Матеріали для підготовки до практичного заняття №1

Матеріали для підготовки до практичного заняття

для студентів 2 курсу медичного факультету

спеціальність «Здоров’я людини»

до практичних занять

 

Теми: І. Методи культивування бактерій. Поживні середовища і їх характеристика. Типи і механізми живлення бактерій.

ІІ. Основні принципи і методи виділення чистих культур. Виділення чистих культур аеробних бактерій. Створення анаеробних умов. Культуральні властивості мікроорганізмів.

ІІІ. Ферменти бактерій та їх значення для ідентифікації збудників. 

 

Культивування мікроорганізмів. Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища.  Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови  для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю  та водню для побудови власних білків. Водень і кисень  для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також  білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу  середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного  й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію,  мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну в’язкість, густину Залежно (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують  спеціальні середовища. Частину їх готують у  лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

 

 

 

Класифікація живильних середовищ

П р о с т і

С к л а д н і

Рідкі: ПВ, МПБ Щільні: МПЖ, МПА

Спеціальні: цукров. МПА, МПБ, сиров. МПА,                    кров. МПА, асцит. МПА   Збагачення, накопичення: селенітовий МПБ,     с-ща Мюллера, Кауффмана, Кітт-Тароцці   Елективні: Ру, 1% лужна ПВ               Диференціально-діагностичні:   1.для визначення цукролітичних властивостей               (с-ща Гіса, Ендо, Левіна, Плоскірева)   2. для визначення протеолітичних властивостей      (згорнута сироватка, МПЖ, кусочки м’язів)   3. для визначення пептолітичних властивостей                           (МПБ, ПВ)   4. для визначення гемолітичних властивостей                    (кров. МПА)   5. для визначення редукуючих властивостей      (середовища з різними барвниками)

 

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 %  та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою  волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин.  Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи,  надає  середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних  систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ   використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: м’ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний,  сироватковий агари,  сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.

Третя група – елективні середовища. Їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів.  Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії, середовище Плоскірева – для дизентерійних паличок, середовище Мюллера- для тифо-паратифозних бактерій. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на  середовищах, у складі яких є  до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон.

Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група – диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо.

На поверхні щільного поживного середовища мікрорганізми можуть утворювати суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія –  це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Утворення її є проявом  культуральних властивостей бактерій.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду  притаманні свої особливі  колонії.

 

 

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) вони поділяються на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-  2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і мутними.

За рельєфом  і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусоподібні. плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth – гладенький), а шорсткі –  R-форми (rough – шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість  тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них  формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні і чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.  

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному. хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не  змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад  має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть,  як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

 

ТИПИ І МЕХАНІЗМИ ЖИВЛЕННЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.

Бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються  різноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію  функціональної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовнішнього середовища.

Хімічний склад бактерій. Як і всі живі  істоти, бактерійна клітина складається з чотирьох основних елементів – азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає 45-   55 % сухого залишку клітини, кисень – 25-30 %, азот – 8-15 % і водень – 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з якого побудовано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.

Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. Вона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або зв’язаному стані. Вільна вода є середовищем, в якому відбувається  розмаїття біохімічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) внаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона виступає розчинником  багатьох речовин, що надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.

Зв’язана вода – також необхідний компонет цитоплазми, проте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призводить до її загибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає виходити  з неї, цитоплазма зморщується, відшаровується від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.

Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується  з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, вуглеводів, полісахаридів, низькомолекулярних органічних речовин і солей.

У  клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів

 

Хімічний склад клітини

 

Білок складає до 55 % сухого залишку клітини. Його представлено простими та складними білками. Прості білки  називають протеїнами. За своїм складом вони суттєво не відрізняються від білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса міститься в цитоплазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці грамнегативних  мікробів, нуклеоїді. Токсини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза є простими білками.

Складні білки – протеїди свою назву отримали за здатність сполучатися з іншими речовинами. Так, білки, зв’язані  з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами – глікопротеїди, ліпідами – ліпопротеїди, залізом, міддю-  хромопротеїди. Вони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нуклеопротеїди забезпечують суперспіралізацію нуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й виконують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; ліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бактеріальних ендотоксинів, отже, вірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну  функцію клітини, є переносниками кисню.

Тонкі фізико-хімічні дослідження дозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів.

Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою (ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. Їх вміст коливається в межах 25-30 % сухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, транспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК – форма, що утворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної інформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. Рибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від РНК еукаріотів  за константою седиментації. Транспортні РНК  здатні зв’язуватись із амінокислотами, що накопичуються в цитоплазмі, й доставляти їх до рибосом, на яких відбувається процес біосинтезу.

Вуглеводи становлять 12-20 % сухого залишку. Їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, оліго-та поліозидами, полісахаридами, іншими сполуками. Їх роль у забезпеченні життєдіяльності клітини важко переоцінити, так як  вони входять до складу будь-яких структур клітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. Полісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони зумовлюють антигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) властивості.

Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли в основу розробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. Особливості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вакцини, специфічні діагностичні сироватки.

У клітині міститься  в середньому до 10 % ліпідів. Однак в окремих груп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується до 40 %. У грамнегативних бактерій в зв’язку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 разів більше, ніж у грампозитивних.

В середньому в клітині є до 22 млн молекул  різноманітних ліпідів. Представлено їх, в основному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних кислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні властивості  клітини (кислотостійкість), її токсичні функції,  беруть участь у метаболізмі.

Важливою складовою частиною будь-якої мікробної клітини є мінеральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і можуть  знаходитись у вільному стані в цитоплазмі. Без них не обходяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у мікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх похідні  за рахунок здатності утворювати макроергічні (багаті на енергію) зв’язки постачають клітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєдіяльності бактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й кальцій  здатні активувати багато ферментів; залізо – невід’ємний складник цитохромів.

Клітинний метаболізм. Сукупність усіх біохімічних   перетворень у клітині називається метаболізмом. Він відбувається за двома основними напрямками. Перший забезпечує синтез складних клітинних сполук із більш простих. Тому він одержав назву біосинтез, конструктивний метаболізм або  анаболізм. Однак переважна  більшість реакцій синтезу й розпаду потребує енергетичного забезпечення. Тому енергетичний метаболізм або катаболізм представляє собою потік реакцій, які супроводжуються накопиченням електрохімічної енергії, що потім викорстовується клітиною.

Конструктивний та енергетичний метаболізм  – тісно пов’язаний між собою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і одні й ті ж речовини використовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи – амфіболічними.

Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. Вони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для побудови  власних структур. Саме цим зумовлюється убіквітарність їх розповсюдження.

Конструктивний метаболіз прокаріотів. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись постійний обмін речовин з навколишнім середовищем. У клітину ззовні мусить надходити  пластичний матеріал, з якого вона  синтезує всі необхідні їй молекули.

У конструктивному метаболізмі провідна роль належить сполукам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. Залежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві групи: автотрофи і гетеротрофи.

Типи метаболізму бактерій

 

Автотрофи (autos – сам, trophe – живлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з CO₂ як єдиного джерела вуглецю.  Гетеротрофи (heteros -інший) – мікроорганізми, джерелом вуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні  споживати  будь-які прості й складні вуглецеві сполуки – цукри, амінокислоти, багатоатомні спирти, парафіни та ін.

Ступінь вираження гетеротрофії у бактерій може бути найрізноманітніша.  Найвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити тільки всередині  живих клітин (рикетсії, хламідії). Їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі мікрорганізми називають облігатними (суворими) паразитами.

Однак багато мікробів можна вирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, пептиди, вітаміни, фрегменти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних рости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, називають  факультативними паразитами.

Більшість бактерій, що населяють земну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих організмів не залежать  і живляться за рахунок мертвих органічних залишків.

Мікроорганізмам необхідний азот для синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні бактерії здатні засвоювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), інші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило,  засвоюють азот у відновленій формі – це солі амонію, сечовини, органічні сполуки  (амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) також можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони  відновлюються до аміаку за допомогою ферментів нітратредуктази й нітритредуктази.

Дикі штами бактерій здатні синтезувати всі необхідні їм речовини з обмеженого числа органічних сполук, наприклад, глюкози та солей амонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми  (варіанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних їм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живильних середовищах. Їх називають ауксотрофними організмами.

Джерела енергії та донори електронів. Залежно  від джерела енергії, що засвоюють мікробні клітини, їх поділяють на фототрофи і хемотрофи.

Фототрофні бактерії здатні використовувати енергію сонячного світла. Їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патогенних для людини серед них   немає.  Інші прокаріоти, які  одержують енергію за рахунок окисно-відновних реакцій в субстратах, називаються хемотрофами.

Для здійснення різноманітних реакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних перетворень віддають електрони, називаються донорами. Молекули, які одержують електрони, називаються акцепторами.

Мікроорганізми, для яких джерелом електронів є неорганічні сполуки типу Н₂, Н₂S, NH₃⁺ , Fe ⁺² та інші, називаються літотрофами (litos – камінь). Інші бактерії, для яких донором електронів  виступають органічні речовини, називаються органотрофами.

Залежно від способу одержання енергії, донора електронів та джерела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 основних типів прокаріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й фотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, хемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемооргано-автотрофи й хемоорганогетеротрофи.

Мікроорганізми, які здатні викликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів.

Бактерії, яким притаманний один із спосібів живлення, позначають як облігатні,  а ті, які використовують два джерела енергії, – міксотрофи.

Для здійснення своїх метаболічних перетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні сполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн), вітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору неможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він  необхідний компонент фосфоліпідів, коферментів.

Мікроорганізми  засвоюють сірку з природних джерел, де вона знаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної сірки, а потреби у фосфорі задовільняються за рахунок  засвоєння неорганічних фосфатів.

Усі необхідні йони металів клітина одержує за рахунок неорганічних сполук. Деякі елементи (магній, кальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в інших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у клітині надзвичайно різноманітна, так як вони входять до складу  основних клітинних метаболітів, виконуючи життєво важливі функції.

При культивуванні бактерій крім білків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього середовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів росту.  Вони включаються до складу клітинних метаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі вітаміни (біотин,  тіамін, пантотенова кислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та піримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.

   Надходження речовин у клітину.

Незважаючи на досягнення мікробіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клітині остаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення метаболітів назовні не з’ясовано. Встановлено, що мікробам притаманний  голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні речовини тільки в розчиненому вигляді . 

Однак деякі субстрати не розчиняються у воді (білки, полісахариди), або  утворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому випадку клітинні екзоферменти, які виділяються  в навколишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплюючи їх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.

Виділяють декілька механізмів проникнення  речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли створюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та зовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії.

Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків – пермеаз, які містяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає енергетичного забезпечення.

 

Однак більшість поживних речовин,  метаболітів, іонів проникають у клітину за допомогою активного транспорту. Його також забезпечують білки-пермеази, але вони є  високоспецифічними й здатні переносити тільки певні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує  клітина, тому можливий перенос і проти градієнта концентрації речовини. Якщо цьому процесу передує певна хімічна модифікація  молекули, його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також механізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних іонів.

Конструктивний метаболізм. Обмін білків у мікроорганізмів відбувається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до амінокислот і біосинтетичні процеси, пов’язані з конструюванням нових молекул.  Перший напрямок забезпечують ферменти екзопротеази, що виділяються в навколишнє середовище,  та ендопротеази, які нагромаджуються в клітині. Кінцеві продукти -амінокислоти, – що утворюються під час цього процесу, можуть зазнавати дезамінування та декарбоксилювання, перетворюючись на аміак, вуглекислий газ, оксикислоти.

Біосинтетичні процеси відбуваються за участю готових амінокислот, які трансамінуються або перамінуються. Деякі мікрорганізми здатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно зазначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму людини, здатні синтезувати незамінні амінокислоти – лізин, метіонін, триптофан.

Вуглеводний обмін забезпечуєтся або гідролітичним розщепленням молекул з утворенням глюкози й мальтози або фосфоролізом. І в одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються вивільненням енергії. Це відбувається при бродінні –  окисно-відновних реакціях анаеробного розщеплення органічних речовин, головним чином, вуглеводів. Метаболіти, які утворюються під час бродіння, використовуються для біосинтетичних процесів. Продуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, мурашина), спирти (етиловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, водень. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, розрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види бродіння. При бродінні вивільняється  незначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 молекулу субстрату утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).

Синтез вуглеводів відбувається або з вуглекислого газу (автотрофи), або за рахунок  вуглецемістких органічних сполук.

Як було зазначено, ліпіди мікроорганізмів представлено насиченими та ненасиченими жирними кислотами, фосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. Мікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за участю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою клітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включаються до складу фосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших ліполітичних ферментів.

Ферменти мікроорганізмів. Усі біосинтетичні процеси  та інші метаболічні перетворення в клітині відбуваються  за участю особливих  високоактивних біологічних каталізаторів, які називаються ферментами.  Вони належать до 6 класів: гідролази (забезпечують реакції розщеплення за участю води), оксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть участь  у процесах дихання), ізомерази (здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси ізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних субстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеплення хімічних груп негідролітичним шляхом),  лігази (відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахуноко енергії АТФ).

Здатність утворювати певні ферменти кодується клітинним геномом і є постійною ознакою бактерій. Так як бактеріальна клітина займає невеликий об’єм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів синтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої групи постійно присутні в бактерії  в певних концентраціях. Вони зумовлюють першочергові біосинтетичні потреби клітин.

Клітина виділяє  ферменти в навколишнє середовище (екзоферменти). Там вони здійснюють   контактне позаклітинне  перетравлювання речовин або пошкоджують тканини організму господаря. Ендоферменти  локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в периплазматичному просторі.

Класифікація ферментів бактерій

 

 

Роль ферментативної діяльності мікроорганізмів важко переоцінити. Вони мають загальнобіологічне значення. Відома участь бактерій  у кругообізі речовин у природі, формуванні родовищ корисних копалин (нафта, вугілля, поклади сірки). Мікроорганізми – прекрасні санітари довкілля. Вони здатні біодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє середовище.

Людина поставила мікробні ферменти собі на службу. Їх широко використовують у різних галузях хімічної, харчової, фармацевтичної, парфумерної  промисловостей, сільському господарстві, медицині.

Протеазами видаляють волосяний покрив зі шкір тварин, знімають желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що забезпечують бродіння,  використовуються для одержання бутанолу, ацетону, необхідних для проведення хроматографічних досліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти – кефір, йогурт, кисляк, кумис – також продукти діяльності бактерій бродіння.

Мікроорганізми використовуються у виноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла,  силосуванні кормів, квашенні овочів. Із дріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як живильне середовище використовують парафіни – відходи нафти.

За допомогою мікроорганізмів та їх ферментних систем в медичній промисловості одержують  гормони гідрокортизон, преднізолон, різноманітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують вітаміни (В_12­). Зі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу і стрептокіназу, які руйнують тромби в кровоносних судинах.

Оскільки здатність утворювати ферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко використовується в лабораторній практиці для ідентифікації бактерій. Її проводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, ліполітичних та інших ферментів.

Енергетичний метаболізм прокаріотів.  За своїм об’ємом реакції, що забезпечують клітину внутрішньою енергією, значно  перевищують  біосинтетичні процеси.

Мікроорганізми можуть використовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні користуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтезуючі бактерії) та хімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова енергії.

Явище  нагромадження  енергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту протонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, а електрони передаються на відповідні молекули- акцептори.

Протягом своєї еволюції бактерії виробили три способи одержання енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.

При бродінні в анаеробних умовах у певних окислювально-відновних реакціях утворюються нестабільні молекули, фосфатна група яких  містить багато вільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти (АДФ), яка перетворюється в  АТФ. Реакції, в яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстратного фосфорилювання. Відновлювач, який при цьому утворюється, (НАДН₂, відновлений  фередоксин), переносить  електрони на ендогенний акцептор (піруват, ацетальдегід) або звільняється у вигляді водню.

Окислення  відбувається внаслідок переносу електронів через спеціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембрані. Він складається  з набору переносників і в більшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до Н₂О.

Основою фотосинтетичних процесів у представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними пігментами: флавопротеїнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять негемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення енергії.

Енергія, яку генерує клітина, запасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню – Dmн⁺  або в молекулах АТФ.

Прокаріоти містять декілька сполук із високоенергетичними фосфатними зв’язками – ацилфосфати, фосфоенолпіруват, аденозинфосфосульфат, а також сполуки з тіоефірним зв’язком – ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. Перенос її веде до розриву зв’язку, з’єднуючого з молекулою, отже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєднання такої групи до молекули акцептора підвищує рівень його вільної енергії, переводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних реакціях.

Найголовніше місце в переносі хімічної енергії належить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та мембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється фосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергічних зв’язки, які при гідролізі звільняють  31,8 кДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі розміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки кілтини, де необхідна енергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля 10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.

На прикладі  E. coli визначено, скільки необхідно енергії,  щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль АТФ, із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль – на синтез ДНК і РНК, 2 ммоль – для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання життєдіяльності  – осмос, рух клітини тощо.

Іншою універсальною клітинною енергією є енергія трансмембранного потенціалу Dmн⁺. Це здійснюється за допомогою спеціальної «петлі», локалізованої в цитоплазматичній мембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої сторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а протони  вивільняються в зовнішнє середовище.

При такому переносі  назовні клітини накопичуються іони водню, середовище підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває більш лужного характеру. Виникає орієнтований поперек ЦПМ градієнт іонів водню. Оскільки Н⁺ – хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення з обох сторін ЦПМ викликає створення  не тільки концентраційного градієнта часток, але й орієнтованого поперек мембрани електричного поля. Напруга потенціалу Dmн⁺  досягає 200-250 мВ.

Енергія трансмембранного потенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного АТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного фосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може проходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідролізі АТФ зростає  енергія Dmн⁺ на ЦПМ.

Таким чином, дані реакції є природними механізмами, які з’єднують процеси окислення з фосфорилюванням. Енергія, яка накопичується на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні потреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює рух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та іонів через мембрану, а енергія АТФ  – синтетичні процеси в клітині.

Але ні енергія Dmн+, ні АТФ не можуть нагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже тривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії прокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахаридів, ліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, вкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

РІСТ І РОЗМНОЖЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Під ростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і відповідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження – це здатність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю об’єму середовища

Розмноження бактерій – складний процес, пов’язаний із синхронною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу – ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої  в місці з’єднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розходяться. Кожна з них є матрицею, на якій  за принципом комплементарності  синтезуються їх копії,  які згодом об’єднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис. нуклеотидів, які пізніше зшиваються ферментом лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.

Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перегородки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складатимуться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних  мікробів  синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають зв’язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм.

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий – такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип – із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому  утворюються багатонуклеоїдні форми бактерій.

Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбувається в різних площинах. Це спричиняє, наприклад,  утворення   різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів – диплококів,  стафілококів, тетеракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмножуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення клітин, подібних до спор, конідій.

Облігатні внутрішньоклітинні паразити – хламідії – розмножуються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується  нове покоління  елементарних тілець. Тривалість циклу складає 40-48 годин.

Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись  і простим бінарним поділом.

Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години – 16, через 4 – 256, через 15 – мільйони. Через 35 год їх об’єм становитиме  до 1000 м³, а маса – понад 400 т.

При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, досягаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періодичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з генетично обмеженим ростом.

Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від  часу культивування, називається кривою росту.

 

 

Розрізняють чотири основні фази росту періодичної культури: початкову (або лаг-) фазу, експоненціальну (або логарифмічну) фазу, стаціонарну та фазу відмирання.

Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.

Експоненціальна (логарифмічна)  фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії.  Вона залежить від віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи – 30 хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу – 5-18 год. Час,  протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази – 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит живильних речовин у середовищі, низький парціальний  тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період  сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну (М-) концентрацію, а величину біомаси – терміном вихід або урожай. Ця ознака є  специфічною й характерною  для кожного  виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням  числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом  власних ферментів.

 

Поділ мікроорганізмів за температурним оптимумом

 

Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів  зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціальнго росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням  живильного середовища, додатковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати – прилади, які дозволяють проводити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах.

 Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища.

Принципи і методи виділення чистих культур бактерій

 

 

 Етапи видiлення чистих культур аеробних мiкроорганiзмiв:

 

1 – макро- i мiкроскопiчне вивчення  дослiджуваного  матерiалу  i посiв на щiльнi поживнi середовища для одержання окремих колонiй;

2 – макро- i мiкроскопiчне вивчення колонiй i пересiв на скошений агар;

3 – перевiрка культури на чистоту та її iдентифiкацiя;

 

Морфологічна ідентифікація – визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками.

Приймають до уваги форму і зовнішні ознаки бактерії (коки, палички, спірохети), навність капсули, спори, джгутиків.

Культуральна ідентифікація – визначення виду бактерій за їх культуральними властивостями.

Приймають до уваги характер росту бактерій на рідких і щільних поживних середовищах (характеристика колоній, ріст на рідкому середовищі).

Біохімічна ідентифікація – визначення виду бактерій за їх біохімічними ознаками.

Приймають до уваги цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, редукуючі, гемолітичні та інші ферментативні властивості бактерій.

 

Серологічна ідентифікація – визначення виду бактерій за їх антигенною будовою.

Для цього використовують специфічні аглютинуючі антимікробні сироватки.

Біологічна ідентифікація –  заражають лабораторних тварин (гвінейських свинок, щурів, мишей) чистою культурою бактерій і спостерігають за тими змінами, які вони викликають в організмі.

4 – висновок про видiлену культуру.

 

Поділ бактерій за типом дихання

n  Облігатні аероби (збудники туберкульозу, чуми, холери)

n  Облігатні анаероби (збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії)

n  Факультативні анаероби (стафілококи, ешеріхії, сальмонели, шигели та інші)

n  Мікроаерофіли (молочнокислі, азотфіксуючі бактерії)

n  Капнеїчні (збудник бруцельозу бичачого типу)

 

 

Дихання бактерій. Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні  та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших  – неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі  кисню. У 1863 р. він запропонував терміни «аероб» та «анаероб».

Сьогодні, залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп.  Облігатні  аероби – мікроорганізми, для оптимальнгоо росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки.  Облігатні анаероби – бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є  збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентиними газами (азотом, воднем).  Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини  кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли – особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками є  збудники бруцельозу бичачого типу.

В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. В клітинах факультативних анаеробів  також є  цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

Детальне вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб  відбулось переключення механізму бродіння на аеробне дихання,  достатньо було 0,2 %  кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної  на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв’язана.

Вирощування мікроорганізмів

Живильні середовища повинні бути такими, що легко засвоюються, з певним складом азотистих речовин, вуглеводів, вітамінів і відповідною концентрацією солей, ізотонічними, стерильними, мати буферні властивості, оптимальну в’язкість і певний окислювально-відновний потенціал.

Мікроорганізми, які потребують високих концентрацій солей, називають галофільними. Вони поширені в морях, океанах, солоних озерах. До них належать деякі патогенні для людини види (Vibrio parahaemolyticus та   ін.).

Протягом усієї історії мікробіології живильні середовища посту­пово вдосконалювались. У допастерівський період як середовища для вирощування мікроорганізмів застосовували тільки настої і відвари. Л. Пастер і К. Негелі запровадили в практику культивування безбілкові  середовища.

Р. Кох і Ф. Леффлер для вирощування бактерій використовували м’ясну воду, пептон і натрію хлорид. Це середовище являє собою м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), з якого готують м’ясо-пептонний агар (МПА), додаючи  1—2 %  агару.

Агар — твердий волокнистий матеріал, який добувають із деяких водоростей. У водних розчинах він утворює густий гель (холодець). Агар складається з 70—75 % полісахаридів, 2—3 % білків та інших азотовмісних речовин, 2—4 % золи. Основними компонентами агару є високомолекулярні речовини — агароза й агаропептин. Агар розчиняється у воді при нагріванні і охолоджується при кімнатній температурі. Його випускають у вигляді безбарвних пластинок або порошку. Завдяки властивості агару надавати поживному субстрату при охолодженні консистенції густого гелю і високій стійкості до фермента тивної дії мікроорганізмів його широко застосовують при виготовлен­ні напіврідких, густих і сухих поживних середовищ.

Розроблено методику виготовлення синтетичного полімерного матеріалу, що використовується для приготування густих поживних середовищ і з успіхом замінює природний дефіцитний агар.

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до 20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

 

Основні живильні середовища. Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньоперед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експериментального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

 

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп­тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наяв­ністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група  селективні середовища, які завдяки додаванню певних компонентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. так, середовище Мюллера є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ робить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

 

Класифікація живильних середовищ

 

 

Все ширше застосування в мікробіологічних лабораторіях знаходять численні комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготовлені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети та висушуються для видалення води. До них належать системи АРІ-20 для ідентифікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів, Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для ідентифікації ентеробактерій. Непогано зарекомендували себе тест-системи Roche та інші.

 

 

Біохімічна ідентифікація бактерій за допомогою тест-систем

 

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюючих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro–ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно дослідити широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки. Комп’ю­терна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оцінити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ входять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо, рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готують спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання живильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду натрію складає 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, інші солі додаються із розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри, багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до 0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар, який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворюючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С. Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки, кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів. Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компоненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’язково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра, або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилізації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеці­альні матраци, колби, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками. Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так, середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при температурі 112 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Середовища без вуглеводів можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв. Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Контроль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути основою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку попередньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шматки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи накип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтрувальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного ­об’є­му, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура 120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за допомогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. ­Бульйон фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, пробірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С про­тягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед застосуванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додаютьстерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тварини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідкуючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержати в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стабільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру, порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попередньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через ­м’ясорубку. Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану суміш ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30  хв перевіряють рН. Якщо активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недоброякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища, встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температу­рі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За 1‑2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища ­припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка набуває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду. Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної води). За наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амінний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до 100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4‑7,6, розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецептурою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартними сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промисловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

Для культивування бактерій широко застосовують безбілкові середовища, в яких добре ростуть багато органотрофних, у тому числі патогенних видів бактерій. До цих середовищ входить багато компонентів.

Культивування в синтетичних середовищах з використанням методу мічених атомів дає змогу детальніше диференціювати бактерії за характером їх  біосинтезу.

 

 

 

МПА

 

Середовище Ендо.

 

 

Середовище  Плоскирева.                     Середовище Левіна

 

 

 

 

  

Середовища Гіса                                           Жовтково-сольовий агар

 

 

Кровяний МПА

 

 

 

Розрідження желатини             Тест на виявлення індолу

                                                                                                                                                           (червоний папірець свідчить

                                                                                                                                                           про продукцію індолу)  

 

Для диференціації прототрофних і ауксотрофних бактерій широко використовують селективні середовища. Прототрофи ростуть на мінімальному середовищі, яке містить тільки солі й вуглеводи, оскільки вони самі можуть синтезувати потрібні їм для розвитку метаболіти, тоді як ауксотрофи потребують середовища, що містить певні амінокислоти, вітаміни й інші речовини.

На густих живильних середовищах бактерії утворюють різні за формою й величиною колонії — видимі скупчення мікроорганізмів одного виду, що формуються в результаті розмноження з однієї або кількох клітин. Колонії бувають плоскими, опуклими, куполоподібними, удавленими, їх поверхня — гладкою (S-фор-ми), шорсткою (R-форми), покресленою, горбкуватою, краї — рівними, зазубленими, волокнистими, бахромчастими. Форма колоній також різноманітна: кругла, розеткоподібна, зірчаста, деревоподіб­на. За величиною (діаметром) колонії поділяються на великі (4— 5 мм, середні (2—4 мм), дрібні (1—2 мм) і карликові (менше 1 мм).

 

Різні види колоній

 

Колонії різняться і за консистенцією, густиною, кольором. Вони можуть бути прозорими й непрозорими, забарвленими і безбарвними, вологими, сухими і слизистими. У рідких живильних середовищах бактерії ростуть з утворенням дифузної каламуті, плівки, осаду, які видно неозброєним оком.

У лабораторних умовах бактерії вирощують у пробірках, чашках Петр і, у флаконах.

В інститутах, які виготовляють вакцини й сироватки, мікроорга­нізми культивують глибинним способом, що дає змогу раціональніше використовувати поживний субстрат і одержувати бактеріальну масу у великій кількості. Культури вирощують у реакторах з великим об’ємом поживного середовища. Аерування досягають пропусканням струменя повітря через товщу середовища. Метод аерування використовують і для лабораторних досліджень з метою швидкого вирощування аеробних бактерій та вивчення деяких процесів обміну речовин.

В умовах лабораторії анаероби вирощують у стаціонарних анаеростатах або портативних мікроанаеростатах з розрідженням повітря до 1—8 мм або в вакуум-ексикаторах.

Культивування анаеробів можливе в умовах заміщення кисню атмосферним азотом або іншим інертним газом. Анаеробні умови можна створити і простішими способами: за допомогою вазелінового масла, яке вміщують шаром поверх живильного середовища, або висіванням матеріалу в товщу агару. Застосовують спеціальні скляні трубки, які заповнюють МПА і запаюють на кінцях. Вирощують анаероби звичайно в середовищах Кітта — Тароцці, Вільсона — Блера  та   ін.

 

Принципи і методи виділення чистих культур бактерій

Бактеріологічне дослідження

Бактеріологічний метод дослідження є найважливішим у практичній діяльнос­ті будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання ­залежить визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування інфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді необхідно встановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

 Тому перед освоєнням основних принципів і методів виділення чистих культур необхідно оволодіти технікою посівів і пересівів бактерій в рідкі й на щільні живильні середовища.

Техніка посівів мікроорганізмів. Посіви проводять як з метою виділення збудників із досліджуваного матеріалу від хворих, так і для нагромадження чистих культур з метою подальшого їх вивчення та ідентифікації. Техніка посівів у рідкі та на щільні живильні середовища має свої особливості.

У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне середовище (щільне або рідке), в іншій – досліджуваний матеріал. Пробірки затискають великим та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом пробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахиленими, і потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби зповітря та навколишніх предметів з однієї не потрапили в іншу. Корки з пробірок виймають, тримаючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома іншими пальцями правої руки, як олівець, тримають бактеріологічну петлю або піпетку, якими розподіляють досліджуваний матеріал.

Спочатку стерилізують петлю у верхній ­частині полум’я газового пальника. Пробірки відкривають і край їх проносять через полум’я пальника. Петлю опускають у пробірку, де є до­сліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись стінки, охолоджують. У подальшому петлю опускають у пробірку і набирають матеріал. Якщо він знаходиться у рідкому стані, для посіву достатньо краплі рідини, яка затримується в кільці бактеріологічної петлі. Коли використовують мікроби, що виросли на поверхні середовища, обережно плавним рухом набирають невелику кількість їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середовище. Петлю повільно виймають з пробірки, не торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку з середовищем. Штриховими рухами від однієї стінки пробірки до іншої, починаючи з нижньої частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні агару знизу догори.

Петлю виймають з пробірки, корки і краї пробірок проносять через полум’я і закривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.

При посіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом занурюють у рідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на стінці пробірки й омивають середовищем.

Матеріал, який набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, вилива­ють у живильне середовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку обе­режно, щоб не замочити корок, струшують або обертають, затиснувши в ­долонях.

Для посіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі невелику кількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню середовища біля краю чашки.

Посів петлею

 

 Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб знищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з місця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню агару, де було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по решті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву тривали від краю до краю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один до одного. Цим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для одержання ізольованих колоній.

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою. Стерильний шпатель проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розпо­діляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.

Посів шпателем

 

При посіві тампоном чашку дещо відкривають однією рукою, тампоном торкаються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до попереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного середовища пробірку з м’ясо-пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у праву і роблять укол до дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.

Посів матеріалу в товщу живильного середовища. Перед посівом матеріал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цього матеріал заливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50 °С МПА. Обережно похитуючи чашку, круговими рухами по поверхні стола перемішують в ній матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відділити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягнути за допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному і біологічному роз’єднанні бактерій.

 

 

 

 Метод розведень

 

 

 Метод поверхневих штрихів.

 

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, був одним із найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів. Він полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень). Р. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно культивувалось при оптимальній температурі. У його товщі утворювались ізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод Дригальського є більш досконалим методом, який широко розповсюджений в повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню сере­довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – в третій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На по­верх­ні середовища в першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільний ріст бакте­рій, у другій – густий ріст, а в третій – ріст у вигляді ізольованих колоній.

 

Колонії за методом Дригальського

 

Метод штрихових посівів сьогодні використовується в мікробіологічних лабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його паралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів.

 

 

Метод штрихів

 

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів тампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дригальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище перетворюються в чисту культуру

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні:

1. За типом дихання. Всі мікроорганізми за типом дихання поділяються на дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae тощо) та анаеробні (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens та ін.). Якщо матеріал, з якого слід виділити анаеробні збудники, попередньо прогріти, а потім культивувати в анаеробних умовах, то виростуть саме ці бактерії.

2. За спороутворенням. Відомо, що деякі мікроби (бацили і клостридії) здатні до спороутворення. Серед них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів зовнішнього середовища. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії термічного фактора, а потім інокулятивно перенесений в живильне середовище. Через деякий час на ньому виростуть саме ті бактерії, які здатні до спороутворення.

3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідок особливостей їх хімічної будови стійкі до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, харкотиння при туберкульозі попередньо обробляють рівним об’ємом 10 % розчину сірчаної кислоти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора гине, а мікобактерії внаслідок їх резистентності до кислот, виростають.

Холерний вібріон (Vibrio сholerae), навпаки, є галофільною бактерією, тому для створення оптимальних умов росту його висівають на середовища, які містять луг (1 % лужна пептонна вода). Вже через 4-6 год на поверхні середовища з’являються характерні ознаки росту у вигляді ніжної голубуватої плівки.

4. Рухомість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) мають тенденцію до повзучого росту і здатні швидко розповсюджуватись по поверхні дещо вологого середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у краплинку конденса­ційної рідини, яка утворюється при охолодженні стовпчика скошеного агару. ­Через 16-18 год вони розповсюджуються на всю поверхню середовища. Якщо взяти матеріал з верхньої частини агару, будемо мати чисту культуру збудників.

5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших протимікробних засобів. Внаслідок особливостей метаболізму бактерій вони можуь мати різну чутливість до деяких хімічних чинників. Відомо, що стафілококи, аеробні бацили, що утворюють спори, стійкі до дії 7,5–10 % хлориду натрію. Ось чому для виділення цих збудників використовують елективні живильні середовища (жовтково-сольовий агар, маніт-сольовий агар), які містять саме цю речовину. Інші бактерії при такій концентрації хлориду натрію практично не ростуть.

6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для гальмування росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, навпаки, додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє інгібуванню росту бактеріальної флори, якщо треба виділити гриби. Додавання фуразолідону в певних концентраціях до живильного середовища створює селективні умови для росту коринебактерій і мікрококів.

7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні покриви. Деякі патогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої кількості ферментів агресії здатні проникати через непошкоджену шкіру. Для цього шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають досліджуваний матеріал, який містить збудника і велику кількість стороньої мікрофлори. За деякий час тварину забивають, а з крові або внутрішніх органів виділяють ­мікроби.

8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворювань. Окремі тварини проявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів.

Наприклад, при будь-якому способі введення Streptococcus pneumoniae білим мишам у них розвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна картина спостерігається при зараженні гвінейських свинок збудниками туберкульозу (Mycobacterium tuberculosis).

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями як штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом розуміють мікроби одного виду, які виділено з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – це мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

 

 

Матеріали склали: доц. Романюк Л.Б.