возможности их использования

Занятие 3

Тема: Проблемы криобиологии и криомедицины. Консервирование тканей и органов, возможности их использования. Стволовые клетки.    Изготовление, использование, перспективы.

 

План

1.   История развития, проблемы  криобиологии и криомедицины.  

2.  Проблемы консервирования тканей

3.  Показания к забору алло- и ксенотрансплантатов.  

4   Время и порядок забора аллотрансплантатов.  

5.  Консервирование низкими температурами

6. Температурный шок, криопротекторы, эквилибрация.  

7.  Лиофилизация биологических субстратов

8. Методы оценки состояния консервированных тканей.  

9.  Биологическая классификация изолированных и консервированных тканей.

10. Свойства стволовых клеток.  

11.  Медицинское применение стволовых клеток.  

12.  Источники стволовых клеток.  

13. Организация процесса заготовки и лабораторных исследований пупочной крови.  

14.  Украинский банк биологических объектов.  

15.  Продукция украинского банка биологических объектов 

16. Успехи и трудности криобионики. Анабиоз организма.

 

 

 

 

ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕДИЦИНЫ

 

Благодаря применению в медицине достижений физики низких температур и криогенной техники удалось разработать новые перспективные методы консервирования тканей, а также способы лечения холодом некоторых опухолей и воспалительных процессов.    Для решения научных, технических и практических задач применения холода в биологии и медицине создан криобиологический центр. В мире существует более 100 научно-исследовательских институтов, которые занимаются проблемами криобиологии и криомедицины.  

Широкие исследования в этой области были обусловлены необходимостью продолжительного сохранения компонентов крови и тканей, а также использования холода для лечения разных патологических процессов.  Этому оказывали содействие достижения в области криогенной техники.  

В СССР первая криогенная лаборатория была создана в 1928 г.  в Харькове при Украинском физико-техническом институте. Позднее в Москве начала работать подобная лаборатория при Институте физических проблем под руководством академика П.Л. Капицы.  Выяснялись особенности поведения биологических объектов в условиях глубокого холода, изучались механизмы криостойкости и криоповреждения разных структур живого организма, создавалась специальная аппаратура.  

Рис.2. Гепатоциты мыши под криомикроскопом во время процесса замороживания. Эксперимент с тремя разными темпами замораживания показали: 10°C/мин (A,B), 100°C/мин (C,D) и 400°C/мин (E,F). Слева (A,C,E) клетки показаны посля появления экстра целюлярного льда при  -1°C , и справа (B,D,F) после достежения температуры -40°C. Дегидратационное повреждение при медленном замораживании через образование экстра целюлярного льда проявляется в виде значительного смарщивания клеток (B), тогда как повреждение через образование внутриклеточного льда при быстром замораживании определяется в виде потемнения клеток через отражение света образованным в клетках льдом.

 

 

Рис.3 Механизм повреждения клеток в процессе замораживания

 

В последнее время криобиология выделилась в отдельную дисциплину, которая преимущественно изучает процессы, которые происходят в клетках, тканях, органах и организме под воздействием низких, не физиологических температур.  

      Намечается специализация криомедицины, которую условно можно разделить на два раздела: криотерапию и гипотермию.  

Криотерапия, или лечение холодом, включает методы, основанные на дозированном охлаждении тканей, отдельных органов или всего организма, которые содействуют заживлению патологических процессов. Одной из составных криотерапии является криохирургия, в основе которой лежит местное (локальное) замораживание тканей с целью их разрушения, удаления или стимулирования процессов заживления.  

Криобиология и криомедицина тесно взаимосвязанны, поскольку молекулярные и субклеточные преобразования, которые происходят в тканях во время замораживания-оттаивания без специальной защиты, лежат в основе холодового разрушения (деструкции).    Именно этот процесс есть главным в криотерапии.  

Клинические результаты криотерапии зависят от температуры, скорости охлаждения, вида и состояния тканей и других факторов.  

Из хладагентов чаще всего используют жидкий азот. Технология охлаждения тканей основана на двух принципах – контакте биологического объекта с зондом, температура которого при охлаждении может снижаться   до -196⁰С и при нагревании повышаться до 200⁰ С, и распылении агента по поверхности патологической ячейки.  

В 70-80 года начало развиваться новое направление криомедицины. Дозированное охлаждение в диапазоне температур, которые превышают границу криостойкости тканей, стимулируют процессы заживления в ячейке острого и хронического воспаления. С учетом этих свойств были разработаны методы лечения холодоэрозивных (язвенных) конъюктивитив, ожогов, гнойных ран, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, трофических язв, артрита.    

Гипотермия. В древней медицине одним из наиболее распространенных терапевтических приемов было применение холода. Известный рецепт, датированный 3500 г. до н. э.,  содержит рекомендации относительно местного использования холода при ранениях головы, грудной клетки и других участков тела. Гиппократ и его ученики также знали о целебных свойствах низких температур. Так, с помощью холодной воды и льда они утоляли боль при травмах, подагре, останавливали кровотечение из ран, облегчали страдания больных на столбняк.  

О применении холода с целью лечения упоминается в материалах, найденных при раскопках Помпеи. В документах, которые дошли до нас, рассказывается, что Гай Юлий Цезарь (102-44 до н.э.) и Август (63 до н.э. -14 н.э.) холодом лечили артрит и ревматизм. На Востоке еще в 200 г. до н.э. при хронической лихорадке больных обертывали пакетами со льдом.  

Еще тогда не без оснований считали, что закаливание холодом обеспечивает долголетие.    Французский хирург Лоррей во время войны 1812 года ампутированые конечности обкладывал льдом.  М.И. Пирогов (1810-1881), имея опыт лечения раненых во время Крымской войны, считал целесообразным применять холод при кровотечениях.    Английский врач Д. Арнотт в середине минувшего столетия для лечения головной боли, межреберной невралгии, столбнячного воспаления и других болезней применял кожаные мешки, наполненные льдом. При этом уменьшались ощущения боли, кровотечение и количество выделений из раны.  

“Гипотермия” (в переводе с латинского языка Hypo означает под, внизу, therme-тепло).    И так, понятия “гипотермия” означает “состояние охлаждения, снижение температуры тела вследствие теплоотдачи”.  

Было выявлено, что при гипотермии ослабляются функции органов. Это стало предпосылкой исследований по созданию методов, которые бы разрешили предотвращать преждевременное умирание. На протяжении многих веков человечество мечтало о путях увеличения продолжительности жизни. Теперь, казалось, такой путь найден. Не значит ли это, что с помощью гипотермии можно на определенное время замедлить жизненный процесс? Может ли на период влияния холодовых факторов угаснуть жизнеспособность организма, а потом, при создании оптимальных русловий, восстановиться? Эти и другие вопросы старались выяснить выдающиеся ученые всего мира.  Решение этой проблемы в одинаковой мере интересует представителей разных областей науки – биологов, медиков, философов и т. п.

По мнению ученых при температуре –196⁰ С полностью прекращается жизнь органа и тканей, возникает состояние, которое называется анабиозом (в переводе с латинского языка anabyosys означает оживление).  

Многие люди умирают в молодом возрасте, поскольку не найдены эффективные методы лечения некоторых болезней. Разве не заманчиво “заморозить” больного на определенный период, чтобы потом, когда человеество научится бороться с тем или другим недугом, возвратить его к жизни?

Некоторые страны (США и Великобритания) используют общую глубокую гипотермию – “замораживание” людей с пока что неизлечимыми патологиями, для того чтобы потом, пользуясь новыми способами лечения, “разморозить” их и вылечить! Фирма “Этингер” такие эксперименты начала уже с 80-х лет. Замораживание идет очень хорошо, но «эффект от размораживания пока-что не опубликован. На “сохранении” на сегодняшний день находится свыше 300 “пациентов”.    

Многочисленные исследования показали, что для организма человека температура тела 24-25⁰С есть критической, поскольку при этом усиливается работа сердца.    

Длятся поиски путей физиологического охлаждения организма. Пока–что самым рациональным считается метод гипотермии, когда температура тела не опускается ниже 32-28⁰С.  

Общей гипотермии (охлаждение всего тела) достигают путем погружения человека в холодную воду, орошение тела с помощью специальных аппаратов или обложение пакетами с льдом. Кроме того, с этой целью используют специальные одеяла, камеры, костюмы; температуру циркулирующей крови снижают в системе искусственного кровообращения.  

Для введения организма в состояние гипотермии и поддержания его функций на этом уровне на протяжении продолжительного времени применяют наркоз, под влиянием которого угнетаются центры терморегуляции. Глубина гипотермии зависит как от продолжительности влияния холодового фактора, так и от его интенсивности. При поверхностном охлаждении температура тела снижается до 34-33⁰С, при умеренном – до 32-29⁰С, при глубоком – падает ниже 29⁰С.  

В поисках путей более физиологического охлаждения, ученые предложили краниоцеребральную гипотермию.  Этот метод признан перспективным. Его преимущество перед общей гипотермией состоит в том, что он разрешает руководить процессом охлаждения.  Благодаря тому, что температура мозга снижается быстрее, чем температура органов грудной и брюшной полости, уменьшается риск возникновения нарушений функции сердечно-сосудистой системы.  

При общей гипотермии из-за возможности остановки сердца нельзя быстро охладить организм, и таким образом защитить мозг от гипоксии, в то время как при охлаждении головы удается снизить температуру структур мозга, повысив их стойкость к дефициту кислорода.  

Методика проведения краниоцеребральной гипотермии значительно более проста, разрешает точнее регулировать температуру. Целью этого вмешательства является создание оптимальных условий для функционирования органов и тканей, которые наиболее чувствительно реагируют на недостаток кислорода. При краниоцеребральной гипотермии действие холодового агента оказывается значительно слабее, чем при общей гипотермии, поскольку при охлаждении головы температура мозга более низкая, холод влияет на меньшую площадь рецепторних полей.  При температурном градиенте между мозгом и внутренними органами в 3-5⁰С замедляются обменные процессы, уменьшается активность мозга с возникновением охранительного торможения. В тоже время сохраняются условия для обеспечения организма кислородом.  

Умеренная краниоцеребральная гипотермия используется во многих опасных для организма ситуациях. Она защищает организм и его системы от влияния многих вредных факторов. Тем не менее. она не лечит, а лишь на определенное время создает необходимые условия (замедляет обменные процессы, поддерживает жизнедеятельность организма на сниженном уровне) для хирургического вмешательства.  

Изучение электроэнцефалограммы в процессе охлаждения свидетельствует о снижении биоэлектрической активности мозга с постепенным ее угасанием. Краниоцеребральная гипотермия создает условия для устранения отека тканей мозга.  Благодаря этому свойству ее применяют при болезнях, которые сопровождаются нарушениями кровообращения мозга.  

Гипотермию используют не самостоятельно, а как дополнение к основному методу терапии.    Чаще всего ее рекомендуют при гипоксии, отеке, травмах мозга, нарушении циркуляции спинномозговой жидкости и крови, остановке сердца, клинической смерти, удушью, а также в тех случаях, когда обычные реанимационные мероприятия не дают желательных результатов, а состояние больного ухудшается.  

Криотерапия базируется на лечебном применени и дозированных холодових влияний на организм.  Следствием холода, который предопределяет отморожение, человек знаком давно. Его использовали для обезболивания еще в 19 ст. С течением времени были созданы простые и надежные криогенные инструменты, расширилась сфера применения холодового агента в медицине.    

Сейчас в медицинской практике применяют инструменты двух классов – относительно простые автономные аппараты и стационарное оснащение, в котором предусмотрено регулирование охлаждения и отогревания рабочей части.  

      При этом место локализации патологического процесса охлаждается при контакте ткани с криоапликатором или холодовым агентом.  В криотерапии чаще всего используют жидкий азот (температура кипения -196⁰С) лигазы-оксида зота, углекислый газ.  

Жидкий азот – наиболее эффективный холодовой агент. Его применяют в хирургии, хранят в специальных баллонах или чанах.  

Принцип действия холода на патологически измененные ткани состоит в том, что сначала живые клетки повреждаются, а потом гибнут. Под влиянием охлаждения, замораживания и отогревания в клетках розвиваються процессы (так называемый температурный шок), вследствие которых клетки гибнут.  

Быстрое снижение температуры биологического объекта без его замораживания резко изменяет ход биологических реакций в клетках, которые сопровождается разрушением их стенок (мембран).    

Охлаждение клеток, тканей до низких температур предопределяет формирование кристаллов   льда не только в межклеточном пространстве, но и в середине клеток.  

Оттаивание тканей при спонтанном отогревании за счет притока тепла из окружающей среды тоже оказывает содействие гибели тканей. Это объясняется увеличением размеров кристаликов льда, которые повреждают стенки клеток. Темп отогревания при этом имеет важное значение: при медленном оттаивании кристалики льда формируются интенсивнее, чем при быстром.  

Процессы, связанные с криогенным влиянием на ткани и последующим отогреванием, называют криоциклом.  Как свидетельствуют многочисленные эксперименты на тканях и культурах клеток, полной гибели всех клеточных элементов после одного цикла замороження не происходит.  Тем не менее клетки, которые остаються живыми, гибнут через несколько часов вследствие функционально-структурных изменений в них. Поэтому, чтобы обеспечить полную гибель клеток, необходимо выполнить два криоцикла подряд (один за другим).  При этом целесообразно проводить быстрое охлаждение и медленное оттаивание.  

Процесс заживления в зоне криохирургичного разрушения имеет инной ход, чем при других повреждениях. Так, при разрушении опухолей кожи с помощью низких температур никогда не бывает грубых или келлоидны хрубцов. Это очень важно при операциях на лице, руках и других открытых участках тела, где косметичнисть и функциональность играют чрезвычайно важную роль.  

Вторым направлением применения низких температур в медицине есть криоэкстракция.    Она основана на эффекте криоадгезии (холодового прилипання). Вероятно, в детстве каждый человек неоднократно наблюдал такой эффект: при дотрагивании влажной рукой (или языком) к замороженому металлическому предмету кожа (слизистая оболочка) прилипает и ее невозможно оторвать без повреждения.  

Этот метод широко используют в офтальмологии. Специальным криозондом действуют на глазное яблоко при катаракте. При этом кристалик “прилипает” к зонду. Такой эффект наблюдается в температурном диапазоне от -40 до 70⁰С. Криоэкстракцию применяют во многих клиниках мира для лечения больных на катаракту.  Ведь под действием холода пораженный кристалик удаляется вместе с капсулой.  При других же операциях по поводу катаракты в 25 % больных не удавалось удалить не только ядро кристалика, но и саму капсулу. Нередко это приводило к развитию вторичной катаракты и больные вынуждены были идти на повторную операцию. При применении криоэкстракции удается достичь хороших последствий в 96-97 % больных.  

В определенных дозах холод стимулирует процессы заживления ожогов, гнойных ран, трофических язв, эрозий, конъюктивитов и т. п.  

Холод благоприятно действует на ожог, когда температура поврежденной кожи снижается от 100 С до -80С.  Чем раньше начать охлаждать пораженный участок, тем лучшие результаты. С целью охлаждения используют холодную воду, лед, снег.    Криохирургические вмешательства с успехом применяют в оториноларингологии для лечения воспалительных процессов лимфоиднои ткани глотки (хронического тонзиллита), а также при носовых кровотечениях. Описанный метод хорошо зарекомендовал себя при доброкачественных опухолях этого участка – лимфангиомах, лейкоплазиях, полипах.  

      Чаще всего пользуются охладительными устройствами, которые работают на углекислоте, оксиде азота, фреоне, портативними или автономными зондами и аппликаторами на жидком азоте.  

С большим энтузиазмом было воспринято сообщение о применение холода в урологии. Даже начали говорить о возможности полной замены традиционных методов лечения гипертрофии предстательной железы. Криодеструкция предстательной железы легче переносится больными, при ней не бывает кровотечений. Эти преимущества и стали основанием для оптимистичных выводов, которые, к сожалению, оказались преждевременными.  

Дело в том, что под влиянием замороживания патологически измененных тканей в организме наблюдаются сложные иммунобиологические процессы, которые предопределяют рассасывание увеличенной предстательной железы.  

      Но это бывает не во всех случаях, то есть не всегда криодеструкция обеспечивает желательные результаты. Именно поэтому криометод не смог полностью вытеснить из арсенала хирургов традиционные операции.  Его применяют в конкретних ситуациях как вспомогательный.  Тем не менее дальнейшие исследования в этом направлении, бесспорно, перспективны.  

Способность крови свертываться под влиянием холода используют с целью предотвращения распространения клеток опухоли из пораженного органа. Раковые клетки во время операции могут попасть в кровеносную и лимфатическую сосудистые сети, с током крови или лимфы заноситься в отдаленные органы и там метастазировать. Чтобы предотвратить этот процесс, во время хирургического вмешательства ткани, которые должны удаляться, промораживают. При этом в них прекращается кровообращение, и раковые клетки не могут попасть в кровеносные сосуды. Такие приемы применяют при операциях на толстой кишке, желудке, который повышает радикализм вмешательства и улучшатт результаты лечения.  

Большой интерес вызывает объединение влияний низких температур и других физических факторов, например, ультразвука, рентгеновского излучения, магнитных полей.    Интересно, что при одновременном использовании холода и одного из названных факторов усиливается действие каждого из них. Это означает, что для лечения определенной категории больных можно применять рентгеновское облучение в меньших дозах, охлаждать ткань не к таким низким температурам.  Благодаря синергизму (одинаковому направлению) их действия эффективность лечения при этом не снизится.  

Очень хороших результатов достигнуто в лечении опухолей кожи. В данном случае криодеструкция патологических новообразований кожи имеет большие преимущества перед другими методами лечения. Ее выполняют, как правило, без дополнительной анестезии (обезболивания), так как она не сопровождается сильными болевыми ощущениями. Кроме того, рана после криодеструкции заживает быстрее, на коже не остается грубых шрамов.    Это очень важно в тех. случаях, когда опухоль локализуется на лице. Результаты тем лучше, чем раньше было проведено лечение. Так, при раннем выявлении болезни полностью вылечиваются от рака кожи 95-98 % больных. Лечение проводится амбулаторно, то есть больные не требуют госпитализации.  

Кроме гемангиом (сосудистых опухолей), базалиом (опухолей кожи), фибром (опухолей соединительной ткани) и других заболеваниях криометодами удаляют также бородавки, пигментные пятна. Низкие температуры широко используются для консервирования биологических субстратов.    

 

КОНСЕРВИРОВАНИЕ ТКАНЕЙ

 

Для консервирования используют алло-и ксенотрансплантаты, реже аутотрансплантаты, которые успешно используются при реконструктивно-пластических операциях.  

Успех пластических операций с использованием консервированных тканей зависит от:

1) правильного выбора показаний для проведения соответствующей операции;

2) оперативной техники;

3) качества консервированного трансплантата.  

Консервированный трансплантат, как сложный биологический продукт, имеет разностороннее действие на реципиента. В зависимости от метода обработки и консервирования эта операция может кметь или большой клинический эффект, или может вызвать послеоперационные послетрансплантационные осложнения.    

Поэтому следует правильно организовывать забор, обработку и консервирование тканей.    От живых доноров редко, но проводят забор кожи, костной ткани (ребра, часть большеберцовой кости), почек. Часто проводят забор крови у доноров.  

Забор трансплантационного материала в большинстве случаев является большой травмой для донора, часто приводит к осложнениям, поэтому их проводят редко. Чаще проводят забор тканей и органов для трансплантации от трупа. Трупный материал дает большие возможности для забора разных видов тканей, так как жизнеспособность тканей после смерти некоторое время сохраняется. Это дает возможность заготовить жизнеспособные трансплантаты.  

Перед забором трансплантатов у трупа необходимо изучить историю болезни умершего, диагноз, возраст, причину смерти, перенесенные болезни, лабораторные показатели, при необходимости провести дополнительные обследования. Лучше всего забор органов и тканей проводить у трупов, умерших внезапно, при несчастных случаях, от инфаркта миокарда, апоплексии и др. Не нужно проводить забор у трупов, умерших после продолжительной агонии.  

После этого, следует провести отбор трупа, нет ли кахексии, инфицированных ран, язв на коже, экземы, фурункулов и др. При заборе глазного яблока проверяют, не высохла ли ткань глазного яблока, так как это делает его непригодным к пересадке. Наиболее целесообразно брать органы и ткани у трупов 20-45 лет. Хрящи и кровеносные сосуды следует брать исключительно у молодых индивидуумов (от 18 до 35 лет).  

Противопоказания: гепатит, туберкулез, остомиэлит, септицемия, бактериемия, отравления кислотами, лугами, грибами и др.  

Время забора: после смерти в тканях проходят сложные биохимические процессы, которые приводят к потере их жизнеспособности, а в дальнейшем к аутолизу и гниению.    Аутолиз является следствием действия тканевих ферментов, а гниение – бактериальной флоры.  

Инвазия бактерий начинается с желудочно-кишечного тракта, потом “поражает” близкоразмещенные ткани и органы и в конце костную ткань и кожу. Поэтому забор ткани следует проводить в первые 12 ч. после смерти. Если сохранять трупы при температуре +4⁰С то интервал может быть увеличен до 24 часов после смерти.  

Порядок забора тканей у трупа: глазное яблоко, кожа, сухожилия, хрящи, костная ткань, твердая мозговая оболочка, широкая фасция бедра, перикард.                       

ЗАБОР КСЕНОТРАНСПЛАНТАТОВ (ткани животного происхождения) проводят после строгого контроля ветеринарного врача.

Трансплантаты из пластмассы, нержавеющих металлов (сталь, золото, серебро, платина и др.) используются в стоматологии, травматологи (при переломах костей; для остеосинтеза и прочего).  

Искусственные трансплантаты имеют ряд преимуществ:

– изготовляются заводским способом в неограниченных количествах;

– их можно многократно стерилизовать;

– не нужно консервировать;

– легко и удобно транспортировать;

– имеют значительную прочность и неограниченные сроки хранения.  

Вместе с этим они имеют ряд недостатков: это инородные тела, которые часто вызывают раздражение окружающих тканей, ухудшают регенерацию.  

Сейчас изготовляют комбинированные трансплантаты, например из пластмассы и ауто-или ксеноматериалом.  

Ткани от трупов можно брать в стерильних условиях. Для этого необходимо иметь операционную, которая отвечает всем требованиям.  

Перед забором кожные покровы тщательно моют теплой водой, щетками, бреют бритвой, обрабатывают спиртом, антисептиками, эфиром, йодом. Если забор проводят в нестерильних условиях, то их в последующем стерилизуют, чаще радиационным методом.    Техника забора тканей может быть иной, но основное правило должно быть выдержано – это не изуродовать труп.  

Кожу забирают дерматомами из нижних и верхних конечностей, спины. Твердую мозговую оболочку после забора разрезают кусками, которые необходимые в клинике (50-100 см²). Забор ребер проводят костотомом через одно, с целью сохранения формы грудной клетки. Кровеносные сосуды забирают следующие – почечную артерию, аортальную дугу, грудную аорту и др.  Временами проводят забор и вен. Из сухожилий часто забирают ахиловое, сухожилия руки или часть длинных сухожилий и коротких мышц.  Костную ткань берут в следующем порядке: ребра, плечевые кости, кости предплечья, гребень клубовой кости, бедренная кость и кости голени.  

Обработка тканей: Ткани (независимо от метода проведенного забора (в стерильних или нестерильных условиях) следует очистить и обработать. Это проводится в специальных боксах, сохраняя условия стерильности. Ткани очищают от мышц, сухожилий, фасций, жира и др.  

МЕТОДЫ КОНСЕРВИРОВАНИЯ: Существуют разные методы консервирования:

1) консервирование при низкой температуре в незамороженном состоянии. При этом температура колеблется от +2 до +8⁰С с использованием или без использования растворов для консервирования. Чаще всего температура поддерживается от +2 до +8⁰С; из растворов используют р-н Рингера, Рингер-Локка и прочие. Часто к ним добавляют гомогенную плазму или сыворотку в соотношении1 до 10. Временами для консервирования используют спирт, формалин, мед, глицерин;

2) консервирование методом заморожения;

3) путем лиофилизации;

4) консервирование путем химической обработки;

5) консервирование путем включения в пластмассу.  

Имеет значения глубокое замораживание. Для костной ткани достаточно 20^оС, для   костного мозга, нервов, сосудов, кожи нужна температура от -79 до -196⁰С.  

Имеет значение и скорость замораживания. Быстрое замораживание приводит к “температурному шоку”.  Много клеток при таком шоке гибнут. Для сохранения жизнеспособности клеток их помещают в особые защитные растворы (глицерин и др.). Эти вещества называются криопротекторами.  

Низкие температуры изменяют биохимические и биофизические реакции клеток, но основное значение в таких случаях имеет состояние уволенной в клетках воды.  

Известно, что вода в клетках находится связанной с белками, или в свободном состоянии-свободная вода. Замерзание тканей приводит к кристаллизации свободной воды, которая находится внутри и внеклетки. Образование кристаллов в тканях приводит к механическому разрушению клеточных мембран, и конечно – к гибели клеток.  Кроме этого, к гибели клеток приводит не только механическое действие кристаллов, но и действие повышенной концентрации солей внутри– и вне самой клетки, которая наступает в таких условиях.  

При использованные защитных растворов можно предотвратить фазы образования стекловидного состояния несвязанной воды (витрификация). Таким образом, сохраняется жизнеспособность клеток.  

Глицерин СН₂ОН-СНОН-СН₂ВОН используют в концентрации от 10 до 15 % разведения в физиологическом растворе. Ткань, перед консервацией омещают в защитный раствор на 2 часа при температуре 4⁰ С.  Глицерин проникает через мембрану клетки и связывается с несвязанной водой. Этот процесс называется ЭКВИЛИБРАЦИЕЙ.  

Таким образом, криопротекторы не дают возможности образоваться кристаллам. После проведенной эквилибрации постепенно проводят замораживание тканей и в дальнейшем сохраняют в чанах с жидким азотом в криохранилище.  

       Для размораживания ткани помещают в физиологический раствор с антибиотиками при температуре +38⁰С.  

Лиофилизация: Лиофилизацией называется консервирование, при котором высушивается данный замороженный продукт под вакуумом. Переход воды из замороженого состояния проходит прямо в водные пары (минуя  жидкое состояние) называется возгонкой (возгонка). Слово лиофилизация – по-гречески обезвоживание.  

Таким образом, лиофилизация состоит из замораживания ткани и возгонки.    Замораживание должно быть быстрым, температуру следует понижать за секунды на -10-20⁰С.  Небыстрое замораживание проводит к кристаллизации, кристаллы льда постоянно увеличиваются и размеры их могут быть разными, от нескольких микрон до 0,2 г.  

Возгонка – это обезвоживание замороженной ткани, которое происходит при температуре ниже нуля, в вакууме, при давлении ниже чем 4,6 рт.    ст.    вода переходит из состояния льда в парообразное состояние.  

Таким образом, твердое вещество переходит прямо в парообразное состояние без образования промежуточной жидкой среды. Во время лиофилизации необходимо создать такие условия, которые регулируют температуру продукта и давление водных паров так, чтобы обеспечить переход льда в пар. Сроки пригодности лиофилизированых тканей могут быть до 2-3 лет, если в них остаточная влажность ниже 1-5 %. Их сохраняют при комнатной температуре, легко транспортируют.  

Недостатки лиофилизированных тканей.

Из литературных источников известно, что лиофилизированные ткани ломаются больше чем замороженные. Лиофилизированные ткани мертвы. Если содержимое воды в клетках ткани уменьшается более чем на 60 % – они гибнут (Г. Кристинова, Консервирование и трансплантация органов и тканей, том II, София, 1975г. –С. 134).  

По данным лаборатории криоконсервирования биологических субстратов Тернопольского медицинского университета, где проводилась лиофилизация ксенодермотрансплантатов для лечебных учреждений Украины установлено, что проведение лиофилизации ксенодермотрансплантатов с предыдущим пребыванием их в анабиозе изменяет их свойства после лиофилизации. Остаточная влажность в ксенодермотрансплантатах может быть не более 2%.  Они остаються жизнеспособными как и при криоконсервовании и с успехом могут использоваться для лечения ожоговых и послетравматических ран и трофических язв.  

 

 

 

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ КОНСЕРВИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ

 

  Уровень изучения ткани: органный, тканевой, клеточный, субклеточный.

Клинико-экспериментальний.   Трансплантация. Органное культивирование. Клеточное культивирование.

Биохимический. Исследование соединительной ткани. Исследование ферментов, продукции молочной кислоты, состава культурального среды. Морфологический. Гистологические, цитогистохимические методики. Электронная микроскопия. Биофизический. Термография, полярография, определение биопотенциалов, электропроводимости. Хемилюминесценция.

Радиоизотопный. Резорбция индикатора – Авторадиография.

 

Эффективность после лиофилизации может быть достигнута только при сохранении трансплантатом его биологических свойств в организме реципиента. Для этого пересаженная ткань должна сохранять общебиологические и специфические качества после консервирования, трансплантации и приживления.  

 

 

БИОЛОГИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ И

КОНСЕРВИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ

1 группа.  

СВЕЖЕИЗОЛОЛИРОВАННЫЕ ТКАНИ

Биологическая характеристика. Высокая степень жизнеспособности и метаболической активности. Хорошо выражена потенция роста in vitro, приживленность in vivo (настоящее приживление при аутопластике), временное – при гомо- и ксенопластике, эндокринные железы сохраняют способность к продуцированию гормонов.  

 

 

Источник заготовки:

1.    Жизнеспособные ткани, взятые у живых или агонирующих доноров;

2.    Утильне ткани, взятые из ампутированных конечностей и резецированных органов;

3.    Выращенные на питательных средах;

4.  эмбриональные и трупне ткани, взятые жизнеспособными в границах соответствующих, специфических для них сроков при данных условиях.  

ІІ группа. КОНСЕРВИРОВАННЫЕ ТКАНИ изолированные ткани, подвергнутые консервированию, которые не лишают ткань, или большую часть ее, элементов жизнеспособности.  

1.    Гемибиотическое консервирование.    Проводится при плюсових температурах (близких до 0 град. С). Жизнеспособность их сохраняется в границах нескольких дней, недель.  

Сохраняют их в консервантах, которые состоят из биологических и химических веществ, которые имеют питательное, антицитолизирующее, бактерицидное и бактериостатическое влияние на ткань.  

2.  Анабиотично консервированные ткани. Сохраняют продолжительное время (часто месяцы и годы) в состоянии резко сниженной жизнедеятельности (обменные процессы значительно приостановлены – неполный анабиоз) или в нежизнеспособном состоянии (метаболизм практически полностью прекращен – полный анабиоз).    В случае прекращения действия консервирующих агентов (“деконсервирование“) и возвращения в соответствующие благоприятные для активной жизни условия такие ткани способны восстанавливать достаточно высокой уровень обмена и жизнедеятельности присущий данной ткани.  

Жизнедеятельность их может быть продемонстрирована с помощью возможных функциональных тестов (например, рост в тканевых культурах, настоящее приживление при аутопластике, временное при гомопластике, продуцирование гормонов и др.).  

К этой подгруппе относим криоконсервованую кожу, лиофилизованую кожу по методике В.В. Бигуняк, П.И. Лучанко, 1995, криоконсервованые другие ткани.  

3.    Абиотично консервированные ткани.   Мертвые ткани, все белковые компоненты которые под влиянием консервации испытали невозвратные изменения. Метаболизм (внутриклеточный и тканевой) целиком отсутствует. Все тканевые элементы нежизнеспособные, но общая цитоархитектоника и структура тканей в целом сохранены –грубые морфологические изменения не определяются. Такие ткани могут обладать довольно высокой степенью биологической активностости и проявлять ее при подсадке.  

К этой подгруппе относим ткани консервированные в спирте, формалине, лиофилизированные ткани.  

 

ІІІ группа.    ТКАНЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ.  

Лечебные препараты биологического происхождения, изготовленные с гемогетероткани или органов подданных при консервациии специальной обработке, в результате чего ткани теряют витальнисть и присущую им морфологическую структуру; биохимический состав их поднимается. Биологическую активность могут сохранять. С помощью импрегнации разных средств способны набирать бактериостатических, бактерицидних и других свойств.    Пример: фибриновая пленка, SYS pur – derm и др.  

  

СВОЙСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Стволовые клетки – это такие клетки, которые в процессе деления могут образовывать специализированные клетки разных тканей. В книге проводится обзор современных (на июнь 2001 г.)   представлений о стволовых клетках.  

В зависимости от степени дифференциации стволовые клетки могут быть:

*тотипотентними, то есть, способными образовывать клетки дорогих типов;

*плюринотентними, способными образовывать клетки многих, но не всех типов;

*мультипотентними, способными образовывать клетки нескольких типов.  

Когда оплодотворенная яйцеклетка начинает делиться, получаются первые тотипотентные стволовые клетки.  

Приблизительно через четыре дня они начинают дифференцироваться.  

Получаются плацента, экстраэмбриональные органы и собственно эмбрион. На этой стадии она называется бластоцитом – тотипотентных клеток уже нет. Плюринопотентные клетки образовывают две популяции. Первая представляет собой массу клеток, которая расположенна внутри эмбриона и в дальнийшем образует разные органы будущего организма; вторая – будущие половые клетки – сначала располагаются внутри желчного мешка, а позднее мигрируют в половые органы, которые начинают формироваться.  

Позднее плюринопотентные клетки продолжают дифференцироваться, превращаясь в специализированные стволовые клетки – мультипотентные.  

Одни из них могут образовывать разные клетки крови, другие – нейроны и глиальные клетки нервной системы, третьи – разные клетки кожи и т.д.  

Стволовые клетки не только имеют важное значение в развитии плода, но и сохраняются в детском и взрослом организме.  Так, кровяные стволовые клетки содержатся в костном мозгу и в менших количествах в самой крови.  На протяжении всей жизни организма они делятся, образуя разные типы клеток крови. Небольшие количества стволовых клеток содержатся в печени, головном мозгу и во многих других органах. Такие стволовые клетки называются региональными; при поврежденнии тканей соответствующего органа стволовые клетки, которые находяться в нем, мигрируют в зону повреждения, делятся и дифференцируются, образуя на этом месте новую ткань (наперекор распространенному мнению, что нервные клетки не восстанавливаются).  

МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Судьба стволовых клеток в тканях взрослого организма, как правило, очень маленькая. Из-за этого возможности органов из регенерации очень ограниченные.    К счастью, стволовые клетки могут быть занесены в організм искусственно.    В последние несколько лет опубликовано большое количество работ, которые подтверждают, что стволовые клетки, попадая на поврежденные участки разных органов, превращаются в самый раз у клетки того типа, что необходимый,чтобы залечить поврежденную (при условии, что они владеют потенцией к соответствующей дифференциации).    Попадая в поврежденное інфарктом сердце, они превращаются у клетки сердечной мышцы – миоцити, в пораженному інсультом главком мозге – в нейрони глиальни клетки.    Стволовые клетки могут превращаться у клетки печени, костного мезга и др.    Это дает надіжду на излечение більшого количества разнообразнейший заболеваний.  

         Численне эксперименты на животных и первые экземпляры на людях демонстрируют широкие возможности при менения СК.    Только в статьях пересчитываются следующие области медицины, в которых продемонстрированная высокая эффективность использования стволовых клеток:

– неврология (лечения следствий травм главного и спинного мозга, инсультов, коматозних состояний, нейродегенеративних заболеваний и др.   );

– кардіологія (лечения атеросклероза, ИБС и следствий инфаркта миокарду);

– ендокринология (лечения инсулинозависимого диабета, следствий овариектомии и др.);

– болезни опирно-рухового апарата (репарація костей, костная пластика, лечения миопатий, следствий травмы, рубцево-спайкови процессы);

– гепатология (лечения гепатитов, циррозы печени);

– гематология;

– косметология;

– геронтология и гериатрия

– и другие.  

Преимущественно региональные стволовые клетки превращаются в клетки тканей соответствующего органа. Проведенные в последние годы эксперименты продемонстрировали свойство некоторых типов стволовых клеток при определенных условиях менять специализацию.  Так, было показано, что нейрональные стволовые клетки могут превращаться в клетки крови, а клетки из костного мезга – у клетки печени.  

Методы медицинского использования стволовых клеток продолжают совершенствоваться все более скорыми темпами. На сегодняшний день наиболее разработанные методы использования фетальних клеток, а также использование пупочной крови для лечения ряда онкологических заболеваний и нарушений иммунитета. Что касается стволовых клеток другого происхождения, то их использование скорее всего можно будет проводить за теми же методиками, которые применяются в случае фетальних стволовых клеток.  

Особый интерес составляет сохранение стволовых клеток для их использования самым донором. Сохранения при температуре ниже -130⁰С  может быть на протяжении многих десятков (и даже сотен) лет. Это разрешает сохранять детские клетки донора к возникновению потребности в них при заболевании или в старосте. Реакция отторжения на собственные клетки исключена полностью. Поскольку использование стволовых клеток очень эффективное при почти всех заболеваниях, которые связанные со старением можно ождать,  что их сохранение от рождения к соответствующему возрасту разрешит отодвинуть наступление стариковских изменений и радикально продолжить жизнь.

Стволовые клетки плаценты и пупочной крови могут быть успешно использованы для лечения близких родственников донора (родителей, братьев и сестер).

В целом можно ожидать, что в ближайшие года медицинское использование стволовых клеток будет получать все более широкое распространение и скоро полностью изменит большинство областей медицины.

 

ИСТОЧНИКИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Человеческие эмбрионы и фетальные ткани.

Понятно, что этот источник очень ограничен, а его использование поднимает ряд этических проблем. Фетальные стволовые клетки вызовут в организме реципиента реакцию отторжения, как и всякие другие чуждые клетки. Значительно больше приемлемы с этической точки зрения такие источники стволовых клеток, как ткани взрослого организма.

 

Стволовые клетки присутствуют во многих, если не во всех, тканях организма. На практике для их получения могут использоваться:

– костный мозг ;

– слизистая оболочка носоглотки в участке обонятельных рецепторов;

– жировая ткань;

– плацентарная и пупочнаяя кровь новорожденного;

– собственно плацента.  

Наилучшими свойствами владеют те клетки, которые взяты на максимально ранних стадиях развития организма.

 

Схема организации процесса заготовки и лабораторного тестирования   пупочной крови в БПК

Примечание: Выполнение всех манипуляций в роддоме (разговор с роженицей, эксфузия крови, заполнение документации, осуществляется только медицинскими работниками. Запрещено выполнение этих процедур персоналом, который имеет биологическое, химическое, фармацевтическое и другое немедицинское образование в связи с нарушениями этики и прав человека.  

КОСТНЫЙ МОЗГ

Чрезвычайно богатый стволовыми клетками. Однако, взятие образцов костного мозга есть болевой и опасной процедурой. Большинство стволовых клеток костного мозга –гематопоэтические, то есть, способные превращаться в разные клетки крови. Однако, в строме костного мезга присутствуют и мезенхимальные стволовые клетки, способные образовывать жировую, хрящевую, костную и мышечную ткани.

СЛИЗИСТАЯ ОБОЛОЧКА НОСОГЛОТКИ

Содержит частично специализированные стволовые клетки, способные превращаться в клетки нервной ткани нейроными клетки глии. Эти клетки должны быть пригодны для лечения травм и заболеваний головного и спинного мозга. Соскоб слизистой может быть легко сделан под местным обезболиванием или даже без него. Однако, применение этих клеток для замены тканей других, чем нерв, требует дальнейших исследований.

ЖИРОВАЯ ТКАНЬ

Содержит мезенхимальные стволовые клетки, способные образовывать жировую, хрящевую, костную и мышечную ткани. Жировая ткань может быть легко получена при липосакции. В данное время этот источник считается очень перспективным.

ПЛАЦЕНТАРНАЯ И ПУПОЧНАЯ КРОВЬ

Очень богата стволовыми клетками, их там даже больше, чем в костром мозге. Это гематопоэтичные клетки, весьма высокая эффективность их применения продемонстрирована при многих гематологических заболеваниях и нарушениях иммунитета.   Для их получения достаточно при рождении ребенка собрать кровь из его пуповины и сохранять в замороженном состоянии к тому времени, пока они ему не потребуются. Возможно так же использовать их для лечения других пациентов при условии их совместимости за антигенами так называемой HLA-системы.

ПЛАЦЕНТА

В апреле 2001 г. было опубликовано сообщение, которое американская фирма Anthrogenesиs Corporatиon (AnthroGen) получила из человеческой плаценты значительное количество (в 10 раз больше, чем из пупочной крови) стволовых клеток, которые способные превращаться в кожные, кровяные, мышечные и нервные клетки.

Если это сообщение подтвердится, плацента станет одним из наиболее перспективних источников стволовых клеток как для ауто-, так и для алотрансплантации. Можно будет создать криобанк плацентарних стволовых клеток, которые содержали бы клетки с большим количеством разных комбинаций антигенов.

К сожалению, более современными материалами мы не владеем и на сайте компании дальнейших уточнений нет. Возможно, что компания проводит оформление патента на свои технологи и не хочет раскрывать тайн в открытой публикации.  

ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОЗДАНИЯ БАНКА ПУПОЧНОЙ КРОВИ

Проблема донорства гематопоэтических клеток для трансплантации при лечении гематологических заболеваний является очень актуальной. Для ее решения предлагается создание банка пупочной крови, где могут сохраняться разные HL.

Типы образцов гематологических клеток. Авторы проводять результаты данных заготовки и хранения клеток пупочной крови. На основе опыта и данных литературы приведена схема организации банка пупочной крови и образец бланка осмысленого согласия матери на взятие крови из пуповины.

Среди фетальных заболеваний опухолевой и неопухолевой природы, которые встречаются у детей, надо выделить Острые лейкозы (4-5 на 100000 детей, апластические анемии, в том числе врожденные анемии Фанконии Даймонда-Блекфена (встречаются 1 на 250000 детей), талассемии, врожденные иммунодефицитные состояния (дефицит адгезии лейкоцитов, синдром Барра, болезнь Гюнтера, синдром Харлера). При отсутствии своевременного и адекватного лечения такие больные умирают более чем в 90 % случаев на протяжении 2-6 месяцев от начала развернутой клинической картины. Радикальным методом лечения лейкозов, апластических анемий, тяжелых врожденных имунодефицитних состояний есть трансплантация костного мозга (ТКМ) или периферических стволовых клеток (ПСК) от совместного за системой HLA родственного донора (родные братья или сестры). Но осуществление таких операцийв РФ достигает не более 160-200 в год. Аллогены ТКМ составляютот 1/5 до 1/10 из всех проведеных операций. Потребность в ТКМ и ПСК удовлетворена меньше, чем на 1-2 %.

Основная проблема в низкой обеспеченности аллогенном ТКМ состоит в отсутствии совместных родственных доноров. В решении данной проблемы большое значение могут сыграть неродственные доноры. Так в Европе, Америке, Азии уже давно существуют регистры доноров кроветворных клеток, которые насчитівают на 2002 год более 7 млн  потенциальных доноров костного мозга (КМ) и ПСК. Несмотря на наличие таких регистров доноров, удовлетворение запроса в нахождении совместных за HLA системой антигенов   кроветворных клеток для детей с заболеваниями системы крови и острыми лейкозами составляет не более 30-60 %. Кроме того, даже при нахоженные в Американском или Европейском Регистрах такого донора, затраты на поиски донорского КМ в центре трансплантации обходится от 25000 до 50000 долларов США.  

Преимущества и недостатки применения кроветворных клеток пупочной крови (ПК)

      Выще перечисленные проблемы использования неродственного КМ приводят к необходимости поиска болем доступного, дешевого и достаточно эффективного источника кроветворной ткани, которым есть пупочная кровь (ПК), которая содержит большое количество стволовых клеток. Успешное практическое применение такого источника  гематопоэтических клеток для трансплантации ребенку с анемией Фанцони впервые осуществили врачи в Париже в 1988 г., а уже через 13 лет в мире начислялось более 1500 пересадок с использованием кроветворных клеток ПК. Поэтому ПКнужно рассматривать как альтернативу КМ для операции трансплантации больным с гемобластозами.     

      Однако, важно отметить, что доза  гемопоэтических клеток, которая необходимая для успешной трансплантации при использовании ПК из расчета на 1 кг массы тела реципиента составляет 3,7 х 10⁷ ядровместиткльных клеток (ЯВК). Применение доз меньше 1 х 10⁷ ЯВК/кг массы тела больного значительно увеличивает риск непригодности трансплантата и рецидива заболевания. Поэтому гемопоэтические клетки, полученные из ПК, преимущественно используют в детской практике.

Предварительно проведенный анализ в Русском НИИ гематологи и трансфузиологии показал, что из заготовленных образцов ПК (n=104) 51,7 % может быть использован для пересадки детям в воздасте 5-7 лет, а детям до 1 года – 100 % только 12, 1% – для реципиентов старше 12 лет. По результатам статистической обработки даннях банка пупочной крови (БПК) в г. Дюссельдорфе из 2100 заготовленных единиц ПК для взрослых реципиентов с массой тела 50-70 кг потенциальными трансплантатами могли считаться 25% от общего количества размороженных образцов. Такой расчет делался при условии использования методик наращивания  гемопоэтических предшественников с применением колоностимулирующих факторов.

Среди преимуществ использования кроветворных клеток ПК для пересадок перед донорскими КМ и ПСК надо отметить:

– отсутствие риска здоровью как матери, так и ребенка (донора);

– не нужно применять общую анестезию при эксфузии ПК;

– значительное снижение риска передачи некоторых латентных инфекций (цитомегаловируса) от донора реципиенту, чем при использовании КМ и ПСК взрослых доноров, у которых такие инфекции встречаются у десятки раз чаще:

– неограниченная возможность длительного хранения гемоноэтических клеток ПК в замороженном состоянии. Это разрешает накоплять и сохранять разные HLA-типы стволовых клеток, в то время как потенциальные доноры КМ с течением времени выбывают из донорського Регистра по разной причине (возрастные ограничения, соматические болезни, миграции, отказ донора и др.)

– возможность предоставления замороженнях единиц клеток ПК, которые находяться в БПК, в дорогом центре ТКМ, которое отстраняет задержки и неуверенность, которые часто возникают из-за забрудненого поиска донора и заготовки КМ;

– значительно меньшая стоимость, чем КМ (10000 против 25000 долларов), а при созданные БПК в РФ, стоимость такого образца ПКможет составлять менше 2000 долларов;

– возможность страховать жизнь ребенка, от котрого получена данная порция крови.  

Как сообщает УКРАИНСКИЙ БАНК БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ       (г. Харьков), последнее десятилетие характеризуется интенсивным развитием нового направления в медицине – клеточной и тканевой терапии и и спользование для этих целей тканей и клеток эмбрио-фето-плацентарного комплекса.

Высокий клинический эффект применения клеток и тканей эмбрионального и фетоплацентарного происхождения подтверждается публикациями в специальной литературе и средствах массовой информации, а также результатами, полученными при использовании продукции Украинского Банка биологических объектов. Суть метода клеточной и тканевой терапии состоит в активном заместительном и стимулирующем влиянии на функционально неполноценные клетки и ткани в отдельных органах и системах. В отличие от других центров, которые занимаются лечением эмбриональными и половыми клетками и тканями, в основе разработанных нами технологий лежит положения о сохранении биологическими объектами жизнеспособности, которая предопределяет после их применения высокие клинические результаты. Механизм действия жизнеспособных имплантантов основано на сохранении в криоконсервований ткани метаболически активных веществ естественного происхождения, которые корригируют иммунологический статус пациента и владеют полиморфологическим эффектом специфической и неспецифичной направлености.

Преимуществом в использовании тканевых трансплантантов есть то, что пациент получает ряд биологически активных сбалансированных соединений естественного происхождения, которые способны осуществлять влияние на разные стороны метаболизма целостного организма.

В основу разработанных методов долгосрочного низкотемпературного хранения биологических объектов положен мировой опыт криоконсервирования разных клеток и тканей.

Разработка современных технологий криоконсервирования, которые отвечают мировым стандартам, а также соблюдение требований по подготовке трансплантационного материала, его проверке, маркировке и хранения разрешило войти Украинскому Банку биологических объектов в систему тканевих банков мира – Европейскую Ассоциацию Тканевих Банков.

С целью ускоренного введения новых методов в практику лечебных учреждений, разработки нових перспективних направлений в клитинно-тканевий терапии и обеспечения их современного уровня на базе Института проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины (Харьков) был создан Межведомственный Центр криобиологии и криомедицини под эгидой Министерства Охраны Здоров”я, Академии Медицинских Наук и Национальной Академии Наук Украины.

 

ОБЕСПЕЧЕНИЕ  БЕЗОПАСНОСТИ  РЕЦИПИЕНТА.

В Украинском банке биологических объектов на основе положений о деятельности Европейской и Американской Ассоциаций Тканевих банков разработана система, которая, с одной стороны, разделяет донора и реципиента на основе полной конфиденциальности и анонимности, а з другой – обеспечивает получение трансплантационно гоматериала в соответствии с необходимыми требованиями, что к селекции донора, подготовке к хранению, сохранению и выдаче для использования в разные лечебные учреждения.

Для исключения возможного заражения реципинта все объекты проходят проверку на инфицирование сифилисом, вирусами гепатита В и С, СПИД, цитомегаловирусом, вирусом краснухи, герпеса.

Каждый имплантант имеет паспорт, куда заносятся результаты проверки и которая обеспечивает безопасность трансплантационного материала для реципиента.

 

ХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Каждый образец ткани или доза клеток помещенны в герметичный контейнер, который имеет соответствующую маркировку. Контейнер находится в низкотемпературном хранилище Украинского Банка биологических объектов.

К пользователю материала контейнер доставляют в переносному сосуде Дюара с жидким азотом. В условиях, которые обеспечивают чистоту при использовании имплантантов, контейнер погружают в воду с температурой 42⁰С до его полного отогрева, раскрывают, а потом используют по назначению.

Сопроводительные документы – паспорт на препараты, обратной талон находяться у пользователя. По окончании лечения (выписке из стационара, прекращении амбулаторного наблюдения) обратной талон направляют в Украинский Банк биологических объектов.

 

ПРОДУКЦИЯ УКРАИНСКОГО БАНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

ФРАГМЕНТЫ ТКАНИ ПЛАЦЕНТЫ.

Механизм действия. Имплантация фрагментов ткани плаценты осуществляет влияние на органы-мишени, стимулируя их функционирование и повышает неспецифическую резистентность организма в целом к неблагоприятным факторам внешней среды и стрессовым ситуациям, стимулирует репаративные способности клеток при заболеваниях разного генеза и повреждениях.

Это связано с тем, что плацента является настоящим “депо” разных биологически активных веществ, которые обеспечивают рост и развитие организма плода. Кроме того, плацента есть слабо иммуногенным органом и владеет ярко выраженными иммунными функциями за счет репродуктивных протеинов.

Так, в частности, хорионический гонадотропин активирует Т-лимфоциты и действует как активатор иммунной системы в целом, а хорионический адренокортикотропный гормон обеспечивает прямую и обратную звязь между нейроэндокринной и иммунной системами.

Децидуальный эндометрий синтезирует пролактин, который является настоящим имуномодулятором, содействуя реализации имунокомпетентными клетками своих функций.   Такими же имуномодулюющими функциями обладает хорионический тиреотропный гормон.

В период физиологически протекающей беременности в тканях плаценты синтезируется целый ряд пептидов – структурных аналогов нейропептидов головного мозга – эндорфины и энкефалины, которые осуществляют имуномодулирующий эффект. Их стимулирующее или угнетающее действие зависит от исходной активности иммунокомпетентных клеток и проявляется в регуляции иммунного ответа клеточного и гуморального типа.

В плаценте происходит синтез белков, которые относятся к классу интерлейкинов – ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, одной из функций которых есть индукция гуморальных факторов неспецифичной резистентности, а вырабатываемый клетками трансформующий фактор роста стимулирует репарацию за счет активации мезенхимальних клеток и процессов неоваскуляризации.

Нами полученны морфологические экспериментальные данные, которые разрешают констатировать при имплантации фрагментов плаценты стимуляцию эндокринных органов и ткани печени, улучшение трофики сердечно-сосудистой системы, эффекты “омоложения” организма в целом и органов половой сферы, повышение репаративной способности тканей.

Фрагменты плаценты при имплантации осуществляют выраженный клинический эффект при лечении фето-плацентарной недостаточности, невынашивании и иммунологическом конфликте при беременности.

В комплексном лечении пациентов с ишемической болезнью сердца осуществлялось положительное влияние подсадки фрагментов плаценты, вызывая снижение холестерина сыворотки крови на 19, 2%, что, в свою очередь, приводило к снижению риска дальнейшего развития ИХС на 38%.

О положительном влиянии имплантации или местного применения экстракта плаценты свидетельствуют данные, которые полученны при лечении ЛОР заболеваний – язвенных, субатрофичних и атрофических ринитах, ларингитах, синуситах, которые сопровождались снижением количественного обсеменения патогенными микроорганизмами, повышением уровня секреторного иммуноглобулина А.

Имплантат относится к тканевим препаратам, которые осуществляют специфическое и неспецифичное действие.  За счет наличия в высокой концентрации гормонов, ферментов и других биологически активных веществ коригирует иммунологические показатели организма и повышает его стойкость к неблагоприятным факторам.

Форма выпуска. Биологический материал, который предлагается для имплантации, представляет собой фрагмент ткани плаценты 1х1, 5 см, который запакован в герметичный одноразовый контейнер.

Контейнер имеет соответствующую маркировку, которая дублируется на паспорте, сопровождения каждого контейнера.

Средства применения.   Отогрев биологического материала проводят непосредственно перед применением.  

       После отогрева (до 5 мин.   пребывания в теплой воде) контейнер раскрывают с соблюдением правил асептики и антисептики, трансплантационный материал вытягивают пинцетом и вводят в подкожный карман (верхне–наружный квадрант ягодицы, подлопаточный участок).   На разрез накладывается шов и давящая повязка.

Противопоказания и побочные эффекты. Не рекомендуется применение при генерализованой инфекции, острой почечной недостаточности, туберкулезе.   В первый день после имплантации возможный субфебрилитет и ощущения некоторого дискомфорта.

Эффект имплантации проявляется через день, хотя возможна и более отсроченная реакция.   Прослежено лечебное влияние имплантации на срок до 1 года.

 

ЭКСТРАКТ   ПЛАЦЕНТЫ.

Это водный экстракт, полученный после мелкодисперсного фрагментирования ткани плаценты. Содержит указанные выше ферменты, гормоны и биологически активные вещества.

Форма выпуска. Экстракт, который предлагается, расфасован в одноразовые контейнеры и содержит 1, 3-1, 5 мл.   экстракта. Контейнер имеет соответствующую маркировку и сопровождается паспортом, который удостоверяет чистоту экстракта.

Средство применения.   Вводится подкожно или внутримышечно по 1, 3, 5 мл.   с интервалом в 2-3 дня. На курс лечения назначается 3-4 инъекции.

Показания такие же, как и при имплантации фрагментов плаценты.

Побочных явлений и осложнений при применении не отмечено.

АМНИОТИЧЧЕСКАЯ И ХОРИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКИ.

Амниотическая и хориальная оболочки покрывают плаценту и обеспечивают ее функционирование.

Амнион представляет собой тонкую прозрачную оболочку, которая прилегает к хориону, вистилает внутреннюю поверхность плаценты и переходит на пуповину, покрывая ее в виде футляра.  

       Микроскопически амнион состоит из 5 рдел.   Цитоплазма клеток эпителия амниона содержит липиды, полисахариды, гликозоаминогликаны, а также многочисленные ферменты типа липазы, пептидаз, трипсина, гликолитичные ферменты.

Хорион представляет собой оболочку, которая непосредственно прилегает к децидуальнои части плаценты с одного стороны и амниона – з другой. В децидуальний части различают 4 пласта, клетки которого отличаются полиморфизмом.   Цитоплазма этих клеток содержит значительное количество рибонуклеопротеидов, высокомолекулярные полисахариды, гликоген, а также щелочную фосфатазу, неспецифические эстеразы и прочие ферменты. В соединительной ткани гладкого хориона найденны кислые гликозаминогликаны – гиалуроновая кислота и хондроэтинсульфаты, а также разные гликопротеиды и гликоген.

Использование биологически активного материала – амниотичной и хориальной оболочек – есть альтернативой традиционным методам лечение длительно незаживающих ран и трофических повреждений за счет использования нетрадиционных подходов к стимуляции репаративной способности тканей пациента.

Использование биологического покрытия уменьшает болевые ощущения и формирование рубцов. Доказано наличие нескольких механизмов действия биологического покрытия.

а) секреция клетками цитокинов и ростковых факторов, которые стимулируют в тканях пациента миграцию и пролиферацию клеток соединительной ткани, за счет чего происходит закрытие рановой поверхности; б) формирование соединительнотканного матрикса на рановой поверхности; в) замещения эпидермальних клеток и дермы пациента за счет донорского материала.

Форма выпуска.

Фрагменты хориальной и амниотичной оболочек 3х5 см, запакованны в одноразовые контейнеры.

Контейнеры маркированы и имеют сопроводительные документы.

Средства применения.

       Отогрев материала проводят по общей методике (см. выше), фрагменты вынимают пинцетом и накладывают на рановую поверхность. Дополнительной фиксации материала не нужно, он остается на рановой поверхности до полного лизиса или отторження.

 

 

 

ФРАГМЕНТЫ ТИМУСА ПЛОДА.

Механизм действия.

Эндокринная функция тимуса неразрывно связана с его деятельностью в качестве центрального органа имуногенеза, который обеспечивает становление имунокомпетентности Т-лимфоцитов и нормальную работу периферических отделов системы, которая регулирует иммунный гомеостаз.

Существует тесная связь между функциональной активностью тимуса и других желез внутренней секреции. Формирование на фоне возрастной инволюции тимуса разных патологических процессов, в частности, опухолевого или аутоимунного, вызывает нарушение иммунологической реактивности пациента.

Поскильку контролирующие функции  тимуса распространяются на всю популяцию Т- лимфоцитов можно считать, что его возрастная инволюция поднимает внутренний иммунологический баланс организма, доказательством чего есть развитие системных и аутоимунних заболеваний при опухолях и других поражениях тимуса.

Развитие хронических инфекционно-токсических заболеваний может поддерживаться второстепенной иммунной недостаточностью.

Препараты тимуса, которые предлагаются для имплантации, есть комплексными биологически активними соединениями, которые включают кроме гормонов  тимуса, медиаторы клеточного иммунитета (лимфокины), которые выделяются тимоцитами, и биологически активные факторы тимичных макрофагов, которые также влияют на диференцировку Т- лимфоцитов.   Эффект распространяется на все участки системы Т-

лимфоцитов, начиная с полипотентной стволовой  клетки и заканчивая зрелыми Т- клетками лимфатических узлов. Действие имплантанта есть преимущественно регулирующим, зависит от исходного уровня иммунологических процессов и обеспечивает их коррекцию и восстановление.

Составным эффектом деятельности имплантанта есть регуляция иммунитета в широком понимании слова, т. е.   а) стимуляция лимфоидних клеток-предшественников; б) торможение избыточной продукции В-лимфоцитов и избыточный синтез гуморальных антител; в) обеспечение взаимодействия с имуногормональними функциями других желез внутренней секреции.

Рекомендуется применение в качестве имуностимулятора при заболеваниях, которые сопровождаются снижением клеточного иммунитета, в том числе при острых хронических гнойных заболеваниях, трофических язвах, а также при угнетении иммунитета после лучевой и химиотерапии, в качестве лечебного средства при аутоимунних заболеваниях.

Форма выпуска.

Имплантант представляет собой фрагмент  тимуса плода 0,5х 0,5, погруженный в одноразовый контейнер, который имеет соответствующую маркировку. Правила использования такие же, как и фрагмента плаценты.

Противопоказания и побочные эффекты не выявлены.

 

ГОМОГЕНАТ КЛЕТОК НЕРВНОЙ ТКАНИ ПЛОДА.

Лечение и реабилитация больных с тяжелыми формами поражения центральной и периферической нервной системы представляет собой значительные трудности, неопределенности, несмотря на достижения современной фармакологии. Адекватная помощь больным, которые страдают тяжелыми дистрофическими неврологическими заболеваниями, не может быть обеспечена даже за счет наличия арсенала лечебных средств разной направлености действия.

Использования разных вариантов клеточной и тканевой терапии при этой патологии часто есть “жестом отчаяния” врача, который уже не надеется на улучшение или стабилизацию состояния больного. В то же время есть сообщения в литературе, посвященные этому вопросу, что применение разных вариантов клеточной и тканевой терапии наиболее перспективно собственное в ранние сроки заболевания или диагностики того ли другого поражения нервной системы.

Описана возможность получения удовлетворительных результатов в лечении последствий токсических и алкогольных энцефалопатий, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянном склерозе, центральных и периферических парезах и параличах, полиневритах, болезни Дауна и другой патологии.

Рассматривая механизм действия трансплантанта нервной ткани можно, согласно данным литературы, выделить элемент неспецифичности за счет действия нейротрофических факторов и элемент специфического действия, обусловленное наличием большого количества нейромедиаторив, которые вводятся с трансплантантом и обеспечивают коррекцию нейротрансмитерного дефицита.

Форма выпуска и средства использования.

Биологический материал, который предлагается для использования, представляет собой гомогенат нервной ткани из разных участков головного мозга плода. Материал расфасован в пластиковые одноразовые пробирки объемом 1,5 мл.  При использовании после отогрева крышку пробирки откручивают, а материал набирают в шприц, дополняя до 2,5 мл.   раствором новокаина. Вводят глубоко внутримышечно. На курс лечения рекомендуется 3-4 инъекции с интервалом между ними в 2-3 дня.

Противопоказаний к использованию не выявлено.  

КОСТНАЯ ТКАНЬ ПЛОДА.

В настоящее время общепринятым есть положение о том, что аутогенный пластический материал имеет большие преимущества перед другими видами трансплантационного материала. Тем не менее, аутопластика сопровождается рядом довольно часто непреодолимых недостатков, к числу которых можно отнести дополнительную травму пациента, а также наличие системных заболеваний скелета.

Костная пластика гомотрансплантантами получила достаточно широкое распространение в ортопедии, но к числу ее недостатков следует отнести отторжение трансплантанта, его продолжительная перестройка и включение в общий костный метаболизм, который вынуждает увеличивать сроки иммобилизации в послеоперационном периоде.

Всеобщее внимание уделяется вопросу брефопластике – пересадке гомологичной плодовой костной ткани.

Экспериментальные исследования, посвященные крианиопластике костной тканью плода, свидетельствуют, что тонкие малодиференцийованные костные трансплантанты быстро реваскуляризируются и обладают более высокими пластическими свойствами, чем ткани взрослого донора. Результаты рентгенологических и морфологических исследований показали, что восстановление целостности кости при ауто- и брефопластике наступало приблизительно до 70 дней, а при гомопластике костной тканью донора оно не наступало и через 150 дней.   Большинство авторов использовали консервированную кость плода при лечении длительно несрастающихся переломах трубчастых костей и ложных суставов нижней челюсти, при посттравматических остеомиэлитах и некоторых видах опухолей.

Данные литературы свидетельствуют, что метод низкотемпературного консервирования получил достаточно широкое распространение при сохранении костных трансплантантов.   В монографии А.С. Иммамалиєва приводятся обобщенные сравнительные данные о влиянии низких температур на костный трансплантат и ход репаративной регенерации после их клинического использования, на основе чего автор отдает преимущество криоконсервованым гомотрансплантатам.

Нами разработаны и предлагаются к клиническому применению криоконсервованые костные фрагменты плода 20-37 недель развития.

Форма выпуска.

Материал, который предлагается, изготавливается в виде фрагментов 10-12 см.

(плоскостные кости) и 5-7 см.   (трубчатые кости). Костная “крошка” изготавливается с костной и хрящевои ткани на основе экстракта плаценты или физиологического раствора.   Расфасована в одноразовые контейнеры объемом 1,5–2,0 см.

Препараты находятся в одноразовых контейнерах.

Требования к хранению такие же, как и для всех криоконсервованих трансплантатов.

Средства применения.

После отогрева материал извлекают из контейнера с соблюдением стерильности и используют на усмотрение хирурга.

Противопоказания и побочные эффекты не выявлены.

ФРАГМЕНТЫ ТКАНИ СЕЛЕЗЕНКИ ПЛОДА.

Гетеротопичная трансплантация селезенки при сохранении всех межклеточных взаимосвязей в консервированной ткани может найти применение в лечении некоторых метаболичних нарушений с целью их регуляции.

История применения фрагментов селезенки в качестве лечебного средства достаточно продолжительная и включает, в основном, работы по использованию тканей крупного рогатого скота или нежизнеспособные ткани человека.

Метод криоконсервации разрешил создать запасы и предложить для клинических целей жизнеспособный материал, который прошел весь комплекс проверки на безвредность ткани для реципиента.

Об участии селезенки в защитных реакциях организма, ходе инфекционных процессов и ее роли в иммунных реакциях организма свидетельствуют классические работы И.И. Мечникова, В.К. Високовича и др. Как часть ретикулоэндотелиальной системы селезенка принимает активное участие в защитных реакциях организма, в частности, при овотворениях разной локализации за счет изготовления антибластичного вещества.

Считается доказанным влияние селезенки на минеральный обмен, в звязи с чем имеются данные о лечении больных с недостаточностю паращитовидних желез, которая развилась вследствие оперативноо лечения. В литературе есть сведения о влиянии селезенки на холестериновый и углеводный обмены.

На 20-22 неделе развития плода в селезенке происходит наиболее значительное увеличение количества лимфоцитов на целый орган с увеличением размеров Т-зависимых зон, площадь которых далее по мере развития плода увеличивается. Наличие в ткани селезенки плода высокого содержимого иммуноглобулинов М и G разрешает расценивать его в качестве имунокоректора, который действует через систему простагландинов.

Гетеротопичная трансплантация оказывает содействие нормализации процессов кровообразования, поскольку, по мнению некоторых авторов, селезенка содержит вещества,  идентичные гемопоэтинам, что и вызывает стимуляцию костного мозга.

Гетеротопическая трансплантация обеспечивает поступление в организм комплекса факторов, который обеспечивает общий положительный эффект.

Форма выпуска.

Материал, который предлагается, представляет собой фрагмент ткани селезенки 0,5х1,0 см, запакованный в одноразовый контейнер.

Противопоказания и побочные эффекты не выявлены.

ГЕМОПОЭТИЧНЫЕ КЛЕТКИ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА.

Механизм действия.

Гемопоэтичные заболевания и наследственные метаболические нарушения привлекают внимание врачей, которые исследуют возможности применения имплантации эмбриональных клеток.

Некоторые иммунные и гематологические заболевания могут быть излечены путем имплантации клеток-предшественников, т. е.   стволовых клеток.   При введении этих клеток в организм реципиента они попадают в органы-мишени и дают популяцию, которая обеспечивает достаточный уровень кровообразования, поскольку те клетки, которые вводятся являются иммунологически незрелыми (лимфоциты, способные индуцировать реакцию “трансплантат против хозяина”, появляются в печени эмбриона после 18 недель гестации).  

Восстановление усиленного гемопоэза после проведения противопухолевой терапии есть одной из самых актуальных участков использования клеток эмбриональной печени.   Существует мнение, что трансплантация  гемопоэтических клеток может заменить трансплантацию костного мозга, так как их использование не требует подбора за системой гистосовместимости.

Клиническое применение  гемопоэтических клеток было начато в 1961 г.   во время лечения хронической панцитопении, аплазии  тимуса, тяжелого комбинированного иммунодефицита, острой миелогенной и лимфобластной анемии. По данным литературы, наблюдается высокая степень клинического улучшения при апластической анемии (54%), лейкемии (40%).

Форма выпуска.

Препарат представляет собой суспензию живых клеток, выделенных из печени эмбрионов человека до 18 недель гестации.

Поставляется в ампулах объемом 1 мл. , концентрация клеток составляет 10-40 млн.  в 1 мл.

Используется после отогрева. Противопоказаний и побочные эффекты не выявлены.

ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА.

Механизм действия.

Нейротрансплантация как альтернатива медикаментозным методам восстановления возбужденных функцый нервной системы интенсивно развивается в последнее время, причиной чего стало сообщения шведских ученых о регрессии болезни Паркинсона после пересадки нейротрансплантата.

Поиск тканей, трансплантация которых оказывала содействие бы наибольшему клиническому эффекту обнаружил уникальные свойства клеток нервной ткани эмбриона человека.

Высокое содержимое в эмбриональных препаратах бластних клеток обеспечивает их рост, миграцию и образование межклеточных контактов. Эти клетки способны изменятся и диференцироваться в ответ на стимулы окружающей среды. Новотворение сосудов в трансплантате начинается уже в первые 24 часа после трансплантации.

Эмбриональные клетки продуцируют и содержат большое количество разных биологически активных веществ, ростковых факторов, стадиоспецифических белков и пептидов, таких как фетопротеин и разные адаптогены.

Таким образом, трансплантат есть источником биохимических составных для мозга реципиента, вырабатывает трофические факторы для стимуляции функций и владеет способностью восстанавливать пораженные нейроны.

Трансплантация эмбриональных клеток и их асоциатив имеет перевес перед трансплантацией клеток и тканей от взрослого донора, так как не вызывает отторження транслантированной ткани. Это обеспечивается тем, что в нейронах и глии фетального мозга человека антигены 1 и 2 класса главного комплекса гистосовместимости не экспресованы.

Нейротрансплантация показана и применяется при болезни Паркинсона, Гентингтона, разных неврологических заболеваниях.  Возможность лечения путем нейротрансплантации показана также для болезни Альцгеймера, синдрома Корсакова, амиотрофичного латерального склероза, наследственной атаксии. Инсульты, травмы головного и спинного мозга составляют большую группу заболеваний, при которых применения нейротрансплантации дает обнадеживающие результаты.

Форма выпуска.

Материал представляет собой суспензию живых нервных клеток головного мозга эмбриона человека. Поставляется в ампулах по 1 мл.   Содержимое клеток в 1 мл.   – 10-100 млн.

И так, эффективность всех выше названных препаратов связана с тем, что клетки и ткани, в особенности эмбрионального происхождения, имеют высокую активность за счет содержимого факторов роста, цитокининов, гормонов, ферментов, которые обуславливают их высокой терапевтический эффект.  

Биологически активные соединения стимулируют у реципиентов регенераторные процессы, повышают сопротивляемость организма, стимулируют иммунологические реакции. Они осуществляют заместительную функцию, влияют на обменные процессы, стимулируют компенсаторные силы организма, имеют противовоспалительную активность

“В целом можно ожидать, что в ближайшие года медицинское использование стволовых клеток будет получать все более широкое распространение и скоро полностью изменит большинство областей медицины.

    Стволовые клетки через 10-15 лет сделают переворот в медицине”.

 (АКАДЕМИК   ВАЗИАНОВ,   2003 г. )

 

Успехи и трудности крионики. Сколько может продлиться анабиоз организма?
Понятия анабиоза и смерти не тождественны. Анабиоз есть временное замедление всех жизненных функций, смерть – необратима. Оживить можно только заживо замороженный неповрежденный организм, сохранивший потенциал памяти возрождения.

       Способность бактериальной клетки к самоконсервации в неблагоприятных условиях называется спорообразованием. Спора может существовать в условиях абсолютного холода (при отсутствии влаги) и вакуума, и только высокая температура и агрессивная среда способны разрушить клеточную стенку и испортить генетический материал. В благоприятных условиях происходит инициация процесса жизни, и клетка оживает, претерпевая метаморфозы перевоплощения и возобновляя способность к размножению.

      Анабиоз наблюдается главным образом у семян растений и у некоторых беспозвоночных (насекомых, круглых червей), но встречается и у высших форм (лягушек, мелких землеройных млекопитающих). В природе известны многие виды мелких животных, способных обратимо переносить глубокое замораживание.

      Одним из главных условий воскрешения умерших в физическом виде Древний Мир предполагал сохранение памяти об умершем. Современная наука добавляет условие сохранения внутренней памяти. Это означает, что организм может метафизически возродиться, если память его достаточна для обновления в новых условиях, то есть потенциал жизни не исчерпан, но находится в заторможенном состоянии. В определенном смысле крионику можно трактовать как попытку сохранить память человека в заморозке до лучших времен, когда законсервированная информация сможет стать доступной для воскрешения улучшенными научными методами. Хотя воскресение осуществляется Богом, без человеческих усилий оно невозможно. В 20 главе Откровения Иоанна Богослова сказано, что после Страшного Суда были воскрешены только те умершие, которые “были записаны в раскрытой книге жизни”, а “кто не был записан в книге жизни, тот был брошен в озеро огненное”.

       Для будущего воскрешения древние бальзамировали своих знатных умерших и воздвигали для них мавзолеи – в честь правителя Карии Мавзола Галикарнасского (4 век до нашей эры). Кария входила в состав Иранской империи, где государственной религией был зороастризм. Не исключено, что принцип сохранения памяти об умершем для последующего его телесного возвращения послужил основой возникновения множества тайных эзотерических организаций, передающих знания своим членам из поколения в поколение. Одной из таких организаций стал Мальтийский орден, некоторое время возглавляемый Павлом Первым. Супруга убиенного Павла Мария Федоровна построила для любимого мужа мавзолей, надеясь на его воскресение.

      С надеждой на воскресение выразил идею заморозить умершего Ленина большевик Леонид Красин. То, что технократ и атеист Красин искренне верил в оживление замороженного тела силами будущей науки, засвидетельствовано документально. Несмотря на скепсис некоторых большевистских руководителей, в Германии было закуплено и перевезено в Россию необходимое холодильное оборудование и начата его установка в одной из башен Кремля. Как всегда, не успели завершить до оттепели, а потому остановились на бальзамировании. Коммунистам тогда было невдомек, что для пущей уверенности замораживать надо было живого Ленина – так нет, они еще и мозг из него вынули и отдельно законсервировали в формальдегиде в Институте мозга. Поэтому можно быть абсолютно уверенными в том, что Ленин никогда не воскреснет – друзья постарались.

         Впервые научно сформулировал концепцию заморожения тел для сохранения английский анатом Джон Хантер в конце 18 века (просвещенная Мария Федоровна – жена Павла – накануне смерти супруга узнала об открытии ученых и всерьез прониклась мыслью о воскрешении супруга). Похожую точку зрения высказывал и наш соотечественник Порфирий Бахметьев в начале 20 века. Практичные же американцы поставили дело сохранения умерших в холоде на поток и создали целую индустрию на базе науки крионики, наподобие дианетики – науки о полном психическом исцелении. Все бы ничего, если бы не наивная вера американцев во всемогущество запротоколированного знания и патологическая страсть наставлять остальное человечество на путь истинный.

      Криоконсервация отдельных клеток и тканей широко используется в трансплантологии, клеточной терапии, репродуктивной медицине, как часть процесса искусственного оплодотворения вне организма матери. Уже в 1940 году была обратимо заморожена сперма быка, в 1967 году в США был пока что необратимо заморожен первый человек (профессор психологии Джеймс Бэдфорд), а в 1985 году Грегори Фэй впервые осуществил оживление человеческого эмбриона после длительной заморозки.

       Чтобы сохранить живые клетки в течение нескольких месяцев, их хранят при температуре минус 72 градуса в твердой двуокиси углерода. При этой температуре все химические реакции практически приостанавливаются. Для более длительного хранения используют более низкие температуры, вплоть до температуры жидкого азота (минус 196 градусов). Теоретически в таком холоде хранение возможно на тысячи и миллионы лет.

        Успешный опыт сохранения биологических материалов накоплен в медицинской трансплантологии. Как правило, органы для трансплантации становятся доступны после смерти донора и подписания родственниками права на медицинское их изъятие. В распоряжении врачей имеется всего несколько часов для определения соответствия трансплантанта донора реципиенту. Из-за ограниченности времени не исключена возможность перенесения пациенту ВИЧ и других видов инфекции.   При операции могут быть пересажены собственные клетки пациента, клетки чужого человека или родственника, эмбриональные или фетальные клетки, генетически модифицированные клетки животных.

        В последние годы в трансплантологии все больше практикуется использование заранее запасенного собственного (или ближайших родственников) костного мозга и стволовых клеток, которые выделяют из пуповинной крови новорожденных. Основной способ хранения здесь тот же – глубинное и длительное охлаждение.

         Помимо клеток и органов практикуется пересадка тканей и наращивание недостающих частей органов. Охлаждение используют, чтобы как можно дольше сохранить жизнедеятельность клеток трансплантанта. Иногда, впрочем, клетки намеренно убивают, для использования ткани донора в качестве матрицы, на которой размножаются собственные клетки организма – все зависит от используемой технологии.

        Несмотря на некоторые успехи по пересадке органов и тканей человека, по сей день не существует методики, позволяющей замораживать без повреждения такие органы как сердце, почки, печень и лёгкие. В некоторых случаях удавалось успешно пересадить фрагменты яичника женщине после их непродолжительного хранения в жидком азоте. Те же эксперименты по пересадке яичников на овцах проходят более удачно. По-видимому, необходимо еще дополнительное время для экспериментов и отработки методик, но движение, как признают медики, осуществляется в правильном направлении.

        Работы по криоконсервации почек человека возглавляет известный американский ученый Грегори Фэй. На основанной им фирме “21 Century Medicine” используют комбинацию запатентованных криопротекторов из метоксилированных эфиров сахарных спиртов, блокирующих образование ледяных кристаллов при быстром охлаждении. Охлаждение органов до минус 130 градусов без образования льда и разрушения тканевой структуры получило название витрификации – области крионики, где уже достигнуты значительные успехи. В последние годы большое распространение получила практика очень быстрого замораживания ооцитов и эмбрионов с целью достижения витрификации. Витрификационные среды обычно содержат этиленгликоль или сахарозу, а также их комбинации с фиколом. Основные препятствия по использованию крионики в практической медицине связаны с механизмами повреждающего действия холода. Некоторые из них действуют на клеточном уровне, другие возникают на уровне тканей.

Клеточный уровень

Мембрана клетки состоит из двух слоев фосфолипидных молекул, каждая из которых имеет гидрофильный и гидрофобный конец. Гидрофобные стороны обращены внутрь мембраны, гидрофильные – наружу. В нормальном состоянии мембрана имеет жидкокристаллическую структуру, а толщина слоя составляет около 4 нм. При охлаждении клетки мембрана претерпевает фазовый переход из жидкокристаллического состояния в гелевое. Температура фазового перехода такой сложной структуры как мембрана колеблется в диапазоне от минус 20 до +60 градусов (подобный широкий фронт плавления имеет и ДНК). Ширина диапазона зависит от того состава входящих в мембрану липидов (соотношения АТ и ГЦ пар нуклеотидов). На температуру фазового перехода оказывает влияние и состав ионной среды. Ионы кальция повышают температуру перехода, а холестерин снижает ее. При замораживании липидные концы молекул напрягаются, мембрана утолщается и функционирование ее нарушается. По мере охлаждения в мембране могут образоваться дырки (поры), часто необратимые при восстановлении нормального температурного режима. Приобретенная пористость мембраны может стать одной из причин гибели клетки.

            Еще больший вред на клеточном уровне наносят кристаллики льда, образующиеся при замораживании объекта. Фактически лед разрывает мембраны клетки на осколки. Если небольшие повреждения клетка еще способна регенерировать, с более значительными разрушениями она не справляется. Образование льда происходит как внутри клеток (наиболее опасные повреждения), так и в межклеточном пространстве (не очень опасные).

Тканевый уровень

Растрескивание тканей происходит прежде всего из-за неравномерности охлаждения крупных объектов. Также при образовании кристаллов льда в оставшейся жидкости резко повышается концентрация солей, которая может привести к необратимому нарушению белковых структур. Чем медленнее происходит охлаждение, тем больше концентрация солей. При замерзании с поверхности объекта в нем формируется фронт кристаллизации, который образует и гонит перед собой повышенный солевой градиент, который при достижении критической величины приводит к смерти.

Чтобы защитить клетки и ткани от повреждающего воздействия холода, используют различные защитные вещества – криопротекторы – и подбирают оптимальный режим замораживания для данного типа клеток. Дополнительные трудности обусловлены разнородным клеточным составом отдельных органов, каждый из которых требует своего режима заморозки. Не существует идеальных протекторов, способных понизить температуру кристаллизации хотя бы до температуры “сухого льда”. По мере охлаждения, рано или поздно, достигаются температура и концентрация раствора, называемые эвтектическими. В точке эвтектики охлаждаемая смесь превращается в аморфную массу, имеющую вид сухого порошка. Однако частицы этой смеси настолько малы, что не оказывают повреждающего действия на клетку. Опаснее максимальная доза воды, способная выделиться в виде кристаллов льда. Здесь многое зависит от типа клеток.

        Опыты по замораживанию золотистого хомячка показали, что если в тканях головного мозга в лед превращается не более 60% воды, то при оттаивании хомячки выживают без сколько-нибудь заметных отклонений в поведении. Если же льда образуется больше, оттаявшие хомячки утрачивают память и координацию движений. Использование в качестве протектора глицерина позволяет понизить долю образуемого при замораживании льда: при введении в нервную ткань хомячка 28% глицерина образование льда при любых низких температурах не превысит 60% (критерий Смита). Однако сам глицерин оказывает побочное токсическое действие на мозг хомячка.

        Обычно на практике используют меньшие концентрации протекторов, чем те, которые получаются по критерию Смита. При этом образцы подвергают медленному охлаждению в парах жидкого азота. Образующиеся в межклеточном пространстве кристаллы приносят относительно мало вреда. В процессе роста они оттягивают воду из клеток; концентрация растворенных веществ внутри них повышается, и образование кристаллов замедляется. В некоторых клетках вода витрифицируется, в других образуются небольшие, не опасные для жизни ледяные кристаллы, а оставшаяся незначительная часть клеток погибает.

Разделяют проникающие и непроникающие через мембрану криопротекторы. Наиболее распространены проникающие вещества: глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, ацетамид и диметилсульфоксид. Среди непроникающих чаще других используют полиэтиленгликоль, сахарозу, фикол. При составлении плана-сценария заморозки применяют комбинации и тех и других протекторов.

        Животные дикого мира, способные переносить в природе сильные холода, часто вырабатывают внутри организма те же глицерин или сахара (глюкозу и трегалозу). Кроме того, многие зимующие насекомые, а также некоторые обитающие в арктических водах рыбы вырабатывают так называемые айс-блокеры – блокаторы образования льда, – поддерживающие воду организма в переохлаждённом жидком состоянии при температурах на несколько градусов ниже точки замерзания – обычно, на несколько градусов. Айс-блокеры практически не влияют на количество образующегося при более низких температурах льда, а потому неэффективны при глубоком медленном замораживании в криобиологии. Но при быстром замораживании они могут оказаться полезны.

           Не меньшие трудности при витрификации возникают на этапе согревания объекта и возвращения его к жизни. Поскольку переохлаждённая вода метастабильна, на опасном участке также может происходить образование кристаллов. Кроме того, сказывается токсичность криопротекторов. Во избежание дополнительных разрушений организма необходимо обеспечить его быстрое согревание с одновременным отмыванием от протекторов.

             Наконец, помимо протекторов и блокаторов при консервации используют и другие вспомогательные вещества: мембранопротекторы и антиоксиданты. Мембранопротекторы защищают мембраны от повреждения и образования дыр. Антиоксиданты связывают свободные радикалы, которые в условиях кислородного голодания повреждают многие макромолекулы.

        Выяснение механизмов физических повреждений организма при замораживании и оттаивании не может дать ответ на вопрос о возможности продления жизни человека в замороженном состоянии. Поскольку большинство ученых считает, что личность человека определяется деятельностью его мозга, а память зависит от связи между нейронами, можно было бы сузить проблему до гипотезы: возможно ли путем замораживания сохранить в целости структуру связей нервных клеток головного мозга? Или, по крайней мере, восстановить память с достаточной степенью точности?

            Известно, что после смерти человека его нервные клетки разрушаются относительно медленно, сохраняя связи между собой в течение нескольких часов. Некоторые же нервные клетки продолжают после смерти определенную функциональную активность, то есть еще живы. Казалось бы, не потерян шанс на оживление и других нервных клеток, а затем и на восстановление функций всего мозга, всей памяти человека, если реанимацию проводить средствами медицины будущего, дающими возможность лечить нервную клетку на молекулярном уровне. Но насколько глубоки и обратимы нарушенные?

Тот факт, что современные методы крионики уже сейчас позволяют обратимо замораживать и размораживать отдельные нервные клетки и участки головного мозга, дает мало оптимистических оснований для возрождения целостного организма. Если повреждения отдельных органов и могут быть исправлены, справедливо ли это в отношении мозга?

Возвращаясь к различию между анабиозом и смертью, можно предположить, что восстановление связей мозга возможно только у замороженного живьем человека. Что это за человек? Управление сознанием доступно немногим тренированным людям: тибетским монахам, индийским йогам и представителям некоторых других древних учений, – которые постигли всю полноту учения и способны погружать себя в транс и нирвану. Учитель Вивекананды Рамакришна, не старый и совершенно здоровый, точно спланировал дату и час своей смерти. Быть может, если бы его заморозили в момент отключения сознания и всех жизненных функций, при оттаивании он сумел бы самостоятельно возродиться, без привлечения новой медицины. Жаль, он сам не поделился, что думает по этому поводу.

Источники информации:

      А). Основные:

1.     Олейник Г.А., Григорьева Т.Г., Федак Б.С. Ожоги и отморожения. Атлас. Под редакцией Никонова В.В., 2009. – 143с.

2.     Пер Хеден. Енциклопедия пластической хирургии. – Москва «АСТ Астрель», 2001. – 326с.

3.     Сумин С.А. Неотложные состояния. – Москва «МИА», 2002. – 650с.

4.     Ожоги; Руководство для врачей / Под.ред.Б.А. Парамонова, Я.О. Порембського, В.Г.Яблонського.-СПб.:СпецЛит,2000.-488с.

5.     Белоусов А.Е. Очерки пластической хирургии Т.1. Рубцы и их коррекция – СПб.: Командор – SPB, 2005.- 128с.

6.     Классификация ожоговых ран по глубине поражения / Методические рекомендации / Состав.: Э.Я. Фисталь, Н.Е. Повстяной, Г.П. Козинец и др.-Донецке, 2003.-16с.

7.     Турак И.А. Адекватный шов раны.-  Ужгород ВАТ “Патент”, 2005.-81с.

8.     Нычик А.З. Основы оперативной техники в хирургии.- Тернополь, 2003.

9.     Цепколенко В.А., Грубник В.В., Пшенов К.П. Пластическая эстетическая хирургия : Современные аспекты.- К.: Здоров’я, 2000.- 232с.

10.           http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/zagalna_surgery/classes_stud/комбустіологія/медичний/6%20курс/русский/занятие%203%20консервирование%20тканей%20и%20органов..htm

11.           http://www.ibt.in.ua/rus/index.html

Б). Дополнительные:

1.Фисталь Э.Я., Козинец Г.П., Самойленко Г.Э., Косенко В.М. Комбустиология.- Киев, 2004.

2. Л.Я. Ковальчук та співав. Алгоритми спілкування студентів (лікарів) з пацієнтами (методичні рекомендації). Тернопіль, ТДМУ, «Укрмедкнига» 2009, 39 с.

3.Белоусов А.Э. Пластическая реконструктивная и эстетическая хирургия.- Санкт-Петербург: Гиппократ, 1998.

4.Казарезов М.В., Королева А.М., Головнев В.А. Контрактуры.- Новосибирск, 2002. 

5. Петров С.В.  Общая хирургия: “Питер”, 2003.

6. Юденич В.В., Гришкевич В.М. Руководство по реабилитации  

 обожженных.- Г.: Медицина, 1986.

7. Золтан Я.  Операционная техника и условия оптимального заживления

 ран.- Будапешт, 1977.

8. Франтишек Буриан. Атлас пластической хирургии.- Г.: “Медицина”,1967.

9. Гришкевич В.М., Мороз В.Ю. Хирургическое лечение последствий ожогов

           нижних конечностей.- Г., 1996.