Біохімія як наука

ФЕРМЕНТИ: СТРУКТУРА І ВЛАСТИВОСТІ.

 

Одна з основних відмінностей між живим і неживим світом полягає в тому, що постійність неживого грунтується на його хімічній незмінності, тоді як стабільність і збереження живого базується на безперервних хімічних змінах, що відбуваються в ньому.

Хімічні процеси в організмі каталізуються особливими речовинами (біокаталізаторами), що називаються ферментами, або ензимами. Вчення про ферменти – одна з найважливіших проблем сучасної біології і біохімії. Саме тому ХХ ст. називають ще століттям ферментів, бо вчення про них – це дітище цього століття. Зараз встановлено, що немає жодного процесу в організмі, який би відбувався без участі ферментів. Травлення, енергозабезпечення, побудова структурних компонентів клітин і тканин, ріст, розмноження, м’язове скорочення, згортання крові пов’язані з роботою ферментів.

Фермен­тативні процеси людина використовувала ще в глибокій давнині. Протягом тисячоліть люди випікали хліб, виготовляли сир, вина, чай, барвники, дубили шкіри. Але застосовування тут ферментативних технологій мало суто емпіричний характер. Термін фермент уперше ввів у науку голландський учений ХVІІ ст. Ван-Гельмонт для речовин, що стимулюють перетворення виноградного соку у вино.

 

При цьому відбувається виділення міхурців газу, що нагадує кипіння (з лат. fermentatio – кипіння, бродіння). Цей процес назвали ферментацією, а речовини, що його викликають – ферментами. Дещо пізніше був запропонований ще один термін – ензими (від грец. en zyme – в дріжджах).

 

Зараз обидва ці терміни вживаються як синоніми. Учення про ферменти виділилось у самостійну науку – ензимологію або ферментологію. У 30-х роках нашого століття ферменти вперше були отримані в кристалічному вигляді (Самнер). Зараз нара­ховується понад 2000 ферментів, встановлена їх природа, для деяких і структура, для багатьох – існування різних молекулярних форм-ізоферментів.

 

 

Хімічна природа ферментів

 

За хімічною природою ферменти – це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто вони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому організмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока молекулярна маса, розщеп­лення до амінокислот під час гідролізу, утворення колоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей важких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціону­ван­ню. Як і білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, ферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, уреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової (про­сте­тичної) частин. Їх називають ще голоферментами, а їх складові, відповідно, апоферментами (білкова частина) і простетичною групою, або кофактором (небілкова частина ферменту);

голофермент Þ апофермент + простетична група

 

Простетична група міцно і постійно зв’язана з апоферментом. Якщо небілкова частина ферменту зв’язана з апоферментом непостійно, тобто знаходиться в дисоційованому стані й приєднується до апоферменту тільки під час каталітичного процесу, то її називають коферментом, іноді – кофактором. Усе ж термін кофактор більше вживається в тих випадках, коли небілкова частина ферменту представлена якимось мікроелементом (металом), якому притаманна ще й функція активатора. Загалом, небілкова частина складного ферменту – низькомолекулярна і термостабільна, тоді як білкова – високомолекулярна і термолабільна. Важливо, що апофермент і кофермент проявляють ферментативні властивості тільки при поєднанні їх.

 

Апофермент у складному ферменті вказує на тип перетворень, відповідає за так звану специфічність дії ферменту. Небілкова частина голоферменту сприяє зв’язуванню ферменту з речовиною, на яку він діє (субстратом), здійснює передачу електронів, атомів, іонів з однієї речовини в іншу. Важливо, що одна і та ж небілкова речовина в одних ферментах може бути зв’язана з білковою міцно (як простетична), а в інших – слабо, і то лише під час реакції (кофермент). Наприклад, ФАД легко відщеплюється від білкової частини оксидази D-амінокислот, а з ферментами тканинного дихання він утворює міцний зв’язок.

 

Коферменти, або коензими

 

Кофермент, або коензим, бере участь у перетворенні субстрату, тоді як апофермент вказує на тип реакції. Коферментом можуть висту­пати різні за природою низькомолекулярні органічні, а також неор­га­нічні речовини (метали), що здатні зв’язуватись із субстратом і видо­змінювати його.

 

Вітаміни як коферменти

Найчастіше коферментами виступають вітаміни та їх похідні. Наприклад, пірофосфорний ефір вітаміну В₁ – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази, альфа-кетоглутаратдегідрогенази та транскетолази;

В₁ – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази

похідні вітаміну В₂ – ФМН, ФАД входять до складу оксидно-відновних ферментів. Сюди ж належать і похідні вітаміну В₅ – НАД і НАДФ.

 

 НАДН – кофермент дегідрогеназ

Коферментом переамінування та декарбоксилювання амінокислот є похідні вітаміну В₆ – піридоксальфосфат. Вітамін В₃ є основою для утво­рення коферменту А (кофермент ацилювання)

 

та пантотеїнфосфату – коферменту ацилпереносного білка синтезу жирних кислот. Вітамін В₁₀ в організмі перетворюється на кофермент ТГФК, що бере участь у перенесенні одновуглецевих фрагментів. Із вітаміну В₁₂ утворюється два коферменти – метилкобаламін та дезоксиаденозил-кобаламін, які разом із ТГФК переносять і видозмінюють одновуглецеві фрагменти під час синтезу нуклеїнових кислот у кровотворних органах.

 

Вітамін Н (біотин) утворює активний кофермент – карбоксибіотин, що бере участь у процесах карбоксилювання. Роль коферментів можуть відігравати і вітаміноподібні речовини – ліпоєва кислота, убіхінон, карнітин та інші. Перша з них входить до складу піруватдегідрогеназного комплексу і бере участь в оксидно-відновному перетворенні альфа-кетокислот. Убіхінон служить проміжним переносником електронів і Н⁺ в дихальному ланцюзі, а карнітин входить як кофермент до складу трансфераз, що переносять залишки жирних кислот через мітохонд­рі­альну мембрану.

 

Нуклеотидні коферменти

Найчастіше коферментами виступають нуклеозиддифосфати, рідше – нуклеозидмонофосфати.

 

Коферменти дегідрогеназ

У складі коферментів нуклеозиддифос­фати зв’язуються з вуглеводами, ліпідами, амінокислотами тощо. Реакції, в яких беруть участь нуклеотидні коферменти, зводяться до перетворення субстрату в молекулі коферменту. Наприклад, перетворення УДФ-глюкози в УДФ-галактозу (стереоізомеризація). Нуклеотидні коферменти можуть також виступати в ролі донорів субстратів у реакціях переносу груп. Так, УДФ-глюкоза є донором глюкози для біосинтезу глікогену, УДФ-глюкуронова кислота – донор залишку глюкуронової кислоти в реакціях кон’югації (наприклад, білірубіну). ЦДФ-холін може служити донором холіну під час біосинтезу холінфосфатидів.

 

Порфіринові коферменти

Ці коферменти за своєю структурою подібні або навіть тотожні гему в гемоглобіні. Вони містять іони металів, зокрема заліза, які можуть змінювати свою валентність (Fe⁺²  Fe⁺³) і за рахунок цього брати участь у перенесенні електронів під час окисно-відновних процесів. Порфіринові коферменти входять до складу таких ферментів, як цитохроми (b, с, а₁, а₃), каталаза, пероксидаза та ін.

 

Модель третинної структури цитохрому С. Червоним в центрі молекули показаний активний центр — комплекс заліза з органічною сполукою порфірином. Іон заліза, переходячи з двох- у трьохвалентний стан і навпаки, може віддавати і отримувати електрони.

 

Коферменти-метали або металовмісні комплекси

Значна кількість ферментів для своєї дії потребує наявності металів. У таких ферментах метали беруть участь в окисно-відновних процесах або відповідають за утворення зв’язку між ферментом і субстратом. Іноді важко з’ясувати, чи даний метал або його іон входить до складу ферменту, чи виконує тільки роль активатора ферменту. В останньому випадку фермент може каталізувати реакцію і без металу. Ферменти, що містять у своєму складі метали, без них не будуть проявляти хімічної активності. Зараз встановлено, що більш ніж 30 % із відомих ферментів є металовмісними або металозалежними. Металоферменти зустрічаються в різних класах ферментів. Іон металу може входити в активний центр ферменту або бути зв’язаним із залишками амінокислот апоферменту, що розміщені на певній відстані від активного центру. Крім участі в окисно-відновних процесах, про що сказано вище, метали сприяють формуванню вищих структур апоферменту, які також є необхідними для функ­ціонування ферменту. Ці структури стабі­лізуються шляхом утворення сольових містків між іонами металів і карбоксильними групами амінокислот. Такі функції здебільшого виконують метали постійної валентності. Наприклад, іони кальцію стабілізують альфа-амілазу, іони цинку – алкогольдегідрогеназу (при відсутності цинку остання дисоціює на субодиниці й втрачає активність). Наведемо приклади ферментів, що містять як коферменти метали:

алкогольдегідрогеназа, вугільна ангідраза                 –        цинк

аргіназа, амінопептидаза                                    –          марганець

аскорбатоксидаза                                                 –          мідь

цитохромоксидаза                                              –          мідь, залізо

ксантиноксидаза                                                    –          молібден

фосфатаза                                                               –          магній

супероксиддисмутаза                                                      –          мідь, цинк

Коферменти-фосфати вуглеводів

Коферментами можуть бути і деякі фосфати вуглеводів. Наприклад, 2,3-дифосфогліцерат є коферментом фосфогліцеромутази, що пе­ретворює під час гліколізу 3-фосфогліцерат на 2-фосфогліцерат. Для деяких ферментів роль коферменту можуть виконувати пептиди. Зокрема, трипептид глутатіон (глутамілцистеїнілгліцин), що може зна­ходитись у відновленій або окисненій формі (HS-SH- або -S-S-), виконує функцію коферменту для багатьох оксидоредуктаз, наприклад глута­тіонпероксидази.

Структурно-функціональні особливості
ферментів

 

Більшість ферментів має чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і четвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із субодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування ферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне перетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у реакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його частина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається тільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в поліпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово вони повинні бути досить зближені.

Та частина молекули ферменту, яка з’єднується із субстратом, нази­вається активним центром ферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із субстратом, утворення ферменто­субстратного комплексу і каталітичне перетворення субстрату. В активно­му центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну ділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або якірну ділянку, що зв’язує фер­мент із суб­стратом. Схема розташу­вання скла­дових компонентів актив­ного центру показана на рисунку.

За утворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає третинна структура білко­вої молекули. Отже, при по­рушенні третинної структури (дена­турація) роз’єднуються просто­рово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, фермент втрачає актив­ність. У складі активного центру простого ферменту знаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утво­рюють залишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі інші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із субстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом важлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв’язкам (водневі зв’язки, гідрофобна взаємодія).

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі як кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. Кофермент при цьому може відповідати за утворення зв’язку із субстратом, формування третинної або четвертинної структури апоферменту і каталітичне перетворення субстрату. Ферменти можуть мати 1, 2, 3 і більше активних центрів, що залежить від кількості протомерів (субодиниць), які входять у його структуру.

Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні центри (від грец. алос – інший, другий; стереос – просторовий, структурний). Алостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних чинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що взаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів. Приєднання до алостеричного центру ефектора призводить до певних структурних змін в активному центрі та, як наслідок, пригнічення або підвищення активності ферменту. Ефекторами можуть служити продукти ферментативних реакцій, гормони, медіатори нервової системи, метали. Алостеричних центрів (як і активних) фермент може мати декілька, відповідно до кількості протомерів. Важливо зазна­чити, що алостеричні й активні центри у ферментах просторово від­окремлені, тобто знаходяться один від одного на певній відстані.

 

Ізоферменти (ізоензими)

Ферменти, як і всі інші білки, характеризуються молекулярною гете­рогенністю. Зокрема, ті з них, що побудовані з декількох субодиниць, можуть існувати в різних молекулярних формах, утворюючи цілі сімейства ферментів. Такі форми зустрічаються в різних тканинах організму і навіть усередині однієї клітини. Уперше це було встановлено на екстрактах із різних тканин, які піддавались електрофорезу в крохмальному гелі з наступним фарбуванням барвниками, специфічними для якогось певного ферменту. Так було виявлено, що на електрофореграмі ферменти дають по декілька забарвлених смуг, кількість яких залежить від виду тканини. Наприклад, лактатдегідрогеназа (ЛДГ) утворювала від однієї до п’яти забарвлених смуг, залежно від виду тканини. Отже, в різних тканинах є по декілька молекулярних форм ЛДГ, які діють на один і той самий субстрат, але відрізняються між собою електрофоретичною рухомістю. Такі ферменти, що каталізують однакову реакцію і знаходяться в різних тканинах, але відрізняються між собою деякими фізико-хімічними властивостями, наприклад електрофоретичною рухомістю, молекулярною активністю, стабільністю, називаються ізоферментами, або ізоензимами. В основі цих відмінностей знаходиться генетично зумовлена різниця їх первинної структури. Але форми ферментів, що утворилися внаслідок модифікації первинної структури після завершення синтезу білка, не відносять до ізоферментів. Ізоферменти є характерними для більшості ферментів, які складаються з декількох субодиниць. Відносно добре вивчені ізоферменти лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, креатинкінази, лужної фосфатази, амінотрансфераз та ін. Розглянемо множинні ізоформи лактатдегідрогенази (ЛДГ), яка каталізує зворотну реакцію перетворення піровиноградної кислоти в молочну з участю коферменту НАД. На електрофореграмі ЛДГ виявляється 5 ізоформ, кожна з яких містить по 4 субодиниці, але двох різних типів, які умовно позначають “Н”-тип (від heart – серце) і “М”-тип (від muscle – м’яз).

Оскільки Н-субодиниці несуть більш виражений від’ємний заряд за умов електрофорезу (рН=8,4), ніж субодиниці М, вони з більшою швидкістю рухаються до анода і на фореграмі розташовуються найдалі від лінії старту. З аналогічної причини ізоферменти, що містять переважно М-протомери, рухаються з малою швидкістю в електричному полі й знаходяться біля катода. Усі інші ізоферменти, що складаються з М- і Н‑субодиниць, займають проміжні місця. Таким чином, ЛДГ має 5 ізо­форм, кожна з яких складається з таких протомерів:

ЛДГ₁=Н₄, ЛДГ₂=МН₃, ЛДГ₃=М₂Н₂, ЛДГ₄=М₃Н, ЛДГ₅=М₄.

Характерно, що кожна тканина в нормі має своє співвідношення форм, свій ізоферментний спектр ЛДГ. За типом ізоферментного спектра ЛДГ біологічні об’єкти діляться на 3 групи:

1. Із переважним вмістом у спектрі анодних, “швидких” форм (ЛДГ₁ і ЛДГ₂). Сюди відносять: серце, мозок, нирки, підшлункову залозу, еритроцити.

2. Тканини з переважанням ЛДГ₃ (легені, селезінка, лімфовузли).

3. Тканини, в яких переважають катодні, “повільні” ізоформи (печінка, скелетні м’язи).

Отже, міокард характеризується високим вмістом ЛДГ₁ і ЛДГ₂ і дуже малим вмістом “повільних” компонентів. Печінка і м’язи, навпаки, містять більше “повільних” ізоформ і зовсім мало “швидких”. Вивчення ізо­ферментного спектра широко використовується в клініці для дифе­ренціальної діагностики органічних і функціональних уражень органів і тканин, а також встановлення топографії патологічного процесу. Ізо­фер­менти відіграють важливу роль у регуляції ферментативної активності, а також у процесі розвитку і диференціації клітин.

Припускають, що не тільки ферменти, але і багато інших білків можуть існувати в клітинах у вигляді численних форм, які являють собою суміш різних субодиниць, закодованих різними генами. Величина су­марної активності ферменту в тканинах завжди визначається спів­відношенням і сумою окремих ізоформ і залежить від стану організму, вікових особливостей і сторонніх чинників, що діють на організм.

Питання біосинтезу ізоферментів з’ясовано недостатньо. Наявні дані дозволяють припустити, що він змінюється залежно від рівня метаболізму при різних станах організму. Внутрішньоклітинний синтез ізоферментів порушується при недостачі білків, що потрапляють в організм, а також вітамінів, коферментів, наявності інгібіторів тощо.

За рахунок ізоферментів обмін речовин у тканинах і органах може пристосуватися до дії мінливих внутрішніх і зовнішніх чинників. Кожна тканина має індивідуальний набір ізоферментів, який характеризує специфічність метаболізму в ній і забезпечує функціонування всіх її складових компонентів.

 

 Функціональні ферментні системи

У функціональному відношенні ферменти взаємодоповнюють дію одні одних. Хімічні сполуки іноді під час перетворень переходять через довгі ланцюги реакцій, в яких беруть участь багато ферментів. Нерідко в таких численних перетвореннях продукти першої реакції служать субстратом для наступної. Сукупність таких реакцій створює поняття про так звані метаболічні шляхи, що характеризують перетворення вуглеводів, жирних кислот, кетокислот тощо. Ферменти, що функ­ціонально пов’язані між собою при перетворенні певних субстратів і які розміщені в одних і тих самих органелах клітини, об’єднуються під поняттям функціональні ферментні системи, або надмолекулярні ферментні асоціації. Прикладом таких систем можуть бути ферменти, що беруть участь у розщепленні глюкози до піровиноградної або молочної кислоти. Сюди відносять і ферменти, що окиснюють жирні кислоти в так званому циклі Кноопа до ацетил-КоА. Кожна ланка в цих ланцюгах перетворень каталізується певним ферментом, а зв’язок між сусідніми реакціями реалізується через проміжні метаболіти.

Окремі ферментні системи асоційовані між собою не тільки функціонально, але і структурно. До них можна віднести, наприклад, поліферментний комплекс піруватдегідрогенази, що включає в себе декілька ферментів, які через декілька стадій здійснюють окиснення піровиноградної кислоти.

Подібною є і система синтезу жирних кислот, до якої входять сім структурно об’єднаних ферментів, що виконують спіль­ну функцію – синтез жирних кислот.

Деякі структурно-функціональні асоціації ферментів закріплюються на мембрані й утворюють своєрідні ланцюги, або конвеєри, ферментів, через які із метою вилучення енергії передаються “е” і “Н⁺“. Можна вважати, що поліферментні структурно-функціональні системи в клітинах досить поширені, вони виконують біологічно важливі функції і мають переваги над неасоційованими ферментами: скорочуються відстані, на які повинні переноситися метаболіти в ізольованих ферментних реакціях, вони менш енергоємні, більш чутливі до регуляторних впливів.

 

Властивості ферментів як каталізаторів

 

Ферменти мають ряд властивостей, подібних до небіологічних каталізаторів, але одночасно і відрізняються від них. Спільними для всіх видів каталізаторів є:

1. Вони пришвидшують тільки ті реакції, які можливі з точки зору термодинаміки, тобто ті процеси, що йдуть у напрямку термодинамічної рівноваги, але з малою швидкістю.

2. Вони не змінюють напрямку реакції.

3. Каталізатори збільшують швидкість наближення системи до термодинамічної рівноваги, не змінюючи при цьому точки рівноваги.

4. Відносно не змінюються після реакції, тобто вивільняються і знову можуть реагувати з наступними молекулами субстрату.

5. Усі каталізатори діють у відносно малих концентраціях.

Разом із тим, ферменти як білкові структури мають властивості, від­мінні від властивостей каталізаторів неорганічних. Що це за властивості? Для ферментів характерні: специфічність, чутливість до дії сторонніх чин­ників, залежність дії від рН і t°, ферментам, на противагу іншим каталі­заторам, притаманна значно вища каталітична активність. Розглянемо ці властивості.

 

Специфічність дії ферментів

Специфічність є характерною рисою, що відрізняє ферменти від усіх інших небіологічних каталізаторів. Так, дрібно розпушені платина, залізо чи нікель можуть виступати каталізаторами розкладу перекису водню на воду і кисень. Серед ферментів таку дію проявляє в основному каталаза. Таким чином, ферментам притаманна виражена специфічність дії. Кожен фермент діє на певний субстрат або на певну групу близьких за структурою субстратів чи на певний тип зв’язку в молекулі.

Висока специфічність дії ферментів зумовлена конформаційною й електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату і ферменту, а також особливістю структури активного центру ферменту, що забезпечує високу спорідненість із субстратом і вибірковість перебігу однієї якоїсь реакції серед багатьох інших, які здійснюються в клітині. В активному центрі є функціональні групи для зв’язування відповідного специфічного субстрату, а також компоненти, що перетворюють субстрат на продукт реакції. Таку властивість називають субстратною специфічністю ферменту. Завдяки специфічності ферменти не тільки пришвидшують перетворення субстратів, але і визначають напрямок метаболічного процесу.

Ферменти можуть проявляти відносну (групову), абсолютну та просторову, або стереоспецифічність. Ферментами з відносною спе­цифічністю можуть служити фосфатази, ліпази, протеази та ін. Так, фос­фатази здатні гідролізувати різні фосфороорганічні сполуки, наприклад бета-гліцерофосфат, глюкозо-6-фосфат, холінфосфат; ліпаза розщеплює різні жири тваринного і рослинного походження; протеази (пепсин, трипсин та ін.) також гідролітично розщеплюють пептидні зв’язки в білкових молекулах.

 

Відносна специфічність властива переважно ферментам травної системи, що має важливе біологічне значення, бо економить засоби впливу на субстрати. Спільним для розглянутих вище ферментів є їх дія на однакові зв’язки певної групи субстратів.

Велика кількість ферментів характеризується абсолютною спе­цифічністю, тобто здатністю перетворювати тільки якийсь один субстрат. Прикладом таких ферментів може служити фермент уреаза, що каталізує перетворення сечовини, але не впливає на метилсечовину; фермент аргіназа перетворює аргінін, але не діє на метиларгінін; сукцинат­дегідрогеназа окиснює сукцинат, але не діє на малеат.

Усій групі ферментів притаманна стереоспецифічність, тобто здатність впливати на один якийсь із стереоізомерів, наприклад на D- або L-ізомер. Так, ферменти, що каталізують перетворення вуглеводів, діють тільки на D-ізомери, але не впливають на L-ізомери; фермент фумараза каталізує перетворення фумарової кислоти, яка є транс-ізомером, але не діє на цис-ізомер – малеїнову кислоту.

 

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості реакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q₁₀, що вказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. Для хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина цього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі при зростанні температури на 10 °С. Однак для фермен­тативних процесів така законо­мір­ність існує тільки в діапазоні низьких температур – до 50-60 °С. Вище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження активності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С. Су­марна швидкість ферментативної реакції при зміні температури сере­довища являє собою результуючу від складання двох швидкостей – зро­стання швидкості у відповідь на підвищення температури і зниження швидкості як функції денатурації білка-ферменту. Сумація цих двох швид­костей для більшості ферментів теплокровних істот дає найбільше значення швидкості при температурі 37-40 °С.

Температура, при якій швидкість ферментативної реак­ції максимальна, називається тем­пературним оптимумом. Треба мати на увазі, що його величина буде зале­жати і від тривалості дії температури на фермент. Так, фермент може переносити високу температуру протягом короткого часу і в цей період активність його значно підвищиться. Але тривале перебування ферменту при високій температурі призводить до його денатурації і зниження активності.

Низькі температури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення ферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) відновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. Охолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в них мета­болічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

Температурний оптимум 37-40 °С для більшості ферментів тепло­кровних тварин і людини, очевидно, створює найкращі умови для існування структурної й електростатичної спорідненості між активним центром ферменту та субстратом, необхідним для їх взаємодії. Однак зустрічаються ферменти, що не руйнуються при значно вищих температурах і зберігають ферментативну активність. Так, лужна фосфатаза печінки стабільна при температурі 50 °С, а фермент м’язів міокіназа витримує навіть +100 °С. На активність ферментів впливають ще такі чинники, як концентрація субстрату, рН середовища тощо.

 

 Залежність активності ферментів від рН середовища

Якщо активність ферментів визначати при різних значення рН, то графік залежності матиме вигляд куполоподібної кривої, крива може бути симетрична, з однаковим підйомом і спуском у кислому і лужному середовищах, або йти на зниження в якійсь одній ділянці.

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом ферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для більшості з них знаходиться в межах рН 6‑8. Ряд внутрішньоклітинних фермен­тів найкраще функціонує у нейтраль­ному середовищі. Разом із тим, для ферментів шлунково-киш­кового тракту рН‑оптимум може знаходитись у зоні від нейтрального до сильно кислого і лужного сере­довищ. Так, пепсин має оптимум рН 1,5‑2,5, трипсин – рН 8,0-9,0. Для виявлення залежності активності ферменту від концентрації водневих іонів експерименти проводять при оптимальній температурі, достатньо високих концентраціях субстрату, але при різних значеннях рН.

Чутливість активності ферментів до зміни рН середовища, очевидно, пов’язана з тим, що фермент, залежно від середовища, може знаходитись в іонізованій або неіонізованій формі, що буде обов’язково від­ображатися на третинній структурі білка, зокре­ма при формуванні активного цент­ру та утворенні фермент-субстрат­ного комплексу. Безумовно, різне зна­чення рН буде по-різному впли­вати і на стан іонізації кофакторів та субстратів. Можна ствер­джувати, що саме при рН-оптимумі між суб­стратом і ферментом існує найкра­ща про­сторова та електро­статична компле­ментарність, яка забезпечує їх зв’язування, утво­рення фер­мент-субстратного комп­лексу і подальше перетворення його. На рис. показана графічна залежність активності ферментів від рН сере­довища.

 

Механізми та особливості перебігу
ферментативних реакцій

 Енергетичні особливості ферментативних реакцій

Чому під впливом ферментів зростає швидкість реакцій?

Для того, щоб відбувалася реакція, реагуючі молекули повинні мати певний запас енергії.

Ферменти, як і інші каталізатори, прискорюють тільки ті реакції, які термодинамічно можливі, тобто ті, що відбуваються самовільно, але з малою швидкістю. Можливість перебігу хімічної реакції визначається різницею між вільною енергією початкових речовин і продуктів реакції. Якщо вільна енергія продуктів реакції менша, ніж початкових речовин, тобто відбувалося розсіювання енергії, то реакція перебігає самовільно – вона термодинамічно можлива. У випадку переважання вільної енергії продуктів реакції над вихідними речовинами реакція енергетично стає неможливою (це так звана ендергонічна реакція). Вона може здійснюватись тільки за умов надходження зовніш­ньої енергії в кількості, більшій за енергію утворюваних продуктів.

Швидкість будь-якої реакції залежить від величини енерге­тичного бар’єру, який необхідно подолати реагуючим молекулам, але для різних реакцій величина цього бар’єру неоднакова. У зви­чайних умовах (при відсутності каталізатора, ферменту або при низьких температурах) є дуже мала кількість молекул, здатних перемагати цей бар’єр і вступати в реакцію. Отже, без каталізаторів та при низьких тем­пературах швидкість реакцій буде низькою.

Здатність молекул вступати в хімічну реакцію визначається енергією активації, яка затрачається на перемагання сил відштовхування, що виникають між електронними хмаринками взаємодіючих молекул. Інакше кажучи, енергія активації витрачається на утворення проміжного комплексу між реагуючими молекулами.

 

Механізм ферментативних реакцій

За всю історію вчення про ферменти було запропоновано багато гіпотез, що пояснювали механізм їх дії. Більшість із них має суто історичний характер і не витримала випробувань у світлі нових даних про структуру ферментів та їх активного й алостеричного центрів. Заслуговує уваги гіпотеза, запропонована на початку ХХ ст. Варбургом і Бейлісом. Її значення полягає в тому, що вона пов’язувала механізм дії ферментів із дією неорганічних каталізаторів. Ця гіпотеза пояснювала, що поверхня ферменту служить місцем для адсорбції реагентів. За цих умов різко зростає кількість молекул субстрату, що припадає на одиницю площі ферменту, а отже, за законом діючих мас зростає і швидкість реакції. Також припускалось, що в результаті зв’язування субстрату з активним центром ферменту відбуваються механічні зміни молекул субстрату, що призводить до більшої реакційної здатності. Але адсорбційна гіпотеза не могла пояснити специфічності дії ферментів, тому вона не використовується.

Для пояснення специфічності дії ферментів у 1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою “ключа і замка” або гіпотезою “шаблону”.

 

В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо субстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру ферменту (замок), то реакція не відбувається.

 

Але і ця гіпотеза (її ще називають гіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко уявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного замка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою вимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до субстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного центру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат індукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими словами, “замкова щілина”, за Кошлендом, виготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми “ключа” при контакті з ними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного центру, при яких він утворює із суб­стратом неактивний комплекс, і тоді реакція не відбувається. На рис. представлені зміни структури активного центру ферменту, що можуть викликатись субстра­том (за Кошлендом):

Значну роль у вивченні механізму взаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, опубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з гіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується утворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу. Процес утворення комплексу описується рівнянням і перебігає у декілька стадій, кожна з яких має свої особливості:

1 стадія – зв’язування субстрату з активним центром ферменту, тобто утворення ферментосубстратного комплексу (ES);

2 стадія – перетворення первинного ферментосубстратного ком­плексу в один або декілька активних ферментосубстратних комплексів (ЕS^x i ES^xx);

3 стадія – відокремлення продуктів реакції від активного центру ферменту і вивільнення ферменту та продукту (Е і Р).

1-а стадія за тривалістю найкоротша: вона проходить майже миттєво. За цей час субстрат орієнтується навколо активного центру й утворює з ним короткоіснуючу, неміцну проміжну сполуку. На 2-й стадії, яка перебігає найповільніше, відбуваються розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення нових із каталітичним центром ферменту. Зни­жується енергія активації субстрату, що зумовлює зростання швидкості його перетворення. 3-я стадія за тривалістю наближається до 1‑ї, і швидкість її перебігу залежить від дифузії продукту в середовище. На рис. 2.10 представлена схема утворення проміжного ферментосубстратного комплексу.

Достовірність утворення ферментосубстратного комплексу, посту­льованого вперше Міхаелісом, зараз доведена експериментально, математично методами ЕПР і ЯМР. Перші докази існування ферменто­субстратного комплексу були одержані в лабораторії Кейліна і Чанса. Сучасні методи дослідження дозволяють визначити для ряду фер­ментативних реакцій константи швидкості утворення ферментосуб­стратних комплексів та їх дисоціації на фермент і продукти.

Встановлено, що в утворенні ферментосубстратних комплексів беруть участь водневі зв’язки, електростатичні та гідрофобні взаємодії. До­сліджуючи рівняння Міхаеліса-Ментен, можна також вивчити кінетику ферментативних реакцій, встановити порядок реакції та стежити за впли­вом різних чинників на перебіг ферментативного процесу. В за­гальному, прискорення хімічних реакцій відбувається завдяки тому, що ферменти забезпечують правильну орієнтацію молекули субстрату біля каталітичного центру, надають для каталізу протон-донорні і протон-акцепторні групи, утворюють за допомогою ковалентних зв’язків не­стабільні проміжні сполуки із субстратом і викликають напруження в молекулі субстрату або її деформацію.