МОРФОЛОГІЯ І БІОЛОГІЯ ВІРУСІВ

 

Морфологія і біологія вірусів. Основні методи nкультивування вірусів.

Методи індикації вірусів.

Віруси Бактерій – бактеріофаги. nСтруктура, класифікація. Форми взаємодії бактеріофагів з бактеріальною nклітиною. Вірулентні nі помірні фаги. Практичне використання бактеріофагів

Мікробіологічний контроль у стоматологічних приміщеннях.  Санітарно-бактеріологічне дослідження nводи, грунту, повітря. Санітарно-показові nмікроорганізми

 

Відомо тисячі видів різноманітних nвірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно nвелику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи nорганічного світу, служать переносниками генетичної nінформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з nрозшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та nсинтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної nінженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот nі сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні nзахворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні nгарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими nрозмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а nтакож облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

За ступенем небезпеки для людини віруси поділяють на чотири nгрупи. До першої групи належать збудники гарячки Ебола, Ласса, Марбурга, nМачупо, натуральної віспи, до другої входять арбо- і аренавіруси, віруси сказу, nгепатитів А і В, ВІЛ. До третьої групи належать віруси nгрипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини. Четверта група nпредставлена адено-, корона-, герпес-, рео- та nонковірусами. Цей поділ певною мірою умовний, так як внаслідок генетичної nмінливості можуть з’являтися штами вірусів з підвищеною nвірулентністю.

Структура вірусів. Окрема вірусна частинка одержала nназву віріон. nВін складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та nбілкового футляра, що її оточує, – капсида. Разом вони nформують нуклеокапсид. Капсиди nутворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна nдля кожного виду вірусів і використовується як nтаксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими.

 До них належать nнайдрібніші з патогенних вірусів людини: поліовіруси, nаденовіруси, ­паповавіруси.

 Проте більшість nвірусів має ще одну оболонку – суперкапсидну, nяка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними nбілками-глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, nщо називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. nСтруктурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер. До них належать віруси сказу, герпесу, грипу, nенцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям nсиметрії. Тип симетрії залежить nвід способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів nнавколо неї. Виділяють ізометричний n(або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип nхарактеризується тим, що капсомери утворюють багато­гранник (найчастіше nікосаедр – 20-гранник).

Усі відомі ДНК-геномні віруси ­мають nскладні капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, парвовіруси), а також деякі віруси, nщо містять РНК – пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією nмолекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. nТакий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, грипу, кору, епідемічного паротиту та ін.

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких nбактеріофагів. При цьому головка nбактеріофага має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у хвості, nукладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: nпаличкоподібна (віруси мозаїчної хвороби тютюну), кулеподібна (віруси сказу), nсферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна (віруси натуральної віспи), nголовчаста або сперматозоїдна (бактеріофаги), ниткоподібна (віруси ебола, віруси бактерій). На рис  представлені основні форми і структури nнайпоширеніших РНК- і ДНК-геномних вірусів.

 

Класифікація вірусів. В основі nсучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової nкислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо:

(1)  Тип нуклеїнової nкислоти, її структура, стратегія реплікації

(2) Розміри, nморфологія, симетрія віріону, число капсомерів, nнаявність суперкапсиду. 

(3) Наявність nспецифічних ферментів, особливо РНК- і ДНК-полімераз, nнейрамінідази

(4) Чутливість nдо фізичних і хімічних агентів, особливо ефіру

(5) Імунологічні nвластивості

(6) Природні nмеханізми передачі

(7) Тропізм nдо господаря, його тканин і клітин

(8) Патологія, nформквання включень

(9) Симптоматологія nзахворювань.

 

 За наявністю нуклеїнової кислоти їх поді­ляють nна ДНК-геномні та РНК-геномні віруси. Із 71 відомої родини вірусів 20 nродин містять віруси, патогенні для людини (табл.).

 

 

Хімічний склад вірусів. Віруси містять лише один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 до 40 % маси віріона. Вірусні геноми містять інформацію, nдостатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10^-15 мг, nщо в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина – до 0,093 мм. Число nнуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту nВ) до 230000 (вірус натуральної віспи). Віруси характеризуються надзвичайним nрозмаїттям форм геному. Він може бути представлений як односпіральними, так і nдвоспіральними молекулами, бути лінійним, циркулярним nабо фрагментованим.

Білки вірусів (70-90 % маси віріона) nподіляються на структурні та неструктурні. Структурними називають nтакі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують nряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, nвзаємодіють з мембранами чутливих клітин, і забезпечують проникнення вірусу в nклітину, мають РНК- і ДНК-полімеразну активність та nін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються nпід час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного геному, nє попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. nЗалежно від розташування у віріоні, білки поділяються nна капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з nнуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах nі входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний nшар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища. nВіруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди – nкомплекс вірусних суперкапсидних білків та ліпідів клітинної мембрани яких nвіруси набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, nгліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи nзахист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Різні групи вірусів мають неоднакову nстійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, nщо мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька nгодин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. nЧутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення nзалежить від величини геному вірусів: чим менший геном, тим резистентніший nвірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до nефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації nводневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень nрН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, nпроникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО). nВіруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, nвіруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.

Взаємодія nвірусів і клітини. Розрізняють декілька типів взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує nв клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції nклітинного генетичного апарата. При цьому утворюється nнове покоління інфекційних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, nа інфекційні віріони не утворюються, такий тип nвзаємодії позначають як абортивний.

Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- nта ДНК-геномні віруси (СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в nклітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових nвластивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією.

Отже, віруси є особливими інфекційними агентами, які nвимагають своєрідних прийомів для роботи з ними, не nподібних до мікробіологічних. Вірусологічні дослідження nпроводять у спеціально обладнаних вірусологічних лабораторіях.

 

За своїм ступенем небезпеки для nлюдини віруси поділяють на чотири групи.

 І група:  nзбудники гарячки Ебола, Ласа, Марбурга, Мачупо, натуральної віспи, а також nвірус гепатиту В (мавп).

 ІІ група –  nарбовіруси, деякі аренавіруси, віруси сказу, віруси гепатиту А і В nлюдини, ВІЛ.

 ІІІ група –  nвіруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вісповакцини.

ІV група –  nаденовіруси, коронавіруси, герпесвіруси, реовіруси, онковіруси.

 

Резистентність nвірусів до дії факторів зовнішнього середовища

. Різні групи вірусів мають nнеоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до nних віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, nпарагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на nповерхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні nвластивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та nультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший nгеном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну nоболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших nжиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації nводневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень nрН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, nпроникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). nВіруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, nвіруси грипу та ін.) чутливі до кислих значень рН.

         Головна властивість вірусу – nпредставити   свій геном в nклітині-господарі, для того, щоб відбулась його експресія (трансляція і nтранскрипція)

Репродукція nвірусів.

Особливості nїї полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони nрізноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись nнезалежно від ДНК клітини.

Вірусам nпритаманний диз’юнктивний nспосіб репродукції.

Останній nполягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та nчасі:

нуклеїнові nкислоти реплікуються в ядрі клітини, білки – в цитоплазмі, а збирання цілих nвіріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани.

Репродукція nвірусів – унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах nеукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам nвірусів.

 

У nрепродукції вірусів виділяють ряд стадій.

До nранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) nїх всередину кілтини та їх роздягання (депротеїнізація).

Пізні nстадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових nкислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення nвірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і nспецифічним.

Неспецифічний nвизначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними nгрупами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди.

Специфічний механізм (обернена та nнеобернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними nрецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну nприроду. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є nсіалова кислота. Число рецепторів на ділянках nадсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і nщілин.

Проникнення вірусів всередину nклітини відбувається за механізмом рецепторного nендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які nмістять особливий блок з високою молекулярною масою – клатрин.

Мембрани nінвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число nможе сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні nзливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів nвзаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує nще один механізм проникнення вірусів у клітину – індукція злиття мембран. Вона nвідбувається завдяки особливому вірусному білку злиття n(F- від fusion – злиття).

Внаслідок nцього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а nгеном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, nпарагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання nвіріонів – багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий nапарат, зникають захисні оболони, які гальмують експресію генома. Відбувається nвоно в спеціалізованих ділянка – лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні nстадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка.

Механізм nреплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) nзалежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він nнеоднаковий.

Виділяють n6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових nДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) nспочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них nза принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій – nінформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах nне утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. В однониткових nДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми nДНК.

Реплікація nу вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На nматеринській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома nслужать проміжні форми РНК.

Суттєво nвідрізняється від попередніх механізм реплікації ретровірусів (онкорнавірусів). n

Їх nпроцес репродукції тісно пов’язаний з nрепродукцією клітини-хазяїна.

Спочатку nна РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою nРНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка nДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна.

У nтакому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК nслужить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією nназивають процес утворення інформаційних (матричних) РНК.

 

Вона nвідбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або nРНК-залежні РНК-полімерази.

 

У nДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів – власні nвірусспецифічні транскриптази.

На nстадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК nта перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. nМолекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного nкоду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках nамінокислоти.

Складання nвіріонів – не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість nспецифічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні nїх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки nнеобхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових nкислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулуму. У nскладних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на nцитоплазматичній мембрані.

Прості nвіруси залишають клітину, як правило, шляхом «вибуху», розриваючи її мембрану.

Складні nвіруси – брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись nжиттєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

 

 

 

Репродукція nвірусів

Визначення розмірів вірусів

 

A.  Фільтрування

B.    Седиментація в ультрацентрифузі

C.   Спостереження в електронному мікроскопі

 Порівняльні розміри:

(1) Staphylococcus має діаметр 1000 nm.

(2) Бактеріофаги –10-100 nm.

(3) Діаметр молекули сироваткового альбуміну 5 nmб глобуліну – 7 nm, гемоцианін (23 nm.

 

Методи лабораторної nдіагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись nза двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або nїх компонентів в організмі хворого (вірусологічна nдіагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у nсироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не nзразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх nтитр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення nприросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними nсироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – nчерез 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практично підтверджує перенесення захворювання, його ще називають nретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які nвикористовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру nантитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. nВикористання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно nприскорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення nвірусів. Для виділення вірусів, nнеобхідних для подальшого їх дослідження з метою nідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування nматеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, nкультури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження nматеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору nзалежить хід подальшого вірусологічного дослідження. nЗалежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом nможе бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, nспинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, nотриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. nОдержаний матеріал необхідно зберігати за умов nзбереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при nтемпературі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які nзаповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не nконтамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова nрідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. nДопустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються nв стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний nрозчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний nматеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити nбактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме nрезультати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях nвикористовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом nє обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації n500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. nДопустимим вважається використання спеціальних nантибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких nшвидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім nвикористовують для зараження.

Зараження nкурячих ембріонів. Курячі nембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої nідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у nтермостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

 

 

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і nзакритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у nяких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх nпросвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють nспиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, nзнімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою nі герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним nмішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим nінструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою nшприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем nовоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим nпарафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих nембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну nпорожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на nхоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над nповітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної nоболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

Бляшки на хоріоналантоїсній nоболонці

 

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом nчерез невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці nхоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і nзакритим способами. При першому після знаходження nхоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом nамніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі nвірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку nспрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис­товують 3-8-денні nембріони, тому що в них жовт­ко­вий мішок займає значну частину порожнини яйця. nЗараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. nПотім їх охолоджують до температури 4 °С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в nстерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним nшприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам nембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають nхарактерну цитопа­тичну дію, яка проявляється nутворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан­тоїсної оболонки. Вони nопуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. n84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі nз курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів nрепродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів nзастосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в nтому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх nаглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні ви­значають nза титром гемаглютинації – найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще nвиявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при nкультивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні nлунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на nякій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна nоболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. nЇх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують nвіруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше nв кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за nумови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді nперевернутої парасольки.

Зараження nлабораторних тварин. Численні nлабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та nідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, nрозробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше nвикористовують білих мишей різного віку (навіть одно- nі дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових nщурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи nзараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання nтощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, nу дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, nпідшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, nвнутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Зараження мишенят-сисунців у nмозок при діагностиці Коксаки- інфекції

Для виділення вірусів простого nгерпесу, натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин n(кроликів) на скарифіковану рогівку ока. При дослідженні вірусів nгепатиту А вводять досліджуваний матеріал через рот. При виділенні вірусів з nнейротропними властивостями, таких як арбовіруси, віруси сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей (1-2-денних сисунців) у мозок. nДля цього матеріал попередньо обробляють антибіотиками nдля деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і nвводять у мозок до 0,02 мл матеріалу дещо вище орбітального горбика. Тварин, nякі загинули протягом 24 год після введення матеріалу, nбракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок травматичних ушкоджень. За nрештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). nЇх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому nсприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення nштучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, nякі використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. nТепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, nякі високочутливі до більшості вірусів, здатних nвикликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин nHeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок nмавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із nбудь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною nобробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі nшматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування nзв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини nпоміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в nкамері Горяєва.

 

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними nабо синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої nхудоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні nгідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти nтканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, nякі подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких nсередовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад nкомпонентів, які входять до їх складу, може nзмінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже nїх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, nкомбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних nумовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 n(культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), nсередовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот nі вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), nсередовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин nХенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання nклітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в nлабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, nаденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, nаденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої nмавпи (культивування поліо­вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих nембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), nнирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, nреовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання nсуворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування nмікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матері­алу або повітря спричиняє їх загибель. nТоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, nоскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання nцього до живильних середовищ і досліджуваного nматеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну n(100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, nлінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або nінших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур nклітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у nлабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів ivitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони nпредставляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту nі розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи nтваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони nшироко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та nінтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх nотримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у nвигляді одношарових культур, прикріп­лених до поверхні скла, у спеціальних nматрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур nклітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp‑2 (карцинома гортані людини), КВ n(карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка nембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), nВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин nвідбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від nіншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні nклітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають nдиплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання nвакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними nвірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної nактивності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, nчерез що їх рідко використовують у практиці звичайних nвірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які nодержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, nсвиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього nспочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у nживильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та nгліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і nпоступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких nумов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У nразі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури nорганів. Вони представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів nтварин, які протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою nжиттєдіяльність в особливих умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові nкультури. З цією метою культури клітини вирощують у nфлаконах, пробірках, матрацах, які розташовуються горизонтально, щоб клітини nмогли прикріпитись до скла. Перед зараженням їх проглядають під nмікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований моношар клітин. Для nзараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють nживильне середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у nкожну пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а nпотім інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1-2 год для nадсорбції вірусів на поверхні клітин. Після цього nвидаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для видалення nнеприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середовище n(середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої nхудоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у nтермостаті при 37 °С протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи nрезультати.

Внаслідок розмноження вірусів у nкультурі клітин у них виникають дегенеративні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). nСтупінь їх вираження визначається видом вірусів, їх nінфікуючою дозою, фізіологічними особливостями клітин тощо. В одних випадках ці nзміни виникають через декілька днів після зараження n(віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька тижнів і навіть nмісяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження nнайчас­тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД₅₀ (ЦПД₅₀ n– така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % nпробірок, що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин nможна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують nутворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують nдесятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким nзаражають відповідні культури клітин. Після n30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають nбентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну nбичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини nантибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні nклітин, бентоніт надає моношару клітин молочного nкольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки nпервинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється nформуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

За морфологічними nзмінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної nдії. Її особливості дозволяють провести попередню діагностику захворювання.

При повній nдегенерації клітинного моношару спостерігаються nзміни в переважній більшості клітин. Вони гинуть, nвідокремлюються від скла. Окремі клітини, що залишаються живими, змінюють свою nморфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми. nТакий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам nполіомієліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне nвідокремлення всіх клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, nреспіраторно-синци­тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому виникають багатоядерні nгігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви­кликають утворення nскупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круглоклітинна дегенерація). При репродукції риновірусів nутворюються округлі клітини, які мають відростки, а при розмноженні nгерпесвірусів спостерігається формування подібних клітин однакового розміру, nякі розкидано по всьому моношарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний nтип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної nгарячки) не здатні викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для їх виявлення використовують феномен nінтерференції, при якому клітинні культури паралельно заражають іншими nвірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за nчотири-плюсовою системою: (4+) – означає, що nвідбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх, (2+) – у 50 %, (+) – до n25 % клітин, (+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклітинні nвключення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в цитоплазмі nклітин. Їх утворення, форма, nвеличина, наявність у них вірусних нуклеїнових кислот є важливим моментом при nпроведенні вірусологічної діагностики захворювань. Такі включення утворюють nвіруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), натуральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденовіруси, віруси nгрипу та інші.

Включення виявляють при світловій nмікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на nспеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують nдосліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють nотримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод nімунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними nсироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях nлюмінесцентного мікроскопа включення світяться nхарактерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) nза допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити nтонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних nвключень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або nгістологічні зрізи із тканин загиблих.

Цитопатична дія  вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, nфарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи. З nцією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках nабо пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після nодержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить nвіруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод nімунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними nсироватками, кон’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях nлюмінесцентного мікроскопа включення світяться nхарактерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) nза допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити nтонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або nвнутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, nзскрібки клітин або гістологічні зрізи із тканин загиблих.

Методи ідентифікації вірусів

 

 

 

Важливим етапом лабораторної nдіагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у nдосліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних nсироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання nеритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді n«парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

 

 

 

Реакція nгемадсорбції

 

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується nна здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою nспецифічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації nеритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени n(вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, nлабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні n(або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення nкомпонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН n7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців n(гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та nзберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх nстабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи nакриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних nінгібіторів, прогріваючи при температурі n56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи nрозчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом nта іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення nактивності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює nвід 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, nяке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною nреакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який nдифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на nдні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій nаглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

 

Облік nреакції  гальмування гемаглютинації

 

Для постановки реакції з метою nвизначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) роблять nдвократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а потім nдодають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від nвластивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, n37 °С 1-18 год. Потім до комплексу nдодають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини інкубують nпротягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і nоцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при nвідсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для nідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція nгальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно nполягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні nкультур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці nглікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при nвзаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, nзв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, nкультура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням n1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, nгвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або nрозчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, nпопередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають nтемпературному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів nгемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури nклітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в nтому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від nвластивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану nвірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок nвидаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин n(білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку nдодають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У nконтрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку nтварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка nомивали клітини, при кімнатній температурі протягом n15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, nінкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після nцього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування nеритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на nнаявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При nпозитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному nсередовищі, при негативній – вони адсорбуються на nклітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників nпарагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних nвірусів та ін.

Реакція nнейтралізації. Принцип nреакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, nяке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію nможна ставити в культурах клітин з обліком результатів nза цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом nбляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі nсисте­ми – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий nматеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), nімунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин nХенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. nЇї підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. nНайчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні nкультури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, nпопередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. nПо 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура nклітин. Перед проведенням досліду в пробірках nзамінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з nкультурою клітин для кожного розведення вірусмісткого nматеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. nКлітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. nРезультати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають n50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше nрозведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують nпробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу n(найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі nпротягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 n°С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. nВідсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, nякий вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію nможна ставити в спеціальних nполістиролових планшетах.

Кольорова nпроба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні nгинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки nабо при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур nклітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок nчого утворюються продукти клітинного метаболізму, які nзсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору nіндикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на nсолом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусміст­кого матеріалу, який містить 100 nТЦД₅₀, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної nсироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при nтемпературі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з nіндикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають nрезиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають nрезультати. При позитивному тесті в дослідних nпробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо nвимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу nособливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації nвірусів є реакція nнейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип реакції полягає в тому, що nантитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують віруси, сприяють nзменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій nкультурі клітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках nабо матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які nпопередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього поверхню моношару клітин заливають освітленим nіндиферентним агаром у суміші з усіма необхідними компонентами і суправітальним nбарвником нейтральним червоним. Заражені клітини nінкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу протягом 5 діб nпри температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення nутворення бляшок є використання бентонітового покриття. Цей метод набув nширокого застосування при вивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в nтому, що заражені сумішшю вірусів та імунної сироватки моношарові культури nклітин заливають рідким живильним середовищем, яке nмістить гель бентоніту. Часточки бентоніту адсорбуються на поверхні культур nклітин і гальмують вільне поширення вірусів серед nклітин. Вже через 2 дні після зараження nз’являються вірусні бляшки у вигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні nмоношару клітин (див. вкл., рис. 28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить nзменшення числа та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у nпорівнянні із контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число бляшок або їх величина зменшились на n80 % у порівнянні з контролем. Нейтралізуючим титром сироватки є те її nнайбільше розведення, при якому ще спостерігають нейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або nлабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та nспецифічної імунної сироватки. При обліку результатів nвраховують кількість загиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на nхоріоналантоїсній оболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації nвірусів за їх, наприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної діагностики nгерпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію nзв’язування комплементу nдосить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації nхвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних nгетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із nспецифічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього не відбувається nгемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна nімунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та nелектроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед nпостановкою основного досліду обов’язково титрують для nвизначення робочих доз інгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують nвірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. nПісля інкубування цієї першої системи до неї додають nпопередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній nтемпературі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між nвірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. nТому наступне додавання гемолітичної системи (при nвідсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – nпозитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний nкомплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх nгемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою nсистемою: від “++++” – різко позитивна реакція n(прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність nосаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при nвірусологічних інфекціях належить те, що її можна ставити як при температурі 37 n°С (інкубуючи систему “антиген – антитіло – комплемент” протягом 1 год), так і nна холоду (+4 °С протягом 18 год), а також використовуючи мікрометод, коли nвсі інгредієнти реакції беруться в об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх nвірусних інфекціях.

 

Облік РЗК

 

У реакціях імунодифузії використовують nпринцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому nсередовищі, наприклад, агаровому гелі. У зоні оптимальних співвідношень nантигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від nкількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія nвідповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному nсклі, яке покривають 1 % агарозою. Після застигання в nній роблять лунки. У центральну лунку вносять специфічну противірусну nсироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить nвіруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24-48 год. Поява ніжних nліній преципітації свідчить про наявність вірусного nантигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні nіз електрофорезом. Метод зустрічного імуноелектрофорезу найчастіше використовують для nвизначення HВsAg вірусу гепатиту В або інших вірусних nантигенів, які мають негативний заряд. Сутність цього методу полягає в тому, що nна скляну пластинку наносять шар агарози, в якому після nзастигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у лунки, які роз­ташовані nближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. nПісля цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають nпостійний електричний струм. Вірус­ні антигени з негативним зарядом рухаються в nнапрямку до аноду, а антитіла сироватки – до катоду. nЧерез 24 год в агаровому гелі спостерігають появу nліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні nконцентрації антигенів і антитіл.

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє визначити nкомплекси, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із nспецифічними антитілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш nефективним, ніж використання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації nметоду матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують nпротягом 1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси nвірусів з антитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після nпромивання осаду до нього додають 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або nураніл-ацетат. Встановлюють відповідне значення рН, наносять матеріал на nспеціальну мідну сітку і вивчають під електронним nмікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, навантажених nантитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації вірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту nтощо.

Метод nфлуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у вірусології внаслідок nвисокої специфічності та зручності в користуванні. Існують численні модифікації nцього методу. Зокрема, можна виявляти та ідентифікувати віруси як безпосередньо nв досліджуваному матеріалі, так і після попереднього nзараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає у взаємодії nантигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами (родаміном, який nдає люмінесценцію червоного кольору, або флуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який nзумовлює зелене світіння комплексу в ультрафіолетових променях). nМетод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно використовувати для nідентифікації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження nкультуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, nпопередньо заражають досліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують nпри оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця nфіксують в ацетоні та наносять на них специфічну сироватку. Систему інкубують у nвологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, nвідмивають від надлишку сироватки і наносять тонкий шар флуоресціюючої nантисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця nвідмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під nлюмінесцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

РІФ

При реакції радіального гемолізу відбувається nвзаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на еритроцитах, суспендованих в nагарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки і дифундують в шар агару. При nцьому утворюються специфічні імунні комплекси на поверхні еритроцитів. У nприсутності комплементу спостерігається лізис еритроцитів і, відповідно, nутворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою стереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони nгемолізу навколо лунки може досягати 2 мм і більше. При відсутності гемолізу nабо його діаметрі менше 2 мм nреакцію розцінюють як негативну. Вважається, що за своєю nчутливістю ця реакція не поступається РГГА.

 

Реакція зворотної непрямої гемаглютинації використовується nу вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність nїї полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними nпротивірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок nчого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції nє еритроцити, оброблені таніновою кислотою з адсорбованими на них молекулами nпротивірусних антитіл (сенсибілізовані еритроцити), вірусні антигени і розчин nелектроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в капілярах, а також nмікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний nматеріал (0,025 мл) розводять дво­кратно електролітом, після чого додають такий nсамий об’єм еритроцитарного анти­тільного діагностикуму. Експозиція nвідбувається протягом 30 хв при температурі 37 °С після nчого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних nлунках спостерігають виражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з nнерівними хвилястими краями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки nабо лунки – “перевернута парасоль­ка”. При негативному результаті – щільний, nкомпактний осад з рівними краями.

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при nцьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки nнеобхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання nантигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи nзабарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза nхрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові nпродукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза n(бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції nне такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна nфосфатаза, особливо при використанні технік з nподвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній nпрактиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, nа також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які nмають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі nімуноферментні методи.

Прямий nметод. На першому етапі nреакції антиген реагує з антитілом, міченим nпероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат n(наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо nантиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. nМетодика постановки проста, проте така реакція вживається рідко nз приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий nметод. Спочатку антиген nреагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс nантиген – антитіло. Після промивання у систему вносять nпротиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим nкомплексом. Після наступного промивання вносять nсубстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу nвідповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації nтехніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені nгаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти nгаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують nможливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, nмає 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому nавідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також nдля інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях nпочали за­стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх nвикористання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. nБіотинована пероксидаза і авідин після змішування nутворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і nбіотинованої лужної фосфатази.

Непрямий nІФА

 

Облік ІФА

 

Техніка подвійної мітки. Останнім часом nодержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть nбути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі nі для диференціації субпопуляцій nлімфоцитів. На клітинах nодночасно можна виявити два або більше різних nантигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання nавідин-біотин-пер­оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне nмоноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при nцьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У nнаступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з nкомплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого nантитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні nімуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої nфази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи nантитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджува­ну сироватку, а після інкубації і промивання nвносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають ­субстрат для nвикористаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або nспектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного nметоду, найчас­тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і nхарактеристики специфічних антитіл у різних класах nімуноглобулінів. Особливо важливими є моди­фікації ІФА-IgM з використанням nмоноклональних антитіл.

Конкурентний nтвердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану nсироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені nферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені nантитіла не можуть реагувати з цим антигеном і nактивність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності nв сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені nензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні nсубстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться nвсі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами nантигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два nнукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність nзаміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є nпоказником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також nавторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного nзв’язування антитілами досліджуваного антигена і nміченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій nкількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого nантигена зв’язується з антитілами.

Принцип nконкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій nфазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім nдодають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі nспецифічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись nз антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у nпробі.

Метод n“сендвіча” також nвикористовується для дослідження антигенів. У даному nвипадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного nкомплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною nміткою, яке зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить nвід кількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ nможе застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві nдетермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій nфазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного nміченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних nантитіл.

Для дослідження алергенів і IgE nвикористовують тести RAST (radioallergo­sorbent test), а також RIST n(radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (­фільтрувальний nпапір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла nIgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З nдопомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. nВідповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних nметодів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні nспецифічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними nізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість nрадіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти nбіополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які nбули розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано nз тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних nантитіл, оскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У nзв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені nмолекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, nдосліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), nстають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та nімобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані nантигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції nелектрофоретично ­переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в nспеціальній камері. ­Фіксова­ні блоти обробляють специфічними до антигена nантитілами, відмивають і додають ра­діо­активно мічений кон’югат для виявлення nантитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок nнітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. nНа проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені nантитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла nабо антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму n(хромоген) повинен бути попередньо нанесений на nнітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, nв яких використовується блотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southerблотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести nдо двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і nтих, які базуються на феномені реакції антиген-антитіло.

Реакції nгібридизації блотинг – nвисокоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової nкислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні ­зонди, що nзастосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, ­штучно­го nсинтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на від­міну nвід РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділи­ти nдві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним nізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного nзонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в nструктурі якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним ­аналогом nтрифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, nвиконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному nматеріалі знайде комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна nвиявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який зна­ходиться в яйці, специфічно здатний nзв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які nреагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагують з біотином, який nзнаходиться в гібридизованому зонді, ­свідченням чого nє зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфіч­ний субстрат. Зонди з nбіо­тином можна виявити, використовуючи мічені флуоро­хромом антитіла проти ­біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які nмістять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн nімуноблотинг використовується nдля виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) nрозділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки nмігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які nскладаються з білків різної молекулярної маси. Після nрозділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є nтою основою, на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. nМембрану ріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і nінкубують їх певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти nбілків. ­Смуги промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають nмічену антиглобулі­нову сироватку. Після чого смуги nповторно промивають для видалення антиглобулінових мічених антитіл і nспостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де наступила реакція між антигенами nі антитілами. У цьому методі можна використовувати мічені ізотопом антитіла .

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є nбіотин, за­стосування якого значно підвищує чутливість nреакції і вилучає небезпеку, пов’язану з радіоактивним випромінюванням. Проте nзастосування біотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з nбіотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної реакції nнаступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова nметодика, яка вживається для дослі­дження різних аспектів імунологічної nвідповіді в процесі розвитку інфекційного процесу. З nїї допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також анти-IgM, nанти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує nфакт зараження ВІЛ на основі виявлення антитіл. Вона використовується для nдиференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики захворювань, nвикликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

Виділення та титрування nбактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бакте­рій описав М.Ф. Гамалія в 1898 nр. Детальніше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом nдослідив канадський мікробіолог Ф. ­д’Ерелль у 1917 р. nВін назвав цей агент бактеріофагом. nНа основі вивчення феномена nбактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та nгенетики. Бактеріофаги виявились основною моделлю для дослідження nтонкої структури гена, універсального генетичного коду, впливу радіації на nспадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму nсперматозоїда. Вони складаються з гексагональної головки, в nякій ­міститься ДНК, хвостового відростка (стержня, оточеного nбілковим чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами. Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утво­рена nкапсомерами, які оточують одну щільно скручену мо­лекулу ДНК. Порожнистий nвідросток довжиною 100-200 нм служить для прикріплення до поверхні бактерійної nклітини та її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою базальної nпластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість ­морфологічних типів фагів: nнитчасті, без відростка, з аналогом відростка, nкоротким відростком, з чохлом відростка, що не скорочується й з чохлом nвідростка, що скорочується.

 

Будова бактеріофагу

 

Бактеріофаги

Хімічний склад фагів, як інших nвірусів, представлений нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю ліпідів nу оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК. За своїм nскладом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних структур nінших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість n“внутрішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься nфермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової nкислоти в бактеріальну клітину.

Бактеріофаги на поверхні клітини

 

Адсорбція і проникнення фага в nклітину

 

Реплікація фагів та їх  збирання

 

Вихід бактеріофагів

 

У мікроорганізмів, виявляється, nтакож існують “інфек­ційні хвороби”, і викликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характеризується строгою специфічністю. Для nкожного виду як патогенних, так і сапрофітних мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на n“свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на nпевну різновидність (або навіть певний штам), що має nвелике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих nфаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції nта намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які nздатні лізувати кілька близьких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох nфакторів зовнішнього середовища. Зокре­ма, вони nвитримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та nрентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони nшвидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії nдезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, додати декілька nкрапель відповідного бактеріофага, то через певний час ­відбувається nпросвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення nлізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають nмікроорга­нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні nсуцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст nвідсутній. Такі зони мають, як правило, круглу форму і виникають внаслідок літичної nдії бактеріофагів. Їх називають nнегативними колоніями або бляшками nбактеріофагів.

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бактеріальною nклітиною, вони поді­ляються на вірулентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всередину клітини, спричиняючи nїї лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних nпрактично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні nбактеріофаги, частина клітин залишається неушкодженою ними, тому що nспостерігається явище лізогенії – інтеграції nгенома бактеріофага в геном клітини.

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікроорганізми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких факторів (іонізуючого й ультрафіолетового nвипромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має велике біологічне nзначення й широко поширена у мікробному світі, тому що nпід впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості nбактерій. Таке явище називають фаговою nконверсією. Доказана можливість перетворення нетоксигенних дифтерійних nпаличок у токсигенні під впливом лізогенізації їх nпомірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують nсинтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. nДоведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників nботулізму, стафі­лококів та інших бактерій. У деяких nвипадках під впливом помірних бактеріофагів можуть nзмінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі­онів, nферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх nвикористовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, nв генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних nпроцесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони nзустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм види nмікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, nплазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють nбактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та nпаратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур nмікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом nвідповідні бактерії. Для цього досліджуваний матеріал nцентрифугують, для осадження твердих частинок, а надосадову рідину в об’ємі 1 nмл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який попередньо засіяний 1 мл n6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інкубації при температурі 37 n°С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, nрозводять у 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 nразів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та інкубують протягом доби nпри оптимальній температурі. Як контроль використовують культуру бактерій без nбактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріофаг, середовище залишається nпрозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той час як у контрольній пробірці nвідбувається ріст бактерій (середовище стає мутним).

Для визначення наявності інфекційних nбактеріофагів використовують метод Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в nтому, що попередньо матеріал, який містить бактеріофаг, nрозводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10^-1, 10^-2, 10^-3, n10^‑4. Після цього по 1 мл кожного nрозведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 % м’ясо-пептонного агару, додають n0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно перемішують і виливають у чашки nПетрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 % м’ясо-пептонного агару. Чашки nзалишають на 30 хв при кімнатній температурі для nзастигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих nстерильних плям – “негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом nГраціа, після добової інкубації підраховують nчисло “негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає nкількості фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число nфагових корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній nмножать на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10^-4 nз’явилось 50 колоній, отже, титр фагів дорівнює: 50х10^-4 або 5х10^-5 в 1 мл.

Титрування фагів

 

Утворення бляшок

 

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд пробірок із м’ясо-пептонним nбульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг

Титрування бактеріофагів за методом nАппельмана

Після цього в них додають по 0,05 мл nіндикаторних мікроорганізмів. Паралельно готують контрольні пробірки: одну – з nкультурою бактерій без фага, а другу – з бактеріофагом без мікробів. Посіви nінкубують при 37 °С протягом 18-24 год і спостерігають за лізисом nмікроорганізмів. Титром бактеріофага вважають найбільше його розведення, яке викликає повний лізис бактерій.

Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, nїх можна використовувати для фагоіндикації n– визначення виду відповідних бактерій в інфекційному матеріалі nта об’єктах зовнішнього середовища.

Для цього у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном nзасівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. nПробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють nмутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці nі роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії nбактеріофагів.

З цією ж метою на щільне живильне nсередовище газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після nпідсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою nнаносять краплю відповідного розведення бактеріофага, яке вказано на ампулі. nПосіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність nпрозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофага. Позитивний nрезультат вказує на належність бактерій до певного виду.

Фаготипування бактерій проводять з метою аналізу nепідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його nвиконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. Цей метод nгрунтується на використанні специфічної чутливості бактерій до своїх nбактеріофагів, яка свідчить про спільне (тотожнє) nпоходження бактерій, що мають однаковий фаготип.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) nзбудників. Для цього чашку з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують 4 годинну бульйонну nкультуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на nповерхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру nпо поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують nу термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню засіяного газону в nкожний квадрат капають піпеткою певні бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній nтемпературі протягом 18-20 год, після чого оцінюють результати за допомогою nлупи. Залежно від чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюють за nчотири-плюсовою системою: від лізису, який зливається, до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фага є постійною nознакою, порівнюють фаготипи досліджуваних культур з nфаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх nзбігові роблять висновок про виявлене джерело інфекції.

 

 

Санітарна nмікробіологія. Екологiя мiкроорганiзмiв.

Мiкрофлора та санiтарно-показовi бактерiї грунту, води, повiтря, методи їх визначення.

 

Мікроорганізми повсюдно поширені nу навколишньому середовищі. Вони є в грунті, воді, повітрі, на рослинах, nхарчових продуктах, предметах, в організмі людини і тварин. На відміну від nрослин і тварин, мікроорганізми можуть використовувати в процесах метаболізму nметан, водень, молекулярний азот, окис вуглецю і перетворювати їх у сполуки, що nзасвоюються рослинами і тваринами. Так, наприклад, гнильні мікроорганізми, nрозщеплюючи загиблі рослини і трупи тварин, повертають в атмосферу 90 % вуглекислого газу, який nпоглинається  рослинами.

У кругообігу азоту беруть nучасть азотфіксуючі бактерії родів Phizobium, Azotobacter, деякі актиноміцети, синьо-зелені водорості та nін. У грунті відбуваються процеси амоніфікації (гниття білків з утворенням nаміаку) і нітрифікації (окислення солей амонію в азотнокислі сполуки, що nзабезпечує рослини легко засвоюваними сполуками азоту); під впливом nденітрифікуючих бактерій (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa та ін.) здійснюється денітрифікація – nрозкладання азотно- й азотистокислих солей з виділенням вільного азоту, в nрезультаті чого збе­рігається рівновага між вмістом молекулярного азоту в nатмосфері і  зв’язаним  азотом  nгрунту, рослин і тварин.

Процеси розпаду безазотистих nречовин називаються бродінням. Розрізняють бродіння спиртове (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces el lipsoides та ін.), маслянокисле (Clostridium butyricum.Clostridium lactis та ін.), молочнокисле (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis та ін.) і бродіння пептинових речовин (Flavobacterium pectinovorum та nін.). Названі реакції беруть участь у кругообігу вуглецю.

Кругообіг сірки, фосфору і nзаліза здійснюється сіркобактеріями, залізобактеріями та іншими видами nмікроорганізмів.

Ферментативна активність мікроорганізмів nзабезпечує звільнення поверхні Землі від загиблих рослин і тварин, а також від nекскрементів тварин і людини; вони мінералізуються з утворенням вуглекислого nгазу, аміаку, води, азотистої, азотної, сірчаної і фосфорної кислот, що nвикористовуються в природі для синтезу складних органічних  сполук.

Як показник загального рівня бактеріального nобсіменіння грунту, води, повітря, харчових продуктів, оточуючих предметів nвикористовують мікробне число (загальна кількість мікроорганізмів в 1 мл nдосліджуваної рідини, 1 г nтвердої речовини, 1 м³ nповітря, на 1 м^{2 n}поверхні площі досліджуваного об’єкта або субстрату), яке визначають nметодом прямого підрахунку під мікроскопом або за допомогою мембранних.

Загальний рівень nбактеріального забруднення і кількість санітарно-показових мікроорганізмів n(бактерії групи кишкових паличок, ентерококи, стафілококи, стрептококи, nтермофіли) є непрямими показниками ймовірності потрапляння у навколишнє nсередовище патогенних   видів.

Мікрофлору nнавколишнього середовища вивчає санітарна nмікробіологія, завданнями якої є: розробка методів мікробіологічних і nвірусологічних досліджень грунту, води, повітря, предметів побуту, харчових nпродуктів та ін.; вивчення джерел забруднення навколишнього середовища nмікрофлорою, що становить небезпеку для людини; дослідження життєдіяльності nмікроорганізмів у навколишньому середовищі, особливо в умовах його хімічного і nбіологічного забруднення; визначення нормативів для гігієнічної оцінки об’єктів nнавколишнього середовища, в тому числі харчових продуктів (за мікробіологічними nпоказниками); обгрунтування заходів для оздоровлення об’єктів навколишнього nсередовища і контроль за ефективністю їх виконання (якість водопостачання, nробота підприємств харчової промисловості і громадського харчування, знезаражування nстічних вод,  покидьків та ін.)

Складні взаємозв’язки мікроорганізмів із середовищем, які зумовлюють їх розмноження, розвиток і виживання, nвивчає спеціальна біологічна наука екологія. Розрізняють екологію nпопуляцій і екологію угруповань. Вивчення nекології мікроорганізмів є основою для розуміння явищ паразитизму, механізму виникнення зоонозних захворювань, особливо тих, що характеризуються nприродною вогнищевістю, а також для nрозробки практичних заходів у боротьбі з різними   nінфекційними   захворюваннями

 

Мікрофлора nгрунту

Учення про грунт створили С. nМ. Виноградський, В. В. Докучаев, П. А. Костичев, В. Р. Вільямс nта інші вчені. Родючість грунту залежить не тільки від наявності неорганічних nта органічних речовин, а й від різних видів мікроорганізмів, nщо зумовлюють якісний склад грунту. У грунті є необхідні для розвитку бактерій nпоживні ре­човини і волога, внаслідок чого їх кількість в 1 г грунту досягає величезних nкількостей: від 200 млн у глинястому грунті до 5 млрд у чорноземному. В 1 г орного шару грунту nміститься 1—10 млрд бактерій.

Мікрофлора родючого грунту nскладається з популяцій водоростей, актиноміцетів, нітрифікуючих, nденітрифікуючих, целюлозорозкла-даючих бактерій, сіркобактерій, пігментних nмікроорганізмів, грибів і найпростіших. Особливо велике значення мають nазотфіксуючі бактерії, які можуть жити не тільки в коренях бобових, а й на nтютюнових рослинах. У збагаченні грунту азотом важливу роль відіграють nсиньо-зелені водорості. Ступінь обсіменіння грунту мікроорганіз­мами залежить nвід його характеру та хімічного складу.

Найбільше (1 000 000 в 1 мм³) бактерій у верхньому шарі грунту— nна глибині 5—15 см. У глибоких шарах (1,5—6 м) трапляються одиничні особини; їх nвиявлено і в артезіанській воді. У родовищах нафти живуть нафтові бактерії. nЖивлячись парафінами (відходи нафти), вони перетворюють частину нафти в густу nасфальтоподібну масу, вна­слідок утворення якої закупорюються природні nрезервуари нафти. В орному шарі окультуреного грунту товщиною 15 см на площі 1 га може бути 5—б т бактеріальної nмаси

Основні представники мікрофлори грунту:

Нітрифікуючі, nденітрифікуючі, азотфіксуючі бактерії, сірко-, залізобактерії, гриби, nнайпростіші.

 

З виділеннями nлюдей і тварин у грунт попадають і деякий час там зберігаються збудники правця, nгазової гангрени, ботулізму, сибірки, черевного тифу, дизентерії, холери, nокремі віруси.

Обсіменіння грунту nмікроорганізмами залежить від ступеня забруднення його фекаліями і сечею, а nтакож від характеру обробітку та удобрення. Наприклад, в орному шарі грунту в n2,5 раза більше мікроорганізмів, ніж у лісовому. У грунті довго зберігаються спори nсапрофітів (В. cereus, В. megaterium та nін.).

Патогенні, що не утворюють nспор, бактерії внаслідок нестачі потрібних поживних речовин, а також в nрезультаті згубної дії світла, висихання, бактерій-антагоністів і фагів nзберігаються у грунті від кількох діб до кількох місяців.

У здійсненні профілактичних nзаходів санітарна мікробіологія враховує властивість багатьох видів ґрунтових nбактерій (В. subtilis, В. brevis, В. nthermophilus та ін.) пригнічувати nріст і розмноження патогенних   і   умовно-патогенних   мікроорганізмів.

Звичайно nгрунт є несприятливим середовищем для більшості патогенних видів бактерій, nвірусів, грибів, найпростіших. Проте як фактор передачі низки збудників nінфекційних захворювань він відіграє важливу роль

Відбір проб грунту проводять у 4-5 точках вибраної nділянки на глибині 10-15 см. nЛопатою викопують ямки глибиною 20см. Над однією з бокових стінок ямки за допомогою nпропаленого на вогні ножа зрізають верхній шар грунту. В стерильну банку беруть nпо 200-300 г nіз кожної точки, змішують, відбирають наважку в 30 г і вносять у колбу, що nмістить 300 см³ стерильної води. Суміш ретельно збовтують на протязі n10 хв, потім відстоюють 2-3 хв для осідання грубих частинок.

При необхідності брати пробу з глибших шарів грунту nвикористовують спеціальний земляний бур Некрасова, який дає змогу відбирати nпроби на заданій глибині.

Із отриманої суспензії готують серійні десятикратні nрозведення від 10^-1 до 10^-6 і більше. По 1 см³ nіз останніх двох розведень вносять на дно двох стерильних чашок Петрі й nзаливають 15 см³ розтопленого й охолодженого до 45 С nМПА. Після застигання середовища чашки інкубують 48 год при 28-30С. nІз суми колоній, що виросли на двох чашках одного розведення, вираховують nсереднє арифметичне й визначають ЗМЧ. Наприклад: посіяно 1 см³ nсуспензії грунту з розведення 10⁴; на чашці з агаром виросло в nсередньому 70 колоній; отже ЗМЧ = 70 х 10⁴ = 7 х 10⁵ nбактерій.

При визначенні титру БГКП по 1 см³ різних nрозведень грунту засівають у 9 см³ глюкозо-пептонного або nлактозо-пептонного середовища. В разі розкладу вказаних цукрів до кислоти й nгазу висів роблять на середовище Ендо, темно-червоні колонії, що виросли, nмікроскопують, ставлять пробу на оксидазу й вираховують титр БГКП так само, як nі для води.

Титр ентерококів визначають шляхом посіву nвідповідних розведень на середовище Каліни або ДИФ-3; перфрінгенс-титр nвираховують посівом розведень суспензії на середовище Вільсона-Блера; кількість nгрибів  nна середовище Сабуро, актиноміцетів  на nкрохмально-аміачний агар. Для визначення титру термофільних бактерій різні nрозведення суспензії грунту вносять у чашки Петрі, заливають розтопленим і nохолодженим МПА. Посіви інкубують 24 год при 60 С, nпідраховують кількість вирослих колоній і роблять перерахунок на 1 г грунту.

Оцінку ступеня забруднення грунту проводять шляхом nвизначення загального мікробного числа й кількісного аналізу основних nіндикаторних мікроорганізмів                                                      n                                                    

Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту

 

Санітарно-показові бактерії грунту: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium perfringens – показники фекального nзабруднення і термофільні мікроорганізми.

Колі індекс n– кількість бактерій nгрупи кишкової палички в 1 г nгрунту

Грунт вважається чистим, якщо його колі-індекс nне перевищує 1000.

 

Мікрофлора nводи

1. автохтонна – nактиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони;

2. заносна, при nзабрудненні водоймищ стічними водами – кишкові палички, ентерококи, клостридії, nспірили, вібріони, ентеровіруси, ротавіруси.

 

Мікрофлора води річок залежить nвід ступеня їх біологічного забруднення та якості очистки стічних вод, які nспускають у русла річок.

Мікроорганізми дуже поширені nтакож у водах морів і океанів, де їх виявляли на різних глибинах (3700—10 000 м). До них належать nгалобактерії (рід Halobacterium) і nгалококи (рід Halococcus), nякі адаптувались до існування в умовах високих концентрацій солей. Галобактерії nі галококи — хеморганотрофи, аероби, плеоморфні мік­роорганізми, утворюють nпігменти різного кольору, індол, сірководень, оксидазу, каталазу, розріджують nжелатину.

Із морської води прибережної nзони систематично висіваються галофільні вібріони — V. parahaemolyticus, V. angilolyticus, які спричинють у людей гострий nгастроентерит, що виникає в результаті вживання у їжу малосольної риби, а також nнедостатньо термічно оброблених креветок і мідій.

Ступінь обсіменіння води nорганізмами прийнято виражати сапробністю, під якою розуміють сукупність живих nістот, які живуть у водах з великим скупченням тварин або рослинних решток. Розрізняють nчотири зони сапробності.

Полісапробна зона— дуже забруднена вода, бідна на кисень і багата на органічні сполуки. nКількість бактерій в 1 мл доі сягає 1 млн і більше, переважають Е. соїі та nанаеробні бактерії, які спричинюють процеси гниття і бродіння.

У мезосапробній nзоні (зона помірного забруднення) мінералізуються nорганічні речовини з інтенсивним окисленням і вираженою нітрифікацією. nКількість бактерій в 1 мл становить сотні тисяч.

Олігосапробна зона характерна для чистої води. Кількість бактерій у ній nнезначна, в 1 мл налічується кілька десятків або сотень:; Е. соlі у цій зоні немає.

Катаробна зона— nзона дуже чистої води (особливо в осінньо-зимовий період), вона розташована nвдалині від населених пунктів і берегів.

Санітарно-показові бактерії води: кишкова паличка, ентерокок, Clostridium nperfringens – показники фекального забруднення.

 

 

 

Мікробіологічні показники безпеки питної води

(Наказ nМОЗ України від 23.12.1996 р.)

 

Визначення ЗМЧ – по1 nмл води різних розведень засівають у розтоплений і nохолоджений МПА на чашках Петрі.

 

 

 

 

   Визначення nБГКП проводять за методом мембранних фільтрів або за методом бродильних nпроб.

До категорії БГКП належать бактерії nродини Enterobacteriaceaе, що обєднує nроди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це nграмнегативні, безспорові, оксидазонегативні палички, які ферментують глюкозу і nлактозу до кислоти й газу при 37 С. Вони виділяються в зовнішнє nсередовище з випорожненнями людей і теплокровних тварин і є кількісним nпоказником ступеня фекального забруднення води. Тому чим більше її фекальне nзабруднення, тим вища ймовірність контамінації води відповідними патогенними nмікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних nбактерій, а в ній  фекальні кишкові палички (ФКП), які nрозкладають лактозу при 44,5 С. До E.coli nвідносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником свіжого nфекального забруднення. Для його визначення можна використати S.faecalis, який порівняно nшвидко гине в оточуючому середовищі.

При повноцінному nсанітарно-мікробіологічному дослідженні води визначають ЗМЧ, БГКП, E.coli, nентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (холерні вібріони, nсальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного nаналізу відбирають 500 см³ води у стерильні флакони, закриті nватно-марлевою пробкою, покритою зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з nводопровідних кранів проводять після обпалювання їх спиртовим факелом і nнаступного випускання води на протязі 10 хв. Проби хлорованої води беруть у nфлакони з дехлоратором (на 500 см³ води 2 см³ 1,5 % nрозчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Якщо дослідження проводять на виявлення не лише nіндикаторних а й патогенних мікроорганізмів, потрібно брати пробу обємом n2500 см³ води. Коли визначають ще й індекс коліфагів обєм nпроби збільшують до 3500 см³.

У відкритих водоймах nпроби беруть за допомогою батометра.

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає кількість мезофільних, nмезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які виростають на МПА при 37 С nпротягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного бактерійного забруднення nводу сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках виростало від 30 до 300 nколоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду сіють у нерозведеному nстані в обємі n1 см³. Проби з відкритих водойм, криниць, джерел і т.п. сіють після nпопереднього їх розведення від 10^-1 до 10^-3 і більше n(особливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної nводи, в першу з них вносять 1 см³ досліджуваної води, ретельно nперемішують, із цієї пробірки переносять 1 см³ у другу, потім у nтретю і всі наступні по 1 см³ попереднього розведення. Для nвиготовлення кожного розведення необхідно брати нову стерильну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в обємі n1 см³ вносять, рівномірно розкапуючи, на дно стерильної чашки Петрі, nпотім заливають її 10-12 см³ розтопленого й охолодженого до 45 С nмясо-пептонного nагару. Обережними круговими рухами змішують воду з агаром. Як правило, сіють не nменше двох розведень і для кожного з них використовують дві чашки. Після застигання nсередовища посіви вирощують у термостаті при 37С протягом 24 nгод. Через добу підраховують число колоній у двох чашках і знаходять середнє nарифметичне. При значній кількості колоній підрахунки проводять за допомогою nспеціального приладу АПК (апарат для підрахунку колоній). Методика користування nним регламентована спеціальною інструкцією.

Відповідно до nіснуючих вимог звичайна водопровідна вода може містити не більше 100 мікробів. nЗМЧ відкритих водойм і криничної води не повинно перевищувати 1000.

Визначення кількості бактерій групи кишкових nпаличок. Цей показник (індекс БГКП) визначають nза допомогою методу мембранних фільтрів і бродильним методом. nМікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембранних фільтрів. Він nзначно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. nСутність методу полягає в концентруванні бактерій з певного обєму nдосліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні на середовищі Ендо при 37 С nі підрахунку індексу БГКП в 1 дм³ води.

При аналізі водопровідної води необхідно фільтрувати nне менш як 333 см³. При дослідженні води невідомої якості слід nфільтрувати менші обєми: наприклад 3, 30, 100, 200 см³.

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні nфільтри під 6 номерами: чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для nдослідження води використовують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до n80 С nдистильовану воду і ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кипятять nтричі по 15 хв, кожного разу замінюючи воду. Після останнього кипятіння nводу не зливають, фільтри залишають в ній до вживання.

Для фільтрування води nвикористовують апарат Зейтца або прилад Рубльовської водопровідної станції.

Прилади оптирають ватним nтампоном, змоченим спиртом, і фламбірують. Після охолодження їх монтують на nколбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик) кладуть стерильним пінцетом nпідготовлений мембранний фільтр, прижимають його верхньою частиною приладу n(стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією. У воронку n(стакан), дотримуючись правил асептики, наливають досліджуваний обєм nводи й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у колбі Бунзена. Після nзакінчення фільтрування знімають воронку (стакан), мембранний фільтр беруть nобпаленим на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так, щоб між агаром і nфільтром не було бульбашок повітря. В одній чашці Петрі можна розмістити 3-4 nфільтри. Чашки з фільтрами на середовищі Ендо вміщують у термостат догори, nінкубують при 37С nпротягом 18-24 год.

 Визначення nколі-титру та колі-індексу води

(метод мембранних фільтрів).

 

 Мікроорганізми на nфільтрі (метод мембранних фільтрів).

Електронна фотографія.

 

Облік результатів проводять через добу. При nвідсутності будь-яких колоній або при рості лише плівчастих, зубчастих та інших nколоній, не властивих для ешеріхій, видають негативний результат. Якщо nвиростають типові для коліформних бактерій колонії, з них виготовляють мазки. У nвипадках виявлення грамнегативних паличок залишок колонії пересівають у nглюкозо-пептонне середовище й при позитивній бродильній пробі присутність БГКП nвважають позитивною. Дослідження закінчують постановкою проби на оксидазу. Для nцього знімають фільтр і кладуть його колоніями на фільтрувальний папір, nзмочений реактивом на виявлення оксидазної активності. При наявності оксидази nколонії забарвлюються у синій колір. Коліформні бактерії не утворюють оксидази.

 

Мікрофлора nповітря

Мікрофлора повітря дуже різноманітна. Склад nїї залежить від ступеня забрудненості повітря мінеральними й органічними зависями, nтемператури, осадів, характеру місцевості, вологості та інших факторів. Чим nвища концентрація у повітрі пилу, газів, кіптяви, тим більше в ньому бактерій. nКожна частинка пилу або диму може адсорбувати їх на своїй поверхні.

Над поверхнею гір, арктичних nморів, океанів мікроорганізми трапляються рідко.

Мікрофлора повітря nскладається із найрізноманітніших видів мікроорганізмів, які надходять у нього nз грунту, рослин і живих організмів. У повітрі часто трапляються пігментні nсапрофітні бактерії (мікрококи, різні сарцини), В. subtilis, В. megaterium, В. cereus, nактиноміцети,  плісеневі, дріжджові гриби nта ін.

Кількість бактерій у повітрі nколивається у великих діапазонах від кількох особин до багатьох десятків тисяч nекземплярів в 1 м³. nТак, наприклад, у повітрі Арктики міститься 2—3 особини на 20 м³; у nпромислових містах в 1 см³ повітря виявляється величезна кількість nбактерій. У лісі, особливо хвойному, бактерій у повітрі дуже мало, бо на них nзгубно діють леткі речовини рослин — фітонциди, що мають бактерицидні nвластивості. Над Москвою на висоті 500 м в 1 м³ по­вітря було виявлено n1100—2700 бактерій, тоді як на висоті 2000 м — від 500 до 700. Спороносні види і nплісеневі гриби було виявлено на висоті 20 км. Деякі мікроорганізми виявляють і на nвисоті 61—77 км. В 1 г пилу є до 1 млн. nбактерій.

Залежно від пори року nякісний і кількісний склад мікрофлори повітря змінюється. Якщо взяти загальну nкількість мікроорганізмів у повітрі взимку за 1, то весною вона становитиме n1,7, влітку — 2, восени — 1,2

 

Основні представники мікрофлори nповітря: актиноміцети, nсарцини, мікрококи, бацили, гриби.

Патогенні мікроорганізми попадають в повітря від хворого і можуть тимчасово там знаходитись – збудники nдифтерії, туберкульозу, коклюшу, скарлатини, менінгіту, ангіни, грипу, кору, nаденовірусних інфекцій тощо.

Санітарно-показові nмікроорганізми повітря: гемолітичні nстрептококи і золотисті стафілококи.

Оцінку чистоти повітря закритих nприміщень проводять на основі визначення загальної кількості мікробів в 1 м³  і наявності санітарно-показових бактерій. З цією метою проби повітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Кількість мікроорганізмів у nробочих і жилих приміщеннях тісно пов’язана з санітарно-гігієнічним режимом. nПри скупченні людей, поганій вентиляції, слабкому природному освітленні, nнеправильному прибиранні приміщень кількість мікроорганізмів значно nзбільшується. Сухе прибирання, рідке миття підлоги, використання брудних nганчірок і щіток, сушіння їх у тому ж приміщенні створюють сприятливі умови для nнагромадження в повітрі мікроорганізмів.

Віруси можуть розповсюджуватися nповітряно-пиловим і повітряно-краплинним шляхом. При чханні, кашлі, розмові nхвора людина виділяє у навколишнє середовище на відстань 1—1,5 м і більше разом nз краплинками слизу, мокротиння патогенні віруси.

Мікроорганізми, що є nв повітрі, можуть бути у трьох фазах бактеріального аерозолю — краплинній, nкраплинно-ядерній і пиловій. Під аерозолем розуміють фізичну систему із дрібних nтвердих або рідких часточок, що зависли в газовому середовищі.

Людина вдихає за добу в nсередньому 12 000—14 000 л повітря, причому 99,8 % nмікроорганізмів, що є в ньому, затримуються в дихальних шляхах. Бактеріальний nаерозоль (до 60 000 краплин різного розміру), що утворюється природним шляхом у nпросторі носової частини глотки, при чханні і кашлі виділяється в повітря.

Найбільше бактерій nвиділяється при чханні, менше — при кашлі, ще менше — при розмові. Характер nбактеріального аерозолю залежить від в’язкості секрету, що виділяється з nдихальних шляхів. Рідкий секрет подрібнюється на менші краплинки легше, ніж nв’язкий. Біля бактеріовиділювача утворюється найбільш концентрований аерозоль, nщо складається з бактеріальних краплин розміром від 1 до 2000 мкм. Величина nосновної маси краплин коливається від 2 до 100 мкм. Крупні краплини величиною nвід 100 до 2000 мкм виділяються на відстань 2—3 м і більше і швидко осідають. nДрібні краплинки бактеріального аерозолю (1—10 мкм) можуть довго (протягом nкількох годин і діб) бути в завислому стані.

Повітря — несприятливе nсередовище для бактерій і вірусів. Відсутність поживних речовин, вологи, nоптимальної температури, згубна дія сонячного проміння і висушування не nстворюють умов для їх збереження. Однак і порівняно короткого nперебуванням мікроорганізмів у повітрі цілком досить для того, щоб зумовити nпередачу патогенних видів мікроорганізмів від хворих осіб здоровим. Через повітря можуть передаватися разом з краплинами nслизу й мокротиння при чханні, кашлі, розмові збудники хвороб — скарлатини, nдифтерії, коклюшу, стафілококової, стрептококової і менінгококової інфекцій, nангіни, туберкульозу, гострого сальмонельозного гастроентериту, грипу, кору, nнатуральної і вітряної віспи, герпесу, епідемічного паротиту, краснухи, nаденовірусних та інших захворювань. Повітряно-пиловим шляхом розповсюджуються nспори сибірки, правця, гісто-плазмозу, грибів, збудники Ку-гарячки, орнітозу та nін.

 

Критерії nоцінки мікробного забруднення повітря в приміщеннях лікарні

 

 

Санітарно-бактеріологічне дослідження повітря проводять у плановому порядку в дитячих закладах, nлікарняних палатах, операційних, пологових залах тощо. При цьому визначають nзагальну кількість бактерій в 1м3 повітря і наявність санітарно-показових nмікроорганізмів (гемолітичних, стрептококів і золотистих стафілококів). Проби nповітря відбирають седиментаційним або аспіраційним методами.

 

Седиментаційний nметод Коха використовують для визначення мікрофлори повітря закритих приміщень. Для цього чашки Петрі з МПА або nспеціальними середовищами для стафіло- і стрептококів nзалишають відкритими у місцях взяття проб. Строки експозиції залежать від nгаданого мікробного забруднення повітря: при великій nкількості бактерій чашки відкривають на 5-10 хв, при малій – на 20-40 хв. Після експозиції чашки закривають і вміщують у термостат при n37 °С на 18 год, а потім ще добу витримують при кімнатній температурі. nПідраховують кількість колоній і визначають число бактерій в 1 м3 повітря. За даними В.Л. nОмельського, на площу в 100 см2 за 5 хв осідає стільки nбактерій, скільки їх міститься в 10л повітря.

Наприклад, на чашці з агаром при 5 хв nекспозиції виросла 21 колонія. Площа стандартної чашки Петрі складає біля 70 см2. Отже, на 100 см² nвиросло б 21·100:70=30 колоній, тобто та кількість бактерій, яка міститься в 10 л повітря. Отже, в 1 м3 їх буде 30·1000:10=3000.

Аспіраційний метод nгрунтується на ударній дії повітряного струменя об поверхню живильного nсередовища і прилипанні до нього бактерій. Дослідження nпроводять за допомогою апарата Кротова (Рис. 2). nПовітря в кількості 100-250 л nпропускають зі швидкістю 25 л/хв через клиноподібну щілину над чашкою з nживильним середовищем. Електромотор приладу обертає чашку з постійною nшвидкістю, що рівномірно розподіляє втягнуті через nщілину бактерії на всій площі середовища. Засіяну чашку інкубують при 37 °С nпротягом доби і ще 24 год при кімнатній температурі, підраховують nкількість колоній. Знаючи об’єм пропущеного через апарат повітря і число nколоній, легко вираховують кількість мікробів в 1 м³. Видову характеристику nмікрофлори визначають після макро- і мікроскопічного nдослідження колоній, виділення чистих культур і їх ідентифікації звичайними nметодами. Державних стандартів для оцінки nбактеріального забруднення повітря ще не розроблено. Прийняті лише тимчасові nдопустимі норми кількості санітарно-показових бактерій в 1 м³ повітря лікарняних приміщень.

 

 

Колонії nбактерій на МПА

Аппарат Кротова

після посіву мікрофлори повітря

седиментаційним методом.

 

Апарат Кротова nскладається з пристрою для відбору проб повітря, ротаметра, який регулює швидкість nі кількість всмоктуваного повітря, та електромотора. Прилад включають у nелектромережу, знімають кришку, на спеціальний диск закріплюють відкриту чашку nПетрі з живильним середовищем. Рукою надають їй інерційного руху за nгодинниковою стрілкою, закривають кришку апарата і включають мотор. Чашка nобертається з постійною швидкістю 60 об/хв. Повітря із заданою швидкістю nвтягується через клиноподібну щілину плексигласової пластини, що закриває чашку nПетрі з агаром. При цьому частинки аерозолю з мікроорганізмами рівномірно nприлипають до живильного середовища. При дослідженні загального мікробного nчисла пропускають, як правило, 100 дм³ повітря зі швидкістю 25 дм³/хв. nЯкщо визначають кількість індикаторних бактерій (золотисті стафілококи, альфа- nі бетта-гемолітичні стрептококи) обєм nдосліджуваного повітря збільшують до 300-500 дм³. Після взяття проби nчашку з посівом повітря знімають, закривають її, й інкубують 18-24 год при 37 С nі ще 24 год при кімнатній температурі.

Розрахунок загального мікробного числа проводять за nформулою:

          

   а • 1000

X = ,

  V

де    а  nкількість колоній, що виросли в чашці Петрі,

        V обєм nпропущеного через прибор повітря в дм³,

        1000  nзаданий обєм nповітря для визначення ЗМЧ.

 

Приклад розрахунку: через прилад nпропущено 100 дм³ повітря; число колоній, що виросли  n370. Отже кількість мікроорганізмів у 1 м³ повітря буде дорівнювати:

370 х 1000

X =  n= 3700.

100

 

Фільтраційний метод. Для його використання запропоновані nспеціальні прилади: Дяконова, Речменського, Кіктенко, ПАБ-1, ПОВ-1 та ін. nПринцип їх дії зводиться до пропускання певного обєму nповітря через рідину в приладі (або фільтр) з наступним висівом мірної nкількості її на живильні середовища. При застосуванні фільтрів їх накладають на nщільне живильне середовище. Підраховують число колоній, що виросли, та nпроводять відповідні перерахунки на весь обєм рідини в nприладі й визначають число мікроорганізмів у 1 м³ повітря.

За допомогою цього методу можна провести дослідження nповітря на присутність і тих патогенних мікроорганізмів, які не культивуються nна живильних середовищах. Рідину, що поглинула бактерійні аерозолі повітря, nможна використати для зараження лабораторних тварин або проведення спеціальних бактеріологічних nта вірусологічних досліджень.

Безпосереднє виявлення патогенних nі умовно-патогенних мікроорганізмів (стафілококи, стрептококи, псевдомонади, nінші грамнегативні бактерії), які викликають госпітальні інфекції, проводять nпри аналізі повітря хірургічних, акушерсько-гінекологічних та інших nстаціонарів.

При виникненні внутрішньолікарняних інфекцій, nспричинених стафілококами, проводять дослідження на виявлення джерела й шляхів nїх розповсюдження. При цьому визначають ідентичність культур, виділених із nповітря, інших обєктів nоточуючого середовища, а також від хворих і медичного персоналу за допомогою nфаготипування.

Державні стандарти для оцінки nсанітарно-бактеріологічних показників повітря ще не розроблені. Запропоновані nлише тимчасові положення про допустиме нормування мікробного забруднення nокремих лікарняних та інших приміщень. Так, у повітрі операційних, родильних nзалів, реанімаційних, перевязувальних і процедурних загальна nкількість бактерій в 1 м³ nдо роботи не повинна перебільшувати 500, після роботи  1000; nкількість S.anreus не nбільше 4, а гемолітичних стрептококів взагалі не повинно бути. У повітрі nлікарняних палат взимку ЗМЧ не повинно перевищувати 3500, S.aureus  до 24, nа гемолітичних стрептококів не більше 24. Влітку ці показники не повинні nперевищувати відповідно 5000, 52 і 36.

 

Мікробіоценоз, біотоп, екологічна nніша.

Популяція – су nкупність особин одного виду, які проживають у певному біотопі.

Біотоп n– ділянка обмеженої території з однорідними умовами існування.

Мікробіоценоз – nсукупність популяцій мікроорганізмів, які проживають в одному біотопі.

Екосистема – nсистема, в яку входять біотоп і мікробіоценоз.

Біосфера – жива nоболонка землі, загальна сума всіх екосистем.