Методические указания

 

 

Методические указания

к практическим занятиям для студентов фармацевтического факультета.

 

ЗАНЯТИЕ № 2 (практическое – 6час.)

 

Темы:

1. Строение и физико-химические свойства белков-ферментов. Механизм действия ферментов, кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов.

2.Ферментативные процессы по типу реакци основных классов ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Механизм возникновения энзимопатий. Энзимодиагностика, энзимотерапия.

  

        Цель: Уметь исследовать при помощи качественных реакций зависимость действия ферментов от температуры и природы субстрата.Уметь исследовать зависимость действия фермента амилазы от рН среды и присутствия модификаторов, обяснять значенне этих свойств в медицинской практике. Объяснять изменения хода ферментативных процессов и накопления промежуточных продуктов метаболизма при врожденных (наследственных) и приобретенных пороках метаболизма – энзимопатиях. Анализировать изменения активности индикаторных ферментов плазмы крови при патологиях определенных органов и тканей.

 

Профессиональная ориентация студентов:

Ферменты являются участниками всех химических реакций, которые лежат в основе жизнедеятельности. Белковая природа ферментов определяет их высокую лабильность, чувствительность к разным воздействиям и смену активности при  патологических состояниях организма. Определение активности ферментов в биологических жидкостях организма широко применяется в клинической практике с диагностической целью, проверки эффективности лечения. Для достоверности таких анализов важно придерживаться оптимальных условий их проведения, подбор субстратов, оптимального рН среды. Заболевания в той или иной мере сопровождаются нарушением биоэнергетических процессов, что катализируются оксидоредуктазами. Знания функций этих ферментов и факторов, влияющих на них, позволяют предупреждать и корректировать патологические процессы. Исследование диастазы, правильная трактовка результатов есть основой своевременной диагностики острого панкреатита, инфекционного паротита, злокачественных опухолей слюнных желез.

Исследование активности каталазы, пероксидазы дает представление о состоянии антиоксидной защиты организма, и понижение этих показателей есть признаком генетического их дефекта, заболеваний на туберкулез, злокачественные опухоли, анемию.

Знание оптимальных условий каталитической активности ферментов является важной предпосылкой понимания патогенеза болезни и обосновывает выбор методик исследования ферментов с диагностической целью.

 

 Методика выполнения практической работы.- 9.00-12.00 час.

І. Предмет, задачи, основные этапы и современные направления развития биохимии. Строение и физико-химические свойства белков-ферментов. Механизм действия ферментов, кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов. Работа 1. Выявление амилазы в слюне.

             Фермент амилаза постепенно гидролизует крахмал через промежуточные продукты (декстрины) к мальтозе. Последняя под воздействием фермента мальтазы расщепляется на 2 молекулы глюкозы. Нерасщепленный крахмал дает с иодом синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины молекул, дают с йодом разные окрашивания: амилодекстрины-фиолетовое,  еритродекстрины-красно-бурое, ахродекстрины-желтое (цвет йода в воде). Конечные продукты гидролиза крахмала – мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакциями Тромера или Фелинга.

     Принцип метода. О наличии амилазы в слюне свидетельствует расщепление в ее присутствии крахмала, на что указывает в конечном результате негативная реакция с йодом или позитивная реакция Тромера или Фелинга.

        Исследуемый материал, реактивы, обладнання– слюна; 1% раствор крахмала; 10% раствор NаОН (или КОН) и 1% раствор сульфата меди, или реактив Фелинга; 0,1% раствор йода в 0,2% растворе йодида калия; термостат или водяная баня; пипетки; пробирки; цилиндр на 10 или 25 мл.

Ход работы.   Берут 2 пробирки. В одну из них (опыт) набирают 1 мл слюны, предварительно разведенной в 10 раз. В друге (контроль) наливают 1 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора крахмала и ставят на 10 мин в водяную баню при 37^оС. После инкубации содержание пробирок делят на 2 ровных половины. С одной половиной растворов выполняют качественную реакцию на крахмал, а из другой-реакцию на продукты его гидролиза (Тромера или Фелинга).

 

 Реакция на крахмал  (иодная проба).

      К 1 мл исследуемого раствора добавляют 1-2 капли иода в иодиде калия. При наличии крахмала появляется синяя расцветка.

 

Реакция Тромера.

  Принцип основывается на восстановлении гидроксида меди(ІІ) до оксида меди(І) за счет окисления альдегидной  группы глюкозы или мальтозы.

    Ход работы. К 1 мл исследуемого раствора добавляют 1 мл 10% NаОН и 0,5 мл 1% СuSO₄. Осторожно нагревают верхнюю часть смеси к моменту закипания. При наличии глюкозы или мальтозы появляется кирпично-красная расцветка (позитивная реакция).

 

      Реакция Фелинга. Принцип аналогичен реакции Тромера. Преимуществом реакции Фелинга является то, что медь зсвязана с сегнетовой солью и не образует при избытке реактива Фелинга окиси меди черного цвета, который маскирует основную реакцию.

 

        Ход работы.    До 1 мл исследуемого раствора добавляют равный объем реактива Фелинга и осторожно нагревают пробирку до закипанию смеси. При наличии глюкозы или мальтозы наблюдается образование кирпично-красного осадка.

 

Работа 2. Исследовать влияние температуры на активность амилазы слюны.

 

 Одним из характерных свойств ферментов есть термолабильность, то есть чувствительность к изменениям температуры. Температура, при которой наблюдается максимальная скорость ферментативной реакции, называется оптимальной. Для большинства ферментов ее значение лежит в пределах 35-40^о С. При повышении температуры белковая часть фермента может денатурировать и он теряет каталитические свойства. При снижении температуры активность резко снижается.

Принцип метода. О зависимости активности амилазы слюны от температуры судят за расщеплением под ее влиянием крахмала в разных температурных условиях. Степень расщепления крахмала обнаруживают иодокрахмальной реакцией или реакцией Фелинга.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование -слюна; 1% раствор иода в иодиде калия; 0,5% раствор крахмала; реактив Фелинга; термостат или водяная баня; лед; пипетки; пробирки; водяной термометр.

Ход работы.

Набирают в пробирку 1 мл слюны и разводят ее в 10 раз, добавляя 9 мл воды. В другую пробирку отбирают 1 мл этой разведенной слюны и кипятят ее в течение 1-2 мин, после чего охлаждают проточной водой.

В четыре другие чистые пробирки наливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала. В первую и вторую добавляют по 1 мл разведенной слюны (приготовленной в самом начале работы). В третью пробирку добавляют 1 мл прокипяченой слюны, в четвертую-1 мл воды (контроль). Первую пробирку вмещают в стакан с льдом, остальные три пробирки – в водяную баню при t 38^о С на 10 мин. После этого содержание каждой из 4-х пробирок делят на 2 равных части. С первой половиной растворов проводят реакцию с иодом, а со второй половиной- реакцию Фелинга. Отмечают цвет в обеих рядах пробирок. Результаты заносят в таблицу:

 

 

Работа 3. Исследовать влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Принцип работы. Активирующий влияние хлористого натрия и ингибирующее-сернокислой меди на активность амилазы определяют за степенью расщепления крахмала, о чем свидетельствуют результаты реакции с йодом.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование-слюна; 1% раствор NаСI; 1% раствор CuSO4; 1% раствор крахмала; 1% раствор иода в иодиде калия; мерный цилиндр; пипетки; пробирки; водяная баня или термостат; водяной термометр.

Ход работы. Развести слюну в цилиндре в 40 раз (в зависимости от активности слюны ее можно развести в 10, 20, 30, 50 раз). В три пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. В первую пробирку добавляют 2 капли воды (контроль); в другу– 2 капли 1% раствора NаСI; в третью-2 капли 1% раствора СuSO4. Дальше в каждую пробирку добавляют по 5 капель 1% раствора крахмала. Все три пробирки помещают в водяную баню при 38^о С на 5 мин. После инкубации во все пробирки добавляют по 1-2 капли раствора иода, перемешивают, наблюдают за расцветкой, за которой и определяют присутствие в пробе активатора или ингибитора. Можно добавить в каждую пробирку 1-2 мл воды-окрашивание будет более выразительно.

 

Работа 4. Исследовать влияние рН среды на активность амилазы слюны.

Фермент проявляет максимальную активность при оптимальном значении рН. Каждый фермент имеет свой оптимум рН: пепсин – 1,5-2,5; аргиназа-9,5; амилаза-6,8-7,0. С изменением рН меняется степень диссоциации ионогенных групп, фермент изменяет свою конфигурацию, в том числе, активного центра, который предопределяет снижение или потерю его каталитических свойств.

Принцип метода. Оптимум рН для амилазы слюны можно установить за расщеплением крахмала при разных значениях рН среды. Степень гидролиза крахмала оценивается за результатом реакции с йодом. При оптимальном значении рН расщепление крахмала происходит полностью (расцветка с иодом отсутствует). По мере отдаления от оптимума рН в кислую  или щелочную сторону расщепления крахмала проходит частично, к стадии декстринов (фиолетовая или красно-бурая расцветка) или крахмал вообще не расщепляется (синяя расцветка).

Исследуемый материал, реактивы, оборудование – 0,2М Nа₂НРО₄; 0,1М раствор лимонной кислоты; 0,5% раствор крахмала; 0,1% раствор йода в 0,2% растворе иодида калия; термостат или водяная баня; пробирки; пипетки; мерный цилиндр; водяной термометр.

Ход работы. Берут 6 пробирок и готовят буферные растворы с разным значением рН согласно таблицы:

 

Таблица     Приготовления буферных растворов

 

 

В каждую пробирку приливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл слюны (предварительно разведенной в 50 раз). Содержание пробирок перемешивают и вмещают в термостат или водяную баню на 10 мин. при 37^о С. После инкубации во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают. Наблюдают расцветку и отмечают рН, при котором амилаза действует наиболее активно. Чтобы расцветка была более выразительной, можно в каждую пробирку добавить по 1-2 мл воды.

 

Работа 5. Исследовать специфичность действия амилазы и сахаразы.

 Специфичностью называется способность ферментов катализировать определенные химические реакции. Различают абсолютную, относительную, специфичность стереохимии. Специфичность предопределена белковой частью ферментов, а также строением их активного центра. Только некоторые четко определены функциональные группы ферментов могут принимать участие в образовании фермент-субстратних комплексов. Амилаза ускоряет гидролиз только полисахаридов (крахмала, гликогена) и не действует на олигосахариды. Мальтаза гидролизует расщепление мальтозы, но не действует на сахарозу.

Принцип метода. О специфичности амилазы и сахаразы свидетельствует их выборочное действие на субстраты. Продукты гидролиза субстратов определяются реакциями Тромера или Фелинга.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование – слюна; вытяжка из дрожжей; 0,5% раствор сазарози; 1% раствор крахмала; 10% раствор NаОН и 1% раствор CuSO₄ (или реактив Фелинга); термостат или водяная баня; пробирки; пипетки; водяной термометр.

                               

                             Специфичность амилазы

Ход работы.

В 2 пробирки вмещают по 1 мл слюны, разведенной в 5 раз. В первую пробирку добавляют 1 мл 1% крахмала, в другую-1 мл 0,5% раствора сахарозы. Обе пробирки ставят в термостат или водяную баню на 15 мин при t⁰ 38⁰С, после чего с содержанием пробирок выполняют реакцию Фелинга. Отмечают, с каким субстратом реакция позитивная.

                         Специфичность сахаразы

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 1 мл вытяжки из дрожжей. В первую пробирку добавляют 1 мл 0,5% раствора сахарозы, в другую-1 мл 1% раствора крахмала. Обе пробирки ставят в термостат или водяную баню на 15 мин при t 38^о С, после чего с содержанием пробирок выполняют  реакцию Фелинга. Отмечают, с каким субстратом реакция позитивная.

 

Результаты опытов заносят в таблицу:

 

                                               

 

ІІ. Ферментативные процессы по типу реакци основных классов ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Механизм возникновения энзимопатий. Энзимодиагностика, энзимотерапия.

Работа 6. Выявление каталазы в крови.

Выявление каталазы в крови.

  Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Содержится во всех тканях и жидкостях организма, но больше всего в строме эритроцитов и печени. В процессе окисаления некоторых веществ образуется пероксид водорода,  токсичный для организма. Каталаза (Н₂О₂:Н₂О₂-оксидоредуктаза) разлагает пероксид водорода :