Морфология и ультраструктура вирусов

Морфология и биология вирусов. Основные методы культивирования вирусов.

Методы индикаци вирусов.

Вирусы бактерий – бактериофаги. Структура, классификация. Формы взаимодействия  бактериофагов с бактериальной клеткой. Вирулентные и умеренные фаги.

Практическое применение бактериофагов.

Микробиологический контроль в стоматологических помещениях.

Санитарно-бактериологическое исследование воды, почвы, воздуха.

Санитарно-показательные микроорганизмы.

 

Современная вирусология представляет собой бурно разви­вающуюся отрасль естествознания, оказывающую большое влия­ние на развитие многих медико-биологических и клинических дисциплин. Изучение механизмов репродукции вирусов показало возможность их воспроизведения только из одной нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК- Открытие и последующее изучение явлений лизогении и вирогении, свидетельствующих о возмож­ности сохранения вирусной информации и передаче ее потомству, потребовало пересмотра сложившихся понятий о механизмах формирования, персистирующих инфекций и онкологических за­болеваний. Открытие нового вируса иммунодефицита человека ВИЧ доказало возможность образования новых видов, вызываю­щих определенные нозологические формы инфекций человека в современных условиях. Вместе с тем в области общей вирусоло­гии продолжает оставаться ряд нерешенных проблем, связан­ных с происхождением, генетикой и молекулярной биологией вирусов, изысканием путей химиотерапии вирусных инфек­ций и т. д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ

Стремительные темпы развития вирусологии во второй поло­вине нашего столетия позволили получить важнейшие сведения  о структуре и химическом составе разных вирусов, в том числе их генома, а также о характере взаимодействия с клетками хозяев.

Полученные материалы свидетельствуют о том, что вирусы существуют, в двух качественно разных формах: внекле­точной — в и р и о н  и  в н у т р и к л е т о ч  н о й — в и р у с. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопро-теид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой — капсидом. В то же время внутрикле­точный вирус есть самореплицирующаяся форма, не способная к бинарному делению. Тем самым в определение вируса закла­дывается принципиальное различие между клеточной формой микроорганизмов, размножающихся бинарным делением, и реп­лицирующейся формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других: 1) наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК); 2) отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем; 3) возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации.

Вместе с тем вирусы отличаются от обычных репликонов, ка­кими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов, поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи.

Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кисло­ты на два подцарства — р и б о вирусы и дезоксирибо-вирусы. Полцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение раз­ных видов.

В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается-типу нуклеиновой кислоты и ее молекуляр-но-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегменти­рованная, несегментированная, с повторяющимися и инверти­рованными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, по­лученные в результате электронно-микроскопических и иммуно­логических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локали­зация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, рН, детергентам и т. д.

В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств (табл. 1,2). Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кис­лоты, структурой, целостностью или фрагментацией генома, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровируеов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы.

Таблица 1.

Классификация ДНК-геномных вирусов

 

 

 

Таблица 2.

Классификация РНК-геномных вирусов

МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА ВИРИОНОВ

Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-—18 до 300—400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную» нитевидную, сферическую форму парал­лелепипеда, сперматозоидную.

Структура простого вириона — нуклеокапсида — свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота — ДНК или РНК — надежно защищена белковой оболочкой — капсидом.(рис. 1.).

 

Рис. 1.  Структура простого вируса

 

Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат принципы спираль­ной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов состоят из структурных субъединиц, уло­женных в виде спирали вокруг оси (рис. 2.). При таком расположении субъединиц обра­зуется полый канал, внутри которого ком­пактно уложена молекула вирусной нук­леиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковид­ного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. При этом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа).

 

        

Рис.2. Спиральный тип симметрии

Сферическая структура вирионов определяется капсидом, по­строенном по принципам кубической симметрии, в основе кото­рой лежит фигура икосаэдра — двадцатигранника (рис. 3.). Капсид сос­тоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул), которые объединены в морфологические субъединицы — к а п с о м е р ы. Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или 12.

 

        

 

Рис. 3. Кубический (икосаэдрический тип симметрии) вирусов. Структура капсида аденовируса

Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц — пентамеры, или из 6 субъединиц — гексамеры. Нуклеокапс и д сложноорганизованных вирионов, называемый «сердцеви­ной», покрыт внешней оболочкой — суперкапсидом(рис. 4.).

 

Рис. 4.  Структура сложного вируса

 

 

Рис. 5. Смешанный тип симметрии вирусов (бактериофаги).

 

 

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВИРИОНОВ

В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кис­лоты — РНК или ДНК — и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, которые они получают из клеток хозяина.

Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 • 10⁶—1 • 10 ). Она пример­но в 10—100 раз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По сво­ей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особен­ностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, кото­рые могут иметь линейную или кольцевую форму. Хотя в каж­дой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертирован­ные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК- Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, так и двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными марке­рами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транс­крибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.

Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной для всех РНК однонитевой формой у ряда виру­сов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линей­ной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спираль­ные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вслед­ствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Одно­нитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций подразделяют на две группы. К первой относят РНК, облада­ющие способностью транслировать закодированную в ней инфор­мацию на рибосомы клетки хозяина, т. е. выполнять функцию «РНК. Ее называют плюс-нить и обозначают знаком «+» (пози­тивный геном). Ко второй группе относят вирусные одноцепочечные РНК, которые не могут функционировать как «РНК, а так же как ДНК служат лишь матрицей для ее образования. Такие РНК называют минус-нить, обозначают знаком «—» (не­гативный геном). РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от ми-нус-нитевых имеют характерные модифицированные концы в ви­де «шапочки», которые необходимы для специфического узна­вания рибосом. Вирусные РНК состоят из нескольких фрагмен­тов (например, РНК вируса гриппа) или представлены нефраг-ментированной молекулой (РНК парамиксовирусов).

     У двунитевых как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана в одной цепи. Однако существуют вирусы, у которых информация может быть частично закоди­рована и во второй цепи. Таким образом, достигается экономия генетического материала. В то же время это указывает на то, что проведение оценки количества генетической информации по молекулярной массе ДНК или РНК может оказаться недостовер­ной.

Вирусные белки, так же как и белки клеточных организ­мов, подразделяют на структурные и функциональные. Первые входят главным образом в состав вирусного капсида, вторые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репро­дукции вирусов.

Структурные белки у простых вирионов, лишенных суперкапсида, представлены капсидными белками, которые образуют фут­ляр, защищающий нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их сос­тав входят белки, несущие «адресную» функцию, заключающую­ся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. Они могут участвовать также в адсорбции вирусов на этих клетках и проникновении в них. У сложных вирионов, имеющих внеш­нюю оболочку, капсидные белки также выполняют защитную функцию. Однако они не принимают прямого участия в адсорб­ции вируса и проникновении в клетку хозяина. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных РНК или ДНК. Кроме того, в составе вирионов имеются так называемые «внутренние» гистоноподобные белки, связанные с вирусной нуклеиновой кислотой. Они образуют рибо- или дезоксирибо-нуклеопротеиды, которые обладают определенными антигенными свойствами.

Существенной особенностью капсидных белков является стро­го упорядоченная структура, обеспечивающая построение капсида из субъединиц-капсомеров, состоящих из идентичных полипеп­тидных цепей, способных к самосборке. Таким образом дости­гается экономия генетического материала вируса. В противном случае, для синтеза разных капсидных белков потребовалась бы информация, закодированная в гораздо большем количестве генов.

Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. У многих вирионов они располагаются в виде шиловидных отрост­ков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы об­ладают антигенными свойствами. Многие из них ответствен­ны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и при­нимают участие в слиянии с клеточной мембраной, обеспечивая тем самым проникновение вириона в клетку хозяина. Наряду с упомянутыми соединениями в составе суперкапсида имеются гликолипиды.

Липидный и углеводный состав вириона  определяется  клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Липиды стабилизируют структуру сложных вирионов.

Ферменты вирусов. В отличие от прокариот и клеток всех других организмов, вирусы лишены ферментов, участвующих в многочисленных метаболических реакциях. Однако многие вирусы содержат в составе капсидов одну или две группы фер­ментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрип­ции, ко второй — ферменты, участвующие в проникновении ви­русной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе обра­зовавшихся вирионов  (нейраминидаза, лизоцим,  АТФ-аза).

Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. К первым относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК- и РНК-полимеразы), обна­руженные у многих вирусов, обратная транскриптаза ретро-вирусов, а также эндо- и экзонуклеазы, АТФ-аза, нейраминида­за отдельных вирусов.

Вирусиндуцированными считаются те ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме. Прежде всего это от­носится к РНК-полимеразам пикорна-, тога-, орто- и парамик-совирусам, а также ДНК-полимеразе покс- и герпесвирусов.

Наряду с собственными вирусы используют клеточные фер­менты, которые не являются вирусспецифическими. Однако их активность может модифицироваться в процессе репродукции вируса.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ ХОЗЯИНА

Взаимодействие вируса с клеткой хозяина — это сложный многоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжа­ется после их проникновения внутрь клетки. В результате та­кого взаимодействия развивается либо продуктивная, либо абор­тивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При продуктивной форме происходит размножение, точнее репродукция (лат. reproduce — воспроизводить) вируса, при абортивной — ее нарушение на одном из этапов, при и н-тегративной — интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном.

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ

Как отмечалось выше, вирусы являются самореплицирую­щейся формой, неспособной к бинарному делению, в отличие от микроорганизмов с клеточной организацией. В 50-х годах было установлено, что размножение, или репродукция, вирусов про­исходит путем репликации их нуклеиновой кислоты и биосинте­за белков с последующей самосборкой вириона. Этот процесс происходит   в   разных   частях   клетки — ядре   или   цитоплазме,          вследствие чего получил название

дизъюнктивного, т. е. разобщенного размножения.

Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках че­ловека и животных, насекомых, растений и бактерий, которая состоит в подчинении клеточных матрично-генетических меха­низмов вирусной информации (рис. 6.).

1-я стадия — адсорбция — характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой глико-протеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кис­лоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эритроцитов, на которых адсорбируются многие вирусы. Для орто- и парамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других — белки или липиды клеточной мембраны.

Рецепторами вирусов являются так называемые «прикре­пительные» белки, располагающиеся в составе капсидов прос­тых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов (глико-протеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамик-со-, рабдо-, арено- и буньявирусов).

Первый этап адсорбции определяется неспецифическими си­лами межмолекулярного притяжения, второй — специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.

2-я стадия — проникновение вируса в клетку хозяина — происходит путем виропексиса и слияния мембран. Виропексис есть не что иное, как частный случай рецепторного эндоцито-за, который состоит в инвагинации участка плазматической мембраны, где имеются углубления, покрытые рецепторами снаружи, на которых адсорбируется вирус. Затем происходит образование вакуоли вокруг вируса, в составе ко­торой он находится в цитоплазме клетки хозяина. (рис.7, 8.). Описанный способ проникновения вирусных частиц характерен для аденови­русов, вируса гриппа и др.

 

Рис. 6. Схема репродукции вируса

 

3-я стадия — «раздевание» вирионов — заключается в их депротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, пре­пятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. «Раз­девание» вириона начинается сразу же после его прикреп­ления к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолити-ческих ферментов, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мембраной.

Рис. 7. Проникновение вируса в клетку хозяина путем рецепторного эндо-цитоза (виропексис).

1 — внеклеточный онко­вирус типа С; 2 — адсорб­ция вируса на свободной клеточной поверхности; 3 — впячивание клеточной обо­лочки; 1а, 2а, За — после­довательные этапы проник­новения вируса, почкующе­гося на поверхности сосед­них клеток; 4—локализа­ция вируса в фагосоме; 5 — проникновение сердцевины вируса в цитоплазму; 6 — деструкция вируса в фаго-лизосоме. ПО — плазмати­ческая оболочка, ОВ — обо лочка вируса, От — отросток оболочки вируса; Сц — сердцевина вириона.

Рис.   8.   Проникновение   вируса   в   клетку   хозяина   путем   слияния   мембран.

1 — внеклеточный онковирус; 2, 3, 4 — последовательные этапы слияния оболочки

вируса   и   клетки;   ОВ — оболочка   вириона;   От — отросток   оболочки   вируса;   Сц —сердцевина вириона.

 

4-я стадия заключается в транскрипции и репликации ви­русных геномов. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит, так же как и клеточно­го генома, по триаде ДНК-> «РНК->- белок (рис. 5.5, а). Раз­личия касаются только происхождения фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина (например, вирус оспы), имеется собственная вирусспецифичес-кая РНК-полимераза. Вирусы, геномы которых транскриби­руются в ядре (папова- и аденовирусы, вирусы герпеса), исполь­зуют содержащуюся там клеточную РНК-полимеразу II или III.

У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осу­ществляется несколькими путями.

1. Вирусы с негативным геномом (минус-нитевые), к которым относятся орто-, парамиксо- и рабдовирусы (см. табл. 1), имеют в своем составе вирусспецифическую РНК-полиме­разу или транскриптазу. Они синтезируют ыРНК на матрице геномной РНК- Подобный фермент отсутствует в нормальных клетках,   но   синтезируется   клетками,   зараженными   вирусами.

Он   находится   в   составе  как  однонитевых,  так  и   двунитевых РНК-содержащих вирусов.

2.      У   вирусов    с    положительным    геномом    (плюс-нитевые), к которым относятся пикорна-, тогавирусы и др., функцию «РНК выполняет сам геном, который транслирует со­держащуюся в нем информацию на  рибосомы клетки хозяина.

3.      Особняком  стоит группа  РНК-содержащих ретровирусов, в составе которых имеется обратная транскриптаза, или ревертаза.  Уникальность этого фермента  состоит  в его способности переписывать информацию с РНК на ДНК- Этот процесс назывется обратной  транскрипцией.  

Как отмечалось выше, количество генов в вирусном геноме весьма ограничено. Поэтому для увеличения количества вирус­ной информации существует своеобразный трансляционный меха­низм, функционирующий через «РНК, который передает значи­тельно больше информации, чем записано в вирусной нуклеи­новой кислоте. Это достигается разными путями, например при транскрипции информации с переписывающихся участков ДНК на «РНК путем сплайсинга (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов), а также йри считывании антико-донами тРНК одной и той же молекулы ыРНК с разных нуклеоти-дов. При этом образуются новые триплеты, увеличивающие ко­личество транслируемой информации.

Регуляция транскрипции осуществляется клеточными и вирус-специфическими механизмами. Она заключается в последова­тельном считывании информации с так называемых «ранних» и «поздних» генов. В первых закодирована информация для син­теза вирусспецифических ферментов транскрипции и реплика­ции, во вторых — для синтеза капсидных белков.

Вирусспецифическая информация транслируется на рибосомы клетки хозяина, которые предварительно освобождаются от кле­точных  белков  и  собираются  в  вирусспецифические  полисомы.

Репликация вирусных геномов заключается в синтезе молекул ДНК или РНК, которые накапливаются в фондах этих нуклеи­новых кислот, использующихся при сборке вирионов.

Репликация вирусной ДНК происходит на обеих нитях при участии клеточной ДНК-полимеразы. У однонитевых вирусов вначале образуется вторая нить (репликативная форма).

Репликация вирусных РНК происходит только при участии того же вирусспецифического фермента, который катализирует транскрипцию вирусного генома. У плюс-нитевых вирусов репли­кация РНК практически не отличается от их транскрипции. У минус-нитевых вирусов репликация отличается от транскрип­ции длиной образовавшихся дочерних молекул РНК- При репли­кации они полностью соответствуют по своей протяженности ма­теринской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы ыРНК-

У ретровирусов репликация, так же как и транскрипция ДНК, происходит в составе клеточного генома при участии клеточной ДНК-полимеразы.

5-я стадия — сборка вириона — состоит прежде всего в образовании нуклеокапсидов. Поскольку синтез вирусных нукле­иновых кислот и белков в клетке происходит в разных структу­рах клетки, необходима транспортировка составных частей вири­она в одно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеино­вые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизволь­но соединяться друг с другом. В основе самосборки простых вирионов лежит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник. В других случаях полипептиды в виде спирали окружают вирусную нуклеиновую кислоту.

Многие простые вирионы собираются на репликативных ком­плексах — мембранах эндоплазматического ретикулума. У слож­ных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на реплика­тивных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкап­сидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкаю­щие к ним с другой стороны нуклеокапсидные участки выпячива­ются через клеточную мембрану, образуя почку, как это имеет место у орто- и парамиксовирусов, рабдовирусов. После отде­ления почки, содержащей нуклеокапсид и суперкапсидные белки, образуются свободные вирионы. Они либо через клеточную плазматическую мембрану проходят во внеклеточное пространст­во, либо через мембрану эндоплазматического ретикулума про­никают в вакуоль эндоплазматической сети. При этом мембран­ные липиды обволакивают почку, вытесняя из нее белки. Многие ДНК-содержащие вирусы, например вирус герпеса, собираются в ядре клетки на ее мембране, где образуются нуклеокапсиды. Затем они отпочковываются в перинуклеарное пространство, приобретая внешнюю оболочку. Дальнейшее формирование вириона происходит в мембранах цитоплазматического ретику

лума   и   в   аппарате   Гольджи,   откуда   вирус  транспортируется на поверхность клетки.

6-я стадия — выход вирусных частиц из клетки — происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, напри­мер пикорнавирусы, аденовирусы и др., вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие виру­сы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования, в результате чего в течение длитель­ного времени она сохраняет свою жизнеспособность (рис. 9. ). Такой путь характерен для вируса гриппа и др.

Рис. 9. Выход вируса иммунодефицита человека из клетки путем почкования

ИНТЕГРАЦИЯ ВИРУСНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТОЧНЫЙ ГЕНОМ

Данный путь взаимодействия между вирусом и клеткой хо­зяина не одинаков для ДНК- и РНК-содержащих вирусов. В первом случае вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. При этом место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющи­мися в определенных участках — ДНК сайтах при участии ряда ферментов: рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз. Вирус, интег­рированный в клеточный геном, называют провирусом.

В случае РНК-содержащих вирусов включение РНК в кле­точный геном происходит путем обратной транскрипции. Механизм обратной транскрипции состоит в перво­начальном образовании ДНК-транскрипта на матрице РНК при обязательном участии обратной транскриптазы. Этот транс­крипт представляет собой одну нить ДНК, являющуюся матри­цей для образования второй нити. Затем образовавшийся дву-нитевой ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном. Данный процесс объединения вирусной нук­леиновой кислоты с хромосомой клетки хозяина называется в и р о г е н и е й. В интегрированном состоянии вирусная ДНК мо­жет транскрибироваться в составе клеточного генома при участии клеточных РНК-полимераз.

Биологический смысл интегративного типа взаимодействия между вирусом и клеткой хозяина можно видеть прежде всего в сохранении вирусной информации в составе клеточного гено­ма и ее передаче потомству. Вместе с тем это в определенной степени отражается и на эволюции некоторых вирусов (на­пример, бактериофагов), которые при выщеплении из состава клеточной хромосомы могут захватывать отдельные ее гены.

С другой стороны, подобный тип взаимодействия может отразиться на судьбе клеток хозяина в зависимости от располо­жения локуса, в котором происходит интеграция вирусного генома, вплоть до расстройства регуляции синтеза белка и неконтролируемого деления клетки. Это может при­вести к онкогенной трансформации клеток хозяина и развитию разнообразных опухолей.

 

 

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

На первом этапе развития вирусологии единственным мето­дом, доказывающим наличие фильтрующихся инфекционных агентов в исследуемом материале, служило заражение лабора­торных животных. В 1931 г. в вирусологической практике стали использоваться куриные эмбрионы для репродукции вирусов с диагностическими целями, а также для производства вирусных вакцин.

   Методы культивирования вирусов. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, потому они могут репродуцироваться только в живой клетке. Исходя из этого, предложены три основных способа культивирования вирусов: на лабораторных животных, куриных эмбрионах и культурах клеток.
     Лабораторных животных используют для выделения вирусов и их идентификации из клинического, секционного материала в биологических пробах и реакциях нейтрализации. Для этого служат многообразные виды животных: белые мыши (взрослые и сосунки), гвинейские свинки, хомяки, кролики, мартышки, которых можно заражать в мозг, внутрибрюшинно, интраназально, под кожу и тому подобное. В зависимости от вида возбудителя, у подопытных животных развиваются характерные признаки поражения (рис.10.)
  

Рис. 10. Заражение мышей-сосунков при коксаки инфекции

 

  Куриные эмбрионы используют для выделения вирусов и определения их вида. Доступность и относительная дешевизна эмбрионов, простота в работе позволяют использовать их для приготовления диагностических препаратов и получения вакцин. Как правило, работают с 5-12-14-дневными эмбрионами. Заражения проводят открытым и закрытым способом в полость алантоису, полость амниона, на хорионалантоисну оболочку, в желтковый мешок (рис.11.).

 

Рис. 11. Заражение куриных эмбрионов. Бляшки на хорионалантоисной оболочке.

 

Современную вирусологическую диагностику трудно представить без использования клеточных культур. Культуры клетки разделяют на ряд групп. Первичные культуры получают из тканей человека или животных при их ферментативной дезинтеграции с помощью трипсина, хемотрипсина или версена. Культуры могут выдерживать до 10 делений в условиях in vitro. Они чувствительные ко многим вирусам, их можно получать в лабораториях в любом количестве. Чаще всего используют культуры почек эмбриона человека, почек мартышек, свиней, фибробласты куриных эмбрионов.

   Перевиваемые культуры – клетки, которые приобрели способность к безграничному росту. Как правило, они являются производными опухолей человека или животных. Такие культуры чувствительные ко многим вирусам, имеют тенденцию к безграничному росту, потому приобрели широкое применение в вирусологических лабораториях. Их выращивают в виде однослойных культур на поверхности стекла в флаконах или суспензии. Используют тканевые культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hер 2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости).

 

   Рис. 12. Нормальный монослой клеток (а), цитопатический эффект (b, c).

 

Диплоидные культуры – особенная группа клеток одного типа, которые выдерживают в лабораторных условиях до 100 пассажей, храня при этом исходный диплоидный набор хромосом. Они свободные от контаминации вирусами, микоплазмами, грибами, онкогенно безопасные, высокостабильные. Культуры линий IMR-90 (из легких 16-недельного плода человека) и J (клетки крови) используют для получения вакцинных штаммов вирусов.
   При размножении вирусов в тканевых культурах происходят многообразные изменения клеток. Всю совокупность их называют цитопатическим действием (ЦПД) или цитопатическим эффектом. Одни вирусы вызывают полную деструкцию (разрушение) клеток и отпадения их монослоя от стенки пробирки или флакона. Так действует, например, вирус полиомиелита. Другие вирусы вызывают в клетках разной степени дегенеративные изменения ядра и цитоплазмы, появление специфических включений и тому подобное. Такое цитопатическое действие проявляют вирусы натуральной оспы, бешенства, аденовирусы, герпесвируси. При заражении культуры вирусом кори или респираторно-синцитиальним вирусом образуются гигантские многоядерные отростчатые клетки – так называемые синцитии и симпласты (рис. 13, 14, 15, 16). Онкогенные вирусы вызывают ЦПД в виде клеточной пролиферации, что предопределяет образование опухолей.

Рис. 13. Различные виды цитопатического эффекта в культуре клеток

 

 

Рис. 14. Нормальный монослой (слева)и деструкция монослоя (справа)

Рис. 15. Цитопатический эффект в почечных клетках обезьяны 

Рис.16. Формирование синцития (многоядерных клеток).

 

ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ, ИЛИ ФАГИ)

В 1917 г. французский микробиолог Д’Эррель изучал возбу­дителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры при внесении в нее фильтрата испражнений больных людей.

Лизирующее начало сохранялось при многократном пассиро­вании культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом («пожиратель» бактерий от лат. pha–gos — пожирающий), а действие бактериофага, заканчивающе­еся лизисом бактерий, — феноменом бактериофагии.

Вместе с тем Д’Эррель правильно оценил биологический смысл открытого им феномена. Он высказал предположение, что бактериофаг является инфекционным агентом, лизирующим бактерии, вследствие чего в окружающую среду поступают дочерние фаговые частицы. На твердых средах, засеянных смесью фага с бактериальной культурой, в местах лизиса бак­терий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов. Посев этой же бактериальной культуры на жидкую среду приводит к просветлению среды. Позднее было показано, что фа­ги являются бактериальными вирусами, имеющими в качестве хозяев бактерии определенных видов. Номенклатура бактериофа­гов основана на видовом наименовании хозяина. Например, фа­ги, лизирующие дизентерийные бактерии, получили название ди­зентерийных бактериофагов, сальмонеллы — сальмонеллезных бактериофагов, дифтерийные бактерии — дифтерийных бактери­офагов и т. д.

В истории микробиологии изучение феномена бактериофагии занимает особое место. Простота культивирования, короткий пе­риод генерации, высокий выход фагового потомства и возмож­ность точного его количественного учета способствовали ус­пешному изучению многих проблем молекулярной генетики и общей вирусологии. В частности, в системе фаг — бактериаль­ная клетка впервые было открыто явление лизогении, по­лучившее позднее название интегративной инфекции.

Структура. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка. У некоторых фагов отросток очень корот­кий или вовсе отсутствует. Размеры фаговой частицы колеблются от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки равен 60—100 нм, длина отростка 100—200 нм.

Различают несколько морфологических типов бактериофагов. К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду. II тип составляют фаги с аналогом отростка. Это мел­кие РНК-содержащие фаги и однонитевой ДНК — фаг ф%174. К III типу относятся фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком, к IV типу — фаги с несокращающимся чехлом отростка и двуните-вой ДНК (Tl, T5 и др.). V тип представляют ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой разной формы  (Т2, Т4, Т6).

Наиболее изучены Т-фаги (англ. type — типовые). Они со­ставляют Т-группу коли-дизентерийных фагов, включающую 7 представителей: 4 нечетных Т1, ТЗ, Т5 и Т7 и 3 четных Т2, Т4, Т6. Наиболее сложной оказалась структура Т-четных фагов, в частности Т2 (см. рис. 17). Он состоит из головки гексагона­льной формы и отростка. Последний образован полым стержнем диаметром около 8 нм. Снаружи стержень окружен чехлом, спо­собным к сокращению. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная пластинка, в углах которой распола­гаются короткие зубцы. От каждого зубца отходит по одной нити длиной 150 нм. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции фага на бактериальной клетке.

 

 

Рис. 17, 18. Основные структуры бактериофага.

 

 

 

Химический состав. Фаги, как и другие вирусы, состоят из нуклеиновой кислоты и белка. Большинство их них содержат двунитевую ДНК, которая замкнута в кольцо. Однако сущест­вуют и однонитевые фаги, например фаг фх174. В составе некоторых фагов обнаружены ДНК с необычными азотистыми основаниями. Так, у фага Т2 вместо цитозина содержится 5-ок-симетилцитозин. Некоторые фаги содержит РНК.

Капсид головки фага и чехол отростка построены из поли­пептидных субъединиц по кубическому (головка) и спираль­ному (отросток) типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части        отростка (фаг Т2)

содержится фермент лизоцим. Внутри голов­ки у фага Т2 обнаружен внутренний белок, в состав которого входят полиамины (спермин, путресцин). Этот белок играет оп­ределенную роль в суперспирализации фаговой ДНК, которая только в таком виде может разместиться в сравнительно не­большой головке.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°—70 °С. Они хорошо переносят за­мораживание и длительно сохраняются при низких температу­рах и высушивании. Сулема (0,5% раствор), фенол (1 % раст­вор) не оказывают на них инактивирующего действия. В то же время 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколь­ко минут. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация так­же вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — му­тации.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характери­зуется последовательной сменой тех же стадий, которые были рассмотрены для вирусов животных и человека. Однако имеют­ся и некоторые особенности.

Адсорбция фага на бактериальной клетке происходит только при соответствии фаговых рецепторов, расположенных на конце отростка, с рецепторами бактериальной клетки, связан­ными с клеточной стенкой. Некоторые фаги адсорбируются на половых ворсинках (sex pili), контролируемых F– или R-плаз-мидами. На бактериях, полностью лишенных клеточ­ных стенок (протопласты), адсорбции фагов не происходит.

На адсорбцию фагов большое влияние оказывают состав и рН среды, температура, а также наличие некоторых аминокис­лот или других соединений, например триптофана для фага Т2.

Проникновение фага в бактериальную клетку про­исходит путем инъекции нуклеиновой кислоты через канал отрос­тка. При этом, в отличие от вирусов человека и животных, капсидные белки головки и отростка остаются вне клетки. (рис. 19.)

Некоторые фаги вводят свою ДНК без предварительного повреждения клеточной стенки бактерий, другие — сквозь от­верстия, которые они пробуравливают в клеточной стенке с помощью лизоцима, содержащегося в их капсиде.

Однонитевая ДНК фага срх174, а также нуклеиновая кис­лота нитчатых фагов проходят в клетку вместе с одним из кап-сидных белков.

 

 

 

 

Рис. 19. Адсорбция и проникновение фага в клетку

 

Репликация фаговой нуклеиновой кислоты и синтез фагоспецифических ферментов транскрипции и реплика­ции происходят примерно так же, как и при репродукции дру­гих вирусов. Однако латентный период инфекции, т. е. время для формирования фагового потомства, значительно короче.

Сборка фаговых частиц, или морфогенез, заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки (рис. 20.)

 

 

 

Рис. 20. Репликация нуклеиновой кислоты и сборка фаговых частиц.

Выход зрелых фагов из бактериальной клетки про­исходит путем «взрыва», во время которого зараженные бакте­рии лизируются. Лизис происходит при участии фагового лизоцима либо без него.(рис. 21.) Некоторые ДНК-содержащие нитчатые фаги (например, фаг fd) освобождаются из клетки путем «про­сачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и кле­точную стенку бактерии, во время которого они приобрета­ют капсиды. Бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность.

 

Рис. 21. Выход зрелых фагов из клетки.

 

 

Лизогения. Наряду с описанным продуктивным типом вза­имодействия бактериального вируса с клеткой хозяина, закан­чивающегося образованием фагового потомства и лизисом бак­терий, это взаимодействие может происходить по интегративному типу. Фаги, вызывающие данный тип инфекции, получили на­звание умеренных. Они отличаются от вирулентных тем, что встраивают свою ДНК в бактериальный геном, с кото­рым реплицируются. Фаговая ДНК, ассоциированная с геномом своего хозяина, носит название профага. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются л и-зогенными, а само явление — лизогенией. Это назва­ние отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к лизису при освобождении профага из состава бактериаль­ного генома и перехода в вирулентный фаг, способный репро­дуцироваться.

Спонтанный лизис нередко происходит в отдельных клетках популяции лизогенных бактерий, но не захватывает все клетки. Это связано со способностью лизогенных бактерий приобретать иммунитет к последующему заражению одноименным фагом, вследствие чего остальные лизогенные клетки, содержащиеся в бактериальной популяции, полностью сохраняют свою целост­ность и жизнеспособность.

Продукция фагов лизогенными бактериями значительно уве­личивается при их облучении суббактерицидными дозами УФ-лучей или обработке некоторыми химическими соединениями, взаимодействующими с их ДНК. Данный феномен называется индукцией   профага.

Как уже отмечалось, наличие профага в составе бактериаль­ного генома не мешает репликации ДНК бактериальной клет­ки и самого профага. Однако гены профага самостоятельно не транскрибируются, что связано с образованием репрессора — низкомолекулярного белка, блокирующего данный процесс. Син­тез репрессора контролируется генами профага. При инактива­ции репрессора УФ-облучением профаг выходит из состава бак­териального генома и превращается в вирулентный фаг, вызы­вающий продуктивную инфекцию.

Лизогенизация лежит в основе фаговой или лизогеннрй конверсии. Она заключается в изменении свойств у лизоген­ных бактерий, например приобретении способности продуци­ровать  токсин,   изменять  морфологию,   антигенные  свойства  и другие признаки. Механизм этого явления связан с внесением новой информации в бактериальную клетку.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособ­ными образовывать фаговое потомство, например, трансдуци-рующие фаги. Их используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение бактериофагов. Строгая специфич­ность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипи­рования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в ми­кробиологической практике. Он позволяет не только определить

видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее ф а г о тип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго опре­деленные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использова­ние наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологи­ческого анализа инфекционных заболеваний: установления источника инфекции и путей ее передачи.

Кроме того, по наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий, представляющих опасность для здоровья человека. Данный метод индикации патогенных бактерий также применяется в эпи­демиологической практике. Его эффективность повышается при постановке реакции нарастания титра фага, которая основана на способности специфических линий фагов репродуцироваться на строго определенных бактериальных культурах. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый воз­будитель, происходит нарастание его титра (рис. 22.). Широкое исполь­зование реакции нарастания титра фага осложняется труд­ностью получения индикаторных наборов фагов и другими при­чинами.

 

 

Рис. 22. Титрование фага, образование стерильных пятень

 

Применение фагов с лечебными и профилактическими целя­ми проводится сравнительно редко. Это связано с большим ко­личеством отрицательных результатов, которые объясняются следующими причинами: 1) строгой специфичностью фагов, ли-зирующих только те клетки бактериальной популяции, которые снабжены соответствующими рецепторами, вследствие чего фаго-резистентные особи, имеющиеся в каждой популяции, полностью сохраняют свою жизнеспособность; 2) широким применением более эффективных этиотропных средств — антибиотиков, не об­ладающих специфичностью бактериофагов.

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-прртейного, стафилококкового и других бактериофагов, а также наборы для фаготипирования брюшно­тифозных бактерий, стафилококков и др. Последние широко применяются с эпидемиологическими целями для установления ис­точника инфекции. Так, например, в случае выделения от раз­ных больных бактериальных культур, принадлежащих не только к одному виду, но и к одному фаготипу, можно считать, что они заразились из одного и того же источника инфекции. В случае выделения разных фаготипов следует искать несколько источ­ников инфекции.

В настоящее время препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вы­званных антибиотикорезистентными бактериями. При этом в каждом случае предварительно определяют чувствительность вы­деленных возбудителей к данному препарату бактериофага.

Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики одноименного заболевания в детских коллективах.

 

 

 

 

 

ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ, ИЛИ ФАГИ)

В 1917 г. французский микробиолог Д’Эррель изучал возбу­дителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры при внесении в нее фильтрата испражнений больных людей.

Лизирующее начало сохранялось при многократном пассиро­вании культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом («пожиратель» бактерий от лат. pha–gos — пожирающий), а действие бактериофага, заканчивающе­еся лизисом бактерий, — феноменом бактериофагии.

Вместе с тем Д’Эррель правильно оценил биологический смысл открытого им феномена. Он высказал предположение, что бактериофаг является инфекционным агентом, лизирующим бактерии, вследствие чего в окружающую среду поступают дочерние фаговые частицы. На твердых средах, засеянных смесью фага с бактериальной культурой, в местах лизиса бак­терий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов. Посев этой же бактериальной культуры на жидкую среду приводит к просветлению среды. Позднее было показано, что фа­ги являются бактериальными вирусами, имеющими в качестве хозяев бактерии определенных видов. Номенклатура бактериофа­гов основана на видовом наименовании хозяина. Например, фаги, лизирующие дизентерийные бактерии, получили название ди­зентерийных бактериофагов, сальмонеллы — сальмонеллезных бактериофагов, дифтерийные бактерии — дифтерийных бактери­офагов и т. д.

В истории микробиологии изучение феномена бактериофагии занимает особое место. Простота культивирования, короткий пе­риод генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного его количественного учета способствовали ус­пешному изучению многих проблем молекулярной генетики и общей вирусологии. В частности, в системе фаг — бактериальная клетка впервые было открыто явление лизогении, получившее позднее название интегративной инфекции.

Структура. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка. У некоторых фагов отросток очень корот­кий или вовсе отсутствует. Размеры фаговой частицы колеблются от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки равен 60—100 нм, длина отростка 100—200 нм.

Различают несколько морфологических типов бактериофагов. К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду. II тип составляют фаги с аналогом отростка. Это мел­кие РНК-содержащие фаги и однонитевой ДНК — фаг ф%174. К III типу относятся фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком, к IV типу — фаги с несокращающимся чехлом отростка и двуните-вой ДНК (Tl, T5 и др.). V тип представляют ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой разной формы  (Т2, Т4, Т6).

Наиболее изучены Т-фаги (англ. type — типовые). Они со­ставляют Т-группу коли-дизентерийных фагов, включающую 7 представителей: 4 нечетных Т1, ТЗ, Т5 и Т7 и 3 четных Т2, Т4, Т6. Наиболее сложной оказалась структура Т-четных фагов, в частности Т2 (см. рис. 17). Он состоит из головки гексагона­льной формы и отростка. Последний образован полым стержнем диаметром около 8 нм. Снаружи стержень окружен чехлом, спо­собным к сокращению. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная пластинка, в углах которой распола­гаются короткие зубцы. От каждого зубца отходит по одной нити длиной 150 нм. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции фага на бактериальной клетке.

 Химический состав. Фаги, как и другие вирусы, состоят из нуклеиновой кислоты и белка. Большинство их них содержат двунитевую ДНК, которая замкнута в кольцо. Однако сущест­вуют и однонитевые фаги, например фаг фх174. В составе некоторых фагов обнаружены ДНК с необычными азотистыми основаниями. Так, у фага Т2 вместо цитозина содержится 5-ок-симетилцитозин. Некоторые фаги содержит РНК.

Капсид головки фага и чехол отростка построены из поли­пептидных субъединиц по кубическому (головка) и спиральному (отросток) типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части отростка (фаг Т2)

содержится фермент лизоцим. Внутри головки у фага Т2 обнаружен внутренний белок, в состав которого входят полиамины (спермин, путресцин). Этот белок играет оп­ределенную роль в суперспирализации фаговой ДНК, которая только в таком виде может разместиться в сравнительно не­большой головке.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°—70 °С. Они хорошо переносят за­мораживание и длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Сулема (0,5% раствор), фенол (1 % раствор) не оказывают на них инактивирующего действия. В то же время 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколь­ко минут. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация таке вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — мутации.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характери­зуется последовательной сменой тех же стадий, которые были рассмотрены для вирусов животных и человека. Однако имеют­ся и некоторые особенности.

Адсорбция фага на бактериальной клетке происходит только при соответствии фаговых рецепторов, расположенных на конце отростка, с рецепторами бактериальной клетки, связаными с клеточной стенкой. Некоторые фаги адсорбируются на половых ворсинках (sex pili), контролируемых F– или R-плаз-мидами. На бактериях, полностью лишенных клеточ­ных стенок (протопласты), адсорбции фагов не происходит.

На адсорбцию фагов большое влияние оказывают состав и рН среды, температура, а также наличие некоторых аминокислот или других соединений, например триптофана для фага Т2.

Проникновение фага в бактериальную клетку про­исходит путем инъекции нуклеиновой кислоты через канал отрос­тка. При этом, в отличие от вирусов человека и животных, капсидные белки головки и отростка остаются вне клетки. (рис. 19.)

Некоторые фаги вводят свою ДНК без предварительного повреждения клеточной стенки бактерий, другие — сквозь от­верстия, которые они пробуравливают в клеточной стенке с помощью лизоцима, содержащегося в их капсиде.

Однонитевая ДНК фага срх174, а также нуклеиновая кис­лота нитчатых фагов проходят в клетку вместе с одним из кап-сидных белков.

 Репликация фаговой нуклеиновой кислоты и синтез фагоспецифических ферментов транскрипции и репликации происходят примерно так же, как и при репродукции других вирусов. Однако латентный период инфекции, т. е. время для формирования фагового потомства, значительно короче.

Сборка фаговых частиц, или морфогенез, заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки.

Выход зрелых фагов из бактериальной клетки происходит путем «взрыва», во время которого зараженные бактерии лизируются. Лизис происходит при участии фагового лизоцима либо без него.(рис. 21.) Некоторые ДНК-содержащие нитчатые фаги (например, фаг fd) освобождаются из клетки путем «про­сачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, во время которого они приобретают капсиды. Бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность.

Лизогения. Наряду с описанным продуктивным типом вза­имодействия бактериального вируса с клеткой хозяина, закан­чивающегося образованием фагового потомства и лизисом бактерий, это взаимодействие может происходить по интегративному типу. Фаги, вызывающие данный тип инфекции, получили на­звание умеренных. Они отличаются от вирулентных тем, что встраивают свою ДНК в бактериальный геном, с кото­рым реплицируются. Фаговая ДНК, ассоциированная с геномом своего хозяина, носит название профага. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются л и-зогенными, а само явление — лизогенией. Это назва­ние отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к лизису при освобождении профага из состава бактериаль­ного генома и перехода в вирулентный фаг, способный репро­дуцироваться.

Спонтанный лизис нередко происходит в отдельных клетках популяции лизогенных бактерий, но не захватывает все клетки. Это связано со способностью лизогенных бактерий приобретать иммунитет к последующему заражению одноименным фагом, вследствие чего остальные лизогенные клетки, содержащиеся в бактериальной популяции, полностью сохраняют свою целост­ность и жизнеспособность.

Продукция фагов лизогенными бактериями значительно уве­личивается при их облучении суббактерицидными дозами УФ-лучей или обработке некоторыми химическими соединениями, взаимодействующими с их ДНК. Данный феномен называется индукцией   профага.

Как уже отмечалось, наличие профага в составе бактериального генома не мешает репликации ДНК бактериальной клетки и самого профага. Однако гены профага самостоятельно не транскрибируются, что связано с образованием репрессора — низкомолекулярного белка, блокирующего данный процесс. Син­тез репрессора контролируется генами профага. При инактивации репрессора УФ-облучением профаг выходит из состава бак­териального генома и превращается в вирулентный фаг, вызы­вающий продуктивную инфекцию.

Лизогенизация лежит в основе фаговой или лизогеннрй конверсии. Она заключается в изменении свойств у лизогенных бактерий, например приобретении способности продуцировать  токсин,   изменять  морфологию,   антигенные  свойства  и другие признаки. Механизм этого явления связан с внесением новой информации в бактериальную клетку.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособ­ными образовывать фаговое потомство, например, трансдуци-рующие фаги. Их используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение бактериофагов. Строгая специфич­ность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипи­рования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в ми­кробиологической практике. Он позволяет не только определить

видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее ф а г о тип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго опре­деленные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использова­ние наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологи­ческого анализа инфекционных заболеваний: установления источника инфекции и путей ее передачи.

Кроме того, по наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий, представляющих опасность для здоровья человека. Данный метод индикации патогенных бактерий также применяется в эпи­демиологической практике. Его эффективность повышается при постановке реакции нарастания титра фага, которая основана на способности специфических линий фагов репродуцироваться на строго определенных бактериальных культурах. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый возбудитель, происходит нарастание его титра (рис. 22.). Широкое исполь­зование реакции нарастания титра фага осложняется труд­ностью получения индикаторных наборов фагов и другими причинами.

Применение фагов с лечебными и профилактическими целя­ми проводится сравнительно редко. Это связано с большим ко­личеством отрицательных результатов, которые объясняются следующими причинами: 1) строгой специфичностью фагов, ли-зирующих только те клетки бактериальной популяции, которые снабжены соответствующими рецепторами, вследствие чего фаго-резистентные особи, имеющиеся в каждой популяции, полностью сохраняют свою жизнеспособность; 2) широким применением более эффективных этиотропных средств — антибиотиков, не об­ладающих специфичностью бактериофагов.

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-прртейного, стафилококкового и других бактериофагов, а также наборы для фаготипирования брюшно­тифозных бактерий, стафилококков и др. Последние широко при­меняются с эпидемиологическими целями для установления ис­точника инфекции. Так, например, в случае выделения от раз­ных больных бактериальных культур, принадлежащих не только к одному виду, но и к одному фаготипу, можно считать, что они заразились из одного и того же источника инфекции. В случае выделения разных фаготипов следует искать несколько источ­ников инфекции.

В настоящее время препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вы­званных антибиотикорезистентными бактериями. При этом в каждом случае предварительно определяют чувствительность вы­деленных возбудителей к данному препарату бактериофага.

Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики од­ноименного заболевания в детских коллективах.

 

Серологические реакции в вирусологии.

Гемагглютинация – это феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Некоторые вирусы имеют на своей оболочке рецепторы, комплементарні рецепторам поверхности эритроцитов определенных животных, и при добавлении к суспензии вирусов эритроцитов, последние склеиваются. Однако эта реакция не иммунологическая, потому что в ней не принимает участия основная система – антиген и антитело.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1 : 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

 

Реакция торможения гемагглютинации (РГГА) принадлежит к серологическим реакциям иммунитета. В РГГА специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), лишают его свойства склеивать эритроциты

Реакция нейтрализации вирусов.   В основе реакции лежит  способность специфических антител крепко связываться с вирусом,  в итоге вирус не может адсорбироваться на чувствительных клетках и размножаться у них.

Для постановки реакции необходимое наличие вируса, сыворотки, которая содержит антитела, и биологического объекта, который выступает индикатором нейтрализации. Такими объектами могут быть в зависимости от вида вируса лабораторные животные, куриные эмбрионы, тканевые культуры.

 

 Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген взаимодействует с антителом, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой ензимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует в месте соединения антигена с антителом с мобилизованным ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.(рис. 26, 27.).

Для такой метки широко используется фермент – пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрату дает разноцветные продукты реакции.

Различают прямые и непрямые иммуноферментные методы.

Прямой метод. На первом этапе реакции антиген реагирует с антителом, меченым пероксидазой, потом к образованному комплексу добавляют соответствующий субстрат (например, Н2О2 и 5-аминосалицилову кислоту). 

Непрямой метод. Сначала антиген  реагирует с антителами, образовывая комплекс антиген – антитело, после промывания в систему вносят противоглобулиновые антитела, меченые пероксидазой, которые связываются с первым комплексом. После следующего промывания  вносят субстрат, который, разлагаясь адсорбируемым энзимом, предопределяет появление соответствующей окраски.

Иммуноблотинг. Для проведения иммуноблотинга исследуемые антигены сначала разделяют с помощью элетрофореза в геле. Полученные фракции электрофоретически переносят на листок нитроцеллюлозы (блот), который находится в специальной камере. Фиксированные блоты обрабатывают специфическими к антигену антителами, отмывают и добавляют радиоактивно меченный коньюгат для выявления антител, которые связались с антигеном.(рис. 28, 29)

После повторного промывания листок нитроцеллюлозы размещают в кассете с рентгеновской пленкой для радиоаутографии. На проявленной пленке появятся полосы локализации антигена, который связал меченые антитела.

Вместо радиоактивной метки можно использовать люминесцентные антитела или антитела, коньюгированные с ферментом. В последнем случае субстрат для энзима (хромоген) должен быть предварительно нанесенный на нитроцеллюлозную мембрану.

Вирусы (лат. virus — яд животного происхождения) — мельчайшие организмы, которые по своей морфологии, биологическим свойствам, химическому составу и способу размножения отличаются от других микроорганизмов. Вирусы являются строгими (облигатными) внутриклеточными паразитами и не размножаются вне живых клеток. Размеры вирусов очень малы: от 25 до 250 нм, их определяют размерами пор фарфоровых фильтров, через которые они проходят при фильтрации. Существуют мелкие вирусы: полиомиелита, ящура, желтой лихорадки, размер которых до 25 нм, и более крупные: вирусы оспы и осповакцины, размер которых приближается к 250 нм. Самые крупные мантийные вирусы — орнитоза, трахомы и венерической лимфогранулемы — имеют размер до 300—350 нм. Однако их химический состав сложнее, чем у остальных вирусов. Поэтому мантийные вирусы выделены в особую группу микроорганизмов «хламидозоа», или хламидии (по классификации Берджи группа 18).Изучение формы вирусов и их строения возможно только в электронном микроскопе при увеличении в 50 000—300 000 раз. Крупные вирусы размером более 150 нм можно увидеть в обычном световом микроскопе при специальных методах окраски и увеличении в 900— 1000 раз.
Форма вирусов может быть различной: шаровидной, овоидной, палочковидной, нитевидной, многогранной и булавовидной

Зрелые частицы вируса называют вирионами. Вирион состоит из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку — капсид. Тип и свойства нуклеиновой кислоты имеют важное значение в классификации вирусов. Характерными признаками вирусов является содержание в вирионе только одной из нуклеиновых кислот: либо ДНК, либо РНК- Все остальные живые организмы содержат одновременно и ДНК, и РНК. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты вирусы можно разделить на две большие группы: ДНК-содержащие и РНК-содержащие. Нуклеиновая кислота вирусов может состоять из одной нити (однонитчатая) или двух нитей (двунитчатая). Почти все РНК-содержащие вирусы имеют в своем геноме однонитчатую РНК. ДНК-содержащие вирусы чаще имеют двунитчатую ДНК и редко — однонитчатую.

У многих вирусов нуклеиновая кислота и белок (нуклеопротеид) находятся внутри вириона (сердцевина — core), а у некоторых вирусов нуклеиновая кислота непосредственно заключена в капсид (нуклеокапсид). Капсид состоит из повторяющихся белковых субъединиц, которые образованы одной или несколькими белковыми молекулами. Группы из нескольких белковых молекул можно видеть на электронных микрофотографиях. Такие структурные единицы, образующие часть капсида, называют капсомерами. Способ укладки капсомеров (тип симметрии) и количество их в капсиде неодинаковы у разных вирусов. Капсомеры могут быть уложены в капсидах в виде многогранника с равными симметричными гранями (кубический тип симметрии) или по спирали (спиральный тип симметрии). Спиральный тип симметрии имеют вирусы гриппа, а кубический — адено-, герпес- и энтеровирусы. Вирусы с кубическим типом симметрии называют также изометрическими. У вирусов группы оспы и бактериофагов сложный тип симметрии: например, головка бактериофага кубического типа, а отросток- хвост— спирального

Многие вирусы животных и человека обладают внешней оболочкой (пеплос), окружающей их капсид. В состав этих оболочек входят липиды или липопротеиды. Наличие внешних оболочек характерно для вирусов, созревание которых происходит на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки хозяина. Проходя через поверхность пораженной клетки, вирусный капсид как бы обволакивается этой мембраной, формируя один или несколько слоев своей внешней оболочки. Внешнюю оболочку имеют миксо-, герпес- и рабдовирусы (вирус бешенства), а также тогавирусы (вирусы энцефалитов). Внешние оболочки этих вирусов, содержащие фосфолипиды, разрушаются эфиром, что служит отличительным признаком от вирусов, которые имеют голый капсид. Вирусы группы оспы также имеют внешние оболочки, но формирование их происходит внутри пораженной клетки и к эфиру они нечувствительны. У некоторых вирусов (миксо- и тогавирусы) из внешнего липидаого слоя выступают наружу вирусспецифические гликопротеиды. Эти выступающие капсомеры называют шипами (пепломеры), хотя концы их не острые, а тупые.

Мелкие вирусы, имеющие форму палочек или шариков, могут образовывать упорядоченные структуры в виде кристаллов. Кристаллы состоят из сотен миллиардов вирусных частиц, тесно прижатых друг к другу.

Вирусы оспы, бешенства, хламидии трахомы и некоторые другие, поражая различные клетки организма, образуют в них внутриклеточные включения. Это крупные и плотные гранулы, которые при определенной окраске могут быть обнаружены в световом микроскопе. Внутриклеточные включения располагаются в ядре клетки или ее цитоплазме. Происхождение их пока неясно.

В одних случаях они являются внутриклеточными колониями (скоплениями) элементарных частиц вируса (вирионов), в других — продуктами реакции клетки хозяина на внедрившийся вирус. Обнаружение внутриклеточных включений при некоторых инфекциях служит диагностическим признаком заболевания: например, тельца Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе.

  Вирусы составляют самостоятельное царство Vira, которое отличается от животных и растений тем, что в составе вириона находится только одна из двух нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), отсутствуют клеточные структуры и автономный обмен веществ и вирусы имеют репродуктивный способ размножения, возможный только в живой клетке

Международный комитет по таксономии вирусов (МКТВ) на III Международном конгрессе вирусологов (Мадрид, 1975) произвел группирование вирусов в роды и семейства на основании морфологии вириона, химического состава вирусов, характера репродукции их. Основные признаки, на которых базируется классификация вирусов:

1) характеристика нуклеиновой кислоты; тип (ДНК,РНК), число нитей в ней (одно- или двунитчатая), процентное содержание ее в вирионе, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина;

2) морфология вириона, тип симметрии, наличие внешних липопротеидных. оболочек, форма и размер вириона;

3) биофизические свойства вирусов и их химический состав (белки, липиды);

4) особенности репликации вирусов. Большое значение также придают устойчивости вируса к физическим и химическим факторам, кругу поражаемых хозяев и антигенным свойствам вирусов. Как «вид» предложено рассматривать набор вирусов, имеющих сходные характеристики. Род — группа видов с определенными общими свойствами, а семейство — группа родов, имеющих общие свойства.

Все изученные в настоящее время вирусы сгруппированы в 14 семейств, помимо которых существует группа неклассифицированных вирусов, например вирус гепатита А (возбудитель инфекционного гепатита) и вирус гепатита В (возбудитель сывороточного гепатита).

  Фаги представляют собой мельчайшие частички, или корпускулы, состоящие из головки и хвоста (отростка), по форме напоминающие сперматозоид. У некоторых фагов отросток очень короткий или совсем отсутствует. Размеры фагов варьируют от 20 до 200 нм: диаметр головки достигает обычно 60—95 нм, длина отростка 250 нм, ширина 10—25 нм. Как и вирусы, фаги имеют наружную белковую оболочку и заключенную в головке нуклеиновую кислоту. У большинства фагов это двунитчатая ДНК, Однако обнаружены фаги, имеющие однонитчатую

ДНК и даже РНК. Размеры молекулы ДНК во много раз превышают величину самого фага.

Наиболее изучены фаги кишечной палочки, имеющие сложное строение. Они состоят из головки, имеющей вид многогранника (кубический тип симметрии), и отростка — полой жесткой трубки, окруженной чехлом с капсомерами спирального типа укладки. На конце отростка имеется базальная пластинка с отходящими от нее нитями (рис. 27).

 

По химическому составу частицы бактериофага являются нуклеопротеидами и состоят на 50— 60% из белка и на 40—50% ДНК.

 

Фаги обладают специфичностью, которая заключается в их способности размножаться и вызывать лизис только бактерий определенного вида или типа. Различают моновалентные фаги, которые лизируют культуру бактерий определенного вида, и типовые фаги, лизирующие отдельные штаммы или варианты внутри одного и того же вида. Существуют и полифаги, которые могут вызывать лизис клеток родственных видов бактерий. Свойства специфичности фагов используют при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

 

Фаговые частицы, размножаясь в бактериальных клетках, засеянных сплошным газоном по поверхности плотных питательных сред, лизируют их и образуют «стерильные пятна». Такие пятна называют негативными колониями фага. У разных фагов они имеют строго определенную форму на микробном газоне: правильно округлую, звездчатую (дизентерийный фаг). Негативные колонии фага могут быть полностью прозрачны или состоят из прозрачного центра и мутной периферической зоны. При добавлении фага к жидким питательным средам, где культивируются чувствительные к нему бактерии, среда, бывшая до того мутной, просветляется.

 

Устойчивость фага к внешним воздействиям достаточно велика. Он устойчив к обычно используемым концентрациям дезинфицирующих веществ: 1—2% раствору фенола, 0,5% раствору сулемы, 1,5% раствору лизола. Отмечено даже привыкание фага к азотной и серной кислотам. Он выдерживает нагревание до 70—75°С. Тем не менее образование фага задерживают цитраты и оксалаты, рентгеновские и ультрафиолетовые лучи. Угнетающе действуют на фаг стрептомицин и полисахариды— гликоген и крахмал. В организме фаг сохраняется 10—13 дней.

 

Происхождение и природа фага до сих пор остаются неясными. Живую природу фага доказывают его способность к размножению за счет бактерии-хозяина, приобретение устойчивости к воздействию внешних факторов, способность изменяться и давать продукцию энзимов (ферменты). О происхождении фагов имеются два мнения:

1) фаг является экзогенным паразитом бактерий, существующим за счет перехода от одних бактерий к другим (болезнь бактерий);

2) фаг имеет эндогенное происхождение из бактерий и представляет собой одну из форм их развития. Предложена и компромиссная точка зрения: фаги произошли из фильтрующихся форм бактерий — эндогенно, но после обособления стали паразитами бактерий. 

 

МИКРОЭКОЛОГИЯ

Экологическая микробиология как раздел общей микробио­логии изучает взаимоотношения микро- и макроорганизмов, сов­местно обитающих в определенных биотопах. Это понятие введено С. Н. Виноградским  (1945).

Экологическая микробиология использует понятия общей эко­логии. Главные из них: популяция — совокупность особей од­ного вида, обитающих в пределах определенного биотопа; б и-о т о п —

территориально ограниченный участок биосферы с от­носительно однородными условиями жизни; микробиоце­ноз — сообщество популяций микроорганизмов, обитающих в оп­ределенном биотопе; экосистема — система, состоящая из биотопа и биоценоза; геосфера, гидросфера, атмо­сфера, онтосфера — соответственно совокупность почвен­ных, водных, воздушных и паразитарных экосистем; биосфе­ра— живая  оболочка  планеты,  общая сумма  всех экосистем.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В МИКРОБИОЦЕНОЗАХ

Важнейшим объектом изучения экологической микробиологии является микробиоценоз. В естественных средах (почва, вода, воздух, живые организмы) микроорганизмы живут в виде сообществ, образуя экологические связи как между собой, так и с растениями, животными и человеком, а также с абиогенными факторами окружающей среды.

Популяции микроорганизмов состоят из особей одного вида, который характеризуется гетерогенностью , так как содержит различные варианту. Отношения между ними носят преимущественно симбиотический характер, хотя в некоторых случаях, например при разных темпах размножения в среде с лимитирующим источником питания, имеет место конкуренция.

Межвидовые взаимоотношения сложны, многообразны и ди­намичны. Они могут быть разделены на несколько видов.

Нейтрализм — форма межвидовых отношений, при ко­торой обитающие в одном биотопе популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.

При симбиозе обе популяции извлекают для себя пользу. Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм). Мутуализм наблюдается в тех случаях, когда симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Например, одна популяция синтезирует продукт, которой является основой пита­ния для другой популяции. Симбиоз наблюдается между аэробами и анаэробами, организмом человека и его собственной (аутохтонной) микрофлорой.

Содержание явления коменсализм хорошо отражает его русский синоним — нахлебничество. Коменсалы питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значе­ния. Например, коменсалы человека — аутохтонные бактерии и грибы, питающиеся слущенным эпителием или остатками органических веществ.

При конкуренции, или антагонизме, происхо­дит подавление жизнедеятельности одной популяции другой. Антагонисты обладают способностью выделять в среду обитания вещества, которые вызывают задержку размножения или гибель компонента микробиоза. К таким веществам относятся антибиоти­ки, бактериоцины, органические и жирные кислоты и др.

Паразитизм — такой вид межвидовых связей, при кото­ром одна популяция (паразит), нанося вред другой популяции (хозяину), извлекает для себя пользу. Паразитами бактерий являются фаги, бделловибрионы. К микробам-паразитам человека относятся бактерии, вирусы, грибы, простейшие.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

В зависимости от среды обитания микроорганизмы разделяют на    свободноживущие    и    паразитические.    Свободноживущие  заселяют лито-, гидро- и атмосферу, обитают и в различных антропогенных средах (жилища, одежда, продукты, химические препараты, в том числе лекарственные и др.). Попадая в организм человека, они могут иногда вызывать инфекционное заболевание.

МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ

Почвы являются важнейшей средой обитания микроорганиз­мов. Вместе с растениями и животными они составляют сложные и многообразные биогеоценозы, состав которых, плотность, функ­циональная активность и прочие характеристики зависят от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, влажности, концентрации углекислого газа, осмотического давления, интен­сивности инсоляции. Существенное влияние на состав микро­биоценозов оказывают агротехнические мероприятия, такие как вспашка, мелиорация, внесение, удобрений, ядохимикатов и др. Плотность микрофлоры особенно высока в черноземных, кашта­новых почвах, хорошо удобряемых сероземах. Она максимальна на глубине 10—20 см. В верхнем слое почвы и на глубине свыше 1—2 м микроорганизмы встречаются в незначительном коли­честве.

Микроорганизмы почвы участвуют во всех процессах транс­формации вещества и энергии: осуществляют синтез биомассы и аккумуляцию энергии, биологическую фиксацию азота, броже­ние, гниение (аммонификацию), нитрификацию, денитрификацию, трансформацию серы, фосфора и других элементов.

Азотфиксирующие бактерии

Почва содержит также микроорганизмы, поступающие из во­ды, воздуха, от животных, растений. С фекально-бытовыми, сточ­ными водами различных предприятий в почву попадают патоген­ные и условно-патогенные для человека микроорганизмы. В нор­мально функционирующей почве интенсивно протекает процесс самоочищения, в результате чего относительно быстро перераба­тываются органические вещества в гумус и почва освобожда­ется от несвойственных ей микроскопических грибов и бактерий.

Сроки переживания патогенных для человека микробов в поч­ве широко варьирует в зависимости от их вида и интенсивности процессов самоочищения. Аспорогенные патогенные и условно-патогенные бактерии, вирусы выживают в течение нескольких дней, недель или месяцев; споры возбудителей столбняка, сибир­ской язвы, анаэробной раневой инфекции могут сохраняться мно­го лет. Для возбудителей ботулизма, актиномикоза, глубоких микозов, микотоксикозов почва является естественной средой обитания.

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бакте­рий и бактерий — показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием бактерий, свидетельствующих о фекальном за­грязнении  (санитарно-показательные бактерии), рассматривают как санитарно неблагополучные. Для определения давности фе­кального загрязнения почвы определяют несколько санитарно-показательных организмов. Присутствие в почве Е. coli и Strepto­coccus faecalis указывает на свежее, бактерии родов Citrobacter и Enterobacter — на несвежее, a Clostridium perfringens — на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка прово­дится с помощью определения коли-индекса — количества бакте­рий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г поч­вы, перфрингенс-титра — массы почвы (в граммах), в которой обнаружена особь вида Cl. perfringens, общей численности са­профитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Рис. Колонии микроорганизмов почвы

Микробиологическое исследование почвы. Берут навеску в 1 г и после соответствующей обработки почвы растиранием или другим способом переносят ее в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды. Установлено, что значительно больше микроорганизмов выявляется в том случае, если навеску предварительно поместить в стерильную фарфоровую ступку, увлажнить 0,4 – 0,8 мл воды на 1 г почвы и 5 мин растирать стерильным резиновым пестиком до пастообразного состояния. Готовят разведения почвенной суспензии, для чего 1 мл почвенной суспензии из колбы (разведение 1:100) последовательно переносят в ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды или в колбу с 99 мл воды (1:10000). Посев почвенной суспензии на плотные среды производится из разведении 1:10; 1:100; 1:1000 и т. д. в зависимости от группы учитываемых микроорганизмов, типа почвы, ее влажности и т. д. В случае засева плотных сред разведение подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50 – 200 колоний бактерий и

актиномицетов и 30 – 50 колоний грибов.  При слишком густом или разреженном посеве подсчет количества микроорганизмов будет очень неточным. Из каждого образца почвы берут не менее 3 – 5 повторных навесок и каждую высевают на 3 – 5 чашек с различными средами. Для этого из нужного разведения пипеткой берут 1 мл суспензии и помещают в чашку Петри, равномерно распределяя по поверхности агара круговыми движениями. Засеянные чашки подписывают, переворачивают вверх дном и помещают в термостат на 5 – 7 дней.

Учет числа бактерий в почве. Число микробов в почве можно определить прямым подсчетом. Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Так как есть медленно растущие формы микробов, окончательный подсчет делают на 5-е сутки. Чтобы установить количество микробных клеток в 1 г сырой почвы, число колоний в чашке Петри умножают на степень разведения. Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются. Это часто наблюдается в чашках при разведении 1:100. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (менее 10), которые могут образоваться из случайно попавших из воздуха клеток при внесении в чашку суспензии или питательной среды. Учет в этом случае недостоверен. Для правильного определения числа клеток подсчитывают только те, количество колоний в которых свыше 10, но не более 250 – 300 (в последнем случае при условии, что колонии очень мелкие). При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учесть одни и те же колонии, помечают их чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Иногда в последнем разведении число колоний более 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет проводят с учетом того, что он дает представление лишь о минимальном количестве микроорганизмов в почве. Большое число колонии (более 300) подсчитывают с помощью камеры Вольфюгеля. Перевернутые вверх дном чашки помещают под подставу камеры и накрывают стеклянной пластинкой, на которую нанесена сетка. Стороны образованных ею квадратов могут измеряться в сантиметрах или миллиметрах. Число колоний подсчитывают в разных местах чашки (в 20 – 25 квадратах) и делают пересчет на общую площадь чашки. Для сравнения количества бактерий в разных почвах необходимо подсчитать их число на 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельном бюксе, высушенном до постоянной массы, берут навеску (5-10 г), определяют ее влажность, сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для подсчета числа клеток микроорганизмов в 1 г сырой почвы определяют разность между массой сырой и сухой почвы, делят на массу навески и умножают на 100. Расчет количества микроорганизмов в 1 г абсолютно-сухой почвы ведут по следующей формуле:

, где а – среднее количество микроорганизмов в одной чашке Петри; μ – степень разведения;

W – влажность почвы.

Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно, на 2 – 3-е сутки роста учитывают споровые и неспоровые формы бактерий. На среде Чапека на 5 – 7-е сутки роста учитывают колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5 – 7-е сутки роста – колонии грибов и дрожжей.

 

МИКРОФЛОРА ВОДОЕМОВ

Вода открытых морских и пресноводных водоемов, так же как и почва, является естественной средой обитания разнообраз­ных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших. В грунтовых водах содержатся единичные микро­организмы. Микрофлора водоемов разделяется на собственную (аутохтонную) и заносную, поступающую из почвы, воздуха, живых организмов.

Количественный и качественный состав микробиоценозов за­висит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, температуры, рН, кон­центрации кислорода и углекислого газа, скорости движения во­ды и особенно от массивности поступления ливневых, фекально-бытовых и промышленных сточных вод. Они несут с собой большое количество органических веществ, промышленных отхо­дов и различных микробов.

Состав микроорганизмов и их функции различны на поверхно­сти воды и на дне водоемов (в иле). В иле активно протекают процессы гниения и брожения, хемоаутотрофного, метилтрофного и гетеротрофного синтеза. На поверхности воды микро­организмы образуют пленку, в которой энергично протекают про­цессы фотосинтеза. В прибрежной зоне открытых водоемов, особенно вблизи крупных населенных пунктов, вода содержит большое количество заносных микробов, в том числе патоген­ных и условно-патогенных для человека, обитающих в кишечни­ке животных и самого человека.

Хотя вода и неблагоприятна для существования патогенных и условно-патогенных микробов, многие из них способны пережи­вать в ней определенное время, а в некоторых случаях даже размножаться. Сроки выживания патогенных микробов в воде зависят главным образом от их вида, контаминирующей дозы, температуры воды, степени насыщения воды органическими ве­ществами и состава сапрофитических микробов.

Определенное влияние на продолжительность выживания ока­зывают химический состав, рп воды, солнечная радиация, тип водоисточника. Споры возбудителя сибирской язвы могут сохра­няться в воде годы; многие месяцы переживают в воде энтеровирусы, сальмонеллы, лептоспиры, вирус гепатита А; меньше (дни, недели) — возбудители дизентерии, холеры, бруцеллеза. Условно-патогенные аспорогенные бактерии выживают в воде в течение нескольких недель.

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу — количеству мезофильных хемоорга-нотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру — наимень­шему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу — количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300, коли-индекс — не более 3, а микробное число — не более 100.

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды

(Приказ МЗО Украины от 23.12.1996 г.)

 

 

Определение коли-титра и коли–индекса воды (метод мембранных фильтров).

Рис. Микроорганизмы на фильтре (метод мембранных фильтров). Электронная фотография.

 

Рис. Colilert тест (ферментный)

МИКРОФЛОРА. ВОЗДУХА

Воздух непригоден для размножения микроогранизмов, так как в нем недостаточно влаги и питательных веществ, а солнечная радиация и высушивание действуют на микроорга­низмы губительно. Обнаруживаемые в воздухе микробы посту­пают главным образом из почвы, с поверхности растений и жи­вотных, с продуктами отходов некоторых производств.

Плесневой грибок

Видовой и численный состав микрофлоры атмосферного воз­духа малочислен, вариабелен и динамичен. Он зависит от интенсивности солнечной радиации, ветра, метеоосадков, покро­ва почвы, плотности населения и др. Преобладают споры грибов, актиномицетов, бацилл, пигментообразующие виды аспо-рогенных бактерий. Воздух жилых помещений содержит в основ­ном микрофлору дыхательных путей и кожи человека, мно­гие представители которой способны переживать в воздухе в те­чение времени, достаточного для инфицирования находящихся в нем людей.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу — количеству осо­бей, обнаруженных в 1 м³ воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий — представителей микрофлоры дыхательных путей (гемолитические стрептококки, золотистый стафилоккок). ГОСТ на микробную обсемененность воздуха пока отсутствует.

Критерии оценки микробного загрязнения  воздуха в помещениях больницы

Исследуемый обьєкт	Микробное число	Staph. aureus (в 250 л)
Воздух операционных: до начала работы во время работы Воздух родильных залов	Не больше 500 Не больше 1000 Не больше 1000	Не должно быть То же самое То же самое

    

 

Рис. Колонии бактерий на МПА после посева микрофлоры воздуха седиментационным методом

 

Рис. Аппарат Кротова

 

МИКРООРГАНИЗМЫ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Многие пищевые продукты (молоко и молочные изделия, мя­со и мясные изделия, рыба и рыбные изделия, яйца, ягоды, фрук­ты, овощи, грибы и др.) являются благоприятной средой для размножения микроорганизмов. В микрофлоре ряда пищевых продуктов выделяют специфические виды, которые вносят в процессе технологического производства молочно-кислых продуктов, хлебных изделий, напитков. Они не представляют опасности для человека. Неспецифические виды микроорганизмов могут попадать в пищевые продукты при их заготовке, доставке, пе­реработке и хранении. Источником этих микробов являются сырье, воздух, вода, оборудование, люди, занятые в процессе заготовки, доставки, хранения и особенно переработки продук­тов, а также животные (обычно грызуны), вступающие в кон­такт с продуктами. Через пищевые продукты (алиментарным путем) передаются возбудители кишечных инфекций, пищевых интоксикаций и токсикоинфекций, зоонозов, микозов.

Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение микробного числа и санитарно-показатель-ных микроорганизмов (БГКП), а также возбудителей заболе­ваний. Санитарные показатели некоторых продуктов нормиро­ваны ГОСТами.

МИКРОФЛОРА ДРУГИХ СРЕД

Кроме почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов, микро­организмы обнаруживаются на разнообразных предметах в ок­ружении человека. Эти объекты могут быть разделены на три группы: бытовые, производственные и медицинские. К бытовым объектам относятся внутренние поверхности помещений, мебель, посуда, белье, одежда, обувь, средства уборки, книги, игруш­ки, картины, кухонные принадлежности и др.; к производ­ственным — сырье, оборудование, продукция, инструментарий и т. д. В медицинских учреждениях, кроме бытовых предме­тов, имеются также специфические медицинские объекты. К ним относятся медицинский инструментарий и оборудование, перевя­зочный и шовный материалы, лекарственные препараты, раст­воры дезинфектантов, антисептиков, спецодежда, предметы ухо­да за больными. В перечисленных объектах обнаруживаются как свободноживущие, так и паразитические микроорганизмы. Главным источником контаминации (загрязнения) условно-пато­генными и патогенными видами микроорганизмов являются выделения человека и реже — животных. Ряд возбудителей ин­фекционных заболеваний (легионеллы, псевдомонады, протеи, клебсиелла пневмонии, иерсинии) способны размножаться на не­которых объектах внешней среды (ванные, душевые и др.). Другие микроорганизмы — возбудители контактных, кишечных и ка­пельных инфекций — сохраняются в окружающей среде в те­чение определенных сроков, достаточных для передачи новому хозяину. Эти сроки колеблются от нескольких минут (возбуди­тели кори, коклюша, сифилиса) до многих месяцев (возбу­дитель туберкулеза и лет (споры возбудителя сибирской язвы).

Санитарный контроль за микробной контаминацией прово­дится в медицинских и детских учреждениях, предприятиях об­щественного   питания   и   по   производству   продуктов   питания, в эпидемических очагах инфекционных болезней. Показате­лями микробной контаминации являются общее микробное число, наличие БГКП, а также протея, энтерококка, синегнойных бактерий, стафилококка и различных видов патогенных бактерий, главным образом возбудителей кишечных и капельных ин­фекций.

Принципы санитарно-микробиологических исследований

На результаты анализов могут существенно повлиять различные факторы. На современном этапе задачи санитарной микробиологии значительно осложняет интенсивное загрязнение окружающей среды, влияющее не только на аутохтонную (нормальную), но и аллохтонную (санитарно-показательную и патогенную) микрофлору. Поэтому при проведении санитарно-микробиологических исследований следует помнить о следующих основных принципах.

Пробы следует отбирать с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта. Исследования необходимо проводить быстро; при невозможности немедленного проведения анализа материал сохраняют в холодильнике не дольше 6-8 ч. • Для получения объективных результатов следует отбирать несколько проб из разных участков объекта.  Более адекватные результаты можно получить проведением повторных отборов и анализов проб.  При проведении анализов следует использовать только стандартные и унифицированные методы исследования.  В работе необходимо использовать комплекс тестов — прямых (выявляющих патогены) и косвенных (указывающих на загрязнение объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени). • Интерпретацию результатов санитарно-микробиологических исследований следует проводить с учётом других гигиенических показателей (органолептических, химических, физических и т.д.).

Источник: http://meduniver.com/Medical/Microbiology/851.html MedUniver

Загрязнение окружающей среды патогенными микроорганизмами делает ее фактором передачи инфекционных заболеваний.

Для определения в окружающей среде микроорганизмов, которые отрицательно влияют на здоровье человека, проводится санитарно-бактериологическое исследование почвы, воды, воздуха.

Методы исследования разрабатывает санитарная микробиология.

Определениев объектах среды патогенных микроорганизмов затруднительно, т.к. они находятся в среде временно, в небольшом количестве, а методы их определения длительные и трудоемкие.

Поэтому для оценки санитарного состояния среды применяют:

1) определение общей микробной загрязненности;

2) определение санитарно-показательных микроорганизмов.

Санитарно-показательные микроорганизмы – представители нормальной микрофлоры кишечника и дыхательных путей человека и теплокровных животных.

Эти микроорганизмы обладают следующими свойствами:

1) выделяются в среду теми же путями, что и патогенные микробы (с испражнениями из кишечника и с капельками слизи из дыхательных путей);

2) сохраняются в среде те же сроки, что и патогенные микробы;

3) живут только в организме человека или животных и не имеют других мест обитания;

4) не размножаются в среде, поэтому их количество постоянно некоторое время после попадания в среду;

5) методы их определения легкие и доступные (их содержание можно оценить количественно);

6) обладают стабильными и типичными свойствами, поэтому их легко отличить от других видов.

Таким образом, санитарно-показательные микроорганизмы свидетельствуют озагрязненность  окружающей среды выделениями (испражнениями, мокротой и пр.) человека и животных.

Если в объектах среды повышается количество санитарно-показательных микробов, то повышается вероятность присутствия в них патогенных и условно-патогенных микробов.

Для разных объектов окружающей среды выбраны определенные санитарно-показательные микробы.

РОЛЬ СВОБОДНОЖИВУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОЗНИКНОВЕНИИ И СУЩЕСТВОВАНИИ БИОСФЕРЫ

Формирование биосферы произошло около 3 млрд лет тому назад, когда единственными обитателями Земли были прокари-отические бактерии. Это позволяет допустить их участие в фор­мировании биосферы планеты в сочетании с геологическими и атмосферными явлениями.

В современнную эпоху развития Земли, заселенной разно­образными видами растений, животных, грибов, водорослей, доминирующая роль в жизнедеятельности биосферы принад­лежит также микроорганизмам. Они активно участвуют в кру­говороте веществ и энергии (биогеохимические циклы). Как известно, животные и растения синтезируют большее количество органических веществ, чем может быть минерализовано ими самими или под действием абиогенных факторов. Это могло бы привести к «эффекту складирования», лимитирующему содержа­ние таких жизненно важных элементов, как азот, углерод, се­ра, фосфор и др.; к сужению возможностей проявления жизни, а в последующем и к ее прекращению. Микроорганизмы в отличие от животных и растений способны трансформи­ровать все органические вещества, в том числе синтезируемые животными и растениями. Кроме того, они самостоятельно осуществляют синтез биомассы и ее разложение до исходных элементов. Так, азотфиксирующие бактерии из молекулярного азота воздуха синтезируют белки, аммонификаторы трансформи­руют белки в аммиак и его соли, нитрифицирующие бактерии превращают аммонийные соли в соли азотной кислоты, а денит-рофикаторы восстанавливают их в молекулярный азот. Одни микроорганизмы из диоксида, углерода, карбонатов и минераль­ных веществ синтезируют углеводы, другие в процессе брожения снова превращают их в диоксид углерода  и карбонаты.

Такая трансформация происходит также с серой, которую микроорганизмы окисляют до серной кислоты, а затем восста­навливают до серы, с фосфором, водородом и другими элемента­ми. Эти биогеохимические циклы возникли на заре жизни, они протекают и в современный период, когда главным проду­центом биомассы стали растения, а главным ее минерализа­тором — микроорганизмы.

На важную роль микроорганизмов в существовании совре­менной биосферы указывает количество суммарной биомассы прокариотических  бактерий  в  природных  субстратах  планеты, равное 74,46 • 10⁹ т, в то время как для растений оно составля­ет — 55 • 10⁹ т, животных — 0,55 • 10⁹ т, простейших и почвен­ных водорослей— 1,5 • 10⁹ т. При этом метаболическая актив­ность биомассы бактерий в десятки и даже сотни раз превышает таковую животных и растений.

Велика роль микроорганизмов в синтезе «парниковых эле­ментов», которые определяют климат атмосферы. Два из них — метан и оксиды азота — синтезируются только бактериями. Главный «парниковый элемент» — диоксид углерода — поступа­ет в атмосферу в результате разложения органических веществ грибами (около 50—70% всей массы) и бактериями (около 30—50%  массы  без учета  искусственного сжигания топлива).

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Проблема охраны окружающей среды состоит в сохранении экологического равновесия в биосфере. Микробиологические ас­пекты этой проблемы определяются той важной ролью микроор­ганизмов в существовании биосферы, о которой было сказано выше.

Первый аспект — это охрана групп микроорганизмов, участ­вующих в круговороте веществ. Негативное действие антропо­генных факторов, прежде всего промышленных и автомобильных выбросов, проявляется в замедлении или полном прекращении процессов синтеза биомассы и ее трансформации. Подавление деятельности нитрифицирующих бактерий приводит к накопле­нию в воде и почве аммиака, солей аммония и азотистой кислоты, повышению активности денитрифицирующих бактерий. Это резко снижает количество нитратов, которые являются глав­ным источником азота для растений в природных экосистемах. Подавление бактерий-аммонификаторов приводит к накоплению в почве и воде неразложившихся органических веществ и исклю­чению, таким образом, азота из круговорота веществ. Подавле­ние азотфиксирующих бактерий снижает концентрацию биоген­ного азота и приводит к нарушению экологического баланса между ним и атмосферным азотом, обеднению почв гумусом, сни­жению их плодородия. Антропогенные факторы оказывают также негативное воздействие на круговорот углерода, серы, фосфора и других элементов. В результате описанных процессов возмож­ности жизни микроорганизмов в экосистемах сужаются и они ча­сто погибают.

Второй аспект, требующий внимания, заключается в необхо­димости дифференцированного отношения к микроорганизмам, осуществляющим биодеградацию. С одной стороны, следует ох­ранять микроорганизмы, которые разрушают попадающие в воду и почву ксенобиотики — соединения, обычно не встречающиеся в природе и появляющиеся в ней в результате деятельности человека. Многие из ксенобиотиков обладают токсическим, аллергенным, тератогенным, канцерогенным действием на челове­ка. С другой стороны, необходимо подавлять развитие или даже уничтожать микроорганизмы, которые наносят ущерб народному хозяйству, вызывая порчу зерна, овощей, фруктов, ягод, мяса, рыбы, молока и продуктов из них, лекарств, а также вызыва­ют разрушение различных материалов, водопроводной и канали­зационной сети.

И наконец, третий аспект — это защита биосферы от кон­таминации патогенными и условно-патогенными микроорганиз­мами.

С развитием молекулярной генетики возникла проблема за­щиты природы от искусственных мутантов, а с выходом человека в космос — предупреждение заноса на нашу планету внеземных и попадания в космос земных микроорганизмов.

 

 

Серологические реакции в вирусологии.

Гемагглютинация – это феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Некоторые вирусы имеют на своей оболочке рецепторы, комплементарні рецепторам поверхности эритроцитов определенных животных, и при добавлении к суспензии вирусов эритроцитов, последние склеиваются. Однако эта реакция не иммунологическая, потому что в ней не принимает участия основная система – антиген и антитело.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1 : 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.