Home » Матеріали підготовки до лекції з біоорганічної хіміії

Матеріали підготовки до лекції з біоорганічної хіміії

2 Червня, 2024

Амінокислоти. Пептиди. Білки.

Білки – основа всього живого. Вони є компонентами всіх клітин тканин живих організмів. До білкових речовин належать ферменти, деякі гормони та ін. Поряд з нуклеїновими кислотами білки є найскладнішими зі створених природою біополімерів. Молекулярна маса білків складає від 5000 до багатьох мільйонів одиниць.

Білки з низькою молекулярною масою називаються пептидами. Мономерними одиницями білків і пептидів є a-амінокислоти.

У залежності від природи вуглеводневого радикала, з яким зв’язана карбоксильна група, амінокислоти підрозділяють на аліфатичні й ароматичні. Аліфатичні амінокислоти за взаємним розміщенням аміногрупи та карбоксильної групи поділяють на a-, b-, g-амінокислоти і т. д. Найбільш розповсюдженими в природі є a-амінокислоти, які входять до складу білків.

Номенклатура та ізомерія

За замісниковою номенклатурою ІЮПАК назви амінокислот утворюють з тривіальних або систематичних назв відповідних карбонових кислот та префікса аміно-. У випадку тривіальних карбонових кислот для позначення положення аміногрупи застосовують букви грецького алфавіту a-, b-, g– і т.д., при використанні систематичних назв кислот положення аміногрупи позначають цифровими локантами. Для амінокислот, які входять до складу білків, найчастіше застосовують тривіальні назви. Ароматичні амінокислоти бензольного ряду розглядають як похідні бензойної кислоти:

Ізомерія Ізомерія амінокислот аналогічна ізомерії гідроксикислот. Вона

може бути зумовлена різною структурою вуглеводневого радикала, з котрим сполучена карбоксильна група, та різним положенням аміногрупи у вуглецевому ланцюзі (структурна ізомерія); для амінокислот, що містять асиметричний атом вуглецю, ізомерія пов’язана з різним розміщенням замісників у просторі (оптична ізомерія).

Способи добування

Існує множина способів добування амінокислот, з яких найважливішими є такі:

Дія аміаку на галогенокарбонові кислоти. При взаємодії галогенокарбонових кислот з аміаком атом галогену заміщується на аміногрупу. Через доступність a-галогенокарбонових кислот цей метод в основному застосовується для добування a-амінокислот:

Дія аміаку та ціановодневої кислоти на альдегіди (синтез Штреккера). Цей спосіб застосовується для синтезу a-амінокислот. При взаємодії альдегідів з аміаком спочатку утворюється альдімін, який в присутності ціановодневої кислоти перетворюється на a-амінонітрил. Нітрил, що утворився, легко гідролізується до кислоти:

Приєднаня аміаку до на a-, b-ненасичених кислот. При дії аміаку на a-, b-ненасичені кислоти утворюються b-амінокислоти. Приєднання аміаку проходить проти правила Марковникова:

Відновлення нітробензойних кислот. При відновленні нітробензойних кислот за реакцією Зініна утворюються відповідні амінобензойні кислоти:

Фізичні та хімічні властивості

Амінокислоти являють собою білі кристалічні речовини з високими температурами плавлення, добре розчинні у воді. Внаслідок наявності в структурі кислотного центру (група — СООН) та основного центру (група — NH₂) амінокислоти кристалізуються з нейтральних водних розчинів у вигляді внутрішніх солей, що дістали назву біполярні іони, або цвіттер-іони:

У хімічному відношенні амінокислоти виявляють властивості первинних амінів та карбонових кислот. По карбоксильній групі вони утворюють функціональні похідні карбонових кислот — солі, складні ефіри, аміди, галогенангідриди.

За участю аміногрупи амінокислоти утворюють солі з мінеральними кислотами, вступають в реакції алкілування, ацилування, реагують з азотистою кислотою, а також дають інші реакції, властиві первинним амінам. Оскільки амінокислоти утворюють солі як з мінеральними кислотами, так і з основами, вони є амфотерним речовинами.

Деякі хімічні перетворення амінокислот представлені на схемах.

Разом з тим амінокислоти виявляють деякі специфічні властивості, зумовлені взаємним впливом карбоксильної і аміногруп.

Відношення амінокислот до нагрівання. При нагріванні a-, b-, g– та δ-амінокислот утворюються різні продукти. a-Амінокислоти при нагріванні зазнають міжмолекулярної дегідратації, утворюючи при цьому циклічний діамід — дикетопіперазин:

b-Амінокислоти при нагріванні відщеплюють молекулу аміаку, утворюючи a-, b-ненасичені кислоти:

g– та δ-Амінокислоти при нагріванні зазнають внутрішньомолекулярної дегідратації, утворюючи циклічні аміди — лактами:

Взаємодія a-амінокислот з нінгідрином. При дії нінгідрину на a-амінокислоти утворюється барвник синьо-фіолетового кольору. Реакція проходить у дві стадії. На першій стадії під дією нінгідрину відбувається окислювальне дезамінування амінокислоти та її декарбоксилування. На другій стадії реакції аміак, що утворився, реагує з еквімолекулярними кількостями звичайного та відновленого нінгідрину, утворюючи барвник синьо-фіолетового кольору:

Нінгідринова реакція використовується для якісного визначен-

ня а-амінокислот.

Окремі представники

g-Аміномасляна кислота (4-амінобутанова кислота, ГАМК) NН₂—СН₂—СН₂—СН₂—СООН. Біла кристалічна речовина (т пл. 202 °С), добре розчиняється у воді. ГАМК утворюється в живих організмах при декарбоксилуванні глутамінової кислоти. Є нейромедіатором, що бере участь в обмінних процесах головного мозку.

g-Аміномасляна кислота під назвою аміналон або гамалон широко застостосовується в медицині для лікування нервово-психічних захворювань, при ослабленні пам’яті, порушеннях мозкового кровообігу та ін. ГАМК використовується в синтезі інших лікарських препаратів, наприклад пірацетам, фенібут тощо.

ε-Амінокапронова кислота (6-аміногексанова кислота)

NH₂— СН₂— СН₂— СН₂— СН₂— СН₂— СООН. Біла кристалічна речовина (т. пл. 372 °С), легко розчиняється у воді. Застосовується в медицині як кровоспинний засіб.

Антранілова кислота (о-амінобензойна кислота). Біла

кристалічна речовина (т. пл. 145 °С), практично не розчиняється у воді. Застосовується у виробництві барвників і лікарських засобів.

п-Амінобензойна кислота (ПАБК) .

Біла кристалічна речовина (т. пл. 186 °С), мало розчинна у воді. Входить до складу фолієвої кислоти, яка виконує роль фактора росту для деяких мікроорганізмів.

Складні ефіри п-амінобензойної кислоти широко застосовуються в медицині як місцевоанестезуючі засоби, наприклад анестезин

(етиловий ефір п-амінобензойної кислоти) та новокаїн (b-діетиламіноетилового ефіру п-амінобензойної кислоти гідрохлорид) :

a-АМІНОКИСЛОТИ ЯК МОНОМЕРИ БІЛКІВ

До складу більшості білків входить близько 25 різних a-амінокислот загальної формули R—(NН₂)СН—СООН, з яких приблизно 20 присутні в кожній білковій молекулі. Основні a-амінокислоти, що входять до складу білків, подані в таблиці нижче.

В номенклатурі a-амінокислот частіше застосовують тривіальні назви: гліцин, аланін, валін, лейцин та ін. У біохімії використовують також трилітерні скорочення тривіальних назв, наприклад: гліцин Глі, аланін Ала, валін Вал. Систематичні назви для природних a-амінокислот практично не застосовують.

За хімічною природою залишку, зв’язаного з a-амінокислотним фрагментом СН(NН₂)СООН, a-амінокислоти поділяють на аліфатичні, ароматичні та гетероциклічні.

У гетероциклічних a-амінокислот проліну та оксипроліну a-амінокислотний фрагмент входить до складу гетероциклу:

У залежності від кількості -NН₂ та -СООН груп у молекулі розрізняють a-амінокислоти: моноаміномонокарбонові (гліцин, валін та ін.), моноамінодикарбонові (аспарагінова, глутамінова кислоти та їх аміди) та діаміномонокарбонові (орнітин, лізин, аргінін, гістидин).

За кислотно-основними властивостями a-амінокислоти поділяють на нейтральні (містять рівну кількість аміно- та карбоксильних груп), кислі (з додатковою карбоксильною групою) та основні (з додатковою аміногрупою).

Більшість a-амінокислот утворюється в організмі (замінні амінокислоти), але деякі a-амінокислоти організм людини нездатний синтезувати; вони надходять у складі білків, які вводяться в організм їжею.

Стереоізомерія

Усі a-амінокислоти, за винятком гліцину, містять хіральний a-вуглецевий атом та існують у вигляді пари енантіомерів.

Для позначення конфігурацій при хіральному центрі застосовують L та D–систему:

a-Амінокислоти, котрі входять до складу білків тварин і людини мають L-конфігурацію. Амінокислоти D-ряду зустрічаються лише в небілкових компонентах рослин і грибів, а також синтезуються мікроорганізмами.

Деякі амінокислоти, наприклад, ізолейцин і треонін, містять по два хіральні центри і можуть існувати у вигляді двох пар енантіомерів; у білках зустрічаються такі їх ізомери:

Використання а-амінокислот L-ряду для біосинтезу білків має найважливіше значення у формуванні їх просторової структури та виявленні біологічної активності.

Фізичні властивості

a-Амінокислоти являють собою кристалічні речовини, що не мають чітких температур плавлення та розкладаються при температурі вищій 200 °С. Вони не розчинні в неполярних органічних розчинниках, але помітно розчинні у воді. У кристалічному стані та водих розчинах амінокислоти знаходяться у вигляді біполярних іонів (цвіттер-іонів, внутрішніх солей). Можливість утворення останніх пов’язана з амфотерністю амінокислот, зумовленою наявністю в їх молекулі кислотної (СООН) і основної (NН₂) груп.

У водному розчині a-амінокислоти існують у вигляді рівноважної суміші, яка складається з цвіттер-іонів, катіонної та аніонної форм:

Положення такої рівноваги істотно залежить від рН середовища: в сильнокислому середовищі (рН 1-2) переважає катіонна форма, в сильнолужному (рН 13-14) — аніонна. Якщо розчин амінокислоти помістити в електричне поле, то в кислому середовищі молекули переміщуються до катода (катіонна форма), а в лужному — до анода (аніонна форма). Проте, для кожної амінокислоти існує характерне значення рН, при котрому молекули не переміщуються в електричному полі. При цьому значенні рН, званому ізоелектричною точкою (рІ), амінокислота знаходиться у вигляді цвіттер-іонів і в цілому електронейтральна. Ізоелектрична точка залежить від співвідношення кількостей кислих і основних груп у молекулі: рІ кислих амінокислот має значення менше 7, тому що в кислому середовищі стримується іонізація другої карбоксильної групи та, відповідно, рІ основних

амінокислот знаходиться в області більшій 7, бо в лужному середовищі стримується протонування другої аміногрупи.

Способи добування

Раніше були розглянуті загальні методи добування амінокислот, в т.ч. a-амінокислот. В процесі синтезу утворюється рацемічна суміш (±)-a-амінокислот, розділення котрої на оптичні антиподи проводять за допомогою хімічних і ферментативних методів.

Найширше використовуваний, хімічний метод розщеплення рацематів a-амінокислот грунтується на утворенні діастереомерних солей N-ацильних похідних (±)-a-амінокислот з оптично активними основами, наприклад, бруцином або стрихніном. Внаслідок різної розчинності один з діастереомерів утворює осад, а інший, більш розчинний, залишається у розчині. Розділені діастереомерні солі потім розкладають до a-амінокислот.

Ферментативний метод розщеплення оснований на гідролізі N-ацил-a-амінокислот ацилазами або складних ефірів a-амінокислот естеразами.

Гідроліз білків. a-Амінокислоти добувають шляхом лужного, кислотного або ферментативного гідролізу білків. При кислотному гідролізі відбуваються також побічні реакції, наприклад, глутамін аспарагін гідролізуються до глутамінової та аспарагінової кислот, а триптофан розкладається. Лужний гідроліз призводить до рацемізаії a-амінокислот. Тому найширше застосовується ферментативний метод гідролізу. Розділення a-амінокислот у білкових гідролізатах проводять за допомогою іонообмінної хроматографії.

Мікробіологічний синтез. Деякі мікроорганізми в процесі своєї життєдіяльності виробляють певні a-амінокислоти. Ці мікроорганізми вирощують на багатих вуглеводами середовищах — крохмалі, меласі, патоці та ін. Таким способом добувають аспарагінову та глутамінову кислоти, триптофан, лізин та ін.

Хімічні властивості a-амінокислот

Раніше були розглянуті хімічні властивості амінокислот. Також подані реакції, котрі застосовуються у аналізі a-амінокислот, синтезі пептидів або лежать в основі перетворень a-амінокислот в організмі.

Реакції по аміногрупі

Утворення N-ацильниx похідних. При взаємодії a-амінокислот ангідридами або хлорангідридами карбонових кислот утворюють N-ацильні похідні, котрі відносно легко руйнуються до вихідних a-амінокислот. У зв’язку з цим реакція ацилювання використовуєте для блокування (захисту) аміногрупи при синтезі пептидів. Як ацилюючі реагенти використовують бензоксикарбонілхлорид (а) або трет-бутоксикарбоксазид (б):

Захисну карбобензоксигрупу видаляють каталітичним гідролнолізом або дією розчину бромоводню в оцтовій кислоті на холоді:

Трет-бутоксикарбонільну групу руйнують дією трифтороцтової кислоти:

Дезамінування. Під дією азотистої кислоти a-амінокислоти перетвоорюються на відповідні a-гідроксикислоти:

Реакція застосовується в аналітичній практиці (метод Ван-Слайка). За об’ємом азоту, що виділився, визначають кількісний вміст a-амінокислоти.

В організмі a-амінокислоти піддаються окисному дезамінуванню. Реакція відбувається під дією ферментів оксидаз і окисного агенту коферменту НАД:

Трансамінування ( пергаміну вання). Процес проходить тільки в живих організмах. Реакція відбувається за участю ферментів трансаміназ і коферменту піридоксальфосфату між a-аміно- і a-кетокислотами та зводиться до взаємообміну аміно- та карбонільною групами:

Взаємодія з карбонільними сполуками. Формальдегід реагує з a-амінокислотами у водному розчині з утворенням N-гідроксиметильних похідних.

Реакцію покладено в основу кількісного визначення a-амінокислот методом формольного титрування за Серенсеном.

Інші альдегіди та кетони реагують з а-амінокислотами з утворенням основ Шиффа:

Взаємодія з фснілізотіоціапатом (реакція Едмана). При взаємодії a-амінокислот з фенілізотіоціанатом утворюються похідні З-феніл-2-тіогідантоїну. Спочатку в присутності лугу відбувається приєднання фенілізотіоціанату за аміногрупою a-амінокислоти, а потім при нагріванні продукту приєднання в присутності мінеральної кислоти відбувається циклізація з утворенням похідного фенілтіогідантоїну (ФТГ-похідного):

Реакція використовується для установлення будови пептидів (деградація за Едманом).

Взаємодія з 2,4-динітрофторбензолом (реактив Сетера). При взаємодії a-амінокислот з 2,4-динітрофторбензолом (ДНФБ) утворюється N-динітрофенільне похідне (ДНФ-похідне):

Реакція проходить за механізмом S_N. Використовується для визначення будови пептидів.

Реакції по карбоксильній групі

Утворення хелатних сполук. Характерною особливістю a-амінокислот є здатність утворювати міцні хелати комплексні солі з іона важких металів, наприклад:

Незначна розчинність та інтенсивне забарвлення хелатів міді (II) дозволяє використовувати їх в аналітичній практиці для виявлення a-амінокислот.

Утворення складних ефірів. Як карбонові кислоти a-амінокислоти при взаємодії зі спиртами утворюють складні ефіри:

Складні ефіри a-амінокислот розчинні в органічних розчинниках, леткі та добре переганяються. Ці властивості їх використовуються при розділенні суміші a-амінокислот у білкових гідролізатах. З цією метою a-амінокислоти спочатку етерифікують, а потім одержані ефіри піддають перегонці. Для розділення суміші складних ефірів a-амінокислот нині застосовують метод газо-рідинної хроматографії (ГРХ). Ця реакція служить також зручним методом захисту карбоксильної групи при синтезі пептидів.

Утворення галогенангідридів і ангідридів. Аналогічно карбоновим кислотам, a-амінокислоти утворюють галогенангідриди та ангідриди. Перед проведенням реакції спочатку захищають аміногрупу утворенням N-ацильних похідних.

Декарбоксилювання. У зв’язку з наявністю біля a-вуглецевого атома двох сильних електроноакцепторних груп карбоксильної та аміногрупи a-амінокислоти відносно легко декарбоксилюються:

Ідентифікація a-амінокислот

Нінгідринна реакція. Для виявлення a-амінокислот використовується реакція з нінгідрином, в результаті котрої утворюється продукт, забарвлений в синьо-фіолетовий колір з максимумом поглинання при 570 нм:

Нінгідриновий реактив застосовується в хроматографічному аналізі для проявлення хроматограм на папері та в тонкому шарі сорбенту, а також для кількісного колориметричного визначенні a-амінокислот.

Ксантопротеїнова реакція. Це реакція з концентрованою азотною кислотою на a-амінокислоти, що містять у своїй молекулі ароматичні цикли. В результаті останньої відбувається нітрування ароматичного циклу з утворенням нітропохідного, забарвленого у жовтий колір.

БУДОВА ПЕПТИДІВ І БІЛКІВ

Внаслідок взаємодії аміно- та карбоксильних груп a-амінокислоти здатні до поліконденсації. Поліаміди, котрі утворюються при цьому, називають пептидами:

Амідний зв’язок (—СОNН—) між двома a-амінокислотними фрагментами називається пептидним зв’язком. Атом вуглецю пептидної групи знаходиться в sp₂-гібридизованому стані. Неподільна пара електронів атома азоту вступає в спряження з p-електроном карбонільної групи, в результаті чого подвійний зв’язок С=О дещо подовжується (124 нм замість 121 нм у звичайного зв’язку), а зв’язок С- N дещо вкорочується (132 нм замість 147 нм), і, відповідно, набуває в значній мірі характеру подвійного зв’язку, обертання навколо котрого утруднене. Таким чином, електронна будова зумовлює жорстку площинну структуру пептидної групи.

Наявність пептидного зв’язку в молекулах пептидів і білків підтверджується біуретовою реакцією: при взаємодії з лужним розчином

сульфату міді утворюється фіолетове забарвлення.

У залежності від кількості амінокислотних залишків у ланцюзі пептиди поділяють на ди-, три-, тетрапептиди і т.д. Пептиди з молекулярною масою меншою ніж 10000 умовно відносять до поліпептидів, а з більшою ніж 10000—до білків. Тому між білками та пептидами важко провести чітку межу, проте білки мають складнішу структуру.

Незважаючи на величезне різноманіття білків і пептидів у природі будова їх поліпептидного (поліамідного) ланцюга однакова. Він складається з пептидних (СОNH) і метинових (СН) груп, які чергуються. На одному кінці ланцюга знаходиться амінокислота з вільною аміногрупою (N-кінцева амінокислота), а на іншому — амінокислота з вільною карбоксильною групою (С-кінцева амінокислота). Пептидні та білкові ланцюги прийнято записувати так. щоб N-кінцева амінокислота знаходилася ліворуч, а С-кінцева амінокислота праворуч:

Назви пептидів утворюються шляхом послідовного перелічування всіх амінокислот, починаючи з N-кінцевої амінокислоти, причому назви амінокислот, крім останньої, набувають суфікса -ил (-іл). За цією ж послідовністю пишуть також скорочені позначення:

Визначену послідовність a-амінокислот, які входять у певний поліпептидний ланцюг, називають первинною структурою пептиду або білка. Зміна амінокислотної послідовності призводить до порушення або зникнення біологічної активності білка. Білки відрізняються від пептидів складнішим рівнем структури. В структурній організації білків, крім первинної, розрізняють вторинну, третинну та четвертинну структури.

Вторинною структурою білків називають просторове розташування (просторове укладання) атомів основного поліпептидного ланцюга. Розрізняють два типи вторинної структури білків a-спіраль і складчасту b–структуру.

aСпіраль має просторову форму, подібну до правозакручених гвинтових східців (рис. нижче). Оскільки вона побудована зі фрагментів, які повторюються (-NН-С^a-СО), то розміри її доволі постійні. На один виток спіралі припадає приблизно 3,6 амінокислотного залишку, що відповідає лінійній відстані вздовж вісі спіралі 0,54 нм. Діаметр спіралі дорівнює 0,5 нм. Крок спіралі (відстань між однаковими атомами) становить поліпептидного ланцюга 015 нм.

У формуванні спіральної структури основну роль виконують водневі зв’язки, котрі утворюються між групами СО та NН, розділеними трьома амінокислотними залишками. Водневі зв’язки майже паралельні вісі спіралі, а оскільки в утворенні водневого зв’язку береучасть кожна група С=О та NН a-спіралі, то це робить конформацію вельми стійкою.

Найчастіше поліпептидні ланцюги в білках спіралізуються не повністю. Наприклад, залишки проліну та оксипроліну не містять атомів водню в пептидній групі, та, відповідно, не беруть участі в утворенні водневих зв’язків: поліпептидний ланцюг на цих ділянках просто зігнутий. Ізопропільна група валіну також створює стеричні перешкоди для спіралізації.

Іншим типом вторинної структури є так звана складчаста b-структура, в якій окремі поліпептидні ланцюги в зигзагоподібній конформації укладені паралельно один одному та зв’язані між собою численними водневими зв’язками. Якщо поліпептидні ланцюги мають однаковий напрямок від N– до С-кінця, то утворюється паралельна складчаста b-структура, а якщо протилежний антипаралельна. У b-структурі бокові групи амінокислотних залишків знаходяться вище та нижче умовної площини, проведеної крізь структуру.

Поліпептидний ланцюг, що має той або інший тип вторинної структури, здатний певним чином скручуватись у просторі, що і визначає третинну структуру білка, тобто загальну форму поліпептидного ланцюга. Третинна структура, крім водневих зв’язків, стабілізується іонними (між додатковими карбоксильними і аміногрупами) та ковалентними (дисульфідні містки в цистині) зв’язками, а також гідрофобною взаємодією (ван-дер-ваальсові сили притягання між неполярними боковими групами амінокислотних залишків).

Третинна структура білків формується також під впливом водного середовища клітини, що пов’язане зі здатністю води гідратувати деякі гідрофільні бокові групи амінокислотних залишків і зміщувати всередину білкової молекули гідрофобні групи.

Четвертинна структура білка властива макромолекулам, до складу яких входять декілька поліпептидних ланцюгів (субодиниць), сполучених між собою нековалентними зв’язками.

Для виявлення пептидом специфічних функцій в організмі необхідно відтворити лише його первинну структуру, а у випадку білка — відтворити всі його конформаційні особливості.

Окреме місце у розвитку хімії білків займає визначення поліпептидної структури гормонів вазопресину, окситоцину та інсуліну. В 1953 р. американський біохімік В. дю Віньо розшифрував будову гормонів гіпофізу окситоцину та вазопресину. Ним установлено, що спільним структурним елементом цих гормонів є пептид з дев’яти амінокислотних залишків з дисульфідним зв’язком між четвертим і дев’ятим з них. Ці гормони відрізняються лише двома амінокислотними фрагментами: замість лейцину та ізолейцину в окситоцині (а) вазопресин (б) містить аргінін і фенілаланін:

При цьому окситоцин викликає скорочення гладкої мускулатури, зокрема матки, а вазопресин підтримує баланс рідини в організмі.

Десять років (1943-1953 рр.) знадобилося англійському біохіміку Ф.Сенгеру для розшифрування структури гормону підшлункової залози — інсуліну. Ним установлено, що молекула інсуліну складається з двох поліпептидних ланцюгів, сполучених між собою дисульфідними містками: А-ланцюг містить 21 амінокислотний залишок і додатковий дисульфідний зв’язок, завдяки котрому інсулін у просторі утворює петлю, а Б-ланцюг ЗО залишків:

У 1963-1964 рр. було синтезовано обидва поліпептидні ланцюги інсуліну. Інсулін різних видів тварин і людини відрізняється за будовою. Ці структурні розбіжності припадають на ділянку 8-10 ланцюга А. Інсулін регулює вміст глюкози в крові, нестача його в організмі викликає цукровий діабет.

До поліпептидів відносяться деякі широко застосовувані антибіотики, наприклад, граміцидин С— циклічний декапептид, використовуваний для лікування захворювань, викликаних стрептококами, пневмококами та ін. До складу граміцидину С, крім амінокислотних залишків L-ряду, входять два залишки D-фенілаланіну:

СИНТЕЗ ПЕПТИДІВ

В основі синтезу пептидів лежить процес утворення пептидного (амідного) зв’язку між карбоксильною групою одної a-амінокислоти та аміногрупою — іншої. Спрощено цей процес можна подати такою cхемою:

Проте, через неполярну природу a-амінокислот (цвіттер-іонна структура) проведення реакції потребує дуже високих температур, що сприяє різним небажаним побічним процесам, наприклад, циклізації з утворенням дикетопшеразинів та ін. Крім того, в процесі синтезу виникають складнощі, пов’язані з необхідністю сполучати залишки a-амінокислот у певній послідовності. Наприклад, при взаємодії гліцину і аланіну можливе утворення чотирьох дипептидів:

У зв’язку з цим для проведення цілеспрямованого синтезу слід створити такі умови, за котрих одна з амінокислот взаємодіяла б своєю карбоксильною групою, а інша— аміногрупою. З цією метою здійснюють захист функціональних груп (-NН₂ та -СООН). які не беруть участі в утворенні пептидного зв’язку. Захисні групи обирають таким чином, щоб потім кожну з них незалежно одна від одної можна було б легко видалити, не руйнуючи при цьому пептидного зв’язку.

Для захисту аміногруп використовують реакцію ацилювання, найчастіше бензилоксикарбонілхлоридом або трет-бутоксикарбоксазидом. Важливою властивістю карбобензокси- та трет-бутоксикарбонільних груп є те, що вони надійно захищають хіральний центр амінокислот від рацемізації. Карбобензоксигрупу видаляють каталітичним гідрогенолізом, а трет-бутоксикарбонільну за допомогою трифтороцтової кислоти. Для захисту карбоксильної групи викорис товують реакцію етерифікації.

Крім того, з метою підвищення ефективності процесу амідування здійснюють активацію карбоксильної групи N-захищеної амінокислоти шляхом перетворення її на хлорангідрид або на змішаний ангідрид (найчастіше взаємодією з егилхлорформіатом). Нижче наведено схему синтезу дипептиду аланіл-глщину.

1. Захист аміногрупи аланіну

2. Активація карбоксильної групи Н-захищеного аланіну

3. Захист карбоксильної групи гліцину

4. Утворення пептидного зв’язку та зняття захисту

Синтез пептидів за наведеною схемою досить складний та трудоємкий.

У 1962 р. Б.Меррифілдом був запропонований більш досконалий метод добування пептидів, так званий твердофазний синтез. Суть останнього полягає в тому, що поліпептидний ланцюг доточується на твердому носії без виділення проміжних продуктів синтезу. Пептид, фіксований на носії, після кожної стадії ретельно відмивають від надлишку реагентів і побічних продуктів. Відщеплюють кінцевий продукт від носія за допомогою суміші бромоводневої та трифтороцтової кислот.

В якості твердого носія використовують зерна полімерної смоли, що містить хлорметильні (-СН₂С1) Ірупи, котрі називають якірними групами, з якими реагує карбоксильна група N-захищеної a-амінокислоти. В результаті взаємодії відбувається фіксація С-кінця майбутнього поліпептиду на поверхні носія. Аміногрупу, як правило, захищають трет-бутоксикарбонільною групою (БОК), яка легко видаляється дією трифтороцтової кислоти. Пептидний зв’язок утворюється в присутності активатора карбоксильної групи — N,N‘-дициклогексилкарбодііміду (ДЦГК) — C₆H₁₁–N=C=N–C₆H₁₁. Широке застосування цієї речовини пов’язане з легкістю добування, простотою застосування, а також швидкістю та ефективністю проходження реакції конденсації в його присутності.

Тепер твердофазний синтез пептидів проводять у спеціальних синтезаторах, де всі етапи здійснюються автоматично з запрограмованою подачею відповідних a-амінокислот.

Білки́ — складні високомолекулярні природні органічні речовини, що складаються з амінокислот, сполучених пептидними зв’язками. В однині (білок) термін найчастіше використовують для посилання на білок як речовину, коли неважливий її конкретний склад, та на окремі молекули або типи білків, у множині (білки) — для посилання на певну кількість білків, коли точний склад важливий.

Зазвичай білки є лінійними полімерами — поліпептидами, хоча інколи мають складнішу структуру. Невеликі білкові молекули, тобто олігомери поліпептидів, називаються пептидами. Послідовність амінокислот у конкретному білку визначається відповідним геном і зашифрована генетичним кодом. Хоча генетичний код більшості організмів визначає лише 20 «стандартних» амінокислот, їхнє комбінування уможливлює створення великого різномаїття білків із різними властивостями. Крім того, амінокислоти у складі білка часто піддаються посттрансляційним модифікаціям, які можуть виникати і до того, як білок починає виконувати свою функцію, і під час його «роботи» в клітині. Для досягнення певної функції білки можуть діяти спільно, і часто зв’язуються, формуючи великі стабілізовані комплекси (наприклад, фотосинтетичний комплекс).

Функції білків в клітині різноманітніші, ніж функції інших біополімерів — полісахаридів і нуклеїнових кислот. Так, білки-ферменти каталізують протікання біохімічних реакцій і грають важливу роль в обміні речовин. Деякі білки виконують структурну або механічну функцію, утворюючи цитоскелет, що є важливим засобом підтримки форми клітин. Також білки грають важливу роль в сигнальних системах клітин, клітинній адгезії, імунній відповіді і клітинному циклі.

Білки — важлива частина харчування тварин і людини, оскільки ці організми не можуть синтезувати повний набір амінокислот і повинні отримувати частину з них із білковою їжею. У процесі травлення протелітичні ферменти руйнують спожиті білки, розкладаючи їх до рівня амінокислот, які використовуються при біосинтезі білків організму або піддаються подальшому розпаду для отримання енергії.

Білки були вперше описані шведським хіміком Єнсом Якобом Берцеліусом в 1838 році, який і дав їм назву протеїни, від грец. πρώτα — «першорядної важливості». Проте, їхня центральна роль в життєдіяльності всіх живих організмів була виявлена лише у 1926 році, коли Джеймс Самнер показав, що фермент уреаза також є білком. Секвенування першого білка — інсуліну, тобто визначення його амінокислотної послідовності, принесло Фредерику Сенгеру Нобелівську премію з хімії 1958 року. Перші тривимірні структури білків гемоглобіну і міоглобіну були отримані за допомогою рентгеноструктурного аналізу, за що автори методу, Макс Перуц і Джон Кендрю, отримали Нобелівську премію з хімії 1962 року.

Історія дослідження

Антуан Франсуа де Фуркруа, основоположник дослідження білків

Білки були виділені в окремий клас біологічних молекул у 18 столітті в результаті робіт французького хіміка Антуана де Фуркруа та інших учених, в яких було відмічено властивість білків коагулювати під час нагрівання або під дією кислот. У той час були досліджені такі білки, як альбумін з яєчних білків, фібрин з крові і глютен із зерна пшениці. Голландський хімік Герріт Мульдер провів аналіз складу білків і виявив, що практично всі білки мають однакову емпіричну формулу. Мульдер також визначив продукти руйнування білків — амінокислоти — і для однієї з них (лейцину) майже точно визначив молекулярну масу — 131 дальтон.

Мульдеру, зокрема, належить перша модель хімічної будови білків, запропонована ним у 1836 році. Виходячи з теорії радикалів, він сформулював поняття про мінімальну структурну одиницю у складі білків. Саме ця одиниця зі складом C₁₆H₂₄N₄0₅ отримала пізніше назву «протеїну» (Pr), а концепція — теорії протеїну. Сам термін «протеїн», що в сучасному розумінні означає білок більшістю європейських мов, був запропонований у 1838 році співробітником Мульдера Якобом Берцеліусом. Перевірка цієї моделі привернула увагу відомих хіміків свого часу, таких як Юстус Лібіх і Жан-Батист Дюма. Під впливом нових даних теорія протеїну декілька разів корегувалася, але все ж до кінця 1850-х років від неї довелося повністю відмовитися.

До кінця 19 століття вже було досліджено більшість амінокислот, що входять до складу білків. У 1894 році німецький фізіолог Альбрехт Коссель висунув теорію, що амінокислоти є головними структурними елементами білків. На початку 20-го століття німецький хімік Еміль Фішер експериментально доказав, що білки збудовані з залишків амінокислот, сполучених пептидними зв’язками. Також він здійснив перші аналізи амінокислотного складу білків та дав пояснення протеолізу. Після 1926 року також стала зрозумілою центральна роль білків в організмах, коли американський хімік Джеймс Самнер (згодом — лауреат Нобелевскої премії) показав, що фермент уреаза також є білком^[7].

Вивченню білків перешкоджала складність їхнього виділення. Тому перші дослідження білків проводилися з використанням тих поліпептидів, які могли бути очищені у великій кількості, тобто білків крові, курячих яєць, різних токсинів і травних/метаболічних ферментів, які можна було виділити в місцях забою худоби. У кінці 1950-х років компанія Armour Hot Dog Co. змогла очистити кілограм бичачої панкреатичної рибонуклеази А, яка стала експериментальним об’єктом для багатьох учених.

Ідея про те, що вторинна структура білків утворюється в результаті формування водневих зв’язків між амінокислотами, була висловлена Вільямом Астбері в 1933 році, але Лайнус Полінг вважається першим ученим, який зміг успішно передбачити вторинну структуру білків. Пізніше Волтер Каузман, спираючись на роботи Кая Ліндерстрем-Ланга, зробив вагомий внесок до розуміння законів утворення третинної структури білків і ролі в цьому процесі гідрофобних взаємодій. У 1949 році Фред Сенгер визначив амінокислотну послідовність інсуліну, продемонструвавши таким способом, що білки — це лінійні полімери амінокислот, а не розгалужені (як у деяких цукрів) ланцюжки, колоїди або циклоли.

Перші структури білків, що ґрунтуються на методах рентгеноструктурного аналізу на рівні окремих атомів, були отримані в 1960-х роках, а за допомогою ЯМР-спектроскопії — в 1980-х роках. У 2006 році Банк даних білків (Protein Data Bank) містив приблизно 40 000 структур білків. У наш час кріоелектрона мікроскопія великих білкових комплексів за роздільною здатністю наближається до атомного рівня.

Особливістю досліджень білків початку 21-го століття є одночасне отримання даних про білковий склад цілих клітин, тканин або організмів — протеоміка. У результаті необхідності аналізу цих даних та росту можливостей обчислювальних технологій активно розвиваються методи біоінформатики аналізу та порівняння білкових структур та обчислювальні методи передбачення структури білків, наприклад, методи молекулярної динаміки, призначені замінити в майбутньому експериментальне визначення білкових структур.

Схематичне зображення утворення пептидного зв’язку. Подібна реакція відбувається на рибосомі — молекулярній машині для складання білків.

Молекули білків є лінійними полімерами, що складаються з α-L-амінокислот (які є мономерами цих полімерів) і, в деяких випадках, з модифікованих основних амінокислот (щоправда модифікації відбуваються вже після синтезу білка на рибосомі). Для позначення амінокислот в науковій літературі використовуються одно- або трьохбуквені скорочення. Хоча на перший погляд може здатися, що використання «всього» 20 основних типів амінокислот обмежує різноманітність білкових структур, насправді кількість варіантів важко переоцінити: для ланцюжка всього з 5 амінокислот воно становить вже більше 3 мільйонів, а ланцюжок з 100 амінокислот (невеликий білок) може бути представлений більш ніж у 10¹³⁰ варіантах (для порівняння — кількість атомів у Всесвіті оцінюється приблизно у 10⁸⁰). Поліпептидні ланцюжки завдовжки від двох до кількох десятків амінокислотних залишків зазвичай називають пептидами, при більшому ступені полімеризації — власне білками або протеїнами, хоча цей поділ вельми умовний.

Основні рівні структурної організації білків

Окрім послідовності амінокислот поліпептиду (первинної структури), для функціонування білків украй важлива тривимірна структура, яка формується в процесі згортання білків (або фолдинга, від англ. folding). Ця структура утримується в результаті взаємодії структур нижчих рівнів. Тривимірна структура білків за нормальних природних умов називається нативним станом білка. Хоча чимало білків здатні згортатися та приймати нативний стан самостійно, завдяки властивостям свого поліпептидного ланцюжка, інші вимагають допомоги інших білків, молекулярних шаперонів. Виділяють чотири рівні структури білків:

Первинна структура — пептидна або амінокислотна послідовність, тобто послідовність амінокислотних залишків у пептидному ланцюжку. Саме первинна структура кодується відповідним геном і найбільшою мірою визначає властивості сформованого білка.

Вторинна структура — локальне впорядковування фрагменту поліпептидного ланцюжка, стабілізоване водневими зв’язками і гідрофобними взаємодіями. Найпоширеніші типи вторинної структури білків включають^]: α-спіралі (спіраль, що має 4 залишки на виток, стабілізована водневими зв’язками між пептидними групами з кроком у 4 ланки) і β-листи (кілька зигзагоподібних поліпептидних низок, в яких водневі зв’язки утворюються між відносно віддаленими ділянками ланцюжка або між різними ланцюжками, а не між близько розташованими пептидними групами, як це має місце для α-спіралі). Інші елементи вторинної структури включають π-спіралі (спіралі з кроком водневих зв’язків у 3 ланки), $3_{{10}}$ -спіралі (спіралі з кроком водневих зв’язків у 5 ланок), повороти, невпорядковані фрагменти та інші.

Приклади зображення тривимірної структури білків або їхніх фрагментів. Показаний білок — триозофосфатізомераза — складається з восьми α-спіралей, розташованих на зовнішній поверхні й восьми паралельних β-листів всередині Ліворуч — «паличкова» модель, із зображенням всіх атомів і зв’язків між ними. Кольорами позначені різні атоми. В середині — зображення елементів вторинної структури — α-спіралей і β-листів. Кольорами позначені типи елементів. Праворуч — контактна поверхня білка, на підставі ван дер Ваальсових радіусів атомів. Кольорами позначені електростатичні властивості поверхні.

Будова і склад

Залежно від структури білки поділяють на прості (протеїни) та складні (протеїди). Останні, крім білка, містять у своїй структурі хімічно зв’язану з ним простетичну групу – небілкову частину молекули. За природою простетичної групи протеїди ділять на ліпопротеїди, нуклеопротеїди, глікопротеїди, хромопротеїди, фосфопротеїди та мета металопротеїди.

Ліпопротеїди в якості простетичної групи містять ліпіди, нуклеопротеїди – нуклеїнові кислоти, глікопротеїди – вуглеводи, хромопротеїди – пігменти, фосфопротеїди — фосфорну кислоту, металопротеїди – метали.

Існують також складні білкові комплекси, до складу котрих водночас входять білки, ліпіди та вуглеводи, звані гліколіпопротеїдами. Вони містяться в сполучній тканині, клітинних стінках бактерій та ін. У залежності від просторової форми молекул білки поділяють на глобулярні та фібрилярні. Глобулярні білки мають сферичну або еліпсоїдну форму, фібрилярні – складаються з витягнутих ниткоподібних макромолекул, які називають протеноїдами.

Глобулярні білки (альбумін, глобулін) малостійкі до дії температури, кислот і лугів, а фібрилярні (білки волосся, нігтів, епідермісу; сполучної, кісткової, хрящової тканин та ш.) вельми стійкі. Під впливом багатьох факторів (підвищена температура, зміна рН середовища, УФ- і у-випромінювання та ін.) відбувається руйнування просторової форми білків при збереженні первинної структури. Цей процес називають денатурацією білка. Денатурація є, як правило, оборотним процесом і призводить до втрати біологічних функцій білків. Прикладом теплової денатурації є «зсідання» яєчних білків при варці яєць. При денатурації відбувається розрив водневих зв’язків, які стабілізують просторову форму білка. Денатурований білок втрачає розчинність, у результаті чого первісна просторова форма його не може бути відновленою. Денатурацію може також викликати утворення нерозчинних солей білків. Це відбувається при отруєнні солями важких металів (ртуті, свинцю та ін.). Як протиотруту в таких випадках застосовують білки з підвищеним вмістом кислотних груп, наприклад, яєчний альбумін. Виконуючи роль конкурента, ці білки зв’язують метали з утворенням нерозчинних солей, котрі виводяться з організму.

Залежно від структури білки поділяють на прості (протеїни) та складні (протеїди). Останні, крім білка, містять у своїй структурі хімічно зв’язану з ним простетичну групу небілкову частину молекули. За природою простетичної групи протеїди ділять на ліпопротеїди, нуклеопротеїди, глікопротеїди, хромопротеїди, фосфопротеїди та мета металопротеїди.

Норми білка в харчуванні. Повноцінні та неповноцінні білки. Замінні і незамінні амінокислоти. Азотовий баланс.

Білки складають 18-20 % від загальної маси і близько 50 % сухої маси тіла людини. В організмі масою 70 кг є 12-15 кг білків. На відміну від вуглеводів і жирів, в організмі немає резервних білків. У той же час білки відіграють надзвичайно важливі функції в організмі ( пластична, каталітична, енергетична, деякі білки проявляють властивості гормонів, виконують захисну функцію і т.п.). Це означає, що білки дуже динамічні структури, в організм вони постійно надходять із харчовими продуктами, синтезуються, розкладаються, перетворюються в інші речовини.

Організм може тривалий час обходитись без жирів або вуглеводів, але виключення із раціону білків навіть на короткий час призводить до значних порушень, а іноді – до незворотних патологічних змін. За добу в організмі людини оновлюється близько 400 г білків, тобто стільки розпадається до амінокислот і стільки ж синтезується. Частина амінокислот, утворених при розпаді білків, використовується для біосинтезу нових білків із поповненням енергії у вигляді АТФ або перетворюється в непептидні речовини (аміни, гем, тироксин, холін, таурин тощо). Це означає, що для поповнення втрачених під час метаболізму амінокислот організм повинен постійно одержувати білки з продуктами харчування. Під час травлення в шлунково-кишковому тракті білки розпадаються до амінокислот. Утворені амінокислоти використовуються для синтезу білків організму, а також небілкових азотових речовин.

Оскільки на частку білків і вільних амінокислот припадає більше 95% всього азоту в організмі, то за азотовим балансом, тобто різницею між кількістю азоту, що надходить з їжею, і кількістю азоту, що виводиться з організму (переважно у вигляді сечовини), можна оцінювати загальний білковий обмін. Розрізняють три види азотового балансу. В дорослої здорової людини при нормальному харчуванні спостерігається азотова рівновага (нульовий азотовий баланс), тобто кількість азоту, що надходить, дорівнює кількості, що виділяється з організму.

Позитивний азотовий баланс буває під час росту організму, вагітності, одужання після виснажливих захворювань. За цих умов кількість азоту, що надходить в організм, більша за кількість азоту, що виводиться з організму, тобто загальна білкова маса в організмі збільшується.

Негативний азотовий баланс вказує на збільшення кількості азоту, що виводиться з організму, порівняно з надходженням. Він спостерігається в похилому віці, при виснажливих захворюваннях, білковому або повному голодуванні. В цих випадках загальна маса білків в організмі зменшується.

Повне виключення білка з їжі призводить до швидкого розвитку негативного азотового балансу, що виражається щоденною втратою близько 4 г азоту, тобто 25 г білка. Це означає, що за умов виключення білка з їжі та при достатньому надходженні всіх інших харчових продуктів за добу організм тратить близько 25 г тканинних білків. У разі повного голодування втрата білків ще більша, оскільки в такому випадку амінокислоти, що утворюються при розпаді тканинних білків, будуть використовуватися і для забезпечення енергетичних потреб організму. Максимальна кількість азоту, що екскретується за цих умов, складає близько 20 г на день, тобто розкладається близько 125 г білка. Тривале голодування, як і повне голодування, неодмінно призводить до смерті. Наслідки білкового голодування: порушення фізичної і психічної активності, зниження вмісту білків плазми, що спричиняє порушення колоїдно-осмотичної рівноваги, набряки, зниження синтезу білків м’язів, недокрів’я, ослаблення діяльності серця, порушення імунітету.

Як було сказано вище, у дорослої людини при нормальному харчуванні має місце азотова рівновага. Якщо в умовах азотової рівноваги підвищити кількість білка в їжі, то азотова рівновага незабаром відновиться, але вже на вищому рівні. Таким чином, азотова рівновага може встановлюватись при значних коливаннях вмісту білка в їжі. Мінімальна кількість білка в раціоні, достатньому за калорійністю, при якій підтримується азотова рівновага, складає 30-50 г. Оптимальним для підтримання нормального стану дорослого організму є споживання 80-100 г повноцінного білка (при важкій фізичній роботі – 100-150 г). У США потреба білка вираховується з розрахунку 1 г на кілограм маси людини.

Висока швидкість синтезу білка точно зрівноважується швидкістю його розпаду. Регуляція обміну білків здійснюється групою гормонів. Зокрема, інсулін, соматотропін, тироксин, чоловічі й жіночі статеві гормони у фізіологічних умовах стимулюють біосинтез білків. Глюкокортикоїди гальмують синтез білків у більшості тканин, за винятком печінки, і стимулюють використання амінокислот для глюконеогенезу.

Фактори, що впливають на білковий обмін:

1) вік;

2) фізіологічний стан організму;

3) нервово-гормональний статус;

4) фізичне навантаження;

5) характер харчування (кількісний і якісний склад білків їжі, а також надходження з нею вуглеводів, ліпідів, вітамінів, мінеральних солей).

Фізіологічна потреба у білку

Наукове обґрунтування фізіологічної потреби у білку відбувається за азотистим балансом. Якщо людина знаходиться на безбілковому харчовому раціоні, то втрати азоту з сечею, калом та потом становлять 85 мг на 1 кг маси тіла. Тоді мінімальна норма споживання білка буде: (85 мг o 6,25) = 0,5 г на 1 кг маси тіла. Така кількість білків забезпечить рівновагу між процесами синтезу та розпаду їх в організмі людини. Враховуючи рівень засвоюваності білків, стресові ситуації, фізичні навантаження, безпечний рівень споживання білків становить 0,75 г на 1 кг маси тіла, а максимальний – 1,1 г. Таким чином:

мінімальна потреба у білках – 0,5 г на 1 кг маси тіла	оптимальна потреба у білках – 0,75 г на 1 кг маси тіла	максимальна потреба у білках – 1,1 г на 1 кг маси тіла
забезпечує азотисту рівновагу і є нижньою межею безпеки, яка задовольнить потребу у білку для 60 % населення.	забезпечує поправку на стресову ситуацію (20 %) і забезпечує засвоюваність білків (30 %).	забезпечує витрати на фізичну працю (40 %), є верхня межа безпеки і задовольнить потребу у білку для 95 % населення. Для спортсменів, військовослужбовців потреба у білку – 2 г на 1 кг маси тіла, для підлітків та чоловіків у період виконання ними репродуктивної функції – 2,5-3 г.

Потреба у білках залежить від енерговитрат і становить при енерговитратах більше 3000 ккал – 11 %, 2500-3000 ккал – 12 %, 2000-2500 ккал – 13 % від енергоцінності раціону.

Травлення білків у шлунку

Травлення білків відбувається в шлунку і кишечнику. В шлунку розщепленню білків сприяють два чинники:

1) протеолітичні ферменти;

2) кисле середовище.

Основним ферментом шлунка є пепсин, оптимальне значення рН якого знаходиться в межах 1,5-2,5. При зростанні рН дія пепсину слабшає, а при рН 5-6 – він просто не діє. Кисле рН у шлунку створюється завдяки соляній кислоті. Вона утворюється в обкладкових клітинах шлункових залоз і секретується в порожнину шлунка, де її концентрація сягає 0,16 М. За рахунок цього шлунковий вміст має значення рН у межах 1,5-2,5. Соляна кислота в шлунку стимулює перетворення неактивного пепсиногену в активний пепсин, створює оптимальне рН для його дії, викликає набухання білків. Крім того, вона запобігає розвитку в шлунку мікрофлори, стимулює вироблення секретину та прискорює всмоктування заліза. При гастритах і зменшенні кислотності шлункового соку гнилісні процеси в шлунку можуть бути причиною неприємного запаху з рота у хворих.

Пепсин виділяється основними клітинами залоз шлунка в неактивній формі, у вигляді проферменту (попередника пепсину) – пепсиногену. Останній під впливом соляної кислоти перетворюється в активний протеолітичний фермент – пепсин. Перетворення пепсиногену в пепсин може відбуватися і під впливом самого пепсину, тобто автокаталітично:

$Описание: C:\Users\admin\Desktop\011113\06. Катаболізм простих білків..files\image002.jpg$

За допомогою НСl перетворення здійснюється повільно, тоді як автокаталітичний процес – дуже швидко. Таким чином, соляна кислота ініціює утворення активного пепсину, який швидко за автокаталітичним механізмом спричинює утворення решти пепсину із пепсиногену. Активний пепсин утворюється за рахунок відщеплення від пепсиногену пептидного ланцюга із 42 амінокислотних залишків.

У залишеній частині молекули відбувається конформаційне перетворення і утворюється активна форма пепсину. Пепсин частково всмоктується в кров і через нирки виділяється в сечу (уропепсин), активність його іноді визначається в клініці, особливо в педіатрії, для оцінки секреторної діяльності слизової шлунка. Зменшення секреції шлункових залоз супроводжується зниженням активності уропепсину, і, навпаки, гіперсекреція, зокрема виразкова хвороба шлунка, призводить до підвищення активності уропепсину.

Іноді в клініці визначають активність пепсину в шлунковому соці. Це дозволяє відрізнити анацидний стан (відсутність НСl при наявності пепсину) від справжньої ахілії, коли слизова шлунка не виробляє ні соляної кислоти, ні пепсину. Визначення концентрації соляної кислоти в шлунковому соку також використовується для діагностики деяких захворювань шлунка. Для дослідження секреції соляної кислоти спершу відкачують вміст шлунка за допомогою зонда, після цього підшкірно вводять гістамін, який стимулює секрецію соляної кислоти. Наступні проби шлункового соку, взяті кожні 15 хв з часу введення гістаміну, дають змогу виключити або підтвердити діагноз ахілії чи анацидного гастриту. Висока кислотність буває при виразці шлунка і дванадцятипалої кишки. Низька кислотність характерна для гіпоацидних гастритів. Повна відсутність кислоти (анацидітас) спостерігається при атрофічних гастритах. За цих умов, як правило, відсутній і пепсин, тобто не утворюється шлунковий сік (ахілія). Через відсутність внутрішнього фактора Кастла, що є необхідним для всмоктування вітаміну В₁₂, ахілія нерідко супроводжується анемією.

Різні білки розщеплюються пепсином з неоднаковою швидкістю. Зовсім не перетравлюються пепсином кератин, колаген. Легко розщеплюються м’язові білки (міоген, міозин), а також альбуміни і глобуліни. Пепсин гідролізує пептидні зв’язки, утворені аміногрупами ароматичних амінокислот (фенілаланін, тирозин), а також лейцину і глутамінової кислоти. Білки їжі в шлунку розщеплюються до поліпептидів і коротких пептидів.

У шлунку діють пепсини А, В, С (гастриксин), які утворюються з пепсиногену I та II і проявляють оптимальну активність при різних значеннях рН – від 1,0 до 3,0.

У дітей грудного віку залозами слизової шлунка виробляється фермент хімозин (ренін). Синтезується він у вигляді прохімозину, який при рН 5,0 перетворюється в активну форму. Хімозин перетворює казеїноген молока у нерозчинну кальцієву сіль казеїну за рахунок відщеплення пептиду. Такий комплекс затримується довше у шлунку, що сприяє його розщепленню ферментом; рН-оптимум хімозину лежить в межах 3,5-5,0. Він активується іонами кальцію.

Шлунковий сік – безбарвна, прозора, слабоопалесціювальна рідина з питомою густиною 1,002 – 1,007 г/см³та сильнокислою реакцією (рН 1,5 – 2,5), до складу якої входить вода (99 – 99,5%), ферменти(пепсин, гастриксин тощо), муцин, гідрохлоридна кислота та інші речовини.

Надзвичайно важливе клінічне значення має вивчення кислотоутворювальної функції шлунка, яке складається з двох аспектів: а) визначення концентрації вільної гідрохлоридної кислоти і загальної кислотності; б) отримання інформації про дебіт-годину гідрохлоридної кислоти.

Кисла реакція шлункового соку зумовлена наявністю гідрохлоридної кислоти (НСl), кислореагуючих фосфатів, а при патологічних процесах – молочної кислоти і летких жирних кислот.Сукупність усіх кислореагуючих речовин шлункового соку називають загальною кислотністю.

Загальну кислотність шлункового соку чисельно виражають у мілілітрах 0,1 н. Розчину натрію гідроксиду, необхідного для нейтралізації 100 мл шлункового соку в присутності індикатора фенолфталеїну (інтервал переходу рН 8,2 – 10).

Вільну гідрохлоридну кислоту в шлунковому соку вимірюють у мілілітрах 0,1 н. розчину натрію гідроксиду, затраченого на нейтралізацію шлункового соку в присутності індикатора 2,4-диметиламіноазобензолу (рН переходу 2,9 – 4).

Підвищення вмісту гідрохлоридної кислоти та загальної кислотності (гіперхлоргідрія) спостерігають при виразковій хворобі шлунка, гіперацидному гастриті.

Зниження вмісту вільної гідрохлоридної кислоти та загальної кислотності (гіпохлоргідрія) спостерігають при гіпоацидному гастриті, раку шлунка.

Значне зниження загальної кислотності та повна відсутність гідрохлоридної кислоти (ахлоргідрія) вказують на рак шлунка, хронічний гастрит.

Відсутність гідрохлоридної кислоти та пепсину (ахілія) виявляють при злоякісній анемії, раку шлунка.

Травлення білків у кишечнику

Травні соки кишечника містять протеолітичні ферменти підшлункової залози і власне кишечника. Підшлункова залоза секретує проферменти: трипсиноген, хімотрипсиноген, проеластазу. Сік підшлункової залози являє собою слабколужну рідину (рН 7,2-7,8) завдяки вмісту гідрокарбонату натрію.

Під впливом ферменту кишечника ентерокінази (ентеропептидази) трипсиноген перетворюється в трипсин. Це відбувається за рахунок гідролітичного відщеплення від трипсиногену гексапептиду. Перетворення трипсиногену в трипсин здійснюється автокаталітичним шляхом. Всі інші проферменти переходять в активну форму під впливом трипсину.

Трипсин і хімотрипсин – подібні за структурою та функцією ферменти, що каталізують розщеплення поліпептидних молекул у ділянці пептидних зв’язків: трипсин – у ділянці лізину та аргініну, хімотрипсин – карбоксильних груп тирозину та фенілаланіну, ендопептидази.

Підвищення активності трипсину та хімотрипсину в сироватці крові спостерігають при гострому панкреатиті. Менш виражене підвищення активності ферменту – при хронічному панкреатиті.

Зниження активності трипсину і хімотрипсину в крові виявляють при карциномі підшлункової залози, порушенні всмоктування в кишках.

Визначення фекального трипсину і хімотрипсину є прямим методом кількісної оцінки панкреатичних ферментів. він може мати деяке значення як скринінг-тест при захворюваннях підшлункової залози. Визначення вмісту хімотрипсину в калі доцільно проводити при стеатореї та під час скринінгу кістозного фіброзу.

Трипсин, хімотрипсин і еластаза як ендопептидази походять від одного попередника. Дія трипсину спрямована на пептидні зв’язки, утворені карбоксильними групами лужних амінокислот (аргінін, лізин) та аміногрупами інших амінокислот. Хімотрипсин переважно гідролізує ті пептидні зв’язки, які утворені карбоксильними групами ароматичних амінокислот (тирозин, фенілаланін, триптофан) й аміногрупами інших амінокислот. Інакше, за субстратною специфічністю хімотрипсин подібний до пепсину. Саме тому при ахілії або резекції шлунка білкова їжа буде перетравлюватись до кінця. Фермент еластаза має ширшу субстратну специфічність, але найкраще гідролізує пептидні зв’язки, що утворені гліцином, серином, аланіном та проліном.

У травленні білків у тонкому кишечнику активна участь належить і екзопептидазам: карбоксипептидазам, що синтезуються в підшлунковій залозі й активуються трипсином. Розрізняють карбоксипептидази А і В. Вони відщеплюють від поліпептидів С-кінцеві амінокислоти. Карбоксипептидаза А (містить іон цинку) відщеплює від поліпептидного ланцюга крайні ароматичні амінокислоти, а карбоксипептидаза В відщеплює лужні амінокислоти (аргінін, лізин). До амінопептидаз відносяться аланінамінопептидаза і лейцинамінопептидаза, які відщеплюють відповідно з N-кінця аланін чи лейцин. Завершують гідролітичне розщеплення білків до амінокислот дипептидази, які розщеплюють окремі дипептиди. Наприклад, гліцилгліциндипептидаза розщеплює дипептид до 2-х молекул гліцину. Важливо, що основні процеси гідролізу білків (як і вуглеводів та жирів) перебігають на поверхні слизової оболонки кишечника (так зване пристінкове, або мембранне травлення). У мембранному травленні пептидів беруть участь ферменти екзопептидази (карбоксипептидази, амінопептидази) і дипептидази.

Підшлунковий сік (1,5 – 2 л) – безбарвна прозора рідина лужної реакції (рН = 8 – 8,5) містить велику кількість ферментів, які гідролізують білки, жири, вуглеводи.

Секреція підшлункового соку починається через 2-3 хвилини після вживання їжі (триває протягом 4-10 годин (залежно від характеру їжі). Цей процес починається з подразнень їжею рецепторів ротової порожнини та дії умовно-рефлекторних подразників. Активізують підшлункову секрецію 1. Харчова кашка, яка подразнює нервові закінчення 12-палої кишки. 2. Особлива речовина – секретин, що утворюється в стінці 12-палої кишки під дією соляної кислоти шлункового соку. Центр регуляції підшлункової секреції міститься у довгастому мозку.

Сік підшлункової залози діє найсильніше бо він має основні ферменти трипсин і хімотрипсин перетворюють білки до амінокислот. Трипсин утворюється з трипсиногону після його активації ентерокіназою – ферментом, який виробляється 12-палою кишкою. З вуглеводних ферментів найважливішою є амілаза, яка гідролізує крохмаль до дисахаридів; мальтаза перетворює дисахариди на моносахариди (глюкозу), лактаза розщеплює цукор молока до моносахаридів, нуклеаза діє на нуклеїнові кислоти; ліпаза розщеплює жири на гліцерин і жирні кислоти (цьому допомагає жовч, яка емульгує жири).

Кишковий сік на відміну від соку підшлункової залози мутнуватий, бо вміщує клітини злущеного епітелію та інші елементи. В ньому знаходяться ферменти пептидази, що розщеплюють поліпептиди до амінокислот, а також вуглеводні ферменти: сахараза, лактоза, мальтаза й ентерокіназа та ліпаза. (Ентерокіназа – названа Павловим „ферментом ферментів”, відкрита Шеповальниковим в лабораторії Павлова в 1899 році.).

За добу кишкового соку виділяється близько 3 л. Секреція кишкових залоз збуджується внаслідок механчної і частково хімічної дії хімусу на стінку кишки.

Всмоктування продуктів розщеплення білків

Амінокислоти швидко всмоктуються в мікроворсинках тонкого кишечника. Але при наявності фруктози і галактози всмоктування їх сповільнюється. Всмоктування амінокислот – активний процес і вимагає енергії АТФ, за механізмом подібне до всмоктування глюкози і тому залежить від транспорту в клітини натрію.

Всмоктування амінокислот здійснюється за допомогою спеціальних транспортних систем. Транспорт амінокислот, подібно до транспорту моносахаридів, є вторинним активним і для його здійснення необхідний градієнт іонів Na⁺, що створюється Na⁺, К⁺-АТФ-азою мембрани епітелію кишечника. Існує декілька переносників для амінокислот: 1)нейтральних з коротким вуглецевим ланцюгом; 2) нейтральних з довгим ланцюгом; 3) основних; 4) кислих; 5) проліну. Амінокислоти кожної групи конкурують між собою за зв’язування з відповідним переносником. Під час транспорту амінокислот через мембрану ентероцитів іон Na⁺ входить разом з амінокислотами всередину клітини. Звідси натрій відкачується за допомогою Na⁺, К⁺-АТФази, а амінокислоти залишаються всередині клітини.

Гальмують транспорт амінокислот через мембрани ентероцитів галактоза та фруктоза.

Описана ще одна система транспорту амінокислот через плазматичну мембрану ентероцитів та інших клітин (мозку, нирок) – гамма-глутамільний цикл. У ньому беруть участь шість ферментів, з яких один (гамма-глутамілтрансфераза) знаходиться в мембрані, а інші – в клітині. Перенесення амінокислоти здійснюється гамма-глутамілтрансферазою. Кофактором цього ферменту є трипептид глутатіон (гама-глутамілцистеїнілгліцин). Під впливом гамма-глутамілтрансферази відбувається реакція між амінокислотою і глутатіоном.

Інші п’ять ферментів циклу забезпечують відщеплення в цитоплазмі клітини амінокислоти від гамма-глутаміну та ресинтез глутатіону.

У кишечнику відбувається всмоктування невеликої кількості дипептидів і негідролізованих білків. Вони всмоктуються шляхом піноцитозу і всередині клітин гідролізуються лізосомальними протеазами. Мізерна кількість білків, що надходить з кишечника в кров, виводиться нирками (пепсин, підшлункова амілаза) або розкладається протеазами крові. Проникність слизової кишечника у новонароджених вища, ніж у дорослих. Це має фізіологічне значення, бо в кров дитини можуть потрапляти антитіла молока. В декотрих випадках у новонароджених із кишечника в кров можуть всмоктуватися і нативні білки, що призводить до сенсибілізації організму і може служити причиною ідіосинкразії до білкової їжі.

Травлення білків регулюється системою гормоноподібних речовин, які виробляються в клітинах травного тракту. Більшість із цих речовин відноситься до пептидів. Тільки гістамін є аміном гістидину. Гормоноїди виділяються під впливом їжі і через кров проявляють свою регуляторну дію. Так, надходження їжі в шлунок стимулює виділення гістаміну і гастрину, які зумовлюють секрецію пепсину і соляної кислоти, необхідних для травлення білків у шлунку. Надходження їжі в дванадцятипалу кишку служить стимулом для виділення ентерогастрину, який гальмує секрецію шлункового соку.

Слизова тонкої кишки у відповідь на надходження сюди їжі відповідає виділенням цілої групи регуляторів (секретин, холецистокінін-панкреозимін, хімоденін, ентерокінін), які проникають у кров і забезпечують швидке виділення травних соків підшунковою залозою та слизовою кишки. Порушення секреції регуляторів супроводжується змінами процесів травлення їжі.

В основі патології травлення білків знаходяться нестача травних ферментів і відповідних їм коферментів та порушення процесів всмоктування в кишечнику. Нестача соляної кислоти і пепсину в шлунку істотно не відбивається на травленні білків, оскільки в кишечнику є достатньо протеолітичних ферментів, що компенсують її. Однак дефіцит соляної кислоти призводить до розвитку мікробної флори та гниття у шлунку. При нестачі протеаз підшлункової залози спостерігаються неперетравлення білків, виділення їх з калом та відносне білкове голодування. Неперетравлені білки зазнають змін під дією мікрофлори товстого кишечника– гниття, що супроводжується утворенням отруйних речовин.

Перетворення амінокислот під дією мікрофлори товстого кишечника (гниття білків у кишечнику)

Неперетравлені білки та АК, які не всмокталися, надходять у товстий кишечник, де під впливом ферментів мікрофлори утворюють продукти, не характерні для обміну амінокислот в організмі людини і навіть отруйні. Інтенсивність процесу в нормі невелика, але може значно зростати при порушенні діяльності кишечника. Цей процес називається гниттям білків.

Майже нетоксичними продуктами є аміни, кето- і оксикислоти, спирти. Зокрема, аміни утворюються при декарбоксилюванні ароматичних амінокислот (фенілетиламін із фенілаланіну, тирамін із тирозину, триптамін із триптофану), діамінокислот (кадаверин із лізину, путресцин із орнітину, агматин із аргініну). У слизовій кишечника аміни піддаються окиснювальному дезамінуванню із звільненням аміаку. Кадаверин, путресцин і агматин переважно утворюються при гнитті трупа (трупні отрути). При розпаді сірковмісних амінокислот метіоніну і цистеїну в кишечнику утворюються гази, сірководень (Н₂S) і метилмеркаптан (СН₃SH).

Ферменти мікроорганізмів каталізують також розпад бокових ланцюгів триптофану і тирозину з утворенням токсичних продуктів – крезолу і фенолу, скатолу й індолу.

Неприємний запах вмісту товстої кишки зумовлений частково скатолом та індолом. Невеликі кількості цих речовин всмоктуються у товсту кишку, потрапляють у печінку, де знешкоджуються, перетворюючись у нетоксичні водорозчинні сполуки, які виводяться із сечею. Індол і скатол піддаються у печінці гідроксилюванню і наступній кон’югації з сірчаною чи глюкуроновою кислотами. Фенол і крезол відразу знешкоджуються в реакції кон’югації.

Донором залишку сірчаної кислоти служить 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфат (ФАФС), а донором глюкуронової кислоти – уридиндифосфоглюкуронова кислота (УДФГК). Ферменти глюкуронілтрансферази і сульфотрансферази каталізують перенесення залишків глюкуронової та сірчаної кислоти на індоксил, скатоксил, фенол, крезол. Утворені парні сполуки (ефіросірчані кислоти та глюкуроніди) виводяться із сечею. Калієва сіль індоксилсірчаної кислоти має назву індикан. Рівень індикану в сечі розглядається як показник інтенсивності процесів гниття в кишечнику і швидкості реакцій знешкодження у печінці. В нормальній сечі індикан міститься у незначній кількості, що не виявляється звичайними якісними реакціями. Індиканурія спостерігається при інтенсивному гнитті білкових речовин у кишечнику (коліт, закрепи, непрохідність кишечника, рак, абсцес, перитоніт).

Із фенілаланіну в товстій кишці в невеликій кількості утворюється бензойна кислота. У печінці при взаємодії бензойної кислоти з гліцином утворюється гіпурова кислота, яка виводиться з сечею. Для оцінки знешкоджувальної функції печінки застосовують пробу на синтез гіпурової кислоти (пробу Квіка). Суть проби полягає в пероральному прийомі бензоату натрію і визначенні в сечі кількості гіпурової кислоти. При перенхіматозних ураженнях печінки синтез гіпурової кислоти знижений. Та обставина, що гіпурова кислота може синтезуватись із бензойної, утвореної в товстій кишці під дією ферментів мікроорганізмів, робить пробу Квіка у діагностичному плані недостатньо надійною і рідковикористовуваною.

ЗАГАЛЬНІ ШЛЯХИ ПЕРЕТВОРЕННЯ АМІНОКИСЛОТ

В органах і тканинах знаходиться невелика кількість вільних АК. Після всмоктування амінокислоти потрапляють через портальну систему в печінку, яка є головним органом обміну амінокислот в організмі. Периферичні тканини з різною ефективністю поглинають циркулюючі в крові амінокислоти. Крім амінокислот їжі, фонд вільних амінокислот в організмі поповнюється за рахунок розпаду тканинних білків і синтезу замінних амінокислот.

Тканинні білки гідролізуються протеолітичними ферментами-катепсинами (пептидгідролазами), які локалізовані, головним чином, у лізосомах клітин. Загальна кількість вільних амінокислот в організмі людини складає близько 30 г (під час травлення вміст їх значно зростає). Амінокислоти використовуються далі в таких напрямках: 1) синтез білків; 2) синтез пептидів; 3) утворення різноманітних низькомолекулярних азотовмісних речовин-біогенних амінів, пуринів, піримідинів, креатину, холіну, таурину, тироксину, порфіринів тощо, 4) розщеплення до кінцевих продуктів; 5) перетворення у вуглеводи чи ліпіди.

Синтез і розпад білків в організмі дорослої людини відбуваються з різною швидкістю. Так, у дорослої людини масою 70 кг за добу синтезується і розпадається близько 400 г білка. Ці дані свідчать про високу швидкість оновлення білків тіла. Очевидно, що збільшення сумарної кількості білків при рості організму чи в процесі виздоровлення відбувається за рахунок білків їжі. Катаболізм амінокислот до кінцевих продуктів (СО₂, Н₂О, NH₃) супроводжується звільненням енергії. Однак енергетична роль амінокислот при звичайному раціоні невелика. За рахунок окиснення амінокислот покривається 10-15 % потреби організму в енергії. Окиснювальне розщеплення амінокислот зростає при переважно білковому харчуванні, голодуванні та цукровому діабеті. На початковій стадії окиснювального розпаду амінокислоти втрачають свої аміногрупи у формі аміаку, який в організмі людини йде на синтез сечовини, що виводиться з сечею. Відщеплення аміногрупи від амінокислот призводить до утворення альфа-кетокислот, які потім окиснюються до СО₂ і Н₂О. Альфа-кетокислоти також можуть перетворюватись у вуглеводи чи ліпіди.

Дезамінування амінокислот, його види. Роль ферментів і коферментів.

Процес відщеплення аміногрупи від амінокислоти з утворенням вільного аміаку називається дезамінуванням і може здійснюватись різними шляхами, характерними для різних видів живих організмів. У вищих тварин основним шляхом є окиснювальне дезамінування, при якому, крім аміаку, утворюється альфа-кетокислота.

Непряме дезамінування. Доля амінного азоту та альфа-кетокислот

Розрізняють кілька типів дезамінування. Окисне дезамінування амінокислот є основним шляхом їх розкладу в організмі, особливо тварин.

Приводить до утворення відповідних кетокислот, процес проходить за участю ферментів — оксидаз амінокислот. Окисним шляхом дезамінуються й аміни, шо утворюються в організмі при декарбоксилюванні амінокислот. Значна частина цих амінів токсична, тому дезамінування має важливе значення для їх знешкодження. Дезамінування амінів каталізується амінооксидазами. Оксидази природних амінокислот, крім глутаматдегідрогенази, що дезамінує L-глутамінову кислоту, в тваринних тканинах мало активні. Тому більшість L-амінокислот підлягає непрямому дезамінуванню шляхом попереднього перезмінування з утворенням глутамінової кислоти, яка потім підлягає окислювальному дезамінуванню або іншим перетворенням.

Іншими типами дезамінування є відновне, гідролітичне та внутрішньомолекулярне.

Відновне дезамінування відбувається шляхом окислювально-відновних реакцій між двома амінокислотами, внаслідок чого обидві амінокислоти дезамінуються (реакція між аланіном і гліцином). При внутрішньомолекулярному дезамінуванні утворюються ненасичені кислоти. Ці реакції мають місце при дезамінуванні ряду амінокислот (наприклад, аспарагінової кислоти у рослин і деяких бактерій; гістидину в печінці людини). При гідролітичному дезамінуванні утворюються D-оксикислоти. Цим шляхом дезамінуються також пуринові основи й піримідинові основи у плісеневих грибів, деяких бактерій і тканинах тварин.

Дезамінування грає важливу роль і в метаболізмі ДНК. Спонтанне дезамінування цитозину в результаті гідролізу перетворює його на урацил, виділяючи в процесі аміак. Це може відбуватися in vitro через використання бісульфатів, при чому перетворюється цитозин, але не 5-метилцитозин. Ця властивість дозволяє дослідникам послідовностей ДНК відрізнити неметильований цитозин (що перетворюється на урацил) і метильований цитозин (залишається незмінним). В ДНК для репарації такого пошкодження урацил видалається і замінюється цитозином відповідно до гуаніну на іншому ланцюжку ДНК. Спонтанне дезамінування 5-метилцитозину приводить до утворення тиміну і аміаку. У ДНК, цей відгук не може бути виправлений, тому що механізми репарації не визнають тимін як помилку (в протилежність урацилу), в результаті чого мутація зберігається. Ці мутації сприяють рідкісності CPG-ділянок в геномам еукаріотів.

В організмі людини є декілька ферментів, що каталізують такі реакції, різної специфічності й біологічного значення. В печінці і нирках є неспецифічна оксидаза L-амінокислот, яка у фізіологічних умовах малоактивна, оскільки оптимум рН для неї дорівнює 10. Простетичною групою оксидази L-амінокислот служить ФМН. Значно активніша в організмі людини оксидаза D-амінокислот, ФАД-залежний фермент, що виділений із нирок, печінки й мозку. Фермент каталізує окиснювальне дезамінування тільки D-ізомерів амінокислот, що не входять до складу білків, і тому біологічна роль його є загадковою. Він міг би окиснювати D-амінокислоти клітинних стінок бактерій, якщо б вони всмоктувались.

Єдиним високоефективним ферментом, що діє на амінокислоту L‑ряду в організмі вищих тварин і людини, є глутаматдегідрогеназа. Вона каталізує реакцію: