Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипні прояви

ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ І ВІРУСІВ. Основи біотехнології та генної інженерії

Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипні прояви.

   Вона започаткована блискучими експериментами Грегора Менделя в 60-х роках минулого століття. Закони Менделя були підтверджені дослідами Г. де Фріза, К. Клорренса, Е. Чермака. Значний вклад у розвиток вчення про мінливість мікроорганізмів внесли К. Негелі (засновник теорії плеоморфізму – про безмежну мінливість бактерій), Р. Кох і Ф. Кон, які висунули ідеї мономорфізму, що стверджували постійність та незмінність бактерійних ознак, притаманних певним видам.

   Значний внесок у вивчення законів мінливості мікроорганізмів зробили Л. Пастер, І. Мечніков, Л. Ценковський, М. Вавілов, М. Тимофєєв–Ресоцький. У 1944 р. О. Ейвері, К. Маклауд, М. Мак–Карті довели, що саме ДНК є речовиною, яка зберігає генетичну інформацію. Д. Уотсон і Ф. Крик, М. Уілкінсон у 1953 р. розшифрували генетичний код, встановивши особливості механізмів синтезу білка.

 Гени, які відповідають за синтез сполуки, позначають рядковими літерами латинського алфавіту, які відповідають назві сполуки. Наприклад, his+ – гістидиновий ген, leu+ – лейциновий ген. Гени, що контролюють резистентність до антибіотиків, інших препаратів, позначаються літерою r (resistance – стійкість). Чутливі до препаратів бактерії позначаються літерою s (sensitive – чутливий). За цим принципом позначення kanr, risr означає резистентні до канаміцину та ристоміцину штами, а kans, riss – чутливі. Фенотип батерій позначається аналогічно генотипу, однак прописними літерами.

   Сукупність генів нуклеоїда та позахромосомних факторів спадковості зумовлюють генотип бактеріальної клітини. Фенотип – індивідуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування.
   Існує певний механізм, за допомогою якого послідовність нуклеотидів у гені визначає послідовність амінокислот у білку.

   Спочатку ДНК клітини деспіралізується, і на одній із її ниток, як на матриці, фермент ДНК-залежна РНК-полімераза за принципом комплементарності формує полірибонуклеотидний ланцюг, який називається інформаційною або матричною РНК (іРНК, мРНК). Ця стадія синтезу білка називається транскрипція (transcriptio – переписую). 

  Інформаційна РНК переноситься клітиною в цитоплазму, де розташовані рибосоми. Розпочинаєтся наступний етап – трансляція (translatio – перенесення). Саме в цей період на рибосомах відбувається зчитування генетичного коду іРНК та побудова поліпептидних ланцюгів.

   У цитоплазмі клітини завжди існують особливі специфічні нуклеїнові кислоти, які називаються транспортними РНК (тРНК). На одному з кінців вони мають триплет нуклеотидів (антикодон), а на іншому – місце для з’єднання з відповідною амінокислотою (кодон). Вони доставляють необхідну амінокислоту до рибосоми, на якій відбувається елонгація (elongatio – подовження) поліпептидного ланцюга.

   Генетична інформація клітини може бути закодована як хромосомними генами, так і генами, які знаходяться у позахромосомному стані, тобто відмежовані від хромосоми, але здатні до тривалого підтримання та відтворення в такій формі. Їх виявлено у бактерій багатьох родів. Позахромосомні елементи спадковості представлено плазмідами, транспозонами, Is-елементами та фагами.

   Найдрібнішими за своїми розмірами є Is-послідовності (insertion sequenses – вставлені послідовності). Вони складаються з 1000 пар нуклеотидів і не несуть інших генів, крім генів, що відповідають за їх переміщення у різні ділянки бактеріальної ДНК. В усіх випадках вони пов’язані з хромосомною або плазмідною нуклеїновою кислотою і не здатні до самостійної реплікації.

Функції:

     Координуюча: взаємодія транспозонів, плазмід, помірних фагів між собою та хромосомою бактерії, забезпечуючи їх реплікацію.

     2. Регуляторна: викликають інактивацію генів, або служать промоторами (ділянки ДНК, які регулюють експресію клітинних генів).

     3. Індукують мутації за типом делеції або інверсії

   Транспозони (transposition – переміщення) є нуклеотидними послідовностями, які крім генів, що відповідають за транспозицію, можуть нести гени, кодуючі інші функції. Довжина їх сягає 2000-20000 нуклеотидних основ.

Вони можуть існувати самостійно у вигляді кільцевої молекули ДНК, не здатної до реплікації, або бути включеними до складу бактерійних геномів і плазмід. Вони можуть нести інформацію про синтез, наприклад, бактеріальних ентеротоксинів, ферментів, руйнуючих антибіотики.

   Транспозони виявлено у клітинах дріжджів, бактерій, рослин, комах, хребетних і навіть людей. Найважливіша їх властивість – здатність до міграції з одного реплікона до іншого. За рахунок цього вони виконують функції:1. Регуляторна.

     2. Кодуюча.

     3. Індукують генні мутації за типом делеції або інверсії.

     4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями (структурними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявляються інсерції, делеції, інверсії

Плазміди – кільцеві молекули ДНК молекулярною масою до 10⁶-10⁸ Д з 1,5-400 тис пар основ. Вони можуть існувати в цитоплазмі у вільному стані або бути інтегрованими з клітинною хромосомою. Тоді їх називають епісомами. Плазміди містять у своєму складі tra-оперон (transfer – перенос), який забезпечує їх здатність до передачі, і гени, які кодують якусь ознаку. Їх називають трансмісивними, якщо вони самостійно передаються іншим клітинам за допомогою кон’югації, і нетрансмісивними, коли не мають власного апарату передачі, а переносяться разом трансмісивними або при трансдукції. Види плазмід

     1. Трансмісивні (кон’югація).

     2. Нетрансмісивні (трансдукція)

     3. “Криптичні”.

     4. Монокопійні

     5.Мультикопійні

Плазміди виконують регуляторну та кодуючу функції. Регуляторний ефект їх полягає в здатності представляти власні реплікони при порушенні функціонування клітинних генів; кодуюча роль – у внесенні в клітину нових ознак, які надають їй певних переваг при взаємодії з організмом хазяїна.
    Сьогодні відомо декілька десятків різноманітних плазмід. Серед них найдетальніше вивчено плазміди F, Col, R, Ent, Hly, бактеріоциногенності, біодеградації. Плазміди F забезпечують перенос бактеріальної хромосоми при кон’югації. R-плазміди є факторами множинної резистентності до лікарських засобів. Вони кодують стійкість до 10 антибіотиків та солей важких металів (Ni, Cu, Hg). Col-плазміди забезпечують синтез коліцинів – білків з летальною активністю проти коліформних мікроорганізмів. Hly-плазміди зумовлюють утворення гемолізинів у золотистих стафілококів, Ent-плазміди забезпечують ентеротоксигенну активність штамів кишкової палички. Плазміди біодеградації надають мікроорганізмам здатність утилізувати незвичні субстрати: Cam-плазміда – камфору, Oct-плазміда – октану тощо.

Функціональні властивості плазмід

Про плазмідну локалізацію гена можуть свідчити високі темпи втрати ознаки спонтанно, а також підсилення її під впливом підвищеної температури, хімічних речовин (акридинові барвники), спільна втрата і спільне набуття декількох ознак.

   Сприяти проявам мінливості бактерій можуть деякі помірні та дефектні бактеріофаги. За своїми біологічними властивостями вони подібні до плазмід, можуть самостійно існувати в цитоплазмі бактеріальних клітин. При інтеграції з хромосомою мікроба вони можуть надавати йому нові ознаки   Таким чином, плазміди убіквітарні. Вони не мають вирішального значення для забезпечення існування бактерійних клітин, однак відіграють чи не найважливішу роль у створенні розмаїття генетичного матеріалу при природному відборі.

Мінливість мікроорганізмів     Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представники мікробного царства.

   Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.    Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

 Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.   При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.    Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутаційний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послідовність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

 
   Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проявом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група – це мутації стійкості. Після них мікроорганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентрації речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність до антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

 
   За своїм походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 10⁵-10¹² без втручання експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів. Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх факторів.

   Індуковані мутації виникають під впливом дії на клітину встановлених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища, ніж спонтанних.

   За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості – плазмідах; за кількістю генів, які мутували, – на генні та хромосомні, за величиною – на великі (хромосомні) та малі (точкові).

   Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки ДНК).

   Точкові мутації частіше спостерігаються як делеція, вставка фрагменту ДНК (інсерція) або заміна основ. Якщо спостерігають заміну пуринових основ на пуринові, а піримідинових на піримідинові, таку мутацію називають транзицією. За умови заміни пуринової основи на піримідинову і навпаки, мутація називається трансверсією.
   Будь-яка мутація, що змінює генотип дикого штаму, називається прямою мутацією. Якщо внаслідок мутації відновлюється вихідний генотип дикого штаму, вона називається зворотньою. Однак, коли відновлюється фенотип дикого штаму, але мутація відбувається в локусі, не зачепленому прямою мутацією, такий тип змін одержав назву супресорної мутації. Вона може бути внутрішньогенною та позагенною. Плейотропними називають такі мутації, які ведуть до зміни двох і більше ознак.

Мутації є ще таких видів:

1. Пряма мутація

     2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія

     3. Супресорна мутація (внутріш-ньогення, позагенна). Веде до відновлення фенотипу а не генотипу.

     4. Плейотропна мутація (зміна 2-ох і більше властивостей клітини)

     5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)   

   Збільшувати частоту мутаційного процесу можуть особливі фактори, які називають мутагенами. Найдоступніший мутаген – ультрафіолетове випромінювання з довжиною хвилі 2600 А°. Воно викликає особливі пошкодження – утворення димерів тиміну та заміну основ. Іонізуюче опромінення (рентгенівські промені, γ-промені) також спричиняє мутації різної природи. Велику групу складають хімічні мутагени. Найбезпечніший з них – азотиста кислота, яка дезамінує аденін. N-нітрозометилсечовина є супермутагеном й канцерогеном, здатним викликати різні типи мутацій. Не поступаються їй за своєю активністю нітрозогуанідин, етилметансульфонат. Високу мутагенну активність мають акридини, аналоги основ (5-бромурацил), які включаються до складу ДНК між основами, викликаючи зсув рамки зчитування. До біологічних мутагенів належить перекис водню, що утворюється при метаболізмі всередині клітин, лікарські препарати, такі як нітрофурани, деякі антибіо

тики (мітоміцин С).   

 

 

Класифікація мутагенів

     Фізичні:

     1. УФО (λ-2600 А) – найсильніша мутагенна дія; утворюються димери тиміну, заміна основ

     2. Іонізуюче опромінення (рентгенівське, гамма-промені)

     Хімічні:

      1. Азотиста кислота (самий доступний і безпечний)

      2. N-нітрозометилсечовина – супермутаген, канцероген

      3. Етилметансульфонат

      4. Акридини

      5. Нітрозогуанідин

      6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин)

      7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики

     Біологічні: перекис водню віруси, фаги

Дія різних мутагенів на бактерії. Своєрідною формою генотипної мінливості бактерій є явище дисоціації. Його можна спостерігати при культивуванні мікроорганізмів на щільних живильних середовищах. Ізольовані колонії мікроорганізмів певного виду утворюють на поверхні середовища колонії двох типів – S-форми (smooth – гладенький) і R-форми (rough – шорсткий). Колонії першого типу – гладенькі, блискучі, з рівними краями. Колонії R-типу, навпаки, мутні, шорсткі, з нерівним зазубреним краєм. Виявилось, що деякі властивості мікроорганізмів, незважаючи на те, що вони належать до одного й того ж виду, також відрізняються. Так, клітини S-форми колоній, нормальної морфології, викликають дифузне помутніння бульйону, біохімічно вони більш активні, повноцінні в антигенному відношенні, більш вірулентні, їх виділяють, як правило, в гострому періоді захворювання. Збудники чутливі до бактеріофагів і стійкі до фагоцитів, бактрицидної дії сироватки крові.    Мікроорганізми, що утворюють R-форми колоній, мають слабшу біохімічну активність, менш чутливі до дії бактеріофагів і мають менш виражені вірулентні властивості. Винятком є збудники туберкульозу, сибірки, чуми.
   Дослідження довели, що такі зміни відбуваються внаслідок мутацій у генах, що детермінують синтез окремих компонентів мембран бактерій.   Вважається, що дисоціація надає мікробам певних селективних переваг при існуванні в організмі хазяїна, і в той же час вона утруднює діагностику інфекційних хвороб, насамперед, дизентерії та ешерихіозів.

Властивості мікробів S-колоній

     Клітини нормальної морфології

     Дифузне помутніння бульйону

     У рухомих видів є джгутики

     У капсульних варіантів є капсули

     Біохімічно більш активні

     Повноцінні в антигенному відношенні

     У патогенних видів – вірулентні

     Виділяються в гострому періоді хвороби

     Чутливі   до бактеріофагів

     Менш чутливі до фагоцитозу

Однак протягом своєї еволюції бактерійні клітини виробили певні механізми, що забезпечують стабільність генетичного коду, оберігають його від мутацій або ліквідують їх негативні наслідки. Вони називаються репараціями. Репаративні процеси поширені у мікробів і контролюються за допомогою спеціальних генів.
   Виділяють види репарацій: фотореактивація, темнова та SOS–реактивація.

Фотореактивація захищає клітину від негативної дії ультрафіолетової радіації, яка викликає утворення тимінових димерів. На сонячному світлі (λ – 300-400 нм) утворюються особливі ферменти, які руйнують зв’язки між піримідиновими димерами.

Феномен темнової репарації складніший за попередній. Його сутність полягає в тому, що особливі ферменти знаходять мутовану ділянку ДНК і вирізають її. За допомогою ДНК-залежної ДНК-полімерази комплементарно відновлюється вихідна структура молекули, і ферменти лігази зшивають її з материнською ниткою.

Для одержання мутантів розроблено методи, засновані на виявленні різниці в швидкості росту бактерій, різної здатності їх до виживання тощо.

SOS-реактивація

     При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК

 

Методи виявлення мутантів

     За різницею в швидкості росту (посів на мінімальне середовище; Мутанти виростають)

     Різна здатність до виживання

     Метод реплік Ледерберг

 

 

Генетичні рекомбінації

    Рекомбінації – особливі феномени спадкової мінливості мікроорганізмів, які не пов’язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох “батьківських” клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне джерело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими rec-генами (recombination – рекомбінація).

 
   Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансформація, трансдукція та кон’югація.

    Трансформація – процес гібридизації внаслідок переносу генетичних детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

   Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 р., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утворюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів ІІІ типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами ІІ типу (R-форма) лабораторна тварина через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи ІІ серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова генетичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу. Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака передавалась спадково.
   У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компетентності, природа якої остаточно не з’ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка – компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клітинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.
   Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Згодом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлюється ендонуклеазами, а інша – вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу – експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п’яти-десятихвилинного контакту клітини-реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год.

 

 

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.
   Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів – представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одержання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.    При кон’югації внаслідок фізичного контакту між бактеріями-донорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача генетичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-пілі. Необхідною умовою для процесу кон’югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility – плодючість). Він є кон’югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів переносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-факторами позначаються як F⁺-, а без нього – F^–– клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон’югації. Статеві ворсинки – особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує величину бактерії.    Процес кон’югації починається з того, що за допомогою статевих ворсинок клітина-донор торкається клітини-реципієнта, фіксує її та притягує до себе. Після цього плазміда починає реплікуватись, і одна її нитка передається в реципієнтний штам, а інша залишається на місті. Відбувається комплементарний синтез іншої нитки ДНК. Таким чином, F⁺-фактор мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала кон’югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже, може сама вступати в кон’югацію. Частота цього процесу – 10^-6-10^-8. В деяких випадках F-плазміда здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон’югацію з досить високою частотою – 10^-1-10^-4. Такий штам називають штамом Hfr (high frequency of recombination – висока частота рекомбінацій). На відміну від F+-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон’югацію з F–штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 510⁴ пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора.    Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор називається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

    Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різноманітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон’югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування.  

   Явище кон’югації досліджено для багатьох представників мікробного царства – кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших. Встановлено, що процес кон’югації може відбуватись не тільки в межах одного виду, але й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує на увагу факт передачі за допомогою кон’югації фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.    Трансдукція. У 1952 р. Н. Ціндер і Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон’югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон’югації, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бактеріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу фагами фрагментів ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта одержало назву трансдукції.    Вона часто відбувається в ентеробактерій, псевдомонад, стафілококів та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі профаг, тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищем у мікробному світі.    Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та абортивну.

   Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприклад, фаг λ E. coli має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag i bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag i bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна. Бактеріофаг φ 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.    Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприйнятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.    Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

    Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

   Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набувають токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.
   При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.
   Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репродукції віріонів.   Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також феномени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кроликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок курчат – штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви численних генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivо, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

Практичне значення генетики бактерій (Video–Бioтехнологiя)

    Генетичні феномени знайшли широке практичнезастосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біотехнології, сільського господарства.    Завдяки застосуванню генетичних методів, одержано високоактивні штами бактерій, грибів, актиноміцетів, дріжджів, які продукували у 200-1000 разів і більше амінокислот, органічних кислот, ферментів, вітамінів, кормового білка, порівняно з вихідними, а також вакцинні штами мікроорганізмів та вірусів. Використання різноманітних мутагенів (ультрафіолетове та радіоактивне опромінення, хімічні речовини) дозволило створити мутантний штам гриба Penicillium chryzogenum, який у дикому стані продукував 100 од/мл пеніциліну, а після направленої селекції – 10000 од/мл.
   Встановлено, що деякі мікроорганізми, наприклад, Fuzarium monilifore, синтезують біологічно активні субстанції типу фітогормонів, гіберелінів, біоінсектицидів та інших, які є ефективними стимуляторами росту й розвитку вищих рослин. Генетичні підходи дозволили проводити цілеспрямований селекційний процес для одержання продуцентів цих речовин.
   Суттєвий вклад вносить генетика у зменшення забруднення довкілля: очистка стічних вод, переробка відходів і побічних продуктів сільськогосподарського виробництва та промисловості, запропонувавши спеціально селекціоновані з цією метою мікроорганізми.

   Стрімкий розвиток біологічної науки яскраво проявився у становленні генної та клітинної інженерії – сукупності експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени від одного організму до іншого. Вона народилась у 1972 р., коли американським дослідникам П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коену вдалось одержати гібрид вірусу мавпи SV-40 і бактеріофага λ.

    Ще донедавна можливість конструювання живих організмів із заданими властивостями здавалась недосяжною. Для здійснення цього фантастичного експерименту необхідно одержати відповідний ген, приєднати його до спеціального вектора – провідника, щоб не бути знищеним клітинними ферментами, ввести в іншу клітину і заставити там працювати. Для всіх цих операцій необхідна участь спеціальних ферментів (їх відомо вже декілька сотен), які здатні розрізати донорську ДНК і ДНК вектора в певних ділянках на окремі фрагменти. Інші ферменти необхідні для приєднання відповідних генів до ДНК. Для розшифровування будови генів використовують методи біохімічного синтезу за участю ферментів ревертаз. Як вектори використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги, деякі віруси. Вони здатні реплікуватись у клітині-реципієнті і містять один або декілька маркерів, що дозволяють розпізнавати рекомбінантні клітини.

 

Про високу ефективність генно-інженерних методів одержання хімічно чистих біологічно активних речовин свідчить такий факт. Щоб одержати 5 мг соматотропіну, було використано мозок 500 000 овець протягом 5 років, в той час як аналогічну кількість гормону дають 9 л бульйонної суспензії кишкової палички.
   Генна інженерія надала можливість одержати інсулін, простагландини, енкефаліни, інтерферон, інтерлейкіни, гормони, різноманітні ферменти, численні хімічно чисті вуглеводи – глюкозу, ксиліт тощо. Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами

   Медична наука стоїть на порозі розробки методів генної хірургії. Наприклад, у людини деколи зустрічається вроджена недостатність ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). У такому випадку вона схильна до подагри, часто спостерігається біль у суглобах, розвивається нирково-кам’яна хвороба. Експерименти на тваринах переконливо довели, якщо вмонтувати ген, відповідальний за синтез цього ферменту, в ретровірус і ввести його у спинний мозок білих мишей, вони починають синтезувати ГГФРТ. Клонований з макрофагів людини ген фактору некрозу пухлин у кишковій паличці при введенні її білим мишам із саркомами викликає їх руйнування.    Широкі перспективи відкриває генна інженерія на шляху створення високоефективних засобів специфічної профілактики інфекційних захворювань. Введення в геном кишкових паличок, вірусів вісповакцини, дріжджів деяких генів вірусів гепатиту В, ящура дозволили розробити субодиничні вакцини.

Таким чином, мікробіологічна наука дозволяє створити струнку систему взаємопов’язаних галузей біотехнології, які мають унікальну перевагу – вони засновані на функціонуванні природних систем, які підпорядковуються інтересам людини.

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ

     Способи збільшення інформації:

     – дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів

     – зсув рамки трансляції

     – сплайсинг  (вирізання інтронів)

     – транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

У вірусів можуть бути:

     Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин)

     Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах

     Рекомбінації

 

ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ

  1. Рекомбінація: Обмін генами (міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)

Схрещування близьких за властивостями вірусів при одночасному культивуванні.

Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена  чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і  вірусу вісповакцини

  2. Множинна реактивація: вірусна інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси

  3.  Пересортування генів:  між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.

 

  4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.

  Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл

  5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.

Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.

  6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)

 

ВИДИ НЕГЕНЕТИЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

     1. Фенотипове змішування

     2. Негенетична реактивація

     3. Комплементація

     4. Стимуляція

     5. Інтерференція