромурацил), которые включаются в состав ДНК между основами, вызывая сдвиг рамки считывания. К биологическим мутагенам принадлежит перекись водорода, которая образуется при метаболизме внутри клеток, лекарственные препараты, такие как нитрофураны, некоторые антибиотики (митомицин С).
Классификация мутагенов
Физические:
1. УФО (λ- 2600 А) – сильнейшее мутагенное действие; образуются димеры тимина, замена основ
2. Ионизирующее облучение (рентгеновское, гамма-лучи)
Химические:
1. Азотистая кислота (самый доступный и безопасный)
2. N -нитрозометилсечовина – супермутаген, канцероген
3. Етилметансульфонат
4. Акридини
5. Нитрозогуанидин
6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-аминопурин)
7. Лекарственные препараты (нитрофураны, некоторые антибиотики
Биологические: перекись водорода вирусы, фаги
Действие разных мутагенов на бактерии.
Своеобразной формой генотипной изменчивости бактерий является явление диссоциации. Его можно наблюдать при культивировании микроорганизмов на плотных питательных средах. Изолированные колонии микроорганизмов определенного вида образуют на поверхности среды колонии двух типов – S-формы (smooth – гладкий) и R -формы (rough – шершавый). Колонии первого типа – гладкие, блестящие, с ровными краями. Колонии R -типу, напротив, мутные, шершавые, с неравным зазубренным краем. Оказалось, что некоторые свойства микроорганизмов, невзирая на то, что они принадлежат к одному и тому же виду, также отличаются. Так, клетки S-форм колоний, нормальной морфологии, вызывают диффузное помутнение бульона, биохимически они более активны, полноценны в антигенном отношении, более вирулентные, их выделяют, как правило, в остром периоде заболевания. Возбудители чувствительны к бактериофагам и стойки к фагоцитам, бактрицидному действию сыворотки крови. Микроорганизмы, которые образуют R-формы колоний, имеют более слабую биохимическую активность, менее чувствительные к действию бактериофагов и имеют менее выраженные вирулентные свойства. Исключением являются возбудители туберкулеза, сибирки, чумы. Исследования доказали, что такие изменения происходят в результате мутаций в генах, которые детерминируют синтез отдельных компонентов мембран бактерий. Считается, что диссоциация предоставляет микробам определенных селективных преимуществ при существовании в организме хозяина, и в то же время она утруждает диагностику инфекционных болезней, в первую очередь, дизентерии и эшерихиозов.
Свойства микробов S -колоний
Клетки нормальной морфологии
Диффузное помутнение бульона
У подвижных видов есть жгутики
У капсульных вариантов есть капсулы
Биохимически более активные
Полноценные в антигенном отношении
У патогенных видов – вирулентные
Выделяются в остром периоде болезни
Чувствительные к бактериофагам
Менее чувствительные к фагоцитозу
Однако в течение своей эволюции бактериальные клетки произвели определенные механизмы, которые обеспечивают стабильность генетического кода, оберегают его от мутаций или ликвидируют их негативные последствия. Они называются репарациями. Репаративные процессы распространены у микробов и контролируются с помощью специальных генов. Выделяют виды репараций: фотореактивация, темновая и SOS -реактивация.
Фотореактивация защищает клетку от негативного действия ультрафиолетовой радиации, которое вызывает образование тиминових димеров. На солнечном свете (λ – 300-400 нм) образуются особенные ферменты, которые разрушают связи между пиримидиновими димерами.
Феномен темновой репарации более сложен предыдущего. Его сущность заключается в том, что особенные ферменты находят мутированный участок ДНК и вырезают его. С помощью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы комплементарно возобновляется исходная структура молекулы, и ферменты лигазы сшивают ее с материнской нитью.
Для получения мутантов разработаны методы, основанные на выявлении разницы в скорости роста бактерий, разной способности их к выживанию и тому подобное.
SOS -реактивация
При множественных повреждениях участки с мутациями переводятся в неактивное состояние, а их роль исполняет невредимый участок ДНК
Методы выявления мутантов
По разнице в скорости роста (посев на минимальную среду; мутанты вырастают)
Разная способность к выживанию
Метод реплик Ледерберг
Генетические рекомбинации
Рекомбинации – особенные феномены наследственной изменчивости микроорганизмов, которые не связаны с мутационным процессом. Рекомбинант, который при этом возникает, наследует некоторые признаки обеих “родительских” клеток, ведь происходит экспрессия гена реципиента и части генома донора. Генетические рекомбинации создают неисчерпаемый источник разнообразных комбинаций генов, которые природа использует в процессе эволюции. Считается, что способность клеток к рекомбинациям детерминируется особенными rec-генами (recombination – рекомбинация).
Выделяют три основных вида генетических рекомбинаций : трансформация, трансдукция и конъюгация.
Трансформация – процесс гибридизации в результате переноса генетических детерминант от бактерии к бактерии с помощью изолированной ДНК.
Впервые на явление трансформации обратил внимание Ф. Гриффитс в 1928 г., изучая пневмококки (Streptococcus pneumoniae), которые образуют капсулу в организме, а на агаре растут в виде гладких (S -форма) колоний. При введении белым мышам убитых нагреванием вирулентных капсульных пневмококков ІІІ типа вместе с авирулентными бескапсульними пневмококками ІІ типа (R -форма) лабораторное животное через несколько дней погибало, а из ее крови высевались живые капсульные пневмококки ІІ серотипу. Следовательно, происходила глубокая перестройка генетического аппарата клетки, которая приобретала способность синтезировать капсулу. Это значит, что авирулентный штамм превратился в вирулентный, что из мертвых клеток выделился какой-то агент, который предоставлял возможность живым клеткам образовывать полисахарид капсулы. И этот признак передавался наследственно. В 1944 г. О. Евери, К. Маклеод и М. Маккарти смоделировали этот феномен in vitro, выделили и очистили трансформирующий агент. Им оказалась молекула ДНК. Трансформация происходит только в тех клетках, которые способны к ней. Такое состояние определяется понятием компетентности, природа которой окончательно не выяснена. Считается, что она предопределяется наличием особенного белка – компонента клеточной мембраны, способного расщеплять некоторые структурные элементы клеточной поверхности. Таким образом высвобождаются рецепторные участки, с которыми взаимодействует ДНК. Состояние компетентности формируется на определенных стадиях развития бактериальной клетки. Механизм явления трансформации заключается в том, что сначала на поверхности клетки-реципиента адсорбируется небольшой фрагмент двунитевой ДНК (1/250-1/500 часть хромосомы клетки-донора). Впоследствии он проникает внутрь клетки, где одна нить ДНК переваривается эндонуклеазами, а другая – монтируется в клеточную хромосому. Наступает последняя фаза процесса – экспрессия рекомбинанта. Такой процесс интеграции происходит очень быстро. Исследовано, что для появления рекомбинанта достаточно п’яти-десятиминутного контакта клетки-реципиента с донорской ДНК, а сам процесс завершается через 2 часа.
Трансформирующую активность ДНК можно приостановить химическими мутагенами, ультрафиолетовым, ионизирующим облучением и, особенно, ферментом ДНК-азой, что убедительно свидетельствует об участии ДНК в этом процессе.
Способность к трансформации выявлена у многих микроорганизмов – представителей родов Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia и других. За ее помощью можно передать резистентность к антибиотикам, способность метаболизувать разнообразные вещества, капсулообразование и тому подобное. Феномен трансформации можно использовать для анализа наследования определенных признаков бактериальной клеткой, получение путем гибридизации микроорганизмов с новыми свойствами. При конъюгации в результате физического контакта между бактериями-донорами и бактериями-реципиентами происходит передача генетического материала через особенные выросты, которые называются секс-пили. Необходимым условием для процесса конъюгации является наличие в клетке-доноре особенного фактора, который называется F -фактор (fertility – плодовитость). Он является конъюгативной плазмидой, которая существует автономно в цитоплазме бактерии. Состоит она из генов переноса и генов, которые кодируют определенные признаки клетки. Бактерии с F -факторами обозначаются как F+, а без него – F– клетки. F -фактор детерминирует образование половых ворсинок, следовательно, способность клеток к конъюгации. Половые ворсинки – особенные трубчатые выросты на поверхности клетки. Они полые, длина их в несколько раз превышает величину бактерии. Процесс конъюгации начинается с того, что с помощью половых ворсинок клетка-донор касается клетки-реципиента, фиксирует ее и притягивает к себе. После этого плазмида начинает реплицировать, и одна ее нить передается в реципиентний штамм, а другая остается в клетке донора. Происходит комплементарный синтез другой нити ДНК. Таким образом, F+-фактор имеют уже две бактерии. Клетка, которая получила конъюгативную плазмиду F, приобретает способность синтезировать половые ворсинки на поверхности, следовательно, может сама вступать в конъюгацию. Частота этого процесса – 10-6-10-8. В некоторых случаях F -плазмида способна интегрировать с хромосомой. Если такая интеграция стабильна, образуются клоны клеток, в которых все бактерии способны вступать в конъюгацию с достаточно высокой частотой, – 10-1-10-4. Такой штамм называют штаммом Hfr (high frequency of recombination – высокая частота рекомбинаций). В отличие от F +-клеток в Hfr-донорах F-фактор интегрирован с хромосомой бактерий. Когда такие клетки вступают в конъюгацию из F–штаммами, к ним передается только одна нить ДНК. Длится процесс 60-90 минут, а скорость переноса представляет до 5(104 пар нуклеиновых основ за одну минуту. Таким образом, в клетке-реципиенте экспрессируется собственный геном и часть генома донора. Порой в клетках Hfr может происходить отщепление F -фактора и он переходит в автономное существование в цитоплазме, захватив с собой сегменты хромосомы клетки-хозяина. Такой F -фактор называется F-генота, а клетка, что его несет, клеткой F’. В ее хромосоме является дефект, соответствующий потерянному фрагменту.
Таким образом, от бактерии к бактерии можно перенести разнообразные свойства донорского штамма. Кроме того, прерывая процесс конъюгации через определенные промежутки времени и изучая новые свойства, которые приобрела клетка-реципиент, можно определить локализацию генов на хромосоме, то есть провести ее картирование.
Явление конъюгации исследовано для многих представителей микробного царства – кишечных и синегнойных палочек, сальмонелл и других. Установлено, что процесс конъюгации может происходить не только в пределах одного вида, но и между разными родами бактерий. С медицинской точки зрения заслуживает внимания факт передачи с помощью конъюгации фактора множественной лекарственной резистентности (R), который предопределяет стойкость бактерий к многим антибиотикам.
Трансдукция. В 1952 г. Н. Циндер и Д. Ледерберг, изучая процесс конъюгации между разными штаммами сальмонел, обратили внимание, что иногда обмен генетическим материалом происходит не в результате конъюгации, а в результате высвобождения из родительских штаммов умеренного бактериофага. Явление обмена генетической информацией у бактерий путем переноса фагами фрагментов ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту получило название трансдукции. Она часто происходит у энтеробактерий, псевдомонад, стафилококков и бацилл. Считают, что большинство видов микроорганизмов несут в своем геноме профаг, потому трансдукция может быть чрезвычайно распространенным явлением в микробном мире. Выделяют три основных вида трансдукции: специфическую, общую или генерализованую и абортивную.
Специфическая трансдукция характеризуется способностью бактериофагов переносить лишь определенные гены от бактерии донора, которые локализуются по обе стороны от места интеграции фага в геном клетки. Например, фаг λ E. coli имеет сайт интеграции в хромосому бактерий между генами gag i bio, которые кодируют соответственно ферментацию галактозы и синтез биотина. При выходе из бактериальной хромосомы, он захватывает часть генетического материала донора (гены gag i bio), а сам при этом теряет часть собственного генома. Такой бактериофаг называют дефектным, потому что количество собственной ДНК ограничено за счет включения генома хозяина. Бактериофаг φ 80 переносит только триптофановий ген кишечных палочек. Клетки, какие лизогенизированые дефектными фагами, становятся невосприимчивыми к заражению гомологичными вирулентными бактериофагами. Во время формирования головки бактериофага и сборки фаговых корпускул в него может проникнуть, следовательно, передаться бактерии-реципиенту, любой фрагмент ДНК бактерии-донора, например, ген, который предопределяет резистентность к антибиотикам.
Следовательно, фаг просто переносит генетическую информацию, а его собственная ДНК не берет участия в образовании рекомбинанта.
Процесс трансдукции отличается от лизогенной конверсии, которую также обеспечивают умеренные бактериофаги. При последней клетка приобретает новые свойства за счет экспрессии в ней собственных генов фага. Ярким примером такого явления является перенос tox+ генов дифтерийных фагов в дифтерийные палочки, в результате чего они приобретают токсигенные свойства. Аналогичное явление наблюдается у возбудителей ботулизма, стафилококков. При абортивной трансдукции фагова ДНК и гены бактерии-донора не интегрируются в хромосому реципиента, а остаются в цитоплазме. Во время деления клетки они передаются только одной из дочерних клеток, а впоследствии просто элиминируются из нее. Явление ненаследственной и наследственной изменчивости наблюдается также у вирусов. Модификациям подлежат состав белков капсида, суперкапсида, который предопределяется влиянием клеточных компонентов при репродукции вирионов. Как проявление генотипичной изменчивости, у вирусов выявлены также феномены мутаций и рекомбинаций. В результате мутаций могут изменяться размеры бляшек под агаровым покрытием, нейровирулентность вирусов для животных, чувствительность их к действию химиотерапевтических препаратов. Благодаря мутациям, которые возникли при пассажах вирусов через мозг кроликов, получен фиксированный вирус, а при пассажах через мозг цыплят – штамм Флюри, которые используются при создании антирабических вакцин для активной профилактики бешенства. При заражении чувствительной клетки одновременно несколькими вирусами наблюдаются проявления многочисленных генетических рекомбинаций: множественная реактивация, пересортировка генов, крос-реактивация, гетерозиготность, транскапсидация. Они встречаются также in vivо, что позволяет по-новому оценить некоторые стороны развития вирусных инфекций.
Практическое значение генетики бактерий (Video – Бioтехнологiя)
Генетические феномены нашли широкое практическое применение в разных областях науки, техники, медицины, фармацевтической промышленности, биотехнологии, сельского хозяйства. Благодаря применению генетических методов, получены высокоактивные штаммы бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, которые продуцировали в 200-1000 раз и больше аминокислот, органических кислот, ферментов, витаминов, кормового белка, сравнительно с выходными, а также вакцинные штаммы микроорганизмов и вирусов. Использование разнообразных мутагенов (ультрафиолетовое и радиоактивное облучения, химические вещества) позволило создать мутантний штамм гриба Penicillium chryzogenum, который в диком состоянии продуцировал 100 от/мл пенициллина, а после направленной селекции – 10000 от/мл. Установлено, что некоторые микроорганизмы, например, Fuzarium monilifore, синтезируют биологически активные субстанции типа фитогормонов, гиберелинов, биоинсектицидов и других, которые являются эффективными стимуляторами роста и развития высших растений. Генетические подходы позволили проводить целеустремленный селекционный процесс для получения продуцентов этих веществ. Существенный вклад вносит генетика в уменьшение загрязнения окружающей среды: очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов сельскохозяйственного производства и промышленности, предложив специально селекционированные с этой целью микроорганизмы.
Стремительное развитие биологической науки ярко проявилось в становлении генной и клеточной инженерии – совокупности экспериментальных методов, с помощью которых переносят гены от одного организма к другому. Она родилась в 1972 г., когда американским исследователям П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коэну удалось получить гибрид вируса обезьяны SV – 40 и бактериофага λ.
Еще до недавнего времени возможность конструирования живых организмов с заданными свойствами казалась недосягаемой. Для осуществления этого фантастического эксперимента необходимо получить соответствующий ген, присоединить его к специальному вектору – проводнику, чтобы не быть уничтоженным клеточными ферментами, ввести в другую клетку и заставить там работать. Для всех этих операций необходимое участие специальных ферментов (они известно уже несколько сотен), которые способны разрезать донорскую ДНК и ДНК вектора в определенных участках на отдельные фрагменты. Другие ферменты необходимы для присоединения соответствующих генов к ДНК. Для расшифровки строения генов используют методы биохимического синтеза при участии ферментов ревертаз. Как векторы используют бактериальные плазмиды, бактериофаги, некоторые вирусы. Они способны репликуватись в клетке-реципиенте и содержат один или несколько маркеров, которые позволяют распознавать рекомбинантные клетки.
О высокой эффективности генно-инженерных методов получения химически чистых биологически активных веществ свидетельствует такой факт. Чтобы получить 5 мг соматотропина, был использован мозг 500 000 овец в течение 5 лет, в то время как аналогичное количество гормона дают 9 л бульонной суспензии кишечной палочки. Генная инженерия предоставила возможность получить инсулин, простагландины, энкефалины, интерферон, интерлейкин, гормоны, разнообразные ферменты, многие химически чистые углеводы – глюкозу, ксилит и тому подобное. Некоторые гормоны человека, которые продуцируются рекомбинантными микроорганизмами
|
Белок |
Название вещества |
|
Инсулин |
Гумулин, Новолин |
|
Соматостатин |
Протропин, Гуматроп |
|
Интерферон альфа |
Роферон, Велферон |
|
Интерферон гамма |
Актимун |
|
Интерферон бета |
Фрон, Бетасерон |
|
Интерлейкин-2 |
Пролейкин |
|
Фактор некроза опухолей |
– |
|
Эритропоэтин |
Прокрит, Епоген |
|
Гранулоцит колониестимулирующий фактор |
Филграстин, Ньюпоген |
|
Плазминоген активатор |
Актилиз |
Медицинская наука стоит на пороге разработки методов генной хирургии. Например, у человека порой встречается врожденная недостаточность фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). В таком случае она склонна к подагре, часто наблюдается боль в суставах, развивается почечно-каменная болезнь. Эксперименты на животных убедительно доказали, если вмонтировать ген, ответственный за синтез этого фермента, в ретровирус и ввести его в спинной мозг белых мышей, они начинают синтезировать ГГФРТ. Клонирован из макрофагов человека ген фактора некроза опухолей в кишечной палочке, при введении ее белым мышам с саркомами вызывает их разрушение. Широкие перспективы открывает генная инженерия на пути создания высокоэффективных средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. Введение в геном кишечных палочек, вирусов осповакцины, дрожжей некоторых генов вирусов гепатита В, ящура позволили разработать субъединичные вакцины.
Таким образом, микробиологическая наука позволяет создать стройную систему взаимосвязанных отраслей биотехнологии, которые имеют уникальное преимущество, – они основаны на функционировании естественных систем, которые подчиняются интересам человека.
ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ
Способы увеличения информации :
– – двукратное считывание одной иРНК с других инициирующих кодонов
– – сдвиг рамки трансляции
– – сплайсинг (вырезка интронов)
– – транскрипция из участков ДНК, которые перекрываются
У вирусов могут быть:
Модификации (изменение состава белков капсида, суперкапсида под воздействием клеток)
Мутации (размер бляшек под агаровым покрытием, нейровирулентность для животных, чувствительность к действию химиотерапевтических агентов, ts -мутации – температурочувствительность, – вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах
Рекомбинации
ВИДЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ
1. Рекомбинация: Обмен генами (межгенная) и их частями (внутригенная)
Скрещивание близких по свойствам вирусов при одновременном культивировании.
Например, вирусы полиомиелита ( увеличенная и уменьшенная чувствительность к гуанидину, разная нейровирулентность), вирусы гриппа (разная нейровирулентность для мышей, но одна пневмотропность), гибридизация вирусов оспы кролика и вируса осповакцины
2. Множественная реактивация: вирусная инфекция вызывается при заражении вирионами с поврежденным геномом, поскольку функцию этого гена выполняет вирус, у которого ген не поврежден. Потомки – невредимые вирусы
3. Пересортувание генов: между вирусами, которые имеют сегментированные геномы (вирусы гриппа человека, кочок, свиней, буньявирусы, аренавирусы, реовирус). Гибридные формы называют реасортанты.
4. Гетерозиготность: одновременной репродукции нескольких вирионов, разных по наследственным свойствам, образуются вирионы, которые содержат определенный геном одного из родительских штаммов и часть генома другого вируса (т.н. диплоидные или полиплоидные вирусы). Такое объединение не наследуется, но позволяет дать потомков с разными свойствами.
Это вирусы гриппа, болезни Ньюкасл
5. Транскапсидация: часть чужеродного генетического материла, заключенного внутри капсида другого вируса, способная переноситься в стабильной форме в чувствительные к основному вирусу клетки.
Аденовирусы человека не размножаются в клетках обезьян. Но при одновременном культивировании аденовирусов и вирусов SV – 40 под одним капсидом образуется вирус, который содержит геномы обоих вирусов, который способен размножаться в клетках обезьян.
6. Крос-реактивация (спасание маркера) : реактивация инактивированного генома неинактивированным (подобно множественной реактивации)
ВИДЫ НЕГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ
1. Фенотипическое смешивание
2. Негенетическая реактивация
3. Комплементация
4. Стимуляция
5. Интерференция
