ФЕРМЕНТИ: БУДОВА, ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ, КЛАСИФІКАЦІЯ ТА МЕХАНІЗМ ДІЇ

ФЕРМЕНТИ: БУДОВА, nФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ, КЛАСИФІКАЦІЯ ТА МЕХАНІЗМ ДІЇ. КІНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ. РЕГУЛЯЦІЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ nАКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ.

ФЕРМЕНТИ – БІОЛОГІЧНІ КАТАЛІЗАТОРИ

 

Одна з основних відмінностей між живим nі неживим світом полягає в тому, що постійність неживого грунтується на його nхімічній незмінності, тоді як стабільність і збереження живого базується на nбезперервних хімічних змінах, що відбуваються в ньому.

Хімічні процеси в організмі каталізуються особливими nречовинами (біокаталізаторами), що називаються ферментами, або ензимами. Білкову природу nферментів беззаперечно довів Джеймс Самнер (1926), який отримав перші nкристалічні  препарати ферменту nуреази.  Вчення про ферменти – одна з найважливіших проблем сучасної біології і nбіохімії. Саме тому ХХ ст. називають ще століттям ферментів, бо вчення про них n– це дітище цього століття.

Джеймс Бетчеллер Самнер (англ. James nBatcheller Sumner, 19 листопада 1887, Кантон, штат Огайо – 12 серпня 1955, Баффало, Нью-Йорк) – американський біохімік, член Національної АН nСША і Американської nакадемік мистецтв і наук. Закінчив Гарвардський університет в 1910 році та його nаспірантуру в 1914, nотримавши ступень доктора філософії. У 1914-1929 викладав nбіохімію в Корнельському університеті (Ітака, США); nз 1929 nдиректор лабораторії хімії ферментів у цьому ж університеті. Основні роботи – по nпрепаративній хімії білків, nвперше виділив фермент в кристалічній формі (уреазу), довівши таким чином білкову природу ферментів. За цю nроботу отримав Нобелівську премію з хімії 1946 р.

 

Зараз nвстановлено, що немає жодного процесу в організмі, який би відбувався без nучасті ферментів. Травлення, енергозабезпечення, побудова структурних компонентів nклітин і тканин, ріст, розмноження, м’язове скорочення, згортання крові nпов’язані з роботою ферментів.

http://www.youtube.com/watch?v=AFbPHlhI13g&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=AEsQxzeAry8&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=KED6BHVM97s&feature=related

Ферментативні nпроцеси людина використовувала ще в глибокій давнині. Протягом тисячоліть люди nвипікали хліб, виготовляли сир, вина, чай, барвники, дубили шкіри. Але nзастосовування тут ферментативних технологій мало суто емпіричний характер. nТермін «фермент» уперше був запропонований голландським ученим ХVІІ ст. nВан-Гельмонтом для nречовин, що стимулюють перетворення виноградного соку у вино. При цьому відбувається виділення nміхурців газу, що нагадує кипіння (з лат. fermentatio – кипіння, бродіння). Цей nпроцес назвали ферментацією, а речовини, що його викликають – ферментами. Дещо nпізніше був запропонований ще один термін – ензими (від грец. en zyme – в дріжджах).

Зараз обидва ці терміни вживаються як синоніми. nУчення про ферменти виділилось у самостійну науку – ензимологію або nферментологію. У 30-х роках минулого століття ферменти вперше були отримані в кристалічному nвигляді (Джеймс Самнер). Зараз nнараховується понад 2000 ферментів, встановлена їх природа, для деяких і nструктура, для багатьох – існування різних молекулярних форм – ізоферментів. Усі ферменти мають свої особливості nфункціонування, але можна виділити загальні nвластивості для всіх них:

1)                nкаталізують nлише енергетично можливі реакції;

2)                nприскорюють nяк пряму, так і зворотну реакцію, але не зміщують напрямку хімічної  рівноваги;

3)                nу nході реакції не змінюються та не входять до складу кінцевого продукту;

4)                nмають nвисоку специфічність дії (здатність каталізувати перетворення однієї або групи nподібних молекул);

5)                nзначно nбільш ефективні, ніж звичайні небіологічні каталізатори – кожна молекула nферменту може виконувати від декількох тисяч до мільйонів «операцій» за секунду nта прискорювати реакції у мільйони і мільярди разів;

6)                nдіють nу відносно м’яких умовах (фізіологічних значеннях рН, температури, нормальному nатмосферному тиску);

7)                nвони nє каталізаторами, активність яких може бути регульована, тобто збільшена або nзменшена.

 

Будова  ферментів

За nхімічною природою ферменти – це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто nвони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому nорганізмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока nмолекулярна маса, розщеплення до амінокислот під час гідролізу, утворення nколоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей nважких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціонуванню. Як nі білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, nферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, nуреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової n(простетичної) частин. Їх називають ще голоферментами, nа їх складові, відповідно, апоферментами n(білкова частина) і простетичною групою, nабо коферментом (небілкова частина nферменту) (рис. 1):

голофермент Þ апофермент + nкофермент, або простетична група

Рис. 1. Схема nбудови складного (двокомпонентного ферменту)

 

Простетична група міцно і постійно зв’язана з апоферментом. nЯкщо небілкова частина ферменту зв’язана з апоферментом непостійно, тобто nзнаходиться в дисоційованому стані й приєднується до апоферменту тільки під час nкаталітичного процесу, то її називають коферментом, іноді – кофактором.

Усе ж nтермін кофактор більше вживається в тих випадках, коли небілкова частина nферменту представлена якимось мікроелементом (металом), якому притаманна ще й nфункція активатора. Загалом, небілкова частина складного ферменту – nнизькомолекулярна і термостабільна, тоді як білкова – високомолекулярна і nтермолабільна. Важливо, що апофермент і кофермент проявляють ферментативні nвластивості тільки при їх поєднанні.

Апофермент nу складному ферменті вказує на тип перетворень, відповідає за так звану nспецифічність дії ферменту. Небілкова частина голоферменту сприяє зв’язуванню nферменту з речовиною, на яку він діє (субстратом), здійснює передачу nелектронів, атомів, іонів з однієї речовини в іншу. Важливо, що одна і та ж nнебілкова речовина в одних ферментах може бути зв’язана з білковою міцно (як nпростетична), а в інших – слабо, і то лише під час реакції (кофермент). nНаприклад, ФАД легко nвідщеплюється від білкової частини оксидази D‑амінокислот, а з ферментами тканинного nдихання він утворює міцний зв’язок.

Коферменти, або nкоензими

 

Кофермент, або коензим, бере участь у nперетворенні субстрату, тоді як апофермент вказує на тип реакції. Коферментом nможуть виступати різні за природою низькомолекулярні органічні, а також nнеорганічні речовини (метали), що здатні зв’язуватись із субстратом і видозмінювати nйого.

 

Вітаміни як nкоферменти

Найчастіше коферментами виступають вітаміни та їх похідні. Наприклад, nпірофосфорний ефір вітаміну В₁ – ТПФ – є коферментом nпіруватдегідрогенази, альфа-кетоглутаратдегідрогенази та транскетолази; похідні nвітаміну В₂ – ФМН, ФАД входять до складу оксидно-відновних nферментів. Сюди ж належать і похідні вітаміну nВ₅ – НАД і НАДФ (рис. 2).

 

Рис. 2. Коферменти дегідрогеназ

 

Коферментом nпереамінування та декарбоксилювання амінокислот є похідні вітаміну В₆ n– піридоксальфосфат. Вітамін В₃ є основою для утворення nкоферменту А (кофермент ацилювання) та пантотеїнфосфату – коферменту nацилпереносного білка синтезу жирних кислот.  n

Вітамін В₁₀ в організмі перетворюється на кофермент ТГФК, що nбере участь у перенесенні одновуглецевих фрагментів. Із вітаміну В₁₂ nутворюється два коферменти – метилкобаламін та дезоксиаденозил-кобаламін, які nразом із ТГФК переносять і видозмінюють одновуглецеві фрагменти під час синтезу nнуклеїнових кислот у кровотворних органах.

Вітамін Н (біотин) утворює активний nкофермент – карбоксибіотин, що бере участь у процесах карбоксилювання. Роль nкоферментів можуть відігравати і вітаміноподібні речовини – ліпоєва кислота, nубіхінон, карнітин та інші. Перша з них входить до складу nпіруватдегідрогеназного комплексу і бере участь в оксидно-відновному nперетворенні альфа-кетокислот. Убіхінон служить проміжним переносником nелектронів і Н⁺ в дихальному ланцюзі, а карнітин входить як nкофермент до складу трансфераз, що переносять залишки жирних кислот через мітохондріальну nмембрану.

 

Порфіринові nкоферменти

Ці коферменти за своєю структурою подібні або nнавіть тотожні гему в гемоглобіні. Вони містять іони металів, зокрема заліза, nякі можуть змінювати свою валентність (Fe⁺²  → Fe⁺³) і за рахунок цього nбрати участь у перенесенні електронів під час окисно-відновних процесів. nПорфіринові коферменти входять до складу таких ферментів, як цитохроми (b, с, а₁, nа₃), каталаза, пероксидаза та ін.

Рис. 3. nМодель третинної структури цитохрому С.

Червоним nв центрі молекули показаний активний центр — комплекс заліза з органічною nсполукою порфірином. Іон заліза, переходячи з двох- у трьохвалентний стан і nнавпаки, може віддавати і отримувати електрони.

 

 

Нуклеотидні nкоферменти

Найчастіше nкоферментами виступають нуклеозиддифосфати, рідше – нуклеозидмонофосфати. У складі коферментів nнуклеозиддифосфати зв’язуються з вуглеводами, ліпідами, амінокислотами тощо. Реакції, nв яких беруть участь нуклеотидні коферменти, зводяться до перетворення nсубстрату в молекулі коферменту. Наприклад, перетворення УДФ-глюкози в nУДФ-галактозу (стереоізомеризація). Нуклеотидні коферменти можуть також nвиступати в ролі донорів субстратів у реакціях переносу груп. Так, УДФ-глюкоза nє донором глюкози для біосинтезу глікогену, УДФ-глюкуронова кислота – донор nзалишку глюкуронової кислоти в реакціях кон’югації (наприклад, білірубіну). nЦДФ-холін може служити донором холіну під час біосинтезу холінфосфатидів.

 

Коферменти-метали nабо металовмісні комплекси

Значна nкількість ферментів для своєї дії потребує наявності металів. У таких ферментах nметали беруть участь в окисно-відновних процесах або відповідають за утворення nзв’язку між ферментом і субстратом. Іноді важко з’ясувати, чи даний метал або nйого іон входить до складу ферменту, чи виконує тільки роль активатора nферменту. В останньому випадку фермент може каталізувати реакцію і без металу. nФерменти, що містять у своєму складі метали, без них не будуть проявляти nхімічної активності. Зараз встановлено, що більш ніж 30 % із відомих nферментів є металовмісними або металозалежними. Металоферменти зустрічаються в nрізних класах ферментів.

Іон металу може входити в активний центр ферменту nабо бути зв’язаним із залишками амінокислот апоферменту, що розміщені на певній nвідстані від активного центру. Крім участі в окисно-відновних процесах, про що nсказано вище, метали сприяють формуванню вищих структур апоферменту, які також nє необхідними для функціонування ферменту. Ці структури стабілізуються шляхом nутворення сольових містків між іонами металів і карбоксильними групами nамінокислот. Такі функції здебільшого nвиконують метали постійної валентності.

Наприклад, іони кальцію стабілізують nальфа-амілазу, іони цинку– алкогольдегідрогеназу (при відсутності цинку остання nдисоціює на субодиниці й втрачає активність). В табл. 1 наведено приклади nферментів, що містять як коферменти метали:

 

Таблиця 1. Металоферменти та nвідповідні метали як коферменти

 

Коферменти-фосфати вуглеводів

Коферментами можуть бути і деякі nфосфати вуглеводів. Наприклад, 2,3-дифосфогліцерат є коферментом nфосфогліцеромутази, що перетворює під час гліколізу 3-фосфогліцерат на n2-фосфогліцерат. Для деяких ферментів роль коферменту можуть виконувати nпептиди. Зокрема, трипептид глутатіон (глутамілцистеїнілгліцин), що може nзнаходитись у відновленій або окисненій формі (HS–SH– або –S–S-), виконує функцію коферменту для nбагатьох оксидоредуктаз, наприклад глутатіонпероксидази.

 

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ nОСОБЛИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ

 

Більшість ферментів nмає чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і nчетвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із nсубодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування nферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне nперетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у nреакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його nчастина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається nтільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в nполіпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово nвони повинні бути досить зближені.

Наприклад, фермент nрибонуклеаза, що розщеплює РНК, має структуру, яка скріплюється чотирма дисульфідними nзв’язками (на рисунку заштриховано). В каталітичному центрі ферменту у 12 і 119 nположенні поліпептидного ланцюга знаходяться два залишки гістидину, але вони просторово зближені й можуть викликати розрив nмолекули РНК. На близькій відстані від залишків гістидину знаходиться ще n5 залишків основних амінокислот, які, nочевидно, можуть фіксувати РНК під час реакції (рис. 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4. Схема структури nрибонуклеази – ферменту, що гідролізує РНК (за Ж. Крю).

 

Та частина nмолекули ферменту, яка з’єднується із субстратом, називається активним центром nферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із nсубстратом, утворення ферментосубстратного комплексу і каталітичне перетворення nсубстрату. В активному центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну nділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або nякірну ділянку, що зв’язує фермент із субстратом. Схема розташування складових nкомпонентів активного центру показана на рис. 5.

За nутворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає nтретинна структура білко­вої молекули. Отже, при порушенні третинної структури n(денатурація) роз’єднуються просторово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, nфермент втрачає активність. У складі активного центру простого ферменту nзнаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утво­рюють nзалишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі nінші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із nсубстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом nважлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв’язкам (водневі nзв’язки, гідрофобна взаємодія).

Рис. 5. Схема функціональної організації молекули ферменту:

а – простий фермент; б – двокомпонентний фермент; в – алостеричний фермент; А – активний центр; S – субстрат; R – регуляторний, nабо алостеричний, nцентр; 1 – каталітична nділянка; 2 – контактна ділянка; 3 – кофактор.

 

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі nяк кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. nКофермент при цьому може відповідати за утворення зв’язку із субстратом, формування nтретинної або четвертинної структури апоферменту і каталітичне перетворення nсубстрату. Ферменти можуть мати 1, 2, 3 і більше активних центрів, що залежить nвід кількості протомерів (субодиниць), які входять у його структуру.

Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні nцентри (від грец. алос – інший, другий; стереос – просторовий, структурний). nАлостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних nчинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що nвзаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів. Приєднання до nалостеричного центру ефектора призводить до певних структурних змін в активному nцентрі та, як наслідок, пригнічення або підвищення активності ферменту. nЕфекторами можуть служити продукти ферментативних реакцій, гормони, медіатори nнервової системи, метали. Алостеричних центрів (як і активних) фермент може nмати декілька, відповідно до кількості протомерів. Важливо зазначити, що nалостеричні й активні центри у ферментах просторово відокремлені, тобто nзнаходяться один від одного на певній відстані.

 

Ізоферменти (ізоензими)

Ферменти, як і всі інші nбілки, характеризуються молекулярною гетерогенністю. Зокрема, ті з них, що nпобудовані з декількох субодиниць, можуть існувати в різних молекулярних nформах, утворюючи цілі сімейства ферментів. Такі форми зустрічаються в різних nтканинах організму і навіть усередині однієї клітини. Уперше це було nвстановлено на екстрактах із різних тканин, які піддавались електрофорезу в nкрохмальному гелі з наступним фарбуванням барвниками, специфічними для якогось nпевного ферменту. Так було виявлено, що на nелектрофореграмі ферменти дають по декілька забарвлених смуг, кількість яких nзалежить від виду тканини. Наприклад, лактатдегідрогеназа (ЛДГ) утворювала від nоднієї до п’яти забарвлених смуг, залежно від виду тканини. Отже, в різних nтканинах є по декілька молекулярних форм ЛДГ, які діють на один і той самий nсубстрат, але відрізняються між собою електрофоретичною рухомістю. Такі nферменти, що каталізують однакову реакцію і знаходяться в різних тканинах, але nвідрізняються між собою деякими фізико-хімічними властивостями, наприклад nелектрофоретичною рухомістю, молекулярною активністю, стабільністю, називаються nізоферментами, або ізоензимами. В основі цих відмінностей знаходиться генетично nзумовлена різниця їх первинної структури.

Але nформи ферментів, що утворилися внаслідок модифікації первинної структури після nзавершення синтезу білка, не відносять до ізоферментів. Ізоферменти є nхарактерними для більшості ферментів, які складаються з декількох субодиниць. nВідносно добре вивчені ізоферменти лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, nкреатинкінази, лужної фосфатази, амінотрансфераз та ін. Розглянемо множинні nізоформи лактатдегідрогенази (ЛДГ), яка каталізує зворотну реакцію перетворення nпіровиноградної кислоти в молочну з участю коферменту НАД. На електрофореграмі nЛДГ виявляється 5 ізоформ, кожна з яких містить по 4 субодиниці, але двох nрізних типів, які умовно позначають «Н»-тип (від heart – серце) і «М»-тип (від muscle – м’яз).

На рис. 6 показано nрозділення і відносну кількість ізоферментів ЛДГ nв різних органах. Екстракти нанесені на лінію, відмічену надписом «Старт».

Оскільки Н-субодиниці несуть більш виражений nвід’ємний заряд за умов електрофорезу (рН=8,4), ніж субодиниці М, вони з nбільшою швидкістю рухаються до анода і на фореграмі розташовуються найдалі від nлінії старту. З аналогічної причини ізоферменти, що містять переважно nМ-протомери, рухаються з малою швидкістю в електричному полі й знаходяться біля nкатода. Усі інші ізоферменти, що складаються з М- і Н‑субодиниць, nзаймають проміжні місця. Таким чином, ЛДГ має 5 ізо­форм, кожна з яких nскладається з таких протомерів:

ЛДГ₁=Н₄, nЛДГ₂=МН₃, ЛДГ₃=М₂Н₂, ЛДГ₄=М₃Н, nЛДГ₅=М₄.

Характерно, що кожна тканина в нормі має своє співвідношення форм, свій nізоферментний спектр ЛДГ. За типом ізоферментного спектра ЛДГ біологічні nоб’єкти діляться на 3 групи:

1. Із переважним вмістом у спектрі анодних, “швидких” форм (ЛДГ₁ nі ЛДГ₂). Сюди відносять: серце, мозок, нирки, підшлункову залозу, nеритроцити.

2. Тканини з переважанням ЛДГ₃ (легені, селезінка, лімфовузли).

3. Тканини, в яких переважають катодні, “повільні” ізоформи n(печінка, скелетні м’язи).

Отже, nміокард характеризується високим вмістом ЛДГ₁ і ЛДГ₂ і nдуже малим вмістом «повільних» компонентів. nПечінка і м’язи, навпаки, містять більше «повільних» ізоформ і зовсім мало «швидких». Вивчення nізоферментного спектра широко використовується в клініці для диференціальної nдіагностики органічних і функціональних уражень органів і тканин, а також nвстановлення топографії патологічного процесу. Ізоферменти відіграють важливу nроль у регуляції ферментативної активності, а також у процесі розвитку і nдиференціації клітин.

Припускають, nщо не тільки ферменти, але і багато інших білків можуть існувати в клітинах у nвигляді численних форм, які являють собою суміш різних субодиниць, закодованих nрізними генами. Величина сумарної активності ферменту в тканинах завжди nвизначається співвідношенням і сумою окремих ізоформ і залежить від стану nорганізму, вікових особливостей і сторонніх чинників, що діють на організм.

 

Рис. 6. nІзоформи лактатдегідрогенази. n

А – будова різних ізоформ ЛДГ; Б n– розподіл на nелектрофореграмме і відносні кількості ізоформ ЛДГ в різних органах; В – вміст ізоформ ЛДГ nу плазмі крові в нормі nі при патології n(Електрофореграми – зліва і фотометричне nсканування – праворуч).

 

Питання nбіосинтезу ізоферментів з’ясовано недостатньо. Наявні дані дозволяють nприпустити, що він змінюється залежно від рівня метаболізму при різних станах nорганізму. Внутрішньоклітинний синтез ізоферментів порушується при недостачі nбілків, що потрапляють в організм, а також вітамінів, коферментів, наявності nінгібіторів тощо.

За nрахунок ізоферментів обмін речовин у тканинах і органах може пристосуватися до nдії мінливих внутрішніх і зовнішніх чинників. Кожна тканина має індивідуальний nнабір ізоферментів, який характеризує специфічність метаболізму в ній і nзабезпечує функціонування всіх її складових компонентів.

 

Функціональні nферментні системи

У nфункціональному відношенні ферменти взаємодоповнюють дію одні одних. Хімічні nсполуки іноді під час перетворень переходять через довгі ланцюги реакцій, в nяких беруть участь багато ферментів. Нерідко в таких численних перетвореннях nпродукти першої реакції служать субстратом для наступної. Сукупність таких nреакцій створює поняття про так звані метаболічні шляхи, що характеризують nперетворення вуглеводів, жирних кислот, кетокислот тощо.

Ферменти, nщо функціонально пов’язані між собою при перетворенні певних субстратів і які nрозміщені в одних і тих самих органелах клітини, об’єднуються під поняттям nфункціональні ферментні системи, або надмолекулярні ферментні асоціації. nПрикладом таких систем можуть бути ферменти, що беруть участь у розщепленні nглюкози до піровиноградної або молочної кислоти. Сюди відносять і ферменти, що nокиснюють жирні кислоти в так званому циклі Кноопа до ацетил-КоА. Кожна ланка в nцих ланцюгах перетворень каталізується певним ферментом, а зв’язок між сусідніми nреакціями реалізується через проміжні метаболіти.

Окремі nферментні системи асоційовані між собою не тільки функціонально, але і nструктурно. До них можна віднести, наприклад, поліферментний комплекс nпіруватдегідрогенази, що включає в себе декілька ферментів, які через декілька nстадій здійснюють окиснення піровиноградної кислоти. Подібною є і система синтезу жирних nкислот, до якої входять сім структурно об’єднаних ферментів, що виконують спіль­ну nфункцію – синтез жирних кислот.

Деякі структурно-функціональні nасоціації ферментів закріплюються на мембрані й утворюють своєрідні ланцюги, nабо конвеєри, ферментів, через які із метою вилучення енергії передаються n”е” і “Н⁺“. Можна вважати, що поліферментні nструктурно-функціональні системи в клітинах досить поширені, вони виконують nбіологічно важливі функції і мають переваги над неасоційованими ферментами: nскорочуються відстані, на які повинні переноситися метаболіти в ізольованих nферментних реакціях, вони менш енергоємні, більш чутливі до регуляторних впливів.

 

Властивості ферментів як nкаталізаторів

Ферменти мають ряд nвластивостей, подібних до небіологічних каталізаторів, але одночасно і nвідрізняються від них. Спільними для всіх видів каталізаторів є:

1. Вони пришвидшують nтільки ті реакції, які можливі з точки зору термодинаміки, тобто ті процеси, що nйдуть у напрямку термодинамічної рівноваги, але з малою швидкістю.

2. Вони не змінюють напрямку реакції.

3. Каталізатори збільшують швидкість наближення системи до термодинамічної nрівноваги, не змінюючи при цьому точки рівноваги.

4. Відносно не змінюються після реакції, тобто вивільняються і знову можуть nреагувати з наступними молекулами субстрату.

5. Усі каталізатори діють у відносно малих концентраціях.

Разом із nтим, ферменти як білкові структури мають властивості, від­мінні від nвластивостей каталізаторів неорганічних. Що це за властивості? Для ферментів nхарактерні: специфічність, чутливість до дії сторонніх чин­ників, залежність nдії від рН і t°, ферментам, на противагу іншим каталі­заторам, притаманна nзначно вища каталітична активність. Розглянемо ці властивості.

 

Специфічність nдії ферментів

Специфічність є характерною рисою, що відрізняє ферменти від усіх інших nнебіологічних каталізаторів. Так, дрібно розпушені платина, залізо чи нікель можуть nвиступати каталізаторами розкладу перекису водню на воду і кисень. Серед nферментів таку дію проявляє в основному каталаза. Таким чином, ферментам nпритаманна виражена специфічність дії. Кожен фермент діє на певний субстрат або nна певну групу близьких за структурою субстратів чи на певний тип зв’язку в nмолекулі.

Висока специфічність дії ферментів nзумовлена конформаційною й електростатичною комплементарністю між молекулами nсубстрату і ферменту, а також особливістю структури активного центру ферменту, nщо забезпечує високу спорідненість із субстратом і вибірковість перебігу однієї nякоїсь реакції серед багатьох інших, які здійснюються в клітині. В nактивному центрі є функціональні групи для зв’язування відповідного nспецифічного субстрату, а також компоненти, що перетворюють субстрат на продукт nреакції. Таку властивість називають субстратною специфічністю ферменту. Завдяки nспецифічності ферменти не тільки пришвидшують перетворення субстратів, але і nвизначають напрямок метаболічного процесу.

Ферменти можуть проявляти відносну (групову), nабсолютну та просторову, або стереоспецифічність.

Ферментами nз відносною специфічністю можуть служити фосфатази, ліпази, протеази та ін. nТак, фосфатази здатні гідролізувати різні фосфороорганічні сполуки, наприклад бета-гліцерофосфат, nглюкозо-6-фосфат, холінфосфат; ліпаза розщеплює різні жири тваринного і nрослинного походження; протеази (пепсин, трипсин та ін.) також гідролітично nрозщеплюють пептидні зв’язки в білкових молекулах.

Відносна специфічність властива переважно ферментам травної системи, що має nважливе біологічне значення, бо економить засоби впливу на субстрати. Спільним nдля розглянутих вище ферментів є їх дія на однакові зв’язки певної групи nсубстратів.

Велика nкількість ферментів характеризується абсолютною специфічністю, тобто здатністю nперетворювати тільки якийсь один субстрат. Прикладом таких ферментів може nслужити фермент уреаза, що каталізує перетворення сечовини, але не впливає на nметилсечовину; фермент аргіназа перетворює аргінін, але не діє на метиларгінін; nсукцинатдегідрогеназа окиснює сукцинат, але не діє на малеат.

Усій групі ферментів притаманна nстереоспецифічність, тобто здатність впливати на один якийсь із стереоізомерів, nнаприклад на D- або L-ізомер. Так, ферменти, що каталізують перетворення nвуглеводів, діють тільки на D-ізомери, але не впливають на L-ізомери; фермент nфумараза каталізує перетворення фумарової кислоти, яка є транс-ізомером, але не nдіє на цис-ізомер – малеїнову кислоту.

 

Залежність nшвидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість nхімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості nреакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q₁₀, що nвказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. nДля хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина nцього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі nпри зростанні температури на 10 °С. Однак для ферментативних процесів така nзакономірність існує тільки в діапазоні низьких температур – до 50-60 °С. nВище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження nактивності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться nв межах 20-40 °С.

Сумарна швидкість ферментативної nреакції при зміні температури середовища являє собою результуючу від складання nдвох швидкостей – зростання швидкості у відповідь на підвищення температури і nзниження швидкості як функції денатурації білка-ферменту. Сумація цих двох nшвидкостей для більшості ферментів теплокровних істот дає найбільше значення nшвидкості при температурі 37-40 С.

Рис. 7. Вплив температури на швидкість реакції, яка каталізується ферментом: а n- підвищення швидкості реакції як функція температури; б – зниження швидкості nреакції як функція денатурації білка-ферменту; стрілка вказує на оптимум nтемператури

 

Температура, при якій швидкість nферментативної реак­ції максимальна, називається тем­пературним оптимумом. nТреба мати на увазі, що його величина буде зале­жати і від тривалості nдії температури на фермент. Так, фермент може переносити високу температуру nпротягом короткого часу і в цей період активність його значно підвищиться. Але nтривале перебування ферменту при високій температурі призводить до його nденатурації і зниження активності.

Низькі nтемператури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим nтемпературам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення nферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) nвідновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. nОхолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в nних мета­болічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

Температурний nоптимум 37-40 °С для більшості ферментів тепло­кровних тварин і людини, nочевидно, створює найкращі умови для існування структурної й електростатичної nспорідненості між активним центром ферменту та субстратом, необхідним для їх nвзаємодії. Однак зустрічаються ферменти, що не руйнуються при значно вищих nтемпературах і зберігають ферментативну активність. Так, лужна фосфатаза nпечінки стабільна при температурі 50 °С, а фермент м’язів міокіназа nвитримує навіть +100 °С. На активність ферментів впливають ще такі чинники, nяк концентрація субстрату, рН середовища тощо.

 

Залежність nактивності ферментів від рН середовища

Якщо nактивність ферментів визначати при різних значення рН, то графік залежності nматиме вигляд куполоподібної кривої (рис. ), крива може бути симетрична, з nоднаковим підйомом і спуском у кислому і лужному середовищах, або йти на nзниження в якійсь одній ділянці.

Рис. 8. Вплив рН на швидкість реакції, яка nкаталізується ферментом (стрілка вказує оптимум рН)

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом nферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для nбільшості з них знаходиться в межах рН 6‑8. Ряд внутрішньоклітинних nферментів найкраще функціонує у нейтральному середовищі. Разом із тим, для nферментів шлунково-кишкового тракту рН–оптимум може знаходитись у зоні від нейтрального до nсильно кислого і лужного сере­довищ. Так, пепсин має оптимум рН 1,5‑2,5, nтрипсин – рН 8,0-9,0. Для виявлення залежності активності ферменту від nконцентрації водневих іонів експерименти проводять при оптимальній температурі, nдостатньо високих концентраціях субстрату, але при різних значеннях рН.

Чутливість активності ферментів до nзміни рН середовища, очевидно, пов’язана з тим, що фермент, залежно від nсередовища, може знаходитись в іонізованій або неіонізованій формі, що буде nобов’язково відображатися на третинній структурі білка, зокрема при формуванні nактивного центру та утворенні фермент-субстратного комплексу. Безумовно, nрізне значення рН буде по-різному впливати і на стан іонізації кофакторів та nсубстратів.

Можна nстверджувати, що саме при рН-оптимумі між субстратом і ферментом існує найкраща nпросторова та електростатична комплементарність, яка забезпечує їх зв’язування, nутво­рення фермент-субстратного комплексу і подальше перетворення його. На рис. nпоказана графічна залежність активності ферментів від рН сере­довища.

 

Механізми та nособливості перебігу ферментативних реакцій

 

Енергетичні nособливості ферментативних реакцій

Чому під впливом ферментів зростає швидкість реакцій?

Для того, щоб відбувалася реакція, реагуючі молекули повинні мати певний nзапас енергії.

Ферменти, nяк і інші каталізатори, прискорюють тільки ті реакції, які термодинамічно nможливі, тобто ті, що відбуваються самовільно, але з малою швидкістю. nМожливість перебігу хімічної реакції визначається різницею між вільною енергією nпочаткових речовин і продуктів реакції. Якщо вільна енергія продуктів реакції nменша, ніж початкових речовин, тобто відбувалося розсіювання енергії, то nреакція перебігає самовільно – вона термодинамічно можлива. У випадку nпереважання вільної енергії продуктів реакції над вихідними речовинами реакція nенергетично стає неможливою (це так звана ендергонічна реакція). Вона може nздійснюватись тільки за умов надходження зовніш­ньої енергії в кількості, nбільшій за енергію утворюваних продуктів.

Швидкість будь-якої реакції залежить від величини енергетичного бар’єру, nякий необхідно подолати реагуючим молекулам, але для різних реакцій величина nцього бар’єру неоднакова. У зви­чайних умовах (при відсутності каталізатора, ферменту nабо при низьких температурах) є дуже мала кількість молекул, здатних перемагати nцей бар’єр і вступати в реакцію. Отже, без каталізаторів та при низьких тем­пературах nшвидкість реакцій буде низькою.

Здатність nмолекул вступати в хімічну реакцію визначається енергією активації, яка nзатрачається на перемагання сил відштовхування, що виникають між електронними nхмаринками взаємодіючих молекул. Інакше кажучи, енергія активації витрачається nна утворення проміжного комплексу між реагуючими молекулами.

 

Механізм ферментативних реакцій

За всю історію вчення про ферменти nбуло запропоновано багато гіпотез, що пояснювали механізм їх дії. Більшість nіз них має суто історичний характер і не витримала випробувань у світлі нових nданих про структуру ферментів та їх активного й алостеричного центрів. nЗаслуговує уваги гіпотеза, запропонована на початку ХХ ст. Варбургом і nБейлісом. Її значення полягає в тому, що вона пов’язувала механізм дії nферментів із дією неорганічних каталізаторів. Ця гіпотеза пояснювала, що nповерхня ферменту служить місцем для адсорбції реагентів. За цих умов різко nзростає кількість молекул субстрату, що припадає на одиницю площі ферменту, а nотже, за законом діючих мас зростає і швидкість реакції. Також припускалось, що nв результаті зв’язування субстрату з активним центром ферменту відбуваються nмеханічні зміни молекул субстрату, що призводить до більшої реакційної nздатності. Але адсорбційна гіпотеза не могла пояснити специфічності дії nферментів, тому вона не використовується.

Для пояснення специфічності дії ферментів у n1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою «ключа і nзамка» або гіпотезою «шаблону».

Еміль Герман nФішер

В основі nспецифічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату nі активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому nвипадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо nсубстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру nферменту (замок), то реакція не відбувається.

 

Але і ця гіпотеза (її ще називають nгіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко nуявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного nзамка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою nвимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до nсубстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного nцентру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат nіндукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими nсловами, «замкова nщілина», за nКошландом, nвиготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми «ключа» при контакті з nними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного nцентру, при яких він утворює із субстратом неактивний комплекс, і тоді реакція nне відбувається. На рис. представлені зміни структури активного центру nферменту, що можуть викликатись субстратом (за Кошландом):

Гіпотеза Кошланда nпро індуковану відповідність

 

Значну роль у вивченні механізму nвзаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, nопубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з nгіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується nутворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу. Процес nутворення комплексу описується рівнянням і перебігає у декілька стадій, кожна з nяких має свої особливості:

1 стадія – зв’язування субстрату з активним центром ферменту, тобто nутворення ферментосубстратного комплексу (ES);

2 стадія – перетворення первинного ферментосубстратного комплексу в один nабо декілька активних ферментосубстратних комплексів (ЕS^x i ES^xx);

3 стадія – відокремлення продуктів реакції від активного центру ферменту і nвивільнення ферменту та продукту (Е і Р).

1-а nстадія за тривалістю найкоротша: вона проходить майже миттєво. За цей час nсубстрат орієнтується навколо активного центру й утворює з ним короткоіснуючу, nнеміцну проміжну сполуку. На 2-й стадії, яка перебігає найповільніше, nвідбуваються розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення nнових із каталітичним центром ферменту. Зни­жується енергія активації nсубстрату, що зумовлює зростання швидкості його перетворення. 3-я стадія за nтривалістю наближається до 1‑ї, і швидкість її перебігу залежить від nдифузії продукту в середовище.

http://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ&playnext=1&list=PL07049A3A666B58A5

 

Достовірність nутворення ферментосубстратного комплексу, постульованого вперше Міхаелісом, nзараз доведена експериментально, математично методами ЕПР і ЯМР. Перші докази nіснування ферментосубстратного комплексу були одержані в лабораторії Кейліна і nЧанса. Сучасні методи дослідження дозволяють визначити для ряду ферментативних nреакцій константи швидкості утворення ферментосубстратних комплексів та їх nдисоціації на фермент і продукти.

Встановлено, nщо в утворенні ферментосубстратних комплексів беруть участь водневі зв’язки, nелектростатичні та гідрофобні взаємодії. Досліджуючи рівняння Міхаеліса-Ментен, nможна також вивчити кінетику ферментативних реакцій, встановити порядок реакції nта стежити за впли­вом різних чинників на перебіг ферментативного процесу. В за­гальному, nприскорення хімічних реакцій відбувається завдяки тому, що ферменти nзабезпечують правильну орієнтацію молекули субстрату біля каталітичного центру, nнадають для каталізу протон-донорні і протон-акцепторні групи, утворюють за nдопомогою ковалентних зв’язків нестабільні проміжні сполуки із субстратом і nвикликають напруження в молекулі субстрату або її деформацію.

http://www.youtube.com/watch?v=cXLpxe6sPwI&feature=related

 

Кінетика nферментативних реакцій

 

Основи кінетики ферментативних процесів були закладені у працях Міхаеліса і nМентен, зокрема в рівнянні ферментосубстратного комплексу.

Під кінетикою nферментативних процесів розуміють розділ науки про ферменти, що вивчає nзалежність швидкості ферментативної реакції від хімічної природи субстрату, nумов середовища, а також сторонніх чинників, які впливають на перебіг реакції.

Коли концентрація nсубстрату досить велика, то вона вже не впливає на швидкість, бо остання стала nмаксимальною (свідчення того, що весь фермент зв’язаний із субстратом). nГрафічно залежність швидкості реакції від концентрації субстрату описується nгіперболою, яку називають кривою Міхаеліса.

Рис. 9. Крива насичення хімічної реакції, яка ілюструє співвідношення між nконцентрацією субстрату [S] та швидкістю реакції v

Форма кривої показує, що із nзбільшенням концентрації субстрату всі активні центри ферменту насичуються. Це nдосягається при максимальнїй концентрації ферменту і відповідає максимально nможливій швидкості реакції. Як видно з графіка, при низьких кон­центраціях nсубстрату ферментативна реакція відбувається за першим порядком, тобто nшвидкість зростання її залежить від концентрації однієї речовини – субстрату. В nумовах високої концентрації субстрату реакція перебігає за нульовим порядком, nтобто зміна концентрації не впливає на перебіг процесу, швидкість реакції за nцих умов максимальна, оскільки всі активні центри ферменту зв’язані із nсубстратом.

Дослідження nактивності ферментів проводять при великих концентраціях субстратів (нульовий nпорядок реакції). У цих умовах усі зміни швидкості реакції будуть залежати nтільки від кількості ферменту. Але в живих клітинах концентрації субстрату, як nправило, далекі від насичення ферментів. Це означає, що ферменти в клітинах nвикористовують не всю свою потужність.

 

Залежність nшвидкості ферментативної реакції від кількості ферменту

Якщо субстрат знаходиться в надлишку, що практично має місце в експериментальних nумовах, то швидкість реакції пропорційна кількості ферменту. Але, якщо nкількість ферменту збільшити настільки, щоб субстрат перестав бути в надлишку, nто така пропорційність порушиться, що показано на рис.

Як видно з рисунка, швидкість ферментативної nреакції лінійно зростає із збільшенням вмісту ферменту (прямий відрізок nкривої). Але надмірне зростання концентрації ферменту призводить nдо того, що субстрату стає менше, ніж ферменту і це проявляється зменшенням nнаростання швидкості реакції (на рисунку полога частина лінії).

Дія на ферменти nмодуляторів

Активність nферментів може змінюватись не тільки за зміною кількості субстрату, ферменту, nрН середовища, але і під впливом різних хімічних речовин. Речовини, що nвпливають на хід ферментативних реакцій, називаються їх модуляторами, або nефекторами. Вони поді­ляються на активатори та інгібітори, тобто під їх впливом nреакція може при­скорюватись або сповільнюватись. Вивчення дії модуляторів фер­ментів nмає практичне значення, бо дозволяє глибше зрозуміти природу дії ферментів. nДеякі з них відіграють роль природних регуляторів метаболізму. Існує багато nтипів модуляторів активності ферментів, що відрізняються між собою за будовою nта механізмом дії.

 

Активатори nферментів

Роль активаторів можуть відігравати як органічні (жовчні кислоти, ферменти nй ін.), так і неорганічні речовини (іони металів, аніони). Нерідко nзустрічаються випадки, коли одна і та ж речовина стосовно одного ферменту є nактиватором, а відносно іншого – інгібітором. Іони металів бувають досить специфічними nактиваторами для певних ферментів. Вони можуть сприяти приєднанню субстрату до nферменту, брати участь у формуванні третинної структури ферменту або бути nскладником активного центру. Іони багатьох металів (натрію, калію, кальцію, nмагнію, заліза, міді та ін.) є обов’язковими компонентами, що необхідні для nнормального функціонування багатьох ферментів. Іноді для деяких ферментів nпотрібно декілька різних іонів. Наприклад, для Nа⁺, К⁺-АТФази, nщо здійснює транспорт іонів через плазматичну мембрану, потрібні для nнормального функціонування іони калію, натрію та магнію.

Метали nможуть входити до складу простетичних груп ферментів. Наприклад, залізо в nскладі порфіринових сполук є необхідним компонентом ферментів цитохромної nсистеми, каталази і пероксидази; кобальт входить до простетичної групи nгомоцистеїнтрансметилази і метилмалонілізомерази ферментів; мідь – до nаскорбатоксидази; марганець є активатором ізоцитратдегідрогенази.

Металоферменти, nщо містять у своєму складі переважно дво- і тривалентні іони, утворюють із nзалишками функціональних груп амінокислот та відповідними іонами клешнеподібні nхелатні сполуки. У таких сполуках іони надають ферментам певної просторової nструктури і сприяють утворенню ферментосубстратних комплексів. Деякі ферменти nпри відсутності металів просто не проявляють ферментативної дії. Наприклад, nвугільна ангідраза без цинку не має властивостей ферменту і дію цинку не можна nзамінити жодним іншим іоном.

Аніони, nпорівняно з катіонами, рідше є активаторами ферментів. Прикладами активуючої дії nаніонів можуть бути аніони хлору відносно пепсину та амілази слини; аніони nгалогенів – аденілатциклази; жовчні кислоти – панкреатичної ліпази. Деякі nферменти проявляють активуючу дію стосовно своїх неактивних форм (автокаталіз). nНаприклад, пепсин відносно пепсиногену, трипсин – трипсиногену тощо. Деякі nферменти активують зовсім інші ферменти. Так, ентерокіназа шляхом відщеплення nінгібітора перетворює неактивний трипсиноген в активний трипсин, а останній nперетворює хімотрипсиноген у хімотрипсин. Активаторами можуть бути такі nорганічні сполуки, як цистеїн, відновлений глутатіон та інші, що мають вільну nSH-групу. Ці сполуки здатні відновлювати дисульфідні зв’язки неактивних nферментів до сульфгідрильних груп і цим самим перетворювати ферменти в активні. nТаким чином речовини з вільними SH-групами захищають ферменти від агресивних nхімічних впливів, наприклад від окиснення, і тому виступають активаторами nферментів.

Існує група ферментів, що активуються за допомогою циклічного АМФ.

Такі ферменти nназиваються протеїнкіназами. Механізм їх активації такий. Протеїнкіназа nскладається з двох субодиниць: ката­літичної, що містить активний центр, і nрегуляторної, в якій розміщений центр зв’язування циклічного АМФ. Фермент nнеактивний, бо його активний центр закритий. Він звільняється тільки при nвзаємодії ц‑АМФ і регуляторного центру ферменту.

Циклічний АМФ

Активація ряду ферментів залежить від nпроцесів фосфорилювання і дефосфорилювання. Так, фосфорилаза, що відщеплює від nглікогену одну молекулу глюкози, проявляє свою дію тільки у фосфорильованому nстані (фосфорилаза А), в нефосфорильованому стані (фосфорилаза В) вона nнеактивна. Аналогічно ліпаза жирової тканини активність свою nпроявляє значно інтенсивніше у фосфорильованому стані. Фосфорилювання цих nферментів здійснюється за рахунок АТФ при участі протеїнкіназ.

Дефосфорилювання nфосфорильованої ліпази здійснюється під впливом фосфопротеїнфосфатази.

Деякі ферменти проявляють каталітичну дію тільки в нефосфо­рильованому nстані, а фосфорилювання призводить до втрати їх активності. Прикладом може nслужити фермент глікогенсинтаза. Таким чином, за допомогою поєднаної дії nферментів протеїнкіназ і фосфатаз певні ферменти можуть переходити з nнеактивного стану в активний і навпаки, що має важливе значення в регуляції nметаболічних процесів. В основі активації ферментів, як було показано вище, nлежать різні механізми. Серед них можна назвати такі:

1 – активація за допомогою впливу на активний центр;

2 – активація шляхом відщеплення від ферменту частини пептидного ланцюга nабо якоїсь неорганічної сполуки, що закривала активний центр;

3 – активація шляхом приєднання до ферменту якоїсь модифікуючої сполуки;

4 – активація шляхом дисоціації неактивного комплексу ферменту на nсубодиниці, одна з яких проявляє властивості ферменту.

 

Інгібітори nферментів

Подібно nдо активаторів, інгібуючу дію на ферменти можуть проявляти різні за будовою і nза механізмом дії речовини. Вивчення різних інгібіторів відкриває великі nможливості для розуміння механізмів дії ферментів. Інгібітори (від лат. nінгібіціо – затримка, гальмування) – речовини, що, на відміну від активаторів, nпослаблюють або цілком призупиняють дію ферментів. Деякі інгібітори ферментів є nотрутами для живих організмів (наприклад, ціаніди, сірководень, монооксид nвуглецю). Ряд лікарських засобів також має виражені інгібуючі властивості щодо nпевних ферментних систем. Тому інгібітори широко застосовують в nекспериментальній медицині для з’ясування механізму дії лікарських середників.

http://www.youtube.com/watch?v=0pJOFze055Y

 

За механізмом дії інгібітори поділяються на дві групи:

1. Інгібітори, що вступають із ферментами у зворотну реакцію.

2. Інгібітори, що реагують із ферментами незворотно.

Незворотний nінгібітор утворює з ферментом міцну сполуку за рахунок ковалентних зв’язків. Ці nзв’язки виникають між різними функціональними групами, що поєднуються з nактивним центром ферменту. Такий комплекс не розпадається і не дисоціює на nвихідні речовини, наприклад, ціанідна кислота і її похідні, фосфороорганічні, nтіолові отрути та ін.

Деякі nнезворотні інгібітори руйнують структуру молекули ферменту, тому їх ще nназивають денатурантами. Вони є неспецифічними інгібіторами для всіх ферментів. nСюди відносяться солі важких металів (свинець, ртуть, срібло). Зворотні nінгібітори пригнічують реакцію, але не викликають значних змін у структурі nмолекули ферменту. Розрізняють три типи зворотного інгібування ферментів: nконкурентне, неконкурентне і безконкурентне.

Іони Ag²⁺ nблокують дію каталази

 

Конкурентне nінгібування

Конкурентні інгібітори здатні зворотно nзв’язуватись з активним центром ферменту і конкурувати із субстратом за nактивний центр. Такі інгібітори часто є структурними аналогами субстрату і тому nкомплементарні активному центрові ферменту.

 

http://www.youtube.com/watch?v=duN73LFWNlo&feature=related

 

Якщо активний центр ферменту зв’язується з інгібітором, то він не зможе nвступати в реакцію із субстратом. При наявності субстрату (S) й інгібітора (І) nодночасно відбуваються дві реакції:

                            Е + S Þ ЕS Þ Е + Р

                            Е + І Þ ЕІ

Та сполука, концентрація молекул якої більша, буде переважно спо­лучатися з nактивним центром і визначати напрямок реакції. Зняти гальмівний вплив nінгібітора можна надлишком субстрату, який витіснить інгібітор активних центрів nмолекул ферменту. Конкурентне інгібування називають ще ізостеричним. Воно nвикликається речовинами, які за своєю структурою близькі до субстратів. Прикладом конкурентного гальмування є пригнічення nмалонатом активності сукцинатдегідрогенази – ферменту, що окиснює сукцинат, nякий при цьому перетворюється у фумарат:

 

 

Якщо в середовище, де відбувається nокиснення сукцинату, внести малонову кислоту (інгібітор сукцинатдегідрогенази), nяка за структурою дуже подібна до сукцинату і відрізняється від неї тільки тим, nщо містить одну групу СН₂, то утвориться фермент-інгібіторний nкомплекс, який не здатний окиснюватись, тобто два атоми водню не відщеплюються. nУ результаті приєднання малонату до ферменту реакція окиснення сукцинату nзагальмовується. Отже, сукцинат і малонат, як близькі за структурою nречовини, конкурують за зв’язування з активним центром ферменту. Тому напрямок nреакції буде визначатися співвідношенням концентрацій субстрату й інгібітора. nІнакше кажучи, якщо в середовищі одночасно наявні субстрат та інгібітор, то у nвипадку переважання концентрації інгібітора реакція загальмується і, щоб nзупинити його гальмівну дію, потрібно внести надлишок субстрату. Останній за nзаконом діючих мас витіснить із комплексу інгібітор, і реакція відновиться. nТаку ж конкурентну дію на сукцинатдегідрогенезу проявляє і оксалоацетат, який nтакож близький за структурою до сукцинату.

На рисунку зображена nтрьохмірна структура протеази вирусу имунодефіциту людини (ВІЛ), завдання nкотрої – розчепити синтезуючий загальний білок ВІЛ на оокремі працездатні nбілки. Якщо цю протеазу інгібувати – блокується складання нових вірусних nчастинок.

Конкурентне nінгібування широко застосовується в медичній практиці для боротьби з nінфекціями, в сільському господарстві – для знищення шкідників, а також у nвійськовій справі.

Конкурентними інгібіторами (ізостеричними) можуть виступати про­міжні nпродукти обміну – метаболіти, накопичення яких регулює активність ферментів. nДія багатьох лікарських середників відбувається за принципом конкурентного nінгібування. Наприклад, сульфаніламіди, що широко застосовуються для лікування nінфекційних захворювань, структурно подібні до параамінобензойної кислоти n(ПАБК), яку бактерії використовують для синтезу фолієвої кислоти. Остання nвходить до складу ферментів, необхідних для їх росту. Сульфаніламіди витісняють nПАБК із комплексу з ферментом, що призводить до гальмування росту бактерій.

Конкурентну nдію проявляють також деякі аналоги вітамінів. На­приклад, дезоксипіридоксин – nаналог вітаміну В₅ або аміноптерин – аналог фолієвої кислоти. Ці nаналоги вітамінів називаються ще антивітамінами. Вони можуть утворювати так nзвані антикоферменти, що проявляють властивості конкурентних інгібіторів. nАнтикоферменти або їх попередники антивітаміни застосовуються в біохімічних nдослідженнях або в медичній практиці як ефективні лікувальні засоби. Наприклад, nаміноптерин використовують для лікування лейкозу і пухлинних захворювань; nізоніазид (аналог вітаміну В₅) – туберкульозу; кумарини, що є nантивітамінами нафтохінонів (вітаміни К), застосовують в лікуванні й в nпрофілактиці тромбозів.

 

Неконкурентне nінгібування

Неконкурентне інгібування викликається речовинами, які не мають структурної nспорідненості (подібності) із субстратом і зв’язуються з каталітичними групами nактивного центру та ділянками, що розташовані поза активним центром. Таке nприєднання інгібітора до ферменту змінює конфігурацію активного центру, що nпригнічує його взаємодію із субстратом. У цьому випадку утворюється потрійний nкомплекс: фермент-субстрат-інгібітор:

                                      Е+S+І Þ ESІ.

Цей nкомплекс не здатний перетворюватися в продукт, тому реакція зупиняється.

До неконкурентних інгібіторів nналежить багато різних речовин, наприклад солі важких металів (срібла, ртуті, nсвинцю, кадмію, міді), сполуки арсенію, фосфороорганічні речовини, алкілувальні nречовини, йодацетат, ціаніди, окис вуглецю, сірководень. Конкретні механізми nдії кожного з названих інгібіторів будуть різними. Так, в основі інгібуючої дії nсолей важких металів лежить здатність їх блокувати SH-групи каталітичного центру nферментів; ціаніди міцно з’єднуються з Fe³⁺ каталітичного центру гемінового nферменту цитохромоксидази, що завершує процес біологічного окиснення з nутворенням води. Таке інгібування виключає дихальний ланцюг і клітина гине. nЙодацетат як інгібітор взаємодіє із SH‑групами ферменту, утворюючи з ним ковалентну сполуку, nщо при­зводить до виключення ферменту. Окис вуглецю СО є інгібітором nпереважно тих ферментів, у складі яких є залізо або мідь. Високу інгібуючу nактивність проявляють так звані фосфороорганічні речовини. Серед них nзустрічаються такі, що застосовуються в практичній медицині, сільському nгосподарстві для боротьби із шкідниками, а деякі – як бойові отруйні речовини n(табун, зарин). Ці інгібітори утворюють із ферментами комплекси, які не мають nкаталітичної дії. Фосфороорганічні інгібітори гальмують дію протеаз (трипсину, nхімотрипсину), естераз, зокрема ацетилхолінестерази, що каталізує розпад nацетилхоліну. Як наслідок дії фосфороорганічних інгібіторів буде nнагромаджуватись ацетилхолін, що проявляється порушенням функції нервової nсистеми.

Конкурентні nта багато неконкурентних інгібіторів відносяться до так званих зворотних nчинників, оскільки вони утворюють із ферментами нестійкий комплекс, тобто nгальмують реакції без значних змін у структурі ферменту. Ті інгібітори, що nвступають у реакції з ферментами і утворюють із ними міцні сполуки за рахунок nковалентних зв’язків, викликають незворотне гальмування. Важливе місце серед nнеконкурентних зворотних інгібіторів посідають проміжні продукти метаболізму. nВони здатні зворотно зв’язуватися із специфічними ділянками на поверхні деяких nалостеричних ферментів і змінювати активність їх каталітичного центру.

 

Інгібування nпродуктами реакції

Продукт nреакції нерідко за своєю структурою подібний до суб­страту. Тому, nнагромаджуючись, такий продукт може поводити себе як конкурентний інгібітор nферменту. Цей процес може виконувати регуляторну функцію, бо нагромадження nнадлишку утвореного продукту призводить до гальмування його утворення. nНаприклад, глюкоза є конкурентним інгібітором ферменту глюкозо-6-фосфатази:

глюкозо-6-фосфат + НОН глюкоза + Н₃РО₄

                    фосфатаза

 

Інгібування nнадлишком субстрату

Наявність в інкубаційному середовищі надмірно високих кон­центрацій nсубстрату викликає гальмування реакції. За цих умов крива Міхаеліса проявляє тенденцію nдо зниження. Зрозуміти таке інгібування можна, припустивши, що молекули nсубстрату через взаємні перешкоди здатні займати неправильні положення в nактивному центрі ферменту, що перешкоджає нормальному перебігові реакції.

 

Генетичне nінгібування

Генетичне nінгібування здійснюється шляхом пригнічення утворення ферменту на генетичному nрівні. Генетичне гальмування настає тоді, коли зникає потреба в певному nферментові. Наприклад, у процесі еволюції в людини зникли ферменти, які nсинтезують речовини, що містяться в достатній кількості в продуктах харчування: nдеякі амінокислоти, вітаміни С, В₁, В₂  тощо.

 

ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ

Основними властивостями ферментів як nбіологічних каталізаторів є їх висока  nактивність, специфічність  дії, nтермолабільність, залежність від рН середовища, присутності активаторів та nінгібіторів. Перераховані властивості зумовлені білковою природою ферментів. nШвидкість реакції залежить від співвідношення концентрації ферменту і nсубстрату.

Вплив температури на активність nамілази слини. Однією з характерних властивостей ферментів є їх nтермолабільність, тобто чутливість до змін температури. Температура, при якій nспостерігається максимальна швидкість ферментативної реакції, називається nоптимальною. Для більшості ферментів її значення знаходиться в межах 35-40^{0 n}С. Із підвищенням температури білкова частина ферменту може nденатуруватися і він втрачає каталітичні властивості. При зниженні температури nактивність різко загальмовується.

Принцип методу. Про nзалежність активності амілази слини від температури чвідчить розщеплення nкрохмалю при наявності слини в різних температурних умовах. Ступінь розщеплення nкрохмалю виявляють йодокрохмальною реакцією або реакцією Фелінга.

 

Специфічність дії амілази слини nта сахарази дріжджів. Специфічністю називається здатність nферментів каталізувати певні хімічні реакції. Розрізняють абсолютну, відносну, nстереохімічну специфічність. Специфічність зумовлена білковою частиною nферментів, а також будовою їх активного центру. Тільки деякі чітко визначені nфункціональні групи ферментів можуть брати участь в утворенні nфермент-субстратних комплексів. Амілаза прискорює гідроліз тільки полісахаридів n(крохмалю, глікогену) і не діє на олігосахариди. Мальтаза гідролізує nрозщеплення мальтози, але не діє на сахарозу.

Принцип методу. Про nспецифічність амілази і сахарази свідчить їх вибіркова дія на субстрати. nПродукти гідролізу субстратів визначаються реакціями Тромера або Фелінга.

 

Вплив рН середовища на активність nамілази слини. Фермент проявляє максимальну активність при оптимальному nзначенні рН. Кожен фермент має своє оптимальне значення рН: пепсин – 1,5-2,5, nаргіназа – 9,5, амілаза – 6,8-7,0. Із зміною рН змінюється ступінь дисоціації nіоногенних груп, фермент змінює свою конфігурацію, в тому числі активного nцентру, що зумовлює зниження або втрату його каталітичних властивостей.

Принцип методу. Оптимальне nзначення рН для амілази слини можна встановити за розщепленням крохмалю при nрізних значеннях рН середовища. Ступінь гідролізу крохмалю оцінюється за nрезультатом реакції з йодом. При оптимальному значенні рН розщеплення крохмалю nвідбувається повністю (забарвлення з йодом відсутнє). По мірі віддалення від nоптимального значення рН в кислу  або nлужну сторону, розщеплення крохмалю відбувається частково, до стадії декстринів n(фіолетове або червоно-буре забарвлення), або крохмаль взагалі не розщеплюється n(синє забарвлення).

 

Вплив активаторів та інгібіторів nна активність амілази слини. Речовини, які підвищують активність nферментів, називаються активаторами, а ті, що пригнічують – інгібіторами. nПриклади активаторів деяких ферментів: для амілази – хлорид натрію, для ліпази n– жовчні кислоти, для пепсину – соляна кислота. Неактивні форми деяких nферментів називаються проферментами. В організмі має місце аутоактивація – nперетворення проферменту у фермент за допомогою того ж активного ферменту.

Наприклад, активний пепсин викликає аутокаталіз пепсиногену. Активатори nта  інгібітори (ефектори) можуть впливати nбезпосередньо на активний центр ферменту, а також можуть взаємодіяти з nалостеричними (регуляторними) центрами і тим самим змінювати каталітичну nактивність ферменту. Інгібіторами можуть бути солі важких металів, ціаніди, nфосфорорганічні сполуки, деякі продукти метаболізму, денатуруючі агенти та ін.

Принцип роботи. Активуючий вплив хлориду натрію та nінгібуючий вплив сірчанокислої міді на активність амілази визначають за nступенем розщеплення крохмалю, про що свідчать результати реакції з йодом.

Класифікація і номенклатура ферментів

 

Існує два типи назв nферментів: тривіальна (робоча) і систематична.

Робоча назва ферменту складається з назви субстрату, назви типу nкаталітичної реакції і закінчення аза. Наприклад:

лактат + дегідрогенізація – лактатдегідрогеназа. Це фермент окиснення n(дегідрогенізації) лактату.

За систематичною номенклатурою назва ферменту складається з назви nсубстрату, на який діє фермент, назви типу хімічної реакції і закінчення – nаза. За цією номенклатурою назва лактатдегідрогенази пишеться так:

лактат : НАД – nоксидоредуктаза (суб. І : суб. ІІ – тип хім. реакції)

Поряд із цим, зберігаються nтакож назви давно відомих ферментів (історична назва), наприклад пепсин, nхімотрипсин, каталаза тощо.

За офіційною nміжнародною класифікацією, ферменти діляться на 6 класів, залежно від типу nкаталізованих реакцій (табл.1, 2):

Таблиця 1 nКласифікація ферментів, залежно від типу каталізованих реакцій

 

1. Оксидоредуктази – ферменти, які nкаталізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази – nферменти, які каталізують міжмолекулярне перенесення різних хімічних груп.

3. Гідролази, nякі каталізують реакції гідролітичного розщеплення внутрішньомолекулярних nзв’язків.

4. Ліази, які nкаталізують реакції негідролітичного розщеплення з утворенням подвійних nзв’язків, і навпаки – приєднання груп у місцях подвійних зв’язків.

5. Ізомерази, nякі каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази n(синтетази) – ферменти, які каталізують з’єднання двох молекул із використанням nенергії фосфатного зв’язку. Джерелом енергії для таких реакцій служить АТФ або nінші нуклеозидтрифосфати.

 

Таблиця 2 Приклади ферментів згідно типу реакцій, яку nвони каталізують

 

Класи ферментів nділяться на підкласи, а вони – на підпідкласи.

Підклас уточнює nдію ферменту, вказуючи на природу субстрату. Ще більше конкретизує дію ферменту nпідпідклас, що вказує на природу субстрату чи акцептора, який бере участь у nреакції. Згідно з класифікацією, для кожного ферменту існує шифр, що містить 4 nкодові числа, які розділяють крапками. 1 цифра шифру означає клас, 2 – підклас, n3 – підпідклас, 4 – порядковий номер ферменту у підкласі.

Наприклад, nфермент цитохромоксидаза за міжнародною класифікацією має шифр 1.9.3.1, для nлактатдегідрогенази шифр представлений цифрами 1.1.1.27.

 

Оксидоредуктази

Оксидоредуктази – це ферменти, що каталізують окисно-відновні nпроцеси. Окисненням називається процес віднімання електронів від елемента. nЗворотний до окиснення процес називається відновленням.

Але, оскільки окиснення одних речовин супроводжується відновленням інших, nто всі ці перетворення об’єднуються під назвою окисно-відновних процесів. У nживих організмах окиснення відбувається за допомогою відняття атомів водню або nелектронів від субстратів (донаторів). Акцептором атомів водню або електронів nможуть бути різні речовини – нікотинамідні коферменти (НАД, НАДФ), флавінові nкоферменти (ФМН, ФАД), іони металів, кисень, дисульфідні сполуки та ін (рис. n1).

Рис. 1 Будова nкоферментних форм нікотинаміду та рибофлавіну

 

Оксидоредуктази nподіляються на 17 підкласів. Цим ферментам належить дуже важлива роль у життєдіяльності nорганізмів. Детальніше ми з ними познайомимось при вивченні тканинного дихання. nСубстратами оксидоредуктаз можуть бути спирти, кислоти, альдегіди, кетони, NH₂, nNH, SH-групи, гем і його похідні та інші. Назви цим ферментам даються за nпринципом: донатор: акцептор-окcидоредуктаза. Так, фермент, що окиснює лактат nдо пірувату, називається лактат: НАД-оксидоредуктазою.

За тривіальною (робочою) nноменклатурою, оксидоредуктази, що відщеплюють атоми водню або електрони від nсубстрату окиснення і передають їх на будь-який акцептор, крім кисню або nперекису водню, називаються дегідрогеназами.

 

 

Таблиця 3 Приклади ферментів классу оксидоредуктаз

 

 

Тому розглянута nвище лактат НАД-оксидоредуктаза за тривіальною номенклатурою називається лактат­дегідрогеназою. nОксидоредуктази, що використовують кисень як акцептор водню або електронів, називаються nоксидазами; а ті з них, що переносять атоми водню на перекис водню – nпероксидазами. Ті ферменти, яким властива більш відновна дія, називаються nредуктазами. Частина ферментів класу оксидоредуктаз сприяє прямому включенню nкисню в субстрат. Такі оксидази отримали назву оксигеназ, або гідроксилаз. nТаким чином, у живому світі окиснення може відбуватися шляхом включення в nсубстрат атомів кисню або відщеплення електронів чи атомів водню.

Оксидоредуктази – дуже великий клас, nщо нараховує приблизно 500 ферментів (табл.3). Наведемо декілька прикладів nоксидаз: цитохромоксидаза (рис. 2) окиснює цитохром С внаслідок перенесення nдвох електронів на кисень: 2 цит. с (Fe²⁺)+1/2 О₂ 2 nцит. с (Fe³⁺)+О₂^2-; каталаза (рис. 3) nрозкладає Н₂О₂ на Н₂О+1/2 О₂; nпероксидаза окиснює речовини (спирти, феноли), використовуючи перекис водню як nакцептор атомів.

Рис. 2 nПросторова будова цитохромоксидази

 

Рис. 3 nПросторова будова каталази

 

 

 

Трансферази

Трансферази каталізують реакції міжмолекулярного переносу хімічних nгруп і залишків від одного субстрату (донор) до іншого (акцептор). Назва цих nферментів за міжнародною класифікацією будується так: донатор:акцептор – nтранспортована група – трансфераза. Наприклад, фермент, який каталізує реакцію nперенесення фосфорної групи з АТФ на гексозу – гексокіназа, а повна – nАТФ:D-гексозо-6-фосфотрансфераза. Трансферази, залежно від виду переношуваних nгруп, діляться на 8 підкласів (табл.4). Ті, що переносять СН₃-групи, nназиваються метилтрансферазами; переносники NH₂-груп отримали назву nамінотрансфераз. Розрізняють ще трансферази, що переносять залишки nацилів –ацилтрансферази; залишки карбоксильних груп – карбокситрансферази. nЄ також трансферази, що переносять залишки альдегідів, кетонів тощо. Досить nпоширений підклас ферментів, що переносять залишки фосфорної кислоти на АДФ або nвід молекули АТФ на субстрат. Такі фосфотрансферази називають ще фосфокіназами.

За поширенням nтрансферази близькі до оксидоредуктаз. Вони беруть участь у реакціях nвзаємоперетворень різних речовин, знешкодженні природних та чужорідних сполук. nДеякі трансферази використовуються в діагностиці захворювань. Наприклад, АлАТ, nАсАТ – для діагностики гострих гепатитів та інфаркту міокарда; креатинкіназа – nдля виявлення уражень скелетних м’язів.

Таблиця 4 Приклади ферментів классу трансфераз

 

http://www.youtube.com/watch?v=6r5Ddlcq26s

 

Гідролази

Гідролази – це ферменти, що каталізують розрив nзв’язків у субстратах із приєднанням елементів молекули води. Гідролаз nнараховується до 460.

До гідролаз відносять травні ферменти (ліпази, протеази, глікозидази) та nбагато іншихи (табл.5).

Таблиця 5 Приклади ферментів классу гідролаз

 

 

Гідролази входять до складу лізосом та інших органоїдів, де сприяють nрозпаду біомакромолекул на прості речовини.

Ліази

Ліази каталізують відщеплення від субстрату nнегідролітичним шляхом якої-небудь групи з утворенням подвійного зв’язку або, nнавпаки, приєднання групи в місці подвійного зв’язку. Вони каталізують nрозрив зв’язків С-С, С-N, С-О, С-S. У зв’язку з цим, розрізняють такі підкласи:

– С ‑ nС – ліази. До них відносять декарбоксилази. Під впливом декарбоксилаз nвідбувається декарбоксилювання амінокислот та альфа-кетокислот;

– С – О – ліази nназиваються ще гідроліазами, а за тривіальною номенклатурою – дегідратазами n(гідратазами). Наприклад, карбангідраза (карбонатгідроліаза), яка розщеплює nвугільну кислоту на СО₂ і Н₂О, а також фумаратгідратаза, nпід впливом якої відбувається гідратація фумаро­вої кислоти з утворенням nяблучної;

– С – N – ліази n– це ферменти, які відщеплюють аміак або амідинові групи. Наприклад, nаргініносукцинат-ліаза розкладає аргінінбурштинову кислоту на фумарову й nаргінін, що має місце під час утворення сечовини;

– альдолази – це nферменти, що каталізують розрив гексозофосфатів на дві тріози. Наприклад, nфруктозо-1,6-дифосфат розщеплюється на дві тріози – гліцеральдегід-3-фосфат і nдіоксіацетонмонофосфат.

Ізомерази

Ізомерази каталізують різноманітні процеси ізомеризації. В їх nскладі є декілька підкласів (табл.6):

– рацемази, які каталізують перетворення L-амінокислот на D‑амінокислоти;

– епімерази, які каталізують взаємне перетворення цукрів, наприклад, nгалактози в глюкозу;

– мутази, які каталізують перенесення хімічних груп з однієї частини nмолекули в іншу.

Таблиця 6 Приклади ферментів классу ізомераз

 

 

 Кофактором тут часто виступає похідне nвітаміну В₁₂. Розрізняють ще цис-трансізомерази, nвнутрішньомолекулярні оксидоредуктази, внутрішньомолекулярні трансферази.

Лігази n(синтетази)

Лігази (рис. 4) каталізують процеси конденсації nдвох молекул за рахунок енергії АТФ (або ГТФ, УТФ). Ці ферменти призводять до nутворення нових зв’язків, звідки і походить назва цього класу ферментів (від nлат. лігаре – зв’язувати). Інша назва – синтетази, оскільки вони є nкаталізаторами біосинтетичних процесів.

 

Рис. 4 Синтез доцірних ланок на ДНК матриці за участю ДНК – лігаз n(синтетаз)

 

Іммобілізовані ферменти та їх застосування

 

Ферменти nвиявляють свою активність не тільки в мікропросторі клітини, але й поза організмом. nВони є виключно активними і специфічними каталізаторами, котрі мають недосяжну nдля хімічних каталізаторів активність і вибірковість і, крім того, прискорюють nбагато реакцій, для яких взагалі не відомі хімічні каталізатори. Тому практичне nвикористання ферментів відкриває величезні можливості для розробки багатьох nхімічних процесів, які йдуть у м’яких умовах з високим виходом цільових nпродуктів. Однак, по-перше, ферменти, ідеально пристосовані для роботи в живій nклітині і у разі вилучення зі свого оточення стають дуже нестійкими і не можуть nфункціонувати достатньо тривалий термін. По-друге, ферменти, як правило, є nгомогенними каталізаторами, що дуже незручно з технологічної точки зору, nоскільки такий каталізатор важко відокремити від продуктів реакції і nвикористати знову. По-третє, деякі хіміко-технологічні процеси бажано проводити nза підвищеної температури, наприклад, для того, щоб не допустити забруднення nпродуктів синтезу (особливо лікарських препаратів) мікрофлорою; проте з nпідвищенням температури стабільність ферментів катастрофічно знижується. Окрім nтого, дуже часто потрібні органічні речовини можна одержувати з високим виходом nлише в тому випадку, коли реакція йде виключно в середовищі органічного nрозчинника. Але в цих умовах звичайні ферменти також не здатні нормально nпрацювати і швидко втрачають каталітичну активність. З цього випливає, що nфермент, виділений із живої клітини, потребує значного вдосконалення.

За останні 15-20 років проблему вдалося nрозв’язати, і ферменти стали повноправними компонентами технологічних схем nвиробництва. Це було досягнуто шляхом розвитку методів іммобілізації ферментів, nтобто фіксації їх на якихось нерозчинних матеріалах, які запобігають руйнуванню nферментів, збільшують термін їхньої дії, перетворюють їх у гетерогенний nкаталізатор (наприклад, у вигляді зерен).

Під іммобілізацією розуміють таку nпроцедуру, внаслідок якої молекула ферменту тим чи іншим способом nприкріплюється до певних об’єктів (носіїв), нерозчинних у воді (нерухомий). Ці nоб’єкти разом із ферментом легко відокремлюються від розчину після завершення nреакції. Хімічне «пришивання» ферменту до носія закріплює конформацію ферменту, nщо й є причиною підвищення стійкості та зниження лабільності.

Іммобілізовані ферменти є начебто nмоделлю структурно організованих у клітині ферментів (мембрана – це та ж nнерозчинна основа для сполучення із ферментом).

Приблизно в 70-х рр. XX ст. на стику nпевних хімічних і біологічних дисциплін сформувався новий науково-інженерний nнапрямок: інженерна ензимологія (найважливіший розділ біотехнології), стрімкий nрозвиток якої зумовив створення нових типів гетерогенних біоорганічних nкаталізаторів – іммобілізованих ферментів.

Ферменти і ферментні системи традиційно nзастосовуються в найрізноманітніших галузях практичної діяльності: у харчовій, nфармацевтичній, текстильній, хутровій, шкіряній та інших галузях промисловості, nу медицині, сільському господарстві, органічному синтезі, хімічному аналізі. nОстанніми роками ферменти стали застосовувати для здійснення таких реакцій nорганічної хімії, як окислення, відновлення, метилювання, ацетилювання, nдезамінування, декарбоксилювання, дегідратація, конденсація для поділу і nвідокремлення ізомерів тощо. Вже зараз стало очевидним, що застосування nбіокаталізу в тонкому органічному синтезі відкриває шлях до безвідходних і nнизькотемпературних процесів, які протікають до того ж у неагресивних nсередовищах. Немає сумнівів, що впровадження біокаталітичних процесів у хімічну nтехнологію неминуче сприятиме економії сировини й енергії, зменшенню шкоди, nякої сучасна промисловість завдає навколишньому середовищу. Оволодіння тонкими nмеханізмами дії ферментів, без сумніву, надасть необмежені можливості одержання nу величезних кількостях і з великою швидкістю корисних речовин у лабораторних і nзаводських умовах майже зі 100 % виходом.

Таке широке застосування ферментів nсприяло налагодженню промислового їх одержання у великих кількостях. Сировиною nдля цього служать тканини різних рослин і тварин, але найчастіше – nмікроорганізми, які вирощують на селективних середовищах. Окрім того, nмікроорганізми швидко накопичують свою біомасу, тому для їх культивування nможуть бути використані дешеві поживні середовища. Наприклад, методами nселекції, мутагенезу та генної інженерії вдалося одержати штами різноманітних nвидів бактерій, що продукують ті чи інші ферменти в значних кількостях: іноді з nвиходом понад 50\% від загальної маси клітинного білка.

Таким чином, nіммобілізовані ферменти – це штучно одержаний комплекс ферменту з нерозчинним у nводі носієм. Однак, поняття «іммобілізація» необхідно розуміти ширше, тобто як nбудь-яке обмеження свободи руху білкової молекули ферменту в просторі. Окрім nзв’язування з нерозчинним носієм, цього можна також досягти, наприклад, шляхом nвнутрішньомолекулярної або міжмолекулярної «зшивки» білкових молекул ферменту nнизькомолекулярними біфункціональними реагентами або ж приєднанням ферменту до nрозчинного полімеру.

Іммобілізація здійснюється шляхом nфізичної адсорбції ферментів на нерозчинному матеріалі; включенням ферментів до nкомірок гелю, а також ковалентним зв’язуванням ферменту з нерозчинним nматеріалом або молекул ферменту між собою з утворенням нерозчинних nполіферментних комплексів. Як адсорбенти використовують скло, силікагель, nгідроксиапатити, целюлозу та її похідні, хітин, декстрани та ін. Для включення nферменту до комірок гелю використовують різноманітний гелеутворюючий матеріал, nнайчастіше поліак-риламідний гель. Як матеріал для ковалентного зв’язування nферментів застосовують поліпептиди, білки, похідні стиролу, поліакрила-мід, nнейлон, різні похідні целюлози, крохмаль, агар, агарозу, а також скло, nсилікагель тощо. При ковалентному зв’язуванні ферменти знаходяться на хімічному nповодку біля нерозчинного носія.

При іммобілізації ферментів nвикористовують ті ж самі принципи, що і при афінній хроматографії. Афінна хроматографія nґрунтується на біоспецифічній взаємодії біополімеру, що виділяється, або групи nполімерів із певною речовиною. Цей вид хроматографії застосовується до nферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків, які здатні вибірково за типом nкомплементарності зв’язуватися із субстратами, рецепторами, антигенами, nінгібіторами, кофакторами. Принцип цього методу хроматографії полягає в тому, nщо на нерозчинному носії закріплюють речовину, здатну специфічно зв’язуватися з nбілком, що виділяється, зокрема, ферментом. Цю речовину називають лігандом. nОброблений таким чином носій (адсорбент) розміщують у колонці і через неї nпропускають суміш білків. З адсорбентом зв’язується тільки той білок, який має nспорідненість зі специфічним лігандом. Потім білок знімають із колонки nрозчином, що викликає дисоціацію комплексу, який утворився між білком і nлігандом.

Під час одержання іммобілізованих nферментів вживають усіх запобіжних заходів для збереження активності ферменту. nІммобілізовані ферменти, як правило, менш активні, ніж вільні, оскільки nзв’язування з носієм послаблює індукційний ефект і контакт із субстратом (рис. n5, 6).

 

Рис. 5 Схема nметоду афінної хроматографії:

1 – носій n(матриця); 2 – «ніжка»; 3 – ліганд; 4 – білок (фермент)

Рис. 6 Різні способи іммобілізації ферментів: n«зшивка» білкового ланцюга (а); приєднання молекули ферменту до поверхні nінертного носія (б); включення в пористу матрицю (в)

 

У порівнянні з nнативними попередниками іммобілізовані ферменти мають ряд переваг у разі nїхнього використанні з прикладною метою. По-перше, іммобілізований фермент як nгетерогенний каталізатор можна легко вилучити з реакційного середовища, що дає nможливість:

– зупинити в nпотрібний момент реакцію;

– іще раз nвикористати каталізатор;

– одержати nпродукт, не забруднений ферментом, що є особливо важливим для харчового і nфармацевтичного виробництва. По-друге, використання гетерогенних каталізаторів nдозволяє здійснювати ферментативний процес безперервно, наприклад, у проточних nколонках, і регулювати швидкість реакції, яку каталізують, а також вихід nпродукту шляхом зміни швидкості потоку. По-третє, іммобілізація або модифікація nферменту сприяє цілеспрямованій зміні властивостей каталізаторів, у тому числі nйого специфічності, залежності каталітичної активності від рН, іонного складу та nінших параметрів середовища, і, що дуже важливо, його стабільності стосовно nрізного роду денатуруючих впливів.

По-четверте, nіммобілізація ферментів дає можливість регулювати їхню каталітичну активність nшляхом зміни властивостей носія під впливом деяких фізичних факторів (світло, nзвук та ін.). На цій основі створюються механіко-звукочутливі датчики, nпосилювачі слабких сигналів і безсрібляні фотографічні процеси.

Основні вимоги, nяким мають відповідати носії:

– висока хімічна nі біологічна стійкість;

– висока механічна nміцність;

– достатня nпроникність для ферменту і субстратів;

– висока nпористість;

– можливість nодержання у вигляді зручних у технологічному відношенні форм (гранул, мембран, nтруб, листів і т. ін.);

– легке nпереведення в реакційно-здатну форму (активація):

– висока nгідрофільність, яка забезпечує можливість проведення реакції зв’язування nферменту з носієм у водному середовищі;

– невисока nвартість.

Як носії для іммобілізації ферментів nбілки використовують під час фундаментальних біохімічних досліджень, а також з nпрактичною метою, особливо у медицині. Із точки зору практичного значення nважливими властивостями білкових носіїв є висока місткість відносно ферментів, nздатність до біодеградації, а також можливість застосування деяких із них n(завдяки фібрилярній природі), у вигляді тонкої (товщиною 80 мкм) плівки n(мембрана). Іммобілізацію на білкових носіях можна проводити і у відсутності, і nу присутності зшиваючих агентів. До недоліків білків як носіїв медичних nпрепаратів для використання їх in vivo слід віднести високу імуногенність n(виняток становлять колаген та фібрин). Найчастіше як носії використовуються nструктурні білки (кератин, фіброїн, колаген); рухові білки (міозин), а також nтранспортні білки, наприклад, сироватковий альбумін. Природні носії-ліпіди. Питання nщодо білок-ліпідних взаємодій давно привертають увагу дослідників, оскільки ivivo більшість ферментативних реакцій протікають поблизу або на поверхні nбіомембран – білок-ліпідних утворень. Тому іммобілізація ферментів на природних nліпідних носіях (конструювання ансамблів білок-ліпід) може розглядатися як nнайоптимальніше наближення до умов функціонування ферментних систем у живій nклітині.

Для такої іммобілізації, як правило, nвикористовуються природні ліпіди – компоненти біомембран (фосфатидилхолін, фосфатидил-етаноламіни, nхолестерин та ін.). Ліпідні носії застосовуються у вигляді моношарів на різних nповерхнях або бішарів (як правило, сферичної форми – ліпосоми). Зазвичай nліпідні носії використовуються у вигляді моношарів на твердих поверхнях, наприклад, nсілікагелі, аеросилі. Для приготування ліпосом найчастіше використовують nфосфатидилхолін (лецитин), кардіоліпіни, сфінгомієліни. Ліпосоми – це бульбашки nрозміром від 20-30 нм до 1-2 мкм, отримані з різних природних або синтетичних nфосфоліпідів. Розміщені усередині ліпосом ферменти захищені від швидкого nруйнування протеїназами організму, тому знаходяться в ньому відносно тривалий nчас, виявляючи свою відповідну дію.

Дуже перспективною є галузь утворення nбагатоферментних систем (за типом поліферментних систем в організмі), nзакріплених на одному й тому ж носії, у безпосередній близькості один від nодного. При цьому іммобілізуються два або декілька ферментів, які працюють nпослідовно, їх активні центри певним чином орієнтовані відносно один до одного. nТаким шляхом вдається значно збільшити ефективність їх роботи: проміжні nпродукти, які утворюються під дією одного ферменту в такій системі відразу ж nпотрапляють на інший фермент. Це є особливо важливим, коли проміжні продукти nнестійкі та легко руйнуються в навколишньому середовищі: у такій системі вони nне виходять назовні, а відразу ж перероблюються.

Можна навести низку прикладів, які nсвідчать про великі можливості інженерної ензимології в різних галузях промисловості, nмедицини, сільського господарства. Зокрема, іммобілізовану бета-галактозидазу n(фермент, який розщеплює лактозу до глюкози й галактози), приєднану до nмагнітного стрижня-мішалки, використовують для зменшення вмісту лактози в nмолоці, і таким чином вирішують проблему нестерпності до лактози в деяких nлюдей. Оброблене таким чином молоко в замороженому вигляді зберігається значно nдовше і не піддається загусненню. За допомогою ферментативної технології nотримують продукти харчування, зокрема вуглеводи (крохмаль та глюкозу) із nцелюлози та ін.

У медичній практиці застосовується nпрепарат «Дальцекс-трипсин», який являє собою лікарську форму трипсину, nіммобілізованого на диальдегідцелюлозі і має пролонговану протеолітичну дію, nзастосовують для очищення гнійних ран та поліпшення процесу їх регенерації. nІнший препарат трипсину – «Пакс-трипсин» є іммобілізованим трипсином на полотні nтрикотажного поліаміду; його використовують як матеріал для перев’язок. nФармпрепарат «Стрептодеказа», створений на основі іммобілізації препарату n«Стрептокіназа» (який має тромболітичну активність) на водорозчинній матриці nполісахаридної природи, здатний до тривалого існування в системі кровообігу, nзабезпечуючи пролонговану фібринолітичну дію в крові протягом 48-72 год. n«Стрептодеказа» з успіхом застосовується при тромбозах, інфаркті міокарда тощо, nмає перевагу перед стрептокіназою і фібринолізином, які швидко руйнуються після nвведення в організм. Після введення стрептодекази, якщо це зробити вчасно, nтромб майже безслідно зникає.

Моделювання за допомогою інженерної nензимології процесу фотосинтезу з використанням іммобілізованих ферментів, nкофакторів тощо має велике майбутнє. Нині здійснюються роботи з іммобілізації nне тільки ферментів, але і кофакторів, гормонів, інгібіторів та інших біологічно nактивних лікувально-профілактичних засобів з метою доставки їх в організм при nзахворюваннях, пов’язаних із їх недостатністю або відсутністю. Це усуває nдефіцит деяких ферментів в організмі; видаляє вже відмерлі денатуровані nструктури через дію, головним чином, протеолітичних ферментів (зокрема, nтрипсину та хімотрипсину); забезпечує лізіс тромбів, детоксикацію організму і nт.ін. Іммобілізовані ферменти почали використовуватися в спеціальних колонках nдля перфузії (очищення) крові типу «штучна нирка», «штучна печінка». Із nлікувальною та діагностичною метою використовують іммобілізовані ферменти та nінші речовини, введені в напівпроникні (наприклад, поліамідні) мікрокапсули nрозміром приблизно 200 ммк. У таких напівпроникних капсулах ферменти відносно nдовго зберігаються і чинять відповідну дію на певні органи, до яких капсула nзаноситься током крові, тобто певною мірою забезпечується ще й спрямовна nдоставка ферментів за місцем призначення. Іммобілізовані ферменти nзастосовуються для отримання амінокислот, гідроксикислот, а також природних nречовин із дуже складною структурою, наприклад, стероїдів, порфіринів, nалкалоїдів, простагландинів, антибіотиків тощо.

Амінокислоти використовують у медицині, nсільському господарстві, прикладній мікробіології і в багатьох галузях науки. nВони необхідні як компоненти харчування при недостатності якої-небудь із nприродних, особливо незамінних амінокислот, як складова частина nвнутрішньовенного харчування хворих, для створення лікарських і біологічно nактивних сполук і т. ін. Усі амінокислоти засвоюються організмом тільки в L-формі n(за винятком метіоніну), а надходження до організму L-форми є nнебажаним. Нижче подано схему безперервного потоку отримання L-амінокислоти nL-аланіну та регенерації коферменту в модельній системі, nкуди вихідний субстрат (молочна кислота) подається за допомогою насоса в nкамеру-реактор, який містить іммобілізовані на декстрані НАД+ та дві nНАД-залежні дегідрогенази: лактат- і аланіндегідроге-нази. Із протилежного nкінця реактора продукт реакції L-аланін nвидаляється із заданою швидкістю методом ультрафільтрації:

Подібні реактори знайшли застосування у nфармацевтичній промисловості, наприклад, під час синтезу глюкокортикоїдного nпрепарату преднізолону з гідрокортизону. Не менш важливим напрямком для nмедицини є іммобілізація клітин. Як приклад медичного використання досягнень nбіотехнології можна навести іммобілізацію клітин щитовидної залози для nвизначення тиреотропного гормону в біорідинах або тканинних екстрактах, nотриманих з організму; введення бета-клітин підшлункової залози в організм при nдіабеті та ін. За допомогою іммобілізованих ферментів здійснюється не тільки nпромисловий синтез ряду фармпрепаратів, але й розроблені високочутливі методи nаналізу ліків, експрес-аналіз біологічних компонентів (автомати для аналізу nкрові, сечі). Ферменти значно спрощують аналіз крові: якщо для біохімічного nаналізу необхідно взяти цілу пробірку крові, то створений останніми роками nімуноферментний метод аналізу на базі іммобілізації ферментів обмежується nвсього однією краплею крові і визначає вміст приблизно 50 речовин одразу. Нині nотримані деякі штучні каталізатори, які функціонують за принципом nферментативного каталізу. Вони отримали назву син-зимів. Окремі синзими дуже nефективні, але специфічності ферментів не мають.

Конституційні та nіндуковані ферменти

Ферменти, що постійно зустрічаються в тому чи іншому органі, називаються nконституційними. Вони знаходяться практично в усіх клітинах і органах та nзабезпечують у них синтез білків, нуклеїнових кислот, утворення біологічних nмембран та енергетичний обмін. Разом із тим, диференційовані клітини nвідрізняються між собою за функціями і набором різних ферментів. Наприклад, nклітини печінки містять ферменти, завдяки яким відбувається синтез сечовини; nклітини кори надниркових залоз мають ферменти, необхідні для синтезу стероїдних nгормонів, а в м’язових клітинах є багато креатинфосфокінази. Ферменти, які nнаявні тільки в одному чи двох органах, називаються органоспецифічними nферментами. Наприклад, уроканіназа наявна тільки в печінці, кисла фосфатаза – nпереважно в передміхуровій залозі, аргіназа – в печінці. Ці ферменти найчастіше nвикористовуються для діагностики захворювань.

Усередині nклітини ферменти також розміщуються нерівномірно. Одні з них перебувають у nколоїдно-розчинному стані в складі цитозолю, інші фіксовані в клітинних nорганелах.

За певних обставин у тварин, рослин і бактерій виявляють нові ферменти, nяких переважно немає або є дуже мало. Їх називають адаптивними, бо вони nвиникають внаслідок пристосування організму до певних умов, або індукованими n(від слова індукція – наведення, пуск, введення). Речовини, що викликають nутворення таких ферментів, називаються індукторами. Наприклад, при nсистематичному введенні в кров тварини сахарози тут з’являється фермент nсахараза, що роз­щеп­лює цей цукор на два мономери. У нормі в крові цього nферменту немає.

 

Регуляція ферментативних процесів

У кожній клітині nвідбуваються тисячі різних хімічних реакцій, кожна з яких каталізується nспецифічними ферментами. Як досягається їх гармонійна синхронізація?

Клітина продукує nенергію відповідно до потреб, виробляє стільки мономерів, скільки їх необхідно nдля біосинтезу білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, тобто в нормі в nклітинах і в усьому організмі немає нестачі чи надлишку (перевиробництва) nпродуктів реакцій. У регуляції ферментативних процесів мають значення кілька nмеханізмів:

1. Механізм саморегуляції ферментативних процесів, який базується на nнегативному або позитивному зворотному зв’язку. Механізм саморегуляції за nпринципом позитивного (+) зворотного зв’язку проявляється в автокаталітичних і nланцюгових реакціях. Сюди відносяться перетворення проферментів у активні форми nферментів. Так перетворюється пепсиноген у пепсин, трипсиноген – у трипсин тощо.

Зустрічаються nдва типи такого інгібування: стеричне (конкурентне) й алостеричне. У першому nвипадку продукт реакції (Р) подібний до субстрату (S) і може конкурувати з ним nза активний центр, внаслідок чого реакція сповільнюється. В організмі більш nпоширені реакції, продукти яких не є подібними за структурою до субстрату. Тут nР-інгібітор діє не на активний центр, а на його віддалену ділянку, що врешті nпризводить до деформації молекули ферменту, зокрема й активного центру. Як nнаслідок фермент втрачає здатність приєднувати субстрат і реакція інгібується. nЦе вже інгібування алостеричне. Більшість регуляторних механізмів грунтується nна принципах зворотного від’ємного зв’язку. Прикладом регульованих систем nможуть бути поліферментні системи, всі компоненти яких взаємозв’язані. Продукт nреакції (Р) може впливати на ферменти клітин опосередковано – через клітинне nядро, яке містить систему синтезу ферментів (нуклеїнові кислоти).

2. Механізм регуляції ферментативних процесів за допомогою клітинних nмембран, що регулюють надходження і видалення продуктів реакції. Цей вид nрегуляції пов’язаний із тим, що ферменти в клітині вмонтовані в мембрани або в nпевні місця клітини і переміщення речовин до місць їх знаходження регулюється: nчим більше надходить субстрату через мембрани, тим більше утворюється продукту. nТаким чином, регуляція метаболічних процесів здійснюється не тільки шляхом nзміни активності ферментів, але і розподілом субстратів, метаболітів у різних nділянках клітини.

3. Регуляція ферментативних процесів за допомогою аденілатів (АТФ, АДФ, nАМФ). Вона характерна для реакцій, пов’язаних з утворенням АТФ. Тобто, якщо АТФ nу клітині є багато, то відбувається інгібування ферментів, що прискорюють його nсинтез (фосфофруктокіназа, ізо­цитратдегідрогеназа, фумараза тощо). Коли nконцентрація АТФ в клітині низька, а отже, збільшена концентрація АДФ+АМФ, то nце активує всі названі вище ферменти.

4. Регуляція nшляхом модифікації ферменту. Одним із різновидів модифікації ферментів є їх nфосфорилювання-дефосфорилювання. В одних випадках фосфорилювання ферментів призводить nдо підвищення їх активності, в інших – навпаки. Наприклад, у клітинах жирової тканини є фермент ліпаза, яка може перебувати nу двох формах – фосфорильованій і нефосфорильованій. Але фосфорильована ліпаза nмає значно вищу активність. Ключові ферменти енергетичного обміну – nфосфорилаза і глікогенсинтетаза – також контролюються шляхом фосфорилювання і nдефосфорилювання. Це здійснюється специфічними ферментами – протеїнкіназою і nпротеїнфосфатазою, рівень активності яких регулюється гормонами.

5. Регуляція за допомогою аденілатциклазної системи (рис.7, 8). Важлива nроль тут належить аденілатциклазі та протеїнкіназі, що утворюють єдину nрегуляторну систему (каскад реакцій), необхідну для передачі фізіологічного nсигналу з позаклітинного середовища всередину клітини. При цьому виникає цАМФ, nякий активує протеїнкінази. Протеїнкінази фосфорилюють певні ферменти, що nпризводить до зміни їх активності.

 

Рис. 7 Аденилатциклазна система.

6. Гормональна регуляція ферментативних процесів має nважливе значення в життєдіяльності клітин і всього організму.

Рис.8 Гормональна регуляція внутрішньоклітинних nпроцесів через цАМФ-залежні протеїнкінази (за Маррі Р., Греннером Д., Мейєсом nП. та ін.)

 

Способи nвираження активності ферментів

 

У біологічних об’єктах nферменти знаходяться в дуже мізерних концентраціях, тому для оцінки nферментативних процесів визначають не вміст ферментів, що пов’язано з великими nтруднощами, а швидкість каталізованої реакції. Швидкість ферментативної реакції nзалежить як від активності, так і від кількості ферменту. Дослідження проводять nв умовах оптимальної температури (25 °С), рН середовища і повного nнасичення ферменту субстратом. Швидкість ферментативної реакції оцінюють за nкількістю розщепленого субстрату або за кількістю утвореного продукту реакції. nЗа міжнародну одиницю активності ферменту приймається та його кількість, що nперетворює один мікромоль субстрату (мкмоль) за одну хвилину в стандартних nумовах (МО=мкмоль/хв). Новою міжнародною одиницею активності ферменту є катал (кат.). nВін відповідає кількості ферменту, що перетворює 1 моль субстрату в продукт за n1 с (Кат=моль/с). Відношення міжнародної одиниці (МО) до каталу виражається nтаким чином: 1 кат=1 моль•с^-1=60 моль•хв^-1=60•10⁶ nмкмоль•хв^‑1=6•10⁷ МО; або МО=1 мкмоль•хв^-1=1/60 nмкмоль•с^-1=1/60 мккат=16,67 нкат. Активність ферментів nвиражають ще через питому і молекулярну активність. Питома активність ферменту nвиражається числом одиниць ферментативної активності, що припадає на 1 мг nбілка. Чим вища питома активність, тим чистіший виділений фермент. Кількість nмолекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за хвилину, nназивають сукупністю обертів, або молекулярною активністю ферменту. Наприклад, nодна молекула каталази еритроцитів здатна розщепити за 1 хв 5•10⁶ nмолекул перекису водню (рис. 9).

 

Рис. 9 nШумування каталази при розкладанні перекису водню

 

МЕТОДИ ЯКІСНОГО ВИЯВЛЕННЯ ФЕРМЕНТІВ

 

У nтканинах і біологічних рідинах організму ферменти містяться в дуже малих nкількостях, що ускладнює їх пряме визначення. Для виявлення ферментів, як nправило, застосовують непрямі методи. На наявність ферменту вказує його дія на субстрат, nпоказником якої є зменшення або вичерпання субстрату в результаті його nперетворення (розщеплення, окиснення), або поява продуктів реакції.

 

Виявлення каталази в крові

 

Фермент nкаталаза відноситься до класу оксидоредуктаз. Міститься вона у всіх тканинах і nрідинах організму, але найбільше в стромі еритроцитів і печінці. В процесі nокиснення деяких речовин утворюється пероксид водню, який токсичний для nорганізму. Каталаза (Н₂О₂:Н₂О₂-оксидоредуктаза) nрозкладає пероксид водню з утворенням води та молекулярного кисню:

                каталаза

2 Н₂О₂—————–  2 Н₂О + О₂

 

Принцип методу

При nвзаємодії каталази крові з пероксидом водню в пробірці виділяються бульбашки nкисню, що свідчить про наявність ферменту в досліджуваній рідині.

 

ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ КАТАЛАЗИ КРОВІ

 

Каталаза n(Н₂О₂:Н₂О₂-оксидоредуктаза) nрозщеплює пероксид водню з утворенням молекулярного кисню і води:

             каталаза

2Н₂О₂ n————— О₂ + 2Н₂О

 

Простетична nгрупа каталази побудована за типом гему гемогло-біну. Цей фермент міститься у nвсіх тканинах організму, але найбільш активний він в еритроцитах і печінці. nБіологічна роль каталази полягає в знешкодженні пероксиду водню, який nутворюється в процесі окисно-відновних реакцій в організмі. Активність каталази nвиражають каталазним числом і показником каталази. Каталазним числом nназивається кількість міліграмів пероксиду водню, яка розкладається каталазою в n1 мкл крові за 30 хв. У нормі воно дорівнює 10-15. nПоказником каталази називають дріб, в якому чисельником є  каталазне число, а знаменником – число nмільйонів еритроцитів в 1 мкл nдосліджуваної крові.

 

Визначення каталазного числа

 

Принцип методу

Активність nкаталази крові визначають за кількістю розкладеного пероксиду водню за одиницю nчасу. Кількість пероксиду водню визначається титрометричним методом згідно з nреакцією:

 

2 КМnО₄+5Н₂О₂+4Н₂SО₄——-2КНSО₄ n+ 2МnО₄ +8Н₂О + 5О₂

Різниця nкількості КМnО₄, використана на титрування до і після дії каталази, характеризує nактивність ферменту. Більш об’єктивною одиницею є показник каталази, а не nкаталазне число, так як фермент знаходиться майже виключно в еритроцитах.

 

Клініко-діагностичне значення

 

Активність nкаталази знижується при анемії, туберкульозі, ракових захворюваннях; nпідвищується за умов токсичного гепатиту, дії іонізуючого випромінювання, солей nважких металів.

 

Виявлення пероксидази в крові

 

До nпероксидаз відносяться ферменти, які каталізують окиснення субстратів у nприсутності пероксиду водню (субстрат: Н₂О₂-оксидоредуктаза).

           Н           Н₂О₂

Суб. n—————— суб. окиснений + 2Н₂О

         Н     nпероксидаза

 

У nреакціях виявлення пероксидаз застосовують такі речовини, які змінюють при nокисненні своє забарвлення (феноли, поліфеноли, бензидин). Пероксидаза nзнаходиться головним чином, у рослинах. У тварин вона виявлена в еритроцитах, у nмолоці.

Принцип методу

Наявність nпероксидази в крові виявляється реакцією окиснення бензидину в присутності nпероксиду водню. Продукти окиснення бензидину забарвлюються в зелений, синій nколір, який поступово переходить у бурий.

ВІДНОВЛЕННЯ ЦИТОХРОМУ С

 

Цитохроми – це окисно-відновні nферменти, які беруть участь у транспортуванні електронів у процесах клітинного nдихання. Вони відносяться до залізопорфіринових ферментів, простетична група nяких містить різні похідні гему. Атом заліза в гемі може міняти валентність, nприєднуючи або віддаючи електрон:

 

        +е відновлення

Fе³⁺ ============ Fе²⁺

        -е окиснення

 

В мітохондріях клітин локалізовані nцитохроми  в, с₁, с, а, а₃.

Принцип методу грунтується на реакції nвідновлення цитохрому с за допомогою водню, що виділяється в реакції між nметалічним цинком та хлоридною кислотою. Після відновлення червоний колір nцитохрому с блідне.

 

Використання ферментів у медицині

 

В останні роки nферменти набули широкого застосування в практичній і експериментальній nмедицині. Розрізняють три напрямки використання ферментів у медицині: nензимопатологія, ензимодіагностика й ензимотерапія.