Хроматографический метод анализа

1.     Основные понятия  хроматографии.

2.     Классификация хроматографических методов.

3.     Теоретические основы хроматографии.

4.     Главные узлы газохроматографического оборудования.

5.     Газовая хроматография.

6. Теоретические основы жидкостной хроматографии

7. ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

8. ТСХ – тонкослойная хроматография

9.     Бумажная хроматография

 

1. Основные понятия хроматографии

 

Хроматография – это процесс, который базируется на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении ее в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.

Хроматографический метод разработал русский ботаник М.С. Цвет в 1903 году.

         Сорбция – процесс поглощения твердым веществом или жидкостью (сорбентом) газообразного или растворенного вещества (сорбата), обратный процесс называется десорбцией.

 

Сорбцию разделяют на:

–                     адсорбция – поглощение вещества (адсорбата) поверхностью твердого или жидкого адсорбента;

–                     абсорбция – поглощение вещества (абсорбата) всем веществом абсорбента;

–                     хемосорбция (химическая сорбция) – поглощение вещества сорбентом с образованием химических соединений.

Вещество подвижной фазы непрерывно поступает в контакт с новыми участками сорбента и частично сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично  десорбируется.

 

При постоянной температуре адсорбция увеличивается:

– с возрастанием концентрации раствора;

– с увеличением давления газа.

Зависимость количества поглощенного вещества от концентрации раствора или давления газа при постоянной температуре называется изотермой адсорбции.

    а

 

                                                              

 

с

Математически эта зависимость может быть выражена уравнением Ленгмюра:

где:

n – количество адсорбированного вещества при равновесии;

n_∞ – максимальное количество вещества, которое может                                                                 быть адсорбировано на данном сорбенте;

b – постоянная;

с – концентрация.

 

В области небольших концентраций изотерма адсорбции линейная. Действительно, при bc << 1 знаменатель выражения изотермы адсорбции

(1+ bc) ® 1,

тогда

Это уравнение линейной адсорбции (уравнение Генри).

 

Количество адсорбированного вещества будет определяться:

–                     концентрацией вещества;

–                     сродством к сорбенту.

 

 

2.                 Классификация хроматографических методов.

 

1.                 За физической природой неподвижной и подвижной фаз:

Подвижная фаза	Газообразная	Жидкая
Неподвижная фаза
Твердая	Газо-адсорбционная хроматография	Жидкостная адсорбционная, тонкослойная, ионообменая, ионная, осадочная хроматография
Жидкая	Распределительная газожидкостная хроматография	Жидкостная распределительная хроматография, ВЭЖХ, гель-хроматография

 

2.                 В зависимости от механизма сорбции:

а) молекулярная (взаимодействие между неподвижной фазой (сорбентом) и компонентами разделяемой смеси за счет междумолекулярных сил (типа Ван-дер-Ваальса);

б) хемосорбционная (ионообменная, осадочная, комплексообразовательная или лигандообменная, окислительно-восстановительная).

 

3.                 За способом хроматографирования:

–                                               фронтальная хроматография;

–                                               проявительная (элюентная) – чаще всего используемая хроматография;

–                                               вытиснительная хроматография.

     С    

                                                  Фронтальный метод

                                                   

                              Solv + A + B      Смесь непрерывно подается в колонку

                                  Solv + A

Solv

                                                        V

 

Проявительный (элюентный) метод

Смесь один раз вносится в колонку. Из колонки она непрерывно вымывается подвижной фазой.

                                      B

      C

                    A                                    

 

 

 

 

                                                        V

 

Вытиснительный метод. Исследуемую смесь компонентов А и В в растворителе Solv вводят в колонку и промывают раствором вещества D (вытиснитель), которое сорбируется лучше, чем компоненты пробы.

Преимущество – концентрация раствора не уменьшается.

Недостаток – частое перекрывание зон компонентов, поскольку они не разделены растворителем.

 

4.                 За техникой выполнения:

 

–                                               колонковая (неподвижная фаза в колонке);

–                                               плоскостная:

а) бумажная (неподвижная фаза – бумага);

        б) тонкослойная (неподвижная фаза – сорбент на стеклянной, металлической, полимерной пластинке).

 

3. Теоретические основы хроматографии.

Хроматограмма – это зарегистрированная во времени последовательность показов регистратора.

 

Типичная хроматограмма:

 

C                                                                 

                            h¢ 

 

 

m_0.,5                       h    

        

 

нулевая линия

                               t_r или V_r           V

Основные характеристики хроматографического пика

Высота пика h или h¢(от точки пересечения касательных с нулевой линией).

Ширина пика m_0,5 – расстояние между точками пика на половине высоты (или на любой другой отметке по высоте).

Время удерживания – качественная характеристика каждого компонента (измеряется от момента введения пробы до момента выхода максимума пика).

 Время удерживания зависит от:

–                                               природы хроматографируемого соединения;

–                                               природы подвижной фазы;

–                                               природы и массы неподвижной фазы;

–                                               скорости движения подвижной фазы;

–                                               температуры колонки (в газовой хроматографии);

–                                               длины колонки;

–                                               коэффициента распределения  (чем большее для определенного компонента, тем больше его время удерживания).

 

Время выхода t₀ – время выхода компонента, который не сорбируется, например, растворителя.

Исправленное время удерживания t₁¢= t₁–t₀ – время в течение, которого данный компонент находится в НФ.

 

!!! Исправленное время удерживания t¢ пропорционально коэффициенту распределения данного компонента разделяемой смеси.

 

Относительное время удерживания t_r¢ и относительное исправленное время удерживания t_r рассчитываются по формулам:

t_r¢=t/t_s                t_r= (t – t₀) / (t_s – t₀₎

 

!!! Относительные времена удерживания:

–               меньше зависят от внешних условий, чем время удерживания;

–               разрешают серийный анализ без стандартных образцов определяемых веществ.

Часто измеряют не время удерживания, а расстояние удерживания l – расстояние на хроматограмме от точки, которая отвечает моменту введения пробы, к абсциссе, которая отвечает положению максимума пика.

Объем удерживания (удерживаемый объем) – объем равный объему ПФ, которая выносит из колонки все данное вещество (он зависит от скорости u движения ПФ)

V = t × u

Коэффициент удерживания (замедления) R – это отношение скорости перемещения w данного компонента к скорости u движения потока ПФ:

R = w /u   или   R = t₀ /t .

Коэффициент емкости k – равен отношению исправленного времени удерживания t¢= t – t₀  данного компонента к t₀:

k =  (t – t₀) / t₀

Чем больше коэффициент k, тем больше времени находится данный компонент в НФ.

 

Теория хроматографического процесса.

Метод Мартина и Синджа (теоретических тарелок). Хроматографическая колонка делится условно на ряд элементарных участков – тарелок. Равновесие на каждой тарелке сорбент – подвижная фаза устанавливается очень быстро. Каждая новая порция газа – носителя вызывает смещение этого равновесия, вследствие чего часть вещества переносится на следующую тарелку, на которой, в свою очередь, устанавливается равновесие и происходит переход вещества на другую тарелку. Поэтому, вещество распределяется по нескольких тарелкам, но на средних тарелках ее концентрация оказывается максимальной сравнительно с соседними тарелками. Распределение вещества вдоль слоя сорбента происходит согласно уравнению:

х – расстояние от начала колонки до точки, в которой концентрация равна С;

х₀ – координата центра полосы;

Н – высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ)

l – длина слоя сорбента, на которой проводится поглощение и размещается n теоретических тарелок (длина хроматографической колонки), при этом

n = l/Н

!!! Эффективность колонки тем выше, чем меньше высота ВЭТТ и больше число теоретических тарелок.

         Кинетическая теория хроматографии главное внимание предоставляет кинетике процесса, связывая высоту ВЭТТ с процессами диффузии, медленным установлением равновесия и неравномерностью процесса. Высота ВЭТТ связана со скоростью потока уравнением Ван-Деемтера:

где:

А – коэффициент, который учитывает вихревую диффузию;

В – коэффициент, который учитывает продольную диффузию;

С – коэффициент, который учитывает кинетику процесса сорбция-десорбция;

U – скорость подвижной фазы.

Константа А связана с действием вихревой диффузии, которая зависит от размера частичек, их плотности или плотности заполнения колонки. Константа В связана с коэффициентом диффузии молекул в подвижной фазе. Константа С характеризует кинетику процесса сорбция – десорбция, массопередачу и прочие эффекты.

H     

                                        CU

A         

           

B/U                         

                                                                  U

При небольшой скорости потока высота, эквивалентная теоретической тарелке  уменьшается, а потом начинает возрастать.   Поскольку эффективность колонки тем   выше, чем меньше высота ВЭТТ, то оптимальная скорость подвижной фазы будет равна скорости, которая отвечает точке минимума этой кривой.

Оптимальная скорость разделения, которая обеспечивает большое количество теоретических тарелок, а соответственно маленькую высоту ВЭТТ рассчитывается за формулой:

 

Итак, кинетическая теория дает основу для оптимизации хроматографического процесса.

 

Полнота разделения двух компонентов количественно может быть выражена критерием разделения R_s:

или за ГФУ

Dl – расстояние между максимумами пиков разделяемых компонентов;

m_0,5(1) и m_0,5(2) – ширина хроматографического пика 1 и 2 компонентов на половине высоты.

При R_s = 1 разделение будет достаточно полным.

 

Если пики взаимно перекрываются, то определение ширины пика каждого вещества невозможно, тогда рассматривают степень разделения Y:

    С                                                           ;

h_min                                                   h₂ – высота пика с меньшей

                                               h₂                                             концентрацией вещества;

                                                                                     h_min – высота минимума.

 

                                               t

В хроматографии: качественный анализ базируется на определении времени удерживания, а количественный – на определении высоты или площади пика.

 

4. Главные узлы газохроматографического оборудования

 

–                               дозатор – микрошприц или автосамплер (воспроизводимость размера пробы и постоянность условий ее введения в испаритель);

–                               испаритель (стабильность температурных  условий испарения пробы);

–                               колонка в термостате (1-2-3 м и 50-60 м; прямые, спиральные, U- образные);

–                               детектор;

–                               регистратор.

               

 

Колонки:

–                                               набивные (НФ – адсорбент твердый или покрытый жидкостью) и капиллярные (жидкая неподвижная фаза нанесена на стенку колонки);

–                                               металлические (сталь, медь, латуни), стеклянные, фторопластовые.

!!! Колонки обязательно термостатируются!

 

Требования к адсорбенту (Al₂O₃, силикагели, активированный уголь, пористые капилляры на основе стирола, дивинибензола, синтетические цеолиты ):

1.                            необходимая селективность;

2.                            химическая инертность к компонентам смеси;

3.                            доступность.

 

Детектор предназначен для обнаружения  изменений в составе газа или жидкости, которые прошли через колонку. Показания детектора превращаются в электрический сигнал и передаются регистрирующему прибору.

 

Главными характеристиками детектора являются:

–                                               чувствительность

–                                               границы детектирования

–                                               инерциозность

–                                               диапазон линейности I = f (c)

Дифференциальные (отображают мгновенное изменение          концентрации); часто применяются

Детекторы

 

Интегральные (фиксируют изменение концентрации за целый промежуток времени), применяются не часто

 

К группе дифференциальных детекторов принадлежат:

–                                               катарометр (детектор по теплопроводности);

–                                               ПИД (пламенно-ионизационный);

–                                               детектор электронного захвата (ДЭЗ).

–                                               другие в зависимости от свойств системы, агрегатного состояния фаз.

Детекторы

1.                 По теплопроводности (катарометр) – универсальный детектор, до сих пор широко используемый.

Измеряется сопротивление нагретой проволоки, которая помещается в поток газа.

 

 

 

 

Температура проволоки и ее сопротивление изменяются в зависимости от концентрации компонентов пробы, которые вымываются из колонки.

Катарометр – универсальный, но малочувствительный (10^-2-10^-3%) детектор. На чувствительность катарометра влияет теплопроводность газа-носителя, поэтому необходимо использовать газы-носители с максимально возможной теплопроводностью (Не, Н₂).

2.     ПИД

3 вывод в атмосферу                                                                                                                                                                                                                                                                                                     4 – собирательный электрод                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             4 катод                                                    

                                  2 Н₂   6 воздух                                                                                                                1 из колонки газ-носитель                                                  

 

Газ, который выходит из колонки, смешивается с Н₂ и поступает в форсунку горелки детектора. Ионизированные частички, которые образуются, заполняют междуэлектродное пространство, в результате чего сопротивление снижается, а ток увеличивается. Стабильность и чувствительность ПИД  зависит от выбора скорости потока всех используемых газов (газ – носитель » 30-50 мл/мин; Н₂ » 30 мл/мин, воздух » 300 – 500 мл/мин). ПИД реагирует практически на все соединения, кроме Н₂, инертных газов, О₂, N₂, оксидов Нитрогена, S, C, а также воды. Этот детектор имеет широкую область линейности (6-7 порядков), поэтому он пригоден для определения “следов” веществ.

3.     ДЭЗ        

 

 

 

 

 

 

В камере газ – носитель облучается постоянным потоком b-электронов, которые даются изотопами

В детекторе происходит реакция взаимодействия свободных электронов с молекулами определенных типов с образованием стабильных анионов

В ионизированном газе-носителе (N₂, He) в качестве отрицательно заряженных частичек присутствуют только электроны. В присутствии соединения, которое может захватывать электроны, ионизационный ток детектора уменьшается. Этот детектор дает отклик на соединения, которые содержат Hal (галогены), P, S, NO₃^–, Pb, O. На большинство углеводородов он не реагирует.

 

5. Газовая хроматография

Подвижной фазой в газовой хроматографии является газ или пар.

Подвижная фаза Н₂, Не, N₂, Ar, CO₂.

Газ-носитель не взаимодействует с розделяемыми веществами и неподвижной фазой.

Неподвижная фаза – твердый адсорбент или пленка жидкости.

Температурный режим колонок может быть постоянным или с программированием (прибор в процессе хроматографирования автоматически изменяет, соответственно программе, температуру колонки). Программирование температуры разрешает улучшать разделение сложных смесей.

При проведении газовой хроматографии в нагретый до определенной температуры поток газа-носителя вводят анализируемую пробу. Компоненты пробы испаряются и вместе с потоком газа поступают в термостатированную колонку с неподвижной фазой (адсорбентом). В колонке протекают многократные процессы адсорбции и десорбции на твердом носителе или растворения и выделения в жидкой пленке смеси газообразных веществ. Разделение сложной смеси здесь определяется коэффициентами адсорбции или распределения анализируемых веществ между фазами. На выходе из колонки смесь разделяется на индивидуальные вещества, которые поступают с потоком газа на детектор.

Процесс разделения базируется на отличиях в летучести и растворимости (адсорбированности) разделяемых компонентов.

Через хроматографическую колонку быстрее двигается тот компонент, растворимость которого в неподвижной фазе меньше, а летучесть (упругость паров) при данной температуре большая.

Количественный анализ можно провести только в том случае, если вещество термостойкое, то есть испаряется воспроизводимо и вымывается по колонке без разложения. При разложении вещества на хроматограмме появляются ненастоящие пики, которые принадлежат продуктам разложения.

 

Схема любого газового хроматографа включает:

 

 

 

                                                    дозатор                                                                  самописец-

                                                                                                               регистратор сигнала

                                               регулятор потока     

                                                                                                                 колонка                         

                            газ-носитель                                     термостат  

 

 

Качественный анализ – времена или относительные времена удерживания. Для идентификации необходимы стандартные растворы определяемых веществ, которые позволят определить времена удерживания определяемых веществ и позволят по полученным временам идентифицировать те же вещества, но уже в определяемой смеси с другими веществами.

 

ГФУ предлагает три метода для идентификации:

1)    сравнение времен удерживания анализируемого вещества в испытуемой пробе и в растворе сравнения (стандартный раствор исследуемого вещества);

2)    сравнение относительных времен удерживания анализируемого вещества в испытуемой пробе и растворе сравнения (если возможна невоспроизводимость условий хроматографирования);

3)    сравнение хроматограммы испытуемой пробы с хроматограммой раствора сравнения или с хроматограммой, приведенной в отдельной статье (для препаратов растительного и животного происхождения).

 

Количественный анализ

Базируется на измерении разных параметров пика, которые зависят от концентрации хроматографируемого вещества:

– высоты

– ширины

– площади

– удерживаемого объема

– произведения удерживаемого объема на высоту пика.

 

ГФУ требует проводить определение количественного содержания через площади пиков, тем не менее в случае коэффициента симметрии пика от 0.8 до 1.20 можно применять вместо площадей высоты пиков.

В случае использования программирования температуры количественный анализ – только через площади пиков.

коэффициент симметрии пику m_0.05/2А,

где m_0.05 – ширина пику на одной двадцатой высоты пику;

А – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней границей пика на одной двадцатой высоты пика.

1. Метод нормирования.

Принимают сумму всех параметров пиков (Sh, или SS, или S ширины всех пиков) за 100%. Тогда отношение высоты отдельного пика к сумме высот или отношение площади одного пика к сумме площадей, умноженное на 100 будет характеризовать W_(комп.)(%) в смеси. Понятно, что такой метод предусматривает существование одинаковой зависимости величины измеренного параметра от концентрации всех компонентов смеси.

2. В методе нормирования с калибровочными коэффициентами за 100% принимается сумма параметров пиков с учетом чувствительности детектора. Отличия в чувствительности детектора учитываются с помощью поправочных коэффициентов для каждого компонента. Один из доминирующих компонентов смеси считают сравнительным и поправочный коэффициент для него принимают равным единице. Калибровочные (градуировочные) коэффициенты К_і рассчитывают по формуле:

С_i – концентрация i-компонента в модельной смеси со стандартным веществом;

С_ст – концентрация стандартного вещества;

П_ст и П_i – параметры пиков вещества – стандарта и i-компонента.

За 100% принимают сумму исправленных параметров К_іП_і и результат анализа рассчитывается так, как и в методе нормирования:

Преимущество: 1) нет надобности точности дозирования образца пробы;

2) не абсолютная тождественность условий анализа при повторных определениях.

 

3. Метод абсолютной калибровки (наиболее точный).

Экспериментально определяют зависимость высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочные графики. Далее определяют те же характеристики пиков в анализируемой смеси и за градуировочным графиком находят концентрацию анализируемого вещества.

Это основной метод определения примесей.

Преимущество: не требует разделения всех компонентов пробы, а только тех, которые необходимо определить.

 

4. Метод внутреннего стандарта.

Базируется на введении в анализируемую смесь точно известного количества стандартного вещества. В качестве стандартного вещества выбирают вещество, близкое по физико-химическим свойствам к компонентам смеси, но не обязательно компонент смеси.

В исследуемый раствор и стандартный раствор определяемого вещества прибавляют строго одинаковое количество внутреннего стандарта.

После хроматографирования измеряют параметры пиков анализируемого компонента и внутреннего стандарта на хроматограмме исследуемого раствора и такие же параметры на хроматограмме стандартного раствора определяемого вещества.

Для каждой хроматограмме рассчитывают отношение площади или высоты пика анализируемого вещества к площади или высоте пика внутреннего стандарта. Полученные отношения усредняют для испытуемого раствора и стандартного раствора (за тремя  (а по требованиям ГФУ – пятью) хроматограммами, по меньшей мере для каждого раствора). За найденными средними значениями рассчитывают концентрацию определяемого компонента в испытуемом растворе.

Преимущество: 1) учет режима работы прибора (t°, u_{газа носителя}).

           2) повышенная точность вследствие независимости от воспроизводимости параллельных хроматографирований и хроматографирований стандартного и исследуемого растворов.

Требования к внутреннему стандарту:

1. Хорошая растворимость в пробе и химическая инертность к компонентам анализируемой смеси, неподвижной фазе и твердому носителю.

2.     Внутренний стандарт выбирают из числа соединений, близких к объектам анализа по структуре и летучести.

3.     Количество внутреннего стандарта в пробе подбирают так, чтобы отношение площадей пиков стандарта и определяемого вещества было близко к 1.

4.     Пик внутреннего стандарта на хроматограмме должен размещаться в непосредственной близости к пикам соединений – объектов анализа, не накладываясь ни на них, ни на пики других веществ.

ГФУ требует, чтобы ни один из пиков, которые относятся к анализируемому веществу или его примеси, не маскировались пиком внутреннего стандарта.

5.     Внутренний стандарт не должен содержать примесей, которые накладываются с пиками определяемых веществ-компонентов пробы.

6.     Если определяют в пробе два и больше веществ, которые значительно отличаются временами удерживания, то целесообразно использовать 2 и больше внутренних стандартов.

 

Применение в фармацевтическом анализе, технологии и токсикологическом анализе:

1.     Контроль качества субстанций и лекарственных форм – идентификация и количественное определение летучих остаточных растворителей, следы которых остаются в препаратах после их получения.

2.     Определение содержания спирта и других органических растворителей в готовых ЛС.

3.     Определение консервантов (нипагин, нипазол, сорбиновая кислота) в детских сиропах.

4.     Определение некоторых консервантов в инъекционных растворах (хлорбутанолгидрат в Коргликоне).

5.                 Контроль качества галеновых препаратов.

6.                 Контроль технологических процессов получения галеновых и новогаленовых препаратов.

7.                 Определения метаболических профилей биологических жидкостей (кровь, моча, слюна).

 

6. Теоретические основы жидкостной хроматографии

 

Жидкостная хроматография – это метод разделения и анализа сложных смесей, в котором подвижной фазой является жидкость.

Не смотря на большие достижения методов газовой хроматографии (ГХ), они не могут применяться для определения веществ с высокой молярной массой (больше ~ 300), нелетучих, термически нестойких, ионогенных соединений.

Жидкостная хроматография применяется для разделения более широкого круга веществ, чем ГХ, поскольку большинство веществ являются нелетучими, многие из них являются нестойкими при высоких температурах (в особенности ВМС) и разлагаются при переведении в газообразное состояние. В ЖХ разделение чаще всего происходит при комнатной температуре.

ЖХ базируется на адсорбции из раствора. Адсорбционная равновесие между раствором и адсорбентом согласуется с уравнением изотермы адсорбции Ленгмюра, в области разбавленных растворов изотерма линейная. Селективность адсорбции зависит от природы сил взаимодействия между адсорбированными веществами и адсорбентом.

Эффективность хроматографической колонки зависит, главным образом, от процессов диффузии и массопереноса в обеих фазах и определяется, как и в газовой хроматографии, высотой эквивалентной теоретической тарелке H (ВЭТТ). С линейной скоростью подвижной фазы U и некоторыми другими величинами ВЭТТ связана уравнением

H = 2R_r(1 – R_r)Ut_s,

где

где t_m – среднее время между десорбцией и повторной адсорбцией молекулы вещества, когда она движется со скоростью подвижной фазы U;

t_s – среднее время пребывания молекулы в неподвижной фазе.

Таким образом, с ростом линейной скорости движения подвижной фазы ВЭТТ возрастает и, соответственно, эффективность колонки уменьшается.

 

В классическом варианте ЖХ в стеклянную колонку длиной 1-2 м, заполненную сорбентом (размер частичек ³ 100 мкм), вводят анализируемую пробу и пропускают элюент. Скорость прохождения элюента под действием силы тяжести маленькая, а время анализа большое. Вследствие использования сорбентов с размером зерен 10-30 мкм, поверхностно – и объемно-пористых сорбентов с размером частичек 5-10 мкм, насосов, чувствительных детекторов состоялся переход от классической жидкостной хроматографии к ВЭЖХ. Быстрый массоперенос при высокой эффективности разделения разрешает использовать ВЭЖХ для разделения и определения молекул (адсорбционная и распределительная хроматография), для разделения и определения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзивная или гель-хроматография). Методами афинной и лигандообменной хроматографии разделяют БА молекулы и оптические изомеры.

                                              

  Жидкостная

                                         адсорбционная хроматография

                                                

                     нормально-фазовая              обратно-фазовая

           полярный адсорбент                            неполярный адсорбент

неполярная подвижная фаза             полярная подвижная фаза

 

!!! Выбор подвижной фазы всегда важен, чем выбор неподвижной фазы.

 

Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества.

Подвижная фаза, то есть растворитель или, чаще, смесь растворителей, должна обеспечить разную емкость колонки и эффективное разделение за оптимальное время.

Неподвижная фаза – пористые тонкодисперсные материалы с удельной поверхностью больше 50 м²/г.

Неподвижные фазы

 

                            полярные                                                неполярные

 SiО₂, Al₂O₃, Me_xO_y, флоросил,                графитованная сажа, кизельгур,

а также с привитими полярными                      диатомит.

            группами (–NH₂, – ОН, диолы)

для разделения неполярных                                 не имеют селективности к

и малополярних, средней                                   полярным молекулам

полярности веществ

Указанные сорбенты наносятся на поверхностно-пористые носители.

Подвижная фаза

От нее зависит:

–                               селективность разделения;

–                               эффективность колонки;

–                               скорость движения хроматографической зоны.

 

Требования к подвижной фазе:

1)                            должна растворять исследуемую пробу;

2)                            малая вязкость (коэффициенты диффузии D компонентов пробы достаточно высокие);

3)                            возможное выделение из нее разделяемых компонентов;

4)                            инертность по отношению к материалам всех частей хроматографа;

5)                            отвечает требованиям выбранного детектора;

6)                            безопасная;

7)                            дешевая.

!!! Как было сказано, элюирующая сила подвижной фазы – растворителя влияет на разделение.

Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например, н-гептана.

 

Растворители (элюенты) делят на слабые и сильные.

Слабые элюенты мало адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения D сорбата высокие.

Сильные элюенты сильно адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения D сорбированных веществ (сорбата) низкие.

Например: SiО₂ – неподвижная фаза.

Сила растворителей увеличивается в ряде:

пентан (0) < CCl₄ (0,11) < C₆H₆ (0,25) < CHCl₃ (0,26) < CH₂Cl₂ (0,32) < ацетон (0,47) < диоксан (0,49) < ацетонитрил (0,5)

< этанол < метанол.

В качестве меры относительной полярности принимают шкалу Гильдебранда.

Последовательность растворителей в соответствии с возрастанием их элюирующей силы называют элюотропным рядом.

В жидкостной адсорбционной хроматографии элюотропный ряд Снайдера имеет вид:

пентан (0) < н-гексан (0,01) < циклогексан (0,04) < CCl₄ (0,18) < бензол (0,32) < CHCl₃ (0,38) < ацетон (0,51), этанол (0,88) <  вода, СН₃СООН  (очень большая).

Для обратно-фазовой хроматографии на С₁₈ элюотропный ряд имеет вид:

метанол (1,0), ацетонитрил (3,1), этанол (3,1), изопропанол (8,3), н-пропанол (10,1), диоксан (11,7).

Часто применяют не отдельные растворители, а их смеси. Незначительные количества добавленных других растворителей, в особенности воды, существенным образом увеличивают элюирующую силу элюента.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за оптимальное время. Тогда используют метод ступенчатого или градиентного элюирования. Для увеличения силы элюента в процессе хроматографирования последовательно применяют все более сильные элюенты. Это разрешает элюировать все более сильно удерживаемые вещества за меньшее время.

Существуют эмпирические правила, которые помогают при выборе элюента. Сорбция, как правило, возрастает с увеличением числа двойных связей и ОН-групп в соединениях.

Сорбция уменьшается в ряде органических соединений: кислоты > спирты > альдегиды > кетоны > сложные эфиры > ненасыщенные углеводороды > насыщенные углеводороды.

Для разделения веществ разной полярности и для разделения соединений разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: из неполярных подвижных фаз соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время (время удерживания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабо полярным). Для очень полярных молекул t_r очень большие и анализ при использовании неполярного элюента невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных сорбатов переходят к полярным элюентам. В обратно-фазовом варианте неподвижная обратная фаза сильнее адсорбирует неполярные компоненты из полярных элюентов, например из воды. Снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя (метанол), можно уменьшить времена удерживания компонентов.

 

7. ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ или хроматография высокого давления, базируется на тех же принципах, що и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, которая не смешивается с жидкой НФ хроматографической колонки. Таким образом, в ВЭЖХ обе контактирующие фазы – НФ и ПФ – жидкости. Разделение компонентов базируется на отличиях их коэффициентов распределения между НФ и ПФ.

Метод распределительной, или жидкость-жидкостной хроматографии базируется на распределении вещества между двумя фазами, которые не смешиваются, а значит сводится к многократной ступенчатой экстракции.

Жидкую неподвижную фазу наносят на пористый достаточно инертный сорбент, как в газожидкостной хроматографии, и заполняют им колонку. При пропускании жидкой подвижной фазы через колонку смесь разделяется на компоненты главным образом за счет их разной растворимости в жидкой неподвижной фазе, согласно и соответственно одних и тех же механизмов, которые были в газожидкостной хроматографии. Обычно, растворимость компонентов пробы в неподвижной и подвижной фазах, которые владеют разной полярностью, очень отличается. Если растворимость пробы выше в неподвижной фазе, то время удерживания компонентов значительно возрастает, если растворимость выше в подвижной фазе, то время удерживания может быть близко к t_m – времени удерживания компонента, который не сорбируется. Чтобы достичь разделения, в подвижную фазу, насыщенную неподвижной, включают третий компонент, который снижает отличия по полярности неподвижной и подвижной фаз. Например, к смеси неполярного (гексан) и полярного (вода) растворителей прибавляют спирт. Только в этом случае удается подобрать оптимальные условия для разделения компонентов смеси.

Обычно полярный растворитель (вода, спирт) фиксируют на твердом носителе – силикагеле, диатомите, целлюлозе, Al₂O₃. Подвижной фазой в этом случае есть неполярные растворители – изооктан, бензол и т.д. Такие системы используют в нормально-фазовой распределительной хроматографии.

 

Если неполярный растворитель зафиксировать на носителе, а в качестве подвижной фазы использовать полярные растворители (вода, спирт, буферные растворы, сильные кислоты), то такой вариант называют обратно-фазовой распределительной хроматографией. Нанесенные жидкие фазы имеют большой недостаток – они быстро смываются подвижной жидкой фазой с поверхности носителя, в особенности при использовании ВЭЖХ. Поэтому жидкие фазы “пришивают” к носителю.

В качестве носителей неподвижных жидких фаз для нормально-фазовой распределительной хроматографии используют силикагели с пришитыми нитрильными, аминными и другими группами.

В обратно-фазовом варианте распределительной хроматографии используют силикагели с привитыми алкилсилильными группами от С₂ до С₂₂ (часто применяемыми фазами являются фазы с пришитыми С₁₈).

Главные узлы жидкостного хроматографа:

–                               система подачи подвижной фазы (насос, дегазатор, система для создания градиента концентрации подвижной фазы, измерители давления).

u_{подвиж. ф.} = 0,1-10 мл/мин  р = до 400 атм.

–                               система введения пробы (дозирующая петля);

–                               колонка в термостате; (10, 15, 25 см с диаметром 4-5,5 мм) (5-6 см и диаметром 1-2 мм);

–                               детектор;

–                               регистрирующее устройство.

 

Для непрерывного контроля состава элюата, который вытекает из колонки, используют детекторы:

–                               дифференциальные рефрактометры – достаточно универсальный детектор (чувствительность ~ 10^{–6 г);}

–                               УФ-детектор (10^{–9 г) (254 нм);}

–                               фотометрические и спектрофотометрические;

–                               диодная матрица (УФ- и видимый участок спектра при любой длине волны);

–                               флуоресцентные детекторы для обнаружения токсинов, микробиологических объектов, витаминов (чувствительны более чем в 100 раз);

–                               кондуктометрический для ионной и ионообменной хроматографии (0,01 мкг/мл – 100 мг/мл).

 

Применение ВЭЖХ:

Адсорбционная:

–                               углеводороды;

–                               полициклические углеводороды;

–                               пластификаторы.

Распределительная:

–                               пластификаторы;

–                               углеводные;

–                               пестициды;

–                               ароматические углеводороды и кислоты;

–                               стероиды.

Ионообменная:

–                               аминокислоты;

–                               наркотические и анальгетики средства;

–                               фторированные углеводороды;

–                               компоненты масел (вазелинового).

 

Качественный анализ (ГФУ):

1.                 сравнение времен удерживания анализируемого вещества в испытуемой пробе и растворе сравнения (стандартный раствор этого же вещества) – чаще всего используется;

2.                 сравнения относительных времен содержания анализируемого вещества в испытанной пробе и растворе сравнения (стандартный раствор этого же вещества) – применяется, когда возможное невоспроизведение условий хроматографування;

3.                 сравнения хроматограми испытанной пробы с хроматограмою раствора сравнения или с хроматограмою, приведенной в отдельной статье (для препаратов растительного и животного происхождения).

 

Для количественного определения определяют площади пиков или высоты пиков (ДФУ):

–                                               высоты разрешают считать только при ізократичному режиме хроматографування и при коэффициенте асимметрии 0.8-1.2.

–                                               площади пиков обязательно считать при градієнтному елююванні.

 

Количественный анализ (ДФУ) основного компоненту:

1.                 абсолютное калибрование

2.                 метод внутреннего стандарта.

 

Количественный анализ (ДФУ) примесей:

1.                 количественное определение примеси с использованием раствора сравнения с известной концентрацией примеси;

2.                 метод внутренней нормализации;

3.                 сравнения с разбавленным раствором основного вещества;

4.                 метод стандартных добавок (для повышения точности возможное использование метода внутреннего стандарта).

 

При методике обязательно отмечают:

–                                               параметры колонки (размеры, сорбент, коммерческая марка, размер частиц недвижимой фазы);

–                                               температуру колонки;

–                                               скорость и состав недвижимой фазы;

–                                               тип детектора.

 

Результаты анализа считаются достоверными, если выполняется тест „придатність хроматографічної системы”:

– относительные времена содержания указанных веществ должны быть близкими к указанным величинам;

– число теоретических тарелок, рассчитанное для указанного пика, может быть не меньше указанной величины;

– коэффициент разделения указанных пиков, рассчитанный с хроматограм растворов сравнения (стандартных), может быть не меньше указанной величины;

– относительное стандартное отклонение высоты или площади пику (или их отношений к высоте илиd площади пику внутреннего стандарта)   по результатам 5 хроматографувань может не превышать указанную величину;

– коэффициент симметрии указанного пику, рассчитанный с хроматограми (стандартного) раствора сравнения, может быть в границах, указанных в отдельной статье.

 

8. ТСХ – тонкослойная хроматография

Метод ТСХ, которое есть фармакопейным методом анализа, был разработан Измайловым и Шрайбером еще в 1938 г.

         В методе ТСХ недвижимая фаза нанесена тонким пластом на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. На расстоянии 2-3 см от края пластинки на стартовую линию наносят пробу исследуемой жидкости и погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель поднимается и двигается вдоль пласта сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, которая приводит к их пространственному разделению. Диффузия в тонком пласте сорбента проходит в продольном и поперечном направлениях, тому процес следует рассматривать как двухмерный.

 

         Сорбционные свойства системы в ТСХ рассчитываются с экспериментальных данных за уравнением для фактора подвижности:

где: Х₁ – расстояние от линии старта к центру зоны (за ДФУ к верхнему краю пятна);

      Х_f – расстояние, которое прошел растворитель за то же время.

 

На R_f влияют факторы:

–                                               качество и активность сорбента;

–                                               влага сорбента;

–                                               толщина пласта сорбента;

–                                               качество растворителя;

–                                               др. факторы, которые не всегда удается достаточно проконтролировать.

–                                              

 

На практике часто пользуются относительной величиной – относительным фактором подвижности:

Стандартное вещество (свидетель) в таком же растворителе наносится на стартовую линию рядом с исследуемой пробе и, таким образом хроматографируется в тех же условиях.

        

         Число теоретических тарелок n в методе ТСХ рассчитывается за соотношением

l_н – расстояние от линии старта к нижнему краю пятна;

l_п – расстояние, что показывает длину пятна в направлении распространения фронта растворителей.

Тогда высота, эквивалентная теоретической тарелке, будет равная:

Коэффициент разделения в тонком пласте сорбента K_f связанный с числом теоретических тарелок и подвижностями уравнением:

 

Подложки для сорбента (пластинки):

–                                               стекло:

–                                               алюминиевая фольга;

–                                               полиэфирная пленка.

Сорбенты в ТСХ:

–                                               силикагели;

–                                               оксид алюминия;

–                                               крахмаль;

–                                               целлюлоза и некоторые другие вещества с высокой адсорбционной способностью.

Выбор растворителей зависит от:

–                                               природы сорбента;

–                                               свойств исследуемых веществ.

 

!!! Часто применяют смеси растворителей с двух или трех компонентов. Например, при хроматографувании аминокислот используют смесь н-бутанола, ацетатной кислоты и воды; при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, которые создают постоянное значение рН.

 

ТСХ: – восходящая;

–   нисходящая;

–   круговая или горизонтальная.

 

По окончанию хроматографирования зоны на хроматограммах проявляют физическим или химическим способами.

Физический способ – УФ-свет или радиоавтографии (фотоматериалы – бумага или пленки).

Химический способ – проявка хроматограммы через опрыскивание раствором реактива

После проявки хроматограммы приступают к идентификации и дальнейшему анализу.

 

Основные элементы устройств и деталей для ТСХ:

–         камера со смесью растворителей;

–         хроматографические пластинки (Мерк, Силу фол, Сорбфил и т.п.);

–         устройство для нанесения или микрошприц или калиброванный капилляр;

–         устройство для детектирования хроматограмм – лампа для УФ- света при 254 и 365 нм;

–         устройство для орошения хроматограмм растворами разных реагентов;

–         камера для высушивания хроматограмм;

–         сканер для оценки интенсивности пятен на хроматограммах ли радиоактивные счетчики.

 

Качественный анализ в ТСХ при идентификации (ГФУ):

– основное пятно на хроматограмме, полученной для исследуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца (раствора сравнения), сравнивая окраски (цвет флуоресценции), размер и величину содержания (R_f) обеих пятен.

 

!!! предварительно проводится проверка пригодности ТСХ-пластинок: наносится стандартная смесь индикаторов – судан красный G, бромкрезоловий зеленый, метиловый красный и метиловый оранжевый и хроматографируется в системе растворителей метанол Р – толуол Р (20:80). Когда фронт растворителей пройдет две трети длины пластинки, она считается пригодной, если на хроматограмме будет четко 4 разделенных пятна:

–                                               пятно бромкрезолового зеленого с R_f не больше 0,15;

–                                               пятно метилового оранжевого с R_f в границах от 0,1 до 0.25;

–                                               пятно метилового красного с R_f в границах от 0,35 до 0,55;

–                                               пятно судана красного G с R_f в границах от 0,75 до 0.98.

 

Отдельные требования имеют пластинки, которые предназначенны для детектирования в УФ-свете.

 

Испытания на сопроводительные примеси (ГФУ):

–                     дополнительное пятно на хроматограмме, полученной для испытанного раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме, полученной для раствора сравнения. Как стандартный образец для изготовления раствора сравнения, используют как саму примесь, так и разные разведения испытанного раствора.

!!! Испытания на пригодность хроматографической системы проводится соответственно условиям, приведенным в конкретной АНД или статье.

!!! Проверка чувствительности – чувствительность считается удовлетворительной, если пятно или полоса четко оказываются на хроматограмме, полученной с наиболее разбавленным раствором сравнения.

 

Требования к проверке пригодности хроматографической системы:

– на хроматограмме раствора, используемого для проверки пригодности хроматографической системы, четко делятся пятна указанных в отдельной статье веществ;

– R_f основного пятна на хроматограмме испытанного раствора может быть около величины, указанной в отдельной статье;

– на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки чувствительности хроматографической системы, может быть четко видно пятно.

 

Количественные измерения:

1.     непосредственное определение на пластинке с помощью измерения пропуск или отражения света, флуоресценции (фотоденситометры).

2.     непосредственно на пластинке или на отдельных разрезанных полосах пластинок с помощью счетчиков радиоактивности.

3.     снятием неподвижной фазы, растворением ее в соответствующем растворителе или коктейле и измерения подходящего физического показателя или радиоактивности полученного раствора.

 

9. Бумажная хроматография

 

–                                               случай плоскостной жидкост-жидкостной распределительной хроматографии, которая базируется на разделении веществ, которое происходит по счет различия растворимости в подвижной фазе и недвижимой фазе (вода в порах бумаги).

 

Варианты бумажной хроматографии:

–         восходящая;

–         нисходящая;

–         круговая.

Качественный анализ – как в ТСХ.

Количественный анализ:

–         визуальная оценка – сравнения интенсивности окраска пятен;

–         оценка площадей пятен;

–         вырезания пятна и взвешивания для пятен исследуемого образца и стандартного раствора;

–         элюирование веществ из пятен и следующее  определение подходящим физико-химическим методом.

 

!!! Имеет значения для идентификации и как метод разделения некоторых БАР (сахариды, аминокислоты).