Home » МЕТОДИЧНА ВКАЗІВКА ДЛЯ СТУДЕНТІВ 3 КУРСУ

МЕТОДИЧНА ВКАЗІВКА ДЛЯ СТУДЕНТІВ 3 КУРСУ

11 Червня, 2024

МЕТОДИЧНА ВКАЗІВКА ДЛЯ СТУДЕНТІВ 3 КУРСУ

фармацевтичного факультету

ЗАНЯТТЯ № 4 (практичне – 6 год.)

Тема: Аналіз лікарської рослинної сировини, яка містить ліпіди (макродіагностика). Аналіз жирних олій. Визначення чистоти, фізичних та хімічних показників.

Місце проведення: кафедра фармакогнозії з медичною ботанікою (учбова кімната з фармакогнозії).

Мета. Уміти визначати типи жирних олій, їх фізичні та хімічні показники, знати аналітичне значення; вміти відрізняти справжні ліпіди від ліпоїдів; визначати доброякісність сировини, яка містить ліпіди, гістохімічним методом.

Професійна орієнтація. Ліпіди – жири і жироподібні речовини, які входять до складу клітини усіх живих структур і поряд з білками та вуглеводами забезпечують основні функції життєдіяльності організму. У медичній практиці застосовують мигдальну, персикову, рицинову олію, масло какао, риб’ячий жир, ланолін, спермацет, тому для практичної діяльності провізору необхідні знання про ліпіди.

Базовий рівень знань та вмінь

1. Систематика рослин (“Медична ботаніка” ІІ курс).

2. Фізичні та хімічні методи досліджень (“Фізична хімія”, ІІ курс, “Аналітична хімія” ІІ курс).

3. Фізичні та хімічні властивості ліпідів (“Органічна хімія “ ІІ курс).

Методика виконання практичної роботи – 9⁰⁰-12⁰⁰

§ Ілюстративний матеріал: гербарні зразки лікарських рослин, лікарська рослинна сировина.

Матеріали та обладнання: пробірки, мірні пробірки і циліндри, колба на 250 мл, колба зі шліфом (200 мл), колба з притертою пробкою (250 мл), колби конічні (50 мл), зворотній холодильник, водяна баня, електроплитка, бюретки (25 мл), апарат Сокслета, фільтрувальний папір, скляні палички, штанглаз, камера для хроматографії, скляні хроматографічні пластинки, штатив Бюхнера, сушильна шафа, вага аналітична.

Реактиви: олії, парафін, віск, хлороформ, 0,1 М р-н йоду монохлорид, р-н KJ, 0,1М р-н Na₂S₂O₃, р-н крохмалю, 0,5М спирт. р-н КОН, ксилол, р-н фенолфталеїну, HCl–конц., 0,5М р-н HCl, H₂SO₄-конц., ефірний р-н флороглюцину (1:1000), Н₂О-дист., суміш H₂SO₄:HCl:Н₂О (1:1:1), диетиловий ефір, 95% С₂Н₅ОН, спирт. р-н AgNO₃ (1:50), 0,1М NaOH, силікагель, петролейний ефір:диетиловий ефір:оцтова кислота (9:1:0,1), J₂, 10% спирт. р-н фосфорномолібденова кислота, 50% р-н K₂Cr₂O₇ у H₂SO₄.

Проводити кількісне визначення БАР за методами, передбаченими в Фармакопеї.

§ Методика виконання практичної роботи

Робота 1. На листок фільтрувального паперу скляною паличкою нанести 1 краплю жирної олії і нагріти над електричною плиткою. Жирні олії залишають на папері плями, які не зникають при нагріванні.

Робота 2. Виявлення домішок у жирах. 1 мл олії нагріти з 10 мл 0,5 М спиртового розчину калію гідроксиду при безперервному збовтуванні. Омилювання відбувається дуже швидко. Від додавання до одержаного прозорого розчину 25 мл води не повинна з’являтися каламуть, що свідчить про відсутність домішок у жирах.

Виявлення альдегідів та пероксидів реакцією Крейса: 1 мл олії збовтати протягом 1 хв з 1 мл концентрованої хлористоводневої кислоти, додати 1 мл ефірного розчину флороглюцину (1:1000) і знову збовтати. Поява рожевого або червоного забарвлення свідчить про недоброякісність олії.

Робота 3. Встановлення ідентичності. Кольорові реакції. Кольорові реакції дають можливість ідентифікувати жирні олії або знаходити їх домішки в інших оліях.

Реакція на олію персикового і абрикосового насіння (за Бібером): 5 мл олії збовтати з 1 мл охолодженої суміші сірчаної кислоти, води і димлячої азотної кислоти. З’являється рожеве (до червоного) забарвлення, що поступово переходить в оранжеве. Це свідчить про наявність персикової або абрикосової олії.

Реакція на олію насіння капустяних. Розчинити 2 мл олії в 5 мл ефіру, додати 5-10 краплин спиртового розчину срібла азотнокислого (1:50) і залишити на кілька годин у темному місці. При цьому не повинно з’являтися темне забарвлення або темний осад.

Реакція на риб’ячий жир. Виготовити розчин олії в хлороформі (1:20 – в краплях). 1 краплина розчину при збовтуванні з 1 краплиною концентрованої сірчаної кислоти забарвлюється в синьо-фіолетовий колір, що швидко переходить у бурий. Утворюється ліпохром.

Реакція на ланолін. 0,1 г препарату розчинити у 5 мл хлороформу і обережно нашарувати у пробірці на 5 мл концентрованої сірчаної кислоти. На місці стикання рідин поступово утворюється яскраве буро-червоне кільце, що вказує на наявність холестерину.

Робота 4. Визначення хімічних числових показників.

1) Кислотне число означає кількість міліграмів калію гідроксиду, яка витрачається для нейтралізації вільних кислот, що містяться в 1 г досліджуваної речовини.

Визначення кислотного числа. Близько 2 г (точна наважка) олії, жиру, воску помістити у колбу на 250 мл і розчиняють у 20 мл суміші рівних об’ємів 95%-го етилового спирту і ефіру (попередньо нейтралізованих за фенолфталеїном 0,1М розчином натрію гідроксиду), при необхідності нагріти на водяному нагрівнику зі зворотнім холодильником до повного розчинення. Додати 2 – 3 краплі фенолфталеїну і титрувати розчином 0,1М натрію гідроксиду при постійному помішуванні до появи рожевого забарвлення, яке не зникає протягом 30 сек. Для речовин з невеликим кислотним числом (до 1) титрування проводити з мікробюретки.

Кислотне число (Кч) обчислюють за формулою:

К_{Ч =} V ^. 5,61 ,

де V– об’єм 0,1 М розчину натрію гідроксиду, витраченого на титрування, мл;

m – наважка речовини, г;

5,61 – кількість калію гідроксиду, що відповідає 1 мл 0,1 М розчину натрію гідроксиду, мг.

2) Число омилення – кількість міліграм калію гідроксиду, яка витрачається для нейтралізації суми вільних кислот, що утворилися при повному гідролізі складних ефірів, котрі містяться в 1 г досліджуваної речовини.

Визначення числа омилення. Близько 2 г речовини (точна наважка) помістити у колбу зі шліфом на 200 мл, додати 25 мл 0,5М спиртового розчину калію гідроксиду, колбу з’єднати зі зворотним холодильником і нагріти на водяному нагрівнику 1 год, регулярно перемішуючи обертанням.

При дослідженні важкоомилюваних речовин додають 5 –10 мл ксилолу і нагрівають довше, згідно з вимогами відповідної статті.

Паралельно нагріти 25 мл 0,5М калію гідроксиду. Обидва розчини зразу після нагрівання розвести 25 мл свіжопрокип’яченої гарячої води, додати 2-3 краплі розчину фенолфталеїну і титрувати 0,5М розчином хлористоводневої кислоти до знебарвлення.

Різниця між кількістю мілілітрів 0,5М хлористоводневої кислоти, витраченої у контрольному досліді і при титруванні досліджуваної речовини, являє собою кількість мілілітрів розчину 0,5М гідроксиду калію, витраченого на нейтралізацію суми вільних жирних кислот і кислот, що утворилися при повному гідролізі складних ефірів у досліджуваній наважці.

Число омилення (Ч) обчислюється за формулою:

Ч ₌ (V₁ – V) ^. 28,05

де V₁ – кількість 0,5М р-ну хлористоводневої кислоти, витраченої на титрування контрольного досліду, мл;

V – кількість 0,5М р-ну хлористоводневої кислоти, витраченої на титрування досліджуваної речовини, мл;

m – наважка речовини, г;

28,05 – кількість калію гідроксиду, що відповідає 1 мл 0,5М р-ну калію гідроксиду, мг.

3) Ефірне число – кількість міліграм калію гідроксиду, яка витрачається для нейтралізації жирних кислот, що утворюються при гідролізі складних ефірів, котрі містяться в 1 г досліджуваної речовини.

Різниця між числом омилення та кислотним числом є ефірним числом. Величина ефірного числа залежить від молекулярної маси жирних кислот, які входять до складу гліцеролів.

4) Йодне число – кількість грам галогену, еквівалентна йоду, що зв’язується зі 100 г досліджуваної речовини.

Визначення йодного числа. Близько 2 г досліджуваної олії (точна наважка) помістити у суху колбу з притертим корком на 250-300 мл, розчинити у 3 мл хлороформу або ефіру, додати 20 мл 0,1М р-ну йоду монохлориду, закрити колбу корком, змоченим р-ном калію йодиду, обережно збовтати круговими рухами і витримати в темному місці 1 год. Потім долити послідовно 10 мл р-ну калію йодиду, 50 мл води і титрувати 0,1М р-ном натрію тіосульфату при постійному енергійному збовтуванні до світло-жовтого забарвлення, після чого долити 3 мл хлороформу, сильно збовтати, додати 1 мл р-ну крохмалю і титрувати до знебарвлення.

Паралельно провести контрольний дослід.

При аналізі твердих жирів наважку розчинити у 6 мл ефіру, додати 20 мл 0,1М р-ну йоду монохлориду і 25 мл води. Подальше визначення проводять так, як наведено вище.

Від кількості мілілітрів 0,1 М р-ну натрію тіосульфату, витраченого у контрольному досліді, віднімають кількість мілілітрів 0,1 М р-ну натрію тіосульфату, витраченого на титрування досліджуваного зразку. Одержана різниця відповідає кількості мл 0,1 М р-ну йоду, зв’язаного наважкою досліджуваної олії.

1 мл 0,1 М р-ну натрію тіосульфату відповідає 0,01269 г йоду.

Йодне число (J) обчислюють за формулою:

J ₌ (а – б) ^. 0,01269 ^. 100 ,

де а – кількість 0,1 М розчину натрію тіосульфату, витраченого на титрування в контрольному досліді, мл;

б – кількість 0,1 М р-ну натрію тіосульфату, витраченого на титрування досліджуваної олії, мл;

в – наважка олії, г.

Робота 5. Визначення вмісту жирів у рослинній сировині

Методи кількісного визначення жирів в основному зводяться до видалення жиру за допомогою обробки сировини органічними розчинниками. Як екстрагуючі рідини звичайно застосовують етиловий і петролейний ефіри, хлороформ та інші низькокиплячі розчинники. При роботі з ефірами необхідно дотримуватись правил протипожежної безпеки, зважаючи на його летку займистість!

Для визначення жирів у сировині користуються, як правило, апаратом Сокслета.

Трубка з правого боку екстратора служить для проходження парів рідини, яка нагрівається в колбі, у холодильник. Друга зігнута трубочка, є сифоном, яким з екстрактора до колби переливається розчин речовини, що екстрагується.

Техніка визначення

2-3 г (точна наважка) подрібненого матеріалу зважити у трубочці з фільтрувального паперу, яка називається патроном. Зважити на аналітичних вагах колбу-приймач, заздалегідь висушену при температурі 100-110^оС.

Патрон з наважкою помістити в екстрактор. Усі частини апарату з’єднати, через верхній отвір холодильника налити в екстрактор розчинник (ефір чи хлороформ) у кількості, що в 1,5 рази перевищує місткість екстрактора до сифонної трубки. Апарат нагріти на водяному нагрівнику. Пари розчинника піднімаються по трубці й конденсуються у холодильнику, а звідти розчинник краплинами падає на патрон, розчиняючи жир. Рідина, збираючись в екстракторі до рівня сифона, зливається у колбу-приймач.

Кипіти розчинник повинен помірно: при дуже інтенсивному кипінні частина пари не встигає сконденсуватися в холодильник і легко може звітритися; при дуже слабкому нагріванні рідина не зливається періодично. Якщо в процесі екстрагування треба додавати розчинник, то його вливати у верхній кінець трубки холодильника після відключення джерела нагрівання і охолодження апарату.

Нормальна швидкість екстрагування становить 6-8 зливань за годину.

Щоб визначити кінець екстрагування, потрібно перевірити повноту виділення жиру: обережно розібрати апарат, дати впасти 1-2 краплинам рідини із сифона на годинникове скло або фільтрувальний папір. Показником остаточного виділення буде відсутність масляного нальоту після випаровування розчинника.

В кінці екстрагування апарат охолодити, частини його роз’єднати, розчинник, що залишився в екстракторі, злити у колбу-приймач через сифонову трубку, патрон із сировиною вийняти. Потім частини апарату з’єднати і нагріти на водяній бані; з витяжки розчинник зібрати в екстрактор, а звідти злити у штанглаз. Після повного виділення розчинника колбу-приймач із залишком сушити при 90^о– 95^оС до сталої маси, охолодити і зважити на аналітичних вагах. Вміст жиру у відсотках (Х) в перерахунку на абсолютну суху сировину обчислюють за формулою:

Х ₌ (a – b) ^. 100 ^. 100 ,

m ^. (100 – W)

де а – маса колби із сухим жиром, г;

b – маса порожньої колби, г;

т – маса сировини, г;

W – вологість сировини, %.

Визначити вміст жиру в досліджуваному зразку сировини можна зважуванням знежиреного залишку. Патрони із знежиреною сировиною розкласти у сушильній шафі і висушити при температурі 35^оС до повного видалення розчинника, а потім зважити. Різниця у масі патрона з сировиною до і після екстрагування дає кількість видаленого жиру.

Вміст жиру у відсотках (Х) обчислюють за формулою:

Х ₌ (a₁ – b₁) ^. 100 ^. 100 ,

m . (100 – W)

де a₁ – маса патрона з сировиною до екстрагування, г;

b₁ – маса патрона з сировиною після екстрагування, г;

m – маса сировини, г;

W – вологість сировини, %.

Хроматографічний аналіз

Для дослідження ліпідів широко застосовують хроматографічні методи. Так, склад жирних кислот у жирах визначають методом газо-рідинної хроматографії. Хроматографують не самі жирні кислоти, а їхні похідні – метилові ефіри, що розділяють при невисокій температурі. Для визначення класів ліпідів, зокрема стеринів, придатний метод тонкошарової хроматографії на силікагелі.

Приготування хроматографічних пластинок. Суспензію силікагелю G у воді нанести на скляні пластинки розміром 20х20 або 10х20см. Хроматографічну пластинку активувати нагріванням упродовж 30 хв при 110^оС. Для хроматографування взяти суміш петролейний ефір (t_кип. 30-60^оС) – диетиловий ефір – оцтова кислота. Співвідношення розчинників потрібно обирати залежно від мети розділення. Для звичайного аналізу сумарних ліпідів використовують системи: петролейний ефір (t_кип 30-60⁰С) – диетиловий ефір – оцтова кислота у співвідношенні 9:1:0,1, а для розділення фосфоліпідів і моногліцеролів, що не розділяються у цій системі, застосовують більш полярну систему тих же компонентів, але у співвідношенні 3:7:0,1. Серед інших систем заслуговує на увагу суміш петролейний ефір (t_кип 30-60⁰С) – метилетилкетон – оцтова кислота у співвідношенні 95:4:1 або 84:15:1.

Можна виконати розділення зразка на одній хроматограмі у декількох системах. Шар силікагелю на пластинці з поздовжніми лініями розмежувати на кілька смуг. Зразок ліпідів нанести на старт першої смуги і хроматографувати у системі петролейний ефір – диетиловий ефір – оцтова кислота. Смуги, що залишилися можна використати для розділення фосфоліпідів. На одній хроматограмі можна визначити склад фракцій.

Застосовують мікрохроматографію ліпідів на силікагелі G, нанесеному на предметне скло. Така методика дає можливість розділити мікрокількість ліпідів при мінімальному витраченні сорбенту і розчинників.

Виділення ліпідів. Для проявлення хроматограм використовуються такі реагенти:

1. Пари йоду. Ненасичені ліпіди проявляються у вигляді коричневих плям.

2. Розчин 10% фосфорномолібденової кислоти у 96% етанолі. Після нагрівання пластинки при 80-90^оС смуга ліпідів забарвлюється у темно-синій колір на жовто-зеленому фоні. При незначному перегріванні фон темнішає.

3. Ненасичений розчин калію біхромату у 80% сірчаній кислоті з подальшим нагріванням хроматограми при 80-90^оС. Ненасичені ліпіди виявляються у вигляді коричневих плям зразу після оприскування, насичені – після нагрівання.

4. 50% сірчана кислота з наступним нагріванням пластинки упродовж 10 хв при 160-180^оС. З’являються коричнево-чорні плями на майже безбарвному фоні. Поріг чутливості – близько 2мкг речовини.

Семінарське обговорення теоретичних питань – 12³⁰-14⁰⁰

Теоретичні питання

1. Ліпіди, їх класифікація та фізико-хімічні властивості.

2. Ботанічна характеристика та біологічні властивості ЛР, які містять жири і жироподібні речовини. Визначення типів жирних олій, приклади.

3. Методи отримання жирів і жирних олій. Визначення фізичних і хімічних показників жирних олій.

4. Ліпоїди: бджолиний віск, спермацет, ланолін, фосфоліпіди, їх будова, застосування.

5. Сировинні джерела отримання ліпоїдів.

▪ Тестові завдання та ситуаційні задачі

1. Завдяки високій фізіологічно активній дії простогландини іноді називають:

A. Ферментами

B. Вітамінами

C. Алкалоїдами

D. Гормонами

E. Глікозидами

2. Ліпіди не розчиняються у наступних розчинниках:

A. Спирті

B. Ацетоні

C. Воді

D. Хлороформі

E. Гексані

3. Котрий із числових показників вказує, яка олія – висихаюча, невисихаюча, напіввисихаюча:

A. Кислотне число

B. Пероксидне

C. Бромне число

D. Число омилення

E. Йодне число

4. Яка із вказаних жирних олій містить фосфоліпіди:

A. Oleum Maydis

B. Oleum Ricini

C. Oleum Jecoris

D. Oleum Persicorum

E. Oleum Sojae

Студент повинен знати

1. Будову ліпідів та шляхи їх виділення із сировини.

2. Основні методи якісного та кількісного визначення ліпідів.

Студент повинен вміти

1. Використовувати методи фармакогностичного аналізу для визначення ЛРС.

2. Розпізнавати живі ЛР та на гербарних зразках.

3. Проводити реакції виявлення та визначення жирів у сировині.

Година самостійної роботи – 14¹⁵-15⁰⁰

Джерела інформації:

А – Основні:

1. Фармакогнозія з основами біохімії рослин/ за ред. проф. Ковальова В.М. та інші/ – Харків: Вища школа. – 2000. – С. 412-422.

2. Государственная Фармакопея СССР, 11-ое изд. – М.: Медицина. – 1987. – С.267, 318-320, С. 253-255, 300-303, 314-317.

3. Державна Фармакопея України / МОЗ України. ― 1 вид., ― Х. : РІРЕГ, ― 2001. ― 556 с.

4. Державна Фармакопея України / Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр. ― 1 вид., ― Доповн. 2. ― Х. : Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр, ― 2008. ― 620 с.

5. Державна Фармакопея України / Державне підприємство “Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів”. ― 1-е вид. ― Доповнення 3. ― Х. : Державне підприємство “Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів”, ― 2009. ― 280 с.

6. Державна Фармакопея України / Державне підприємство “Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів”. ― 1-е вид. ― Доповнення 4. ― Х. : Державне підприємство “Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів”, ― 2011. ― 540 с.

7. Веб-сторінка університету > Інтранет > На допомогу студентам > Матеріали для підготовки до практичних занять > Кафедра фармакогнозії з медичною ботанікою > Українська > Фармація > Повний термін навчання > Фармакогнозія> 3 курс>Аналіз ЛРС, яка містить ліпіди. Аналіз жирних олій. Визначення чистоти, фізичних та хімічних показників.

В – Додаткові:

1. Солодовниченко Н.Н., Журавльов М.С., Ковальов В.М. Лікарська рослинна сировина та препарати. – Харків: Золоті сторінки. – 2001. – С. 408.

2. Практикум по фармакогнозии: Учеб. пособие для студ. вузов / В. Н. Ковалев, Н. В. Попова, В. С. Кисличенко и др.; Под общ. ред. В. Н. Ковалева. – Х.: Изд-во НфаУ; Золотые страницы, 2003. – 512 с.

3. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. – М.: Медицина. – 1991. – 656 с.

4. Коновалова О.Ю., Мітченко Ф.А., Шураєва Т.К. Біологічно активні речовини лікарських рослин: навчальний посібник з фармакогнозії для студентів вищих фармацевтичних навчальних закладів і фармацевтичних факультетів вищих медичних навчальних закладів ІІІ-ІV рівнів акредитації спеціальності 7.110 – фармація. – К.: Видавничо-поліграфічний центр “Київський університет”, 2008. – 352 с.

5. Ковалев В.Н., Кисличенко В.С., Журавель И.А., Ковалева А.М., Исакова Т.И. Фармакогнозия: Учеб. пособ. для студ. высш. учебн. завед. Изд-во НфаУ, 2007. – 272.

6. Гулько Р.М. Словник лікарських рослин світової медицини. Латинсько-українсько-російсько-англійський. – Львів: Ліга-Прес, 2005. – ХХІV 506 с.

7. Бобкова І. А. Фармакогнозія: підручник / І. А. Бобкова, Л. В. Варлахова, М. М. Маньковська. – 2-е вид., перероб. та доп. – К.: Медицина, 2010. – 512 с.