Матеріали для підготовки до практичного заняття

Матеріали для підготовки

до практичного заняття  для студентів ІІ курсу

спеціальність «Здоровя людини»

на тему: Морфологія і фізіологія вірусів. Бактеріофаги. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій, викликаних РНК-місткими вірусами. Мікробіологічна діагностика захворювань, що викликаються герпесвірусами та аденовірусами. Лабораторна діагностика вірусних гепатитів та СНІДу. Онкогенні віруси. Повільні вірусні інфекції.

 

МОРФОЛОГІЯ І ФІЗІОЛОГІЯ ВІРУСІВ. Індикація вірусної репродукції. Серологічні реакції у вірусології

 

 

Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

За ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи. До першої групи належать збудники гарячки Ебола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, до другої входять арбо- і аренавіруси, віруси сказу, гепатитів А і В, ВІЛ. До третьої групи належать віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини. Четверта група представлена адено-, корона-, герпес-, рео- та онковірусами. Цей поділ певною мірою умовний, так як внаслідок генетичної мінливості можуть з’являтися штами вірусів з підвищеною вірулентністю.

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, – капсида. Разом вони формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими.

Будова простого віруса

 До них належать найдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, аденовіруси, ­паповавіруси.

 Проте більшість вірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками-глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багато­гранник (найчастіше ікосаедр – 20-гранник).

Усі відомі ДНК-геномні віруси ­мають складні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси, що містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких бактеріофагів. При цьому головка бактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у хвості, укладається спірально.

Будова віруса із змішаним типом симетрії

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси мозаїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (бактеріофаги), ниткоподібна (віруси ебола, віруси бактерій). На рис  представлені основні форми і структури найпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

 

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо:

(1)  Тип нуклеїнової кислоти, її структура, стратегія реплікації

(2) Розміри, морфологія, симетрія віріону, число капсомерів, наявність суперкапсиду. 

(3) Наявність специфічних ферментів, особливо РНК- і ДНК-полімераз, нейрамінідази

(4) Чутливість до фізичних і хімічних агентів, особливо ефіру

(5) Імунологічні властивості

(6) Природні механізми передачі

(7) Тропізм до господаря, його тканин і клітин

(8) Патологія, формквання включень

(9) Симптоматологія захворювань.

 

 За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді­ляють на ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20 родин містять віруси, патогенні для людини (табл.).

 

 

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10^-15 мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи). Віруси характеризуються надзвичайним розмаїттям форм геному. Він може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійним, циркулярним або фрагментованим.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих клітин, і забезпечують проникнення вірусу в клітину, мають РНК- і ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного геному, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – комплекс вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких віруси набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія вірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються, такий тип взаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси (СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які вимагають своєрідних прийомів для роботи з ними, не подібних до мікробіологічних. Вірусологічні дослідження проводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

 

За своїм ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири групи.

 І група:  збудники гарячки Ебола, Ласа, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, а також вірус гепатиту В (мавп).

 ІІ група –  арбовіруси, деякі аренавіруси, віруси сказу, віруси гепатиту А і В людини, ВІЛ.

 ІІІ група –  віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини.

ІV група –  аденовіруси, коронавіруси, герпесвіруси, реовіруси, онковіруси.

 

Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища

. Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.) чутливі до кислих значень рН.

         Головна властивість вірусу – представити   свій геном в клітині-господарі, для того, щоб відбулась його експресія (трансляція і транскрипція)

Репродукція вірусів.

Особливості її полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини.

Вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції.

Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та часі:

нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки – в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани.

Репродукція вірусів – унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.

 

У репродукції вірусів виділяють ряд стадій.

До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину кілтини та їх роздягання (депротеїнізація).

Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним.

Неспецифічний визначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди.

Специфічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.

Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механізмом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які містять особливий блок з високою молекулярною масою – клатрин.

Мембрани інвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину – індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F- від fusion – злиття).

Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання віріонів – багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболони, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка – лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка.

Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий.

Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій – інформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. В однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми ДНК.

Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На материнській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.

Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації ретровірусів (онкорнавірусів).

Їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна.

Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна.

У такому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією називають процес утворення інформаційних (матричних) РНК.

 

Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або РНК-залежні РНК-полімерази.

 

У ДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів – власні вірусспецифічні транскриптази.

На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках амінокислоти.

Складання віріонів – не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулуму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на цитоплазматичній мембрані.

Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом «вибуху», розриваючи її мембрану.

Складні віруси – брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

 

Феномен брунькування

 

Репродукція вірусів

Визначення розмірів вірусів

 

A.  Фільтрування

B.    Седиментація в ультрацентрифузі

C.  Спостереження в електронному мікроскопі

 Порівняльні розміри:

(1) Staphylococcus має діаметр 1000 nm.

(2) Бактеріофаги –10-100 nm.

(3) Діаметр молекули сироваткового альбуміну 5 nmб глобуліну – 7 nm, гемоцианін (23 nm.

 

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх компонентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практично підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

 

 

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

Бляшки на хоріоналантоїсній оболонці

 

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис­товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт­ко­вий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до температури 4 °С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в стерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним шприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа­тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан­тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні ви­значають за титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно- і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Зараження мишенят-сисунців у мозок при діагностиці Коксаки- інфекції

Для виділення вірусів простого герпесу, натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин (кроликів) на скарифіковану рогівку ока. При дослідженні вірусів гепатиту А вводять досліджуваний матеріал через рот. При виділенні вірусів з нейротропними властивостями, таких як арбовіруси, віруси сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей (1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього матеріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріалу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок травматичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Феномен бляшкоутворення

 

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліо­вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матері­алу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріп­лених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp‑2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їх рідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури органів. Вони представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові культури. З цією метою культури клітини вирощують у флаконах, пробірках, матрацах, які розташовуються горизонтально, щоб клітини могли прикріпитись до скла. Перед зараженням їх проглядають під мікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований моношар клітин. Для зараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють живильне середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у кожну пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а потім інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1-2 год для адсорбції вірусів на поверхні клітин. Після цього видаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для видалення неприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середовище (середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у термостаті при 37 °С протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи результати.

Внаслідок розмноження вірусів у культурі клітин у них виникають дегенеративні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). Ступінь їх вираження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особливостями клітин тощо. В одних випадках ці зміни виникають через декілька днів після зараження (віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька тижнів і навіть місяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження найчас­тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД₅₀ (ЦПД₅₀ – така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок, що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагностику захворювання.

При повній дегенерації клітинного моношару спостерігаються зміни в переважній більшості клітин. Вони гинуть, відокремлюються від скла. Окремі клітини, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми. Такий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам поліомієліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне відокремлення всіх клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, респіраторно-синци­тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому виникають багатоядерні гігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви­кликають утворення скупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круглоклітинна дегенерація). При репродукції риновірусів утворюються округлі клітини, які мають відростки, а при розмноженні герпесвірусів спостерігається формування подібних клітин однакового розміру, які розкидано по всьому моношарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний тип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної гарячки) не здатні викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для їх виявлення використовують феномен інтерференції, при якому клітинні культури паралельно заражають іншими вірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за чотири-плюсовою системою: (4+) – означає, що відбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх, (2+) – у 50 %, (+) – до 25 % клітин, (+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклітинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в цитоплазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеїнових кислот є важливим моментом при проведенні вірусологічної діагностики захворювань. Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), натуральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденовіруси, віруси грипу та інші.

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Цитопатична дія  вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Методи ідентифікації вірусів

 

 

 

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

 

 

 

Реакція гемадсорбції

 

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

 

Облік реакції  гальмування гемаглютинації

 

Для постановки реакції з метою визначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) роблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від властивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до комплексу додають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі систе­ми – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст­кого матеріалу, який містить 100 ТЦД₅₀, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція нейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють зменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках або матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які попередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з усіма необхідними компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. Заражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є використання бентонітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при вивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю вірусів та імунної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким живильним середовищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів серед клітин. Вже через 2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення числа та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають нейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або лабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та специфічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед постановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, що її можна ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – антитіло – комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

 

Облік РЗК

 

У реакціях імунодифузії використовують принцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому середовищі, наприклад, агаровому гелі. У зоні оптимальних співвідношень антигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від кількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія відповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке покривають 1 % агарозою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну лунку вносять специфічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного імуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу гепатиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які роз­ташовані ближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. Після цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Вірус­ні антигени з негативним зарядом рухаються в напрямку до аноду, а антитіла сироватки – до катоду. Через 24 год в агаровому гелі спостерігають появу ліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити комплекси, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із специфічними антитілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш ефективним, ніж використання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації методу матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з антитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього додають 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють відповідне значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають під електронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у вірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. Існують численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після попереднього зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який дає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який зумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). Метод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для ідентифікації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них специфічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуоресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

РІФ

При реакції радіального гемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У присутності комплементу спостерігається лізис еритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони гемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсутності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як негативну. Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

 

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується у вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними противірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції є еритроцити, оброблені таніновою кислотою з адсорбованими на них молекулами противірусних антитіл (сенсибілізовані еритроцити), вірусні антигени і розчин електроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) розводять дво­кратно електролітом, після чого додають такий самий об’єм еритроцитарного анти­тільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом 30 хв при температурі 37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – “перевернута парасоль­ка”. При негативному результаті – щільний, компактний осад з рівними краями.

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали за­стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Непрямий ІФА

 

Облік ІФА

 

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер­оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджува­ну сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають ­субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас­тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди­фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergo­sorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (­фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично ­переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. ­Фіксова­ні блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають ра­діо­активно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції антиген-антитіло.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні ­зонди, що застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, ­штучно­го синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на від­міну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділи­ти дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним ­аналогом трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який зна­ходиться в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагують з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, ­свідченням чого є зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфіч­ний субстрат. Зонди з біо­тином можна виявити, використовуючи мічені флуоро­хромом антитіла проти ­біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. ­Смуги промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулі­нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобулінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де наступила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовувати мічені ізотопом антитіла .

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, за­стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’язану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної реакції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослі­дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ на основі виявлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

Виділення та титрування бактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бакте­рій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальніше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом дослідив канадський мікробіолог Ф. ­д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріофагом. На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бактеріофаги виявились основною моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного коду, впливу радіації на спадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда. Вони складаються з гексагональної головки, в якій ­міститься ДНК, хвостового відростка (стержня, оточеного білковим чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами. Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утво­рена капсомерами, які оточують одну щільно скручену мо­лекулу ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм служить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість ­морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з аналогом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка, що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується.

 

Будова бактеріофагу

Хімічний склад фагів, як інших вірусів, представлений нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю ліпідів у оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК. За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних структур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість “внутрішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину.

Бактеріофаги на поверхні клітини

 

Адсорбція і проникнення фага в клітину

 

Реплікація фагів та їх  збирання

 

Вихід бактеріофагів

 

У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфек­ційні хвороби”, і викликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характеризується строгою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофітних мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на “свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близьких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокре­ма, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, додати декілька крапель відповідного бактеріофага, то через певний час ­відбувається просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорга­нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круглу форму і виникають внаслідок літичної дії бактеріофагів. Їх називають негативними колоніями або бляшками бактеріофагів.

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бактеріальною клітиною, вони поді­ляються на вірулентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всередину клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних практично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактеріофаги, частина клітин залишається неушкодженою ними, тому що спостерігається явище лізогенії – інтеграції генома бактеріофага в геном клітини.

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікроорганізми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких факторів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має велике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бактерій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість перетворення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізогенізації їх помірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафі­лококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріофагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі­онів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони зустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Для цього досліджуваний матеріал центрифугують, для осадження твердих частинок, а надосадову рідину в об’ємі 1 мл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який попередньо засіяний 1 мл 6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інкубації при температурі 37 °С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, розводять у 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 разів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та інкубують протягом доби при оптимальній температурі. Як контроль використовують культуру бактерій без бактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріофаг, середовище залишається прозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той час як у контрольній пробірці відбувається ріст бактерій (середовище стає мутним).

Для визначення наявності інфекційних бактеріофагів використовують метод Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в тому, що попередньо матеріал, який містить бактеріофаг, розводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^‑4. Після цього по 1 мл кожного розведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 % м’ясо-пептонного агару, додають 0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно перемішують і виливають у чашки Петрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 % м’ясо-пептонного агару. Чашки залишають на 30 хв при кімнатній температурі для застигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих стерильних плям – “негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом Граціа, після добової інкубації підраховують число “негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає кількості фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число фагових корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній множать на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10^-4 з’явилось 50 колоній, отже, титр фагів дорівнює: 50х10^-4 або 5х10^-5 в 1 мл.

Титрування фагів

 

Утворення бляшок

 

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд пробірок із м’ясо-пептонним бульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг

Титрування бактеріофагів за методом Аппельмана

Після цього в них додають по 0,05 мл індикаторних мікроорганізмів. Паралельно готують контрольні пробірки: одну – з культурою бактерій без фага, а другу – з бактеріофагом без мікробів. Посіви інкубують при 37 °С протягом 18-24 год і спостерігають за лізисом мікроорганізмів. Титром бактеріофага вважають найбільше його розведення, яке викликає повний лізис бактерій.

Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, їх можна використовувати для фагоіндикації – визначення виду відповідних бактерій в інфекційному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища.

Для цього у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.

З цією ж метою на щільне живильне середовище газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення бактеріофага, яке вказано на ампулі. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофага. Позитивний результат вказує на належність бактерій до певного виду.

Фаготипування бактерій проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. Цей метод грунтується на використанні специфічної чутливості бактерій до своїх бактеріофагів, яка свідчить про спільне (тотожнє) походження бактерій, що мають однаковий фаготип.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для цього чашку з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують 4 годинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню засіяного газону в кожний квадрат капають піпеткою певні бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють результати за допомогою лупи. Залежно від чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюють за чотири-плюсовою системою: від лізису, який зливається, до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фага є постійною ознакою, порівнюють фаготипи досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігові роблять висновок про виявлене джерело інфекції.

 

Родина герпесвірусів

   Родина Herpesviridae (herpes – повзучий) включає три підродини: альфагерпесвіруси, бетагерпесвіруси і гамагерпесвіруси. До альфагерпесвірусів відносять віруси простого герпесу і вітряної віспи – оперізуючого герпесу, до бетагерпесвірусів – вірус цитомегалії, до гамагерпесвірусів – вірус Епштейна-Барр і вірус герпесу людини 6. Окремим представникам цієї родини притаманні онкогенні властивості.
   Герпесвіруси мають досить великі розміри (150-210 нм), містять двониткову ДНК, яка оточена капсидом і суперкапсидною оболонкою. Капсид складається із 162 капсомерів і має форму ікосаедра.
   Вірус простого герпесу має типову для герпесвірусів будову. Розрізняють два типи вірусів – 1 і 2. Обидва типи культивують у курячих ембріонах, культурах легеневих і ниркових клітин людини. При цьому утворюються багатоядерні клітини і симпласти   Резистентність вірусів простого герпесу невисока. Вони гинуть при нагріванні до 50 °С через 30 хв, при 4 °С зберігаються протягом місяця, чутливі до дії фенолу, формаліну, спирту, хлороформу, перманганату калію.
   Джерело вірусу – хворі люди й вірусоносії. Вхідними воротами є шкіра й слизові оболонки. Механізм зараження – повітряно-краплинний і побутово-контактний. Можливе зараження статевим шляхом. Потрапивши в організм, вірус розмножується в місці проникнення, потім розповсюджується з током крові або по ходу нервів. В організмі він зберігається все життя, особливо в гангліях трійчастого нерва. Ураження шкіри і слизових оболонок характеризується появою пухирців, наповнених рідиною.
   Вірус герпесу-1 викликає гострий герпес на губах і крилах носа, гінгівостоматит, кератокон’юнктивіт( , менінгоенцефаліт. Вірус герпесу-2 спричиняє герпес геніталій, уражає новонароджених, вважається, що має відношення до виникнення раку шийки матки та ін. Перенесені захворювання не залишають стійкого імунітету.
   При лабораторній діагностиці проводять вірусологічне й серологічне дослідження. Виділяють вірус шляхом зараження курячих ембріонів або клітинних культур. Серологічна діагностика зводиться до постановки РЗК, РІФ, ІФА. Для експрес-діагностики готують мазки-відбитки з герпетичних пухирців, забарвлюють за Романовським-Гімзою і виявляють гігантські клітини з включеннями.
   Для попередження рецидивів герпетичної інфекції використовують багаторазове введення інактивованих вакцин, специфічний імуноглобулін, для лікування – флореналь, ацикловір, лаферон.
   Віруси вітряної віспи – оперізуючого герпесу. Це один і той же вірус, який при первинному інфікуванні у дітей викликає вітрянку, а при активації персистуючого вірусу – оперізуючий герпес. Віріон має типову структуру, розмножується в культурах клітин ембріональних тканин людей і мавп, не репродукується в курячих ембріонах. У зовнішньому середовищі швидко гине.
   Єдиним джерелом інфекції є хвора людина. Вітряною віспою найчастіше хворіють діти 1-3 років. Передача хвороби відбувається повітряно-краплинним шляхом. Захворювання характеризується появою на шкірі висипу – пухирців-везикул. Оперізуючий герпес виникає переважно у дорослих. Вважають, що при первинному зараженні виникає вітряна віспа, а оперізуючий герпес є результатом активації вірусу, що залишався в організмі дитини. Після перенесення вітряної віспи розвивається імунітет на все життя.
   Лабораторні дослідження проводять рідко. У разі потреби роблять вірусоскопію пухирцевої рідини й виявляють внутрішньоядерні включення у мазках-відбитках.
   Введення специфічного імуноглобуліну є ефективним методом профілактики вітряної віспи. Запропонована жива вакцина для імунізації дітей у ранньому віці.
   Вірус цитомегалії в організмі викликає появу гігантських клітин із внутрішньоядерними включеннями, звідки й походить його назва.
   Морфологічно він подібний до вірусів герпесу. Джерелом цитомегаловірусної інфекції є хвора людина. Вірус може місяцями й роками виділятись із сечею та слиною, що має велике епідеміологічне значення. Зараження відбувається повітряно-краплинним і контактним шляхами, а також через плаценту. В зв’язку з цим, хвороба дуже небезпечна при вагітності. Вона характеризується ураженням слинних залоз. Ця форма має легкий перебіг. Виникають і генералізовані форми з жовтяницею, ураженням печінки й селезінки, що може призвести до смерті. Вірус тривалий час персистує у слинних залозах. Найчастіше активація персистуючої інфекції відбувається у пацієнтів онкологічних клінік, відділів трансплантації, де використовуються широко імунодепресанти, у хворих на СНІД тощо. Специфічна терапія і профілактика не розроблені.
   Вірус Епштейна-Барр (ВЕБ). Вперше його було виявлено під час дослідження клітин злоякісної лімфоми Беркіта. За морфологічними й біологічними властивостями він подібний до попередньо описаних герпесвірусів людини. ВЕБ уражає В-лімфоцити, інші клітини лімфоїдної тканини організму, довго зберігається у клітинах господаря. Його особливістю є те, що він здатний не руйнувати, а стимулювати розмноження інфікованих В-лімфоцитів. Останні після повторного зараження тим же вірусом набувають здатності до безкінечного росту. ВЕБ може уражати епітеліальні клітини слизової оболонки верхніх дихальних шляхів і травного тракту, а також клітини лімфоїдної системи, спричиняючи продуктивну інфекцію. В цьому випадку розвивається інфекційний мононуклеоз, в інших, коли уражаються Т-лімфоцити, вони трансформуються, стають злоякісними, внаслідок чого розвивається злоякісна лімфома Беркіта або назофарингіальна карцинома, тобто вірус здатний викликати різні захворювання. В осіб з порушенням імунної системи ВЕБ спричиняє лейкоплакію оболонок язика, порожнини рота, піхви та шийки матки.
   Вірус герпесу людини 6 не відрізняється за своїми морфологічними властивостями від попередніх герпесвірусів. Разом з тим, він відзначається особливим тропізмом. Уражає моноцити і Т-лімфоцити. Вважають, що вірус герпесу людини 6 призводить до лімфопроліферативного захворювання з моноклональною проліферацією В-лімфоцитів, синдрому хронічної втоми дітей віком до 3-ох років. Є дані про те, що він відіграє певну роль при злоякісній В-клітинній лімфомі, саркоїдозі, аутоімунному тиреоїдиті тощо.
   Методи лабораторної діагностики ще остаточно не розроблені.

 

 

 

 

Багатоядерні гігантські клітини з з внутріядерними включенями вірусів простого герпесу

Віруси простого герпесу і синдроми

 

 

 

Вірус простого герпесу 2

 

Терапія

 

Ацикловір (Зовіракс) – пригнічує вірусну ДНК залежну ДНК полімеразу.

 

Valacyclovir (Valtrex)   Famcyclovir (Famvir)

(використовують при генітальному герпесі)

 

VARICELLA–ZOSTER VIRUS     ВГЛ 3

Вірус вітряної віспи й оперізуючого герпесу

Вітряна віспа й оперізуючий герпес спричиняються вірусом, що належить до роду Herpesvirus.

Морфологія. Вірус має типову структуру герпесвірусів. Віріон його ікосаедральної форми, капсид містить 162 капсомери. Діаметр віріона  150—200 нм.

Культивування. Вірус не розмножується в курячих ембріонах, але може репродукуватися в культурах ембріональної тканини лю­дини і мавп. Репродукція вірусу відбувається в ядрі. Сусідні клітини інфікуються контактним шляхом, тому цитопатична дія має вогнище­вий характер і розвивається повільно.

Антигенна структура. Збудники оперізуючого герпесу і вітряної віспи — це два варіанти одного й того самого вірусу.

Резистентність. Вірус протягом місяця зберігає життєздатність у гліцерині; у зовнішньому середовищі нестійкий і швидко гине.

Патогенність для тварин. У природних умовах сприйнятливі тіль­ки люди. Тварини не хворіють.

Патогенез захворювання в людини. Вітряна віспа найчастіше вини­кає у дітей віком до 10 років. Джерелом інфекції є хворий на вітряну віспу. Збудник передається повітряно-краплинним шляхом і локалі­зується первинно в клітинах верхніх дихальних шляхів, потім він потрапляє в кров і розноситься по всьому організму, що призводить до   виникнення   захворювання.

При вітряній віспі уражуються шкіра, слизові оболонки, парен­хіматозні органи, головний мозок. Епітеліальні клітини зазнають дистрофії і гинуть. В уражених клітинах можна виявити внутрішньо­ядерні еозинофільні включення. Некроз епітеліальних клітин і на­копичення міжтканинної рідини зумовлюють утворення пухирців — везикул. При вітряній віспі висип на шкірі поліморфний, везикули однокамерні на відміну від таких при натуральній віспі.

Після інкубаційного періоду тривалістю 2—3 тижні у хворих підвищується температура тіла, з’являються озноб, загальна слаб­кість, втрата апетиту, іноді блювання і понос. За 1—2 доби до виник­нення справжнього висипу досить часто з’являється скарлатинопо-дібний або кореподібний висип, який зникає через кілька годин або 1—2 доби. Для вітряної віспи характерне утворення на слизовій обо­лонці порожнини рота і зіва везикул, а потім виразок. Поява справж­нього висипу супроводиться підвищенням температури тіла,свербежем і відбувається в кілька етапів; розвиток елементів висипу нерівномір­ний. На 5-ту добу захворювання висипи припиняються. У дорослих вітряна віспа має більш тяжкий перебіг.

Ураження вітряною віспою жінок у перші 3 місяці вагітності може призвести до розвитку у плода різних аномалій. Захворювання на вітряну віспу в наступні місяці вагітності не призводить до тера­тогенного ефекту, але дитина може народитися з висипом на тілі або можливе його виникнення в перші дні після народження.

Оперізуючий герпес (оперізуючий лишай) в основному буває у дорослих. Вважають, що причиною його виникнення є акти­вація збудника, який перебуває в організмі в латентному стані, під дією різних стресових факторів. Активований вірус по нервових стов­бурах досягає шкіри, в клітинах якої він репродукується, спричиня­ючи розвиток везикул, таких самих, як і при вітряній віспі, але лока­лізованих на обмеженій поверхні, найчастіше за ходом міжреберних нервів. Захворювання супроводиться палінням, свербежем і неврал­гією, іноді підвищенням температури тіла. Везикули наповнені про­зорою рідиною, висипи поліморфні. У ряді випадків висип зливає­ться і нагадує суцільну стрічку.

Після перенесеного захворювання виникають тривалі невралгії, параліч лицьового нерва та ін. Оперізуючий герпес може давати дисе­мінацію з ураженням внутрішніх органів, наприклад легені, призво-дячи до розвитку тяжкої пневмонії. Він може бути причиною вітря­ної віспи у дитини.

Імунітет. Після перенесеної вітряної віспи несприйнятливість розвивається досить швидко і зберігається протягом усього життя. Повторні випадки захворювання бувають дуже рідко. У крові рекон-валесцентів виявляють комплементзв’язуючі антитіла й аглютиніни проти вірусу вітряної віспи, оперізуючого герпесу.

Лабораторна діагностика. Розпізнавання вітряної віспи та опері­зуючого герпесу звичайно грунтується на клінічних проявах та епіде­міологічних даних. Лабораторні методи дослідження охоплюють ві­русоскопію вмісту везикул і виявлення внутрішньоядерних включень при дослідженні мазків-відбитків. Специфічний антиген виявляють за допомогою РІФ, РЗК та ІФА.

Для виділення вірусу використовують тканинні культури ембріона людини (найчутливіша культура клітин щитовидної залози), які заражують рідиною з везикул і змивами з носової частини глотки хворих. Можна   використовувати  клітини  нирок  мавп,   кролів  та

інших тварин. Характерний повільний розвиток цитопатичного ефекту. У ядрах клітин виявляються включення. Ідентифікацію виділеного вірусу роблять за допомогою РЗК, РІФ, РН,  ІФА.

Серологічну діагностику здійснюють за допомогою РН у культурі клітин,   ІФА,  РЗК.

Лікування і профілактика. Ділянки шкіри, покриті висипом, зма­щують 1 % спиртовим розчином брильянтового зеленого або 10 % розчином калію перманганату. Добрих результатів досягнуто при лі­куванні хворих на вітряну віспу й особливо на специфічну пневмонію аденінарабінозидом. Хворих не госпіталізують, їх залишають удома до  відпадіння   кірок.

Дітям, що були в контакті з хворим на вітряну віспу, вводять іму-ноглобулін або сироватку крові дорослих, їх не допускають протягом З тижнів у дитячі заклади. Імуноглобулін, добутий від перехворілих на вітряну віспу, полегшує перебіг оперізуючого герпесу, але не за­побігає зараженню. Разом з тим імуноглобулін, добутий від людей, які перехворіли на оперізуючий герпес, може захистити дітей від за­раження вітряною віспою. Випробовується жива вакцина з ослабле­ного штаму вірусу вітряної віспи.

Лікують хворих при оперізуючому герпесі інтерфероном, а для усунення болю призначають знеболюючі лікарські засоби, новокаїно­ву блокаду, в окремих випадках преднізолон.

Щоб запобігти розвитку вторинної інфекції, застосовують напів­синтетичні препарати тетрацикліну, пеніцилін.

 

 

Патогенез вітрянки

Вітряна віспа

Розвиток герпес-зостер

 

 

Вірус цитомегалії

Вірус цитомегалії (Cytomegalovirus) належить до роду Herpesvirus. У людини, мавп, морських свинок і мишей він спричиняє ураження слинних залоз.

Морфологія і культивування. У слині, осаді сечі, спинномозковій рідині і в різних органах хворих людей можна виявити клітини, в ядрах яких є крупні включення (8—10 мкм). Морфологічно вірус цитомегалії схожий на вірус герпесу. Є кілька серотипів. Репроду­кується вірус у клітинних культурах, особливо чутливі фібробласти ембріона людини, диплоїдні клітини легень. Цитопатична дія виявля­ється через 5—20 діб після зараження у вигляді виникнення гігант­ських клітин, що мають внутрішньоядерні включення.

Патогенез захворювання в людини. Зараження настає через слину. Захворювання проявляється ураженням слинних залоз, має легкий перебіг і закінчується видужанням або ж набуває генералізованого характеру, проявляється жовтяницею, еритробластозом, збільшен­ням печінки і селезінки і призводить до летального кінця.

Вертикальна передача вірусу від матері плоду, особливо в першо­му триместрі вагітності, призводить до передчасного переривання ва­гітності, мертвонародження, природжених аномалій у плода у ви­гляді ураження головного і спинного мозку, внутрішніх органів, а також до розвитку інтерстиціальної пневмонії.

 

Цитомегаловірус

 

Ангіна у пацієнта з інфекційним мононуклеозом

Вірус герпесу людини 6 уражає CD 4 клітини і
викликає:
  1. Екзантему субітум або  Розеолу інфантум у дітей віком від 6 місяців до 3 років
2.Мононуклеоз з цервікальною    лімфаденопатією.
 Вірус герпесу людини 7 також може бути причиною Розеоли інфантум.
Вірус герпесу людини 8 є причиною саркоми Капоші, пухлини яка розвивається у більшості хворих СНІДом.

 

Родина аденовірусів (Adenoviridae)

   Родина аденовірусів поділяється на два роди: Mastadenovirus (понад 90 серологічних типів) і Aviadenovirus (14 серологічних типів). Рід Mastadenovirus включає в себе віруси людини, мавп, коней, свиней тощо.
   Аденовіруси не мають ліпопротеїнової оболонки. За своєю формою нагадують ікосаедр діаметром 65-80 нм кубічного типу симетрії. Мають 12 вершин, від яких відходить по одному відростку з булавоподібними потовщеннями на вільному кінці. Капсид складається з 252 субодиниць (капсомерів).

   Аденовіруси відносно стійкі до дії фізико-хімічних факторів, не інактивуються ефіром, хлороформом. При прогріванні (56 °С) активність вірусів різко знижується за декілька хвилин.
   Особливістю аденовірусів є те, що вони культивуються тільки в тканинах господаря: аденовіруси людини – в різноманітних первинних і перещеплюваних культурах людських клітин, аденовіруси мавп репродукуються в клітинах мавп і т.д.
   Найчастіше для виділення аденовірусів людини використовують перещеплювані культури клітин HeLa, KB, Hep-2, первинну культуру тканин нирок ембріона людини. Репродукція вірусів супроводжується розвитком внутрішньоядерних включень.

   Біологічною особливістю аденовірусів людини є їх апатогенність для лабораторних тварин.
   Аденовіруси людини – перші патогенні віруси людини, для яких була доведена здатність трансформувати клітини ссавців та індукувати утворення пухлин у сирійських ховрахів.
   Аденовіруси здатні викликати гемаглютинацію еритроцитів. За здатністю аглютинувати еритроцити білих щурів і мавп побудована класифікація аденовірусів людини.
   Аденовірусна інфекція – широко поширене респіраторне захворювання людини. Основний механізм зараження – повітряно-краплинний.
   При виділенні вірусів із фекаліями можливий і фекально-оральний механізм зараження. Аденовірусні інфекції частіше виникають серед дітей у віці від 6 міс. до 2 років, особливо в холодні пори року. В організмі людини аденовіруси розмножуються в епітеліальних клітинах дихальних шляхів, кишечника, кон’юнктиві очей, мигдаликах і лімфатичних вузлах. Аденовіруси викликають гострі респіраторні захворювання (фарингіти, ларингіти, трахеобронхіти), кон’юнктивіти, пневмонії, геморагічні цистити. Окремі серотипи мають онкогенні властивості й зумовлюють появу пухлин у деяких гризунів. Вони можуть також проникати через плаценту, викликаючи каліцтво і смертельні пневмонії новонароджених. У дорослих аденовірусні інфекції виникають рідше і мають більш легкий перебіг. Імунітет після хвороби слабкий, типоспецифічний, недовготривалий. Певну роль у захисті від аденовірусів мають SIgA, які розташовані на слизовій оболонці дихальних шляхів і в носовому секреті.
    Для профілактики та раннього лікування аденовірусних інфекцій застосовують лейкоцитарний інтерферон, а також фермент дезоксирибонуклеазу. Для імунізації військовослужбовців запропонована жива аденовірусна вакцина.

 

Збудники вірусних гепатитів

Віруси імунодефіциту людини

 

 

Вчення про вірусні гепатити  займає особливе місце в інфекційній патології людини в зв’язку з надзвичайною актуальністю цієї проблеми.

Понад століття пройшло з того часу, як С.П. Боткін (1888) сформулював концепцію інфекційної природи захворювання, яке пізніше було названо його ім’ям  (1898). Пройшли десятки років поки з’ясувалась етіологічна неоднорідність  хвороби, з’явились клініко-епідеміологічні докази наявності під єдиною назвою різних нозологічних форм, на сьогодні розшифрованих вірусологами,  які позначаються як гепатити А, В, С, D, E (ГА, ГВ, ГС, ГD, ГЕ). Проте, як стверджується деякими дослідниками, мова може йти про існування семи нозологічних форм гепатитів: A, B, C, D, E, F, G.

Про існування жовтяниць було відомо з давен. Перші відомості про них є в працях  Гіпократа (V ст. до нашої  ери). Ще тоді знали про їх заразність, рекомендували ізолювати хворих (папа Захарій, 75 р. н. е.).  Ібн-Сіна розробив класифікацію  жовтяниць, намагався пояснити їх патогенез.

В.М. Жданов узагальнив відомості про 531 епідемію вірусного гепатиту.

Віруси гепатиту А (ВГА, HAV – англ. hepatitis A virus) було відкрито досить пізно. Досліди на волонтерах, проведені в 40-х роках, дозволили виявити клінічні, епідеміологічні та етіологічні відмінності вірусних гепатитів. Перші успіхи етіологічних досліджень гепатиту належать до 60-70-х років (S. Feinstone та ін., 1973), коли було вияснено, що до цього збудника чутливі мавпи мармозети і шимпанзе, а у фекаліях хворих знайдено віріони діаметром 27 нм. На підставі своїх властивостей вони були віднесені до ентеровірусів і дістали назву “Ентеровірус типу 72”.  Пізніше було доказано існування двох серотипів цього вірусу.

Сироватковий (парентеральний гепатит),  або гепатит В, було виділено в самостійну нозологічну одиницю порівняно недавно, хоча відомості про нього були ще в минулому столітті.  A. Lürman (1895) описав масову появу жовтяниці  у робітників після щеплення  віспи людською лімфою в гліцерині (гуманізованою вакциною). З 1289 чоловік через 3-4 місяці захворіло 191. В американській армії в 1942 р.  вакциною проти жовтої гарячки було щеплено  2,5 млн. чоловік, а захворіло на жовтяницю 51337 чоловік. Особливістю цієї епідемії  була відсутність вторинних захворювань серед осіб, які мали контакт із хворими.

В середині 60-х років B. Blamberg (1965, 1969) опублікував дані  про новий антиген, знайдений в сироватці хворих на лейкоз, і який часто виявлявся у австралійських аборигенів, у зв’зку з чим його тривалий час позначали як “австралійський антиген”. Пізніше було вияснено, що він є маркером сироваткового гепатиту. У 1970 р. D. Dane описав  вірусоподібні частки, які пізніше були ідентифіковані як віріони гепатиту В (ВГВ, HBV – англ. hepatitis В virus).     

Таким чином, обидві нозологічні одиниці знайшли своїх збудників, і стало можливим розробити надійні методи їх діагностики  з майбутнім виходом на специфічну профілактику.

 

ВІРУС ГЕПАТИТУ А

Морфологія та ультраструктура віріонів. У 1973 р. S. Feinstone, A.Kapikian, R. Purcell, використовуючи метод імунної електронної мікроскопії, вперше виявили у фекаліях експериментально заражених ГА волонтерів вірусоподібні ікосаедричні частки діаметром 27-30 нм, які були ідентифіковані як  віруси гепатиту А. Вірус належить до родини Picornaviridae, роду Enterovirus (тип 72).

У центрі віріону  міститься  однониткова лінійна плюс-нитка РНК, що має понад 7000 нуклеотидів молекулярною масою (1,3-1,6)х10⁶ Д, константою седиментації 32- 35S і плавучою густиною 1,64 гсм³. Поверхня капсиду створюється 32 окремими капсомерами, поверхневих виступів немає. Тип симетрії – ікосаедральний.

 

Віруси гепатиту А

 

Будова вірусу гепатиту А

 

 

Ліпопротеїнової оболонки віруси не мають. При негативному контрастуванні в препаратах виявляються як повні, так і порожні частки. Висловлено припущення, що геном ВГА – найдрібніший з усіх геномів вірусів савців.  Він складається з 6500-8100 нуклеотидів, що утворюють три  ділянки, які умовно позначаються PI, P2, P3. В ділянці Р1 (5’-кінець) розміщуються гени чотирьох структурних білків (VР1, VР2, VР3, VP4), послідовність яких варіює у різних вірусів. Середня ділянка кодує недостатньо вивчений поліпептид Р2х, який має  протеолітичну активність і є, напевно, однією з двох вірусспецифічних протеаз. Ділянка, що прилягає до 3’­кінця (Р3), містить гени для VРg, полімерази і протеази. Частини РНК, що прилягають до 3’– і 5’-кінців мають невеликі ділянки з декількох нуклеотидів, які нічого не  кодують.

Функції VPg відповідають кеп-структурі клітинних і-РНК. За його допомогою  віріонна РНК розпізнає відповідну  ділянку малої субодиниці рибосоми, взаємодіє з нею, забезпечуючи початок синтезу поліпептидного ланцюга з NH₂-кінцем. При цьому відбувається така модифікація рибосоми, що вона перестає реагувати на звичайні кеп-структури, віддаючи перевагу  структурам, що містять  VPg на початку ланцюга РНК. Тобто віріонна РНК ентеровірусу блокує синтез клітинних білків.

Деякі інші біологічні властивості  збудніків наведено у табліці.

        

       ДЕЯКІ БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ВІРУСІВ ГЕПАТИТІВ

 

 

^а  Тільки деякі штами; виділити вірус у культурі клітин важко.

^б  Є повідомлення про обмежену реплікацію у гепатоцитах шимпанзе.

^в  ВГА і, можливо, ВГЕ перед інфікуванням печінки реплікуються в кишечнику.

^г  ВГВ персистує та реплікується в лейкоцитах.

^д   Хоча перенесений ГС вважається фактором ризику первинного раку печінки: доказів прямої канцерогенності ВГС не має

 

Стійкість до дії фізико-хімічних факторів. Подібно до інших  ентеровірусів ВГА виявився стійким в діапазоні рН 3,0-9,0, не інактивується ефіром і хлороформом, проте чутливий до формаліну.  Він може зберігатись до двох років при -20 °С,  протягом декількох місяців при 4 °С і тижнями при кімнатній температурі.  Ультрафіолетове випромінювання знищує його за 1 хв. Вірус частково втрачає свою інфекційність на культурі тканин при    60 °С протягом 4-12 год або протягом 6 год при 56 °С, інактивується кип’ятінням за 1 хв, при автоклавуванні (121 °С) – за 20 хв, при дії сухого жару (180 °С) – за одну годину. Дока–

зана висока стійкість вірусів до дії хлору, так як вони витримують хлорування протягом    30 хв при концентрації залишкового хлору 1:1 000 000. Це свідчить  про факт можливості появи захворювань навіть при проходженні вірусів через водоочисні споруди.

Культивування і особливості  репродукції вірусів. Доказано, що ВГА може репродукуватись в деяких клітинних системах, включаючи  первинні та перещеплювані моношарові лінії клітини: ембріональні ниркові клітини мавп, HeLa, трансформовані клітини печінки ембріона мавп (Mel), лімфоїдні клітини людини, клітини    гепатоцелюлярної карциноми людини,  VERO, Detroit-6, KB. Слід  пам’ятати про тривалий інкубаційний період при перших пасажах, який коливається від 4 до 8-10 тижнів. Вірус можна згодом виявити за допомогою методу імунофлуоресценції, РІА,  ІФА або на ультратонких зрізах при електронній мікроскопії. Можливість культивування ВГА дозволила отримати  дані, які характеризують цикл репродукції вірусів, виявити  11 вірусспецифічних антигенів.

Слід відмітити, що успішна адаптація ВГА до культури клітин вкрай важлива для вивчення біологічних властивостей і особливостей реплікації  вірусів (стратегії геному), створення джерела реагентів для діагностики (антигенів, антисироватки), а також для конструювання вакцин (живих або вбитих).

Епідеміологія захворювання. Вірусний гепатит А – антропонозна хвороба. Природним джерелом збудника є людина з різними формами гострого гепатиту, а число хворих з інапарантними та безжовтяничними формами може у 2-10 разів перевищувати кількість осіб з маніфестними проявами захворювання. Популяція людей надзвичайно гетерогенна відносно сприйнятливості  до ГА, що корелює з імунологічними показниками.

Виділення вірусів з організму відбувається, починаючи з другої половини інкубаційного періоду, особливо протягом першого тижня жовтяниці (за п’ять днів до підвищення рівня трансаміназ крові). Заразність знижується через 20-25 днів і тільки в окремих випадках може тривати місяцями.

Основний механізм зараження – фекально-оральний. Інфекційний агент передається через  випорожнення, сечу. Специфічними кінцевими факторами передачі збудника є харчові продукти (м’ясні, молочні, хлібні) та вода. Проміжними факторами можуть бути  мухи, забруднена фекаліями вода, що використовується для миття посуду,  руки людей, які готують їжу.

Кров у період вірусемії також може служити фактором передачі, в зв’язку з чим можливі парентеральні форми захворювання. Збудник може міститись у менструальній крові, спермі, що має певне епідемічне значення.

Гепатит А характеризується убіквітарним розповсюдженням. Захворюваність у багатьох країнах Європи і Америки сягає 200-400 і більше випадків на 100 000 населення, спостерігаються роки її підйому та спаду. Сезонність при ГА достатньо  виражена:  на серпень-грудень припадає до  70 % річної захворюваності.

Сприйнятливість до хвороби загальна. Найбільший спалах  гепатиту А (290 тис. хворих) трапився у 1988 р. в Шанхаї і був пов’язаний із вживанням сирих молюсків, яких часто культивують і збирають у забруднених прибережних водах.

На початку 1996 р. спалахнула епідемія вірусного гепатиту А у м. Севастополі внаслідок прориву стічних вод  у водопровідну мережу. При ГА спостерігаються вогнищеві  захворювання в психлікарнях, будинках для розумово відсталих осіб тощо, що зумовлюється недотриманням правил особистої гігієни.

Інкубаційний період коливається від 15 до 50 днів, найчастіше – 20-25 днів.

Основні клінічні прояви захворювання. Для ГА  властивий перебіг з великим розмаїттям клінічних форм: від безсимптомних до важких з летальними наслідкоми (гострий некроз печінки). Типові форми ГА мають циклічний перебіг. Період продроми (1) або переджовтяничний, епідеміологічно найнебезпечніший. Він характеризується диспептичними проявами (втратою апетиту, відчуттям дискомфорту в животі, болями в ділянці печінки),  помірною гарячкою, триває 1-4 тижні. Для нього характерні декілька варіантів перебігу: гарячково-диспептичний, астено-вегетативний, грипоподібний, ревматоїдний. Жовтяничний період (2) характеризується жовтяницею шкіри і слизових, збільшенням печінки, ахолічним калом, потемнінням сечі, підвищенням показників біохімічних та ензимологічних проб (загального білірубіну з перевагою прямого, рівня трансаміназ – аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ). Тривалість його – 2-4 тижні.  Під час періоду реконвалесценції (3) відновлюються основні функції печінки.

 

Симптоми гепатиту А

 

В більшості випадків ВГА закінчується повним одужанням.

Лікування, в основному, симптоматичне. Слід звертати особливу увагу на щадний режим, вітамінне забезпечення та дієту.

Лабораторна діагностика. Лабораторна діагностика грунтується або на виявленні самого збудника у фекаліях (імунна електронна мікроскопія – ІЕМ) чи його антигенів (РІА, ІФА, ІФ) або антитіл  (РІА, ІФА). В останньому випадку є можливість диференціального визначення різних класів імуноглобулінів – IgM, IgG.

Віремія за умов даної інфекції непостійна. Вірус присутній в крові в низьких концентраціях і недовгий час.  З печінки надходить у кишки, з випорожненнями виходить назовні. Хронічного носійства ВГА або його антигену не встановлено.

Вірус виділяють з калу починаючи з 2-го тижня інкубаційного періоду і протягом 2-3-ох тижнів після появи жовтяниці. З моменту її появи частота виявлення вірусів у фекаліях різко знижується: на 1-му  тижні хвороби їх можна знайти у 50 % обстежених хворих, на 2-му – у 1-15 %, на 3-му – менш, ніж у 10 %.

 

 

Маркери вірусного гепатиту А

 

Профілактика захворювання. Для попередження фекально-орального механізму передачі захворювання застосовують ті ж заходи, що  й при інших кишкових антропонозах. Для профілактики інокуляційних заражень у медичних амбулаторних і стаціонарних закладах індивідуально закріплюють шприци, голки, спеціально обробляють ріжучий і колючий інструментарій.

Сувора ізоляція хворих неефективна, так як пік виділення вірусів з фекаліями припадає на продромальний період. Для локалізації та ліквідації вогнищ ГА слід проводити раннє виявлення хворих з використанням всіх лабораторних тестів, госпіталізацію їх; диспансерне спостереження  протягом місяця після виписки. Особи, які контактували із хворими, підлягають спостереженню протягом 35 днів на предмет виявлення ранніх симптомів захворювання: у них двічі-тричі перевіряють активність ферментів в крові; контактним дітям і вагітним вводять 1,0-1,5 мл людського імуноглобуліну; у  вогнищі організують кінцеву дезинфекцію хлоровмісними препаратами.

Імуноглобулін насамперед попереджує розмноження вірусів, забезпечуючи пасивний захист у 80-90 % випадків при введенні протягом перших тижнів після зараження. Введення його після появи  клінічних симптомів неефективне. В той же час імуноглобулін здатний модифікувати інфекцію, призводячи до безсимптомних форм, а таким чином – до формування активного імунітету.

Необхідність створення вакцини проти ГА не викликає сумнівів, оскільки можна буде забезпечити практично пожиттєвий захист, відпаде необхідність повторного введення імуноглобуліну, який діє протягом 4-6 місяців. Мова може йти про три типи  вакцин: інактивовану, живу та виготовлену генно-інженерними методами.

Для специфічної активної профілактики використовують інактивовану формаліном, адсорбовану на гідроокису алюмінію вакцину, вирощену на людській диплоїдній культурі клітин 

 

 

ВІРУС ГЕПАТИТУ В

Віруси гепатиту В розповсюджені по всій земній кулі. Вони мають надзвичайно велике значення для медицини, так як є винуватцями  хронічних захворювань печінки, в тому числі гепатоцелюлярної  карциноми у людини.  Це зумовлюється дивовижною спорідненістю  вірусів до гепатоцитів і здатністю викликати  персистентну інфекцію при  високій концентрації вірусного антигену та інфекційного вірусу в крові.

Відкриттю ВГВ передувало виявлення B. Blumberg  в 1965 р. у крові австралійського аборигену так званого австралійського антигену. У 1968 р. A. Prince довів, що він є маркером сироваткового гепатиту. У 1970 р. D. Dane, C. Kameron, M. Briggs відкрили вірусоподібні  частки (частки Дейна), які були ідентифіковані як збудники гепатиту В у людини. Подальші дослідження виявили аналогічні віруси і у тварин. На пропозицію             W. Robinson (1980) віруси цієї групи дістали назву гепаднавіруси (англ. hepar – печінка,   dna – ДНК). Це поняття відбиває тропізм вірусів і тип їх нуклеїнової кислоти.

У 1986 р. I. Gast et al. запропонували виділити ці віруси у родину  Hepadnaviridae. До неї входять ВГВ людини, гепатиту лісових бабаків, земляних білок,  гримучих змій, кенгуру, лісових білок, пекінських качок, чапель та ін.

Морфолологія та ультраструктура вірусів. ВГВ – складноорганізовані віруси, сферичної форми діаметром до 42 нм. Зовні вони вкриті ліпідно-білковою суперкапсидною оболонкою.  Внутрішня частина вірусів (капсид) побудована за кубічним типом симетрії, складається з 180 капсомерів. Серцевина вірусу містить ДНК, ковалентно пов’язану з поліпептидом, ДНК-полімеразу, протеїнкіназу і, напевно, антиген, асоційований  з інфекційністю ВГВ (HBeAg).  Плавуча густина в градієнті хлориду цезію дефектних (порожніх)  віріонів – 1, 24 гсм³, повних (з електронно-щільним центром) – 1, 28 гсм³.

 

 

Віруси гепатиту В

 

 

Будова вірусів гепатиту В

 

Незважаючи на те, що ВГВ належить до відносно малих за розмірами, за своєю будовою він дуже складний. Геном його – незвичайна дволанцюгова ДНК, що має форму кільця, один з ланцюгів якої дефектний. Повний ланцюг у кільці представлено “мінус-ланцюгом” L (англ. long – довгий) з 3200 нуклеотидів, тоді як “плюс-ланцюг” S (англ.     short – короткий) становить лише 50-80 % “мінус-ланцюга”.  Кільцева структура  геному підтримується завдяки з’єднанню основи двох ланцюгів на одному з кінців. У серцевині віріону знаходиться ДНК-залежна ДНК-полімераза, яка добудовує дефектну ДНК до повністю дволанцюгової молекули в процесі репродукції вірусів і має властивості зворотної транскриптази.
Геном ВГВ – це “диво компактності”. Він складається з чотирьох генів, названих S, C, P, X, які у значному ступені перекриваються.  Встановлено, що до цих  кодуючих послідовностей належать й регуляторні послідовності, які керують синтезом  вірусних білків  і циклом реплікації. Геном ВГВ має чотири відкриті рамки зчитування.

Будова геному вірусу гепатиту В

 

Антигенна будова. ВГВ мають декілька антигенів. Поверхневий антиген (зовнішній білок) вірусів (HBsAg – англ. hepatitis B surface antigen) за морфологічними, фізико-хімічними та імунологічними властивостями неоднорідний. Завдяки електронно-мікроскопічному дослідженню сироватки крові, де він може міститись у концентрації до 10¹³  часток в 1 мл, виявлено три типи структур HBsAg: сферичні (діаметром 22 нм), тубулярні (діаметром 22 нм і завдовшки 200-400 нм) і великі сферичні (діаметром 42 нм), які є віріонами ВГВ. Хоча хімічна будова HBsAg до кінця не вивчена, встановлено, що до його складу входить 7-9 поліпептидів (Р1-Р9) з молекулярною масою 13-120 кД. Основний компонент, що має  найбільшу імунологічну активність,  представлено глікопротеїдом з молекулярною масою 23-26 кД.  Таким чином, зовнішня оболонка вірусу складається  з  вуглеводів, ліпідів та зовнішнього білка HBsAg, якій кодується геном S, ділянками пре-S1, пре-S2, так званим геном env.

 

Антигенна будова HBV

 

До складу HBsAg входять вуглеводи (3,6-7,5 % маси) як стабілізатор його імуноактівності, ліпіди (20-30 % маси). Вважають, що вуглеводи і ліпіди HBsAg  бере з плазмолеми під час виходу з клітини.

У складі  HBsAg є ряд детермінант, за допомогою яких виділяють 10 субтипів цього антигену. Детермінанта “а” є спільною. Крім неї виявлено дві взаємовиключні детермінанти – d та y, а також дві додаткові  – w та r. Таким чином, чотирма основними субтипами є adw ayw adr ayr. Описано також інші антигенні специфічності – f, g, j, n, t, x.

HBsAg  високостійкий до дії фізико-хімічних факторів. Він не руйнується  під час багаторазового розморожування та заморожування, довго зберігається у висушеному стані. Дія температури 60 °С протягом 21 год його не руйнує, частково втрачається  активність антигену тільки після 30-хвилинного прогрівання при температурі 98 °С. Повна інактивація досягається завдяки 15-хвилинній паровій стерилізації при 121 °С. HBsAg стійкий до дії багатьох хімічних агентів. Часткова або повна його інактивація відбувається при обробці 3-5 % хлораміном, 5 % фенолом, етиловим і бутиловим спиртами тощо.  

HBsAg  виявляють практично  в усіх  біологічних рідинах людини.

HBcAg (англ. core – серцевина) – серцевинний або ядерний антиген, входить до складу нуклеокапсиду ВГВ. Цей антиген виявляється в ядрах гепатоцитів людей, хворих на гострий або хронічний  гепатит В. Його виділено як з часток Дейна, що циркулюють у крові, так і з ядер гепатоцитів хворих, де він перебуває у вільній формі.

HBeAg  (англ. enzyme – фермент) відкрили  L. Magnius i J. Espmark (1972) у сироватці крові хворих на гострий або хронічний гепатит В та у здорових носіїв HBsAg. За допомогою методу імунофлюоресценції HBeAg  виявлено у цитоплазмі та ядрах гепатоцитів інфікованих ВГВ людей. Було висловлено припущення, що HBeAg знаходиться  у частці Дейна між зовнішньою оболонкою, утвореною  HBsAg  та HBcAg. Дані свідчать, що    HBeAg – компонент серцевини віріону, він – ензим з ДНК-полімеразною активністю.

Він термолабільний і чутливий до сульфгідрильних реагентів. 

Деякі дослідники висловлюють припущення про існування ще одного антигену – HBxAg. Він практично не досліджений, але вважається, має відношення до ракової трансформації гепатоцитів.

ВГВ в заражених клітинах і механізм їх реплікації. Вірус гепатиту В не репродукується ні в культурах тканин, ні в курячих ембріонах. Відомо, що HBcAg  присутній тільки в ядрах гепатоцитів, в той час як HBsAg – в цитоплазмі і на клітинній поверхні. Відповідно до цього під електронним мікроскопом частки, подібні до серцевини віріонів, знайдено тільки в ядрах гепатоцитів. Частки, що нагадують HBsAg в клітинах виявити не вдалось, і морфогенез їх та повних віріонів остаточно не  відомий. Встановлено, що вірусна ДНК існує в клітинах у декількох формах: в ядрах у вигляді кільцевої замкнутої молекули (форма 1), релаксованої кільцевої молекули (форма 2), лінійної молекули (форма 3), одноланцюгових фрагментів з 3200 нуклеотидів і молекул вірусних гібридів ДНК-РНК.

Репродукція HBV

 

Робоча модель реплікації ВГВ має такий вигляд. Після проникнення вірусів у клітини в ядрах формуються замкнені кільцеві вірусні ДНК, що складаються з 3200 нуклеотидів. Вони функціонують як матриці для синтезу вірусної мРНК і синтезу плюс-нитки РНК розміром 3200 нуклеотидів, яка в свою чергу є матрицею для синтезу мінус-нитки ДНК. Плюс-ланцюг РНК повної довжини, новосинтезована вірусна ДНК-полімераза (зворотня транскриптаза) і білок-затравка для синтезу мінус-нитки ДНК збираються в комплекс з мажорним (англ. major – великий) структурним поліпептидом серцевини віріона  і утворюють серцевину, або нуклеокапсид вірусу. Потім всередині нуклеокапсида синтезується мінус-нитка вірусної ДНК. На матриці мінус-нитки ДНК у кільцевій конформації синтезується плюс-ланцюг ДНК. Частки збираються  в повні віріони з HBsAg і ліпідовмісними оболонками клітинної мембрани.  На будь-якій стадії репродукції віріонів вони можуть виходити з клітини і знаходитись у крові.

В багатьох випадках вірусна ДНК може інтегрувати з клітинною. Проте інтегрована вірусна ДНК зустрічається у значно менших кількостях (1 копія на клітину), ніж вільна – понад 500 копій на клітину. Інтимні механізми інтеграції до кінця не розшифровані.

Чутливість вірусів до дії фізико-хімічних агентів. Віруси гепатиту В мають надзвичайно високу резистентість до дії різноманітних факторів зовнішнього середовища. Зокрема, вони витримують  кип’ятіння і зберігають антигенність протягом  15-20 хв, а при 60 °С – до декількох годин. Інфекційні та антигенні властивості вірусів зберігаються при УФ-опроміненні плазми крові та її зберіганні при -20 °С. Вірус чутливий до дії формаліну і детергентів. Згубно діють хлоровмісні дезинфектанти, автоклавування при 126 °С інактивує вірус протягом 30 хв, гаряче повітря (сухий жар) при 160 °С – за 60 хв, а при 180 °С – за 40 хв.

Епідеміологія захворювання. Джерело вірусів – людина. Основним резервуаром є “здорові” вірусоносії, число яких на земній кулі перевищує 300-500 млн чоловік, а також хворі на жовтяничну або безжовтяничну форму гепатиту (їх співвідношення  приблизно 1:100) (Video-Гепатит В).  В Україні частота виявлення HBsAg становить 1-4 %. Хворий стає заразним за декілька тижнів до появи клінічних ознак. У цей період HBsAg з’являється в крові, деколи в жовчі та слині. Його можна знайти в сльозах, фекаліях, грудному молоці, вагінальному вмісті, спермі, спиномозковій та синовіальній рідині, пуповинній крові. Антигенемія спостерігається протягом всього клінічно вираженого періоду захворювання і, якщо наслідком є хронізація процесу, може тривати роками. Становленню хронічного носійства сприяє ранній вік людини, стан його імунодепресії, прийом кортикостероїдних препаратів.

Рівень гепатиту В в Україні

 

Провідний механізм передачі – парентеральний (інокуляційний), другорядний – фекально-оральний, рідко – трансплацентарний (вертикальний).  Не виключається й статевий шлях зараження.

 

Шляхи передачі  HBV в Сполучених Штатах

 

Зараження відбувається внаслідок внесення крові та її препаратів (плазми, еритроцитарної маси, тромбіну, фібриногену та ін.,  крім імуноглобуліну), лімфи при будь-якій інструментальній процедурі, яка супроводжується порушенням цілісності шкірних та слизових покривів, включаючи й щеплення. Зараження може відбутися при внутрішньовенних, внутрішньом’язових, підшкірних та інших ін’єкціях, скарифікації шкіри  за допомогою голок, спеціальних скарифікаторів, медичного інструментарію, який використовується в терапевтичній, хірургічниій, стоматологічній, акушерсько-гінекологічній, урологічній та іншій практиці, при забрудненні ран, голінні у перукарнях, коли роблять манікюр, педікюр. Передача вірусу може відбутись при заковтуванні крові, яка містить антиген, при маніпуляціях з кров’ю та її продуктами на станціях переливання крові, біологічних фабриках. Слід пам’ятати, що межа чутливості методів визначення поверхневого антигену  (1нг HBsAg в 1 мл) відповідає 2х10⁸ антигенних часток в 1 мл сироватки. Якщо мати на увазі, що на 1000 дрібних (22 нм) структур антигену припадає одна частка Дейна, то в тому ж об’ємі сироватки міститься 2х10⁵ віріонів. З врахуванням їх дефектності ця кількість містить  100 інфекційних доз. Іншими словами, проби, які негативно реагують в РІА  на HBsAg, можуть мати залишкову інфекційність.

Зараження в побуті не таке вже й рідке явище. Останнім часом вказують на значення тісного сімейного спілкуваня та статевих контактів, використання спільних зубних щіток, помазків для гоління, лез тощо.  Існує сурова взаємозалежність між серологічними  доказами ГВ і особливостями статевого життя (безладні статеві зв’язки, що підвищує вірогідність контакту із хворим, гомосексуалізм протягом тривалого періоду). Передача через комах не була достовірно доказана. Помічено, що москіти і клопи, які напились крові, особливо, коли їх зібрано у квартирах носіїв HBsAg, можуть бути позитивними на вірус. Отже, при годящих умовах вони можуть грати певну роль у розповсюдженни инфекції.

Групу епідемічного ризику складають медичні працівники: хірурги, онкологи, стоматологи, акушери-гінекологи і трансфузіологи, а також середній та молодший медичний персонал. У працівників виробництва препаратів крові маркери вірусної інфекції зустрічаються значно частіше в порівнянні з іншими професійними групами.

Особливе значення має передача вірусів матері своєму плоду під час вагітності, пологів та в післяпологовий період. Найбільш небезпечні в цьому плані носії вірусів при наявності в крові HBeAg. При HBs- i HBe-антигенемії зараження плода відбувається  в 90 % випадків.

Виділяється епідеміологічна небезпека для пацієнтів відділів гемодіалізу. Висока захворюваність серед наркоманів, осіб, яким переливали кров від необстежених за ГВ донорів.

Сезонності при ГВ не відмічається. Дещо більша частота захворюваності серед жінок пояснюється частішими парентеральними маніпуляціями та кровотечами.

Інкубаційний період коливається  від 50 до 180 днів.

 

Патогенез захворювання. При проникненні в організм з кров’ю, вірус зразу ж розноситься, фіксуючись на гепатоцитах. Однак його репродукція не супроводжується цитолізом клітин. Це свідчить про те, що вірус гепатиту В не має прямої цитопатичної дії, а патологічний процес починається  в печінці не з моменту проникнення збудників в гепатоцити, а після розпізнавання  імунокомпетентними клітинами його антигенів на поверхні клітини. Тобто, ураження клітин печінки є імунообумовленим. Антигени ВГВ, локалізовані на мембрані гепатоцитів, фіксуючи антитіла і комплемент, індукують тим самим імунопатологічну реакцію. Крім печінки, імунні комплекси з HBsAg  відмічено в ендотелії судин різних органів, лімфатичних вузлах. З появою цих комплексів пов’язують ураження не тільки печінки, але й інших органів (гломерулонефрит, нодозний артрит, панкреатит тощо).

Інтеграція вірусної ДНК в геном гепатоцитів відбувається як при гострій, так і при хронічній формах гепатитів. При цьому вона носить випадковий характер, так як в кожному випадку в хромосому клітини вмонтовується невизначена ділянка вірусної ДНК. Інтегрована ДНК до того ж може виявитись дефектною, що робить неможливою  експресію її генів, в тому числі й  тих, що контролюють утворення антигенів. При інтеграції повноцінної вірусної ДНК синтезуются антигени, з яких HBsAg поступають у кров. При цьому не відбувається реакції імунного цитолізу внаслідок відсутності “мішені” на мембрані гепатоцитів для Т-кілерів і NK-клітин. Адже вони атакують лише ті гепатоцити, які несуть на мембрані HBcAg: чим більше даного антигену на мембранах, тим інтенсивніше вони руйнуються в результаті імунного цитолізу. При цьому відбувається масовий вихід вірусів із зруйнованих клітин і генералізація інфекції.

Парадоксально, однак в імунологічно скомпрометованих господарів перебіг інфекції більш м’який, ніж у імунологічно нормальних.

Основні клінічні  прояви. В ряді випадків спостерігається поступовий початок захворювання. Продромальний період більш тривалий, ніж при гепатиті А. Спостерігаються анорексія, дискомфорт у животі, нудота і блювота. Більш патогномонічними  в цей період є артралгічний синдром, болі в правому підребер’ї. Температура може бути субфебрильною, спостерігаються уртикарні висипання. Жовтяничний період характеризується більш  вираженою і стійкою білірубінемією, тривалою гіперферментемією. Летальність може досягти 6-12 %.

Лабораторна діагностика. Широко застосовуються серологічні методи діагностики. Для виявлення HBsAg і HBs-антитіл використовують кров хворого обо особи, що перехворіла. На практиці добре зарекомендував себе метод зустрічного імуноелектрофорезу. Однак сьогодні використовують ще значно більш чутливiші методи – радіоімунний аналіз у твердій фазі, імуноензимний аналіз, імунну електронну мікроскопію. Виявити HBeAg  можна за допомогою методу ІФА. Гарні результати одержують  за допомогою реакції преципітації в гелі (РПГ), РНГА, РНЗГА і РЗК, які можна застосувати у повсякденній лабораторній практиці.

У  разі інфікування людини ВГВ перші клінічні ознаки можуть з’явитись в різні  терміни – від 30 днів до 6 місяців, проте маркери ВГВ (HBsAg, HBeAg,  анти-HBc IgM,  анти-HBc IgG, анти-HBe, анти-HBs, пре-S1, пре-S2 та анти-пре-S2) можуть виявлятись ще до появи  клінічних симптомів. Виявлення цих маркерів  має велике, а інколи головне діагностичне та прогностичне значення.

 

Маркери гепатиту В

 

HBsAg в організмі інфікованої людини можна визначити вже через 3-5 тижнів після зараження. Неодмінною умовою видужання після гострого гепатиту В є повне зникнення HBsAg  та поява антитіл до нього. Але тут виникає певна неузгодженість. Анти-HBs антитіла з’являються не відразу після зникнення HBsAg, а через певний проміжок часу, який може коливатись від 2-4 тижнів до 1 року. Це так зване корівське вікно (англ. ”core window”), коли HBsAg  вже не визначається, а анти-HBs імуноглобуліни ще не виявлено (або їх зовсім немає). У цьому інтервалі єдиним маркером гепатиту В є наявність у сироватці крові антитіл до HBcAg (особливо HBc IgM).

Зникнення HBsAg  та поява анти-HBs антитіл є ознакою одужання людини. Вони спочатку перебувають у високих титрах, але з часом (протягом багатьох років після перенесеного гепатиту) титр їх знижується. Вони можуть, як правило, зберігатись все життя, з їх наявністю пов’язаний післяінфекційний імунітет людини.

Сьогодні пре-S1 антигени можна розглядати як маркери:

– інфекційності, 

– підтвердження наявності вірусної реплікації в організмі,

– можливості високого ризику вертикальної передачі ВГВ (від  матері до дитини),  

– заміни HBeAg  у разі ВГВ-2 інфекції.

Анти-пре-S2 антитіла розглядаються як:

– маркер видужання,

– можливий маркер додаткового посилення ВГВ вакцини.

Іншим дуже важливим діагностичним маркером під час гострого  гепатиту В є антитіла до серцевинного антигену (HBcAg) – анти-HBc IgM. Вони можуть бути виявлені у сироватці крові інфікованої людини наприкінці інкубаційного періоду і перебувати там протягом тривалого часу (від 2 місяців до  1,5 року). Майже одночасно з анти-HBc IgM з’являються анти-HBc IgG, котрі, як правило, зберігаються в організмі людини протягом всього життя.

Відкриття HBeAg та анти-HBe дало змогу ще ближче підійти до вивчення проблеми. HBeAg виявляють в сироватці крові хворих на гострий і хронічний гепатити, а також у частини носіїв HBsAg.

HBeAg  – антиген інфекційності або маркер реплікації ДНК ВГВ у гепатоцитах, тобто один з найвірогідніших маркерів гепатиту В.  Кров, в  якій виявлено HBeAg, є високоінфекційною.

Під час гострого гепатиту В HBeAg циркулює в крові не більше 2-ох місяців, після чого відбувається сероконверсія, тобто утворення  анти-HBe  антитіл. Вони ще певний час зберігаються в крові, але за декілька місяців зникають  зовсім. Наявність у крові HBeAg понад два місяці від початку хвороби свідчить про те, що в організмі хворого відбувається процес формування хронічного гепатиту.

Підсумовуючи висловлене, можна стверджувати, що у разі гострого гепатиту В в організмі людини з кінця першого місяця від моменту зараження в сироватці крові можна виявити  HBsAg i HBeAg. Незабаром  після клінічного видужання HBeAg  зникає, а HBsAg виявляється ще до 5-6 місяців. Наявність HBeAg у високих титрах у гострому періоді захворювання та протягом 6-8 тижнів після видужування дає підстави припустити розвиток хронічного гепатиту. Зникнення HBeAg і поява HBe-антитіл – добра прогностична ознака.

Таким чином,  основними маркерами ВГВ  можна вважати  HBsAg,  анти-HBc IgM, HBeAg.

Профілактичні заходи. Для попередження зараження через кров та її похідні встановлено суворі правила відбору донорів крові, забору її, розподілу крові та її компонентів. Донори обстежуються на наявність HBsAg  і при  позитивній реакції звільняються від здачі крові. З числа донорів  виключаються особи, які перенесли вірусний гепатит або гемо- і плазмотрансфузії за останні 2 роки, страждають на нерозпізнані захворювання печінки, алкоголізм, наркоманію,  були в контакті з хворим на вірусний гепатит за останні 6 місяців.  З однієї ампули або флакона дозволяється вводити кров тільки одному реципієнту.

Суворі правила безпеки введено стосовно стерилізації ріжучого та колючого медичного  інструментарію. Після використання його розбирають, миють проточною водою, замочують у гарячому  (50 °С) миючому розчині (перекис водню з миючим засобом) на 15 хв, миють механічно в 0,5-1,0 % миючому розчині, полощуть проточною та дистильованою водою, потім контролюють ефективність очистки шляхом постановки бензидинової проби на наявність слідів  крові.

Інструментарій стерилізують у автоклаві при 1,5 атмосферах (126 °С) 30 хв, в сухожарових шафах при 160 °С протягом 1 год, а при 180 °С – 40 хв, або кип’ятять у дистильованій воді 30 хв з моменту закипання.

При медичних закладах створюють централізовані відділи для стерилізації інструментарію. Під час щеплень використовуються одноразові шприци, безголкові інжектори.

Віруси імунодефіциту людини

У середині 1981 р. Центр по контролю захворюванності США одержав повідомлення, що за останні 8 місяців в районі Лос-Анжелеса було діагностовано 5 випадків пневмоцистоза – дуже рідкісного типу пневмонії, яка викликається Pneumocystis carinii.

 

Pneumocystis carinii.

 

Вона зустрічалась в молодих мужчин-гомосексуалістів. Однак цей збудник належав до умовнопатогенних мікроорганізмів, які безпечні для здорової людини. Але у людей, чия імунна система з тієї чи іншоі причини ослаблена, вони викликали хворобу. Вона настільки зустрічалась рідко, так що ліки для неї вважались експериментальними і призначались тільки з дозволу Центру по контролю захворюваності США (ЦКЗ). У той же час за період з 1967 по 1979 рік цей препарат призначався тільки двічі.

    Приблизно в цей час ЦКЗ одержав повідомлення про збільшення захворюваності одним видом раку – саркомою Капоші.

 

Саркома Капоші

 

До цього це захворювання рідко зустрічалось в США – і головним чином серед мужчин похилого віку, які приймали препарати, що пригнічують дію імунної системи. Однак зараз протягом 30 місяців було зареєстровано 26 випадків саркоми і знову таки у молодих мужчин гомосексуалістів в Нью-Йорку. У деяких з них також була пневмонія (P. carinii) та інші важкі опортуністичні хвороби.

    Пізніше клініцисти та епідеміологи помітили збільшення числа випадків у мужчин-гомосексуалістів двух явищ, які не можна було пояснити: хронічної лімфаденопатії (стан, який характерізується збільшенням лімфатичних вузлів) і досить рідкої так званої недиференційованої неходжкінської лімфоми. І також в основі цих зрушень лежали тяжкі ураження імунної системи.

    Цей клінічний комплекс було класифіковано як абсолютно новий синдром, який в 1982 році одержав назву СНІДу – синдрому набутого імунодефіциту (AIDS). Було встановлено, що у хворих виснажується популяція певних лімфоцитів, зокремаT₄ клітини.

     У 1980 р. колектив, який очолював Р. Галло вперше виділив ретровірус людини – Т лімфотронний вірус типу І людини (HTLV – 1 – human T-lymphatropk virus type I). Цей вірус уражає Т-лімфоціти і викликає досить агрессивний рак (Т- клітинний лейкоз), який ендемічний для Японії, Африки, країн Карибського басейну та інших регіонів. Тільки в Японії нараховується понад 1,5 млн носіїв цього вірусу. Він може передаватись  від матері до дитини, а також  при переливання крові, статевихї контактах. Захворювання проявляється неврологічною симптоматикою, хронічною мієлопатією, дисфункцією сфінктерів.  Захворювання подібно до розсіяного склерозу та бокового аміотрофічного склерозу.

Двома роками пізніше ця ж  група виділила HTLV-II, який також виникликає деякі форми лейкозів (волосистоклітинний), але більш хронічного типу ніж HTLV-I.

Цим двом вірусам придатні одні й тіж особливості – обоє розповсюджуються з кров`ю, статевим контактом і від матері дитини. І там і там хвороба розвивається після тривалого латентного періоду (2 роки), уражаються Т-лімфоцити.

Галло вважав, що це ретровірус. На підтвердження цієї гіпотези було доказано, що ретровірус FeLV (feline leukemia virus – вірус лейкозу котів) виникає рак або пригнічує імунну систему.

Було зроблено гіпотезу, що збудник СНІД – це вірус HTLV -I. Вона не підтвердилась, але стимулювала широкий науковий пошук.

    Люк Монтан`є  у Франції з створив робочу групу з вивченю СНІД ( з першими повідомленнями). Французськи дослідники вирішили перевірити гіпотезу групи Галло.

У 1983 р. після культивування збільшеного лімфовузла молодого гомосексуаліста через 15 днів в культуральній рідині було знайдено фермент – транскриптазу. Значить там був вірус. Він мав особливі властивості – викликав симтомоутворення клітин, але по морфологіїі і серологічним ознакам відрізнявся від HTLV-I i HTLV-II. У великих кількостях накопичувався в культурах клітин В лімфоцитів, попередньо трансформованих вірусом Енштейн-Бар (герпес вірус), були серологічні перехрести з поверхневими білками HTLV I.

Його позначали як LAV (lymphadenopathy associated virus), він розмножувався в Т4, але не в Т ₈  клітинах . Вдалось ідентифікувати вірусний білок р25 (або р24), якщо не було в HTLV-I

Cпочатку антитіла до LAV знаходились у переважній більшості людей з лімфаденопатією, і дуже мало при СНІДі. Але при розширенні обстеження хворих СНІД доля позитивних осіб збільшувалась і досягла 40%.

Монтаньє був впевнений, що це є збудник. Галло був не такий однозначний. Він направив зусилля на одержання великої кількості віруса з крові хворих на СНІД. І вдалося доказати, що в уіх 48 обстежених препаратів від осіб з групи ризику одержали один і той же вірус, який назвали HTLV -III.

В жодної людини, яка веде звичайне статеве життя цього вірусу не було.

Через деякий час була встановлена тотожність вірусу HTLV-III i LAV. І з 1986 р. (ІІІ конгрес по СНІДу в Парижі) йому надане ім`я HIV (human immunodificiency virus). Було показано, що HIV здатен заражати не тільки Т4, але й макрофаги. А вони здатні проходити через ГЕБ, заносити вірус в мозок. Цим і пояснюється патологія нервової системи, яка спостерігається у хворих на СНІД.

Після такого різкого накопичення даних темпи знизились. Але й надалі не обійшлось без сюрпризів. В жовтні 1985 року  Монтан`є аналізував зразки крові, доставлені португальскими дослідниками з Гвінеї-Бісау (Зах. Америка). У деяких осіб клінічно було діагностовано СНІД, хоча HIV в крові не знаходили.

Один з зразків давав постійну негативну реакцію на HIV при застосуванні самих витончених методів  аналізами. Однак врешті з крові вдалось виділити якійсь вірус. Аналізуючи його на нуклеотидні послідовності ДНК  прийшли до висновку, що вони мало комплементарні. Значить, це було виділено новий вірус, його позначили HIV-2.

В еволюційному плані він має родинні зв`язки з HIV-I. В них однакова структура і обидва викликають СНІД. HIV -2 – в основному в Зах. Африці, HIV -I – Центр Африки та інші країни світу.

Виділення HIV -2 – поставило питання про еволюції вірусів.

 

Україна

За оцінками спеціалистів розповсюдженість ВІЛ серед дорослого населення України складає 1,8 %. Тому Україна найбільш постраждала від ВІЛ країна в Європі.

В Україні темпи розвитку епідемії – найвищі в світі. Найвищі темпи росту у Миколаєвській та Одеській областях. Найнебезпечніші міста  – Донецьк, Дніпропетровськ, Одеса, Сімферополь, Миколаїв.

 

Прогнозується, що до 2010 року в Україні кількість ВІЛ-інфікованих досягне 1.5 млн чоловік (за оптимістичним прогнозом – 600 тисяч чоловік).

За період з 2005 до 2014 року біля 300 тисяч чоловік помруть від СНІДу. А тривалість життя скоротиться для чоловіків на 2-4 роки, для жінок – 3-5 років.

 

Щоденно в світі заражаються ВІЛ 14 тисяч чоловік, з них біля 6 тисяч – молоді люди від 15 до 24 років.

Молекулярна біологія ВІЧ.

Геном являє собою двониткову РНК з коефіцентом седиментації 35 S. Геном містить 9213 нуклеотидів і має 9 генів Це особливі послідовності нуклеотидів, що включають транскрипцію вірусних генів. При цьому ферменти, які належать клітині-господарю синтезують РНК-копії провіруса. Частина їх стане генетичним матеріалом нових варіантів, а частина використовується як м РНК для синтезу структури білків і ферментів, що ввійдуть до складу віріона. Вірус або брункується (клітина лишається неушкодженою), а якщо інтенсивна реплікація – лізіс клітини, вона гине.

Основні гени: gag –кодує білки серцевини,  pol – ферменти, env – білки оболонки. Ці гени є у всіх вірусів раку  і лейкозу. Крім того, у віруса є ряд генів-регуляторів: tat –позитивний регулятор,  rev (art, trs) – вибірковий регулятор, vif (sor, A, P, Q) – фактор інфекційності, vpr, vpn– функція їх невідома, nef (3’orf, B, E, F) – негативний регулятор.

 

Ген gag складається з 1500 пар нуклеотидів, кодує білки р17, р24-25, р15, які нарізаються внаслідок процесингу з білка-попередника молекулярною масою р54.  Однак молекулярна маса цих всіх білків ще уточнюється.

    Цей ген короткий, ніж у решти ретровірусів, які кодують не 3 а 4 білка. Ці внутрішні білки найбільш консерівативні і мають спільні антигенні детермінанти з внутрішніми білками інших ретровірусів – лептівірусів і групи HTLV.

Ген pol (головним чином, ревертаза) займає ключове положення у ВІЛ. Він складається з  3300 пар нуклеотидів, відрізняється за своєю гомологією на 80-90 % від решти вірусів. Він кодує три ферменти: ревертазу. вірусспецифічну протеазу і ендонуклеазу. Ендонуклеаза (інтеграза) – це білок р34. Антитіла проти неї знаходять у 92,6 %  хворих на СНІД. Вона нарізає кільцеву ДНК ВІЛ перед інтеграцією її в геном клітини  за місцем з’єднання двох  Ltr.

Ген env  складається з  2600 пар основ. Він кодує білки gp41 (знаходиться у ліпідній оболонці)  і gp 120 (розміщається на оболонці вірусів).

Висока молекулярна маса зв`язана з високимступенем глікозилірування. Можливо, з цією обставиною зв`язана висока антигенна варіабельність особливо для др120.

Такі відмінності по цому білку знадені навіть в одного і того ж  хворого. Це має принципове значення так як саме цей білок визначає інфекційність ВІЛ і синтез протективних противірусних антитіл. І ці антитіла можуть пригнічувати розмноження ВІЧ в культурах клітин.

В ділянці гену env, який кодує gр41, є нуклеотидна послідовність, яка кодує гексапептид, який близький до гексапептиду в інтерлейкіні-2, принципового модулятора імунологічних реакцій. Він антагоніст дії інтерлейкіну-2, можливо відповідає за імуносупресію і за цитолітичну дію ВІЧ. Пропонують використати його для створення вакцини.

При генетичному аналізі чисельних ізолятів ВІЛ не знайдено жодного з повним співпадінням нуклеотидних послідовностей. Ізоляти від одного й того ж хворого (які взято з певними проміжками часу) також різняться  за нуклеотидними послідовностями. Навіть дискутується питання: чи це результат багаторазового повторного інфікування різними варіантами ВІЛ, чи наслідок мінливості. Більшіст ьсхиляється до станнього.

Така інтенсивна мінливість сприяє вичлизанню вірусів від дії специфічних антиіл і захисних механізмів клітинного імунітету і хронізації процесу.

УВ реплікації вірусів є три етапи, на яких можуть відбуватись мутації.

По-перше, транскриптаза не здатна до корекції помилок. Тому можливі мутації при синтезі 1-го ланцюга ДНК на РНК матриці, а потім комплементарної 2-ої нитки ДНК.  По-друге, клітинна РНК-полімераза також не коректрує помилок (вона синтезує  новий генетичний матеріал для вірусів).

Багато мутацій загибельні для вірусів, але й багато несуть незначне функціональне навантаження, тому не впливають на структуру і життєвий цикл віріону.  Тому штами  можуть сильно відрізнятись генетично, але мати ту ж саму патогенність.  Описано також мутації  по регуляторним генам.

Гени-регулятори tat, rev, vif, nef не визначають синтез структурних білків. а виконують регуляторну функцію.

Особливість гену tat i rev є те, що вони представлені в 2-ох ділянках ДНК, розділені геном env. В процесі транскрипції в результаті подвійного сплайсингу проходить об’єднання цих ділянок. Це, напевно, грає критичну роль в життєвому циклі вірусів і забезпечує його персистенцію в заражених клітинах.

Ген tat (transactivator of transcription)  кодує білок р14 (86 амінокислот), який в 1000 разів збільшує рівень експресії м-РНК, тобто підсилює рівень синтезу всіх білків. Він впливає й на транскрипцію, з’єднуючись з вірусними LTR, активуючи її приблизно в 12 разів.

Під впливом цього гена відбувається експресія активації інтерлейкіна-2. Вважають, що з цим геном пов’язаний перехід від латентної ВІЛ-інфекції до її маніфестації. Тому шукаючи  препарати, які болкують tat і його білки, ми наближаємось до розв’язання проблем терапії та профілактики СНІДу.

Ген rev (regulator of viron-protein expression) – вибірковий регулятор, який регулює транскрипцію. Він запускає експресію генів gag i env, контролює експресію ВІЛ в цілому. Він визначає єрівновагу між різними мРНК при їх синтезі, а   також перехід від скритої інфекції до активного розмноження віруса. Вважають, що під час реплікації спочатку експресується РНК, яка кодується tat, rev, net, а потім продукти rev індукують синтез мРНК – генів pol, env, vif (sor).

Ген nef (negative regulatory factor) кодує білок р26-27, який знаходиться в цитоплазмі уражених клітин, а не в ядрі. В зрілих віріонах він ппотім не визначається. Білок здатний сповільнювати  транскрипцію вірусного генома, гальмує розмноження вірусів і переводить їх в стан спокою. За своїми властивостями він схожий на клітинні протеїнкінази, які стимулюють певні реакції в клітині.

Ген  vif (virion infectivity factor)  кодує білок р23, а він ініціює ЦПД, стимулює брункування вірусу і його здатність заражати інші клітини.

Такми чином, генолм ВІЛ –  складна поліфункціональна структура, в якій всі компоненти взаємопов’язані. Зокрема, ген tat підсилює синтез самого себе і білка гена rev.  Rev сповільнює власний синтез і синтез білка гена tat.  Створюється свого роду динамічна рівновага. Це дозволяє вірусу репродукуватись роками, не знищуючи клітини. Тобто,  це адаптивна ознака ретровірусів, для яких господарями є види з довгою тривалістю життя.

 

Взаємодія вірусів з клітиною

Культивуючи вірус на свіжих лейкоцитах периферичної крові Попович М. (Національний інститут здоров’я США), Клацман (Париж) помітили, що в культурі клітин знижується число клітин з антигеном CD₄.  Було досліджено, що з рецепторами CD4 взаємодіє  gp120 на зовнішній мембрані віруса.

Вони присутні на: 

–  T4 лімфоцитах (хелпери/індуктори);

–  3 – 10 % B лімфоцитів;

–  10-20 % моноцитів і макрофагів; серед них альфеолярні макрофаги, клітини Лангенгарса шкіри; гліальні клітини і макроглія ЦНС.

Фолікулярні дендритні клітини мигдаликів  можуть інфікуватись без участі CD4 рецепторів.

 

 

Взаємодія вірусів із CD4 рецепторами

 

Вірус може проникати в клітину двома шляхами: за допомогою злиття мембран при звільненні gp41 (інтегрує в стінку лімфоциту) або ендоцитозом.

 

Особи груп високого ризику щодо ВІЛ інфікування

1.  Гомосексуалісти та чоловіки бісексуали.

2.   Наркомани, які використовують спільні голки.

3.   Люди, яким багаторазово переливали кров або продукти крові в період  між 1978 – 1985 роками.

4.   Сексуально нерозбірливі чоловіки і жінки, особливо повії.

5.                     Люди, які перенесли гепатит B, сифіліс та інші хвороби, що передаються статевим шляхом.

 

Лабораторна діагностика

Діагностика СНІДу базується  на клінічних проявах захворювання і результатах вірусологічних та імунологічних методів  дослідження. У разі ВІЛ-інфекції в організмі вірусоносіїв  або хворих на СНІД можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, інфекційний вірус,  вірусний антиген – у сироватці крові та інфікованих клітинах-мішенях (лімфоцити та ін.), провірус – у ДНК уражених імуноцитів.

Метою вірусологічного дослідження є встановлення етіологічного діагнозу на підставі виявлення вірусспецифічних маркерів.

У всьому світі склалась двоетапна система лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції (Video-“лабораторна діагностика СНІДу).

На першому етапі проводять скринінг сироватки крові на антитіла до ВІЛ за допомогою  різних тест-систем імуноферментного аналізу (ІФА).

 

Забір матеріалу у вірусоносія

 

 Кров донорів досліджують у лабораторіях з діагностики СНІДу, розгорнутих на базі станцій (відділень) переливання крові, а кров осіб, які належать до групи ризику, – у лабораторіях з діагностики СНІДу  різних медичних  закладів (диспенсери, СЕС, протичумні станції, лікарні, поліклініки, діагностичні центри тощо). Крім того, дослідження сироватки крові в ІФА на антитіла до ВІЛ частково проводять  у лабораторіях клінічної імунології, розгорнутих на  базі інфекційних лікарень.

 

ІФА

 

На другому етапі сироватки крові, позитивні в ІФА (два позитивні результати з дфвох або трьох досліджень), направляють у лабораторії спеціалізованих НДІ, діагностичні центри для досолідження за допомогою підтверджуючих тестів: імуноблоту (вестерн-блоту), тесту радіоімунної преципітації (РІП) і реакції непрямої імунофлюоресценції (РНІФ).

 

Імуноблот

 

Одержання позитивного результату під час  дослідження методом імуноблоту або РІП, тобто виявлення антитіл до певних структурних білків ВІЛ, дає змогу зробити позитивний висновок про янаявність ВІЛ-інфекції, хоча можливі випадки несправжньопозитивних реакцій. Аналогічний висновок можна зробити також у разі одержання позитивних результатів дослідження сироваток крові на антитіла до ВІЛ у РНІФ, використовуючи культури Т-лімфоцитів, інфікованих ВІЛ, тобто ті, що містять вірусний антиген.

Крім зазначеної двоетапної схеми лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції на підставі виявленння противірусних антитіл застосовують також альтернативін методи вірусологічної діагностики:

*                        виявлення антигена ВІЛ у сироватці крові  за допомогою ІФА та інших тестів;

*              виділення ВІЛ у культурах лімфоцитів із подальшою індикацією вірусу за ЦПД      (утворення синцитіїв), ревертазною активністю та детекцією вірусного антигену (або провірусу в молекулярній гібридізації in situ);

*                        детекція провірусув лімфоцитах периферичної крові у тесті молекулярної гібридізації.

Ці методи використовують головним чином у лабораторіях спеціалізованих НДІ, де є певні умови для роботи (наприклад, захист персоналу від зараження під час культивування, очищення та концентрування ВІЛ) і висококваліфіковані фахівці.

Одержання позитивного результату під час  застосування одного з наведених методів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу  ВІЛ-інфекції.

На відміну від класичних методів серологічної діагностики вірусних захворювань, для діагностики ВІЛ-інфекції проводять індикацію специфічних антитіл  до поверхневих антигенів у окремих сироватках.

 

Лікування

Лікування СНІДу – надзвичайно важлива проблема, яка, на жаль, далека від остаточного розв’язання.  В залежності від особливостей репродукції вірусів можна передбачити різні способи втручання в його життєвий цикл.

 

Деякі експериментальні підходи до терапії СНІДу

I. Попередження прикріпленню ВІЛ до клітин господаря.

Приклади: 1. Декстран сульфат – негативно заряджений полісахарид; ймовірно конкурує із рецепторами ВІЛ і CD4.

2. Розчинний CD-4, який продукується in vitro і зв’язується з протеїном для продовження його перебування в кров’яному руслі; з’єднується з вільними вірусами і перешкоджає прикріпленню їх до клітин господаря.

 

II. Пригнічення вірусних ферментів.

Приклади: 1. Zidovudine та ін. зв’язуються із зворотною транскриптазою і блокують синтезом вірусної нуклеїнової кислоти.

2. Препарати, які блокують дію ферменту, що сприяє видаленню вірусної оболонки, а пізніше забезпечує включення білків до складу віріону.

 

III. Блокування трансляції матричної РНК

Приклад:   1. Короткі фрагменти RNA, комплементарні сегментам матричної РНК ВІЛ, специфічно з ними взаємодіють і зупиняють синтез вірусного протеїну. ВІЛ, створений генно-інженерними методами, вводиться в клітини, уражені ВІЛ, і блокує утворення РНК.

 

IV. Цілеспрямоване знищення заражених ВІЛ клітин

Приклад:   1.  Токсин Pseudomonas приєднується до синтезованих в умовах лабораторії  CD-4. CD-4 забезпечує приєднання токсину до заражених клітин, взаємодіючи з вірусними антигенами gp 120 на їх поверхнях.

 

V.  Використання імплантованих генів.

Приклад:   1.  У клітини кісткового мозку від хворого на СНІД інтегрується лабораторно зконструйований ген, який перешкоджає активації провіруса. Клітини вводять в організм хворого,  де вони розмножуються, забезпечуючи популяцію клітин, які не можуть продукувати інфекційний ВІЛ.

Ця ідея відпрацьована на попередженні  експериментальної інфекції, що викликаєть вірусом простого герпесу у мишей.

 

VI.            Підвищити чутливість вірусу до ультрафіолетового опромінення.

Приклад:   1. Хворий на СНІД отримує препарати, які підвищують чутливість уражених ВІЛ клітин до дії УФО. Мононуклеарні клітини видаляються з організму, опромінюються  і вводяться назад в організм хворого. Інфіковані опромінені клітини руйнуються в організмі.

 

VII. Використання імуностумуляторів.

Приклади: 1. Інтерферон, синтезований in vitro, який вводиться в організм хворого в малих дозах,  блокує вивільнення вірусів з інфікованих клітин. Це істотно підсилює ефект zidovudine.

α-інтерферон також ефективний проти багатьох випадків саркоми Kaпоші.

2.  Ditiocarb, який хімічний подібний до одного із сільськогосполарських фунгіцидних препаратів, збільшує опір резистентність до вторинних інфекцій. Воно може також призначатись разом із зідовудином.

 

VIII. Порушити збирання і вихід віріоів з клітини можна за допомогою a-інтерферону, амплігену ( індуктора інфтерферону), інгібіторів або модифікаторів функцій протеаз, інгібиторів глікозування білків.

 

 

                

 

Матеріали для підготовки склали доц. Ткачук Н.І.,  доц. Романюк Л.Б.