Класифікація мікроорганізмів. Загальна характеристика прокаріотів

Класифікація мікроорганізмів. Загальна характеристика прокаріотів

Морфологія бактерій. Фарбування бактерій за Грамом

У даному розділі розглядаються методи дослідження морфологічних особливостей основних представників різноманітних мікроорганізмів: бактерій, актиноміцетів, грибів, найпростіших, рикетсій. Всі вони належать до одноклітинних організмів, мають різну форму і внутрішню структуру, які досліджують за допомогою описаних вище методів мікроскопії.

 

Мікроорганізми — найбільш ранні представники живих істот на Землі, що з’явилися 3,5—3,8 млрд років тому. Деяких із них виявляють і в наші дні у найдавніших геологічних відкладеннях.

Проблема походження й еволюції мікроорганізмів надзвичайно складна. Одні дослідники вважали, що мікроорганізми — первинні живі істоти; на думку інших, їм передували неклітинні форми організмів (археобїонти, фотобіонти, протобіонти та ін.).

Після відкриття у XVII ст. А. Левенгуком мікроскопічних живих істот минуло майже два Століття, протягом яких був нагромадже­ний великий фактичний матеріал, що показав їх відмінність від тварин і рослин. Це дало змогу Е. Геккелю в 1866 р. виділити водоро­сті, гриби, найпростіші І бактерії у самостійне царство Protista (першоістоти).

Згідно з класифікацією К- Лемана та Р. Неймана, усі мікроорганізми за морфологією було поділено на три родини: Coccaceae, Bacte–riaceae, Spirillaceae. У міру нагромадження нових наукових даних про мікроорганізми ця класифікація зазнала істотних змін і була значно доповнена, проте і в зміненому вигляді вона не могла задо­вольнити мікробіологів, тому створювались більш досконалі і сучасні класифікації.

В основі сучасної класифікації мікроорганізмів лежить розташування їх за таксономічними категоріями (таксонами) на основі схожості споріднених ознак. Номенклатура — це система назв таксономічних категорій відповідно до міжнародних правил.

Чим більше відомостей є про мікроорганізми, тим точніше їх можна віднести до відповідної таксономічної категорії. Вивчення за до­помогою сучасних методів морфології, біохімії, фізіології, генетики бактерій дає змогу дістати нові дані, що використовуються для вдо­сконалення існуючої класифікації.

Великого поширення набули методи геносистематики і числової (нумеричної)  таксономії.

В основу геносистематики покладено визначення подібності ї відмінності ДНК бактерій. Ступінь їх спорідненості визначається за подібністю вмісту в молекулі ДНК нуклеотиду гуаніну і цитозину (Г + Ц).роблено також методи молекулярної гібридизації ДНК, з’ясування нуклеотидної послідовності генів, за допомогою яких можна визначити спорідненість у межах виду. Мікроорганізми від­носять до одного виду, якщо гомологія ДНК досягає 80—90 %. При цьому враховують і інші критерії подібності (морфологічні, біохімічні, фізіологічні тощо).

Числова таксономія визначає спорідненість між мікроорганізмами за подібністю численних характеристик.

Це математичний метод класифікації, який набрав поширення з розвитком комп’ютерної техніки.

Чим більше ознак відомо про мікроорганізми, тим достовірнішим буде коефіцієнт подібності. Мікроорганізми, що мають 90 % подібності, відносять до одного виду; 70 % — до іншого.

 

Перелічені методи мають відносні границі точності, тому пара­лельно обов’язково треба враховувати й інші критерії подібності.

 

 

Найефективнішим методом таксономії є поєднання геносистема-тики і числової таксономії з класичними методами, що враховують морфологію, біохімію, фізіологію та інші властивості бактеріальної клітини.

У 1923 р. Д. Бергі склав перший міжнародний визначник бак­терій. Наступні видання (1938—1974) визначника під назвою «Вег-gey‘s Manual of Determinative Bacteriology» були підготовлені Між­народним комітетом систематики бактерій.

Відповідно до нового кодексу номенклатури бактерій, що діє з 1 січня 1980 p., запроваджено такі міжнародні класифікаційні ка­тегорії царства Procaryotae: Розділ — Клас — Порядок — Роди­на — Рід — Вид. Основною номенклатурною одиницею є вид.

За сучасними даними, вид бактерій розглядають як сукупність популяцій, що мають такі властивості: 1) спільне походження; 2) пристосованість до певного середовища життя; 3) подібність обмі­ну речовин та характеру міжвидових відношень; 4) наявність подіб­ного генетичного апарату, морфологічних та фізіологічних ознак.

Для визначення виду мікроорганізму спочатку систематизують основні його ознаки (морфологія, рухливість, спороутворення, біо­хімічні та інші властивості), а потім за ними ототожнюють (ідентифі­кують) мікроорганізм і знаходять за визначником його місце в кла­сифікації бактерій.

У мікробіології, як і в біології, для визначення видів бактерій прийнято подвійну (бінарну) номенклатуру, яка характеризується тим, що кожен вид має родову і видову назви. Родову назву пишуть з великої літери, видову — з малої. Так, наприклад, гноєрідний ста­філокок називається Staphylococcus aureus, коринебактерія дифтерії — Corynebacterium diphtheriae, мікобактерія туберкульозу — Mycobacterium tuberculosis, бацила сибірки — Bacillus anthracis, клостридії правця — Glostridium tetani, бліда трепонема — Тгеро-nema pallidura та ін.

Якщо при вивченні виділених бактерій виявляють відхилення від типових видових властивостей, то таку культуру розглядають як підвид.

Є також інфрапідвидовий поділ, що грунтується на відмінності за якимись незначними спадковими властивостями: антигенними — серовар, морфологічними — морфовар, хімічними — хемовар, біохїмічними або фізіологічними — біовар, патогенністю— иатовар, від* ношенні до фагів — фаговар.

З розвитком генетики і селекції мікроорганізмів запроваджено поняття популяції — елементарної еволюційної одиниці (структури) групи особин певного виду. Клон — це сукупність особин, що походять від однієї клітини.

Під терміном «штам» розуміють культуру бактерій, виділену з організму людини або тварини і з зовнішнього  середовища.

Мішаними культурами називають суміш неоднорідних мікроорга­нізмів, виділених із природних субстратів (нестерильних порожнин, тканин організму, харчових продуктів, води, повітря, грунту, змивів із предметів). Чисті культури — це мікроорганізми одного виду або підвиду.

 

Бактерії різних морфологічних форм:

мікрококи                                                           диплококи

стрептококи                                           тетракоки                                  сарцини

  

стафілококи

   

СИСТЕМАТИКА БАКТЕРІЙ

У 1984 р. вийшло в світ нове видання систематики бактерій Вег-gey‘s Manual of Systematic Bacteriology, у підготовці якого брали участь 124 вчених із 14 країн світу. У ньому більш детально і повно подано відомості про мікроорганізми загального, медичного або про­мислового значення, їх нумеричну таксономію, а також генетичний, серологічний і хемотаксономічний методи дослідження більшості най­важливіших патогенних для людини і тварин видів.Викладено основи номенклатури бактерій та принципи їх ідентифікації, дано екологічну характеристику (місця існування, ніші), наведено рецепти середовищ для виділення культур деяких груп бактерій. Подано основні дані з генетики, фаго- і серотипування, бактеріоцинотипування мікро­організмів, резистентності їх до антибіотиків, патогенності для людини і тварин, перелічено основні фактори патогенності, а також інші   властивості.

У І томі посібника наведено грамнегативні аероби й анаероби, які поді­ляються   на   11   груп.

Г р у п а 1. Спірохети: родина Spirochaetaceae (роди Spirochaeta, Cristispi–ra, Treponema, Borrelia), родина Leptospiraceae (рід Leptospira), інші організми.

Група 2. Аеробні (мікроаерофільні, рухливі, спіралеподібні), вібрі-оноподібні бактерії (роди Spirillum, Campylobacter, Bdellovibrio, Azospiril–lum, Vampirovibrio та ін.).

Група 3. Нерухомі (або рідко рухливі) зігнуті бактерії: родина Spirosomaceae (роди Spirosoma, Runella, Flectobacillus та ін.).

Група 4. Аеробні палички і коки: родина Pseudomonadaceae, Azoto–bacteriaceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae, Acetobacteri–aceae, Legionellaceae, Neisseriaceae (роди Flavobacterium, Alcaligenes, Brucella, Bordetella, Francisella та  ін.).

Група 5. Факультативно анаеробні палички: родини Enterobacte–гіасеае, Vibrionaceae, Pasteurellaceae (роди Pasteurella, Haemophilus, Actino–bacillus, Proteus, Provideneia, Morganella та ін.).

Група 6. Bacteroidaceae (роди Bacteroides, Fusobacterium, Leptotri–chia та  ін.;  усього  13 родів).

Група 7. Бактерії, які розщеплюють сульфат і відновлюють сірку (роди Desulfuromonas, Desulfovibrio, Desulfococcus та ін.; усього 7 родів).

Група 8. Анаеробні грамнегативні коки. Родина І. Veillonellaceae (роди Veillonella, Aciaaminococcus, Megasphaera).

Група 9. Рикетсії і хламідії: порядки Rickettsiales, Chlamydiales.

Група 10. Мікоплазми: родина Mycoplasmataceae (роди Mycoplasma, Ureaplasma), Acholeplasmaceae (рід Acholeplasma), Spiroplasmataceae (рід Spi–roplasma) та ін.

F p у п а 11. Ендосимбіонти —бактерії, що живуть на найпростіших комахах, грибах, безхребетних.

У II томі (Firmicutes) дано характеристику грампозитивним бактеріям.

Група 12. Родина Місгососсасеае, роди Micrococcus, Stomatococcus, Staphyloeoccus; 10 родів (без родин): Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Peptococcus,   Peptostreptococcus,  Sarcina  та  ін.

Група   13. Роди Bacillus, Clostridium та ін.

Група   14. Роди Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix  та ін.

Група 15. Роди Corynebaoterim, Propionibacteriurn, Actinomycetes, Bifidobacterium.

Група    16. Родина Mycobacteriaceae, рід Mycobacterium.

Г р у п а 17. Некордіоформні бактерії, роди Nocardia, Pseudonocardia та ін.

До III тому входять археобактерії*, ціанобактерії** і решта грамнега-тивних видів, до IV тому — актиноміцети.

Бактеріальна таксономія, що розпочиналась в основному як інтуїтивний процес, тепер є цілком об’єктивною в результаті розвитку кількісних методів. Можна з певністю стверджувати, що класифіка­ція бактерій, наведена в останньому виданні визначника, найближ­чим часом буде перероблена у зв’язку з появою нових даних про мікроорганізми.

 

 

Зовнішній вид мікроорганізмів напрочуд різноманітний. За формою бактерії поділяють на кокоподібні, паличкоподібні, звивисті та ниткоподібні.

   Коки (kokkos – зерно, кісточка) – кулясті мікроорганізми сферичної, еліпсоподібної, ланцетоподібної або бобовоподібної форми. За картиною розташування мікробів у мазках, яка залежить від способу поділу клітин і наступного їх розходження, кокоподібні бактерії поділяють на ряд груп.

  Мікрококи (micros – дрібний) характеризуються поодиноким і безладним розташуванням клітин. Як правило, це сапрофітні мікроорганізми і за звичайних умов не викликають захворювань у людини. Проте в осіб з імунодефіцитними станами або тих, хто переніс складні операції, трансплантації органів і тканин, вони можуть спричиняти бактеріємію, гнійно-септичні ускладнення.

 

 Диплококи (diploos – подвійний) – група коків, які після поділу не розходяться, а існують парами. Типовими представниками є збудники епідемічного цереброспінального менінгіту та гонореї. Ці мікроорганізми мають характерну бобовоподібну форму і в мазках увігнутими сторонами повернуті один до одного. Збудники крупозної пневмонії та деяких інших гнійно-септичних процесів також належать до диплококів, але мають ланцетоподібну форму або форму полум’я свічки.

Neisseria meningitidis                Pneumococcus

Neisseria gonorrhoeae

 

 Стрептококи (streptos – намисто) – мікроби, які після поділу в одній площині не розходяться, а формують ланцюжки, що складаються з 3-4, а деколи й десятків клітин круглої або еліпсоподібної форми.

 

Частина їх є сапрофітами, представниками нормальної мікрофлори людини, інші викликають важкі гнійно-септичні процеси (пневмонію, менінгіт, остеомієліт, холецистит, сепсис тощо). Доказана роль стрептококів у розвитку скарлатини, ревматизму, бешихи.   

 

 

Тетракоки (tetra – чотири) – коки, які після поділу у двох взаємно перпендикулярних площинах утворюють тетради. Як правило, ці мікроорганізми непатогенні для людини.

 

Сарцини (sarcina – пака, тюк) – коки, у яких поділ відбувається в трьох взаємно перпендикулярних площинах, а після поділу вони не розходяться і розташовуються у вигляді паків з 8, 16, 32, 64 клітин.

Патогенних представників серед них немає.

Стафілококи (staphyle – гроно) – коки, які діляться в декількох площинах, клітини розташовуються хаотично, у вигляді скупчень, що в мазках із чистої культури нагадують виноградне гроно.

Стафілококи – убіквітарні мікроби, зустрічаються в повітрі, грунті, організмі людини і тварин. Чисельні їх представники спричиняють різноманітні гнійно-септичні захворювання: фурункул, карбункул, гідроаденіт, флегмону, нефрит, холецистит, менінгіт, пневмонію, сепсис тощо. Практично в організмі людини немає органів і тканин, які не ушкоджуються стафілококами.

         Не менш дивовижний світ паличкоподібних або циліндричних бактерій, які за своєю кількістю перевищують кокові мікроорганізми. Середні розміри їх 0,5-1,5 мкм завдовжки і 0,5-2 мкм завширшки.

         Паличкоподібні бактерії мають різноманітну форму (циліндричну, еліпсоподібну, овальну, веретеноподібну, у вигляді барабанної палички або тенісної ракетки). Їх кінці можуть бути рівні або нібито обрублені й навіть увігнуті (збудник сибірки), заокруглені (кишкові палички, збудники черевного тифу, дизентерії). Зустрічаються паличкоподібні форми із загостреними кінцями (фузобактерії), булавоподібними потовщеннями на них. Часто трапляються мікроби, що мають розгалуження (мікобактерії туберкульозу). Це дозволяє розпізнавати вид мікроорганізмів, що має велике значення при лабораторній діагностиці.

   Паличкоподібні бактерії, залежно від здатності утворювати спори та їх діаметру, поділяють на власне бактерії, бацили і клостридії.   Власне бактерії – мікрооганізми, які не здатні до утворення спор. До них належать збудники сальмонельозів, черевного тифу, дифтерії, туберкульозу, кашлюка.

Бацили (bacillus – паличка) і клостридії (closter – веретено) здатні утворювати спори. До першої групи належать збудники сибірки, до другої – збудники газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму.

   За аналогією з коками, залежно від способу розташування у мазках, паличкоподібні мікрооганізми поділяють на: а) монобактерії (кишкова, черевнотифозна, дизентерійна палички, збудник чуми

E. coli         Y. pestis

і монобацили (збудники правця, ботулізму);

C. tetani                                              C. botulinum

 

б) диплобактерії (клебсієли пневмонії) і диплобацили;

K. pneumoniae

в) стрептобактерії (збудники м’якого шанкру) і стрептобацили (збудники сибірки).

Haemophilus ducreyi     Bacillus anthracis

Спіралеподібні бактерії мають звивисту, штопороподібну форму. До цієї групи бактерій належать вібріони, спірили, спірохети.

         Вібріони (vibrare – коливатись, тремтіти) – бактерії, з одним невеликим вигином розміром 1/4 завитка спіралі, що надає їм схожість із комою.

Vibrio cholerae

 

Представниками цієї групи є збудники холери і холероподібні вібріони, які населяють водоймища.
         Спірили (spira – завиток, спіраль) – бактерії, які мають декілька вигинів, що надає їм форму штопора. Патогенним представником є спірила, яка викликає у людини содоку (хворобу укусу щурів).

Spirillum minus

До цієї групи мікроорганізмів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спричиняти у людини захворювання шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи.

         Спірохети (speira – виток, haite – довге волосся) також мають штопороподібну форму і розрізняються між собою числом завитків і довжиною (довжина може сягати 500 мкм, а діаметр збудників – 0,3-1,5 мкм). Серед них виділяють патогенні для людини трепонеми (trepo – повертати, nemo – нитка),

Treponema pallidum

 

борелії (за прізвищем французького бактеріолога A. Боррела)

Borrelia. Borrelia hispanica, Borrelia persica

 і лептоспіри (leptos – тонкий, ніжний).

Leptospira interrogans

 

Tрепонеми викликають у людини сифіліс, лептоспіри – лептоспіроз, борелії – поворотний тиф. Існує велика група непатогених спірохет (власне спірохети, сапроспіри, кристиспіри).

      Ниткоподібні бактерії для людини непатогенні. Тіобактерії та залізобактерії є мешканцями грунтів, водоймищ, беруть участь у процесах кругообігу речовин у природі. До цієї групи мікроорганізмів можна віднести й актиноміцети, які здатні викликати у людини тяжкі захворювання – актиномікози.

       Описані морфологічні форми бактерій не обмежують існування мікробного царства. Деякі його представники можуть нагадувати кільце, шестикутну зірку, набувати червоподібної форми. Це, в основному, вільноживучі мікроорганізми, які беруть участь у процесах біодеградації різноманітних природних сполук. Патогених представників серед них немає, і в курсі медичної мікробіології вони не розглядаються.

Складні методи забарвлення

   При складних методах, які ще називають диференціально-діагностичними, використовують декілька різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості хімічного складу клітини або наявність у неї певних структур.
   Для фарбування беруть розведені водно-спиртові або водно-фенолові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.
   Забарвлення мікроорганізмів за методом Грама. Метод Грама є найважливішим методом забарвлення мікробів і виявлення їх тинкторіальних властивостей. Він дозволяє поділити мікроорганізми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапляються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризуються як грамваріабельні.
   Метод було розроблено Кристіаном Грамом у 1884 р. Однак до цього часу остаточно не з’ясовано механізми різного забарвлення мікроорганізмів. Вважають, що така здатність пов’язана з відмінностями у будові пептидоглікану в клітинній стінці грампозитивних бактерій, наявністю тейхоєвих кислот, вищою, порівняно з грамнегативними, концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнат магнію в клітині, співвідношенням РНК:ДНК в цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1), а також більш кислим значенням рН в ізоелектричній точці цитоплазми.
   Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних бактерій здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.
   Грампозитивними є стафілококи, стрептококи, пневмококи, сарцини і монококи, бацили і клостридії, а також дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативні – гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.
   Методика забарвлення полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв (у модифікації Синьова використовують суху полоску фільтрувального паперу, заздалегідь просочену 1 % спиртовим розчином кристалвіолету і висушену, на яку наливають 2-3 краплі води).
   Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують.

Ультраструктура бактеріальної клітини. Бактеріальні клітини є прокаріотичними живими системами.

 

 

 

Між ними та еукаріотами (eu – справжній, karyon – ядро) існують суттєві відмінності, які дозволяють віднести представників мікробного світу до єдиного царства. Слід пам’ятати, що в еукаріотів тканини та органи складаються з окремих клітин, що знаходяться у фізіологічній метаболічній залежності і не можуть існувати окремо. Мікробна клітина – абсолютно автономний складний організм, здатний до самостійного, індивідуальнго існування.

  Найсуттєвішою ознакою прокаріотів є відсутність ядра. Його роль відіграє нуклеоїд – ядерна речовина, яка дифузно розташована в цитоплазмі та не відмежована від неї каріолемою. Нуклеоїд клітини складається з однієї нитки ДНК, замкненої в кільце, гістоноподібні білки та ядерце відсутні. У бактерій немає таких органел, як мітохондрії, апарат Гольджі, ендоплазматичний ретикулюм, хлоропласти, мікротільця. Проте вони мають мезосоми, функція яких аналогічна мітохондріальній. Константа седиментації мікробних рибосом складає 70S, в той час як в еукаріотів – 80S. Існують також суттєві відмінності за будовою джгутиків, наявністю вакуолей тощо.
         Незважаючи на такі кардинальні відмінності в структурі клітин різних систем, загальний план їх будови залишається подібним. Прокаріотний організм містить у собі майже всі клітинні елементи: оболонку, цитоплазму, ядерний апарат, включення.  

Нуклеоїд. Ядерний апарат бактеріальної клітини займає її центральну частину, має неправильну форму і не відмежовується від цитоплазми оболонкою, поєднується з цитоплазматичною мембраною і мезосомою.

Він складається з однієї суперспіралізованої подвійної нитки ДНК діаметром до 2 нм, замкнутої в кільце, інтегрованої з РНК, РНК-полімеразою та білком у співвідношенні 1:1:3. Довжина цієї гігантської молекули може сягати до 1,5-3 мм. Молекулярна маса нуклеоїда – (1-3)х109 дальтон, і містить він до 8х106 пар нуклеїнових основ. Вміст пар основ А+Т і Г+Ц в молекулі кожної клітини є постійним для певного виду бактерій, а частка Г+Ц у загальній молекулярній масі становить 23-75 %.
         Як правило, в клітині нуклеоїд представлено однією копією, проте під час поділу клітини число цих копій може збільшуватись до 2-9.  Досить часто бактерії поруч із хромосомною містять позахромосомну ДНК значно менших розмірів, також скручену в кільце і локалізовану в цитоплазмі. Такі елементи одержали назву плазміди. Вони детермінують синтез деяких речовин, ферментів, забезпечують стійкість бактерій до антибіотиків, отже, надають їм певних селективних переваг.    Ядерну субстанцію мікробів можна виявити в ультратонких зрізах при дослідженні їх в електронному мікроскопі, за допомогою імунофлуоресцентної, радіоімунної мікроскопії, радіоавтографії, а також забарвлюючи її за методами Робіноу-Фельгена, Пікарського тощо.           Цитоплазма бактерійних клітин має рідку консистенцію, прозора, гомогенна, відмежовується від зовнішнього середовища цитоплазматичною мембраною. Вона є своєрідною колоїдною системою, що складається з різноманітних молекул білків, ліпідів, води, ДНК і РНК, вуглеводів, полісахаридів та інших сполук. В’язкість її у 800-8000 разів перевищує аналогічний показник води. Будова і консистенція цитоплазми залежить від віку мікроба – гомогенна у молодих клітин вона поступово перетворюється на дрібнозернисту структуру в старих, набуваючи вигляду щільників. У ній з’являються вакуолі, волокнисті утворення, збільшується її густина, за консистенцією вона нагадує гель.

 При ультрацентрифугуванні цитоплазми можна одержати “розчинну” фракцію, до якої входять різноманітні ферменти, і фракцію “часток” з мембран та рибосом. Рибосоми виконують роль фабрики синтезу білка, їх розмір досягає 16х18 нм. Складаються вони з двох білкових субодиниць 30S-50S. Клітина може містити до 5000-50000 begin_of_the_skype_highlighting  5000-50000 end_of_the_skype_highlighting рибосом, число їх збільшується при активному синтезі білка. Часом рибосоми збираються у скупчення, які називають полірибосомами або полісомами.            Відмінності між рибосомами еукаріотичних та прокаріотичних організмів мають вирішальне значення у пошуках шляхів боротьби з останніми як збудниками інфекційних захворювань. Відомо, що деякі антибіотики здатні частково або повністю припиняти синтез білка саме на 70S рибосомах, залишаючи інтактними 80S рибосоми.

         У процесі життєдіяльності мікрооганізмів у цитоплазмі з’являються морфологічно диференційовані частки, які називають включеннями. Вони бувають різними за своєю природою і виконують різноманітні функції.

Запасні речовини прокаріотів представлено полісахаридами, ліпідами, поліпептидами, поліфосфатами, сіркою. Як полісахариди відкладаються крохмаль, глікоген, гранульоза. У несприятливих умовах вони забезпечують клітину вуглецем та енергією.

  Ліпіди можуть накопичуватись у вигляді гранул β-оксимасляної кислоти, їх можна побачити навіть при звичайній мікроскопії, забарвлюючи препарати суданом ІІІ або суданом чорним.

  Широко розповсюджений тип поживних речовин – поліфосфати. Вони містяться у гранулах, які називають волютиновими, і використовуються клітинами як джерело фосфору. Крім того, вони мають макроергічні фосфатні зв’язки, отже, забезпечують потреби клітини в енергії. Зерна волютина називають ще метахроматичними включеннями, тому що вони забарвлюються в колір, невластивий основному барвнику. Наприклад, метиленова синька забарвлює їх у темно-фіолетовий колір, в той час як цитоплазму клітини – в голубий. Вперше включення такого типу було знайдено у Spirillum volutans, звідки вони й одержали таку назву. Наявність зерен волютину характерна для коринебактерій і, зокрема, для збудника дифтерії.

 

Гранули волютину у складі дифтерійних паличок

 

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки і капсули.

         Вміст клітини відмежовується від навколишнього середовища за допомогою цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) – м’якого, пластичного утворення. Її будова у прокаріотів і еукаріотів подібна, що свідчить про існування універсальної “елементарної мембрани”. Відрізняються вони тільки відсутністю стеролів у перших. Мембрана – обов’язковий структурний компонент мікробної клітини, без неї вони гинуть. За хімічним складом вона є білково-ліпідним комплексом із невеликою кількістю вуглеводів. Формуючи всього 8-15 % маси клітини, мембрана містить до 70-90 % її ліпідних субстанцій.

 

         Дослідження під електронним мікроскопом показали, що мембрана є багатошаровим утворенням. Вона складається з подвійного шару фосфоліпідних молекул. Гідрофобні їх кінці (фосфоліпіди та тригліцериди) спрямовані всередину, а гідрофільні “головки” – назовні. Такий тип розташування стабілізує мембрану. В цей шар вмонтовано інтегральні білки, які пронизують його наскрізь. Деякі групи білків прикріплюються до поверхні мембрани, тому їх називають периферійними. Деколи мембрана покривається ще одним особливим типом білка – поверхневим.

Функції мембранного комплексу різноманітні: він забезпечує селективну проникність та транспорт різноманітних речовин іззовні всередину і навпаки завдяки існуванню в ньому особливих білків-ферментів пермеаз; здійснює транспорт електронів та окисне фосфорилювання субстратів; генерує електрохімічну енергію трансмембранного потенціалу; виділяє гідролітичні ферменти; проявляє біосинтетичну активність; є місцем прикріплення джгутиків.

  Виявити цитоплазматичну мембрану можна в ультратонких зрізах бактерій під електронним мікроскопом.
         Деякі поверхнево-активні речовини і антибіотики (поліміксини) здатні руйнувати мембрану і викликати загибель клітини. Це використовується в пошуках оптимальних шляхів боротьби зі збудниками інфекційних хвороб.
         Клітинна стінка. Клітинна стінка створює захисний шар, який врівноважує високий внутрішній осмотичний тиск бактерій (5-20 атмосфер). Таку міцність забезпечує речовина – муреїн, пептидоглікан. Він складається з особливих полімерних ланцюгів, у яких чергуються залишки N-ацетилмурамової кислоти і N-ацетилглюкозаміну, в свою чергу сполучених між собою 1,4-глікозидними зв’язками. Залишки мурамової кислоти з’єднуються пептидними зв’язками із тетрапептидами амінокислот: L– і D-аланіну, D-глутамінової та мезодіамінопімелінової кислот, L-лізину. Пептидними містками такі гетерополімерні ланцюги зв’язуються між собою, утворюючи гігантський муреїновий мішок.

Те, що до складу бактерій входять речовини, відсутні в тваринних і рослинних клітинах (N-ацетилмурамова кислота і N-ацетилглюкозамін), створює можливість цілеспрямованого знищення бактерій деякими антибіотиками (пеніциліни, цефалоспорини), оскільки клітинні стінки еукаріотів при цьому не пошкоджуються.   

Створена з муреїну структура виконує функцію опорного каркасу, надаючи форму мікробній клітині, крім того, з ним зв’язуються інші речовини.
         За особливостями будови мікробного муреїнового каркасу і вмістом деяких речовин у клітинній стінці можна відрізнити так звані грампозитивні бактерії від грамнегативних. Поділ їх на ці дві групи було запропоновано у 1884 р. Христіаном Грамом, який звернув увагу на особливості фарбування мікробів.

   У грампозитивних бактерій муреїновий шар складає 30-70 % маси клітинної стінки, утворюючи до 40 шарів. Замість мезодіамінопімелінової кислоти в ньому міститься LL-діамінопімелінова кислота або лізин. Суттєвою особливістю є наявність особливих тейхоєвих кислот.

 

 

 

Клітинна стінка крім опорної та захисної виконує ще ряд важливих функцій. Зокрема, вмонтовані у фосфоліпідний шар трансмембранні білки (порини) – це заповнені водою канали, через які проходять низькомолекулярні сполуки. Периплазматичний простір між цитоплазматичною мембраною та клітинною стінкою у грамнегативних бактерій виступає сховищем для різноманітних ферментів – деполімераз, протеїназ, нуклеаз, рестрикційних ферментів, відіграє роль у забезпеченні осморегуляції.
         Під впливом різноманітних речовин клітинна стінка може бути знищена. Так, при дії лізоциму на суспензії грампозитивних мікрококів виникає їх швидкий лізис і просвітління середовища. Аналогічний ефект спричиняє пеніцилін. Лізоцим розриває в муреїні глікозидні зв’язки, а пеніцилін попереджує утворення пептидоглікану, що супроводжується руйнуванням клітинної стінки. При цьому утворюються чутливі до осмотичних умов округлі клітини – протопласти, у яких повністю втрачена клітинна стінка. При дії вказаних препаратів на грамнегативні бактерії формуються клітини, які зберігають рештки клітинної стінки. Їх називають сферопластами.

Капсула. Зовні бактеріальна клітина може бути вкрита речовиною слизового характеру. Вона не має для мікроба життєзабезпечуючого значення, однак захищає його від дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, надає стійкості до фагоцитозу, захищає від проникненя бактеріофагів, забезпечує вірулентні властивості збудників. За своєю хімічною будовою капсула належить до полісахаридних субстанцій, а у B. anthracis – до білкових. Характерним для капсули є наявність великої кількості води.

 

 

 

 

Капсулу можна розглядати у звичайному світловому мікроскопі, якщо забарвлювати нативні препарати простим методом. Однак для виявлення капсул частіше використовують метод Буррі-Гінса, при якому фон препарата створюють тушшю, а мікроорганізм додатково забарвлюється фуксином. У таких випадках на темному фоні видно червону паличку, яка оточена світлим ободком – капсулою.
         Джгутики. Поверхня тіла мікроорганізмів може бути вкрита особливими виростами, що називаються джгутиками, які забезпечують локомоторну функцію. Їх число, спосіб розміщення, довжина є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховується при проведенні систематики прокаріотичних організмів.

   Довжина джгутиків досягає 20 мкм, тоді як товщина – всього 12-18 нм, що лежить за межами роздільної здатності мікроскопа. Джгутики бактерій складаються із спірально закручених ниток особливого білка флагеліну, який утворює спіраль навколо внутрішнього порожнистого простору. У них виділяють три основні частини: спіральну нитку, гак та базальне тіло (два – чотири спеціальних кільця з центральним стержнем), за допомогою яких джгутик закріплюється у цитоплазматичній мембрані та клітинній стінці).

 

Розподіл мікроорганізмів за розташуванням джгутиків

(1) монотрихи (cholera vibrio),

(2) амфітрихи (Spirillum volutans),

(3) лофотрихи (бацила синєзеленого гною, Alcaligenes faecalis),

(4) перитрихи (colibacillum, salmonellae typhi i paratyphi A i B)

 

Спороутворення. На певній стадії свого розвитку, коли запаси поживних речовин вичерпуються, бактерії всередині формують спору (ендоспору) округлої форми.

 

 

 

 

Від вегетативних форм вони відрізняються пригніченням функціонування генетичного апарата, майже повною відсутністю обміну речовин, малою кількістю вільної води, підвищеною концентрацією іонів кальцію, появою у складі дипіколінової кислоти, з якою пов’язують термостійкість спор. Для них характерна поява додаткових оболонок, які запобігають дифузії і проникненню речовин іззовні, більш висока стійкість до пошкоджуючих факторів зовнішнього середовища і здатність тривалий час зберігати свою життєздатність. Спори утворюють два роди грампозитивних паличок – Bacillus (спора за діаметром менше поперечника палички) i Clostridium (спора перевищує розміри палички) і один рід грампозитивних коків (Sporosarcina).    Спори утворюються тільки в зовнішньому середовищі, в організмі тварин та людини процесу споруляції не відбувається. Вони мають еволюційне значення, забезпечуючи збереження виду, а не виконуючи функцію розмноження.

Спороутворення починається, коли в оточуючому клітину середовищі зникають джерела азоту та вуглецю.   Спочатку в клітині при інвагінації мембрани виділяється особливе термінальне ядро, яке містить один клітинний геном, компоненти апарата синтезу білка і власну енергетичну систему. Воно вкривається власною мембраною та мембраною материнської клітини, які утворюють стінку спори. Вона складається з нормального пептидоглікану. Стінку оточує кора, яка містить незвичний пептидоглікан з малим числом поперекових з’єднань і чутливий до лізоциму (автоліз його відіграє вирішальну роль у процесі проростання спори). Оболонка спори складається з кератиноподібного білка і зумовлює погану проникність і стійкість його до хімічних речовин. Екзоспорій оточує всю спору і складається з ліпопротеїнів.

Індукція спороутворення відбувається протягом декількох годин. Розрізняють декілька стадій: підготовчу, передспори, утворення оболонок і дозрівання.

 

Наявність спор у бактерій може мати діагностичне значення, а також спричиняє вибір тактики при знезаражуванні хірургічного інструментарію та перев’язного матеріалу.

  Спори мають здатність сильно заломлювати світло, тому на незафарбованих препаратах їх видно у вигляді блискучих зерен. У зв’язку з тим, що вони стійкі до дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, забарвлювати їх досить важко. Найчастіше використовується метод Ожешко, при якому спори попередньо протравлюють соляною кислотою, а потім забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори при цьому набувають червоного, а вегетативна клітина – голубого забарвлення.

 

.

Мазок із спорової культури  мікроорганізмів і забарвлення його за методом Ауеско: (Ожешки)

 

 

 

Морфологія і структура бактерій. Основні методи дослідження бактерій. Складні методи фарбування.

 

Морфологія і особливості будови спірохет, актиноміцетів, рикетсій, хламідій, мікоплазм, грибів, найпростіших.

 

 

 

Ультраструктура бактеріальної клітини. Бактеріальні клітини є прокаріотичними живими системами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Між ними та еукаріотами (eu – справжній, karyon – ядро) існують суттєві відмінності, які дозволяють віднести представників мікробного світу до єдиного царства. Слід пам’ятати, що в еукаріотів тканини та органи складаються з окремих клітин, що знаходяться у фізіологічній метаболічній залежності і не можуть існувати окремо. Мікробна клітина – абсолютно автономний складний організм, здатний до самостійного, індивідуальнго існування.

 

  Найсуттєвішою ознакою прокаріотів є відсутність ядра. Його роль відіграє нуклеоїд – ядерна речовина, яка дифузно розташована в цитоплазмі та не відмежована від неї каріолемою. Нуклеоїд клітини складається з однієї нитки ДНК, замкненої в кільце, гістоноподібні білки та ядерце відсутні. У бактерій немає таких органел, як мітохондрії, апарат Гольджі, ендоплазматичний ретикулюм, хлоропласти, мікротільця. Проте вони мають мезосоми, функція яких аналогічна мітохондріальній. Константа седиментації мікробних рибосом складає 70S, в той час як в еукаріотів – 80S. Існують також суттєві відмінності за будовою джгутиків, наявністю вакуолей тощо.

         Незважаючи на такі кардинальні відмінності в структурі клітин різних систем, загальний план їх будови залишається подібним. Прокаріотний організм містить у собі майже всі клітинні елементи: оболонку, цитоплазму, ядерний апарат, включення. 

 

Нуклеоїд. Ядерний апарат бактеріальної клітини займає її центральну частину, має неправильну форму і не відмежовується від цитоплазми оболонкою, поєднується з цитоплазматичною мембраною і мезосомою.

 

Він складається з однієї суперспіралізованої подвійної нитки ДНК діаметром до 2 нм, замкнутої в кільце, інтегрованої з РНК, РНК-полімеразою та білком у співвідношенні 1:1:3. Довжина цієї гігантської молекули може сягати до 1,5-3 мм. Молекулярна маса нуклеоїда – (1-3)х109 дальтон, і містить він до 8х106 пар нуклеїнових основ. Вміст пар основ А+Т і Г+Ц в молекулі кожної клітини є постійним для певного виду бактерій, а частка Г+Ц у загальній молекулярній масі становить 23-75 %.

         Як правило, в клітині нуклеоїд представлено однією копією, проте під час поділу клітини число цих копій може збільшуватись до 2-9.  Досить часто бактерії поруч із хромосомною містять позахромосомну ДНК значно менших розмірів, також скручену в кільце і локалізовану в цитоплазмі. Такі елементи одержали назву плазміди. Вони детермінують синтез деяких речовин, ферментів, забезпечують стійкість бактерій до антибіотиків, отже, надають їм певних селективних переваг.

   Ядерну субстанцію мікробів можна виявити в ультратонких зрізах при дослідженні їх в електронному мікроскопі, за допомогою імунофлуоресцентної, радіоімунної мікроскопії, радіоавтографії, а також забарвлюючи її за методами Робіноу-Фельгена, Пікарського тощо.

         Цитоплазма бактерійних клітин має рідку консистенцію, прозора, гомогенна, відмежовується від зовнішнього середовища цитоплазматичною мембраною. Вона є своєрідною колоїдною системою, що складається з різноманітних молекул білків, ліпідів, води, ДНК і РНК, вуглеводів, полісахаридів та інших сполук. В’язкість її у 800-8000 разів перевищує аналогічний показник води. Будова і консистенція цитоплазми залежить від віку мікроба – гомогенна у молодих клітин вона поступово перетворюється на дрібнозернисту структуру в старих, набуваючи вигляду щільників. У ній з’являються вакуолі, волокнисті утворення, збільшується її густина, за консистенцією вона нагадує гель.

 

 При ультрацентрифугуванні цитоплазми можна одержати “розчинну” фракцію, до якої входять різноманітні ферменти, і фракцію “часток” з мембран та рибосом. Рибосоми виконують роль фабрики синтезу білка, їх розмір досягає 16х18 нм. Складаються вони з двох білкових субодиниць 30S-50S. Клітина може містити до 5000-50000 рибосом, число їх збільшується при активному синтезі білка. Часом рибосоми збираються у скупчення, які називають полірибосомами або полісомами.            Відмінності між рибосомами еукаріотичних та прокаріотичних організмів мають вирішальне значення у пошуках шляхів боротьби з останніми як збудниками інфекційних захворювань. Відомо, що деякі антибіотики здатні частково або повністю припиняти синтез білка саме на 70S рибосомах, залишаючи інтактними 80S рибосоми.

 

 

         У процесі життєдіяльності мікрооганізмів у цитоплазмі з’являються морфологічно диференційовані частки, які називають включеннями. Вони бувають різними за своєю природою і виконують різноманітні функції.

 

Запасні речовини прокаріотів представлено полісахаридами, ліпідами, поліпептидами, поліфосфатами, сіркою. Як полісахариди відкладаються крохмаль, глікоген, гранульоза. У несприятливих умовах вони забезпечують клітину вуглецем та енергією.

 

  Ліпіди можуть накопичуватись у вигляді гранул β-оксимасляної кислоти, їх можна побачити навіть при звичайній мікроскопії, забарвлюючи препарати суданом ІІІ або суданом чорним.

 

  Широко розповсюджений тип поживних речовин – поліфосфати. Вони містяться у гранулах, які називають волютиновими, і використовуються клітинами як джерело фосфору. Крім того, вони мають макроергічні фосфатні зв’язки, отже, забезпечують потреби клітини в енергії. Зерна волютина називають ще метахроматичними включеннями, тому що вони забарвлюються в колір, невластивий основному барвнику. Наприклад, метиленова синька забарвлює їх у темно-фіолетовий колір, в той час як цитоплазму клітини – в голубий. Вперше включення такого типу було знайдено у Spirillum volutans, звідки вони й одержали таку назву. Наявність зерен волютину характерна для коринебактерій і, зокрема, для збудника дифтерії.

 

 

 

 

Гранули волютину у складі дифтерійних паличок

 

 

 

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки і капсули.

 

         Вміст клітини відмежовується від навколишнього середовища за допомогою цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) – м’якого, пластичного утворення. Її будова у прокаріотів і еукаріотів подібна, що свідчить про існування універсальної “елементарної мембрани”. Відрізняються вони тільки відсутністю стеролів у перших. Мембрана – обов’язковий структурний компонент мікробної клітини, без неї вони гинуть. За хімічним складом вона є білково-ліпідним комплексом із невеликою кількістю вуглеводів. Формуючи всього 8-15 % маси клітини, мембрана містить до 70-90 % її ліпідних субстанцій.

 

 

 

 

 

         Дослідження під електронним мікроскопом показали, що мембрана є багатошаровим утворенням. Вона складається з подвійного шару фосфоліпідних молекул. Гідрофобні їх кінці (фосфоліпіди та тригліцериди) спрямовані всередину, а гідрофільні “головки” – назовні. Такий тип розташування стабілізує мембрану. В цей шар вмонтовано інтегральні білки, які пронизують його наскрізь. Деякі групи білків прикріплюються до поверхні мембрани, тому їх називають периферійними. Деколи мембрана покривається ще одним особливим типом білка – поверхневим.

 

Функції мембранного комплексу різноманітні: він забезпечує селективну проникність та транспорт різноманітних речовин іззовні всередину і навпаки завдяки існуванню в ньому особливих білків-ферментів пермеаз; здійснює транспорт електронів та окисне фосфорилювання субстратів; генерує електрохімічну енергію трансмембранного потенціалу; виділяє гідролітичні ферменти; проявляє біосинтетичну активність; є місцем прикріплення джгутиків.

 

  Виявити цитоплазматичну мембрану можна в ультратонких зрізах бактерій під електронним мікроскопом.

         Деякі поверхнево-активні речовини і антибіотики (поліміксини) здатні руйнувати мембрану і викликати загибель клітини. Це використовується в пошуках оптимальних шляхів боротьби зі збудниками інфекційних хвороб.

         Клітинна стінка. Клітинна стінка створює захисний шар, який врівноважує високий внутрішній осмотичний тиск бактерій (5-20 атмосфер). Таку міцність забезпечує речовина – муреїн, пептидоглікан. Він складається з особливих полімерних ланцюгів, у яких чергуються залишки N-ацетилмурамової кислоти і N-ацетилглюкозаміну, в свою чергу сполучених між собою 1,4-глікозидними зв’язками. Залишки мурамової кислоти з’єднуються пептидними зв’язками із тетрапептидами амінокислот: L- і D-аланіну, D-глутамінової та мезодіамінопімелінової кислот, L-лізину. Пептидними містками такі гетерополімерні ланцюги зв’язуються між собою, утворюючи гігантський муреїновий мішок.

 

Те, що до складу бактерій входять речовини, відсутні в тваринних і рослинних клітинах (N-ацетилмурамова кислота і N-ацетилглюкозамін), створює можливість цілеспрямованого знищення бактерій деякими антибіотиками (пеніциліни, цефалоспорини), оскільки клітинні стінки еукаріотів при цьому не пошкоджуються.  

 

Створена з муреїну структура виконує функцію опорного каркасу, надаючи форму мікробній клітині, крім того, з ним зв’язуються інші речовини.

         За особливостями будови мікробного муреїнового каркасу і вмістом деяких речовин у клітинній стінці можна відрізнити так звані грампозитивні бактерії від грамнегативних. Поділ їх на ці дві групи було запропоновано у 1884 р. Христіаном Грамом, який звернув увагу на особливості фарбування мікробів.

 

   У грампозитивних бактерій муреїновий шар складає 30-70 % маси клітинної стінки, утворюючи до 40 шарів. Замість мезодіамінопімелінової кислоти в ньому міститься LL-діамінопімелінова кислота або лізин. Суттєвою особливістю є наявність особливих тейхоєвих кислот.

 

 

 

 

 

 

 

Клітинна стінка крім опорної та захисної виконує ще ряд важливих функцій. Зокрема, вмонтовані у фосфоліпідний шар трансмембранні білки (порини) – це заповнені водою канали, через які проходять низькомолекулярні сполуки. Периплазматичний простір між цитоплазматичною мембраною та клітинною стінкою у грамнегативних бактерій виступає сховищем для різноманітних ферментів – деполімераз, протеїназ, нуклеаз, рестрикційних ферментів, відіграє роль у забезпеченні осморегуляції.

         Під впливом різноманітних речовин клітинна стінка може бути знищена. Так, при дії лізоциму на суспензії грампозитивних мікрококів виникає їх швидкий лізис і просвітління середовища. Аналогічний ефект спричиняє пеніцилін. Лізоцим розриває в муреїні глікозидні зв’язки, а пеніцилін попереджує утворення пептидоглікану, що супроводжується руйнуванням клітинної стінки. При цьому утворюються чутливі до осмотичних умов округлі клітини – протопласти, у яких повністю втрачена клітинна стінка. При дії вказаних препаратів на грамнегативні бактерії формуються клітини, які зберігають рештки клітинної стінки. Їх називають сферопластами.

 

Капсула. Зовні бактеріальна клітина може бути вкрита речовиною слизового характеру. Вона не має для мікроба життєзабезпечуючого значення, однак захищає його від дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, надає стійкості до фагоцитозу, захищає від проникненя бактеріофагів, забезпечує вірулентні властивості збудників. За своєю хімічною будовою капсула належить до полісахаридних субстанцій, а у B. anthracis – до білкових. Характерним для капсули є наявність великої кількості води.

 

 

 

 

 

 

 

Капсулу можна розглядати у звичайному світловому мікроскопі, якщо забарвлювати нативні препарати простим методом. Однак для виявлення капсул частіше використовують метод Буррі-Гінса, при якому фон препарата створюють тушшю, а мікроорганізм додатково забарвлюється фуксином. У таких випадках на темному фоні видно червону паличку, яка оточена світлим ободком – капсулою.

         Джгутики. Поверхня тіла мікроорганізмів може бути вкрита особливими виростами, що називаються джгутиками, які забезпечують локомоторну функцію. Їх число, спосіб розміщення, довжина є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховується при проведенні систематики прокаріотичних організмів.

 

   Довжина джгутиків досягає 20 мкм, тоді як товщина – всього 12-18 нм, що лежить за межами роздільної здатності мікроскопа. Джгутики бактерій складаються із спірально закручених ниток особливого білка флагеліну, який утворює спіраль навколо внутрішнього порожнистого простору. У них виділяють три основні частини: спіральну нитку, гак та базальне тіло (два – чотири спеціальних кільця з центральним стержнем), за допомогою яких джгутик закріплюється у цитоплазматичній мембрані та клітинній стінці).

 

 

 

 

Розподіл мікроорганізмів за розташуванням джгутиків

 

(1)   монотрихи (cholera vibrio),

 

(2) амфітрихи (Spirillum volutans),

 

(3) лофотрихи (бацила синєзеленого гною, Alcaligenes faecalis),

 

(4) перитрихи (colibacillum, salmonellae typhi i paratyphi A i B)

 

 

 

 

 

 

 

 

Спороутворення. На певній стадії свого розвитку, коли запаси поживних речовин вичерпуються, бактерії всередині формують спору (ендоспору) округлої форми.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Від вегетативних форм вони відрізняються пригніченням функціонування генетичного апарата, майже повною відсутністю обміну речовин, малою кількістю вільної води, підвищеною концентрацією іонів кальцію, появою у складі дипіколінової кислоти, з якою пов’язують термостійкість спор. Для них характерна поява додаткових оболонок, які запобігають дифузії і проникненню речовин іззовні, більш висока стійкість до пошкоджуючих факторів зовнішнього середовища і здатність тривалий час зберігати свою життєздатність. Спори утворюють два роди грампозитивних паличок – Bacillus (спора за діаметром менше поперечника палички) i Clostridium (спора перевищує розміри палички) і один рід грампозитивних коків (Sporosarcina).

   Спори утворюються тільки в зовнішньому середовищі, в організмі тварин та людини процесу споруляції не відбувається. Вони мають еволюційне значення, забезпечуючи збереження виду, а не виконуючи функцію розмноження.

 

Спороутворення починається, коли в оточуючому клітину середовищі зникають джерела азоту та вуглецю.

   Спочатку в клітині при інвагінації мембрани виділяється особливе термінальне ядро, яке містить один клітинний геном, компоненти апарата синтезу білка і власну енергетичну систему. Воно вкривається власною мембраною та мембраною материнської клітини, які утворюють стінку спори. Вона складається з нормального пептидоглікану. Стінку оточує кора, яка містить незвичний пептидоглікан з малим числом поперекових з’єднань і чутливий до лізоциму (автоліз його відіграє вирішальну роль у процесі проростання спори). Оболонка спори складається з кератиноподібного білка і зумовлює погану проникність і стійкість його до хімічних речовин. Екзоспорій оточує всю спору і складається з ліпопротеїнів.

 

Індукція спороутворення відбувається протягом декількох годин. Розрізняють декілька стадій: підготовчу, передспори, утворення оболонок і дозрівання.

 

 

 

 

Наявність спор у бактерій може мати діагностичне значення, а також спричиняє вибір тактики при знезаражуванні хірургічного інструментарію та перев’язного матеріалу.

 

  Спори мають здатність сильно заломлювати світло, тому на незафарбованих препаратах їх видно у вигляді блискучих зерен. У зв’язку з тим, що вони стійкі до дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, забарвлювати їх досить важко. Найчастіше використовується метод Ожешко, при якому спори попередньо протравлюють соляною кислотою, а потім забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори при цьому набувають червоного, а вегетативна клітина – голубого забарвлення.

 

 

 

.

Мазок із спорової культури  мікроорганізмів і забарвлення його за методом Ауеско: (Ожешки)

 

 

 

Морфологія і особливості будови спірохет, актиноміцетів, рикетсій, хламідій, мікоплазм, грибів, найпростіших.

 

ПАТОГЕННІ АКТИНОМІЦЕТИ

 

Актиноміцети (грец. actis — промінь, tnyces — гриб) — одноклі­тинні грампозитивні мікроорганізми, що входять до родини Actinomy-cetaceae, Streptomycetaceae. До родини Actinomycetaceae входять 370 видів, але тільки деякі з них є збудниками актиномікозу. До па­тогенних актиноміцетів належать A. bovis, виявлений у 1877 р. К. Гар-цом, і A. israilii, виділений у 1891 р. І. Ізраїлем від хворих на актино­мікоз.

 

В актиноміцетів, як і в бактерій, генетичну функцію виконує нуклеоїд.

 

 

 

 

Друзи  патогенних актиноміцетів.

 

 

 

 

 

У нитках міцелію  є зерна хроматину.

 

Розмножуються актиноміцети пророс­танням спор, прикріплених на спороносцях, простим діленням, перешнуруванням і бруньку­ванням.

 

Багато видів актиноміцетів мають вла­стивість виробляти антибіотики.

 

Культивування. Актиноміцети — фа­культативні анаероби, добре розвивають­ся при температурі 25—ЗО °С (оптимальна температура 35—37 °С) на звичайних сере­довищах з рН 4,4—9,0. Вони кислотостій­кі, у свіжих культурах утворюють зернистість. На густих середовищах одні види ростуть з утворенням твердих гладеньких колоній, інші мають складчасті горбкуваті кірковидні, бархатисті, пухнасті або борошнисті колонії, які зростаються з середовищем і з трудом зні­маються петлею; вони можуть бути безбарвними або пігментованими (сині, фіолетові, червоні, жовті, оранжеві, зелені і т. д.).

 

На густих живильних середовищах актиноміцети часто утворюють повітряний міцелій, на кінцях якого розвиваються спори, що надають колоніям певного забарвлення.

 

Питання про токсиноутворення спірне. Вважають, що патогенні актиноміцети містять ендотоксин.

 

Антигенна структура. Actinomyces bovis належить до серогрупи В, Actinomyces israilii — до серогрупи D; в обох видів виявлено серовари 1 і 2, що ідентифікуються за допомогою флюоресціюючих антитіл.

 

Резистентність. Актиноміцети — дуже стійкі мікроорганізми. Вони витримують температуру 60 °С протягом 1 год, довго зберігаються у висушеному стані. Особливо резистентні спори.

 

Патогенність для тварин. Патогенні актиноміцети уражують велику рогату худобу, рідше — свиней, коней. Захворювання має хронічний перебіг з утворенням запальних вогнищ і фістул.

 

До патогенних актиноміцетів належать деякі види роду Nocardia, зокрема N. asteroides, яка при бактеріоскопії має тонкий розгалужений міцелій, що роз­падається на паличкоподібні і кокоподібні елементи; росте в аеробних умовах, утворює зморшкуваті зернисті колонії жовтого або темно-оранжевого кольору. N. asteroides живе в грунті; зараження настає повітряно-пиловим шляхом і в результаті проникнення актиноміцетів в ушкоджену шкіру. Крім людини, хворіють велика рогата худоба, коні, собаки, коти, мавпи, норки, видри та інші тварини. У людини N. asteroides спричиняє нокардіоз — хронічне грану-лематозне ураження легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозку та його оболонок, нирок. Якщо місцем проникнення актиноміцетів є шкіра стопи, розвивається

 

міцетома стопи (мадурська хвороба), що проявляється утворенням абсцесів і  множинних  фістул.

 

ПАТОГЕННІ СПІРОХЕТИ

 

До родин Spirochetaceae і Leptospiraceae входять сапрофіти і па­тогенні види бактерій. До сапрофітів належать Spirochaeta  і Cristispira, що є крупними клітинами роз­міром 200—500 мкм із загостреними або тупими кінцями; деякі з них мають крипти (хвилясті гребені). Патогенні спірохети живуть на мертвих субстратах, у забруднених водоймах, у кишечнику холоднокровних тварин; у природних умовах живуть і непатогенні лептоспіри. За Романовським — Гімзою ці бактерії забарвлюються

у синій колір.

 

До патогенних спірохет належать три роди: Treponema, Borrelia, Leptospira.

 

Treponema pallidum відкрили в 1905 р. Ф. Шаудін і Е. Гофман. Стара назва збудника — бліда спірохета — зумовлена тим, що мікроорганізм погано забарвлюється   аніліновими   барвниками,

 

Морфологія. Т. pallidum— тонкі клітини спіралеподібної форми з 12— 14 завитками (рис. 88). Вони не мають видимої в мікроскоп осьової нитки або осьового гребеня- Кінці трепонем загострені або округлені. Довжина їх 10—13 мкм, ширина — 0,1—0,18 мкм.

 

При електронній мікроскопії поз­довжніх і поперечних ультратонких зрізів збудника  сифілісу добре вид­но  тришарову  зовнішню  мембрану  під     якою     розташовані     базальні    темному полі мікроскопа, тіла;   до них   прикріплені ниткопо­дібні    утвори—фібрили    діаметром    17 нм.    На  кожному кінці клітини є по три фібрили. У цитоплазмі бактерій є рибосоми, вакуоля нуклеоїду і мезосоми. Розмножуються бактерії поперечним діленням.

 

Трепонеми рухливі (їм властиві обертовий, поступальний, зги­нальний і хвилеподібний рухи), погано сприймають барвники, грам-негативні. За методом Романовського — Гімзи забарвлюються у блідо-рожевий колір, що пояснюється низьким вмістом нуклеопротеїдів.

 

Під впливом факторів зовнішнього середовища і лікарських за­собів трепонеми в ряді випадків згортаються в клубки, утворюючи цисти, покриті непроникною муциноподібною оболонкою. Цисти мо­жуть тривалий час бути в організмі хворого в латентному стані, за сприятливих умов вони перетворюються в зерна, а потім у типові спі­ралеподібні трепонеми. Цистоутворення — одна~з форм захисту тре­понем, яка дає змогу їм протистояти дії лікарських засобів, що при­значаються хворим на сифіліс. Бліді трепонеми можуть утворювати L-форми. Цисти і L-форми трепонем більш стійкі до дії факторів зов­нішнього і внутрішнього середовищ.

 

Культивування. Бліда трепонема — дуже вибагливий мікроорга­нізм. Вона не росте у звичайних середовищах, розвивається при тем­пературі 35 °С в анаеробних умовах у середовищах, що містять нир­кову або мозкову тканину; крайні температурні границі росту — 34—40 °С. Добре розвивається бліда трепонема на хоріоналантоїсній тканині курячого зародка, в сироватці крові кролів з додаванням шматочків мозкової тканини під шаром вазелінового масла.

 

Тривале культивування трепонем призводить до втрати ними віру­лентності. Такі культури, адаптовані до живильного середовища, називаються культуральними, на відміну від тканинних культур, що мають властивості патогенності і зберігаються в лабораторних умовах за допомогою пасажів на кролях. Культуральні штами збуд­ника сифілісу різняться між собою рядом ознак: зміною рН середо­вища, ступенем анаеробіозу, індолоутворенням, продукуванням сір­ководню, ставленням до вуглеводів. Багато культуральних штамів спричиняють гемоліз еритроцитів людини, барана, коня, кроля, морської  свинки.

 

Антигенна структура. Серологічні варіанти блідої трепонеми не виявлено. Збудник сифілісу містить полісахаридний, ліпідний і про­теїновий комплекси з дуже складними антигенними властивостями.

 

Резистентність. При низьких температурах (на холоді) бліда тре-понема довго зберігається в гомогенатах уражених тканин. Від дії температури 45—48 °С вона гине через 1 год, 55 °С — через 15 хв. Чутлива до важких металів (ртуть, вісмут, миш’як), кислот, дії дезин­фікуючих засобів та висушування.

 

Патогенність для тварин. У природних умовах у кролів може ви­никати захворювання (кролячий сифіліс), яке спричиняється Тге-ponema canicola, що морфологічно не відрізняється від Т. pallidum.

 

Бліда трепонема малопатогенна для тварин, за винятком мавп. Досягнуто позитивного результату при зараженні кролів у рогівку ока або яєчко. За допомогою експериментального сифілісу вивчено питання імунітету, специфічної хіміотерапії і культивування блідої трепонеми.

 

Лептоспіри — Leptospira (грец. leptos — довгий, тон­кий) є збудниками зоонозних захворювань. Вони входять до родини Leptospiraceae. Лептоспіроз спричиняється Leptospira interrogans.

 

 

Морфологія. Лептоспіри — мікроорганізми з 12—18 дрібними пер­винними завитками, які щільно прилягають один до одного. Нагаду­ють пружину з загнутими і стовщеними кінцями. На кінцях лептоспір є вторинні завитки, що надають їм S- або С-подібної форми. Є також безгачкові штами лептоспір. Довжина лептоспір 7—14 (іноді 20—ЗО) мкм, товщина 0,06—0,15 (0,25—0,3) мкм. Вони рухливі, роблять обер­тові й поступальні рухи.

 

При електронно-мікроскопічному дослідженні структури лептоспір (рис. 89) доведено, що вони складаються з осьової нитки, цитоплазма­тичного циліндра, рівномірно закрученого навколо ригідної осьової нитки, поперечних кілець і багатошарової оболонки. Вважають, що осьова нитка складається із двох відрізків, які зближуються в цен­тральній частині лептоспіри. На поверхні цитоплазматичного циліндра при спеціальній обробці виявляють мікрофібрили, цитоплазма дрібно-грануляриа, у старих культурах є вакуолі. Нуклеоїд розташований ексцентрично, має тонкі, безладно розташовані фібрили ДНК.

 

Морфологічно патогенні і сапрофітні лептоспіри не відрізняються одні від одних, вони різняться лише за складом клітинних жирних /кислот: у патогенних видів більш високий рівень олеїнової, у сапро­фітних штамів —міристинової кислоти.

 

 

 

 

Лептоспіри грамнегативні, за Романовським — Гімзою забарвлю­ються у блідо-рожевий колір. їх можна виявити за методом Буррі або сріблення за Морозовим. Лептоспіри слабко заломляють світло.

 

Під впливом живильного середовища, підвищеної температури і при тривалому культивуванні можуть з’являтися атипові форми леп­тоспір.

 

Культивування. Лептоспіри — хемоорганотрофи, облігатні аероби, ростуть при температурі 28—29 °С у рідких і напіврідких живильних середовищах (безсироваткове середовище Ферворта — Вольірата ін.).

 

Ріст лептоспір на рідких живильних середовищах виявляється на 7—10-ту добу, і його виявляють при перегляді краплини середо­вища у темному полі: середовище не каламутніє.

 

Лептоспіри розмножуються і на густих живильних середовищах, що містять сироватку крові кроля (10 %), суміш Зеренсена, 1 % агар і дистильовану воду. Колонії з’являються на 4—8-му добу.

 

Ферментативні властивості лептоспір достовірно не визначені; можливо, ферменти містяться в кількості, що важко виявляється у зви­чайній   діагностичній   практиці.

 

Антигенна структура. До патогенних лептоспір (L. interrogans) входять 19 серогруп і понад 200 сероварів: в нашій країні трапляється 20 сероварів,  що належать до  13 серогруп.

 

Токсиноутворення. Лептоспіри не продукують екзотоксин. Токсич­ні речовини є тільки в живих лептоспірах, які паразитують в орга­нізмі  людини   і   тварин.

 

Резистентність. У воді лептоспіри виживають 5—10 діб, у грун­ті — 2 доби. В харчових продуктах (молоко, вершкове масло, хліб та ін.) життєздатність лептоспір не перевищує кількох годин. Лепто­спіри довго зберігаються при низькій температурі (мінус 70 — мінус 90 °С), дуже чутливі до висихання, дії кислот, при температурі 56 °С гинуть через ЗО хв. Швидко розчиняються у жовчних кис­лотах.

 

Патогенність для тварин. У природних умовах резервуаром леп­тоспір є ссавці із загону гризунів, комахоїдних, сумчастих, парно­копитних   і   хижаків.

 

У вогнищах лептоспірозу найбільше епідеміологічне значення мають хом’яки, миші, пацюки та ін., які виділяють лептоспіри у зов­нішнє середовище з’сечею і випорожненнями. Ураженість цих тварин лептоспірозом може досягати 30—60 % і більше. Лептоспіроз реє­струють також серед свиней, великої і дрібної рогатої худоби, собак і т. д.

 

Із лабораторних тварин найбільш чутливі до лептоспірозу золо­тисті хом’яки, морські свинки і кролі-сисунці. Захворювання у цих тварин спричиняють свіжовиділені штами лептоспір деяких серогруп. Лабораторні штами лептоспір звичайно втрачають свою вірулент­ність.

 

Рикетсії (Rickettsia) — це поліморфні мікроорганізми (див. рис 6), живуть і розмножуються тільки в клітинах (цитоплазмі і ядрі) тканин тварин, людини й перенощиків. Рикетсії не утворюють єпор і капсул, нерухомі, добре забарвлюються за Романовським — Гім-зою,  Цілем — Нельсеном,   грамнегативні.

 

За допомогою електронної мікроскопії і цитохімічних досліджень у рикетсій виявлено наявність нуклеоїду, внутрішньої оболонки (6 нм) і зовнішньої, що складається із трьох шарів. У цитоплазмі ри­кетсій виявлено гранули типу рибосом величиною 20—70 нм і вакуоле-подібні   структури   діаметром   6—8  нм.

 

Рикетсії розмножуються діленням кокоподібних і паличкоподіб­них форм з утворенням гомогенних популяцій, а також в результаті дроблення ниткоподібних форм з наступним розвитком кокоподібних і паличкоподібних  утворів.

 

Більша частина рикетсій належить до непатогенних мікроорганіз­мів. Близько 50 різних видів рикетсій виявлено в кишках і слинних залозах попелиць, клопів, кліщів.

 

Патогенні рикетсії із родини Rickettsiaceae поділені на три роди: Rickettsia, Coxiella, Rochalimae, вони уражують різні види тварин і людину. Захворювання, що спричиняються рикетсіями, мають назву рикетсіозів

 

До роду Chlamydia, родини Chlamydiaceae належать збудники трахоми, кон’юнктивіту (бленореї з включеннями), пахвинного лім­фогранулематозу (венеричного лімфогранулематозу, хвороби Шко­ла — Февра), орнітозу. Хламідії мають схожий цикл розвитку, спіль­ний груповий антиген, однаковий хімічний склад. Вони містять ДНК і РНК, нуклеопротеїди, ліпіди й вуглеводи.

 

У циклі розвитку хламідій є три стадії. На першій стадії це дрібні (0,2—0,4 мкм) елементарні тіла, оточені тришаровою оболонкою, що містять у компактному стані генетичний матеріал нуклеоїду і рибосоми; на другій стадії — це первинні крупні (0,8—1,5 мкм) тіла, що мають фібрили нуклеоїду і рибосомальні елементи, покриті тонкою оболон­кою; розмножуються діленням; дочірні клітини реорганізовуються в елементарні тіла, які можуть міститися позаклітинно й проникати в інші клітини. Третя стадія розвитку хламідій проміжна (транзи­сторна) між первинними й елементарними тілами. Дрібні (елементарні) тіла мають інфекційні властивості, крупні (первинні) тіла виконують вегетативну функцію. Ріст, розмноження й дозрівання хламідій за­вершуються протягом 40 год.

 

Мікоплазми належать до класу Mollicutes, родин Mycoplasmata-ceae, Acholoplasmataceae, Spiroplasmaceae.

 

Уперше мікоплазми Л. Пастер виявив при вивченні збудника плевропнев­монії великої рогатої худоби, однак виділити їх у той час у чистій культурі на звичайних живильних середовищах і виявити у світловому мікроскопі не було можливості. У 1898 р. Е. Нокар і Е. Ру довели, що збудник плевропнев-

 

 

 

монії може розвиватися на складних живильних середовищах, які не містять клітин культур тканини, а У. Ельфорд за допомогою спеціальних фільтрів ви­значив  розміри  цього  мікроорганізму.

 

Мікоплазми виявлено в грунті, стічних водах, на різних субстра­тах в організмі тварин і людини. Є патогенні і непатогенні види.

 

Морфологія. Мікоплазми — дрібні поліморфні бактерії розміром 0,3—0,8 мкм, не утворюють спор, нерухомі, грамне-гативні. Форма їх може бути яйцевидною, кокобацилярною, нитко­подібною, гіллястою. У пізній фазі росту утворюються ланцюжки кокоподібних тілець. Мікоплазми не мають клітинної стінки, покриті тришаровою цитоплазматичною мембраною завтовшки 7,5—10 нм; у цитоплазмі є ДНК і РНК, рибосоми та інші клітинні компоненти, в яких наявний холестерин. Мікоплазми краще забарвлюються за Романовським — Гімзою.

 

Культивування. Більшість видів мікоплазм — факультативні ана­ероби. Для їх росту потрібні білки, стерини, фосфоліпіди, глікопротеї-ди (муцин), а також пуринові і піримідинові основи. На густих сере­довищах ростуть у вигляді характерних колоній з ущільненим, що вростає в середовище, центром і ніжним ажурним краєм; через 3— 5 діб інкубації вони іноді стають крупними (1,5—2 мкм), але найча­стіше їх важко побачити неозброєним оком. На кров’яному агарі навколо колоній є зона гемолізу. У бульйоні мікоплазми розвивають­ся з утворенням помутніння і дрібнозернистого осаду.

 

Культивують мікоплазми при температурі 36—37 °С (крайні гра­ниці 22—41 °С) на живильних середовищах з рН 7, що містять сиро­ватку крові, з утворенням дуже дрібних колоній.

 

Додавання до живильного середовища холестеролу або інших сте­ролів, екстрактів дріжджів прискорює ріст мікоплазми. Вони можуть культивуватись і в середовищах, в яких немає сироватки крові, але при наявності 0,02 % гемоглобіну й 0,01 % цистеїну. Мікоплазми доб­ре розмножуються в хоріоналантоїсній оболонці  курячого   ембріона.

 

Ферментативні властивості. Процеси метаболізму у мікоплазм дуже варіабельні. Протеолітичних властивостей вони не мають, хоч відомо кілька видів, які розріджують желатину і зсідають сироватку крові; більша частина штамів ферментує глюкозу, деякі з них утво­рюють аргіназу, фосфатазу.

 

Антигенна структура. Мікоплазми мають видову специфічність. До родини Mycoplasmataceae входять два роди (Mycoplasma, Ureaplas-ma), що включають 50 видів, із них найважливіше медичне значення мають М. pneumoniae, М. hominis і М. urealyticum.

 

Токсиноутворення. Із мікоплазм виділено гемолізин і термостабіль­ний   ендотоксин.

 

Резистентність. Більшість штамів мікоплазм гине при температурі 45—55 °С протягом 15 хв. Мікоплазми дуже чутливі до всіх дезинфі­куючих речовин, до висушування, ультразвуку та інших фізичних діянь, стійкі до пеніциліну, ампіциліну, метициліну, цефалоспоринів, чутливі до еритроміцину та інших макролідів.

 

ПАТОГЕННІ ГРИБИ І ЗАХВОРЮВАННЯ, ЩО СПРИЧИНЯЮТЬСЯ НИМИ У ЛЮДИНИ

 

Систематика. Гриби віднесені до рослинних гетеротрофних нефото-синтезуючих організмів-еукаріотїв, що не мають хлорофілу. Тип гри­бів (Fungi s. Mycetes) налічує понад 100 000 видів, об’єднаних у класи Zygomycotina (зигоміцети), Ascomycotina (аскоміцети), Basidiomyco-ina (базидіоміцети), Dauteromycotina (дейтероміцети, незавершені гриби), які, в свою чергу, поділяються на підкласи, порядки, родини, роди, види; усередині останніх є штами. Серед грибів трапляються сапрофіти, паразита і факультативні паразити рослин, тварин і лю­дини. Близько 100 видів грибів можуть спричиняти захворювання в  людей   або   тварин.

 

Форма клітин у молодих культур кругла, яйцевидна або здовжена, у зрілих — грушовидна, булавоподібна, веретенопо­дібна,   амебоподібна.

 

За будовою гриби схожі на водорості, вони мають диференційоване ядро (одне або кілька), клітинну стінку і цитоплазматичну мембрану. Цитоплазма у молодих культур гомогенна, у зрілих — зерниста, в ци­топлазмі є мітохондрії, комплекс Гольджі, вакуолі, різні включення (глікоген, волютин, ліпіди, кристали органічних солей, пігменти).

 

Основним структурним компонентом клітин грибів є міцелій, по­будований із розгалужених безбарвних ниток (гіф) завдовжки 4— 70 мкм і діаметром 1—10 мкм. В одних видів грибів міцелій із нероз-членованої клітини (Мисог), в інших (вищих грибів) багатоклітинний; у дріжджеподібних грибів (Candida) є псевдоміцелій. Ріжки утво­рюють склероцій у вигляді міцного сплетення гіф міцелію.

 

Морфологія клітинних елементів грибів дуже різноманітна, особ­ливо в культурах на різних живильних середовищах; тканинні форми патогенних грибів менш поліморфні, вони значно відрізняються від культуральних, що враховують при лабораторній діагностиці мі­козів.

 

Гриби розмножуються поділом, проростанням, брунькуванням і спороносінням. Найчастішою формою розмноження є проростання, яке супроводиться випинанням стінки і протопласту за ходом або по боках міцелію. Паросток відмежовується від материнської клітини перегородкою, потім утворюється гілляста грибниця. Досить часто гриби   розмножуються   брунькуванням.

 

Спороутворення є засобом не тільки розмноження, а й розповсю­дження грибів у зовнішньому середовищі. Спори поділяються на зовнішні і внутрішні. Зовнішні, або екзоспори, утворюються на грибниці, по боках або на кінцях її міцелію. Ендоспори у завершенихгрибів є результатом статевого процесу, дозрівають вони в асках (аскоміцети), спорангіях (мукор та ін.).

 

У незавершених грибів є талоспори, які утворюються внаслідок перетворення окремих гілочок міцелію в спеціальні спори (артроспори, бластоспори,   конідії,   алейрії,   геміспори).

 

Культивування робиться в аеробних умовах при температурі 22— 37 °С на живильних середовищах, що містять азотисті і вуглецьвмісні речовини; найбільш сприятливим рН є 6,0—6,5, але патогенні гриби можуть рости і при ширшому діапазоні рН — від 3,0 до 10,0.

 

Гриби мають більший набір ферментів, за допомогою яких вони розщепляють білки, вуглеводи, ліпіди. Патогенні гриби потребують різних факторів росту (вітаміни, амінокислоти), мінеральних речовин і мікроелементів (цинк, кобальт, солі заліза, натрію, магнію, міді, фосфору).

 

За характером росту на агарових живильних середовищах патогенні гриби поділяють на кілька типів: шкірясті, гладенькі, твердої консистенції; пухна­сті, пухкі, ватоподібної консистенції; бархатисто-ворсисті, покриті дуже корот­ким густим міцелієм; крихкі, плівчасті, що нагадують ламкий картон, густоборошнисті   при  спороутворенні  та   ін.                                                                             ,

 

На рідких середовищах багато видів грибів ростуть з утворенням повстеподібного осаду  на дні  і  пристінково.

 

Гриби виробляють пігменти різного кольору: білі, жовті, корич­неві, чорні, сині, зелені, червоні, малинові та ін., які диференціюють на розчинні у воді і розчинні у спирті, ацетоні, дихлоретані, чотири-хлористому вуглеці. Продукування пігменту тканинними формами грибів у патологічному матеріалі трапляється тільки у збудників хромомікозу.

 

Токсиноутворення. Деякі види патогенних грибів мають власти­вість продукувати екзотоксини (Fusarium graminiarum), афлатоксини (окремі види аспергіл), ліпотоксол (Fusarium sporotrichiella), а біль­шість грибів має ендотоксини.

 

Патогенез захворювання в людини. За сприятливих умов патогенні гриби у вигляді спор або фрагментів міцелію проникають у тканини і потім розмножуються. Інкубаційний період триває від кількох діб до кількох місяців. Найчастіше ушкоджуються шкіра, волосся і нігті (дерматофіти’); легені (кандидоз, бластомікоз, плісеневі мікози); слизові оболонки (кандидоз, риноспоридоз); лімфоїдно-макрофагальна система і внутрішні органи (гістоплазмоз); лімфатичні вузли, шкіра (споротрихоз). При деяких мікозах уражуються шкіра і внутрішні органи, розвиваються генералізовані процеси.

 

Певну роль у розвитку мікозів відіграють привертаючі (патогене­тичні) фактори. Дерматофітія уражує головним чином дітей дошкіль­ного і шкільного віку; до кандидозів найбільш сприйнятливі ново­народжені і діти раннього віку. Порушення обміну речовин, наявність аномалій розвитку, зумовлених гормональними розладами, недоно­шеність плода сприяють виникненню кандидозів.

 

До умов, які сприяють розвиткові мікозів, належать гіпо- й авіта­міноз, дисбактеріоз, гіпергідроз (надмірна пітливість), перенесені гострі і хронічні захворювання крові, злоякісні пухлини, травми, особливо при хро-момікозі, споротрихозі, нераціональна антибіотикотерапія при різ­них інфекційних захворюваннях.

 

Імунітет проявляється у вигляді-неспецифічного захисту, що реалі­зується клітинними й гуморальними факторами. Шкіра захищає орга­нізм від проникнення патогенних грибів; піт, ліпоїдні речовини інгі-біторно діють на збудників мікозів. Антифунгальними властивостями характеризуються антитіла, які забезпечують специфічний імунітет, що виробляється під впливом антигенів.

 

Особливістю антигенних властивостей патогенних грибів є те, що вони часто мають груповий характер, в результаті чого серологіч­ні реакції можуть бути позитивними як на антигени збудника, так і на антигени інших споріднених грибів, що знижує їх діагностичне зна­чення. Найкраще вивчено при мікозах аглютиніни, преципітини і ком-плементзв’язуючі антитіла; останні мають більш виражену специфіч­ність.

 

Майже всі мікози супроводяться розвитком специфічної алергії, яка здебільшого має захисний характер. Повторні захворювання в алер-гізованому організмі  мають легший перебіг і доброякісну форму.

 

За характером первинної локалізації патогенних грибів, патогене­зом і клінічними проявами виділяють чотири групи мікозів: 1) кера-томікози (різнобарвний лишай, вузлувата трихоспорія); 2) дерма-тофітію (епідермофітія стоп, рубросикоз, трихофітії, мікроспорії); 3) кандидоз (поверхневий, хронічний, вісцеральний); 4) глибокі мі­кози (бластомікози, гістоплазмоз, кокцидіоїдоз, споротрихоз).

 

Морфологічні особливості різноманітних грибів

 

 

 

 

 

 

У мікробіологічній практиці важдиве значення мають складні методи фарбування, за допомогою яких можна виявити різноманітні клітинні структури та досконало вивчити морфологію мікроорганізмів.

 

Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збудники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високомолекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони з великим трудом фарбуються звичайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим феноловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії при такій обробці легко віддають барвник. У звязку з цим при додатковому забарвленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.

 

Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в 1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:

 

1. На фіксований у полумї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають папірець, промивають водою.

 

2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи жовтуватого відтінку (10-30 сек) і декілька разів промивають водою.

 

3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промивають водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

 

Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі бактерії виглядають рубіново-червоними.

 

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розведеним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприймають забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

 

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

 

Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля, висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дистильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним методом Циля-Нільсена.

 

Video

 

 

 

Забарвлення за Романовським-Гімзою.  Метод Романовського-Гімзи належить до складних методів фарбування. Він є одним із основних і найпоширеніших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фарбуються різні структурні елементи паразитів крові  малярійних плазмодіїв, трипаносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм, спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

 

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового синього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосередньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барвника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і висушують на повітрі. Приготовлений розчин наносять на мазок, а ще краще предметне скельце з мазком опускають у стаканчик з барвником. Забарвлення триває від 30 хв до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикальному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних обєктивів.

 

Будучи в розчині синьо-фіолетовим поліхромний барвник Романовського-Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин і найпростіших, тіла бактерій, їх капсули, слиз  у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлюються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна  у вишнево-червоний; цитоплазма має рожевий відтінок.

 

Забарвлення окремих структур мікробної клітини

 

З науковими й діагностичними цілями в бактеріологічних лабораторіях досліджують не тільки форму, розміри, загальні тинкторіальні властивості мікроорганізмів, а й окремі елементи важливих структур: нуклеоїд, цитоплазму, включення, клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану, капсулу, спори, джгутики тощо.

 

Нуклеоїд. У прокаріотів ще немає морфологічно оформленого ядра, а є лише його попередник  нуклеоїд. Він представлений однією або кількома хромосомами, що складаються з ДНК і вільно розташовані в цитоплазмі, не відмежовані від неї будь-якою мембраною. Морфологічно дослідити цю структуру під світловим мікроскопом дуже важко.

 

Розроблені спеціальні мікрохімічні реакції на виявлення ДНК. Однією з них є реакція Фейльгена. Після легкого гідролізу мазка розчином соляної кислоти при підігріванні від дезоксірибофосфату відщеплюються пурини й піримідини, які переходять в альдегіди. Останні реагують з безкольоровою фуксинсірчистою кислотою реактиву Шиффа, при цьому нуклеоїд забарвлюється в червоно-фіолетовий, а цитоплазма в світло-рожевий колір.

 

Ядерну субстанцію можна виявити за методом Пікарського. Фіксований метиловим спиртом або сумішшю Никифорова мазок обробляють 1 % розчином соляної кислоти, підігріваючи його до 60  С протягом 7 хв. Після промивання його забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильованою водою, висушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбуються в темно-червоний, а цитоплазма клітин  у рожевий колір.

 

Ще краще можна виявити нуклеоїд і дослідити його структуру за допомогою електронної мікроскопії ультратонких зрізів бактерійних клітин.

 

Цитоплазма та її включення. Цитоплазма бактерій  складна колоїдна система. У молодих клітин вона гомогенна, у старих набуває зернистої або волокнистої структури. При забарвленні аніліновими барвниками цитоплазма фарбується рівномірно й монотонно.

 

У процесі життєдіяльності бактерій у цитоплазмі появляються різноманітні включення: метахроматичні (волютинові) зерна, краплини нейтральних ліпідів, воску, сірки, гранульози, глікоген, пігмент та ін. Вони є для клітини запасним джерелом енергії.

 

У лабораторній практиці найбільше значення має виявлення волютинових зерен. Волютиновими їх назвали тому, що вперше ці включення відкриті у Spirillum volutans. Їх ще називають метахроматичними, оскільки вони дають явище метахромазії  здатність забарвлюватись у тон, що відрізняється від основного кольору поліхромного барвника. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім зерна набувають пурпурово-синього кольору із-за надзвичайно сильної спорідненості їх до азурів, які завжди присутні в метиленовому синьому барвнику. Поява пурпурового відтінку і обумовлена здатністю давати метахромазію. Ці включення називають також зернами Бабеша-Ернста за іменами авторів, які вперше описали їх. Розташовуються вони переважно на полюсах бактерій, рідше  по всій довжині клітини. Волютинові зерна є характерною диференціальною ознакою для збудника дифтерії  Corynebacterium diphtreriaе.

 

Для виявлення цих включень використовують методи Леффлера, Нейссера, Пю, Мейера, Раскіної та ін.

 

Метод Леффлера. Фіксований мазок забарвлюють лужним спиртово-водним розчином метиленового синього протягом 4-5 хв, висушують і мікроскопують. При цьому волютинові зерна забарвлюють в темно-синій, а цитоплазма в блідо-голубий колір.

 

 

 

Video

 

Метод Нейссера належить до складних методів забарвлення. Він проводиться за таким алгоритмом:

 

1. На фіксований препарат наносять оцтово-кислу синьку Нейссера і фарбують протягом 1 хв, зливають барвник і промивають водою.

 

2. Діють на мазок розчином Люголя на протязі 20-30 сек.

 

3. Не промиваючи препарат водою, наносять розчин везувіну (або хризоїдину) і забарвлюють протягом 1-3 хв.

 

4. Забарвлений мазок промивають водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

 

Мікроскопічна картина: цитоплазма бактерійних клітин фарбується в світлий жовто-коричневий відтінок, метахроматичні зерна  в темно-синій, майже чорний колір.

 

 

 

Video

 

 

 

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера.

 

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером

 

Метиленовий синій                 0,1 г

 

Етанол 96                                2 мл

 

Льодяна оцтова кислота          5 мл

 

Дистильована вода                  100 мл

 

 

 

Везувін

 

Везувін                                     12 г

 

Етанол 96                                60 мл

 

Дистильована вода                   40 мл

 

 

 

Хризоїдин

 

Хризоїдин                                  1 г

 

Дистильована вода                    150 мл

 

Барвник розчиняють у киплячій воді.

 

 

 

Метод Пю. Готують спеціальний барвник: до 2 мл етанолу добавляють 0,2 г толуїдинового синього, потім 100 мл 5 % розчину оцтової кислоти. Барвник стійкий, зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і підігрівають до появи парів на протязі 1-2 хв, охолоджують, промивають водою, висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення. Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

 

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну кислотостійкість. Саме ця властивість і лежить в основі методу. З досліджуваного матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на полумї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв. Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % водний розчин сірчаної кислоти, другий  на такий же час у 4 % розчин калію карбонату. Обидва мазки, не промиваючи водою, висушують фільтрувальним папером. Перший препарат помічають літерою К (кислота), другий  Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 % розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється в світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна  у вишнево-червоний. У мазку Л цитоплазма виглядає слабко забарвленою, а на місці метахроматичних зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

 

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову природу включень.

 

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину Циля  4 мл, льодяної оцтової кислоти  5 мл, етанолу 96  95 мл, дистильованої води  до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на полумї газового пальника до повного випарування барвника, промивають водою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світло-червоний колір, а зерна волютину  в чорно-синій.

 

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки й капсули.

 

Цитоплазматична мембрана  мяка, пластична, трьохшарова поліфункціональна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосомами, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

 

Клітинна стінка  своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає постійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних і осмотичних сил і виконує ряд інших важливих функцій. Вона є унікальним структурним компонентом, властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно вона складається з двох шарів: зовнішнього  пластичного і внутрішнього  ригідного, пружного.

 

Із-зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру, яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизовий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

 

Капсула являє собою міцно звязаний з клітинною стінкою особливий слизовий шар. Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники сибірки, чуми, крупозної пневмонії), у інших вона завжди є в усіх середовищах (клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лейконосток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виділяють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно звязані з клітинною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

 

 

При повсякденних діагностичних лабораторних дослідженнях потреба виявляти клітинну стінку чи цитоплазматичну мембрану майже не виникає. Під світловим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне зневоднення, цитоплазма клітин зморщується й відстає від клітинної стінки (плазмоліз). Під мікроскопом видимі контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостерігається протилежне явище  плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка згодом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх контури (чохли).

 

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки. Найбільш відомими з них є методи Пешкова, Гутштейна, Кнайзі.

 

Метод Пешкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60 мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) на протязі 15 хв, потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлюють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 сек. Препарат висушують на повітрі й мікроскопують. Оболонка виглядає як тонкий червоний обідок навколо бактерійної клітини.

 

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутштейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв 10 % розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 % водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлення оболонки в фіолетовий колір наступає вже через 5-10 сек.

 

Метод Кнайзі. Зафіксований в полумї пальника мазок протравлюють у спеціальному розчині (насичений водний розчин калійних галунів  70 мл, 20 % розчин таніну  30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, накривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка фарбується в червоний колір.

 

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають гелеподібну консистенцію. При звичайних методах фарбування вони погано сприймають барвники. Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і органів, мазках із гною, харкотиння вони виявляються при будь-якому методі фарбування у вигляді незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тілами бактерій і субстратом. Для фарбування самих капсул запропоновані різні методи.

 

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промивають водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним 1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним обєктивом. На темному димчасто-сірому фоні контракстно виділяються незабарвлені капсули, всередині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій.

 

 

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі, або суміші Никифорова (але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім залишають на 30 сек для охолодження. Препарат промивають великою кількістю розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують. Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів  у темно-червоний.

 

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом, або сумішшю Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують. Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули  у блідо-рожевий. Метод постійно дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул (Антоні, Кніге, Ольта, Кауфмана) дають менш демонстративні результати.

 

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворювати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових культур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно заломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліновими барвниками при звичайних методах фарбування.

 

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus), або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової гангрени), або термінально (палички правця).

 

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують проникнення барвників.

 

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок спороносної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4 рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером і фіксують у полумї пальника. Потім мазок забарвлюють за методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в голубий колір, спори  в червоний.

 

 

Метод Пешкова  простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не вимагає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за таким алгоритмом.

 

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полумї газового рожка, або в спиртовому формаліні.

 

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до кипіння, періодично вносячи в полумя на 15-30 сек.

 

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином нейтрального червоного впродовж 30-40 сек. Промивають дистильованою водою, висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають синіми, або голубими, цитоплазма  рожевою.

 

Метод Мюллера. На зафіксований в полумї мазок наливають 5 % водний розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору, а цитоплазма бактерій  синього.

 

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полумї, наливають 5 % водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів, промивають струменем проточної води 30-40 сек і додатково забарвлюють 0,5 % водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в червоний, а спори  в зелений колір.

 

 Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні органи руху  джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

 

1. Монотрихи  один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

 

2. Лофотрихи  пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

 

3. Амфітрихи  поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

 

4. Перитрихи  багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник червоного тифу, кишкова паличка).

 

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

 

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обовязково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла або заліза, що приводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають видимими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відносяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

 

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надавленій краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазовоконтрастної та аноптральної мікроскопії.

 

Забарвлення джгутиків  одна з самих тонких, складних і вимогливих бактеріоскопічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера, Грея, Морозова, Уварова, Бенінєтті та ін. Самим надійним із них є метод Леффлера.

 

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготовлення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежирених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтягнутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши препарат через полумя.

 

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

 

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл 20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірчанокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання, перед використанням обовязково фільтрують.

 

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і профільтрований.

 

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протягом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави. Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-коричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

 

Метод Бенінєтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчином, який завжди готують ex tempore: розчин 1  сірчанокислого цинку 1 г, таніну 10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2  насичений спиртовий розчин генціана фіолетового.

 

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препарат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають водою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

 

Мікроскопічне дослідження живих мікробів.

 

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надавленої й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Перевагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді, тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супроводжується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користуються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні видів збудників.

 

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно рухаються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку структуру їх клітин краще, ніж в забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазовоконтрастної та аноптральної мікроскопії.

 

Необхідно завжди памятати, що робота з живими збудниками більш небезпечна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно обовзково занурювати препарати в дезинфікуючий розчин.

 

Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють фізіологічним розчином, так як наявність великої кількості мікробних тіл у полі зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесену краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінцетом, щоб у надавленій краплі не появлялись бульбашки повітря. Для цього покрівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями. Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмоктують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого папір занурюють у дезинфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швидке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла заздалегідь змащують вазеліном.

 

Висяча крапля  метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів, розроблений Р.Кохом у 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмноження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми, явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо. Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпростіших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури, вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

 

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої суспензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежиреного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо змащують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи щоб крапля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом довгого часу.

 

Мікроскопічне дослідження живих обєктів як в надавленій, так і висячій краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опущеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спочатку при малому збільшенні (х8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких краплинок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По другий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший сухий (х40), а при потребі й на імерсійний обєктив (х90). Трохи відкривають діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роблячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять монотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й безладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молекулярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

 

Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів мікробів із-за кривизни лунки. Для усунення цього недоліку можна користуватись камерою Беттхера. Її легко виготовити в будь-якій лабораторії. До звичайного предметного скла за допомогою воску, парафіну або відповідного клею прикріплюють скляне або пластмасове кільце з діаметром отвору біля 10 мм і висотою 6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця змащують вазеліном і на нього накладають покрівне скельце з живими бактеріями в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих обєктів.

 

Для збільшення контрастності досліджуваних обєктів в надавленій чи висячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і толуїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

 

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

 

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них запропонували Пешков і Фонбрюн.

 

Ш-подібна камера Пешкова. На предметне скло наливають шар розтопленого агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають дві канавки, як показано на рис. 11, і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату. Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розвиток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

 

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за допомогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики попередньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру, щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

 

За допомогою камер Пешкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйомку особливо при використанні фазовоконтрастної й аноптральної мікроскопії.

 

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгутиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікроорганізмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього досліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середовища. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рухливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщі живильного середовища.