Хроматографічні методи аналізу

1.     Теоретичні основи хроматографічних методів.

2.     Класифікація хроматографічних методів.

3.     Газова хроматографія.

4.     Рідинна хроматографія.

5.     Тонкошарова і паперова хроматографія.

6.     Використання у фармацевтичному аналізі.

 

1.     Теоретичні основи хроматографічних методів.

Хроматографія – це процес, який базується на багатократному повторенні актів сорбції і десорбції речовини при переміщенні її в потоці рухомої фази вздовж нерухомого сорбента.

Речовина рухомої фази неперервно поступає в контакт з новими ділянками сорбента і частково сорбується, а сорбована речовина контактує із свіжими порціями рухомої фази і частково   десорбується.

При постійній температурі адсорбція збільшується із зростанням концентрації розчину або тиску газу. Залежність кількості поглинутої речовини від концентрації розчину або тиску газу при постійній температурі називається ізотермою адсорбції.

а                                     математично ця залежність може бути виражена рівнянням Ленгмюра:

де n – кількість адсорбованої речовини при рівновазі;

n_∞ – максимальна кількість речовини, яка може                                                                 бути адсорбована на даному сорбенті;

b – постійна;

с – концентрація.

В області невеликих концентрацій ізотерма лінійна. Дійсно, при bc << 1 (1+ bc) ® 1, тоді

Це рівняння лінійної адсорбції. Воно відповідає рівнянню Генрі (Г – коефіцієнт Генрі). Ізотерма адсорбції може бути також вгнутою, S – подібною і.т.д., що пов’язано з утворенням полімолекулярних шарів на поверхні сорбента, неоднорідністю поверхні сорбента.

 

2.     Класифікація хроматографічних методів.

Різні методи хроматографії можна класифікувати за агрегатним станом фаз, способу їх відносного переміщення, апаратурному оформленні процесу.

1.     За фізичною природою нерухомої і рухомої фаз

Рухома фаза	Рідинна	Газова
Нерухома фаза	Тверда (рідинно-адсорбційна)	Тверда газоадсорбційна
	Рідина (рідино-рідинна)	Рідина (розподільча газорідинна)

2.     В залежності від механізму сорбції

а) молекулярна (взаємодія між нерухомою фазою (сорбентом) і компонентами розділюваної суміші – міжмолекулярні сили типу Ван-дер-Ваальса);

б) хемоморбційна (іонообмінна, осадова, комплексоутворювача або лігандообмінна, ох-red). Причиною сорбції в хемосорбційній хроматографії є відповідні хімічні реакції.

3.     За способом хроматографування:

–         фронтальна;

–         проявна (елюентна) – найбільш вживана;

–         витісняльна.

4.     За технікою виконання:

–         колонкова (нерухома фаза в колонці);

–         площинна: а) паперова (нерухома фаза – папір);

                        б) тонкошарова (нерухома фаза – сорбент на скляні, – металеві, полімерній підложці пластинці).

Нерухома фаза	Газоподібна	Рідинна
Тверда	Газо–адсорбційна хроматографія	Рідинно-адсорбційна колоночна, тонкошарова, іонообмінна, осадова
Рідина	Розподільча газо-рідинна хроматографія	Розподільна рідино-рідинна хроматографія

По способу відносного переміщення фаз розрізняють фронтальну, проявну, витісняльну хроматографію

    

                                                  Фронтальний метод. Використовують порівняно рідко (при очистці від домішок, або для виділення з суміші найбільш слабо сорбованої речовини).

 

 

 

 

 

 

Проявний (елюентний) метод. Компоненти аналізованої суміші розділяються на зони: речовина, яка краще сорбується займає верхню зону колонки, а та, що гірше сорбується – нижню. Тому, А скоріше виходитиме (вимивається або елююється) з колонки і її пік на хроматограмі є раніше, а та, що сильніше сорбується, виходитиме пізніше.

 

Витісняльний метод. Промивним розчином речовини Д., яка сорбується краще від А,В. Концентрація розчину при хроматографуванні не змінюється, але часто є накладання зони речовини А і зони речовини В, оскільки вони не розділяються розчинником.

В хроматографії найчастіше використовують проявний (елюентний метод), при якому газ або розчин, який виходить з колонки, аналізується неперервно.

Типова вихідна крива (хроматограма) приведена.

 

нульова лінія

висота піку (площа)

ширина піку

час або об’єм утримування t або Vr

 

 

 

 

 

Повнота розділення двох компонентів кількісно може бути виражена критерієм розділення К:

Dl – відстань між максимумами піків розділюваних елементів;

m_0,5(1) і m_0,5(2) – ширина хроматографічного піку 1 і 2 компоненту на половині висоти.

При К = 1 розділення буде достатньо повним.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Якщо піки взаємно перекриваються, то визначення ширини піку кожної речовини є неможлтвою, тоді розглядають ступінь розділення Y:

; h₂ – висота піку з меншою концентрацією речовини;

h_min – висота мінімуму.

У хроматографії: якісний аналіз базується на визначенні часу утримування, а кількісний – на визначенні висоти або площі піку.

Відомо декілька теорій хроматографічного процесу. Суттєве значення має метод теоретичних тарілок і кінетична теорія.

Метод Мартіна і Сінджа (теоретинчих тарілок). Колонка скляна і ділиться умовно на ряд елементарних ділянок – тарілок. Рівновага на кожній тарілці сорбент – рухома фаза встановлюється дуже швидко. Кожна нова порція газу – носія викликає зміщення цієї рівноваги, внаслідок чого частина речовини переноситься на наступну тарілку, на якій, в свою чергу, свтановлюється рівновага і відбувається перехід речовини на іншу тарілку. Тому, речовина розподіляється по декількох тарілках, але на середніх тарілках його концентрація виявляється максимальною порівняно з сусідніми тарілками. Розподіл речовинивздовж шару сорбента підчиняється рівнянню:

х – відстань від початку колонки до точки, в якій концентрація рівна С;

х₀ – координата центра смуги;

Н – висота, еквівалентна теоретична тарілка (ВЕТТ)

l – довжина шару сорбента, на якій проведено поглинання і розміщено n теоретичних тарілок, при цьому n = l/Н

ефективність колонки тим вища, чим менша висота ВЕТТ і більше число теоретичних тарілок.

Кінетична теорія хроматографії головну увагу надає кінетиці процесу, зв’язуючи висоту ВЕТТ з процесами дифузії, повільним встановленням рівноваги і нерівномірністю процесу. Висота ВЕТТ зв’язана із швидкістю потоку рівнянням Ван-Деємтера:

де А(вихрова дифузія), В(поздовжня дифузія), С(сорбція-десорбція) – const, a U – швидкість рухомої фази.

Константа А зв’язана з дією вихрової дифузії, яка залежить від розміру частинок, густини або щільності заповнення колонки;

В зв’язана з коефіцієнтом дифузії молекул в рухомій фазі, ця складова враховує поздовжню дифузію;

С характеризує кінетику процесу сорбція – десорбція, масопередачу та інші ефекти.

При невеликій швидкості потоку висота,еквівалентної теоретичної тарілки зменшується, а потім починає зростати. Оскільки ефективність колонки тим вища, чим менша висота ВЕТТ, то оптимальна швидкість рухової фази буде рівна швидкості, яка відповідає точці мінімуму цієї кривої.

Щоб знайти цю точку, продиференціюємо рівняння

H = A + B/U + CU:

 

Тоді  

Отже, кінетична теорія дає основу для оптимізації хроматографічного процесу.

Головні вузли хроматографічного обладнання:

–       дозатор (відтворюваність розміру проби і постійність умов її введення в колонку).

–       колонка (1-2-3 м і 50 м; прямі, спіральні, …)

–       детектор

                        набивні (з адсорбентом)

Колонки

                        капілярні

 

металеві (сталь, Сu, латуні)

скляні

фтрорпластові

Колонки обов’язково термостатуються!

 

Вимоги до адсорбенту (Al₂O₃, силікагелі, активоване вугілля, пористі капіляри на основі спиролу, дивінібензоу, синтетичні цеоліти ):

1.     необхідна селективність.

2.     хімічна інертність до компонентів суміші.

3.     Доступність.

Детектор призначений для виявлення  змін в складі гау (чи рідини) який пройшов через колонку. Покази детектора перетворюються в електричний сигнал і передаються реєструючому приладу.

Головними характеристиками детектора є:

–         чутливість

–         межі детектування

–         інерційність

–         діапазон лінійності I = f (c)

диференціальні (відображають миттєву зміну          концентрації), часто застосовуються

Детектори

 

 

Інтегральні (сумують зміну концентрації за цілий проіжок часу), застосовуються не часто

До групи иференціальних детекторів належать:

–         катарометр (детектор по теплопровідності);

–         ПИД;

–         детектор по лектропровідності;

–         полум’яно-фотометричні та їн. в залежності від:

1.     властивостей системи;

2.     агрегатного стану фаз;

3.     інші причини

 

3. Газова хроматографія

Рухомою фазою в газовій хроматографії є газ аьо пара. В залежності від стану нерумої фази газова хроматографія поділяється на газоадсорбційну (ГАХ), коли нерухомою фазою є рідина, а точніше плівка рідини на поверхні частинок твердого сорбента.

При проведенні газової хроматографії в нагрітій до певної температури потік газу-носія вводять аналізовану пробу. Компоненти проби випаровуються і разом з потоком газу поступають в термостатовану колонку з нерухомою фазою (адсорбентом). В колонці протікають багатократні процеси адсобції і десорбції на твердому носії або розчинення і виділення в рідуій плівці суміші газоподібних речовин. Роздлення складної суміші тут визначається коефіцієнтами адсорбції або розподілу аналізованих речовин між фазами. На виході з колонки суміш розділяється на індивідуальні речовини, які поступають з потоком газу на детектор.

Як рухома фаза Н₂, Не, N₂. Ar, CO₂. Газ-носій не взаємодіє з розділюваними речовинами і нерухомою фазою. Процес розділення базується на відмінностях в леткості і розчинності (адсорбованості) розділюваних компонентів. Через хроматографічну колонку швидше рухається той компонент, розчинність якого в нерухомій фазі менша, а леткість (пружність парів) при даній температурі t⁰ більша.

Кількісний аналіз можна провести тільки в тому випадку, якщо речовина термостійка, тобто випаровується відтворювано й і вимивається по колонці без розкладу. При розкладі речовини на хроматограмі з’являються несправжні піки, які належать продуктам розкладу.

Схема будь якого газового хроматографа включає:

 

 

 

дозатор                                самописець-

           реєстратор сигналу

                               регулятор току  

                                                                                      колонка                           

                            газ-носій                            термостат       

 

 

Детектори

1.     По теплопровідності (катарометр) – універсальний детектор, госій широко використовуваний.

Вимірюєтья опір нагрітої дротини, що поміщена у потік газу.

Температура дротини і її опір змінюються в залежності від концентрації компонентів проби. Які вимиваються з олонки

 

 

 

Калориметр – універсальний, але малочутоивий (10^-2-10^-3%). На чутлмвість калориметра впливає теплопровідність газу-носія, тому необхідно використовувати гази-носії з максимально можливою теплопровідністю (Не,Н₂).

2.     ПІД

3 вивід в атмосферу                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             4 – збираючий електрод                                                                                                                                                                          4                                                                                                                                                                                                                                                                                                        катод                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                

                                  2 Н₂             6 повітря                                                                                                                1 з колонки газ-носій                                                    

Газ, який входить з колонки змішується з Н₂ і поступає у форсунку пальника детектора. Іонізовані частинки, які утворюються заповнюють міжелектродний простір, в результаті чого опір знижуються, а струм збільшується. Стабільність і чутливість ПІД  залежить від вибору швидкості потоку всіх використовуваних газів (газ – носій » 30-50 мл/хв; Н2 » 30 мл/хв, повітря » 300 – 500 мл/хв). ПІД реагує практично на всі сполуки, крім Н₂, інертних газів, О₂, N₂, оксидів нітрогену, S, C, а також води. Цей детектор має широку область лінійності (6 – 7 порядків), тому він придатний для визначення “слідів” речовин.

3.     ДЕЗ        

В камері газ – носій опромінюється постійним потоком b-електронів, оскільки це є

В детекторі відбувається реакція вільних електронів з молекулами певних типів з утворенням стабільних аніонів

 

В іонізованому газі-носії (N₂, He) в якості негативнозаряджених частинок присутні тільки електрони. В присутності сполуки, яка може захоплювати електрони, іонізаційний струм детектора зменшується. Цей детектор дає відклик на сполуки, які містять Hal, P, S, NO₃^–, Pb, O. На більшість вуглеводів він не реагує.

Кількісний аналіз в газовій хроматографії.

Базується на вимірюванні різних параметрів піку, які залежать від концентрації хроматографованої речовини:

– висоти

– ширини

– площі

– утримуваного об’єма

– добутку утримуваного об’єму на висоту піку.

Метод нормування. Приймають суму всіх параметрів піків (S h, або SS, або S ширин) за 100%. Тоді відношення висоти окремого піку до суми висот або відношення площі одного піку до суми площ, помножене на 100 буде характеризувати W(комп.) (%) в суміші. Зрозуміло, що такий метод передбачає існування однакової залежності величини вимірюваного параметру від концентрації всіх компонентів суміші.

В методі нормування з колібрувальними коефіцієнтами за 100% прийм. сума параметрів піків з врахуванням чутливості детектора. Відмінності в чутливості детектора враховуються за допомогою поправкових коефіцієнтів для кожного компонента. Один з домінуючих компонентів суміші вважають порівняльним і поправковий коефіцієнт для нього приймають рівним одиниці. Калібрувальні (градуювальні) коефіцієнти К_і розраховують за формулою:

К_ст = 1 (приймають)

С_і – концентрація компоненту і в модельній суміші із стандартною речовиною

С_ст – стандартної речовини

П_ст і П_і – параметри піків речовини – стандарту й речовини і.

За 100% приймають суму виправлених параметрів К_іП_і і результат аналізу розраховується так, як і в методі нормування

Перевага: 1) не має потреби точності дозування зразка проби;

                  2) не абсолютна тотожність умов аналізу при повторних визначеннях.

3. Метод абсолютної калібровки (найбільш точний).

Експериментально визначають залежність висоти або площі піку від концентрації речовини і будують градуювальні графіки. Далі визначають ті ж характеристики піків в аналізованій суміші і за градуювальним графіком знаходять концентрацію аналізованої речовини. (Основний метод визначення домішок).

Перевага: не вимагає розділення всіх компонентів проби, а тільки тих, які необхідно визначити.

4. Метод внутрішнього стандарту.

Базується на введенні в аналізовану суміш точно відомої кількості стандартної речовини. В якості стандартної речовини вибирають речовину, близьку за фізико-хімічними властивостями до компонентів суміші, але не обов’язково компонент суміші. Після хроматографування вимірюють параметри піків аналізованого компонента і стандартної речовини. Якщо стандартна речовина не входить в склад аналізованої суміші, W_{компон.} (в %) розраховують по формулі:

Q_i i Q_ст. – параметри піків і речовини і стандарту відповідно;

r – відношення маси внутрішнього стандарту до маси проби.

Перевага: 1) врахування режиму роботи приладу (t°, V_{газу носія}).

                    2) підвищена точність внаслідок незалежності відвідтворюваності.

Вимоги до внутрішнього стандарту:

1. Добре розчинний в пробі і хімічно інертний до компонентів аналізованої суміші, нерухомої фази і тв. носія.

2.     Внутрішній стандарт вибирають з числа сполук, близьких до об’єктів аналізу по структурі і леткості.

3.     Внутрішній стандарт в пробі підбирають так, щоб відношення площ піків стандарту і визначуваної речовини було близьке до 1.

4.     Пік внутрішнього стандарту на хроматограмі повинен розміщуватись в безпосередній близькості до піків сполук – об’єктів аналізу, не накладаючись ні на них, ні на піки інших речовин.

5.     Внутрішній стандарт не повинен містити домішок, які накладаються з піками визначуваних речовин-компонентів проби.

6.     Якщо визначають в пробі дві і більше речовин, що значно відрізняються часами утримування, то доцільно використовувати 2 і більше внутрішніх стандарти.

Високоефективна рідинна хроматографія.

Рідинна хроматографія – це метод розділення і аналізу складних сумішей, в якому рухомою фазою є рідина. Він застосовується для розділення більш широкого кола речовин, ніж ГХ, оскільки більшість речовин є нелеткими, багато які з них є нестійкими при високих температурах (особливо ВМС) і розкладаються при переведенні в газоподібний стан. В РХ розділення найчастіше відбувається при кімнатній t°.

Теоретичні уявлення.

Базується на адсорбції з розчину. Адсорбційна рівновага між розчином і адсорбентом підчиняється рівнянню ізотерми адсорбції Ленгмюра, в області розведених розчинів ізотерма лінійна. Селективність адсорбції залежить від природи сил взаємодії між адсорбованими речовинами і адсорбентом.

Ефективність хроматографічної колонки залежить, головним чином, від процесів дифузії і масопереносу в обох фазах і визначається, як і в газовій хроматографії, висотою еквівалентною теоретичній тарілці (ВЕТТ) Н. З лінійною швидкістю рухомої фази U і деякими іншими величинами ВЕТТ зв’язана рівнянням

H = 2Rr(1 – Rr)Uts,

де

де t_m – середній час між десорбцією і повторною адсорбцією молекули речовини, коли вона рухається із швидкістю рухомої фази U;

t_s – середній час перебування молекули в нерухомій фазі.

Таким чином, з ростом лінійної швидкості руху рухомої фази ВЕТТ зростає і, відповідно, ефективність колонки зменшується.

В класичному варіанті РХ в скляну колонку l = 1-2 м, заповнену сорбентом (розмір частинок ³ 100 мкм), вводять аналізовану пробу і пропускають елюент. Швидкість проходження елюента під дією сили тяжіння мала, а тривалість аналізу велика. Внаслідок використання сорбентів з розміром зерен 10-30 мкм, поверхнево– і об’ємно-пористих сорбентів з розміром частинок 5-10 мкм, насосів, чутливих детекторів відбувся перехід від класичної до ВЕРХ. Швидкий масоперенос при високій ефективності розділення дозволяє використати ВЕРХ для розділення і визначення молекул (адсорбційна і розподільча хроматографія), для розділення і визначення іонів (іонообмінна, іонна, іон-парна хроматографія), для розділенні макромолекул (ексклюзийна або гель-хроматографія). Методами афінної і лігандообмінної хроматографії розділяють БА молекули і оптичні ізомери.

Адсорбційна хроматографія

                                                

             Нормативно-фазова                        обернено фазова

             хроматографія                                 хроматографія

          – полярний адсорбент                     – неполярний адсорбент

          – неполярна рухома фаза                – полярна рухома фаза.

Вибір рухомої фази завжди важливіший, ніж вибір нерухомої.

Нерухома фаза повинна утримувати розділювані речовини. Рухома фаза, тобто розчинник, повинна забезпечити різну ємкість колонки і ефективне розділення за оптимальний час.

Нерухома фаза – пористі тонкодисперсні матеріали з питомою поверхнею більше 50 м²/г.

 

                            полярні                    неполярні

    SiO₂, Al₂O₃, Me_xO_y, флоросил       графітована сажа, кизельгур,

                            і т.д.                          диатоміт.

           а також з привитими               (Не маютьселективності

           полярними групами                  до полярних молекул).

    (Для розділення неполярних –NH₂

     і малополярних, середньоїполярності речовин).

Вказані сорбенти наносяться на поверхнево-пористі носії.

Рухома фаза. Від неї залежить:

–       селективність розділення;

–       ефективність колонки;

–       швидкість руху хроматограмної смуги.

Вимоги до рухомої фази:

1)    повинна розчиняти аналізовану пробу;

2)    мала в’язкість (Д_диф. компонентів проби достатньо високі);

3)    можливе виділення з неї розділених компонентів;

4)    інертна по відношенню до матеріалів всіх частин хроматографа;

5)    відповідає вимогам вибраного детектора;

6)    безпечна;

7)    дешева.

Як було сказано, елююча сила рухомої фази – розчинника впливає на розділення.

Елююча сила розчинника показує, у скільки разів енергія сорбції даного елюєнта більша, ніж енергія сорбції елюента, вибраного в якості стандарту, наприклад, н-гептану. Розчинники (елюенти) ділять на слабкі і сильні.

Слабкі елюенти мало адсорбуються нерухомою фазою, тому Д сорбата високі.

Сильні елюенти сильно адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт розподілу сорбованих речовин (сорбата) низькі.

Наприклад: SiO₂ – нерухома фаза.

Сила розчинників збільшується в ряду:

пентан (0) < CCl₄ (0,11) < C₆H₆ (0,25) < CHCl₃ (0,26) < CH₂Cl₂ (0,32) < ацетон (0,47) < діоксан (0,49) < ацетонітрил (0,5) < етанол < метанол.

В якості міри відносної полярності приймають шкалу Гільдебранда.

Розміщення розчинників у відповідності із зростанням їх елюючої сили називають елюотропним рядом. В рідинній адсорбційній хроматографії елюотропний ряд Снайдера має вигляд: пентан (0) < н-гексан (0,01) < циклогексан (0,04) < CCl₄ (0,18) < бензол (0,32) < CHCl₃ (0,38) < ацетон (0,51), етанол (0,88) <  вода, СН₃СООН  (дуже велика).

Для обернено-фазової хроматографії на С₁₈ елюотропний ряд має вигляд: метанол (1,0) <  ацетонітрил (3,1), етанол (3,1) < ізопропанол (8,3) < н-пропанол (10,1) < діоксан (11,7).

Часто застосовують не окремі розчинники, а їх суміші. Незначні кількості доданих інших розчинників, особливо води, істотно збільшують елюючу силу елюента.

При розділенні багатокомпонентних сумішей одна рухома фаза в якості елюента може не розділити всі компоненти проби за достатньо оптимальний час. Тоді використовують метод ступінчатого або градієнтного елюювання. Для збільшення сили елюента в процесі хроматографування послідовно застосовують все більш сильні елюенти. Це дозволяє елюювати все більш сильно утримувані речовини за менший час.

Існують емпіричні правила, які допомагають при виборі елюента. Сорбція, як правило, зростає з ростом числа подвійних зв’язків і ОН-груп в сполуках. Сорбція зменшується в ряду органічних сполук: кислоти > спирти > альдегіди > кетони > складні ефіри > ненасичені вуглеводні > насичені вуглеводні.

Для розділення речовин різної полярності і для розділення сполук різних класів застосовують нормально-фазову хроматографію: з неполярних рухомих фаз сполуки різних класів виходять з колонки з полярним адсорбентом за різний час (час утримування сполук з різними функціональними групами збільшується при переході від неполярних сполук до слабкополярних). Для дуже полярних молекул t_R дуже великі і аналіз при використанні неполярного елюента неможливий. Для зменшення часу утримування полярних сорбатів переходять до полярних елюентів. В обернено-фазовому варіанті нерухома обернена фаза сильніше адсорбує неполярні компоненти з полярних елюентів, наприклад з води. Знижуючи полярність елюента додаванням менш полярного розчинника (метанол), можна зменшити утримування компонентів.

Розподільча хроматографія.

Метод розподільчої, або рідинно-рідинної, хроматографії базується на розподілі речовини між двома фазами, які не змішуються, подібно до багатократної ступінчастої екстракції.

Рідку нерухому фазу наносять на пористий достатньо інертний сорбент, як у газорідинній хроматографії, і і заповнюють ним колонку. При пропусканні рідкої рухомої фази через колонку суміш розділяється на компоненти головним чином за рахунок їх різної розчинності в рідкій нерухомій фазі відповідно до тих самих механізмів, які були у газорідинній хроматографії. За звичай розчинність компонентів проби в нерухомій і рухомій фазах, які володіють різною полярністю, дуже відрізняється. Якщо розчинність проби вища в нерухомій фазі, то час утримування компонентів значно зростає, якщо розчинність вища в рухомій фазі, то час утримування може бути близьким до t_m – часу утримування несорбованого компонента. Щоб досягти розділення, в рухому фазу, насичену нерухомою, включають третій компонент, який знижує відмінності у полярності нерухомої і рухомої фаз. Наприклад, до суміші з неполярного (гексан) і полярного (вода) розчинників додають спирт. Тільки в цьому випадку вдається підібрати оптимальні умови для розділення компонентів суміші.

Звичайно полярний розчинник (вода, спирт) фіксований на твердому носії – силікагелі, діатоміті, целюлозі, Al₂O₃. Рухомою фазою в цьому випадку є неполярні розчинники – ізооктан, бензол і т.д. Такі системи використовують в нормально-фазовій розподільчій хроматографії.

Якщо неполярний розчинник зафіксувати на носії, а в якості рухомої фази використати полярні розчинники (вода, спирт, буферні розчини, сильні кислоти), то такий варіант називають обернено-фазовою розподільчою хроматографією. Нанесені рідкі фази мають великий недолік – вони швидко змиваються рухомою рідкою фазою з поверхні носія, особливо при використанні ВЕРХ. Тому рідкі фази “пришивають” до носія. В якості носіїв нерухомих рідких фаз для нормально-фазової розподільчої хроматографії використовують силікагелі з пришитими нітрильними, амінними та ін. групами. В обернено-фазовому варіанті розподільчої хроматографії використовують силікагелі з привитими алкілсилильними групами від С₂ до С₂₂.

Головні вузли рідинного хроматографа:

–       система подачі рухомої фази (насос, дегазатор, система для створення градієнту концентрації рухомої фази, вимірювачі тиску).

V_рух.ф. = 0,1 – 10 мл/хв  р = до 400 атм.

–       система введення проби (петля);

–       колонка в термостаті; (10, 15, 25 см з діаметром 4-5,5 мм) (5-6 см і діаметром 1-2 мм).

–       детектор;

–       реєструючий пристрій.

Для неперервного контролю складу елюата, який витікає з колонки, використовують детектори:

–       диференціальні рефрактометри; (чутл. ~ 10^–6 г, 10^х – 10^х+4);

–       УФ-детектор (10^–9 г; (10^х – 10^х+5) (254 нм);

–       фотометри і ДФ;

–       флуоресцентні (більш чутливі в 100 разів);

–       кондуктометричний (0,01 мкг/мл – 100 мг/мм).

Застосування ВЕРХ:

Адсорбційна:

–       вуглеводні;

–       поліциклічні вуглеводні;

–       пластифікатори;

Розподільча:

–       пластифікатори;

–       вуглеводні;

–       пестициди;

–       ароматичні вуглеводні і кислоти;

–       стероїди;

Іонообмінна:

–       амінокислоти;

–       наркотичні і болетамувальні засоби;

–       фторовані вуглеводні ;

–       компоненти масел (вазелінового).