Амінокислоти, пептиди, білки
Білки – необхідні компоненти всіх живих організмів, вони беруть участь в більшості життєвих процесів клітини. Серед різних органічних сполук у живих організмів білкам належить провідна роль. Ці сполуки переважають у клітинах і кількісно. Так, у клітинах тварин вони становлять до 40-50% сухої речовини, а рослин — до 20-35%. До складу молекул білків входять атоми Карбону, Оксигену, Нітрогену, Гідрогену, Сульфуру, а також Фосфору, Феруму та ін.
Що собою являють білки? Білки — це високомолекулярні біополімери, мономерами яких є залишки амінокислот. Нескінченна різноманітність білкових молекул забезпечується різними комбінаціями залишків лише 20 амінокислот. Кожен білок характеризується постійним складом амінокислотних залишків та їхньою певною послідовністю.
Білки були виділені в окремий клас біологічних молекул в XVIII столітті в результаті робіт французького хіміка Антуана Фуркруа та інших вчених, в яких було зазначено властивість білків коагулювати ( денатурувати) під впливом нагрівання або кислот. У той час були досліджені такі білки, як альбумін (“яєчний білок”), фібрин (білок з крові) і глютен із зерна пшениці. Голландський хімік Герріт Мульдер провів аналіз складу білків і висунув гіпотезу, що практично всі білки мають подібну емпіричну формулу. Термін “протеїн” для позначення подібних молекул був запропонований в 1838 шведським хіміком Якобом Берцеліусом. Мульдер також визначив продукти руйнування білків – амінокислоти і для однієї з них ( лейцину) з малою часткою похибки визначив молекулярну масу – 131 дальтон. У 1836 Мульдер запропонував першу модель хімічної будови білків. Грунтуючись на теорії радикалів, він сформулював поняття про мінімальну структурної одиниці складу білка, C 16 H 24 N 4 O 5, яка була названа “протеїн”, а теорія – “теорією протеїну”. У міру накопичення нових даних про білки теорія стала неодноразово піддаватися критиці, але до кінця 1850-х незважаючи на критику ще вважалася загальновизнаною.
До кінця XIX століття було досліджено більшість амінокислот, які входять до складу білків. У 1894 році німецький фізіолог Альбрехт Коссель висунув теорію, згідно з якою саме амінокислоти є основними структурними елементами білків. На початку XX століття німецький хімік Еміль Фішер експериментально довів, що білки складаються з амінокислотних залишків, з’єднаних пептидними зв’язками. Він же здійснив перший аналіз амінокислотної послідовності білка і пояснив явище протеолізу.
Проте центральна роль білків в організмах не була визнана до 1926, коли американський хімік Джеймс Самнер (згодом – лауреат Нобелівської премії) показав, що фермент уреаза є білком.
Складність виділення чистих білків ускладнювала їх вивчення. Тому перші дослідження проводилися з використанням тих поліпептидів, які могли бути очищені у великій кількості, тобто білків крові, курячих яєць, різних токсинів, а також травних / метаболічних ферментів, що виділяються після забою худоби. В кінці 1950-х років компанія Armour Hot Dog Co. Змогла очистити кілограм бичачої панкреатичної рибонуклеази А, яка стала експериментальним об’єктом для багатьох учених.
Ідея про те, що вторинна структура білків – результат освіти водневих зв’язків між амінокислотами, була висловлена Вільямом Астбері в 1933, але Лайнус Полінг вважається першим ученим, який зміг успішно передбачити вторинну структуру білків. Пізніше Уолтер Каузман, спираючись на роботи Кая Ліндерстрем-Ланга, вніс вагомий внесок у розуміння законів утворення третинної структури білків і ролі в цьому процесі гідрофобних взаємодій. В 1949 Фред Сенгер визначив амінокислотну послідовність інсуліну, продемонструвавши таким способом, що білки – це лінійні полімери амінокислот, а не їх розгалужені (як у деяких цукрів) ланцюга, колоїди або ціклоли. Перші структури білків, засновані на дифракції рентгенівських променів на рівні окремих атомів, були отримані в 1960-х роках і за допомогою ЯМР в 1980-х роках. В 2006 Банк даних про білки ( Protein Data Bank) містив близько 40 000 структур білків.
У XXI столітті дослідження білків перейшло на якісно новий рівень, коли досліджуються не тільки індивідуальні очищені білки, а й одночасна зміна кількості та посттрансляційних модифікацій великого числа білків окремих клітин, тканин або організмів. Ця область біохімії називається протеомікою. За допомогою методів біоінформатики стало можливо не тільки обробити дані рентгеном-структурного аналізу, але і передбачити структуру білка, грунтуючись на його амінокислотної послідовності. В даний час кріо електронна мікроскопія великих білкових комплексів і передбачення малих білків і доменів великих білків з допомогою комп’ютерних програм за точністю наближаються до вирішення структур на атомному рівні.
вини.
Функції білків в організмі
Каталітична функція
Найбільш добре відома роль білків в організмі – каталіз різних хімічних реакцій. Ферменти – група білків, що володіє специфічними каталітичними властивостями, тобто кожен фермент каталізує одну або декількасхожих реакцій. Ферменти каталізують реакції розщеплювання складних молекул (катаболізм) та їх синтезу (анаболізм), а також реплікації і репарації ДНК і матричного синтезу РНК. Відомо кілька тисяч ферментів, серед них такі, як, наприклад пепсин, розщеплюють білки впроцесі травлення. У процес посттрансляційної модифікації деякі ферменти додають або видаляють хімічні групи на інших білках. Відомо близько 4000 реакцій, що каталізуються білками. Прискорення реакції в результаті ферментативного каталізу іноді величезна:наприклад, реакція, що каталізується ферментом оротат-карбоксілази протікає в 1017 швидше некаталізіруемой (78000000 років без ферменту, 18 мілісекунд за участю ферменту).
Молекули, які приєднуються до ферменту і змінюються в результаті реакції,називаються субстратами. Хоча ферменти зазвичай складаються з сотень амінокислот, тільки невелика частина з них взаємодіє з субстратом, і ще менша кількість – в середньому 3-4 амінокислоти, часто розташовані далеко один від одного в первинної амінокислотноїпослідовності – безпосередньо беруть участь в каталізі. Частина ферменту, яка приєднує субстрат і містить каталітичні амінокислоти, називається активним центром ферменту.
Структурна функція
Структурні білки цитоскелета, як свого роду арматура, надають форму клітин і багатьом органоидам і беруть участь у зміні форми клітин. Більшість структурних білків є филаментозноми білками: наприклад, мономери актину і тубуліну – це глобулярні, розчинні білки, але після полімеризації вони формують довгі нитки, з яких складається цитоскелет, що дозволяє клітині підтримувати форму. Колаген і еластин – основні компоненти міжклітинної речовини сполучної тканини (наприклад, хряща), а з іншого структурного білка кератину складаютьсяволосся, нігті, пір’я птахів і деякі раковини. Дуже велика кількість білків (більше 15 г): сир голландський і плавлений, сир нежирний, м’ясо тварин і курей I і II категорій, більшість риб, соя, горох, квасоля, горіхи фундук і волоські.
Великий вміст білків(10-15 г): сир жирний, свинина м’ясна і жирна, ковбаси варені, сосиски, яйця, крупи манна, гречана, вівсяна, пшоно, борошно пшеничне, макарони. Помірне вміст білків (5-99 г): хліб житній і пшеничний, крупа перлова, рис, горошок зелений. Мале вміст білків (2-49 г):молоко, кефір, вершки, сметана, морозиво вершкове, шпинат, капуста цвітна, картопля. Дуже малий вміст білків (04-19 г): масло вершкове, майже всі овочі, фрукти, ягоди та гриби. Рослинні білки менш повноцінні (недостатньо збалансований амінокислотний склад) і важко перетравлюються.
Захисна функція
Існують декілька видів захисних функцій білків:
1. Фізичний захист. У ній бере участь колаген – білок, який утворює основу міжклітинної речовини сполучнихтканин (у тому числі кісток, хряща, сухожиль і глибоких шарів шкіри) дерми); кератин, що становить основу рогових щитків, волосся, пір’я, рогів та ін похідних епідермісу. Зазвичай такі білки розглядають як білки зі структурною функцією. Прикладами цієї групи білків служать фібриноген і тромбін, що беруть участь у процесах згортання крові.
2. Хімічний захист. Зв’язування токсинів білковими молекулами може забезпечувати їх детоксикацію. Особливо важливу роль в детоксикації у людини відіграють ферменти печінки, що розщеплюють отрути абопереводять їх у розчинну форму, що сприяє їх швидкому виведенню з організму.
3. Імунний захист. Білки, що входять до складу крові та інших біологічних рідин, беруть участь в захисному відповіді організму як на пошкодження, так і на атаку патогенів.Білки системи комплементу і антитіла (імуноглобуліни) відносяться до білків другої групи, вони нейтралізують бактерії, віруси або чужорідні білки. Антитіла, що входять до складу адаптатівной імунної системи, приєднуються до чужорідних для даного організму речовин,антигенів, і тим самим нейтралізують їх, спрямовуючи до місць знищення. Антитіла можуть секретироваться в міжклітинний простір або закріплюватися в мембранах спеціалізованих В-лімфоцитів, які називаються плазмоцитами. У той час як ферменти маютьобмежене спорідненість до субстрату, оскільки занадто сильне приєднання до субстрату може заважати протіканню катализируемой реакції, стійкість приєднання антитіл до антигену нічим не обмежена.
Регуляторна функція
Багато процесів всередині клітин регулюються білковими молекулами, які не служать ні джерелом енергії, ні будівельним матеріалом для клітини. Ці білки регулюють транскрипцію, трансляцію, сплайсинг, а також активність інших білків. Регуляторну функцію білки здійснюють або за рахунок ферментативної активності (наприклад, протеїнкінази), або за рахунок специфічного зв’язування з іншими молекулами, як правило, впливає на взаємодію з цими молекулами ферментів. Так, транскрипція генів визначаєтьсяприєднанням факторів транскрипції – білків-активаторів і білків-репрессоров до регуляторних послідовностей генів. На рівні трансляції зчитування багатьох мРНК також регулюється приєднанням білкових чинників, а деградація РНК і білків також проводитьсяспеціалізованими білковими комплексами. Найважливішу роль в регуляції внутрішньоклітинних процесів грають протеїнкінази – ферменти, які активують або пригнічують активність інших білків шляхом приєднання до них фосфатних груп.
Сигнальнафункція
Сигнальна функція білків – здатність білків служити сигнальними речовинами, передаючи сигнали між тканинами, клітинами або організмами. Часто сигнальну функцію об’єднують з регуляторної, так як багато внутрішньоклітинні регуляторні білкитеж здійснюють передачу сигналів. Сигнальну функцію виконують білки-гормони, цитокіни, фактори росту та ін Гормони переносяться кров’ю. Більшість гормонів тварин – це білки або пептиди.
Зв’язування гормону з рецептором є сигналом, що запускаєв клітці відповідну реакцію. Гормони регулюють концентрації речовин в крові і клітинах, зростання, розмноження та інші процеси. Прикладом таких білків служить інсулін, який регулює концентрацію глюкози в крові Клітини взаємодіють один з одним за допомогою сигнальнихбілків, які передаються через міжклітинний речовина. До таких білків належать, наприклад, цитокіни та фактори росту. Цитокіни – невеликі пептидні інформаційні молекули. Вони регулюють взаємодії між клітинами, визначають їх виживання, стимулюють або пригнічуютьзростання, диференціювання, функціональну активність і апоптоз, забезпечують узгодженість дій імунної, ендокринної та нервової систем. Прикладом цитокінів може служити фактор некрозу пухлин, який передає сигнали запалення між клітинами організму.
Транспортна функція
Розчинні білки, що беруть участь в транспорті малих молекул, повинні мати високу спорідненість (афінність) до субстрату, коли він присутній у високій концентрації, і легко його вивільняти в місцях низької концентраціїсубстрату. Прикладом транспортних білків можна назвати гемоглобін, який переносить кисень з легень до решти тканин і вуглекислий газ від тканин до легень, а також гомологічні йому білки, знайдені у всіх царствах живих організмів. Деякі мембранні білкиберуть участь в транспорті малих молекул через мембрану клітини, змінюючи її проникність. Ліпідний компонент мембрани водонепроникний (гідрофобний), що запобігає дифузію полярних або заряджених (іони) молекул.
Мембранні транспортні білки прийнятоподіляти на білки-канали і білки-переносники. Білки-канали містять внутрішні, заповнені водою пори, які дозволяють іонів (через іонні канали) або молекулам води (через білки-аквапоринів) переміщатися через мембрану. Багато іонні канали спеціалізуються натранспорті тільки одного іона; так, калієві і натрієві канали часто розрізняють ці подібні іони і пропускають тільки один з них. Білки-переносники зв’язують, подібно ферментам, кожну стерпну молекулу або іон і, на відміну від каналів, можуть здійснювати активнийтранспорт з використанням енергії АТФ. Електростанція клітини – АТФ-синтаза, яка здійснює синтез АТФ за рахунок протонного градієнта, також може бути віднесена до мембранним транспортним білкам.
Запасна (резервна) функція білків
До таких білків належать так звані резервні білки, які запасаються в якості джерела енергії і речовини в насінні рослин і яйцеклітинах тварин; білки третинних оболонок яйця (овальбуміни) і основний білок молока (казеїн) також виконують, головним чином, живильну функцію. Ряд інших білків використовується в організмі як джерело амінокислот, які в свою чергу є попередниками біологічно активних речовин, що регулюють процеси метаболізму.
Рецепторна функція
Білкові рецептори можуть як знаходитися в цитоплазмі, так і вбудовуватися в клітинну мембрану. Одна частина молекули рецептора сприймає сигнал, яким найчастіше служить хімічна речовина, а в деяких випадках – світло, механічний вплив (наприклад, розтягнення) та інші стимули. При впливі сигналу на певну ділянку молекули білок-рецептор відбуваються її конформаційні зміни. В результаті змінюється конформація іншій частині молекули, що здійснює передачу сигналу на інші клітинні компоненти. Існує кілька механізмів передачі сигналу. Деякі рецептори каталізують певну хімічну реакцію, інші служать іонними каналами, які при дії сигналу відкриваються або закриваються, треті специфічно пов’язують внутрішньоклітинні молекули-посередники. У мембранних рецепторів частина молекули, що зв’язуються з сигнальної молекулою, знаходиться на поверхні клітини, а домен, що передає сигнал, всередині.
Моторна (рухова) функція
Цілий клас моторних білків забезпечує руху організму (наприклад, скорочення м’язів, у тому числі локомоції (міозин), переміщення клітин всередині організму (наприклад, амебоідное рух лейкоцитів), рух війок і джгутиків, а також активний і спрямований внутрішньоклітинний транспорт (кінезін, дінеін) . Дінеіни і кінезіни проводять транспортування молекул уздовж мікротрубочок з використанням гідролізу АТФ як джерело енергії. Дінеіни переносять молекули та органели з периферичних частин клітини у напрямку до центросоми, кінезіни в протилежному напрямку. Дінеіни також відповідають за рух війок і джгутиків еукаріотів.
. Класифікація.білків
Білки (протеїни, поліпептиди) – Високомолекулярні органічні речовини, що складаються із сполучених в ланцюжок пептидним зв’язком альфа-амінокислот. В живих організмах амінокислотний склад білків визначається генетичним кодом, при синтезі в більшості випадків використовується 20 стандартних амінокислот. Безліч їх комбінацій дають велику різноманітність властивостей молекул білків. Крім того,амінокислоти у складі білка часто піддаються посттрансляційних модифікаціям, які можуть виникати і до того, як білок починає виконувати свою функцію, і під час його роботи в клітині. Часто в живих організмах кілька молекул білків утворюють складні комплекси, наприклад, фотосинтетичний комплекс.
Розмір білка може вимірюватися кількістю амінокислот або в дальтонах (молекулярна маса), частіше через відносно велику величину молекули в похідних одиницях – кілодальтонах (кДа). Білки дріжджів, в середньому, складаються з 466 амінокислот і мають молекулярну масу 53 кДа. Найбільший з відомих в даний час білків – актин – є компонентом саркомеров м’язів; молекулярна маса його різних ізоформ варіює в інтервалі від 3000 до 3700 кДа, він складається з 138 амінокислот.
Порівняльний розмір білків. Зліва направо: антитіло (IgG), гемоглобін, інсулін ( гормон), аденілаткіназа ( фермент) і глютамінсінтетаза (фермент)
Білки є амфотерними поліелектролітами (поліамфолітамі), при цьому групами, здатними до іонізації в розчині, є карбоксильні залишки бічних ланцюгів кислих амінокислот (аспарагінова і глутамінова кислоти) і азотовмісні групи бічних ланцюгів основних амінокислот (в першу чергу, α-аміногруппа лізину і амідиновий залишок CNH (NH2) аргініну, дещо меншою мірою – імідазольний залишок гістидину). Білки як поліамфоліти характеризуються ізоелектричноїточкою (pI) – кислотністю середовища рН, при якій молекули даного білка не несуть електричного заряду і, відповідно, не переміщаються в електричному полі (наприклад, при електрофорезі). Величина pI визначається кількістю кислотних і основних амінокислотних залишків в білку: збільшення кількості залишків основних амінокислот в даному білку веде до збільшення pI; збільшення кількості залишків кислих амінокислот призводить до зниження значення pI. Значення ізоелектричної точки є характерною константою білків. Білки з pI менше 7 називаються кислотними, а білки з pI більше 7 – основними. В цілому, pI білка залежить від виконуваної ним функції: ізоелектрична точка більшості білків тканин хребетних лежить в межах від 5,5 до 7,0. Однак у деяких випадках значення лежать в екстремальних областях: так, наприклад, для пепсину – протеолітичного ферменту сильнокислого шлункового соку pI ~ 1, а для сальміна – білка-протаміну молока лосося, особливістю якого є надзвичайно високий вміст аргініну, pI ~ 12. Білки, що зв’язуються з нуклеїновими кислотами за рахунок електростатичного взаємодії з фосфатними залишками нуклеїнових кислот, часто є основними білками. Прикладом таких білків служать гістони і протаміни. Білки відрізняються за ступенем розчинності у воді, але більшість білків в ній розчиняються. До нерозчинних відносяться, наприклад, кератин (білок, з якого складаються волосся, шерсть ссавців, пір’я птахів і т. п.) і фіброїн, який входить до складу шовку і павутини. Білки також діляться на гідрофільні і гідрофобні. До гідрофільних відносяться більшість білків цитоплазми, ядра і міжклітинної речовини, в тому числі нерозчинні кератин і фібрин. До гідрофобних відносяться більшість білків, що входять до складу біологічних мембран, які взаємодіють з гідрофобними ліпідами мембрани (у цих білків зазвичай є і невеликі гідрофільні ділянки).
Гомологічні білки(імовірно мають загальне еволюційне походження і нерідко виконують одну й ту ж функцію), наприклад, гемоглобіни різних організмів, мають у багатьох місцях ланцюга ідентичні, консервативні залишки амінокислот. В інших місцях знаходяться різні амінокислотні залишки, звані варіабельними. За ступенем гомології (подібності амінокислотної послідовності) можлива оцінка еволюційного відстані між таксонами, до яких належать порівнювані організми.
За складом білки поділяють на прості, що складаються тільки з амінокислотних залишків (протеїни), і складні (протеіди). Складні можуть включати іони металу (металопротеїни) або пігмент (хромопротеїни), утворювати міцні комплекси з ліпідами (ліпопротеїни), нуклеїновими кислотами (нуклеопротеїни), а також ковалентно пов‘язувати залишок фосфорної кислоти (фосфопротеїни), вуглеводу (глікопротеїни) або нуклеїнової кислоти (геноми деяких вірусів). По ряду характерних властивостей протеїни можна розділити на кілька підгруп:
Альбуміни. Вони розчинні у воді, згортаються при нагріванні, нейтральні, порівняно важко осаджуються розчинами солей. Прикладами їх можуть служити: альбумін білка курячого яйця, альбумін кров’яний сироватки, альбумін м’язової тканини, молочний альбумін.
Глобуліни. Вони нерозчинні у воді, але розчиняються в дуже слабких розчинах солей. Більш концентрованими розчинами солей вони знову осаджуються; осадження відбувається при меншій концентрації, ніж та, яка необхідна для осадження альбумінів. Ці білки є дуже слабкими кислотами. Прикладами глобулінів можуть служити: фібриноген, глобулін кров’яний сироватки, глобулін м’язової тканини, глобулін білка курячого яйця.
Гістони. Білки основного характеру. Знаходяться у вигляді нуклеопротеїнів в лейкоцитах і червоних кров’яних кульках.
Протаміни. Не містять сірки, мають порівняно сильні основні властивості, дають кристалічні солі; утримуються (у вигляді нуклеопротеїнів) в сперматозоїдах риб.
Проламіни. Знаходяться в різних зернах хлібних злаків. Чудовою їх особливістю є розчинність в 80%-ному спирті. Представником цих білків може служити гліадин, що становить головну частину клейковини.
Склеропротеіни. Нерозчинні білки, які складають зовнішній покрив тіла тварини і знаходяться в скелеті і в сполучної тканини. До них відносяться кератин, колагени, еластін, натурального. Кератин є головною складовою частиною волосся, рогів, копит, нігтів, пір’я і верхнього шару шкіри. Шкаралупа курячого яйця складається з вапна і кератину. Якщо розчинити вапно шкаралупи яйця в кислоті, то залишиться м’яка шкіра, що складається з кератину. За хімічним складом кератин багатий сіркою.
Колаген. Надзвичайно поширений в живих організмах. З колагенів складається сполучна тканина; вони знаходяться в хрящах. Кістки хребетних тварин складаються з неорганічних речовин (фосфорнокислого і вуглекислого кальцію), жиру і колагену. При кип’ятінні з водою або при дії перегрітої водяної пари колагени утворюють клей. Якщо з кісток витягти жир і потім, обробивши їх кислотою, розчинити фосфорнокислий кальцій, то залишиться білкова речовина-осеїн. При обробці оссеїна перегрітою водяною парою він переходить в клей. Чистий кістяний клей називається желатином. Особливо чистий желатин виходить із риб’ячого міхура кип’ятінням з водою.
Еластин входить до складу еластичних речовин сполучної тканини. Нитки сирого шовку складаються з білкової речовини – серицину. При кип’ятінні з водою шовк звільняється від клею, який при цьому переходить в розчин.
Протеїди також можна розділити на кілька груп:
Фосфоропротеїни містять у своєму складі фосфор. Вони, на противагу протаміну, проявляють основні властивості, мають виражений кислотний характер. Найголовнішим представником фосфоропротеїдів є казеїн молока. Він має виражений кислотний характер, що розкладає вуглекислі солі з виділенням вуглекислого газу. Казеїн розчиняється в слабких розчинах лугів, утворюючи з ними солі. Солі казеїну називаються казеїнати. При нагріванні казеїн не зсідається. При дії кислот на солі казеїну він виділяється у вільному вигляді. Цим пояснюється згортання молока при прокисанні. Казеїн застосовується для виготовлення твердої пластмаси-галаліта. Для отримання галаліта казеїн змішують з водою, фарбами та наповнювачами, пресують під тиском, і отримані пластини обробляють формаліном. Казеїн містить фосфор у вигляді складного ефіру фосфорної кислоти. З інших фосфоропротеінов слід зазначити вітеллін, який знаходиться в жовтку курячого яйця.
Казеїн. Під назвою «казеїн» розуміють найбільшу за масовою часткою групу білків молока. Казеїни присутні у молоці усіх видів тварин, а також у материнському молоці людини. У коров’ячому молоці казеїни містяться у кількості близько 26 г/л, а їх частка у загальній кількості білкових речовин молока становить близько 80 %. Казеїни поділяють на чотири фракції: α σ-, αs2-, ß- i κ-казеїн. Кожна з цих фракцій гетерогенна за своїм складом і містить від 2 до 8 генетичних варіацій, які відрізняються лише кількома амінокислотами. Як a -, так і ß-казеїн містять у своєму складі амінокислоти, етерифіковані фосфорною кислотою. Залишки фосфорної кислоти зв’язують кальцій, який завжди є в молоці, з утворенням кальцієвих «містків» як усередині молекули, так і між різними молекулами. Завдяки цьому казеїни легко утворюють полімери, що містять молекули одного чи різних типів казеїнів. Через наявність надлишку фосфатних груп та гідрофобних ділянок у молекулі казеїну полімери, що складаються з залишків казеїнів різних типів, є дуже специфічними та стабільними сполуками. Таки полімери будуються із сотень чи навіть тисяч залишків молекул казеїнів. У воді вони утворюють колоїдний розчин, що й надає молоку білого кольору. Такі конгломерати молекул називають казеїновими міцелами. Казеїнова міцела, показана на рис. 1, складається з комплексу субодиниць діаметром від 10 до 15 нм (1 нм = 10-9 м ). Міцела середнього розміру складається з 400…500 субодиниць і може досягати розміру 0,4 мкм ( 0.0004 мм ).
Рис. 1 : Казеїнова міцела; A – субодиниця; B – вільні ланцюжки на поверхні міцели; C – фосфат кальцію; D – κ -казеїн; E – фосфатні групи.
Молекули фосфату кальцію та гідрофобні взаємодії між субодиницями забезпечують стабільність казеїнових міцел. Гідрофільні ділянки κ -казеїну містять залишки вуглеводів, які виступають за межі міцел (фрагменти B на рис. 1). Це надає міцелам «ворсистого» вигляду, але саме залишки вуглеводів попереджають агрегацію окремих міцел.
Важливість κ -казеїну та залишків вуглеводів у його молекулі стає очевидною у виробництві сиру. Сичужний фермент, що використовується на першому етапі виробництва сирів, відщеплює залишки вуглеводів κ -казеїну з поверхні міцел. Це призводить до втрати їх розчинності та початку агрегації з подальшим утворенням згустку. За низьких температур структура міцел послаблюється, оскільки ланцюжки κ -казеїну починають дисоціювати, що супроводжується вивільненням гідроксифосфату кальцію. Цей феномен можна пояснити тим, що гідрофобні взаємодії зі зниженням температури послаблюються. Гідроліз ß-казеїну, який є найбільш гідрофобною фракцією казеїнів, до γ -казеїну та протеозопептонів призводить до зменшення виходу сиру, оскільки фракція протеозопептонів переходить до сироватки.
Окрім сичужного ферменту у виробництві сирів можуть використовуватися інші протеолітичні ферменти. Як правило, усі вони відносяться до групи реніну. Сир, що виробляється без реніну – з протеазами рослинного походження для виготовлення вегетаріанських сирів – часто має дещо інший смак і занижений вихід.
Нуклеопротеїни знаходяться в клітинних ядрах. При обережному гідролізі вони розщеплюються на білок і нуклеїнові кислоти. Нуклеїнові кислоти є досить складними речовинами, що розщеплюються при гідролізі на фосфорну кислоту, вуглеводи і азотовмісні органічні речовини групи піримідину і групи пурин.
Хромопротеїни.
Під цією назвою відомі протеїди, які являють собою поєднання білків з фарбованими речовинами. З хромопротеїнів найбільш вивчений гемоглобін – барвник червоних кров’яних тілець. Гемоглобін, з’єднуючись з киснем, перетворюється на оксигемоглобін, який, віддаючи свій кисень іншим речовинам, знову перетворюється на гемоглобін. Значення гемоглобіну в житті людини і тварин дуже велике. Він відіграє роль переносника кисню від легень до тканин. Утворений в легенях оксигемоглабін кров’ю розноситься по тілу і, віддаючи свій кисень, сприяє протіканню в організмі окиснювальних процесів. Крім того, гемоглобін разом з плазмою крові здійснює регулювання величини pH крові і перенесення вуглекислоти в організмі. Характерною особливістю гемоглобіну є його здатність з`єднуватись з окисом вуглецю, після чого він втрачає здатність з’єднуватися з киснем. Цим пояснюється отруйна дії окису вуглецю. Гемоглобін є з’єднанням білка глобіну з барвним початком гемохромогеном. Поза організмом гемоглобін, при дії повітря, перетворюється на метгемоглобін, який відрізняється від оксигемоглобіну міцним зв’язком з киснем. При обробці крижаною оцтовою кислотою метгемоглобін розщеплюється з утворенням глобіну і гематину C34H32O4N4Fe (OH). Гематин дуже близький до гемохромогену, але все ж таки від нього відрізняється.
Серед хромопротеїнів важливе значення у житті рослин відіграє хлорофіл (зелений пігмент). В організмі людини хромопротеїнами є білірубіноїди (білірубін) – продукти розпаду гемоглобіну.
Глікопротеїни.
Деякі білки цієї групи зустрічаються в слизових сполуках тваринних організмів і обумовлюють властивості цих виділень – тягтися в нитки навіть при порівняно великому розведенні. Ці білки утворюються в підщелепній залозі, печінці, залозах шлунка і кишечника. Інші глікопротеїнии знаходяться в хрящах, білкові яйця, склоподібному тілі ока і т.д. Досліджені представники глікопротеїнів є сполуками білків з речовинами, що містять залишки деяких похідних вуглеводів, сірчаної та оцтової кислот.
Ліпопротеїни (грец. lipos— жир+ protos— перший)— білково-ліпідні комплекси. Ліпопротеїни підрозділяються на дві групи: структурні й транспортні. Структурні входять до складу біологічних мембран, а транспортні здійснюють внутрішньоклітинний, а також міжклітинний, міжорганний і міжтканинний транспорт ліпідів. У складі ліпопротеїнів. білки можуть бути зв’язані з ліпідами як ковалентними, так і нековалентними зв’язками. Ліпіди, ковалентно зв’язані з білком, служать якорем, за допомогою якого білки прикріплюються до мембрани. Нековалентно зв’язані. не мають чітко визначеного складу. Це агрегати ліпідів з білками. Ці комплекси (ЛП) мають змінні розміри і склад, містять специфічні аполіпопротеїни чи апопротеїни, які, взаємодіючи з фосфоліпідами і вільним холестеролом, утворюють полярну зовнішню оболонку, яка екранує розташовані всередині неполярні триацилгліцероли та естери холестеролу
Амінокислоти
Білки є полімерами, побудованими з великої кількості амінокислот. Усього відомо 20 амінокислот, їх загальна хімічна формула RCH(NH2)COOH. Один атом азоту (N) та два атоми водню (H) складають аміногрупу (-NH2). Кислотні властивості молекули забезпечуються карбоксильною групою (-COOH). Радикал R– являє собою боковий ланцюг, будова якого, власно, і визначає амінокислоту. Лише одна амінокислота, пролін, має дещо іншу будову (див. табл. 1 нижче).
Отже, амінокислоти – органічні сполуки, до складу яких входять дві функціональні групи: аміногрупа – Н2N і карбоксильна СООН.
Ці речовини можна розглядати як похідні від карбонових кислот, у вуглеводневому радикалі яких один, або кілька атомів Гідрогену заміщено на аміногрупу.
Загальна формула амінокислот: Н2N-R–COOH
Номенклатура амінокислот: назви амінокислот утворюються від назв відповідної карбонової кислоти із додаванням префікса «аміно-», а також з обов’язковим зазначенням положення аміногрупи в молекулі кислоти. Для цього користуються нумерацією атомів Карбону арабськими цифрами, або ж використовують нумерацію літерами грецького алфавіту.
Наприклад: Н2N-СН2– СН2 – СН2 –COOH – аміно бутанова кислота
4 – аміно масляна кислота
γ – аміно масляна кислота
СН3– СН2 – СН –COOH – аміно бутанова кислота
2 – аміно масляна кислота
Н2N α – аміно масляна кислота
СН3– СН – СН2 –COOH – аміно бутанова кислота
3 – аміно масляна кислота
Н2N β – аміно масляна кислота
Таким чином можна зробити висновок, що для карбонових кислот характерне явище ізомерії (ізомерія положення аміногрупи).
Зустрічається явище ізомерії карбонового скелету.
Наприклад:
СН3
СН3 -СН –COOH – α – аміно – 2 метил пропіонова кислота
Н2N
Амінокислоти приєднуються одна до одної, завдяки тому, що карбоксильна група однієї молекули реагує з аміногрупою іншої з утворенням пептидного зв’язку (–C(=O) NH–) і виділенням молекули води (H2O). Пептид є сполукою двох чи більше амінокислот. Олігопептиди містять до 10 залишків амінокислот. Поліпептиди та білки є полімерами, що складаються з більше, ніж 10 молекул амінокислот, однак поліпептиди, що містять більше 50 залишків амінокислот, класифікують як білки.
Схема утворення пептидного зв’язку
Амінокислоти, знайдені у білках, їх абревіатури, назви англійською та українською мовами та хімічні формули
|
|
Arg = аргінін
|
|
Asn = аспарагін
|
Asp = аспарагінова кислота
|
|
Cys = цистеїн
|
Gln = глутамін
|
|
Glu = глютамінова кислота
|
Gly = гліцин
|
|
His = гіститин *
|
Ile = ізолейцин *
|
|
Leu = лейцин *
|
|
|
Met = метіонін *
|
Phe = фенілаланін *
|
|
Pro = пролін
|
Ser = серін
|
|
Thr = треонін *
|
Trp = триптофан *
|
|
Tyr = тирозин
|
Val = валін *
|
За біологічним (фізіологічним) значенням амінокислоти поділяють на три групи:
– незамінні, котрі не можуть синтезуватися в організмі з інших сполук, тому повинні обов’язково надходити з харчовими продуктами. Це незамінні добавки їжі. Незамінних амінокислот для людини вісім: трео-нін, метіонін, валін, лейцин, ізолейцин, лізин, фенілаланін і триптофан;
– напівзамінні амінокислоти можуть утворюватися в організмі, але не в достатній кількості, тому частково мають надходити з їжею. Для людини такими амінокислотами є аргінін, тирозин, гістидин;
– замінні амінокислоти синтезуються в організмі в достатній кількості з незамінних амінокислот та інших сполук. До них належить решта амінокислот.
Термін «незамінні амінокислоти» стосується амінокислот, що беруть участь у фізіологічних процесах, але не синтезуються в організмі та мають надходити з їжею. Аргінін синтезується в організмі людини, проте лише у невеликих кількостях, що не задовольняють фізіологічну потребу у період росту. Метіонін потрібний у великих кількостях для того, щоб у разі нестачі у харчуванні цистеїну ця амінокислота утворювалася як похідна метіоніну. Подібним чином фенілаланін перетворюється на тирозин, і у разі дефіциту тирозину у раціоні фенілаланін має надходити до організму у великих кількостях. Тирозин є незамінною амінокислотою для хворих на фенілкетонурію ( PKU ) , в організмі яких фенілаланін не перетворюється на тирозин. Ізолейцин, лейцин і валін іноді називають «амінокислотами з розгалуженим ланцюгом», оскільки їх вуглецеві ланцюги мають розгалужену будову
Класифікація амінокислот
Відповідно кількості карбоксильних груп
Монокарбонові кислоти
Н2N– СН2–COOH
Амінооцтова кислота
Гліцин
Дикарбонові кислоти
НООС – СН – СН2–COOH
Н2N β–аміно бутандіова
Відповідно до кількості аміногруп
Моноамінокарбонові кислоти
Н2N- СН2 – СН2–COOH
3 аміно пропіонова кислота
Диамінокарбонові кислоти
Н2N- СН2 – СН-COOH
Н2N
2,3 диаміно пропіонова кислота
Амінокислоти класифікуються кількома способами залежно від ознаки, за якою відбувається їх розподіл на групи. Прийнято в основному три класифікації амінокислот: структурна – за будовою бокового радикалу; електрохімічна – за кислото-лужними властивостями амінокислот; біологічна (фізіологічна) – за мірою незамінності амінокислот для організму.
Відповідно до загальної формули а-амінокислоти відрізняються лише будовою, згідно з чим вони поділяються на аліфатичні (ациклічні), циклічні (див. схему).
Амінокислоти
У свою чергу аліфатичні амінокислоти, залежно від наявності тієї чи іншої групи в радикалі, підрозділяють на такі підгрупи: гідрокси-, сірко-, амідовмісні та інші амінокислоти.
Фізичні властивості амінокислот: кристалічні речовини, більшість із яких добре розчиняється у воді. Можуть бути солодкуватими або кислуватими на смак, при нагріванні не плавляться , за температури 200-300°С – розкладаються.
Стереохімія амінокислот
В усіх двадцяти амінокислотах, за винятком гліцину, атом вуглецю при аміногрупі зв’язаний з чотирма різними замісниками. Тетраедрична форма зв’язків вуглецю та асиметрія приєднаних груп зумовлюють наявність двох просторових ізомерів амінокислот ( L – і D – форми молекули ) , що є дзеркальним відображенням один одного (як права та ліва руки). У складі білків знайдено лише L- амінокислоти. У таких амінокислотах, якщо карбоксильну групу показати зверху, як на рисунку нижче, аміногрупа розташована зліва. Для просторового уявлення зв’язки, показані конусами, розташовані над площиною рисунку, а пунктирні зв’язки – під нею.
|
|
|
|
L-аланін |
R-аланін |
Структура пептиду, що складається з двох амінокислот
Цей рисунок показує взаємодію двох амінокислот. Літерами R і R ‘ позначені функціональні групи амінокислот (у табл. 1 вони наведені червоним кольором). Синім колом показано вивільнення молекули води (H2O) , а червоним – утворення пептидного зв’язку (-C(=O) NH-).
Зворотна реакція, тобто руйнування пептидного зв’язку з утворенням вихідних амінокислот здійснюється у результаті гідролізу . У виробництві багатьох харчових продуктів використовуються смакові та ароматичні добавки, які отримують гідролізом рослинних білків. Соєвий соус отримують гідролізом суміші соєвих і пшеничних білків під час бродіння з використанням грибів роду Аspergillus або під час варіння у розчинах кислот. Глютамат натрію (MSG), підсилювач смаку, є натрієвою сіллю глютамінової кислоти. Ця сіль є складовою морських водоростей і соєвих продуктів, отриманих бродінням.
Хімічні властивості амінокарбонових кислот:
1. Дія на індикатори :дані органічні сполуки містять в своєму складі протилежні за своїм характером функціональні групи: аміногрупа – проявляє основні властивості, а карбоксильна група – кислотні. Тобто такі речовини є нейтральними, відбувається ніби взаємонейтралізація протилежних за властивостями функціональних груп. Отже, індикатори в розчинах амінокислот, що містять по одній аміно і карбоксильній групці в своєму складі кольору не змінюють. (Це органічні амфотерні сполуки).
2. Реакції за карбоксильною групою: (реакції з лугами, спиртами, оксидами металів, солями):
1. Н2N- СН2–COOH + NаОН → Н2N- СН2–COONа + Н2О
2. Н2N- СН2–COOH + НО – С2Н5 → Н2N- СН2–COO – С2Н5 + Н2О
3. Н2N- СН2–COOH + СuО → (Н2N- СН2–COO)2Сu + Н2О
4. Н2N- СН2–COOH + Nа2СО3 → Н2N- СН2–COONа + Н2О + СО2
3. Реакції за аміногрупою: (реакції з неорганічними кислотами)
1. Н2N– СН2–COOH + НСl → [Н3N– СН2–COOН]+Сl–
4. Специфічні властивості амінокислот (зумовлені наявністю різних за хімічними властивостями функціональних груп)
НN- СН2–COOH + НN- СН2–COOH + НN- СН2–COOH + НN- СН2–COOH
Н Н Н Н
N- СН2–C ─ N- СН2–C ─ N- СН2–C─ N- СН2–C─ + Н2О
║ ║ ║ ║
Н O Н О Н О Н О
Тому розрізняють молекули дипептиди – містять два залишки амінокислот, що з’єднані Між собою можуть взаємодіяти багато амінокислот, але є особливість продукту такої взаємодії. Речовина, що утворюється має досить велику молекулу, в якій багаторазово повторюється одна і та ж група атомів CO – NН –– пептидна група.
пептидною групою, три пептид – три залишки амінокислот, дві пептидні групи; поліпептид – багато залишків амінокислот і багато пептидних зв’язків.
Добування і застосування амінокислот
1. Деякі можна добути із природніх полімерів – білків, що утворені тільки α – амінокислотами (їх понад 20).
2. В промисловості одержують дією аміаку на галогенпохідні карбонових кислот
Застосування амінокислот:
1. 6 – аміногексанова кислота – мономер для одержання капрону;
2. 7 – аміногептанова кислота – добування полімеру енант (аналог капрону)
3. α – амінокислоти – є складовою природних полімерів білків, вони є складовою частиною продуктів харчування людини, містяться в лікарських препаратах. З їжею людина отримує 8 незамінних амінокислот: лейцин, ізолейцин, лізин, фенілаланін, триптофан, треонін, метіонін. Їх відсутність призводить до затримки росту, втрати ваги та врешті-решт загибелі організму.
Деякі амінокислоти, вже входячи до складу білків, можуть модифікуватися, тобто зазнавати певних хімічних перетворень, які призводять до зміни у структурі радикала. Вони не беруть безпосередньої участі у синтезі білків. Але їх можна знайти в гідролізаті білків. Так, у результаті процесу гідроксилювання, який відбувається в організмі, у бокові радикали лізину та проліну білка колагену вводяться ОН-групи з утворенням гідроксилізину та гідроксипроліну:
Внаслідок модифікаційних перетворень може відбуватися конденсація двох молекул цистеїну з утворенням дисульфіду – цистину.
Цей процес має місце під час взаємодії цистеїнових залишків у поліпептидному ланцюзі: як усередині його, так і між поліпептидни-ми ланцюгами, що спостерігається при формуванні просторової конформації білкової молекули.
За хімічними властивостями амінокислоти – амфотерні електроліти, тобто поєднують властивості і основ, і кислот. У залежності від рН середовища вони можуть мати кислі або основні властивості. У кислому середовищі (рН < 7) амінокислоти несуть позитивний заряд (катіони), оскільки надлишок протонів у середовищі пригнічує дисоціацію карбоксильних груп:
У цьому випадку амінокислоти пересуваються в електричному полі до катоду.
У лужному середовищі (рН > 7), коли є надлишок іонів ОН-, амінокислоти перебувають у вигляді негативно заряджених іонів (аніони), внаслідок дисоціації СООН–групи:
У лужному середовищі амінокислоти в електричному полі рухаються до аноду. Отже, у залежності від рН середовища амінокислоти мають сумарний нульовий, позитивний або негативний заряд.
Відповідно до своєї амфотерної природи амінокислоти можуть утворювати різні солі, реагуючи як з основами, так і з кислотами:
Стан, у якому заряд амінокислоти дорівнює нулю, називається ізоелектричним станом. Значення рН, при якому амінокислоти досягають цього стану і вже не рухаються в електричному полі ні до аноду, ні до катоду, називається ізоелектричною точкою (ІЕТ) і позначається рі. Для нейтральних а-амінокислот значення ІЕТ дещо нижчі за 7 (5,5-6,3) внаслідок більшої здатності до іонізації карбоксильної групи. У кислих а-амінокислот (аспарагінова і глутамінова кислоти) ІЕТ знаходиться значно нижче 7, наприклад, для глутамінової кислоти рІ = 3,2. Для лужних амінокислот ІЕТ знаходиться у межах рН вище 7, і в організмі вони містяться у вигляді катіонів, тобто в них протонізовані обидві аміногрупи. Кислотно-основні властивості амінокислот використовуються при їх розподілі й ідентифікації за методом іонообмінної хроматографії і електрофорезу.
Будова білкових молекул.
Практично всі білки побудовані з 20-амінокислот, що належать, за винятком гліцину, до L-ряду. Амінокислоти з’єднані між собою пептидними зв’язками, утвореними карбоксильної і-аміногрупи сусідніх амінокислотних залишків Білкова молекула може складатися з однієї або декількох ланцюгів, що містять від 50 до кількох сотень (іноді-більше тисячі) амінокислотних залишків. Молекули, що містять менше 50 залишків часто відносять до пептидів. До складу багатьох молекул входять залишки цистину, дисульфідні зв’язку яких ковалентно пов’язують ділянки однієї або декількох ланцюгів. У нативної стані макромолекули білка володіють специфічною конформацією. Характерна для даного білка конформація визначається послідовністю амінокислотних залишків і стабілізується водневими зв’язками між пептидними і бічними групами амінокислотних залишків, а також гідрофобними і електростатичними взаємодіями. Розрізняють чотири рівні організації білкових молекул. Первинною структурою називають послідовність амінокислотних залишків у поліпептидного ланцюга. Всі білки розрізняються по первинній структурі, потенційно їх можливу кількість практично необмежена. Вторинна структура білка – це-спіраль, яка утворюється в результаті скручування поліпептидного ланцюга за рахунок водневих зв’язків/ В одному витку спіралі зазвичай міститься 3,6 амінокислотних залишку, крок спіралі – 0,544 нм. Під третинної структурою білка розуміють розташування його поліпептидного ланцюга в просторі. Істотний вплив на формування третинної структури надають розмір, форма і полярність амінокислотних залишків. Третинна структура багатьох білків складається з декількох компактних глобул, які називаються доменами. Між собою домени звичайно бувають пов’язані тонкими перемичками – витягнутими поліпептидними ланцюгами. Термін четвертинна структура відноситься до макромолекули, до складу яких входить кілька поліпептидних ланцюгів (субодиниць), не пов’язаних між собою ковалентно. Між собою ці субодиниці з’єднуються водневими, іонними, гідрофобними та іншими зв’язками. Прикладом може служити макромолекула гемоглобіну.
Структура білка
Властивості білка зумовлені послідовністю амінокислот у його молекулі, яку ще називають первинною структурою білка. Залежно від будови амінокислоти та її місця у молекулі білка частини молекули утворюють вторинну структуру білка, різновидами якої є просторова α-спираль і b – структура ( b -лист) , представлені нижче. Подальше скручування та реорганізація усередині молекули приводять до утворення структури вищого порядку, а саме, третинної структури білка. Кожен білок містить α-спиралі, b -листи та невпорядковані частини.
.
Приклад b – листа ( стрілочками показаний напрям амінокислотного ланцюжку)
Приклад α- спиралі: A – схема , B – молекулярна структура , C – вид зверху , D – модель просторової структури.
Вторинна та третинна структура є найбільш стабільними формам існування молекули білка. Вони утворюються завдяки нековалентним взаємодіям (іонним, водневим, гідрофобним зв’язкам) між різними амінокислотами бокових ланцюгів білкової молекули, а також у результаті взаємодії з молекулами води, що оточують білок. Різні частини білка, що мають особливі властивості, можуть утворювати структурні компактні субглобули – домени . Завдяки наявності близьких за структурою доменів, різні білки проявляють схожі функції
Реакційно здатні групи, розташовані на поверхні молекули білка, можуть взаємодіяти з іншими молекулами, у т.ч. білковими. Білок-білкова взаємодія, наприклад, між апоферментами (білковими частинами ферментів) або високомолекулярними білками, призводить до утворення вищого рівня організації білків – четвертинної структури .
Вивчення структури білків — це шлях до розуміння механізму їх важливих біологічних функцій в організмі. Зокрема, знання структури ферментів і особливо їх активних центрів дає змогу розкрити механізми здійснення ферментативного каталізу. Вивчення структури скоротливих білків — актину і міозину, які входять до складу м’язів, сприяє вивченню механізмів їх скорочення. Вивчення структури гормонів білкової природи — інсуліну, глюкагону та інших — необхідне не тільки для вивчення механізмів регуляції обміну речовин, а й для опанування засобів синтезу цих гормонів з метою отримання лікарських гормональних препаратів. Просторова структура білкової молекули, властива будь-яким нативним білкам, має назву конформації білка. Будова білків надзвичайно складна, що пояснюється великою кількістю амінокислот у білкових молекулах, значною їх молекулярною масою (від 5000 до кількох мільйонів і вище), утворенням різноманітних хімічних та фізико-хімічних зв’язків між різними атомними групами.
Вивчення первинної структури білка складається з кількох етапів. Спочатку визначають амінокислотний склад білка. Для цього здійснюють повний гідроліз білка в запаяних під вакуумом ампулах під дією 6 М розчину НСІ (кислотний гідроліз) або 2—4 М розчину NaOH (лужний гідроліз) при 110 °С протягом 24 год. Добуту суміш амінокислот аналізують за допомогою іонообмінної хроматографії. Для визначення послідовності амінокислот у поліпептидному ланцюгу білок обробляють протеолітичними ферментами (трипсином, хімотрипсином, амінопептидазою, карбоксипептидазою тощо), які гідролізують пептидні зв’язки між певними амінокислотами. Потім суміш пептидів — продуктів часткового гідролізу — аналізують і визначають амінокислотний склад кожного пептиду, а також послідовність і взаєморозташування пептидів у молекулі білка. При цьому враховують специфічність дії протеолітичних ферментів на поліпептидний ланцюг, беручи до уваги, що трипсин гідролізує пептидні зв’язки, утворені лізином і аргініном, хімотрипсин діє на пептидні зв’язки, утворені ароматичними амінокислотами фенілаланіном, тирозином, триптофаном тощо.
Для вивчення послідовності амінокислотних залишків у молекулах білків Ф. Сенгер розробив стандартний метод визначення N-кінцевих амінокислот. Принципова основа цього методу полягає в тому, що до аміногрупи приєднують хімічну “мітку”, яка не відщеплюється під час гідролізу білка. Якщо з гідролізату виділити таку мічену амінокислоту, можна визначити, який амінокислотний залишок розташований на N-кінці поліпептидного ланцюга білка.
Для “мітки” амінокислотних залишків Ф. Сенгер використовував динітрофторбензол (ДНФ). При обробці цим реактивом білка утворюється динітрофеніл-білок (ДНФ-білок):
У подальшому ДНФ-білок гідролізується з утворенням залишку молекули білка і ДНФ-амінокислоти:
ДНФ-амінокислоту виділяють із суміші продуктів гідролізу та ідентифікують за допомогою хроматографії. Залишок молекули білка реагує з новими порціями ДНФ, усі наведені вище реакції повторюються і завершуються ідентифікацією другої амінокислоти. Реакції продовжуються доти, доки вся молекула білка не розпадеться на окремі ДНФ-похідні амінокислот.
Внаслідок тривалої роботи Ф. Сенгер у 1958 р. повністю встановив первинну структуру гормону інсуліну. Виявилось, що інсулін має два поліпептидних ланцюги — А і В, сполучені двома дисульфідними містками. Ланцюг А має 21 залишок, ланцюг В — ЗО залишків амінокислот. Крім того, в ланцюгу А є дисуль-фідний зв’язок між залишками молекул цистеїну. Цікаво, що існує видова специфічність будови інсуліну, яка виявляється в амінокислотному складі поліпептидного ланцюга А. Якщо інсулін людини має у 8-, 9- і 10-му положеннях цього ланцюга амінокислотну послідовність залишків амінокислот — Тре — Сер — Іле —, то інсулін бика — Ала — Сер — Вал —, барана — Ала — Глі — Вал —, коня — Тре — Глі — Іле —. Інсулін свині має амінокислотну послідовність ланцюга А таку саму, як і у людини, але в 30-му положенні ланцюга В він містить аланін замість треоніну. Відмінність первинної структури препаратів інсуліну, отриманих з підшлункових залоз різних тварин, пояснює неоднакову ефективність цих препаратів під час лікування цукрового діабету.
Для відщеплення та ідентифікації N-кінцевої амінокислоти значного поширення набув також метод, запропонований П. Едманом, що грунтується на застосуванні фенілізотіоціанату. Досліджуваний пептид обробляють фенілізотіоціанатом, який взаємодіє з вільною α-аміногрупою N-кінцевої амінокислоти. У кислому середовищі відбувається розрив пептидного зв’язку, утвореного N-кінцевою амінокислотою з рештою пептиду. Внаслідок цієї реакції вивільняється фенілтіогідантоїнова похідна N-кінцевої амінокис Отже, метод П. Едмана дає змогу послідовно вкорочувати пептиди на один амінокислотний залишок без пошкодження решти поліпептидного ланцюга. Фенілтіогідантоїнову похідну N-кінцевої амінокислоти можна ідентифікувати хроматографічним методом, а послідовність операцій — повторити. Метод дає змогу визначати первинну структуру пептидів та білків (після їх часткового гідролізу трипсином) шляхом послідовного відщеплення N-кінцевих амінокислот. Автоматизація цього методу реалізується в спеціальному приладі — “секвенаторі” (англ. “sequence” — послідовність), що дає змогу досить швидко аналізувати пептидні ланцюги.
Сучасним методом, що дає можливість мітити та ідентифікувати N-кінцеві амінокислотні залишки в пептидах та білках, є також застосування дансилхлориду: Дансилхлорид здатен реагувати з N-кінцевою амінокислотою, утворюючи дансильну похідну (“дансилування пептидів”). Після гідролітичного розщеплення всіх пептидних зв’язків у досліджуваному пептиді дансилована амінокислота може бути виділена та ідентифікована завдяки її специфічній флуоресценції.
Для ідентифікації С-кінцевих амінокислот у білках та пептидах застосовують гідразиноліз за Акаборі. Згідно з цим методом, досліджуваний поліпептид обробляють гідразином NH2 — NH2, що веде до розщеплення пептидних зв’язків і утворення гідразидів усіх амінокислот крім С-кінцевої. С-кінцева амінокислота лишається у вільному стані і може бути виділена з реакційної суміші та ідентифікована.
Використання вищенаведених методів у поєднанні з різними способами розділення пептидів і амінокислот дало змогу встановити первинну структуру багатьох пептидів та білків, зокрема інсуліну (51 амінокислота), міоглобіну (153 амінокислоти), гемоглобіну (574 амінокислоти), рибонуклеази (124 амінокислоти), аспартат-трансамінази (412 амінокислот) тощо. Первинна структура біологічно важливих пептидів.
Пептидами є різноманітні фізіологічно активні сполуки, що містяться в біологічних рідинах та клітинах певних організмів, зокрема трипептид глутатіон, деякі гормони та медіатори нервової системи (окситоцин, вазопресин, нейро-пептиди тощо), регулятори імунокомпетентних клітин (інтерлейкіни, тимопоетини). До пептидів належать також деякі природні токсини, що мають отруйну дію або використовуються як високоефективні лікарські засоби та інструменти фармакологічного аналізу (токсини бджіл, отруйних рослин та комах, нейротоксини з організму рептилій тощо).
Глутатіон — трипептид, що зустрічається в усіх живих клітинах, плазмі крові, еритроцитах і бере участь в окисно-відновних реакціях.
Окситоцин і вазопресин — циклічні пептиди з дев’яти амінокислотних залишків (нонапептиди), що належать до гормонів задньої частки гіпофіза (нейрогіпофіза).
Енкефаліни (Мет-енкефалін та Лей-енкефалін) — представники так званих опіоїдних пептидів, тобто сполук, що впливають на морфінні (опіатні) рецептори головного мозку. Ці біологічно активні сполуки пригнічують відчуття болю, викликають стан психічного задоволення, ейфорію:
Тир — Глі — Глі — Фен — Мет;
Мет-енкефалін
Тир — Глі — Глі — Фен — Лей.
Лей-енкефалін
Тафцин і тимулін — пептиди, що регулюють функцію імунної системи, зокрема Т-лімфоцитів:
Тре — Ліз — Про — Apr;
Тафцин
Глу — Ала — Ліз — Сер — Глн — Глі — Глі — Сер — Асн.
Тимулін
Вивчення первинної структури білків та пептидів дає можливість з’ясовувати причину спадкових захворювань, що виникають внаслідок генних мутацій і синтезу в організмі аномальних білкових молекул. Наприклад, вивчення первинної структури гемоглобіну людей, хворих на серпоподібно-клітинну анемію, встановило, що при цьому захворюванні гемоглобін еритроцитів відрізняється від нормального лише тим, що в Б-поліпептидному ланцюгу залишок глутамінової кислоти замінений на залишок валіну. Така заміна призводить до втрати біологічних властивостей гемоглобіну. Вивчення гемоглобінопатій — захворювань, які супроводжуються порушенням функцій гемоглобіну — транспортного білка крові, що переносить О2 і СО2, сприяло відкриттю майже 100 патологічних форм гемоглобіну. Кожна з цих форм характеризується заміною одного залишку амінокислоти в А- або S-поліпептидному ланцюгу цього білка. (Вториннаструктура білішу — це просторова конфігурація поліпептидного ланцюга переважно у вигляді α-спіралі, складчастої β-структури або інших утворів.
На основі рентгеноструктурних досліджень поліпептидів і білків Л. Полінг і Р. Корі встановили, що в складі природних глобулярних білків поліпептидні ланцюги можуть утворювати а-спі-раль (рис. 6), в якій на один виток припадає 3,6 залишку амінокислоти. Крок спіралі — відстань між витками — дорівнює 0,54 нм, кут підйому витка — 26°, висота одного залишку амінокислоти становить 0,15 нм. Велику роль у формуванні вторинної струтктури білка відіграють водневі зв’язки. На утворення а-спіралі впливає також розташування бічних радикалів залишків амінокислот.
Утворенню спіралі сприяють такі амінокислоти, як аланін, валін, лейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, гістидин, особливо коли вони розміщені підряд у поліпептидному ланцюгу. Навпаки, лізин, аргінін, серин, треонін, аспарагінова і глутамінова кислоти впливають дестабілізуюче на α-спіраль. Зокрема, поліпептиди, до складу яких входить лізин, не утворюють α-спіраль при рН = 7, оскільки радикали цієї амінокислоти в нейтральному середовищі мають позитивний заряд, що не дає їм змоги зближуватись. При цьому сила взаємного відштовхування перевищує сили водневих зв’язків, необхідних для утворення α-спіралі.
Ступінь спіралізації поліпептидних ланцюгів білка залежить від його первинної структури. Так, молекули гемоглобіну і міоглобіну спіралізовані на 75 %, альбуміну сироватки крові — на 50 %, пепсину — на 28 %, а хімотрипсину — лише на 14 %. Неспіралізовані ділянки поліпептидного ланцюга утворені β-структурами або невпорядкованими, аморфними переходами.
Крім α-спіралі поліпептидний ланцюг може формувати іншу впорядковану конформацію, яка дістала назву β-структури, або складчастого шару. β-структура утворюється поліпептидними ланцюгами, які розміщені паралельно і сполучаються між собою за рахунок водневих зв’язків між поліпептидними групами, розміщеними поруч .
β-Структура найбільш поширена в білках опорних тканин — колагені (білок сполучної тканини, сухожилля, шкіри), фіброїні (білок шовку), кератині (білок волосся). У багатьох білках одночасно зустрічаються ділянки α-спіралі і β-структури. Наприклад, фермент рибонуклеаза містить у своєму складі 26 % β -спіралізованих ділянок і 35 % — β -структури, лізоцим — відповідно 40 і 12 %, хімотрипсин — 14 і 45 %.
Отже, вторинна структура кожної білкової молекули характеризується певним співвідношенням укладання поліпептидних ланцюгів у просторі у вигляді α-спіра-лей, β-структур та аморфних ділянок.
Третинна структура— це розташування у просторі спіралізованих поліпептидних ланцюгів з утворенням глобулярних або фібрилярних білкових молекул.
Основною діючою силою в утворенні третинної структури є взаємодія радикалів амінокислот з молекулами води. При цьому неполярні гідрофобні радикали амінокислот неначе занурюються в глибину білкової молекули, утворюючи там “сухі” зони, тоді як гідрофільні полярні радикали розміщуються на поверхні молекули. Внаслідок цих процесів утворюється конформація, яка є термодинамічно найбільш вигідною для всієї молекули в цілому. Третинну структуру стабілізують водневі та іонні зв’язки. На формування третинної структури значний вплив мають температура, рН та іонна сила розчину.
Застосування для вивчення будови білків рентгеноструктурного аналізу та інших фізичних методів дослідження дало змогу встановити третинну структуру близько 300 різних білків, у тому числі міоглобіну, гемоглобіну, пепсину, трипсину, хімотрипсину, лізоциму, фрагментів імуноглобулінів людини тощо.
Четвертинна структура білка — це просторове розміщення кількох білкових поліпептидних ланцюгів, кожний з яких має певні первинну, вторинну і третинну структури. Окремі білкові молекули, що входять до складу четвертинної структури, називаються протомерами, або субодиницями, а білки, побудовані з них, — олігомерами, або мультимерами. Такі олігомерні білки мають звичайно парну кількість протомерів (2, 4, 6, 8, 10, дуже рідко понад 12) з молекулярними масами від кількох тисяч до 100 000.
Важливо підкреслити, що окремі протомери ально не активні, тобто не виявляють властивостей відповідних ферментів, гормонів тощо. Функціональна і біологічна активність з’являється лише при утворенні олігомерного білка після формування четвертинної структури. Прикладом білка з четвертинною структурою є, наприклад, молекула гемоглобіну, яка має молекулярну масу 64500, складається з 574 амінокислотних залишків і є тетрамером, побудованим з двох α-поліпептидних ланцюгів (кожен має по 141 залишку амінокислот) і двох β-поліпептидних ланцюгів (по 146 залишків амінокислот). Кожний з ланцюгів оточує гем, що розташований у центрі молекули, містить у своєму складі один двовалентний іон заліза і може приєднувати молекулу О2.
Зв’язки між протомерами здійснюються за рахунок нековалентних зв’язків — водневих, гідрофільних, іонних, тому за певних умов можливе розділення олігомеру на протомери. Зокрема, молекула гемоглобіну при наявності деяких солей, сечовини або при зміні рН дисоціює на два α- і два β-ланцюги за рахунок розриву водневих зв’язків. Ця дисоціація оборотна — після видалення сечовини або солей з розчину відбувається спонтанна асоціація молекули гемоглобіну.
Прикладом олігомерної молекули є також вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), що складається з однієї молекули РНК і 2130 білкових субодиниць, кожна з яких має молекулярну масу 17500. Білкові протомери приєднуються до РНК, що утворює спіральну структуру з 130 витків.
Багато ферментів мають четвертинну структуру, яка забезпечує не тільки їх каталітичну властивість, а й здатність змінювати ферментативну активність залежно від певних регуляторних факторів. Четвертинна структура імуноглобулінів складається з легких (L) і важких (Н) поліпептидних ланцюгів, сполучених між собою нековалентними і дисульфідними зв’язками.
До фібрилярних білків, що мають четвертинну структуру, належить білок міозин, функція якого пов’язана із скороченням м’язів. Молекулярна маса його становить близько 500 000 (рис. 10). Молекула міозину має витягнуту форму, довжину 150 нм і товщину 2 нм. Діаметр головки молекули становить 16 нм. Субодиницями міозину є два важких поліпептидних ланцюги з молекулярною масою близько 210 000 і кілька легких ланцюгів з молекулярною масою близько 20 000. Кінець кожного важкого ланцюга утворює „головку”, до складу якої входять легкі ланцюги.
Існування олігомерних білків сприяє економії генетичної інформації в організмі. Відомо, що структура кожного білка кодується одним геном. Для забезпечення синтезу чотирьох поліпептидних ланцюгів гемоглобіну потрібно два гени, один з яких кодує утворення α-ланцюгів, другий —β-ланцюгів. Якщо всі чотири ланцюги були б різні, потрібно було б чотири гени.
Хімічний синтезпептидівтабілків. У зв’язку з широким застосуванням білково-пептидних препаратів у медицині, сільському господарстві, харчовій промисловості проблема штучного атним німецьким хіміком Е. Фішером, який в 1901 р. отримав гліцилгліцин, а в 1903 р. запропонував хлорангідридний спосіб утворення пептидів.
Усі методи хімічного синтезу пептидів та білків, що існують у наш час, грунтуються на послідовному здійсненні таких трьох стадій: а) блокуванні (захисті) функціональних груп амінокислоти або пептиду, що не беруть участі в реакції утворення пептидного зв’язку; б) конденсації активованої карбоксильної групи одного реакційного компонента з аміногрупою іншого компонента; в) видаленні захисних груп для отримання вільного пептиду (кінцевого продукту) або продовження синтезу.
Активацію карбоксильної групи в амінокислотах та пептидах здійснюють за рахунок утворення хлорангідридів, азидів, арильних ефірів, змішаних ангідридів при взаємодії карбоксилу з похідними вугільної кислоти, етилхлорформіатом.
Важливим внеском у проблему штучного синтезу пептидів та білків став запропонований Р. Мерифілдом метод твердофазного синтезу. Головна ідея цього методу полягає в закріпленні поліпептидного ланцюга, що утворюється, на полімерному нерозчинному носії, поверхня якого містить хлорметильні “якірні” групи. За допомогою розробленого методу Р. Мерифілд здійснив синтез пептидів брадикініну, ангіотензину та перший штучний синтез ферментного білка — рибонуклеази. В методі рід-кофазового синтезу пептидів (за М. М. Шемякіним, 1965) як носій, на поверхні якого відбувається синтез, застосовують розчинний полістирол, що дає змогу збільшити швидкість реакцій синтезу.
Денатурація білків
Функція білка (за винятком білка як частини харчового продукту) практично повністю визначається його просторовою структурою. Руйнування цієї структури, тобто денатурація білка, може бути наслідком:
- зміни рН ( кислотності )
- зміни концентрації солі («висолювання») зміни температури ( під час технологічного оброблення ) в присутності деяких реагентів ( наприклад, хлорного вапна ).
Жоден з цих факторів не призводить до руйнування пептидних зв’язків, тому первинна структура у денатурованому білку залишається незмінною. Проте функції білка після його денатурації втрачаються.
Якщо білок було обережно денатуровано, а після денатурації повернуто у нормальні фізіологічні умови за температурою, кислотністю, концентрацією солі тощо, можна очікувати поступового відновлення його функцій (наприклад, ферментативної активності).
Більшість білків харчових продуктів у результаті технологічного оброблення чи консервування денатурують. Ферменти сировини під час такого оброблення руйнуються повністю.
Якісні реакції на амінокислоти (α-амінокислоти)
Визначення реакції середовища у водному розчині гліцину.
За допомогою смужки універсального індикаторного паперу визначають рН 1 %-го розчину гліцину. Відсутність кислої реакції розчину гліцину пояснюється утворенням внутрішньомолекулярної солі (цвітер-іона):
Реакція гліцину з купрум(II) сульфатом
У пробірку вносять по 0,5 мл 2 %-го розчину купрум(II) сульфату та 1 %-го розчину гліцину. Утворюється стійка внутрішньомолекулярна комплексна сполука синього кольору:
Сульфатна кислота, яка виділяється в процесі, не руйнує комплекс. При подальшому додаванні 5 – 10 крапель 10 %-го розчину натрій гідроксиду до комплексу змін не відбувається, оскільки сіль гліцину стійка як в кислому, так і в лужному середовищах.
Взаємодія α-амінокислот з формальдегідом
У пробірку вносять 3 краплі 40 %-го водного розчину формальде-гіду та 1 краплю індикатора метилового червоного. Спостерігають появу червоного забарвлення розчину, яке свідчить про наявність кислого середовища.
Піпеткою в пробірку краплями додають 10 %-й водний розчин натрій гідроксиду до нейтральної реакції. Спостерігають появу жовтого забарвлення розчину. Добутий нейтралізований розчин формальдегіду змішують з 3 краплями 1 %-го водного розчину гліцину і спостерігають появу червоного забарвлення (кисле середовище):
Якісна реакція ґрунтується на блокуванні формальдегідом аміногрупи кислоти.
Виявлення сірковмісних амінокислот реакцією Фоля.
В пробірку помістити 10 крапель яєчного білка і 20 крапель 10% розчину гідроксиду натрію. Вміст пробірки перемішати, нагріти до кипіння. Додати 5 крапель 10% розчину ацетату свинцю і знову прокип’ятити. Відмічаємо появу чорного або бурого осаду.
Ксантопротеїнова реакція – кольорова якісна реакція (поява жовтого фарбування), яку дають розчини білка при кип’яченні з концентрованою азотною кислотою. Після додавання концентрованого лугу жовте фарбування переходить в помаранчеве. Реакція вказує на присутність ароматичних амінокислот (фенілаланіна, тирозину і триптофану) і обумовлена освітою їх нітропохідних.
Взаємодія α-амінокислот з нінгідрином
У пробірку вносять 2 краплі 0,1 %-го розчину нінгідрину та 4 краплі 1 %-го розчину α-амінокислоти. Суміш нагрівають до кипіння і спостерігають появу синьо-фіолетового забарвлення розчину:
.Нінгідринова реакція застосовується для якісного визначення α-амінокислот.
Біуретова реакція на пептидні зв’язки.
Біуретова реакція, кольорова реакція (поява фіолетового забарвлення), яку дають при взаємодії з сірчанокислою міддю в лужному середовищі органічні речовини, що мають в молекулі угрупування —СО—NH—. Широко використовується для якісного і кількісного визначення білків і продуктів часткового їх гідролізу ( пептонів і пептидів, починаючи з трипептидів). Вперше описана в 19 ст для простої сполуки — біурету (NH 2 —CO—NH—CO—NH 2 ).
Реакція Адамкевича (Адамкевича–Гопкінса (1874)) Опис досвіду. До 2 мл 1%–го розчину триптофану доливають ~ 1 мл концентрованої оцтової кислоти, струшують і по стінці пробірки обережно додають ~ 2 мл концентрованої сірчаної кислоти. На межі двох рідин спостерігають утворення червоно–фіолетового забарвлення. При струшуванні рідина забарвлюється у фіолетовий колір.
Реакція Ван Слайка. Це реакція визначення первинної аміногрупи в аліфатичних аминах. a–Амінокислоти, що містять первинну аміногрупу, реагують з азотистої кислотою. При цьому утворюється нестійке диазосоединение, разлагающееся з виділенням вільного азоту і утворенням a–гідроксікарбонових кислот:
Реакція використовується для кількісного визначення амінокислот за обсягом виділився газоподібного азоту.Опис досвіду. У пробірку наливають 1 мл 1%–го розчину гліцину і рівний об’єм 5%–го розчину нітриту натрію. Додають 0,5 мл концентрованої оцтової кислоти і обережно збовтують суміш. Спостерігається виділення бульбашок газу:
Реакція Вуазена
Опис досліду. Якщо до 1 мл 5%–го розчину білка в 30%-му розчині їдкого калію додати одну краплю 1,25%–го розчину формальдегіду, 10 мл концентрованої соляної кислоти і через 10 хвилин додати 5-7 крапель 0,05%–го розчину нітриту натрію, то з’являється фіолетове забарвлення, обумовлене присутністю в білку триптофану.
Реакція Міллона
Це реакція на амінокислоту тирозин. Реактив Міллона (розчин HgNO3 і Hg (NO2)2 в розведеній HNO3, що містить домішку HNO2) взаємодіє з тирозином з утворенням ртутної солі нітропохідних тирозину, зафарбованої в рожево–червоний колір:
Опис досліду. До 2 мл концентрованого розчину тирозину додають ~ 1 мл реактиву Міллона, струшують і обережно нагрівають пробірки на полум’ї спиртівки. Утворюється червоне забарвлення.
Реакція Гопкінса–Коле
Це реакція на амінокислоту триптофан. Опис досліду. 1 мл 0,005%–го розчину триптофану змішують з рівним об’ємом гліоксилової кислоти НСО) СООН * і до суміші додають 10 крапель 0,04 М розчину сульфату міді (II). Потім невеликими порціями (по кілька крапель) додають 2-3 мл концентрованої сірчаної кислоти, охолоджуючи пробірку, після доливання чергової порції кислоти, струмом холодної води (або у ванні з льодом). Отриману суміш залишають на 10 хв при кімнатній температурі, після чого ставлять на 5 хв у киплячу водяну баню. Спостерігається утворення синьо–фіолетового забарвлення.
У цій реакції з гліоксилової кислоти під дією концентрованої сірчаної кислоти спочатку виходить формальдегід, який потім конденсується з триптофаном:
Продукт конденсації окислюється до біс-2-триптофанілкарбінола, який в присутності мінеральних кислот утворює солі, забарвлені в синьо-фіолетовий колір:
Реакція Маккарті і Саллівана
Це реакція на амінокислоту метіонін. Опис досліду. До 5 мл 0,02 н. розчину метіоніну додають при перемішуванні спочатку 1 мл 14,3 н. розчину гідроксиду натрію, а потім 0,3 мл свіжоприготованого 10%–го розчину нітропрусиду натрію. Суміш 10 хв нагрівають на водяній бані при 35-40 ° С, потім протягом 2 хв охолоджують у крижаній воді. До суміші додають при помішуванні 5 мл суміші соляної та фосфорної кислот. Отриманий розчин збовтують 1 хв і охолоджують водою кімнатної температури протягом 10 хв. Утворюється яскраве червоно–фіолетове забарвлення.
Реакція Паулі (Діазореакція Паулі) Ця реакція на амінокислоту гістидин заснована на взаємодії гістидину з діазобензолсульфоновой кислотою з утворенням сполуки вишнево–червоного кольору.Реакцію діазотування здійснюють при взаємодії кислого розчину сульфаниловой кислоти з нітритом натрію. При цьому утворюється діазобензолсульфоновая кислота:
Ця кислота, взаємодіючи з гістидином, дає сполуку вишнево–червоного кольору:
Опис досліду. У пробірку наливають 1 мл 1%–го розчину сульфанілової кислоти в 5%-му розчині соляної кислоти. Потім додають 2 мл 0,5%–го розчину нітриту натрію, сильно струшують і негайно доливають 2 мл 0,01%–го розчину гістидину. Після перемішування вмісту пробірки відразу доливають 6 мл 10%–го розчину соди. З’являється інтенсивне вишнево-червоне забарвлення.
Білки довжиною від 2 до декількох десятківамінокислотних залишків часто називають пептидами , При більшому ступені полімеризації – білками , Хоча цей розподіл дуже умовний. При утворенні білка в результаті взаємодії α-аміногрупи (-NH2) однієї амінокислоти з α-карбоксильноїгрупою (-СООН) іншої амінокислоти утворюються пептидні зв’язку. Кінці білка називають С-і N-кінцем (в залежності від того, яка з груп кінцевої амінокислоти вільна:-COOH чи-NH2 відповідно). При синтезі білка на рибосомі нові амінокислоти приєднуються до C-кінця, тому назва пептиду або білка дається шляхом перерахування амінокислотних залишків починаючи з N-кінця. Послідовність амінокислот у білку відповідає інформації, що міститься в гені даного білка. Ця інформація представлена вигляді послідовності нуклеотидів, причому одній амінокислоті відповідає в ДНК послідовність з трьох нуклеотидів – так званий триплет або кодон.
Те, яка амінокислота відповідає даному кодону в мРНК, визначається генетичним кодом, який може трохи відрізнятися у різних організмів. Синтез білків на рибосомах відбувається, як правило, з 20-ти амінокислот, які називаються стандартними. Триплетів, якими закодовані амінокислоти в ДНК, у різних організмів від 61 до 63 (тобто від числа можливих триплетів (4 = 64), вирахувано число стоп-кодонів (1-3)). Тому з’являється можливість, що більшість амінокислот може бути закодовано різними триплетами. Тобто, генетичний код є надлишковим або, інакше, виродженим. Це було остаточно доведено вексперименті при аналізі мутацій.
Генетичний код, який кодує різні амінокислоти має різну ступінь виродженості (кодуються від 1 до 6 кодонами), це залежить від того, як часто зустрічається дана амінокислота в білках, за винятком аргініну. Часто поява її в третьому положенні виявляється несуттєвою для специфічності, тобто одна амінокислота може бути представлена чотирма кодонами, які відрізняються тільки третім положенням. Іноді різниця полягає в перевазі пурину над піримідином. Це називають виродженість – третя ознака. Такий трьох-кодонний код склався еволюційно рано. Але існування відмінностей в деяких організмах, що з’явилися на різних еволюційних етапах, вказує на те, що він був не завжди таким.
Фракціонування і очищення білків
Після досягнення повної екстракції білків, тобто перекладу білків у розчинений стан, приступають до розділення — фракціонування суміші білків на індивідуальні білки. Для цього застосовують різноманітні методи: висолювання, теплову денатурацію, осадження органічними розчинниками, хроматографію, електрофорез, розподіл в двофазних системах, кристалізацію та ін.Розчинення білків у воді пов’язано з гідратацією кожної молекули, що призводить до утворення навколо білкової глобули водних (гідратної) оболонок, що складаються з орієнтованих у певній формі в просторі молекул води. За хімічними і фізичними властивостями вода, що входить до складу гідратної оболонки, відрізняється від чистого розчинника. Зокрема, температура замерзання її становить -40 ° С. У цій воді гірше розчиняються цукру, солі та інші речовини. Розчини білків відрізняються великою нестійкістю, і під дією різноманітних чинників, що порушують гідратацію, білки легко випадають в осад. Тому при додаванні до розчину білка будь-яких водовіднімаючих засобів (спирт, ацетон, концентровані розчини нейтральних солей лужних металів), а також під впливом фізичних факторів (нагрівання, опромінення і ін) спостерігаються дегідратація молекул білка і його випадіння в осад.
Висолювання. При додаванні розчинів солей лужних і лужноземельних металів відбувається осадження білків з розчину. Зазвичай білок не втрачає здатність розчинятися у воді знову після видалення солей методами діалізу або гельхроматографіі. Висолювання білків зазвичай користуються в клінічній практиці при аналізі білків сироватки крові та інших біологічних рідин, а також у препаративної ензимології для попереднього осадження і видалення баластних білків або виділення досліджуваного ферменту. Різні білки висаліваются з розчинів при різних концентраціях нейтральних розчинів сульфату амонію. Тому метод знайшов широке застосування в клініці для поділу глобулінів (випадають в осад при 50% насичення) і альбумінів (випадають при 100% насичення).
На величину висолювання білків чинять вплив не тільки природа і концентрація солі, але і рН середовища і температура. Вважають, що головну роль при цьому відіграє валентність іонів.
