Обладнання клінічних лабораторій
Клінічні лабораторії, розташовані в будівлях поліклінік і оснащені за останнім словом техніки з високим рівнем професіоналізму, що робить можливим початкове обстеження і подальше спостереження пацієнтів з будь-якими захворюваннями. У клінічній лабораторії проводяться всі можливі варіанти аналізів призначені лікарем, у зв’язку з хворобою і в повній відповідності з побажаннями пацієнта. При необхідності, повне обстеження може бути вироблено з максимальною швидкістю і без втрати якостей всього за пару годин.
Після проходження аналізів, прямо в лабораторії пацієнт може отримати короткий опис стану та консультацію за методами подальшого лікування або профілактики.
У клінічній лабораторії налічується кілька головних напрямків обстежень: біохімія; коагулологія; бактеріологія; гематологія; загальні дослідження; гормонологія; ІПСШ (інфекції передаються статевим шляхом).
Біохімія
Це напрям займається дослідженням речовин органічного і не органічного походження, протіканням біохімічних процесів в рідинах людського організму та їх патологій.
Гематологія
Гематологія займається дослідженням крові, клітин та їх патологій. До гематології мають відношення і загальні дослідження – розгляд стану клітин в біологічних рідинах організму та їх патологій. У клінічній лабораторії проводиться загальний аналіз стану крові. За результатами визначають кількість у крові еритроцитів, тромбоцитів, ретикулоцитів. Встановлюють лейкоцитарну формулу. З’ясовують рівень електролітів у крові. У лабораторних умовах кожен показник може бути виявлений і розглянуто окремо.
Коагулологія
Займається процесами згортання і їх патологічними порушеннями. Для аналізу згортання розглядають складові системи гемостазу.
Необхідними в такому випадку є такі процедури: електрокоагулограмма; гемокоагулограмма; визначення часу згортання крові; фібриноген; протромбін.
Бактеріологія
Дана галузь займається вивченням бактерій в біологічних рідинах людини. Клінічна лабораторія проводить тести на мікрофлору біологічних рідин: кров, сеча, грудне молоко, сперма. При дослідженні мікрофлори стає можливим виявити мікроорганізми, що викликають патогенні впливу на організм, визначити їх у кількісному еквіваленті.
Гормонологія
Включає в себе діагностику всіх типів гормонів і пухлинних маркерів.
Клінічна лабораторія проводить оцінку діяльності щитовидної залози. Для постановки діагнозу захворювання, проводять визначення тіреодних панелі.
Клінічна лабораторія дає можливість обстеження пацієнтів з проблемою безпліддя і репродуктивної функції організму.
Серологія та діагностика ІПСШ
У клінічній лабораторії можливе виявлення ІПСШ – інфекцій що передаються статевим шляхом. Найпоширеніші з них – хламідіоз, герпес другого типу, гонорея, кандидоз, сифіліс, мікоплазмоз.
1. Спектрофотометрія
Спектрофотометрія – метод дослідження і аналізу речовин, заснований на вимірюванні спектрів поглинання в оптичній області електромагнітного випромінювання. Даний метод є основою багатьох приладів, що використовуються в клінічній лабораторії.
Основна залежність, яка вивчалася в спектрофотометрії – залежність інтенсивності поглинання падаючого світла від довжини хвилі.
Основний принцип спектрофотометричного вимірювання полягає в наступному: якщо розглядати належним чином обрану і досить вузьку смугу електромагнітного спектра, то поглинаючі властивості аналізованого речовини можна використовувати для визначення його концентрації. У переважній більшості випадків ці речовини в тому вигляді, про який вони в нормі присутні в отриманих від пацієнтів зразках (наприклад, в сироватці крові, в сечі, або в спинномозковій рідини), не мають необхідних характеристик поглинання електромагнітної енергії. У подібних випадках у зразки додаються peaгенти, що викликають протікання хімічної реакції. Ця реакція дасть продукт, який вже має необхідні характеристики. Далі продукти реакції поміщують в кювету для аналізу. Процедури калібрування приладу забезпечують облік можливої різниці між концентрацією продукту реакції і вихідною кількістю аналізованої речовини.
Рис. 1. Оптична схема спектрофотометра
1. Джерело світла.
2. Випускаюча щілина.
3. Відображаюче дзеркало.
4. Дифракційна решітка.
5. Відображаюче дзеркало.
6. Відсікаюча щілина.
7. Лінза.
8. Кювета з пробою.
9. Кремнієвий фотодетектор.
Інтерференція світлових хвиль
Інтерференція – додавання в просторі двох (або кількох) хвиль, при якому в різних його точках виходить посилення або ослаблення амплітуди результуючої хвилі.
Стійку інтерференційну картину дають тільки когерентні хвилі.
Когерентні хвилі – це хвилі, що мають однакові частоти, постійну різницю фаз, а коливання відбуваються в одній площині.
Рис. 2. Накладання світлових хвиль (інтерференція)
Нехай в точку А прийшли дві хвилі однакової частоти, що пройшли перед цим різні відстані і від своїх джерел.
Амплітуда результуючого коливання залежить від величини, що називається різницею ходу хвиль.
– різниця ходу, – шлях хвиль, – оптична різниця ходу; – показник заломлення середовищ.
Якщо різниця ходу дорівнює цілому числу хвиль, то хвилі приходять в точку синфазно. Складаючись, хвилі підсилюють одна одну і дають коливання з подвоєною амплітудою.
Умова максимуму
,
– довжина хвилі, – любе ціле число
Якщо різниця ходу дорівнює непарному числу півхвиль, то хвилі приходять в точку А в проти-фазі. У цьому випадку вони гасять один одного, амплітуда результуючого коливання дорівнює нулю.
Умова мінімуму
,
– нечітке число
В інших точках простору спостерігається часткове підсилення або послаблення результуючої хвилі.
Дифракція на відбиваючій дифракційній решітці
Майже у всіх спектральних дослідженнях використовується дифракція при відбитті. Дію відбиваючої решітки можна легко зрозуміти, розглянувши інтерференцію деяких плоских хвиль, які були відбиті на гранях штрихів решітки.
Рис. 3. Явище відбивання світлових хвиль на дифракційній решітці
Нехай грані штрихів решітки складаються з площиною решітки кут , відстань між штрихами , ширина грані . На решітку падає світло в направленні 1, складаючи з нормаллю до площини решітки кут і відбивається в направленні 2, складаючи з нормаллю кут .
Як видно з рисунка, геометрична різниця ходу між пучками, дифрагуючим від сусідніх штрихів, рівна: . Положення головних максимумів для відбиваючої решітки знаходиться формулою . При нормальному падінні променів на решітку і умова максимумів для відбиваючої решітки має вигляд . У випадку відбиваючої нейрофільованої решітки енергетичне розприділення світла має головний максимум нульового порядку при куті , рівному куту дзеркального відбивання . Якщо відбиваюча дифракційна решітка має профільовані штрихи , то головний максимум виникає при . Цей кут відповідає дзеркальному відображенню від грані штриха (кут блиску).
Отже, залежно від кута нахилу штрихів і відстаней між ними дифракційна решітка може видавати різну кількість порядків спектрів.
Закон Бугера – Ламберта – Бера
При проходженні випромінювання через розчин світло-поглинаючої речовини потік випромінювання послаблюється тим сильніше, чим більше енергії поглинають частки даної речовини. Пониження інтенсивності залежить від концентрації поглинаючої речовини і довжини шляху, прохідного потоком. Ця залежність виражається законом Бугера – Ламберта – Бера.
Щоб врахувати втрати світла, що пройшло через розчин, на відбиток і розсіювання, порівнюють інтенсивності світла, що пройшло через досліджуваний розчин і розчинник.
При однаковій товщині шару в кюветах з одного матеріалу, що містять один і той же розчинник, втрати на відбиття і розсіювання світла будуть приблизно однакові у обох пучків світла, і зменшення інтенсивності залежатиме від концентрації речовини.
Рис. 4. Проходження світла через досліджувану рідину
Відношення інтенсивності падаючого і вихідного потоків світла називають пропусканням або коефіцієнтом пропускання:
де – інтенсивність падаючого світла, – інтенсивність потоку світла, що пройшов через розчин.
Пропускання виражають в процентах. Для абсолютно прозорих розчинів , для абсолютно непрозорих . Взятий з оберненим знаком логарифм називають оптичною щільністю :
Для абсолютно прозорого розчину , для абсолютно непрозорого .
Зменшення інтенсивності випромінювання при проходженні його через розчин підпорядковується закону Бугера – Ламберта – Бера:
або або
де – молярний коефіцієнт поглинання; – товщина поглинаючого слою (см.); – концентрація розчину (моль / л).
Молярний коефіцієнт поглинання – індивідуальна характеристика речовини, він залежить від природи речовини і довжини хвилі і не залежить від концентрації і довжини кювети.
Значення відображає здатність речовини поглинати світло. Ця здатність не безмежна і визначається будовою молекули; максимально можливе значення складає ~ 105 л · см -1 · моль -1.
Спектрофотометр
Спектрофотометр призначений для вимірювання коефіцієнта пропускання і оптичної щільності рідин (у тому числі біологічних) з метою визначення концентрації розчинених у них компонентів, а також вимірювання коефіцієнта пропускання і оптичної щільності твердих і рідких проб різного походження. Застосовується в еколого-аналітичних та санітарно-епідеміологічних лабораторіях медичних установ, а також хімічних, оптичних, біологічних лабораторіях промислових підприємств, наукових та навчальних інститутів.
Спектрометр складається з чотирьох основних частин:
1. Галогенної або дейтерієвої лампи як джерела світла.
2. Монохроматора для відділення необхідної довжини хвилі і видалення небажаного опромінення другого порядку.
3. Кюветне відділення для поміщення досліджуваного взірця.
4. Детектор для реєстрації пропущеного світла і його перетворення в електричний сигнал та відображення на екрані.
Рис. 5. Основні частини спектрофотометра
На рис. 5 представлена блок-схема приладу спектрофотометричного типу. Джерело видає потік променевої енергії, що використовується для аналізу зразка. Монохроматор пропускає енергію в обмеженій смузі частот. Кювета, що містить аналізований зразок, розташовується на шляху енергетичного променя. Детектор видає електричний сигнал, пропорційний кількості отриманої ним енергії, а індикатор показує чисельну величину прийнятого енергетичного потоку або деякої функції від нього (наприклад, концентрації аналізуючої речовини у зразку).
Джерела випромінювання. Водневі або дейтерієві газорозрядні лампи використовуються для одержання енергетичного потоку в діапазоні 200-360 нм. лампи розжарювання з вольфрамовою ниткою використовуються в діапазоні 360-800 нм. Як водневі, так і дейтерієві лампи мають безперервний спектр випромінювання, але проблема у використанні цих джерел полягає в тому. що 90% випромінюваної енергії припадає на інфрачервоний діапазон. Інтенсивність використовувати у видимому та ультрафіолетовому діапазонах можна збільшити, якщо не користуватися лампи під напругою, що перевищує номінальне значення, але такий підхід суттєво скорочує термін служби лампи Інша проблема, пов’язана з використанням вольфрамових ламп, полягає в тому, що в процесі роботи вольфрам поступово випаровується з нитки розжарювання і конденсується на скляній колбі лампи Цей шар, який зазвичай осідає нерівномірно, змінює спектральні характеристики лампи, що може призвести до помилок у вимірах.
Монохроматори – це пристрої, в яких використовуються призми і дифракційні решітки. Вони видають дуже вузьку смугу частот з регульованим значенням центральної (номінальної) частоти. Основним принципом роботи цих пристроїв є просторове розкладання вхідного світлового пучка залежно від довжини хвилі. Далі використовується механічне пристосування, що дозволяє світлу в необхідній смузі частот проходити через щілину.
Призми виготовляються зі скла або кварцу. Кварцові призми необхідні при роботі на довжинах хвиль коротше 350 нм. Система лінз направляє світловий пучок від джерела на вхідну щілину. Призма відхиляє світловий промінь на кут, який є функцією довжини хвилі. Світло з найбільш короткою довжиною хвилі (ультрафіолет) відхиляється найсильніше. Таким чином виходить вихідний пучок, в якому необхідна смуга частот може бути виділена за допомогою непрозорого екрану з вузькою щілиною, встановленого на шляху випромінювання. Спектр довжин хвиль для пучка, що пройшов через щілину, має номінальну трикутну форму. Для призм, як і для фільтрів, частота (довжина хвилі), на якій спостерігається максимум пропускання, називається номінальною (центральною) частотою (довжиною хвилі). За допомогою пристроїв даного типу можна отримати ширину смуги в 0.5 нм. Призми використовуються в діапазоні довжин хвиль 220-950 нм. Нелінійний характер просторового розподілу енергетичного потоку, породжуваного призмою, вимагає досить складних механічних пристроїв для керування положенням щілини при виборі різних номіналів довжини хвилі.
Дифракційні решітки робляться шляхом нанесення великої кількості близько розташованих паралельних ліній на скло або метал. Дифракційна решітка використовує явище відхилення світлових променів на гострих кутах (дифракція). Ступінь відхилення є функцією довжини хвилі. Це призводить до розкладу світла в спектр на кожній лінії. У міру руху і взаємодії цих хвильових фронтів спостерігається їх взаємне посилення або придушення (інтерференція). Просторовий дозвіл світлового пучка по довжинах хвиль, отриманий за допомогою дифракційної решітки, має лінійний характер – на відміну від призми, для якої із збільшенням довжини хвилі просторовий дозвіл зменшується. Як і для призми, при виборі необхідної смуги частот використовується щілина. Механіка пристрою, керуючого становищем щілини, менш складна, ніж у випадку призового монохроматора, внаслідок лінійності просторового дозволу по довжині хвилі. Дифракційні решітки можуть видавати ширину смуги до 0.5 нм і використовуються в діапазоні довжин хвиль 200 – 800 нм.
Кювета. Кювета (рис. 5) містить аналізовану речовину. Її оптичні властивості повинні бути такі, щоб вона не вносила істотних викривлень у спектральні характеристики світла, що через неї проходить. Ретельність і, відповідно, вартість її виготовлення залежать від запланованого рівня загальної точності та надійності спектрофотометра.
Зразок. «Зразок» (у більшості випадків так називають речовину, утворену в результаті взаємодії вихідного біологічного зразка з відповідними реактивами) селективно поглинає світло відповідно до законів Ламберта, Бугера. Бунзена, Роско і Бера.
Спектрофотометр зроблений так, щоб зберігати значення та якомога більш постійними, так що в кожному конкретному випадку величина залежить від . Відповідно невідома концентрація речовини може бути визначена наступним чином. Спочатку знаходиться невідома речовина поглинання , для стандартного зразка, що містить відому концентрацію аналізованого речовини . Далі визначається поглинання , для зразка з невідомою концентрацією аналізованого речовини. Нарешті, невідома величина концентрації аналізованого речовини обчислюється за такою формулою:
На рисунку 6 представлений опис спектрофометра модель 101.
Рис. 6. Опис зовнішнього вигляду спектрофометра
1. Кришка кюветного відділення.
2. Кюветне відділення с кювето-тримачем.
3. Ручка переключення кювето-тримача.
4. Панель управління.
5. Ручка регулювання довжини хвилі.
6. USB порт.
7. Паралельний порт.
8. Кришка вентилятора.
9. Розьєм для кабеля електроживлення.
10. Виключатель електроживлення.
(а)
(б)
Рис. 7. Вигляд лампи, що є джерелом світла (а) та цифрове табло спектрофотометра (б)
Зовнішній вигляд панелі управління представлений на рисунку 7, де 1) Клавіші; 2) ЖК екран.
– (режим) перехід в фотометричний режим
– (ввід) підтвердження / друк
– збільшити значення / встановити 0
– збільшити значення / встановити на 100 % T.
2. Полум’яні фотометри
Полум’яна фотометрія є одним з варіантів емісійного спектрального аналізу і заснована на вимірюванні інтенсивності світла, випромінюваного порушеними частками (атомами або молекулами) при введенні речовини в полум’я пальника.
Полум’яні фотометри використовуються для визначення концентрацій лужних, лужноземельних металів в розчинах, питних, мінеральних, стічних водах, винах, напитках, біологічних речовинах, фармпрепаратах. Прилад широко використовується у медичних, біологічних та навчальних лабораторіях.
Полум’яні фотометри мають три важливі відмінності від приладу, обговореного вище. По-перше, функції джерела енергії та пристрою, що містить зразок, поміщений в полум’я. По-друге, у більшості програм полум’яної фотометрії метою є вимірювання випромінювання світла зразком, а не поглинання ним світла, хоча ми і будемо також обговорювати полум’яні фотометри атомно-абсорбційного типу. По-третє, вогняні фотометри можуть визначати тільки концентрації чистих металів.
При звичайному рівні потужності, використовуваному в полум’яних фотометрах, тільки близько 1% атомів переходить в збуджений стан. Крім того, лише деякі елементи видають достатню потужність випромінювання на одній довжині хвилі при переходах з високоенергетичних на низькоенергетичні орбіталі. Ці два фактори обмежують застосування атомно-емісійної полум’яної фотометрії визначенням, в основному, іонів , та . Розроблено прилади, які можуть здійснювати визначення інших елементів, таких як але для них потрібна значно складніша оптична схема.
У таблиці нижче наведені детальні відомості про виміри атомних викидів полум’я лужних, лужноземельних металів з точки зору довжини хвилі випромінювання і кольору.
Таблиця 1
|
Елементи |
Довжина хвилі випромінювання (нм) |
Колір полум’я |
|
Натрій |
589 |
Жовтий |
|
Калій |
766 |
Фіолетовий |
|
Багрій |
554 |
Зелений лайм |
|
Кальцій |
622* |
Оранжевий |
|
Літій |
670 |
Червоний |
*Кальцій вимірюється за допомогою випромінювання діапазону гідроксиду кальцію 622 нм в якості основного кальцію атомній емісії, що відбувається при 423 нм.
Простий полум’яний фотометр складається з наступних основних компонентів:
1. Полум’я, яке може підтримуватися в постійному вигляді і при постійній температурі: – “Пальник”.
2. Засоби транспортування гомогенного розчину в полум’я з постійною швидкістю: – “Розпилювач* і камера змішувача”.
3. Засіб ізоляції світла з довжиною хвилі, що вимірюється від сторонніх викидів: – “Прості кольорові фільтри” (тип перешкоди).
4. Засіб вимірювання інтенсивності випромінювання полум’я: – “Фото Детектор”.
Рисунок 8 показує послідовне розташування основних компонентів.
Рис. 8. Основні частини полум’яного фотометра
Проста оптична схема, що включає тільки фільтр і лінзу, фокусуючи відфільтрований світловий промінь на детекторі, зазвичай використовується при визначенні та . Для інших вимірів потрібна більш складна оптична схема, що включає монохроматор.
Детальна будова полум’яного фотометра представлена на рисунку 9.
Рис. 9. Полум’яний фотометр
1 – компресор; 2 – склянка з аналізованим розчином; 3 – розпилювач; 4 – вентиль, регулюючий подачу газу; 5 – манометр; 6 – промивалка; 7 – пальник; 8 – увігнуте дзеркало; 9 – лінза; 10 – світлофільтр (монохроматор) ; 11 – фотоелемент (фотоелектронний помножувач); 12 – підсилювач; 13 – стрілочний гальванометр.
Як показано на рис. 9, зразок разом з розчинником подається в розпилювач, що перетворює рідину в тонко дисперсний аерозоль, який вводиться в полум’я. У полум’яних фотометрах використовується кілька типів палива. В даний час зазвичай використовується суміш пропану або природного газу зі стисненим повітрям. Розчинник випаровується в полум’ї, залишаючи мікроскопічні частинки зразка. Ці частинки розпадаються на атоми. Як вже було відмічено, лише невелика частина цих атомів переходить в збуджений стан. Коли атоми повертаються в основний стан, вони випускають енергію у вигляді електромагнітних хвиль на характеристичних частотах.
Багато сучасних атомно-емісійних полум’яні фотометрів розраховані на використання внутрішнього стандарту, призначеного для компенсації відхилень у швидкості подачі розчину, ефективності освіти аерозолю і в характеристиках полум’я. Для цієї мети використовуються іони літію (). Ці іони в нормі відсутні в біологічних зразках, мають високу інтенсивність випромінювання, а їх лінія випускання значно відрізняється по довжині хвилі від ліній натрію і калію. У зразок додається точно відведені кількість солі . Окремий оптичний канал надається для вимірювання інтенсивності випромінювання , і ця величина, разом з відомим значенням концентрації використовується для введення поправки, що компенсує приладові відхилення, у визначення та . У дійсності, в більшості випадків визначення , та , здійснюється паралельно.
При використанні в якості внутрішнього стандарту виникають деякі проблеми. По-перше, хоча компенсація невеликих відхилень у характеристиках приладу і можлива, не вдається компенсувати великі відхилення. По-друге солі все частіше використовуються для терапії важливого психічного розладу – маніакально-депресивного психозу. Якщо пацієнти, які отримували солі спеціально не ідентифіковані в клінічній лабораторії, то визначення та може бути пов’язане з великими помилками. На жаль, в клінічну лабораторію рідко повідомляється будь-яка інформація про пацієнтів, яку можна використовувати для забезпечення надійності вимірювань.
Приклади сучасних полум’яних фотометрів представлені на рисунку 10.
(а)
(б)
Рис. 10. Сучасні приклади полум’яних фотометрів:
а) Cole–Parmer 2655-00/10/15; б) Jenway PFP-7
3. Флуориметрія
Флуориметрія – метод фотометричного аналізу, заснований на вимірюванні інтенсивності вторинного випромінювання, що виникає в результаті взаємодії променевої енергії з визначальною речовиною. Одним із завдань люмінесцентного аналізу є визначення хімічного складу і структури речовин на підставі результатів вивчення їх люмінесцентних характеристик.
Флуоресценцію визначають зазвичай в розчинах з концентрацією речовини, що не перевищує 10-4 – 10-6 г / мл. Збільшення концентрації флуоресціюючого речовини призводить до зменшення або повного зникнення флуоресценції (так зване концентраційне гасіння флуоресценції). При підвищенні температури також зазвичай зменшується інтенсивність флуоресценції.
Фізичний ефект флуоресценції полягає в тому, що молекула досліджуваної речовини поглинає квант світла збудження і при цьому переходить у новий, енергетично більш багатий стан, через деякий мікропроміжок часу вона випромінює надлишкову енергію у вигляді кванта світла флуоресценції (емісії).
Рис. 11. Схема механізма спонтанної флуоресценції
На рисунку 11 представлена схема двох енергетичних електронних рівнів молекули або іона – основного (незбудженого) Ео і першого збудженого Е1. Кожен з цих енергетичних рівнів має систему коливальних (що сходяться) підрівнів з коливальними квантовими числами v”=0; 1; 2; …; – Основного електронного стану та v‘=0; 1; 2; …; – Першого збудженого стану. Якщо молекула (або іон) знаходится в газоподібному стані, то шкірному коливальному рівню відповідає система обертальніх (розбіжніх) підрівнів. Однак оскільки в аналітиці використовують переважно флуоресценцію молекул або іонів в розчин, коли їх вільне обертаном, як правило, придушенням внаслідок взаємодії з оточуючімі частинками, то обертальні підрівні в схемі на рис.11 не приймаються до уваги. При звичайних температурах молекули и іони знаходяться в основному (не збудженому) стані, коли v”=0. При поглинанні частко (молекул або іоном) кванта електромагнітної енергії Еabc=hvabc, где h – постійна Планка, vabc – частота поглиненого світла, частка збільшує свою енергію (збуджується) і переходить у верхнє електронно-коливальний стан Е1 – на деякий коливальний рівень з коливальним квантовим числом v‘, наприклад, на рівень v‘=3, як показано на рис.11, тобто здійснюється енергетичний перехід v”=0 → v‘=3.
Флуоресценція знайшла застосування в аналітичній практиці для ідентифікації речовин за кольором люмінесцирующего випромінювання і для кількісного аналізу за визначенням інтенсивності флуоресценції. У таблиці 2 наведені величини довжин хвиль максимумів збудливого світла і флюоресценції для деяких фармацевтичних препаратів.
Таблиця 2
Максимуми флуоресценції деяких фармацевтичних препаратів
|
Препарат
|
λmax |
Препарат |
λmax |
||
|
збудження |
флуорисцен–сія |
збудження |
Флуорисцен–сія |
||
|
Адреналін |
410 |
520 |
Новокаинамид |
295 |
385 |
|
Акрихін |
285, 420 |
500 |
Норадреналин |
395 |
505 |
|
Аміназин |
350 |
480 |
Окситетрациклін |
390 |
520 |
|
Гамма–аміномасляна кислота |
375 |
485 |
Рибофлавін |
450 |
535 |
|
n-аминосаліцилова кислота |
300 |
405
|
Саліцилова кислота |
310
|
435
|
|
Амітал |
265 |
410 |
Тетрациклін |
390 |
515 |
|
Вітамін А |
325, 327 |
470, 510 |
Тіамін |
365 |
450 |
|
Вітамін Д2 |
390 |
480 |
Тіопентал |
315 |
530 |
|
Вітамін Д3 |
390 |
480 |
Фенобарбитал |
300 |
440 |
|
Гармін |
300, 365 |
400 |
Физостигмин |
300 |
360 |
|
Гризеофульвін
|
295, 335 |
450 |
Фолієва кислота |
290 |
450 |
|
Діэтилстильбэстрол |
410 |
510 |
Хлортетрациклін |
355 |
445 |
|
Менадіон |
335 |
410 |
Хинідин |
250, 350 |
450 |
|
Этамінал |
265 |
440 |
Хинін |
350 |
450 |
Флуориметр
Використовується при виконанні фотометричного, флуориметричного і хемілюмінесцентного методу вимірювання масової концентрації органічних і неорганічних речовин, а також аналізу фармацевтичних препаратів.
В основі флуометричних вимірювань лежить той факт, що деякі молекули випромінюють світло характеристичного спектру (спектр випускання) негайно після поглинання ними електромагнітної енергії і переходу в збуджений стан (явище флуоресценції). Ступінь, до якої молекули збуджуються, залежить від амплітуди і довжини хвилі променевої енергії в спектрі збудження. У цьому процесі невелика частина енергії втрачається, що призводить до того, що спектр випускання в цілому лежить у більш довгохвильовій області, ніж спектр збудження.
Кожен флуориметр або спектро-флуориметр містить три основні блоки (рисунок 12):
1) Джерело світла для порушення флуоресценції зразка.
2) Тримач зразка (Кювета).
3) Детектор для спостереження або вимірювання флуоресценції.
Рис. 12. Основні частини флуориметра
Під флуориметром різної чутливості використовуються різноманітні джерела випромінювання, хвильові селектори та реєструючі схеми. В якості джерела випромінювання зазвичай використовуються ртутні дугові лампи. Вони видають лінійчатий спектр з максимумами на 365, 405, 436 і 546 нм. В якості детекторів зазвичай використовуються фотопомножувачі. Унікальною властивістю цих пристроїв є необхідність вибору робочої смуги частот для двох спектрів – збудження і випускання.
Однією з переваг флуориметрії є більш висока чутливість, яка може на чотири порядки перевищувати чутливість фотометричних методів. Це відбувається тому, що в фотометричних методах для визначення невідомої концентрації аналізованого речовини в зразку вимірюється різниця в поглинанні між розчином, що містить нульову концентрацію аналізованим речовини (% Т = 100) і аналізованих зразком. У випадку сильно розбавлених зразків (для яких, наприклад, % Т = 98), невеликі відхилення в процесі вимірювання можуть привести до великих відносних помилок в результатах вимірювання. У випадку флуориметрії, навпаки, здійснюється пряме вимірювання флуоресценції зразка для визначення невідомої концентрації міститься в ньому аналізованого речовини.
Рис. 13. Блок-схема флуорометра, ФЭУ = фотоелектронний помножувач
Рис. 14. Оптична схема флуорометра
1. Джерело світла – монохроматичний діод.
2. УФС світлофільтр.
3. Збираюча лінза.
4. Випромінюючий світловий потік.
5. Кювета.
6. Еміссіонний потік і розсіяне на кюветі світло від джерела.
7. Колліматор.
8. Селективне дзеркало.
9. Світлофільтр.
10. Фотоелектронний помножувач (ФЕП).
Фотоелектронний помножувач (ФЕП), електровакуумний прилад, в якому потік електронів, що емітується фотокатодом під дією оптичного випромінювання (фотострум), посилюється в результаті вторинної електронної емісії; струм в ланцюзі анода (колектора вторинних електронів) значно перевищує первинний фотострум. Пристрій використовується для виявлення дуже слабких сигналів.
Принцип дії цих детекторів полягає в множенні електронів, випущених фотокатодом під дією потоку фотонів.
Рис. 15. Фотоелектронний помножувач
ФЕП отримує світло через скляне або кварцове вікно, покрите фоточутливою поверхнею – фотокатодом, який випускає електрони, а вони в свою чергу множаться в спеціальних електродах (відомих як діоди). Наприкінці діодного ланцюжка знаходиться анод або збірний електрод. Як правило, струм, що йде через анод пропорційний фотострумів, що генерується фотокатодом.
Такі характеристики фотоелектронні помножувача як спектральна чутливість, квантова ефективність, чутливість, темновий струм, визначаються структурою фотокатода. Кращі фотокатоди, працюють у видимій області світла, мають квантову ефективність менше 30%. Це означає, що 70% фотонів, що потрапляють на фотокатод, не виробляють фотоелектронів, тобто не детектуються. Товщина фотокатода є важливим параметром, за яким необхідно стежити, що б відгук від поглинених фотонів був коректним. Якщо фотокатод буде товстим, то більше фотонів поглинеться при меншій кількості емітованих електронів, а якщо фотокатод буде дуже тонким, то занадто багато фотонів пролетить крізь нього без поглинання. У цій статті показаний фотоелектронний помножувач з непрозорим і досить товстим фотокатодом. Фотоелектрони витягуються з передньої частини фотокатода і прямують до діодами.
Електрони, емітовані з фотокатода, прискорюються, проходячи діодним ланцюжком, яка може складатися з 14 елементів. Часто використовуються фокусують електроди, які спрямовують усі фотоелектрони, емітовані з фотокатода, на перший діод. Коли фотоелектрон вдаряється в перший діод, він провокує емісію додаткового електрона, і вони прискорюються до наступного діода, і т.д. Структура і геометрія поверхні діодів визначають, чи можуть вони використовуватися в фотоелектронному помножувачі. Оскільки примноження залежить від напруги між діодами та загальною кількістю діодів, то електронне множення в 10 мільйонів може бути досягнуто, якщо використовується 12-14 діодних рівнів.
Конфокальні мікроскопи, спектрофотометри та багато останніх камери використовують фото-помножувачі для вимірювання інтенсивності світла. Спектральна чутливість фотоелектронних помножувачів залежить від хімічного складу фотокатода: найкращі моделі містять елементи GaAs (арсенід галію), які чутливі у діапазоні від 300 до 800 нм. Фотокатоди ФЕП не завжди однаково чутливі і часто фотони розтягуються по всьому вхідному вікна, замість сконцентрованого пучка. Фотоелектронні помножувачі не зберігають заряду і відповідають на зміни вхідних світлових потоків в перебігу декількох наносекунд. Завдяки цьому, ФЕП можуть бути використані для виявлення і запису дуже короткочасних подій. Характерною особливістю фотоелектронних помножувачів, що використовуються в наукових цілях, є високе відношення сигнал-шум при множенні більше одного мільйона. Це пов’язано з тим, що темновий шум мізерно малий (може досягатися завдяки охолодженню).
Рис. 16. Кювета детектора в зборі
Рис. 17. Вид передньої панелі детектора
1. Світлодіод «живлення».
2. Кнопка «установки нуля».
3. Світлодіод перегрузки ФЕП.
4. Ручка переключення діапазонів RFU (чуттєвості).
5. Шкала множника діапазонів чуттєвості.
6. Кнопка «мітка».
7. Вхідний фітинг детектора з елементами кріплення кювети.
8. Вхідний фітинг детектора.
Рис. 18. Вид задньої панелі детектора
1. Клема заземлення з вінтом.
2. Позитивний контакт аналогового виходу з роз’ємом RCA.
3. Позитивний контакт аналогового входу з роз’ємом RCA.
4. Позитивний контакт допоміжного виходу з роз’ємом RCA.
5. Переключатель напруги допоміжного входу.
6. Переключатель сталої часу.
Стала часу – величина фільтрації (усереднення) аналогового сигналу. Чим вище значення сталої часу, тим вища фільтрація, тим рівніше базова лінія.
7. Негативний ефект допоміжного входу з роз’ємом RCA.
8. Переключатель напруги 220-110В.
9. Запобіжник.
10. Роз’єм кабеля напруги.
11. Виключатель.
12. Табличка з номером детектора.
Приклади сучасних фруориметрів представлені на рисунку 19.
(а)
(б)
Рис. 19. Сучасні приклади флуорометрів:
а) Varioskan Flash; б) Флуорат-02-АБЛФ-Т
4. Гематологія
Кров – рідка сполучна тканина, що складається з рідкої міжклітинної речовини плазми і формених елементів – еритроцитів (ЕРЦ), лейкоцитів (ЛКЦ) та тромбоцитів (ТРЦ).
Основна функція еритроцитів – перенесення кисню від легень до тканин і вуглекислого газу від тканин до легень. Лейкоцити виконують важливу функцію захисту організму від проникнення хвороботворних мікробів.
Тромбоцити виконують дві основні функції:
1) формування тромбоцитарного агрегату, первинної пробки, що закриває місце пошкодження судини;
2) надання своїй поверхні для прискорення ключових реакцій плазмового згортання.
Клінічний аналіз крові – лікарський аналіз, дозволяючий оцінити ступінь гемоглобіну в системі червоної крові, кількість еретроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, кількість гемоглобіну в одному еретроциті, а також швидкість осідання еритроцитів.
Основним показником формених елементів крові є число елементів кожного типу в мікролітрі (мкл) крові. Нормальний діапазон змісту ЕРЦ для дорослого чоловіка становить 4.6-6.2 х 107 мкл, а для дорослої жінки 4.2-5.4 х 106 / мкл. Нормальні діапазони вмісту ЛКЦ і тромбоцитів для чоловіків і жінок однакові. Нормальний діапазон змісту ЛКЦ становить 4500-11000/мкл, а нормальний діапазон вмісту тромбоцитів дорівнює 15000-40000/мкл. Гематокріт (ГМК) – це відношення всіх форменних елементів крові до сумарного об’єму взірця крові. Гематокрит виражається у відсотках, і його нормальний діапазон для дорослої людини складає 40-54%, а для дорослої жінки 35-47%. Гемоглобін (Hb) є коньюгованим білком, що знаходиться в середині ЕРЦ. Цей білок транспортує основну частину О2, і частина СО2, які переносяться кров’ю. Його вміст виражається в грамах на децилітр. Нормальний діапазон для дорослого чоловіка становить 13.5-18 г / дл, а для дорослої жінки цей діапазон дорівнює 12-16 г / дл.
Іншою групою вимірів проводиться знаходження середнього об’єму клітин (СОК) в кубічних мікронах, середню кількість гемоглобіну в еритроциті (ССГ) в процентах та середня кількість гемоглобіну в (СКГ) в процентах. Нормальні діапазони для цих параметрів такі:
СОК = 82-98 мкм3
ССГ = 27-31 пг
СКГ = 32-36 %
Вміст ЕРЦ (в мільйонах на мікролітр), ГМК (у відсотках), СОК (у кубічних мікронах), Нb (у грамах на децилітр), ССГ (у пікограмів) і СКГ (у відсотках) пов’язані між собою наступними співвідношеннями:
СОК = 10 ГМК / ЕРЦ
ССГ = 10 Hb / ЕРЦ
СКГ = 100 Hb / ГМК
Одиниці виміру для ЕРЦ, Нb і ГМК, використовувані в цих обчисленнях, такі, щоб одиниці для СОК, ССД і СКГ були такими, як зазначено вище.
Приклад 1. Обчислити індекси ЕРЦ по наступних даних:
ЕРЦ = 5 міліонів / мкл
Hb = 15 г / дл
ГМК = 45 %
Відповідь:
СОК = 10 ГМК / ЕРЦ = 450 / 5 = 90 мкм3
ССГ = 10 Hb / ЕРЦ = 150 / 5 = 30 пг
СКГ = 100 Hb / ГМК = 1500 / 45 = 33,3 %
Гематологічні аналізатори
Гематологічні аналізатори застосовуються для діагностики хвороб, як кровотворної системи, так і всього організму людини, і призначені для моніторингу аналізів в клініко-діагностичних лабораторіях. Прикладами таких аналізаторів є Cobas Micros, Hemocomp-10, Hemoscrin.
(а)
(б)
Рис. 20. Сучасні приклади гематологічних аналізаторів:
а) Cobas Micros; б) HOSPITEX HEMASCREEN
Всю багатогранність гематологічних пристроїв можна розділити на 3 класи:
1 клас – напівавтоматичні лічильники клітин крові, що визначають зазвичай від 4 до 10 параметрів (лейкоцити, еритроцити, гемоглобін, гематокрит, середній об’єм еритроцита, середній вміст гемоглобіну в еритроциті, середня концентрація гемоглобіну в еритроцитарній масі, тромбоцити, середній обсяг тромбоцита). Дані прилади в більшості своїй використовують в роботі попередньо розведену кров. В основі підрахунку та аналізу клітин в лічильниках лежить кондуктометричний метод.
2 клас – автоматичні аналізатори, які проводять аналіз цільної крові і визначають до 20 параметрів, включаючи розрахункові показники червоної крові і тромбоцитів за об’ємом, а так само проводять часткову диференціювання лейкоцитів по 3 параметрами (гранулоцити, лімфоцити і «середні клітини», що складаються переважно з еозинофілів і базофілів). В основі підрахунку і диференціювання клітин в аналізаторах даного класу лежить кондуктометричний метод, який доповнюється системами внутрішнього контролю якості.
3 клас – високотехнологічні гематологічні аналізатори, що дозволяють проводити розгорнутий аналіз крові, включаючи повне диференціювання лейкоцитів по 5 параметрам (нейтрофіли, еозинофіли, базофіли, моноцити і лімфоцити), гістограми розподілу лейкоцитів, еритроцитів і тромбоцитів за об’ємом, скетограмми. В основі роботи приладів цього класу лежить комбінація кондуктометричного методу з іншими методами (розсіювання лазерного променя, радіочастотний, цитохимический, використання різний дифференцирующих лізатів і т.д.).
Самим сучасним і найбільш широко поширено використовується є гемаметр Колтера (Coulter STKS).
Рис. 21. Гематологічний аналізатор Колтера (Coulter STKS)
Аналізованим зразком для цього приладу є кров з додаванням антикоагулянту, елілендіамінтетраацетата (ЕДТА). Антикоагулянтами називаються речовини, які перешкоджають нормальному згортанню крові. Вони також запобігають злипання формених елементів крові, яка може завадити їх правильному підрахунку. ЕДТА виконує цю функцію шляхом зв’язування з крові іонів кальцію. Початковим етапом процедури аналізу є автоматичний відбір точно відміреної порції зразка. Далі зразок розбавляється щодо 1:224 розчином, близьким за характеристиками до плазмі крові, у пристрої, позначеному на рис. 22 як Розріджувач 1. Потім розбавлений зразок ділиться на частини, одна частина направляється в камеру змішування і лізису, а інша – в Розріджувач 2.
Рис. 22. Блок схема гематологічного аналізатора Колтера
Призначення камери змішування і лізису – підготувати зразок до виміру вмісту гемоглобіну і ЛКЦ. Лізуючий агент викликає руйнування мембран ЕРЦ і вивільнення в розчин гемоглобіну, що міститься в них. ЛКЦ цим фактором не лізуються. Додавання розчину лікуючого агента збільшує ступінь розведення зразка до 1.250. У ньому також присутній ще один реагент, розчин Драбкина; він перетворює гемоглобін у ціанметгемоглобін. Це робиться для відповідності стандартними методиками визначення концентрації гемоглобіну. Перевагою цього методу є те, що він враховує практично всі форми гемоглобіну, присутні в крові. Потім зразок проходить через відсік рахунки ЛКЦ. який також грає роль кювети для спектрофотометра визначення концентрації гемоглобіну. Останнім етапом цього процесу є вимірювання вмісту ЛКЦ.
На рис. 22 представлена загальна схема методу, використовуваного в цьому вимірі. Той же метод використовується і для підрахунку ЕРЦ. Вакуумний насос плавно витягує контрольований об’єм рідини з відсіку підрахунку ЛКЦ через апертуру. Між електродом, що знаходяться у відсіку підрахунку ЛКЦ і електродом, що знаходяться всередині апертурної трубки, через апертуру тече постійний електричний струм. Кожна клітина ЛКЦ, проходячи через апертуру, витісняє з неї об’єм розчину, рівний її власному обсягому. Питомий електричний опір ЛКЦ значно вище, ніж у розчину, тому в ланцюзі, підключеної до електродів, генерується імпульс напруги. Величина цього імпульсу залежить від об’єму клітини ЛКЦ.
Для збільшення надійності вимірювання в системі паралельно використовуються три пристрої для рахунку. Вони мають один спільний електрод у відсіку підрахунку ЛКЦ і три незалежні електрода в апертурних трубках. Вихідний сигнал від кожної з ланцюгів подається на передпідсилювач. Посилені імпульси напруги пропускаються через порогову схему. Вибір величини порогового напруги є частиною процедури калібрування. Еталонні зразки, для яких значення содернія ЛКЦ визначені незалежними методами, піддаються аналізу, і вели чини порогових напруг встановлюються так. щоб привести результати аналізу у відповідність з еталонними значеннями.
Рис. 23. Апертурний відсік гемометра Колтера
Імпульси, що перевищують граничне значення, пропускаються через ланцюг інтегратора імпульсів, яка видає сигнал постійного струму, пропорційний числу полічених ЛКЦ. Вихідні сигнали від трьох інтеграторів пропускаються через схему голосування. Якщо розходженні в величинах сигналів знаходяться в заданих межах, то їх значення усереднюються. Якщо відмінність однієї з величин від двох інших перевершує задану межу, то вона не використовується при обчисленні середнього значенні. Якщо відмінності всіх трьох величин один від одного перевищують задану межу, включається індикатор помилки і видається нульовий результат.
Наступним етапом обробки сигналу є внесення до усередненого сигналу поправки на збіги. Збіг – це одночасне проходження через апертуру двох або більше ЛКЦ. Для оцінки середнього рівня збігів для даного розміру апертури і даної концентрації клітин використовується статистичний аналіз. Введення поправки здійснюється аналоговою схемою. Чисельне значення вмісту ЛКЦ відображається на дисплеї і виводиться на принтер.
Розглянемо тепер праву частину схеми на рис. 23. Першим етапом є подальше розбавлення зразка 1:224 в розріджувачах II. Друге розбавлення потрібне тому, що концентрація ЕРЦ в крові значно перевершує концентрацію ЛКЦ. Для підрахунку ЕРЦ використовується система, ідентична застосованій для підрахунку ЕРЦ.
Клітини з обсягом, що перевищує 35.9 фл (фемтолітров), класифікуються як ЕРЦ. Будується 256-канальна гістограма розмірів. З цієї гістограмі обчислюються СОК і ДОЕ. ДОЕ визначається як коефіцієнт варіації для статистично розподілу обсягів ЕРЦ.
Клітини з обсягами в межах 2-20 фл класифікуються як тромбоцити. Для кожного з трьох апертурних каналів будується 64-канальна гістограма обсягів цих клітин. Гістограми для кожного каналу піддаються статистичній обробці для отримання величини вмісту тромбоцитів, а також середнього обсягу тромбоцита (СОТ) і ширини розподілу обсягів тромбоцитів (ДОГ). Для отримання кінцевих значень цих параметрів використовується процедура голосування, аналогічна описаній для підрахунку ЛКЦ. Величини СОТ и ДОТ в теперішній час використовуються, в основному, в процедурах контролю якості.
Величини ЕРЦ, Нb і СОК вводяться в спеціалізований комп’ютер, який обчислює значення ГМК, ССД і СКГ.
5. Хроматографія
Хроматографія – являє собою группу методів, призначених для розділення сполук речовин на компоненти. В цьому методі рухомою фазою є газ (газ-носій), а нерухомою — тверда речовина або рідина, яка нанесена на твердий інертний носій або рівномірно покриває внутрішні стінки колонки (нерухома фаза поміщена у колонку).
Цей процес характеризується константою розподілу , яка представляє собою відношення концентрації речовини в нерухомій фазі до концентрації в рухомій фазі .
Концетрація – залежить від природи знаходжуваної речовини, природою рухомої та нерухомої фази, температури і т д.
З точки зору застосування в клінічній лабораторії дані методи використовуються для детектування важких речовин, таких як лікарські препарати і гормони. Наприклад з допомогою газорідинної хроматографії зручно знаходити, в якій степені препарат використовувався у випадку передозування. Наявність даної інформації є життєво необхідною для лікаря, який повинен вибрати наступні терапевтичні процедури.
Для розділення компонентів суміші використовують різну швидкість їх руху в рухомій фазі, що визвана взаємодією цих речовин з нерухомою фазою.
Газова хроматографія заснована на механізмах адсорбції і розподілу. Обладнання складається з системи подавання газу, пристрою для введення проби, хроматографічної колонки, детектора і реєструючого пристрою. Колонки зазвичай виготовляють зі скла або нержавіючої сталі й заповнюють нерухомою фазою. Газ-носій проходить із заданою швидкістю через пристрій уведення проби, колонку, а потім — через детектор. Визначення проводять при сталій температурі або відповідно до заданої температурної програми. Детектори газової хроматографії (полуменево-іонізаційний, за теплопровідністю, термоіонний, мас-спектрометричний, за захопленням електронів тощо) найбільш універсальні й чутливі серед інших хроматографічних методів. Колонку, пристрій уведення проби і детектор термостатують при зазначеній температурі. Готують розчин, який випробовують, і розчин (-и) порівняння, як зазначено в окремій статті. Використовуючи розчини порівняння, налагоджують прилад і добирають об’єми проб, що вводяться і дозволяють одержати необхідний сигнал. Виконують повторні введення для перевірки збігу. Уводять розчини і реєструють результати хроматографування. Визначають висоту (при ізотермічному визначенні, якщо коефіцієнт симетрії становить 0,8–1,2) або площу піків аналізованих компонентів. Для розрахунків вмісту аналізованого компонента використовують методи зовнішнього або внутрішнього стандарту. Для розрахунку вмісту домішок може використовуватися, де це можливо, метод внутрішньої нормалізації. У цих випадках рекомендують застосовувати широкодіапазонний підсилювач та автоматичний інтегратор. У фармацевтичному аналізі газова хроматографія використовуються для контролю залишкових кількостей органічних розчинників у субстанціях, ідентифікації й кількісного визначення розчинників та інших сполук.
На рисунку 24 представлений принцип роботи газорідинного хроматографа.
Рис. 24. Принципова схема газорідинного хроматографа
1 – балон з інертним газом; 2 – пристрій для введення проби в хромотографічну колонку (дозатор); 3 – хромотографічна колонка, 4 – термостат; 5 – детектор; 6 – перетворювач сигналів; 7 – реєстратор.
Пристрій для введення проби в хроматограф являє собою стальний циліндр з каналом, закритий резиновою прокладкою. Пробу вводять з допомогою мікрошприца (рис.25), яким проколюється еластична мембрана. На трубці, що йде до хроматографічної колонки є дозатор.
Рис. 25. Мікрошприц для вводу проби
Дозатор – пристрій для кількісного відбору проби і введення її в хроматографічну колонку.
(а)
1 — еластична мембрана
2 — нагрівальний елемент
(б)
Рис. 26. Схема пристрою вводу проби в хроматографічну колонку (а) та процес вводу (б)
Пристрій нагрівають, для того щоб проба після введення в хронограф швидко випарювалась. Пари, підхоплені несучим газом, починають рухатись по колонці. Газові проби вводять з допомогою іншого пристрою, який представляє собою подвійний кран з трубкою дозатором певного об’єму. При першому положенні крана через трубку продувають атмосферу аналізуючою газовою сумішшю. Потім поворотом крана перекривають трубки дозатора і наступним поворотом вводять в неї потік несучого газа.
(а)
(б)
Рис. 27. Ввід краном: а – заповнення петлі крану пробою газу ; б) – ввід проби в потоці несучого газу
Хроматографічна колонка – засіб для розділення компонентів суміші методом адсорбції. Вона запакована твердою підтримуючою матрицею, на яку нанесена рідка фаза. Колонка поміщена в термостат, в якому постійно контролюється рівень температури. Програматор температури поступово збільшує температуру колонки в послідовності, підібраної для отримання максимальної ефективності виділення саме тої речовини, яка аналізується. Колонки бувають різної довжини та форми, але зазвичай вона має довжину 1 м і діаметр менше 7 мм.
Капілярні колонки являють собою капіляр з внутрішнім діаметром 0,1-0,5 мм і довжиною декілька метрів. Стінки капіляра грають роль носія, рідка фаза носія наноситься безпосередньо на неї. Зменшується опір потоку газу, тому можна робити колонки великої довжини, зменшуючи ефективність розділення.
Рис. 28. Капілярні колонки для газової хроматографії
Детектор – прилад для знаходження змін в складі газу-носія, що пройшов через колонку. Покази детектора перетворюються в електричний сигнал і передаються пристрою, що веде фіксацію, наприклад комп’ютеру.
Рис. 29. Детектор газорідинного хроматографа
Параметри затримки характеризують сорбціонну властивість аналізованих сполук.
Рис. 30. Параметри затримки аналізованої
сполуки в хротомаграфічній колонці.
– час від моменту вводу проби в колонку до виходу максимуму піка.
– час знаходження молекул зв’язку в газовій формі
– час знаходження молекул зв’язку в сорбованому стані
У реєстратора по осі відкладається час, а по осі – інтенсивність вихідного сигналу детектора. Таким чином, хроматограф показує як кількість присутніх елементів, так і час утримання, з якими ці речовинами елюються з колонки. Виходячи з даної інформації, присутні елементи можуть бути ідентифіковані по їх часу затримки або шляхом порівняння з хроммограмами, отриманими в результаті газорідинної хронографії аналізу речовин відомої структури. Приклади хроматограм представлені на рисунках.
Рис. 31. Приклад хроматограми аналізу алкоголю, що знаходиться в крові: вісь Х – час затримки (хв.), Y – сигнал детектора (мв.)
Рис. 32. Приклад хроматограми аналізу рідини, що знаходиться в шлунковому соці
Сучасні газорідинні хроматографи
Газовий хроматограф «Кристаллюкс 4000М» повністю автоматизований, починаючи від введення проби і закінчуючи обробкою хроматографічної інформації, у т. ч. реалізовані функції автоматичного регулювання температури термостатів, витрат і тиску газу-носія (система ЕУПГ), допоміжних газів, автоматичного підпалу детекторів, контроль горіння полум’я в процесі роботи, вимірювання сигналів детекторів за допомогою 24-розрядного АЦП.
Рис. 33. Газовий хроматограф «Кристаллюкс 4000М»
Газовий хроматограф 430-GC (рис. 23) є ідеальним приладом для рутинних досліджень в таких областях як клінічний аналіз, визначення домішок у спиртовмісної продукції, визначення складу жирних кислот, судово-медична експертиза, нафтопереробна промисловість. Прилад компактний (½ від простору, необхідного для установки звичайного лабораторного газового хроматографа), має помірну вартість.
Рис. 34. Газовий хроматограф 430-GC та його цифровий екран
Газорідинна хроматографія дає ряд важливих переваг при аналізі важких сполук: швидкість, можливість роботи з малими кількостями взірця і висока чутливість. Більшість приладів може проводити аналіз клінічно значимих речовин менше ніж за 1 год, а часто і менше ніж за 15 хв, причому для аналізу потрібно лише 1 мм. взірця. Чутливість засобу залежить від типу детектора, що використовується.
6. Обладнання з використанням електрофорезу
Використовується для знаходження кількості типів білків в плазмі, сечі, і спинномозковій рідині, розділення ферментів на складові їх ізоферменти, для ідентифікації антитіл та ряду інших завдань.
У загальному випадку явище електрофорезу може бути визначене як рух твердої фази відносно рідкої (буферного розчину). Основна функція буферного розчину полягає в тому, що він проводить електричний струм і подорожувати постійне значення рН розчину в процесі міграції Буферний розчин стабілізується твердою матрицею, що називається підтримуючим середовищем.
Зональний електрофорез
У цій методиці зразок вводиться в підтримуючу середу, і під дією електричного поля частинки з однаковим зарядом, однакового розміру і форми, мігрують з однаковою швидкістю. Це призводить до поділу частинок по зонах. Фактори, що впливають на швидкість міграції частинок в електричному полі, описуються в наступних параграфах:
Величина заряду. Рухливість даної частинки безпосередньо залежить від сумарної величини її заряду. Рухливість визначається як «відстань, виражена в сантиметрах, яке частинка проходить за одиницю часу при одиничній напруженості поля, вираженої як падіння напруги на сантиметр». [рухливість = см2/(В*сек)].
Іонна сила буфера. Чим більше концентрація буфера, тим менше швидкість міграції частинок. Це відбувається тому, що чим більшу частку сумарного заряду складають буферні іони, тим більшу частку сумарного струму вони несуть. Крім того, це відбувається внаслідок взаємодії буферних іонів з частками.
Температура. Рухливість безпосередньо залежить від температури. Опір підтримуючої середовища проходить току виробляє тепло. Це тепло впливає на електрофоретичний процес двома шляхами. По-перше, воно викликає зростання температури підтримуючої середовища, що призводить до зменшення її опорі і. як наслідок, до збільшення швидкості міграції. По-друге, тепло викликає випаровування води з поверхні підтримуючого середовища. Це призводить до збільшення концентрації частинок і ще більше збільшує швидкість міграції. Внаслідок цих ефектів, для досягнення прийнятної відтворюваності результатів процедури необхідно підтримувати на постійному рівні або прикладена напруга, або силу струму Для коротких розділень при відносно невисокій напрузі можна підтримувати постійним як напруга, так і струм. Однак, при використанні в якості підтримуючої середовища різних гелів, нагрівання є суттєвою проблемою. Для мінімізації виділення тепла в середовищах цього типу зазвичай використовуються джерела, підтримуючу постійну силу струму.
Час. Довжина міграції безпосередньо залежить від часу, протягом якого протікає електрофоретичний процес. Інші фактори, що впливають на міграцію, включають в себе явища електроосмосу і хроматографії, форму частинок, «бар’єрний » ефект, «гнітів потік» і потенціал течії (Henry et al., 1974; Hicks el аl., 1974).
Типи підтримують середовищ. У різних додатках електрофоретичних методик використовується широке розмаїття підтримують середовищ. У їх числі – папір, ацетат целюлози, крохмальний гель, агарових гель, акріло-мідний гель і сахароза. Тут ми обговоримо електрофорез на ацетаті целюлози, оскільки цей метод широко застосовується в клінічних лабораторіях, і його загальний принцип підходить і для інших підтримуючих середовищ.
Плівки з ацетату целюлози мають ряд переваг перед фільтрувальної папером, яка спочатку використовувалася в якості підтримуючої середовища для електрофорезу.
На рис. 35 представлена схема пристрою для електрофорезу на ацетаті целюлози. Смужка ацетату целюлози просочується буферним розчином і установлюється в утримувач мембрани («місток» ) «Місток » встановлюється в «кювету». при цьому обидва кінці смужки занурюються у відсіки з буферним розчином.
Рис. 35. Пристрій для електрофорезу
1 — носій (ацетат целюлози); 2 — кришка; 3 — електроди; 4 — буферний розчин; 5 — ізолятор; 6 — запалювальний гніт.
Поділ заряджених частинок проводять в якому-небудь однорідному носії. Це хроматографічний папір, тонкі шари оксидів кремнію (IV) або алюмінію, крохмальні або інші гелі. На всіх носіях речовини розподіляються в електричному полі у вигляді зон, які можна виявити і виділити, тому метод отримав назву зонального електрофорезу.
Загальні закономірності електрофорезу наступні:
1) рухливість частинок зростає із збільшенням сумарного заряду;
2) чим більше розміри молекул, тим менше їх рухливість;
3) глобулярні і фібрилярні білки володіють різною рухливістю, зумовлену силою тертя при переміщенні;
4) швидкість переміщення речовин прямо пропорційна силі струму, а довжина пройденого частинками шляху прямо пропорційна часу пропускання струму;
5) чим більше опір, тим менше швидкість просування частинок в електричному полі;
6) на рухливість частинок впливає склад розчинника, його концентрація і pH;
7) швидкість переміщення залежить від хімічного складу носія і його відношення до поділу на частинки.
Результат аналізу виводяться у вигляді електрофореграмми, представленої на рисунку 36.
Рис. 36. Електрофореграмма плазми крові: а – в нормі; б – при нефриті (захворювання нирок); де – альбуміни; – глобуліни.
Прикладами сучасних пристроїв електрофорезу є SAS-1 Plus, Experion, MINICAP, CAPILLARYS-2. Дані системи є повністю автоматизованими, багатофункціональними та дозволяють одночасно аналізувати до 28 взірців.
(а)
(б)
Рис. 37. Сучасні пристрої для електрофорезу: SAS-1 Plus (а) та MINICAP (б)
7. Автоматичні хімічні аналізатори
Автоматичні хімічні аналізатори значно підвищують ефективність клінічних лабораторій. Дані пристрої характеризуються великою універсальністю, та дозволяють спростити та прискорити процес отримання результатів.
Розглянемо автоматичний хімічний аналізатор Синхрон CX4 (виробник Beckman), що представлений на рисунку 38:
Рис. 38. Синхрон CX4
Система Синхрон CX4
Система Синхрон CX4 ідеальний біохімічний аналізатор для малих і середніх лабораторій, що виконує весь спектр тестів, включаючи лікарський моніторинг та визначення наркотичних засобів. Максимальна продуктивність 225 тестів на годину. Можливість визначення в одному зразку 24 різних параметрів.
Робочі характеристики. Оператор керує роботою приладу СХ4 з допомогою монітора та клавіатури. Основними є п’ять функцій: програмування взірців, загрузка реагентів, калібрування, спеціальні функції і параметри системи.
1. Програмування зразків. За допомогою цієї функції оператор може позначити матеріал, що міститься у певній чашці, як аналізований або контрольний зразок, ввести інформацію для ідентифікації матеріалу. і вказати, яким тестах цей матеріал повинен бути підданий. Передбачено спеціальні процедури, що дозволяють провести екстрений аналіз зразків. За допомогою системного принтера можна отримати список типів матеріалу, який передбачається помістити в кожну з чашок в секторі зразків (список завантаження). Характеристики сектора зразків будуть обговорюватись нижче. Цей список використовується при розміщенні в секторі отриманих від пацієнтів і контрольних зразків.
2. Завантаження реагентів. Ця процедура дозволяє оператору вставляти, вилучати і замінювати патрони з реагентами в 24 гніздах на барабані реагентів. Кожен патрон з реагентами має етикетку зі штрих-кодом, що містить повну інформацію про нього. включаючи тип тесту, в якому він використовується, і його термін придатності. Пристрій, що зчитує знімає інформацію зі штрих-коду при установці або витягує патрона з барабана, і ця інформація передається головному процесору системи.
3. Калібрування. Для забезпечення точності і надійності вимірювання використовуються матеріали з відомими концентраціями аналізованих речовин (стандартні зразки). Калібрування здійснюється як в момент завантаження реагентів у систему, так і через певні проміжки часу.
4. Спеціальні функції. Ці функції включають в себе установку і налаштування системи, діагностику системи та процедури обслуговування системи.
5. Параметри системи. У цьому режимі оператор може контролювати поточний робочий стан приладу, поточну конфігурацію системи (наприклад, типи активних тестів), і показання різних датчиків приладу (наприклад, температури і рівні рідин).
Опис системи. Система СХ4 включає в себе три основні підсистеми: блок зразків, блок реагентів і реакційну систему.
1. Блок зразків. Блок зразків складається з п’яти модулів: сектори зразків (до восьми), система автоматичного завантаження, поворотний стіл для зразків, пробовідбірник-змішувач, і чашка для промивання пробовідбірника-змішувача. Сектор зразків може нести до десяти чашок із зразками, отриманими від пацієнтів, або з контрольними зразками. Оператор вводить інформацію, що ідентифікує матеріал в кожній з чашок, за допомогою комп’ютерної системи управління (вище). Система автоматичного завантаження переносить сектори із зразками на барабан зразків під управлінням мікрокомп’ютера. У цьому процесі використовуються кроковий двигун і пневмогідравлічна система. По завершенні циклу тестування сектор аналогічним чином знімається з барабана. Поворотний стіл для зразків складається з барабана зразків і оптичного зчитувального пристрою. Барабан зразків є поворотним пристроєм з дискретними положеннями, і приводиться в рух кроковим двигуном. Управління поворотами здійснюється мікрокомп’ютером таким чином, щоб аналізований матеріал був доступний для пробовідбірника. Пробовідбірник має датчик рівня рідини, що дозволяє йому занурювати голку пробника на правильну глибину, забезпечуючи тим самим можливість відбору правильної кількості аналізованого матеріалу. Після того, як аналізований матеріал потрапляє в пробовідбірник, кранова система повертає пробовідбірник в таке положення, щоб голка пробника знаходилася над кюветою на реакційному барабані. За тим матеріал зливається в кювету.
2. Блок реагентів. Блок реагентів включає в себе патрони з реагентами, барабан реагентів і дозатор реагентів. Патрони з реагентами є одноразовими ємностями, в яких містяться реагенти, необхідні для певного тесту. Вони мають етикетки зі штрих-кодом, що вказує тест, в якому вони використовуються. Барабан реагентів обертається під управлінням мікрокомп’ютера, подаючи потрібний реагент до дозатора. Барабан реагентів несе 24 патрони.
3. Реакційна система. Реакційна система включає в себе реакційний барабан і фотометричний блок. Реакційний барабан несе 80 кювет, в яких протікають хімічні реакції У кюветах підтримується постійна температура в 30ºС, або 37ºС. Фотометричний блок складається з ксенонової лампи, коліматорної системи, оптичних фільтрів і фотодіодних детекторів. Ксенонова лампа видає спалах світла щоразу, коли кювету проходить через оптичний блок. Внаслідок того, що спалахи мають змінну інтенсивність, використовується система корекції спалахів. Ця система заснована на проведенні вимірювань поглинання на частотах, відмінних від основної частоти вимірювання. Світло, що пройшло через кювету із зразком, попадає в коліматорну систему, яка поділяє його на промені, спрямовані через кожен з десяти фільтрів (340. 380, 410, 470, 320, 560, 600, 650, 670 і 700 нм) на десять фотодіодних детекторів. Кожен з детекторів видає сигнал, пропорційний інтенсивності падаючого на нього світла. Сигнали проходять через логарифмічний ланцюг посилення і подаються на вхід комутатора. Комутатор, керований мікрокомп’ютером, в певні моменти робити замір сигналу, і передає аналоговий сигнал на аналогово-цифровий перетворювач. Дані вимірювань поглинання в цифровому представленні передаються центральному процесору системи.
Рис. 39. Будова автоматичного хімічного аналізатора
1. Мультифункціональний пробовідбірник для реагентів.
2. Мультифункціональний пробовідбірник для зразків.
3. Міксер.
4. Блок завантаження кювет.
5. Блок для реагентів.
6. Блок для зразків.
7. Реакційний блок.
Результати тестів роздруковуються в формі звіту, який можна вложити в медичну картку пацієнта і передати його лікуючому лікарю.
Автоматичний клінічний аналізатор
Автоматичний клінічний аналізатор (АКА) виробництва фірми DuPont відрізняється від високопродуктивних приладів (рисунок 40), подібних Синхрону СХ4, своєю універсальністю, а не максимальною продуктивністю. Він виконує вимірювання послідовно, а не паралельно, але при цьому для кожного біологічного зразка він може автоматично здійснити будь-який набір з 40 тестів.
Рис. 40. Клінічні аналізатори АКА
Принцип дії АКА заснований на концепції автоматичних маніпуляцій з касетами біологічних зразків (КБЗ) і з касетами хімічних реактивів (КХР). Для кожного біохімічного тесту використовується окрема КХР. У процесі роботи приладу КХР переміщується від блоку до блоку по транспортеру, причому для даного зразка можна вибрати будь-яку послідовність КХР. Час, потрібний для проведення будь-якого визначення за допомогою АКА, становить 7 хвилин, інтервал між визначеннями становить 37 секунд. Це означає, що аналізатор може провести будь-який аналіз як екстрений. Ця особливість представляє клінічній лабораторії важливі додаткові можливості, однак вона ж приводить до збільшення вартості аналізів в порівнянні з іншими автоматизованими методами. Функціональна блок-схема АКА представлена на рисунку 32.
Розглянемо основні характеристики АКА. Зразок, отриманий від пацієнта, поміщається в КБЗ, до якої прикріплена ідентифікаційна картка пацієнта. КХР, відповідні тестам, які передбачається провести для даного зразка, встановлюються на конвеєр позаду КБЗ. Конструкція КХР показана на рис. 33. За останньою КХР на конвеєрі слідує спеціальна касета, що завершує робочий цикл. Кожна з підсистем приладу виконує такі основні функції:
Ідентифікація пацієнта. Коли КБЗ встановлюється в АКА в перший раз. вона проходить через блок, який зчитує і роздруковує інформацію, вручну записану на ідентифікаційну картку пацієнта, прикріплену до КБЗ.
Рис. 41. Блок-схема автоматичного клінічного аналізатора (АКА). КБЗ – касета біологічних зразків. КХР – касета хімічних реактивів. Роз. – розбавник. HГ. – Нагрівач. ВМ = відкривач-міксер. СЗ = станція затримки. КП = код пацієнта.
Блок заповнення. У блоці заповнення з комплекту зразка відбираються аліквоти (відміряні обсяги рідини) і змішуються з розріджувачами, які можуть бути різним для різних визначень. Потім в кожен пакет КХР вводяться по 5 мл. змішаного розчину. Двійкові коди, нанесені на кожну КХР, зчитуються електронними пристроями блоку заповнення, щоб визначити, який саме розчинник використовувати для даного пакета КХР. Після заповнення КХР перемішаються до нагрівачів, а КБЗ поміщають у вихідний лоток.
Рис. 42. Касета біологічних зразків (КБЗ) і касета хімічних реактивів (КХР) автоматичного клінічного аналізатора (АКА).
Нагрівачі. У нагрівачах пакет КХР підігрівається до 37ºС. і ця температура підтримується до кінця процесу.
Відкривач-міксер 1. У цьому блоці руйнуються чотири пластикових капсули з реактивами, які змішуються з розведеним зразком (рис. 42).
Станції затримки. У міру того, як пакет КХР послідовно проходить п’ять станцій очікування, в ньому протікають хімічні реакції між першими чотирма реагентами, розбавляючим розчином і взірцем.
Відкривач – міксер 2. У цьому блоці розкриваються три залишкові капсули з реагентами, і їх вміст додається в реакційну суміш. Для деяких тестів на цьому етапі передбачається певна затримка, дозволяючи хімічним реакціям пройти до кінця перед тим, як КХР потрапить у фотометричний блок. Ця затримка визначається по двійковому коду, що вказує тип тесту, який зчитується в блоці заповненні.
Фотометр. У фотометричному блоці з допомогою особливого преса пластиковий конверт КХР перетвориться в кювету. При цьому в пластиковому пакеті з міряється тиск, а результат вимірювання використовується для того, щоб визначити, чи правильне кількість зразка і розріджувача було введено в КХР. Якщо тиск дуже мало, результати тесту позначаються символом «Р» (від слова presure тиск). Двійковий код КХР зчитується заново, після чого схема управління фотометра вибирає метод вимірювання, тип фільтра і параметри АЦП.
АКА використовує один з трьох методів вимірювання : кінетичний, двухфільтровий і двокасетний (з двома КХР). Для визначення концентрації аналізованої речовини по кінетичному методу, поглинання світла в кюветі вимірюється двічі. При цьому проміжок часу між вимірами суворо фіксований, в рамках двухфільтрового методу вимірювання поглинання здійснюється з двома різними світлофільтрами. Концентрація аналізованої речовини пропорціональна різниці між отриманими значеннями поглинання світла. При роботі по двохкасетному методу, на одній і тій же довжині хвилі визначається різниця поглинання світла сумішшю з аналізованої речовини і реагентів двох різних КХР. Вихідний сигнал фотометра перетворюється в цифрову форму, що задається контролером фотометра, і пересилається на принтер.
Принтер. Принтер видає звіт, який включає в себе ідентифікаційні дані пацієнта, зчитані блоком заповнення і результати фотометричного виміру для кожного пакета КХР, заповненого даним зразком.
