ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА nХРОМАТОГРАФІЯ. ВИЗНАЧЕННЯ ГРАНИЧНО ДОПУСТИМОГО ВМІСТУ ДОМІШОК В СУБСТАНЦІЇ nЛІКАРСЬКОЇ РЕЧОВИНИ.

 

Хроматографія – фізико-хімічний метод nрозділення та аналізу сумішей. Метод базується на розподілі компонентів суміші nміж двома фазами – нерухомою і рухомою (елюєнт), яка протікає через нерухому.

 Метод хроматографії розроблений nв 1903 році М.Цвєтом, який показав, що при пропусканні суміші рослинних nпігментів через шар безбарвного сорбенту індивідуальні речовини розташовуються nу вигляді окремих забарвлених зон. Отриманий таким чином стовпчик сорбенту Цвєт nназвав хроматограмою, а метод – хроматографією. У 1941 році А.Мартін та Р.Сінг nвідкрили метод розподільної хроматографії і показали його широкі можливості для nдослідження білків та вуглеводів. У 50-і роки А.Мартін і вчений А.Джеймс nрозробили метод газо-рідинної хроматографії.

 

Високоефективна nрідинна хроматографія

 

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – nнайбільш ефективний метод аналізу органічних зразків складної будови. Процес аналізу nпроби відбувається у два етапи – розділення проби на складові компоненти та nдетекція і вимірювання кожного компоненту.

Розділення відбувається за рахунок спеціальної nхроматографічної колонки, яка являє собою трубку, заповнену сорбентом. При nпроведенні аналізу через хроматографічну колонку подають рідину (елюент) nпевного складу з постійною швидкістю. В цей потік додається точно виміряна доза nпроби. Компоненти проби, завдяки різній спорідненості до сорбенту колонки, nрухаються по ній з різною швидкістю і досягають детектору в різні проміжки nчасу.

Таким чином, хроматографічна колонка nвідповідає за селективність і ефективність розділення компонентів. Підбираючи nрізні типи колонок можна керувати ступенем розділення речовин, які nаналізуються. Ідентифікація сполук здійснюється по часу їх утримання. Кількісне nвизначення кожного з компонентів розраховують, виходячи з величини аналітичного nсигналу, виміряного за допомогою детектора, який під’єднується до виходу nхроматографічної колонки.

Метод ВЕРХ використовується в санітарно-гігієнічних дослідженнях, nекології, медицині, фармації, нафтохімії, криміналістиці, для контролю якості nта сертифікації продукції.

 

Вимоги до внутрішнього стандарту:

1. Добре розчинний в пробі і хімічно nінертний до компонентів аналізованої суміші, нерухомої фази і тв. носія.

2.     Внутрішній стандарт вибирають nз числа сполук, близьких до об’єктів аналізу по структурі і леткості.

3.     Внутрішній стандарт в пробі nпідбирають так, щоб відношення площ піків стандарту і визначуваної речовини nбуло близьке до 1.

4.     Пік внутрішнього стандарту на nхроматограмі повинен розміщуватись в безпосередній близькості до піків сполук – nоб’єктів аналізу, не накладаючись ні на них, ні на піки інших речовин.

5.     Внутрішній стандарт не nповинен містити домішок, які накладаються з піками визначуваних nречовин-компонентів проби.

6.     Якщо визначають в пробі дві і nбільше речовин, що значно відрізняються часами утримування, то доцільно nвикористовувати 2 і більше внутрішніх стандарти.

 

Високоефективна рідинна хроматографія.

Рідинна nхроматографія – це метод розділення і аналізу складних сумішей, в якому рухомою nфазою є рідина. Він застосовується для розділення більш широкого кола речовин, nніж ГХ, оскільки більшість речовин є нелеткими, багато які з них є нестійкими nпри високих температурах (особливо ВМС) і розкладаються при переведенні в nгазоподібний стан. В РХ розділення найчастіше відбувається при кімнатній t°.

 

Теоретичні уявлення.

Базується на адсорбції з розчину. Адсорбційна nрівновага між розчином і адсорбентом підчиняється рівнянню ізотерми адсорбції nЛенгмюра, в області розведених розчинів ізотерма лінійна. Селективність nадсорбції залежить від природи сил взаємодії між адсорбованими речовинами і nадсорбентом.

Ефективність хроматографічної колонки залежить, головним чином, від nпроцесів дифузії і масопереносу в обох фазах і визначається, як і в газовій nхроматографії, висотою еквівалентною теоретичній тарілці (ВЕТТ) Н. З лінійною nшвидкістю рухомої фази U і деякими іншими величинами ВЕТТ nзв’язана рівнянням

H = 2Rr(1 – Rr)Uts,

де

де t_m – середній час між десорбцією і повторною адсорбцією молекули речовини, коли вона рухається із швидкістю рухомої фази U;

t_s – середній час перебування молекули nв нерухомій фазі.

Таким чином, з ростом лінійної швидкості руху рухомої фази ВЕТТ зростає nі, відповідно, ефективність колонки зменшується.

В класичному варіанті РХ в скляну колонку l = 1-2 м, заповнену сорбентом n(розмір частинок ³ 100 мкм), вводять nаналізовану пробу і пропускають елюент. Швидкість проходження елюента під дією nсили тяжіння мала, а тривалість аналізу велика. Внаслідок використання nсорбентів з розміром зерен 10-30 мкм, поверхнево- і об’ємно-пористих сорбентів nз розміром частинок 5-10 мкм, насосів, чутливих детекторів відбувся перехід від nкласичної до ВЕРХ. Швидкий масоперенос при високій ефективності розділення nдозволяє використати ВЕРХ для розділення і визначення молекул (адсорбційна і nрозподільча хроматографія), для розділення і визначення іонів (іонообмінна, nіонна, іон-парна хроматографія), для розділенні макромолекул (ексклюзийна або nгель-хроматографія). Методами афінної і лігандообмінної хроматографії nрозділяють БА молекули і оптичні ізомери.

Адсорбційна хроматографія

                                                 n

             Нормативно-фазова                        обернено фазова

             хроматографія                                 хроматографія

          – полярний адсорбент                     – неполярний адсорбент

          – неполярна рухома nфаза                – полярна рухома фаза.

Вибір рухомої фази завжди важливіший, ніж вибір нерухомої.

Нерухома фаза повинна утримувати розділювані речовини. Рухома фаза, тобто nрозчинник, повинна забезпечити різну ємкість колонки і ефективне розділення за nоптимальний час.

Нерухома фаза – пористі тонкодисперсні матеріали з питомою поверхнею nбільше 50 м²/г.

n

 

                            полярні                    неполярні

    SiO₂, Al₂O₃, Me_xO_y, флоросил       графітована сажа, кизельгур,

                            і т.д.                          диатоміт.

           а nтакож з привитими               (Не nмаютьселективності

           nполярними групами                  nдо полярних молекул).

    (Для nрозділення неполярних –NH₂

     і малополярних, nсередньоїполярності речовин).

Вказані сорбенти наносяться на поверхнево-пористі nносії.

Рухома фаза. Від неї залежить:

–                   nселективність розділення;

–                   nефективність колонки;

–                   nшвидкість руху хроматограмної смуги.

Вимоги до рухомої фази:

1)                nповинна розчиняти аналізовану пробу;

2)                nмала в’язкість (Д_диф. компонентів проби достатньо nвисокі);

3)                nможливе виділення з неї розділених компонентів;

4)                nінертна по відношенню до матеріалів всіх частин хроматографа;

5)                nвідповідає вимогам вибраного детектора;

6)                            nбезпечна;

7)                            nдешева.

Як було сказано, елююча сила рухомої nфази – розчинника впливає на розділення.

Елююча сила розчинника показує, у nскільки разів енергія сорбції даного елюєнта більша, ніж енергія сорбції nелюента, вибраного в якості стандарту, наприклад, н-гептану. Розчинники (елюенти) ділять nна слабкі і сильні.

Слабкі елюенти мало адсорбуються нерухомою фазою, тому Д сорбата високі.

Сильні елюенти сильно адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт nрозподілу сорбованих речовин (сорбата) низькі.

Наприклад: SiO₂ – нерухома фаза.

Сила розчинників збільшується в ряду:

пентан (0) < CCl₄ (0,11) < C₆H₆ (0,25) < CHCl₃ (0,26) < CH₂Cl₂ (0,32) < ацетон (0,47) < діоксан (0,49) < ацетонітрил (0,5) < етанол < метанол.

В якості міри відносної полярності приймають шкалу Гільдебранда.

Розміщення розчинників у відповідності nіз зростанням їх елюючої сили називають елюотропним рядом. В рідинній nадсорбційній хроматографії елюотропний ряд Снайдера має вигляд: пентан (0) < н-гексан (0,01) n< циклогексан n(0,04) < CCl₄ (0,18) < бензол (0,32) < CHCl₃ (0,38) < ацетон (0,51), nетанол (0,88) <  вода, СН₃СООН  (дуже велика).

Для обернено-фазової хроматографії на С₁₈ елюотропний nряд має вигляд: метанол (1,0) <  nацетонітрил (3,1), етанол (3,1) < ізопропанол (8,3) < н-пропанол (10,1) < діоксан (11,7).

Часто застосовують не окремі розчинники, а їх суміші. nНезначні кількості доданих інших розчинників, особливо води, істотно збільшують nелюючу силу елюента.

При розділенні багатокомпонентних сумішей одна рухома nфаза в якості елюента може не розділити всі компоненти проби за достатньо nоптимальний час. Тоді використовують метод ступінчатого або градієнтного nелюювання. Для збільшення сили елюента в процесі хроматографування послідовно nзастосовують все більш сильні елюенти. Це дозволяє елюювати все більш сильно nутримувані речовини за менший час.

Існують емпіричні правила, які допомагають при виборі nелюента. Сорбція, як правило, зростає з ростом числа подвійних зв’язків і nОН-груп в сполуках. Сорбція зменшується в ряду органічних сполук: кислоти > спирти > альдегіди > кетони > складні ефіри > ненасичені вуглеводні > насичені вуглеводні.

Для розділення речовин різної полярності і для розділення сполук різних nкласів застосовують нормально-фазову хроматографію: з неполярних рухомих фаз nсполуки різних класів виходять з колонки з полярним адсорбентом за різний час n(час утримування сполук з різними функціональними групами збільшується при nпереході від неполярних сполук до слабкополярних). Для дуже полярних молекул t_R дуже великі і аналіз nпри використанні неполярного елюента неможливий. Для зменшення часу утримування nполярних сорбатів переходять до полярних елюентів. В обернено-фазовому варіанті nнерухома обернена фаза сильніше адсорбує неполярні компоненти з полярних nелюентів, наприклад з води. Знижуючи полярність елюента додаванням менш nполярного розчинника (метанол), можна зменшити утримування компонентів.

Газова nхроматографія – найбільш теоретично розроблений метод аналізу.  Саме розвиток теорії і практики газової nхроматографії сприяло швидкому розвитку в останні десятиліття рідинної nколонкової хроматографії і високошвидкісний рідинної хроматографії. Відмінність nметоду газової хроматографії від інших хроматографічних методів пов’язані з nтим, що в якості рухомої фази в ній використовують газ. У залежності від nагрегатного стану нерухомої фази розрізняють газо-адсорбційну хроматографію і nгазо-рідинну. Газохроматографическое поділ в таких системах досягається за nрахунок багаторазово повторюваного процесу розподілу компонентів суміші між nрухається газовою фазою і нерухомою твердої або рідкої фазою, нанесеною на nінертний носій.  Процес поділу заснований nна відмінності в розчинності і летючості аналізованих компонентів. Швидше через nхроматографічну колонку рухається той компонент, розчинність якого в нерухомій nфазі менше, а летючість при даній температурі більше.

         Вибір умов отримання ефективної колонки nв газовій хроматографії випливає безпосередньо із загальної теорії nхроматографічного розділення, а вибір селективної стаціонарної фази пов’язаний nз теорією адсорбції і розчинення. Відмінності в коефіцієнтах розподілу nкомпонентів між рухомою і стаціонарної фазами обумовлені відмінностями nміжмолекулярних взаємодій. Найбільш важливими з них є Ван-дер-ваальсових nвзаємодії. Велику роль також відіграє такий вид взаємодій, як воднева зв’язок, nпричому внесок її в утримування значно зменшується зі зростанням температури. nЦе може виразитися в зміні порядку виходу поділюваних речовин з колонки при nпідвищенні температури. Комплексоутворення для селективного розділення речовин nв газовій хроматографії використовується рідше, ніж у рідинної.

 Газова nхроматографія буває елюентная, фронтальна та витіснювальний.

 Застосування газу як рухомої фази обумовлює nтакі переваги методу, як швидкість проведення аналізу, чіткість поділу. nАналізована проба проходить через колонку у вигляді газу або пари. Цим методом nможуть бути проаналізовані не тільки газоподібні, а й рідкі та тверді речовини. nЇх аналіз можливий при нагріванні, що необхідно для переведення речовин в nгазоподібний стан. Тому температура як робочий параметр процесу грає в газовій nхроматографії велику роль, ніж в інших хроматографічних процесах. Робочі nтемпературні межі для газо-адсорбційної хроматографії від 70 до 600 ° С, для nгазо-рідинної – від 20 до 400 ° С. Описана апаратура для проведення nгазохроматографічний аналізів в області температур вище 800 ° С. У більшості nвипадків Газохроматографический аналіз проводять в ізотермічних умовах. При nаналізі речовин з великим розкидом значень температур кипіння періодично або nбезперервно у процесі аналізу підвищують температуру. Промисловістю nвипускаються прилади для роботи з програмуванням температури.

         Методом газової хроматографії можуть nбути проаналізовані речовини з молекулярною масою менше 400. Випаровування цих nречовин можна провести ‘відтворено, тобто вони можуть бути переведені в парову nфазу і знову сконденсовані без зміни складу.

         В аналітичній практиці в основному nзастосовують метод газорідинної хроматографії. Його переваги перед nгазо-адсорбційним пов’язані головним чином з можливістю широкого вибору nнерухомих рідких фаз різної хімічної природи, а також з високою чистотою і nоднорідністю рідин. Термостійкість адсорбентів дає можливість також проводити nподілу висококиплячих сполук.

 Недоліком газо-адсорбційного методу є nнелінійність ізотерм адсорбції, що призводить до несиметричності піків.

 

АНАЛІЗ nНЕОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

 Розвиток методів газової хроматографії в nаналізі неорганічних речовин відстає в порівнянні з газовою хроматографією nорганічних речовин. По-перше, це пов’язано з агресивністю багатьох неорганічних nсполук по відношенню до адсорбенту, нерухомим фазах і до матеріалів, з яких nвиготовляється зазвичай апаратура для проведення газохроматографічний аналізів. nПо-друге, газова хроматографія неорганічних речовин почала розвиватися пізніше, nніж газова хроматографія органічних сполук. Це обумовлено тим, що для аналізу nнеорганічних речовин є класичні методи, що перевершують за точністю і швидкості nметоди аналізу органічних сполук. Одна вже в даний час газова хроматографія nдозволяє аналізувати сполуки майже всіх елементів періодичної системи.

ВИМОГИ ДО аналізованій речовині

 Газохроматографическим nметодом можуть бути проаналізовані не будь-які речовини, а тільки відповідають nпевним вимогам, головні з яких перераховані нижче.

 1. nЛетючість. Достатньо, щоб пружність пари речовини при робочій температурі nколонки була невисокою. Більш летючим вважається речовина, пружність пари якого nвище, ніж в іншого. Наявність великих моментів диполя, поляризація, воднева nзв’язок призводять до зменшення летючості; іонні та сільнополярние з’єднання nнелетких.

 2. nСтабільність. Кількісний аналіз речовини можливий, якщо воно випаровується в nдозаторі і елюіруется без розкладання, тобто є термостійким. При розкладанні nречовин на хроматограмі з’являються неправдиві піки, притаманні продуктам nрозкладання, що призводить до помилок в аналізі. Можливий аналіз сполук, для nяких відпрацьована методика відтвореного розкладання.

 3. nІнертність. Речовина не повинно утворювати міцних сольвати при розчиненні в nрідкій стаціонарної фазі, не має реагувати з матеріалами, з яких виготовлені nдеталі хроматографа.

 4. nЛегкість отримання. При проведенні кількісного аналізу бажано працювати з nтакими сполуками, які легко отримати з кількісним виходом.

 Цим nвимогам в більшій мірі, як правило, задовольняють органічні речовини. Однак в nостанні роки розроблені способи газохроматографического аналізу різних металів nі їх неорганічних і органічних сполук.

 

АНАЛІЗ МЕТАЛІВ І ЇХ СПОЛУК

 Аналіз nвільних металів можливий при використанні високоапаратурної хроматографічної nапаратури. Сполук металів, летючих при порівняно низьких температурах, nнебагато: галогеніди, алкоголяти, різні хелати, гідриди.

Вільні метали. Розроблено nметоди хроматографування вільних металів при надвисоких тисячеградусних nтемпературах. Наприклад, вдалося здійснити пряме Газохроматографическое nвизначення цинку, кадмію і магнію в сплавах типу припоїв і легких сплавах на nоснові олова, свинцю та вісмуту без хімічної обробки. Розділені цинк, кадмій і nртуть у вигляді парів цих металів. Металеві калій та натрій розділити у вигляді nпари поки не вдалося, вони елюіруются разом при 600-1000 0 C. У майбутньому nпряме Газохроматографическое поділ металів може бути використано при очищенні nметалів та їх сплавів від ультрамалих кількостей домішок.

 Гідриди nметалів. У ряді робіт здійснено Газохроматографический аналіз nлетючих гідридів металів. Можливо безпосереднє поділ гідридів сурми, олова, nтитану, ніобію і танталу. При хроматографування гідридів металів слід nвраховувати їх високу реакційну здатність, схильність до гідролізу і легку nокислюваність. Газохроматографический аналіз гідридів можливий лише за nвідсутності кисню в системі.

         Галогеніди металів. nГазохроматографическим методом можуть бути розділені і кількісно визначені nгалогеніди перехідних металів. Поділ летких хлоридів можна здійснити методом nтермохроматографіі в поєднанні з комплексоутворення. Описано поділ летких nхлоридів Sb, Sn, In, Cd, Zr, Hf, Nb, Ta, Mo, Tc, Re, Ru, Os методом nтермохроматографіі з використанням температурного градієнта від 600 до 25 ° С. nПри значно нижчих температурах можливе визначення хлоридів галію, германію, nмиш’яку, сурми і кремнію. Основні труднощі, що виникає при хроматографії nгалогенідів металів, – їх висока реакційна здатність. У колонці при підвищеній nтемпературі вони реагують з багатьма рідкими нерухомими фазами, з металевими nповерхнями деталей хроматографа, в тому числі колонок. Галогеніди легко nгідролізуються, тому з газу-носія слід видаляти навіть сліди вологи. Оскільки nадсорбенти часто більш інертні, ніж рідкі нерухомі фази, то при аналізі nгалогенідів металів метод газо-адсорбційної хроматографії має певні переваги в nпорівнянні з методом газо-рідинної хроматографії.

Із усіляких nсполук металів, використовуваних для газохроматографического аналізу, nнайбільший практичний інтерес представляють хелати. Можна отримати хелати nпрактично будь-якого металу. В даний час синтезовано багато хелатів, летючість nта термічна стійкість яких задовольняють вимогам газової хроматографії. nОтримати хелати металів з кількісним виходом можна або при взаємодії хлоридів nметалів з відповідними лігандами, або при безпосередній обробці металу або його nоксиду хелатообразующім реагентом. Це знательних спрощує і прискорює аналіз. nТому надзвичайно зручно використовувати хелати металів з отримують нові nліганди, здатні давати міцні летючі хелати з металами:

 

 Слід зазначити, що межа виявлення добре nхроматографірующіхся хелатів становить кілька пікограмів і залежить від nчутливості детектора. Для погано хроматографірующіхся хелатів межа виявлення складає nкілька мікрограмів.

 Зв’язок летючості хелатів зі структурою їх nмолекул. Для цілеспрямованого синтезу летких хелатів металів були зроблені nспроби теоретично узагальнити накопичений експериментальний матеріал по їх nхроматографічному поведінки.

 Спроби nзв’язати конфігурацію молекули комплексу з летючістю або хроматографічністю nпоки не дали однозначних результатів. Відомі летючі і добре хроматографуються nкомплекси, що мають тетраедричних, октаедричні і плоскоквадратної конфігурації. nУ той же час багато комплексів такої ж конфігурації мало летючі чи погано nхроматографуються.

         Відомі як стабільні, так і лабільні nлеткі комплекси, тобто не цілком зрозуміле питання про роль кінетичної nстабільності комплексів.

 Більшість відомих летючих комплексів містить nабо шестичленні цикли з делокалізовані подвійним зв’язком, або чотирьохчленні nцикли з делокалізовані подвійним зв’язком. Практично невідомі летючі хелати з nп’ятичленних циклом.

 До nтеперішнього часу встановлено, що структура комплексу впливає на його хроматографічне nутримування. Утримання ізоструктурного по-дикетонатів різних металів з одним і nтим же лігандом зростає із збільшенням радіуса іона металу. Проте утримування nаналогічних за структурою хелатів різних металів в більшій мірі обумовлено nлігандом і використовуваної рідкою фазою. При невеликих відмінностях іонних nрадіусів металів можна підбором рідкої фази змінити порядок виходу хелатів з nколонки. Так, при хроматографування в-кетоамінатов нікелю та міді на колонці з nполіметілтріфторпропіл-сілоксанов QF-I хелат нікелю виходить з колонки раніше nхелати міді. На колонці з апіезоном L ці хелати виходять одночасно, а на nколонці з полікарборансілоксаном в.-кетоамінат міді виходить раніше nвідповідного хелату нікелю. Часто багато експериментально спостережувані факти nможна пояснити тільки специфічною взаємодією молекул хелатів металів з рідкою nфазою, однак природа цієї взаємодії у багатьох випадках недостатньо ясна.

 Механізм утримування хелатів. У ряді робіт nдосліджувався механізм утримування хелатів металів. Було встановлено, що nутримування ряду хелатів визначається трьома головними факторами: 1) nрозчиненням в рідкій фазі; 2) адсорбцією на поверхні твердої фази; 3) nадсорбцією хелати на поверхні рідкої фази.

         Газова хроматографія з модифікованої nрухомою фазою. Для розділення комплексів металів розроблені два методи, які nвикористовують газову хроматографію з модифікованою рухомою фазою.

         В одному з них використовується носій, nщо містить лари ліганду. Розкладання і сорбцію по дикетонатів металів у nколонках зменшують додаванням в таз-носій невеликої кількості парів nвідповідного по-дикетону. Термодинамічні характеристики системи при цьому не nзмінюються. Поліпшення хроматограм пояснюється придушенням дисоціації хелатів в nрідкій фазі в присутності надлишку вільного по-дикетону. У таких умовах вдалося nповністю розділити ряд хелатів сусідніх в таблиці Д.І.  Менделєєва РЗЕ. Цей метод поки що не вдалося nпоширити на інші леткі комплекси металів, такі, як ді-етілдітіокарбамінати, nдіалкілдитіофосфату і діалкілдітіо-фосфінати.

         У другому методі пропонується nвикористовувати три високих тисках в якості рухомої фази фреон в nсверхкритическом стані. При цьому летючість багатьох комплексів металів nзбільшується за рахунок зміни термодинамічних параметрів системи. Метод не nзнайшов широкого практичного застосування через порівняльної складності nапаратури.

 Слід зазначити, що великі труднощі в газовій nхроматографії хелатів металів пов’язані з аномалією в поведінці багатьох з них nу хроматографічної колонці, причому аномальна поведінка різко посилюється при nпереході до дуже малим кількостей.

ВИЗНАЧЕННЯ nВОДИ

         Вміст nводи в речовинах різного агрегатного стану можна визначати методами nгазо-рідинної, газо-адсорбційної і реакційної газової хроматографії. Найшвидшим nі часто найбільш зручним способом визначення води в неорганічних і органічних nматеріалах є метод газо-адсорбційної хроматографії на колонках з пористими nполімерними сорбентами або вуглецевими молекулярними ситами. Метод nгазо-рідинної хроматографії для визначення води менш придатний. При nвикористанні «акполярних, так і неполярних рідких фаз, нанесених на nдіатомітової носії, піки води виходять несиметричними, в першому випадку – nчерез сильний взаємодії води з гідроксильними групами поверхні носія, а в nдругому – через утворення міцних водневих зв’язків між молекулами полярної nнерухомої фази і молекулами води. Найбільш симетричні піки води були отримані nна насадці, що складається з тефлону і різних поліетіленгліколей, тобто при nвикористанні зовсім інертного носія нерухомої рідкої фази.

         Часто вміст води визначають непрямими nметодами, застосовуючи реакційну газову хроматографію.  Вода реагує з гідридами металів, карбідом nкальцію, металевим натрієм і т. д., продукти реакції детектируются nполум’яно-іонізаційним детектором.

Газовий nхроматограф

 Метод газової хроматографії є n​​одним з найсучасніших методів аналізу. Його відмінні риси – nекспресність, висока точність, чутливість, можливість автоматизації. За nдопомогою цього методу можуть бути вирішені багато аналітичних проблеми вибором nхроматографічної системи і робочих умов. Широкий набір стаціонарних рідких фаз nі адсорбентів, з одного боку, програмування температури, високий тиск, nспецифічні методи детектування, з іншого боку, дозволяють розділяти і кількісно nвизначати з’єднання з ледь помітною різницею в тиску пари. Ступінь nуніверсальності і гнучкості методу газової хроматографії багато в чому nвизначається існуючим технічним рівнем апаратури. Якщо в якісній газової nхроматографії надійна ідентифікація компонентів суміші може бути найчастіше nзабезпечена лише поєднанням з іншими незалежними аналітичними методами, то nкількісний Газохроматографічний аналіз може розглядатися як самостійний nаналітичний метод, який дає результати, які не викликають сумнівів.

Газова хроматографія використовується nтакож у препаративних цілях для очищення хімічних препаратів, виділення nіндивідуальних речовин із сумішей. Метод особливо ефективний при розділенні nречовин, які стосуються одного і того ж класу – вуглеводнів, органічних кислот, nспиртів і т. д.

         Метод широко застосовується у nфізико-хімічних дослідженнях: для визначення фізико-хімічних властивостей nадсорбентів, для визначення термодинамічних характеристик адсорбції, теплоти nадсорбції, ‘поверхні твердого тіла і термодинамічних властивостей розчинів – nконстант рівноваги, ізотерм розподілу, коефіцієнтів активності та ін

 Слід зазначити, що метод безперервно nрозвивається і вдосконалюється. Розширюються і межі застосування методу в nрізних областях науки і техніки. У хімії та нафтохімії це аналіз нафти і nпродуктів її переробки: аналіз сумішей газоподібних вуглеводнів; аналіз nбензину, воску і продуктів їх окислення; вивчення сіро-та азотовмісних nпродуктів крекінгу; аналіз розчинників – спиртів, кетонів, сумішей вуглеводнів; nвивчення складу природних продуктів. У сільському господарстві це аналіз nгербіцидів, пестицидів, добрив.

Розвиток методу йде шляхом синтезу nнових хелатів металів, досить летких і стійких в умовах хроматографування, а nтакож у напрямку пошуку ше більш чутливих і селективних детектуючих систем для nкомплексних сполук металів з органічними лігандами.

 Метод газової хроматографії незамінний в nметалургії, енергетиці, біології, медицині, в харчовій промисловості, nвикористовується для управління технологічними процесами.

Актуальною задачею сучасних хіміко-токсикологічних досліджень є nрозробка різноманітних скринінгових методик та їх удосконалення. Пошук отрут у nбіологічних об´єктах з використанням методу газо-рідинної хроматографії n(ГРХ-скринінг) характеризується швидкістю виконання аналізу, високою nчутливістю, широким вибором хроматографічних колонок та детекторів.

Але сучасні методики ГРХ-скринінгу отрут мають обмеження при nзастосуванні, які базуються на властивостях окремих груп токсичних речовин. При nхроматографуванні за певними умовами число піків на хроматограмі не завжди nвідповідає числу компонентів суміші отрут. Деякі отрути можуть бути nзареєстрованими на хроматограмі загальним піком (співпадання характеристик nутримування) або не бути зареєстрованими детектором (недостатня чутливість, nнеспецифічність).

Тому метою наших досліджень є розробка методики ГРХ-скринінгу отрут nпри використанні іонних асоціатів з метиловим оранжевим для наступного nстворення та використання бази даних відносно значної кількості органічних сполук. n

В результаті попередніх досліджень нами був запропонований nметодологічний підхід до розділення речовин на дві групи отрут, який базувався nна їх здатності утворювати іонні асоціати з індикаторами або не утворювати їх. nДля розділення іонних асоціатів отрут з наступним їх аналізом був застосований nвисокочутливий ГРХ-метод, який дозволяв за розробленими умовами отримувати nнадійні та відтворювані результати.

Попередні дослідження нами були виконані у напрямках вибору nтемпературного режима колонки, детектора, випарника та швидкості надання nгаза-носія у колонку (схема).

Іонообмінна nхроматографія

Іонообмінна nхроматографія (ІХ) є різновидом рідинної хроматографії і в апаратурному nоформленні нічим не відрізняється від інших видів рідинної колонкової nхроматографії. В основі іонообмінної хроматографії лежить процес обміну між nіонами аналізованого розчину (ПФ) і рухливими іонами того ж знака іонообмінника n(НФ).

 Як іонообмінників або іонітів зазвичай nвикористовують синтетичні полімерні речовини, звані іонообмінними смолами. Вони nскладаються з матриці (R) і активних груп, що містять рухливі іони. У залежності nвід знаку обмінюваних іонів розрізняють катіоніти і аніоніти. Катіоніти містять nкислотні групи різної сили, такі як сульфогрупи, карбоксильні, оксіфенільние. nАніоніти мають у своєму складі основні групи, наприклад аліфатичні або nароматичні аміногрупи різного ступеня заміщення (аж до четвертинних).

 Іоніти можуть перебувати в Н-формі та ОН – nформі, а також у сольовий формі. В Н-формі катіоніти і ОН-формі аніоніти nмістять здатні до обміну іони водню та гідроксилу відповідно, у сольових формах nіони водню замінені катіонами металу, аніони гідроксилу – аніонами кислот.

 Залежно від сили кислотних і основних груп у nіонітах розрізняють сильнокислотного (R-SOзН) і слабокислотні (R-СООН) nкатіоніти; сильноосновними (RN (СНз) зон) і слабоосновние (R-NНзОН).

 Сильнокислотного і сильноосновними іоніти nздатні до іонного обміну в широкому діапазоні рН.

 Процес іонного обміну протікає стехіометрічно. nНаприклад:

R-SO 3 H + Na + = RSO 3 Na + H +

R (NНз) зон + Сl – = R (NНз) зСl + ОН –

 Це іонообмінне рівновагу характеризується nконстантою іонного обміну:

[H +] [RSO 3 Na] [OH -] [RN (CH 3) 3 Cl

K H + / Na +=______________; K OH – / Cl – = _________________

[Na +] [RSO 3 H] [Cl -] [RN (CN 3) 3 OH]

 На підставі констант іонного обміну побудовані nряди спорідненості іонів до даного іоніту, що дозволяють передбачати можливості nіонообмінних розділень.

 У залежності від спорідненості до фіксованих nіонів нерухомої фази колективні іони переміщуються вздовж хроматографічної nколонки з різними швидкостями; чим вище спорідненість, тим більше обсяг nутримування компонента. При поділі органічних кислот і підстав важливу роль nграє ступінь їхньої дисоціації.

 Для двох речовин, що мають різні константи nобміні, розраховують фактор поділу або коефіцієнт розподілу, який характеризує nселективність іоніти

 Наприклад, константи іонного обміну солей nзаліза (III) і кобальту (II) на сильнокислотного катионит марки КУ-2 становлять n3726 і 286 відповідно.

Таким чином, можна nзробити висновок, що катионит КУ-2 більш селективен до іонів заліза (III).

 Важливою кількісною характеристикою іонітів є nїх обмінна ємність. Повна обмінна ємність визначається кількістю еквівалентів nіонів, обмінюваних одним грамом сухого іоніту. Чим більше обмінна ємність, тим nбільшу пробу можна ввести в колонку з іонітом.

 При підготовці іонітів до роботи їх переводять nу відповідну форму. Так, для перекладу катіоніту в Н-форму через колонку з nнабряклим іонітом пропускають розчин сильної кислоти, надлишок якої відмивають nводою. Потім повільно пропускають розчин суміші іонів. Кожен катіон nзатримується на іоніте згідно зі своєю сорбуємість. Далі пропускають nвідповідний елюент. Наприклад, катіони лужних металів легко елюіруются 0,1 М nHCl. При цьому іони водню обмінюються на сорбовані катіони, які разом з nрозчином виходять з колонки у відповідності з константами іонного обміну. На nвиході з колонки фракції збирають в окремі судини і визначають зміст будь-яким nпідходящим методом.

 Іоніти застосовуються для деионизации n(знесолення) води, очищення цукрових сиропів від мінеральних солей; в nпрепаративної хімії – для концентрування розчинів; для визначення іонів заліза n(III), міді і свинцю у вині, кальцію і магнію в молоці; різних металів в nбіологічних рідинах. Крім того, іонний обмін використовують для перекладу іонів nу форму, зручну для кількісного визначення. Наприклад, кухонну сіль в розсолі nможна визначити, пропустивши пробу через колонку з катионитом, і виділилася в nеквівалентній кількості кислоту відтитрувати лугом:

R-SOзН + NaCI = R – SO з nNa + НСl.

 Іонообмінну хроматографію застосовують для nрозділення фенолів, карбонових кислот, аміноцукрів, пуринових, піримідинових та nінших підстав. Часто іоніти використовують для попереднього розділення складних nсумішей на менш складні. На іонному обміні засновано отримання іонітні молока nдля дитячого харчування. Іонний обмін використовують для очищення натуральних nсоків від іонів важких металів. Іонообмінні смоли застосовують для отримання nіонообмінних мембран.

 

Тонкошарова хроматографія

   Тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з nнайбільш простих і ефективних експрес-методів розділення і аналізу речовин у nхарчових продуктах, біологічних рідинах і інших об’єктах, що не вимагають nскладного устаткування. У той же час метод має високу вибірковість і чутливістю n(низькою межею виявлення). Цим методом можна визначити 10-20 мкг речовини з nточністю до 5-7%.

 У залежності від природи НФ тонкошарова nхроматографія може бути адсорбційної і розподільної. Найбільш широко nзастосовується в ТШХ перший варіант поділу.

 Нерухома тверда фаза (оксид алюмінію, nсилікагель і ін) тонким шаром наноситься на скляну, металеву (алюмінієва nфольга) або пластмасову пластинку, закріплюється шар за допомогою крохмалю або nгіпсу (іноді використовують платівки з незакріпленим шаром). Для хроматографування nможуть використовуватися готові пластинки, що випускаються промисловістю, nрозміром 5х15 або 20х20 см.

 На відстані 2 см від краю пластинки на nстартову лінію за допомогою мікропіпетки або микрошприца наносять проби nаналізованого розчину (діаметр плям 3-5 мм). Після випаровування розчинника nкрай платівки поміщають в скляну камеру, на дно якої налитий розчинник (ПФ) в nкількості, достатній для утворення шару глибиною 0,5 см. Камеру закривають nкришкою.

 Вибір розчинника (ПФ) залежить від природи nсорбенту і властивостей аналізованих сполук. Наприклад, поділ хлорорганічних nпестицидів на платівці з силікагелем проводять у середовищі гексану. Часто nзастосовують суміші розчинників з двох або трьох компонентів. Так, при nхроматографування амінокислот використовують суміш Н-бутанолу з оцтовою nкислотою і водою, при аналізі неорганічних іонів – водні буферні розчини, що nстворюють постійне значення рН.

 При хроматографування розчинник рухається nзнизу вгору (висхідний варіант) вздовж шару сорбенту і з різною швидкістю nпереносить компоненти суміші, що призводить до їх просторового розділення. nПісля закінчення хроматографічного процесу платівку виймають з камери, nвідзначають лінію фронту розчинника (зазвичай близько 10 см) і висушують.

 Якщо компоненти суміші пофарбовані, то вони nчітко видно на пластині після поділу. Нефарбовані з’єднання виявляють різними nспособами. Якщо пластину помістити в камеру з парами йоду, то чітко nпроявляються коричневі плями для органічних сполук з неграничними зв’язками. nХроматограму можна проявити, обприскуючи її будь-яким реагентом, що дає з nкомпонентами проби забарвлені сполуки. До складу нанесеного шару в готові nпластини часто вводять люмінофор. При опроміненні такої пластини nультрафіолетовим (УФ) світлом вона флуоресціює, а розділені компоненти проби nвидно у вигляді темних плям. Речовини, що мають власну флуоресценцію, також nвиявляють в УФ – світлі (наприклад, пестициди).

 Ідентифікацію речовин на хроматограмі nздійснюють за характером забарвлення плям, параметру утримування R f і за допомогою nстандартних речовин (свідків).

При nстандартних умовах величина R f є постійною величиною, характерною для даного nз’єднання. Але практика показує, наскільки важко створювати сталість всіх nфакторів, від яких залежить відтворюваність значень R f. На величину R f nвпливає якість і активність сорбенту, його вологість, товщина шару, якість nрозчинників та інші фактори, не завжди піддаються достатньому контролю.

Тому nпоряд з величиною R f ідентифікацію проводять по “свідка”.  Стандартне речовина (свідок), наявність якого nприпускають в аналізованій суміші, наносять на лінію стандарту поруч з nдосліджуваної пробій. Таким чином, стандартне речовина хроматографується в тих nже умовах. Після хроматографування і детекції плям порівнюють величини R f nвизначається речовини і “свідка”.

Якісний аналіз після nподілу компонентів суміші методом ТШХ часто використовують для визначення nскладу харчових продуктів. Так, на рис. 3.3.2 представлена n​​хроматограмма жиру, виділеного з м’ясного фаршу різного складу. nХроматографування проводили на пластинках з силікагелем в системі nгександіетіловий ефір (у співвідношенні 3:1), плями детектувала 10% розчином nфосфорно-молібденової кислоти, ідентифікували за блакитному кольору зон на nжовтому фоні платівки. Як видно з хроматограми, за даних умов відбулося nрозділення фосфоліпідів і тригліцеридів. За характерному складу компонентів nм’яса та печінки можна зробити висновок про натуральність м’ясного фаршу в nпробах 1-2, і добавках до нього печінки в пробах 3-5.

 Кількісне визначення в ТХС може бути проведене nбезпосередньо на платівці, йди після видалення речовин з платівки. При nбезпосередньому визначенні на платівці вимірюють тим чи іншим способом площа nплями (наприклад, за допомогою міліметрової кальки) і за заздалегідь nпобудованому градуювальним графіком знаходять кількість речовини. Залежність nміж масою речовини q і площею S на хроматограмі носить нелінійний характер і є nлогарифмічною:

S = a lg q + nв,

 де а і в емпіричні константи. Ця залежність nлінійна для кількостей речовини від 1 до 80-100 мкг.

Для побудови nградуювального графіка на пластинку наносять розчини, що містять різні nкількості стандартного речовини, хроматографіруют, виявляють зони і вимірюють nїх площі (рис. 3.3.3).

 Більш точний денситометрических метод nвизначення речовин на хроматограмі (помилка – 1-2%). У методі денситометрії nпроводять вимірювання оптичного поглинання виявленої хроматограми скануючим nпроменем у минаючому чи відбитому світлі на спеціальних приладах-денситометрах. n

Тонкошарова хроматографія nзнаходить застосування при дослідженні деяких видів харчових продуктів на nбезпеку. Наприклад, для визначення токсинів (афлатоксинів, мікотоксинів, nпатуліну та ін) в арахісі, у зернових, овочах, фруктах, напоях; для визначення nпестицидів (ДДТ та ін) в рослинних і тваринних продуктах, визначення гістаміну nяк показника псування риби. Крім того, ТШХ часто поєднують з газовою nхроматографією, електрофорезом та іншими методами.

 

Хроматографія nна папері

 По механізму поділу розрізняють розподільну, nадсорбційну, осадову та інші види паперової хроматографії (БХ). У розподільній nрідина-рідинної хроматографії папір, приготовлена ​​зі спеціальних nсортів бавовни, виконує роль носія нерухомої рідкої фази (НФ), в якості якої nчасто виступає вода, адсорбована парами паперу. У такому випадку гідрофільна nпапір використовується для нормально-фазової хроматографії.

 Розчинниками (ПФ) є спирти (метанол, етанол, nн-пропанол, бутанол), прості ефіри (етиловий, метиловий), кетони (ацетон, nацетил-ацетон), ефіри органічних кислот (Метилацетат, етилацетат), піридин, nхлороформ. Частіше використовуються суміші розчинників. Так, для поділу nнеорганічних неполярних речовин вживають системи:

 – Ацетон: НCl: Н 2 О (в різних nспіввідношеннях);

– nН-бутанол, насичений НСl (різної концентрації);

 – Н-бутанол: 0,1 М НNОз – ацетилацетон.

 Для розділення деяких органічних речовин nвикористовують метод звернених фаз. У цьому методі для надання папері nгідрофобного характеру її просочують нафталіном, парафіном, розчином каучуку, nсиліконом і ін Такий папір є носієм для неполярних розчинників як НФ. Як ПФ nзастосовують суміші кислот з нижчими спиртами.

 Паперова хроматографія використовується, nнаприклад, для розділення й ідентифікації полінасичених жирних кислот при nвивченні складу ліпідів, виділених з тварин тканин. Папір просочують 5% nрозчином силікону, як ПФ використовують 85% розчин оцтової кислоти.

Поділ речовин в nрозподільній БХ здійснюється завдяки розбіжності у швидкостях руху компонентів nпри багаторазовому повторенні актів екстракції та сорбції. Швидкість nпереміщення компонентів залежить від їх коефіцієнтів розподілу (як і в методі nекстракції).

 По напрямку руху елюента (ПФ) розрізняють nвисхідну, спадну і радіальну (кругову) хроматографію.

 Якщо елюент рухається по паперу вгору, метод nназивають висхідною (а) паперової хроматографією; при його русі зверху вниз – nнизхідною (б) паперової хроматографією. Дуже швидко можна здійснити nхроматографічний аналіз методом радіальної (в) паперової хроматографії, в якому nвикористовується паперове коло (г) з гнотом, опущеним у елюент.

Іноді при складному nскладі проби не вдається розділити її компоненти з допомогою одного розчинника. nТоді застосовують двовимірну хроматографію. У кут квадратного аркуша nхроматографічного паперу наносять хроматографічного паперу наносять розчин nпроби і хроматографіруют спочатку в одному елюент, потім, повернувши nхроматограму на 90, – в іншому. Перший елюент виробляє попереднє розділення nкомпонентів проби, другий остаточне

Для проведення nхроматографії на папері використовують скляні герметизовані камери. Всередині nкамери у верхній (спадний варіант) або нижньої її частини (висхідний варіант) nпоміщають посудину для рухомої фази (човник).

 Радіальну хроматографію можна здійснити в nчашці Петрі. Детекцию зон, ідентифікацію та кількісне визначення в БХ проводять nтакож, як і в методі тонкошарової хроматографії.

 Методом розподільчої рідинної паперової nхроматографії успішно аналізують суміші катіонів у неорганічний якісному nаналізі, суміші амінокислот і інших органічних кислот, пептидів, пестицидів, nфенолів, барвників, синтетичних поверхнево-активних речовин.

 

Гель-проникаюча n(молекулярно-ситова) хроматографія

 Гель-проникаюча хроматографія (ЦПХ) являє nсобою метод поділу молекул, заснований на розходженні з розмірів.

 Як НФ в ЦПХ використовують частки, що мають nпевні розміри пор. Це різного роду гелі (м’які, напівтверді і тверді). Як ПФ nслужать водні або органічні елюент. Принцип поділу молекул в ЦПХ полягає в nтому, що молекули аналізованих речовин розподілені між нерухомим розчинником в nпорах сорбенту і розчинником, що протікає через шар НФ. Молекули, які мають nрозміри, що дозволяють їм проникати в пори сорбенту при русі вздовж колонки, nчастину часу втрачають на перебування в порах. Молекули, що мають розміри, що nперевищують розміри пір, не проникають в сорбент і вимиваються з колонки зі nшвидкістю руху елюента. Молекули, які проникають в пори всіх розмірів, nрухаються найбільш повільно. Зниження швидкості руху речовин вздовж колонки тим nбільше, ніж в більше число пір здатні дифундувати розподіляються частки.

 Таким чином, за допомогою ЦПХ можна розділити nсуміші речовин залежно від розмірів їх молекул.  nВихід речовин з колонки відбувається у порядку зменшення їх молекулярної nмаси. Так можна розділити поліпептиди, білки та інші макромолекули.

 Гель-проникаюча хроматографія на колонці nвикористовується для очищення пестицидів, а також жиророзчинних вітамінів перед nїх визначенням методом ВЖХ.

 

Електрофорез

 Метод аналізу, що базується на здатності nзаряджених частинок до пересування в зовнішньому електричному полі називають nелектрофорезом (від “електро” і грецького phoresis – перенесення).

 Електроліз відноситься до методів розділення nбез перетворення речовин, на основі заряду частинок. За технікою виконання nметод аналогічний хроматографії, тому і розглядається в цьому розділі.

Нерідко під nелектрофорезом розуміють переміщення колоїдних частинок або макромолекул, на nвідміну від фореза – переміщення неорганічних іонів малого розміру.

 Пересування частинок при електрофорезі nзалежить від ряду факторів, основними з яких є: напруженість електричного поля; nвеличина електричного заряду; швидкість і розмір частки; в’язкість, рН і nтемпература середовища, а також тривалість електрофорезу.

 Електрофорез можна проводити як у вільному nрозчині (фронтальний електрофорез), так і на носіях (зональний електрофорез). nОстанній варіант переважно, оскільки носії сприяють стабілізації nелектрофоретичних зон. В якості носіїв використовують: фільтрувальний папір, nсилікагель, крохмаль, оксид алюмінію, полівінілхлорид, агарових і nполіакріламідний гелі та ін

 Електрофоретичне поділ здійснюють на папері, в nтонкому шарі сорбенту, колонці чи в блоці (який часто формують із суспензії nкрохмалю у відповідному електроліті).

 Апаратура для електрофорезу виконується за nєдиною схемою: джерело струму, камера для електрофорезу, два електроди, що nз’єднують камеру з джерелом струму і пристосування для збору та ідентифікації nрозділених речовин (останній блок у деяких випадках відсутня). Для nелектрофорезу використовують як готові набори апаратури (універсальний прилад nдля імуноелектрофорез та електрофорезу білків на папері і крохмалі, набір для nелектрофор  за в поліакриламідному гелі nугорської фірми Реана), так і набори, що складаються експериментатором з nокремих приладів.

 Електрофоретична камера складається з двох nкювет, в які поміщають графітові електроди і розчин провідної рідини (буферний nрозчин). Вище кювет знаходиться підставка для носія паперу. Суміш речовин, що nпідлягають розподілу, наносять на просочену проводить рідиною папір. Папір nпідсушують, поміщають на підставку, кінці занурюють у кювети, потім камеру nщільно закривають кришкою. Після просочування паперу проводить рідиною nпідключають електричний струм. Після закінчення електрофорезу папір підсушують. nЯкісну і кількісну оцінку здійснюють, застосовуючи методи, використовувані в nпаперовій хроматографії, наприклад, прояв білків за допомогою барвників, nкількісну оцінку – методом денситометрії.

 Важливою сферою застосування електрофорезу є nаналіз білків сироватки крові, амінокислот гідролізатів білків, нуклеїнових nкислот і т.п. У кислотному буферному розчині амінокислота знаходиться у вигляді nкатіона NHз + …… COOH, який буде переміщатися до катода, в той час як у nлужному буфері амінокислота перетворюється на аніон NH 2 …. COO -, і буде nрухатися до анода . У ізоелектричної точці амінокислота знаходиться в розчині у nвигляді біполярного іона NH 3 + …… COO – і не буде пересуватися в електричному nполі.

З огляду на те, що окремі nбілки і амінокислоти мають різні ізоелектрична точки, при певному значенні рН nвони будуть рухатися з різною швидкістю. Підбираючи відповідні буферні розчини nдля встановлення певної швидкості руху і розчинності речовин, можна nвикористовувати електрофорез для їх розділення. Метод дозволяє розділяти nречовини, відмінність в ізоелектричній точці яких складає до 0,02 одиниць рН. nГрадієнт рН в 0,02 одиниці часто досягають додатком амфоліти, що представляють nсобою готову суміш аліфатичних поліамінаполікарбонових кислот.

 Електрофоретичне поділ білків широко nвикористовується для оцінки якості м’яса і м’ясних продуктів, для nдиференціювання виду м’яса і риби. Метод також застосовується для виявлення nнем’ясних добавок (білків молока, сої, яєць) в м’ясних продуктах. За допомогою nелектрофорезу в поліакриламідному гелі можна охарактеризувати зміна білків у nпроцесі дозрівання сирів (ріс.3.5.2).

 В даний час використовують високоефективний nкапілярний електрофорез, наприклад, для аналізу вітамінів в дієтичних продуктах n(жиророзчинні А, Е, К, Д; водорозчинних – B 1, B 2, B 6, B 12, С, nнікотинаміду); і для визначення аніонів ( сульфат – хлорид-, йодид-) у молочних nпродуктах.

 

Газова nхроматографія

 У газовій хроматографії (ГХ) як ПФ використовують nінертний газ (азот, гелій, водень), званий газом-носієм. Пробу подають у nвигляді пари, нерухомою фазою служить або тверда речовина – сорбент n(газо-адсорбційна хроматографія) або висококиплячих рідина, нанесена тонким nшаром на твердий носій (газорідинна хроматографія). Розглянемо варіант nгазорідинної хроматографії (ГЖХ). В якості носія використовують кизельгур n(діатоміт) – різновид гідратованого силікагелю, часто його обробляють nреагентами, які переводять групи Si-OH в групи Si-О-Si (CH 3) 3, що підвищує nінертність носія по відношенню до розчинників. Такими є, наприклад, носії n”хромосорб W” і “газохромQ”. Крім того, використовують nскляні мікрошарікі, тефлон і інші матеріали.

 Нерухому рідку фазу наносять на твердий носій. nЕфективність розділення в газорідинної хроматографії залежить головним чином nвід правильності вибору рідкої фази. При цьому корисним виявилося старе nправило: “подібне розчиняється в подібному”. Відповідно до цього nправила для розділення суміші двох речовин вибирають рідку фазу, близьку за nхімічною природою одному з компонентів. Підготовлений носій поміщають в nспіральні колонки, що мають діаметр 2 – 6 мм і довжину до 20 м (набивні nколонки). З 1957 року стали застосовувати запропоновані Голео капілярні nколонки, що мають діаметр 0,2 – 0,3 мм і довжину в кілька десятків метрів. У nвипадку капілярних колонок рідка фаза наноситься безпосередньо на стінку цього nкапіляра, яка виконує роль носія. Застосування капілярних колонок сприяє nпідвищенню чутливості та ефективності поділу багатокомпонентних сумішей.

Газ – носій з балона 1 з nпостійною швидкістю пропускають через хроматографічну систему. Пробу вводять nмикрошприца в дозатор 2, який нагрітий до температури, необхідної для повного nвипаровування хроматографуючої речовини. Пари аналізованої суміші захоплюються nпотоком газу – носія і надходять у хроматографічну колонку, температура якої nпідтримується на необхідному для проведення аналізу рівні (вона може бути nнезмінною, або за необхідність змінюватися в заданому режимі). У колонці nаналізована суміш ділиться на компоненти, які по черзі надходять в nдетектор.  Сигнал детектора фіксується nреєстратором (у вигляді піків) і обробляється обчислювальним інтегратором.

 У ГХ використовують детектори, які перетворять nв електричний сигнал зміни фізичних або фізико-хімічних властивостей газового nпотоку, що виходить з колонки, в порівнянні з чистим газом – носієм. Існує nбезліч детекторів, проте широке застосування знаходять тільки ті з них, які nмають високу чутливість і універсальністю. До таких належать: катарометра n(детектор по теплопровідності); полум’яно-іонізаційний детектор (ПІД), в якому nводневе полум’я служить джерелом іонізації органічної сполуки; детектор nелектронного захоплення (ЕЗД); термоіонні детектор (ТІД), який володіє високою nселективністю до органічних речовин, містить фосфор, азот і сірку. Інтерес до nцього детектора помітно зріс у зв’язку із заміною хлорвмісних пестицидів на nфосфорсодержащие отрутохімікати, що використовуються в сільському господарстві nі попадають потім у харчові продукти.

 Катарометра дозволяє визначити концентрації nречовин в межах 0,1 – 0,01%, ПІД – 10 -3 – 10 -5% “; ЕЗД – 10 -6 – 10 n-10%. Сучасні детектори дозволяють визначати навіть пікограмів (10 -12 г) nречовини в пробі.

 Якісний і кількісний аналіз в методі ГХ nпроводять так само, як і в ВЖХ.

 Газорідинна хроматографія знаходить широке nзастосування для розділення, ідентифікації та кількісного визначення складних nбагатокомпонентних систем, таких як нафта, біологічні рідини, харчові продукти, nпарфумерно-косметичні вироби та багато інших. Метод відрізняється високою nчутливістю, експресність; для аналізу не потрібно великої кількості nдосліджуваного зразка.

 Серед різноманітних хроматографічних методів nгазова і високоефективна рідинна хроматографія є найбільш перспективними для nвирішення складних завдань у практиці харчового аналізу.

 Так, до числа завдань, які можуть бути nдозволені у харчовому аналізі за допомогою цих методів, входять:

 – Визначення хімічної природи речовин, які nобумовлюють характерний аромат свіжих продуктів;

 – Контроль за станом продуктів у процесі nобробки та зберігання;

 – Об’єктивна оцінка показників, що nхарактеризують якість вихідної сировини і готових виробів з нього;

 – Встановлення та усунення причин, що nвикликають небажані зміни продуктів у процесі їх виготовлення;

 – Встановлення факту фальсифікації продукту та nінші.

Методами ГХ і ВЖХ nідентифікують і визначають леткі речовини, що беруть участь у формуванні смаку nі аромату багатьох харчових продуктів або відповідають за їх псування. nНаприклад, визначають леткі жирні кислоти, характерні для якісного м’яса; або nкислоти, які утворюються при зміні нормального процесу бродіння квашеної nкапусти і обумовлюють сторонні відтінки її запаху. Методи використовуються для nвизначення нікотину, нітрозаміни (в рибі і копченостях); харчових добавок n(барвники, консерванти, антиокислювачі); забруднювачів навколишнього середовища n(пестициди, афлатоксини, залишки лікарських препаратів, вітаміни) та ін На рис. n3.6.2 представлена ​​хроматограмма поділу афлатоксинов в молоці.

 Дуже цінними є методи ГХ і ВЖХ у встановленні nфактів фальсифікації споживчих товарів. Так, жовтий барвник у макаронних nвиробах може створити враження про високу вартість продукту. Наявність такого nбарвника можна підтвердити методом ВЖХ. Визначення антоціанів та глікозидів, що nвідповідають за колір вина, дозволяє виявити натуральність вина. Підробки nконьяку також можна розпізнати за допомогою ГХ.

 Методом ВЖХ ідентифікують і визначають nнебілковий азот, наприклад, сечовину, яку додають при фальсифікації білкових nпродуктів з метою збільшення азотистих речовин. Виявлення амінокислоти nоксипроліну, присутньої, головним чином, в білках сполучної тканини, тобто в nдешевій сировині, дозволяє виявити факт заміни їм повноцінного білка nм’яса.  Жири, що визначаються за nтрігліцерідному складу методом ГХ, можуть дати інформацію про кількість жиру і nдобавках стороннього жиру. За визначенням жирно-кислотного складу можна зробити nвисновок про заміну какао-масла гідрожіром в шоколаді і т.п.

 Слід зазначити, що в даний час деякі види nхроматографії використовують не як самостійні методи аналізу, а як методи nпопереднього випробування, або як методи підготовки проби до подальшого nвизначення іншими методами, в тому числі хроматографічними.

 Так, при визначенні амінокислот в гідролізаті nбілків м’яса або крові методом БХ, проводять попереднє очищення гідролізату на nколонках з іонітами.  Аналогічно роблять nпри визначенні летючих підстав і вільних жирних кислот в м’ясі та рибі.

 Методом ТШХ встановлюють наявність в nдосліджуваному зразку хлорорганічних пестицидів, кількісне визначення яких nпотім проводять методом ГЖХ.

Особливо ефективним nвиявилося застосування незалежної аналітичної ідентифікації та визначення nпродуктів хроматографічного розділення при поєднанні ГХ і ВЖХ з іншими методами nдослідження: інфрачервоної спектроскопії та мас-спектрометрією. Методом nмас-спектрометрії можна проводити безперервний аналіз компонентів суміші, nпричому для невеликих кількостей речовин.  nТакий комбінований (гібридний) метод отримав назву nхромато-мас-спектрометрії. Наприклад, визначення пестицидів, залишків nлікарських речовин (пеніцилінів, сульфаніламідів тощо) проводять, nвикористовуючи комплекс: ГХ (або ВЖХ) – мас-спектрометрія. Можливо поєднання nхроматографії з методами ядерного магнітного резонансу, полум’яної (фотометрії, nабсорбційної спектрометрії та ін.)

 Застосування хроматографії поряд з іншими nфізико-хімічними методами, а також їх взаємне поєднання, є тенденцією в nрозробці методик дослідження якості споживчих товарів.

Відбувається перегляд nдержавних стандартів. Так, у 1997-1998 р.р. введені нові стандарти з nдослідження якості води питної (ГОСТ Р51209-98), на вміст хлорорганічних nпестицидів і етилового спирту та горілки (ГОСТ 30536-97), які регламентують nвизначення вмісту токсичних мікродомішок методами газорідинної хроматографії. nНа рис. 3.6.4 представлена ​​хроматограмма токсичних мікродомішок nгорілки і етилового спирту, з якої видно, що методом ГЖХ з використанням nкапілярної колонки можливо роздільне визначення всіх компонентів (на відміну nвід методик попереднього ГОСТ).

 Методи хроматографії nволодіють великою аналітичної ємністю, і, як вже було зазначено вище, знаходять nсаме широке застосування.

 

Кожен nгазовий хроматограф складається з таких блоків.

1. Блок підготовки nгазу-носія. Призначення – постачання, очищення, регулювання та вимірювання nвитрати газу-носія (елюента).

 2.  nДозатор проби. Призначення – в ведення в потік газу-носія порції nаналізованої суміші. Суміш може бути газоподібна, рідка або тверда. В двох nостанніх випадках вона повинна переводитися в пароодібний стан перед nзмішуванням з газом-носієм за допомогою електронагріву.

3.  Хроматографічні колонки. Призначення – nрозділення багатокомпонентної суміші на бінарні суміші газу-носія з розділеними nкомпонентами аналізованої суміші. Інколи розділення компонентів повинно nпроходити при підвищених температурах. У цьому випадку блок хроматографічних nколонок комплектується системою термостатування.

4.  Детектор  n– пристрій, який перетворює фізико-хімічні властивості речовини, що nпоступає в нього з хроматографічної колонки, в електричний сигнал. Блок nдетекторів також обладнується термостатом.

5.  Реєстратор  n– записує сигнал детектора у графічному чи цифровому вигляді.

 

 

         Потік nгазу-носія, що пройшов стабілізацію і очищення від води та вуглеводнів в блоці nпідготовки (1), через пристрій для введення проби (2) вводиться досліджувана суміш n(газоподібна проба подається через газовий кран-дозатор, а рідка – мікрошприцом nчерез випарник). Потік газу-носія переносить суміш речовин проби в nхроматографічну колонку (3), де здійснюється їх розділення за рахунок nбагаторазового повторювання процесів сорбції компонентів суміші з потоку nсорбентом і десорбції їх в потік свіжої порції газу-носія. Ефект розділення nдосягається за рахунок різної швидкості руху компонентів вздовж колонки, яка nзумовлена різними сорбційними властивостями складових аналізованої суміші.

Внаслідок цього з nхроматографічної колонки послідовно виходять бінарні суміші газу-носія та nокремих компонентів проби, що розділені проміжками практично чистого nгазу-носія, які далі потрапляють в детектор (4). Детектор фіксує залежність nфізичних властивостей суміші (теплопровідність, електропровідність, поглинання nсвітла і т.д.) від концентрації компонентів. Електричний сигнал детектора nзображується у вигляді хроматограми за допомогою реєстраційного пристрою (5) n(самописець, комп’ютер).

 

Теоретичні nоснови хроматографічних методів.

Хроматографія – це процес, який базується на nбагатократному повторенні актів сорбції і десорбції речовини при переміщенні її nв потоці рухомої фази вздовж нерухомого сорбента.

Речовина рухомої фази неперервно поступає nв контакт з новими ділянками сорбента і частково сорбується, а сорбована nречовина контактує із свіжими порціями рухомої фази і частково   десорбується.

При постійній температурі адсорбція nзбільшується із зростанням концентрації розчину або тиску газу. Залежність nкількості поглинутої речовини від концентрації розчину або тиску газу при nпостійній температурі називається ізотермою адсорбції.

 

 

 

 

а математично ця залежність nможе бути виражена рівнянням Ленгмюра:

 

 

n

 

 

де n – nкількість адсорбованої речовини при рівновазі;

n_∞ – nмаксимальна кількість речовини, яка може бути адсорбована на даному сорбенті;

b n– постійна;

с – концентрація.

В області невеликих концентрацій nізотерма лінійна. Дійсно, при bc n<< n1 (1+ bc) n® n1, тоді

Це рівняння лінійної адсорбції. Воно відповідає рівнянню Генрі (Г – nкоефіцієнт Генрі). Ізотерма адсорбції може бути також вгнутою, S – подібною nі.т.д., що пов’язано з утворенням полімолекулярних шарів на поверхні сорбента, nнеоднорідністю поверхні сорбента.

 

Класифікація nхроматографічних методів.

Різні методи хроматографії можна класифікувати за агрегатним nстаном фаз, способу їх відносного переміщення, апаратурному оформленні процесу.

1.                            nЗа фізичною природою нерухомої і рухомої фаз

n

Рухома фаза	Рідинна	Газова
Нерухома фаза	Тверда (рідинно-адсорбційна)	Тверда газоадсорбційна
	Рідина (рідино-рідинна)	Рідина (розподільча газорідинна)

2.                            nВ залежності від механізму сорбції

а) nмолекулярна (взаємодія між нерухомою фазою (сорбентом) і компонентами nрозділюваної суміші – міжмолекулярні сили типу Ван-дер-Ваальса);

б) nхемоморбційна (іонообмінна, осадова, комплексоутворювача або лігандообмінна, nох-red). nПричиною сорбції в хемосорбційній хроматографії є відповідні хімічні реакції.

3.                nЗа способом хроматографування:

–                     nфронтальна;

–                     nпроявна (елюентна) – найбільш вживана;

–                     nвитісняльна.

4.                nЗа технікою виконання:

–                     nколонкова (нерухома фаза в колонці);

–                     nплощинна: а) паперова (нерухома фаза – папір);

                  б) тонкошарова (нерухома фаза n– сорбент на скляні, – металеві, полімерній підложці пластинці).

 

n

Нерухома фаза	Газоподібна	Рідинна
Тверда	Газо–адсорбційна хроматографія	Рідинно-адсорбційна колоночна, тонкошарова, іонообмінна, осадова
Рідина	Розподільча газо-рідинна хроматографія	Розподільна рідино-рідинна хроматографія

 

 

По nспособу відносного переміщення фаз розрізняють фронтальну, проявну, витісняльну nхроматографію

    

Фронтальний nметод. Використовують порівняно рідко (при очистці від nдомішок, або для виділення з суміші найбільш слабо сорбованої речовини).

 

 

n

 

 

 

 

Проявний (елюентний) метод. Компоненти аналізованої суміші розділяються на зони: nречовина, яка краще сорбується займає верхню зону колонки, а та, що гірше nсорбується – нижню. Тому, А скоріше виходитиме (вимивається або елююється) з nколонки і її пік на хроматограмі є раніше, а та, що сильніше сорбується, nвиходитиме пізніше.

n

 

 

 

 

 

 

 

Витісняльний метод. nПромивним розчином речовини Д., яка сорбується краще від А,В. Концентрація nрозчину при хроматографуванні не змінюється, але часто є накладання зони nречовини А і зони речовини В, оскільки вони не розділяються розчинником.

В nхроматографії найчастіше використовують проявний (елюентний метод), при якому nгаз або розчин, який виходить з колонки, аналізується неперервно.

Типова nвихідна крива (хроматограма) приведена.

n

 

нульова лінія

висота nпіку (площа)

ширина nпіку

час nабо об’єм утримування t nабо Vr

 

 

Повнота розділення двох nкомпонентів кількісно може бути виражена критерієм розділення К:

Dl – nвідстань nміж максимумами піків розділюваних елементів;

m_0,5(1) nі m_0,5(2) n– ширина хроматографічного піку 1 і 2 компоненту на половині висоти.

При nК = 1 розділення буде достатньо повним.

Якщо nпіки взаємно перекриваються, то визначення ширини піку кожної речовини є nнеможлтвою, тоді розглядають ступінь розділення Y:

; h₂ – висота піку з меншою концентрацією nречовини;

h_min – висота мінімуму.

 

 

 

n

 

У nхроматографії: якісний аналіз базується на визначенні часу утримування, а nкількісний – на визначенні висоти або площі піку.

Відомо декілька теорій nхроматографічного процесу. Суттєве значення має метод теоретичних тарілок і nкінетична теорія.

Метод Мартіна і Сінджа (теоретинчих тарілок). Колонка nскляна і ділиться умовно на ряд елементарних ділянок – тарілок. Рівновага на nкожній тарілці сорбент – рухома фаза встановлюється дуже швидко. Кожна нова nпорція газу – носія викликає зміщення цієї рівноваги, внаслідок чого частина nречовини переноситься на наступну тарілку, на якій, в свою чергу, nсвтановлюється рівновага і відбувається перехід речовини на іншу тарілку. Тому, nречовина розподіляється по декількох тарілках, але на середніх тарілках його nконцентрація виявляється максимальною порівняно з сусідніми тарілками. Розподіл nречовинивздовж шару сорбента підчиняється рівнянню:

х – відстань від початку nколонки до точки, в якій концентрація рівна С;

х₀ – координата nцентра смуги;

Н – висота, еквівалентна nтеоретична тарілка (ВЕТТ)

l – довжина шару сорбента, на nякій проведено поглинання і розміщено n теоретичних тарілок, при цьому n = l/Н

ефективність колонки тим nвища, чим менша висота ВЕТТ і більше число теоретичних тарілок.

Кінетична теорія хроматографії головну увагу надає nкінетиці процесу, зв’язуючи висоту ВЕТТ з процесами дифузії, повільним nвстановленням рівноваги і нерівномірністю процесу. Висота ВЕТТ зв’язана із nшвидкістю потоку рівнянням Ван-Деємтера:

де А(вихрова дифузія), В(поздовжня дифузія), nС(сорбція-десорбція) – const, a U – швидкість рухомої фази.

Константа nА зв’язана з дією вихрової дифузії, яка залежить від розміру частинок, густини nабо щільності заповнення колонки;

В зв’язана з коефіцієнтом дифузії молекул в рухомій фазі, ця nскладова враховує поздовжню дифузію;

С nхарактеризує кінетику процесу сорбція – десорбція, масопередачу та інші ефекти.

При nневеликій швидкості потоку висота,еквівалентної теоретичної тарілки nзменшується, а потім починає зростати. Оскільки ефективність колонки тим вища, nчим менша висота ВЕТТ, то оптимальна швидкість рухової фази буде рівна nшвидкості, яка відповідає точці мінімуму цієї кривої.

Щоб знайти цю точку, nпродиференціюємо рівняння

H = A + B/U + CU:

 

Тоді  

 

 

n

 

 

 

Отже, nкінетична теорія дає основу для оптимізації хроматографічного процесу.

 

Головні nвузли хроматографічного обладнання:

–                               nдозатор (відтворюваність розміру проби і постійність умов її nвведення в колонку).

–                               nколонка (1-2-3 м і 50 м; прямі, спіральні, …)

–                               nдетектор

                        набивні (з адсорбентом)

Колонки

                        капілярні

металеві n(сталь, Сu, латуні)

скляні

фтрорпластові

Колонки nобов’язково термостатуються!

 

Вимоги nдо адсорбенту (Al₂O₃, силікагелі, активоване nвугілля, пористі капіляри на основі спиролу, дивінібензоу, синтетичні цеоліти _n):

1.                            nнеобхідна селективність.

2.                            nхімічна інертність до компонентів суміші.

3.                            nДоступність.

Детектор призначений для nвиявлення  змін в складі гау (чи рідини) nякий пройшов через колонку. Покази детектора перетворюються в електричний nсигнал і передаються реєструючому приладу.

Головними характеристиками детектора є:

–                     nчутливість

–                     nмежі детектування

–                     nінерційність

–                     nдіапазон лінійності I = f (c)

диференціальні (відображають миттєву nзміну          концентрації), часто nзастосовуються

Інтегральні (сумують зміну концентрації nза цілий проіжок часу), застосовуються не часто

До групи nиференціальних детекторів належать:

–                     nкатарометр (детектор по теплопровідності);

–                     nПИД;

–                     nдетектор по лектропровідності;

–                     nполум’яно-фотометричні та їн. в залежності від:

1.                nвластивостей системи;

2.                nагрегатного стану фаз;

3.                nінші причини

 

Газова хроматографія

Рухомою nфазою в газовій хроматографії є газ аьо пара. В залежності від стану нерумої nфази газова хроматографія поділяється на газоадсорбційну (ГАХ), коли nнерухомою фазою є рідина, а точніше плівка рідини на поверхні частинок твердого nсорбента.

При nпроведенні газової хроматографії в нагрітій до певної температури потік nгазу-носія вводять аналізовану пробу. Компоненти проби випаровуються і разом з nпотоком газу поступають в термостатовану колонку з нерухомою фазою n(адсорбентом). В колонці протікають багатократні процеси адсобції і десорбції nна твердому носії або розчинення і виділення в рідуій плівці суміші nгазоподібних речовин. Роздлення складної суміші тут визначається коефіцієнтами nадсорбції або розподілу аналізованих речовин між фазами. На виході з колонки nсуміш розділяється на індивідуальні речовини, які поступають з потоком газу на nдетектор.

Як nрухома фаза Н₂, Не, N₂. Ar, CO₂. Газ-носій не взаємодіє з nрозділюваними речовинами і нерухомою фазою. Процес розділення базується на nвідмінностях в леткості і розчинності (адсорбованості) розділюваних nкомпонентів. Через хроматографічну колонку швидше рухається той компонент, nрозчинність якого в нерухомій фазі менша, а леткість (пружність парів) при nданій температурі t⁰ більша.

Кількісний nаналіз можна провести тільки в тому випадку, якщо речовина термостійка, тобто nвипаровується відтворювано й і вимивається по колонці без розкладу. При nрозкладі речовини на хроматограмі з’являються несправжні піки, які належать nпродуктам розкладу.

 

 

 

 

 

 

Схема nбудь якого газового хроматографа включає:

n

 

n

 

 

дозатор  самописець-

           реєстратор сигналу

                                  регулятор току  

                                                                                        колонка                          

                            газ-носій                       термостат       

Детектори

1.     nПо теплопровідності (катарометр) – універсальний nдетектор, госій широко використовуваний.

Вимірюєтья опір нагрітої nдротини, що поміщена у потік газу.

Температура дротини і її опір nзмінюються в залежності від концентрації компонентів проби. Які вимиваються з nколонки

Калориметр – універсальний, nале малочутоивий (10^-2-10^-3%). На чутлмвість калориметра nвпливає теплопровідність газу-носія, тому необхідно використовувати гази-носії nз максимально можливою теплопровідністю (Не,Н₂).

2.     nПІД

<!–[if gte vml 1]>

++

n<![endif]–>3 вивід в атмосферу                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 4 – nзбираючий електрод                                                                                                                                                                     4                                                                                                                                                                                                                                                                                         катод                                                                                                                                                                                                                                             2 Н₂        6 повітря                                                                                                1 з nколонки газ-носій                                        

Газ, nякий входить з колонки змішується з Н₂ і поступає у форсунку nпальника детектора. Іонізовані частинки, які утворюються заповнюють nміжелектродний простір, в результаті чого опір знижуються, а струм nзбільшується. Стабільність і чутливість ПІД  nзалежить від вибору швидкості потоку всіх використовуваних газів (газ – nносій » 30-50 мл/хв; Н2 » n30 мл/хв, повітря » 300 – 500 мл/хв). ПІД реагує nпрактично на всі сполуки, крім Н₂, інертних газів, О₂, N₂, оксидів нітрогену, S, C, а також води. Цей детектор nмає широку область лінійності (6 – 7 порядків), тому він придатний для nвизначення “слідів” речовин.

3.     nДЕЗ        

 

 

 

 

 

 

В камері газ – носій nопромінюється постійним потоком b-електронів, оскільки це є

В детекторі відбувається nреакція вільних електронів з молекулами певних типів з утворенням стабільних nаніонів

В nіонізованому газі-носії (N₂, He) в якості nнегативнозаряджених частинок присутні тільки електрони. В присутності сполуки, nяка може захоплювати електрони, іонізаційний струм детектора зменшується. Цей nдетектор дає відклик на сполуки, які містять Hal, P, S, NO₃^–, Pb, O. На більшість вуглеводів він nне реагує.

 

 

Кількісний аналіз в nгазовій хроматографії.

Базується nна вимірюванні різних параметрів піку, які залежать від концентрації nхроматографованої речовини:

– висоти

– ширини

– площі

– утримуваного об’єма

– добутку утримуваного об’єму nна висоту піку.

Метод нормування. Приймають суму всіх nпараметрів піків (S h, або SS, або S ширин) за 100%. Тоді nвідношення висоти окремого піку до суми висот або відношення площі одного піку nдо суми площ, помножене на 100 буде характеризувати W(комп.) (%) в суміші. nЗрозуміло, що такий метод передбачає існування однакової залежності величини nвимірюваного параметру від концентрації всіх компонентів суміші.

В методі нормування з nколібрувальними коефіцієнтами за 100% прийм. сума параметрів піків з nврахуванням чутливості детектора. Відмінності в чутливості детектора nвраховуються за допомогою поправкових коефіцієнтів для кожного компонента. Один nз домінуючих компонентів суміші вважають порівняльним і поправковий коефіцієнт nдля нього приймають рівним одиниці. Калібрувальні (градуювальні) коефіцієнти К_і nрозраховують за формулою:

К_ст = 1 n(приймають)

С_і – концентрація nкомпоненту і в модельній суміші із стандартною речовиною

С_ст – стандартної nречовини

П_ст і П_і n– параметри піків речовини – стандарту й речовини і.

За 100% приймають суму nвиправлених параметрів К_іП_і і результат аналізу nрозраховується так, як і в методі нормування

Перевага: 1) не має потреби точності nдозування зразка проби;

                  2) не абсолютна тотожність nумов аналізу при повторних визначеннях.

3. Метод абсолютної калібровки (найбільш точний).

Експериментально визначають nзалежність висоти або площі піку від концентрації речовини і будують nградуювальні графіки. Далі визначають ті ж характеристики піків в аналізованій nсуміші і за градуювальним графіком знаходять концентрацію аналізованої nречовини. (Основний метод визначення домішок).

Перевага: не вимагає розділення всіх nкомпонентів проби, а тільки тих, які необхідно визначити.

4. Метод внутрішнього стандарту.

Базується на введенні в nаналізовану суміш точно відомої кількості стандартної речовини. В якості nстандартної речовини вибирають речовину, близьку за фізико-хімічними nвластивостями до компонентів суміші, але не обов’язково компонент суміші. Після nхроматографування вимірюють параметри піків аналізованого компонента і nстандартної речовини. Якщо стандартна речовина не входить в склад аналізованої nсуміші, W_{компон.} (в %) розраховують по формулі:

Q_i i Q_ст. – параметри піків і речовини nі стандарту відповідно;

r – відношення маси nвнутрішнього стандарту до маси проби.

Перевага: 1) врахування режиму роботи приладу (t°, V_{газу носія}).

                    2) підвищена точність nвнаслідок незалежності відвідтворюваності.

 

 

 

Визначення nвмісту специфічних домішок у субстанції та лікарських засобах, що містять nметамізолу натрієву сіль (анальгін).

0,1 г (точна наважка) поміщають в мірну колбу місткістю 10,0 мл і nрозчиняють в метанолі, доводять об’єм розчину метанолом до позначки, nперемішують і одразу наносять на пластинку (випробуваний розчин).

На лінію nстарту хроматографічної пластинки розміром 10 х 10 із закріпленим шаром nсилікагелю (зв’язуючий компонент – гіпс, флуоресцентний індикатор – 254 нм) nпозначають чотири точки, в які наносять відповідно: 1 – 10 мкл (0,1 мкг) розчину стандартного зразка речовини-свідка n(СЗРС) 4-аміноантипірину; 2 – 10 мкл nвипробуваного розчину (100 мкг анальгіну); 3 n– 10 мкл (0,5 мкг) розчину СЗРС антипірину; 4 – 10 мкл розчину n4-аміноантипірину (0,25 мкг), антипірину (0,5 мкг) і анальгіну (100 мкг).

Пластинку з нанесеними пробами негайно сушать в потоці повітря nпротягом 1 хв, після чого відразу ж поміщають у хроматографічну камеру із nсумішшю розчинників бензол – спирт метиловий (7:3) і хроматографують висхідним nспособом. Коли фронт розчинників пройде 70 мм від лінії старту, пластинку nвиймають із камери, сушать в потоці повітря до зникнення запаху розчинників і nпроглядають в УФ світлі при довжині хвилі 254 нм.

На хроматограмі випробуваного розчину (точка 2) окрім основної плями допускається наявність не більше двох nдодаткових плям, розташованих на рівні плям із точок 1 (не більше 0.25 % 4-аміноантипірину) і 3 (не більше 0,5 % антипірину) та не перевищуючих відповідні плями nза величиною та інтенсивністю поглинання.

Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги nтесту „Перевірка придатності хроматографічної системи”.

Примітка. 1. Приготування розчину nСЗРС 4-аміноантипірину. 0,025 г (точна наважка) стандартного зразка n4-аміноантипірину поміщають в мірну колбу місткістю 10,0 мл, розчиняють в 5 мл спирту nметилового, доводять об’єм розчину спиртом метиловим до позначки, перемішують n(розчин А 4-аміноантипірину).

0,5 мл розчину А n4-аміноантипірину поміщають в мірну колбу місткістю 50,0 мл і доводять об’єм nрозчину спиртом метиловим до позначки, перемішують.

Термін nпридатності розчину – не більше 30 хв.

2. Приготування розчину СЗРС антипірину. 0,050 г (точна наважка) стандартного зразка nантипірину поміщають у мірну колбу місткістю 10,0 мл, розчиняють в 5 мл спирту nметилового, доводять об’єм розчину спиртом метиловим до позначки, перемішують n(розчин А антипірину).

0,5 мл nрозчину А антипірину поміщають у nмірну колбу місткістю 50,0  мл і доводять nоб’єм розчину спиртом метиловим до позначки, перемішують.

Термін nпридатності розчину – не більше 30 хв.

3. Приготування розчину 4-аміноантипірину, nантипірину і анальгіну. У nмірну колбу місткістю 50,0 мл поміщають 0,50 г анальгіну, додають 25 мл спирту nметилового, розчиняють при перемішуванні, додають 0.5 мл розчину А антипірину, 0,5 мл розчину А 4-аміноантипірину, доводять об’єм nрозчину спиртом метиловим до позначки і перемішують.

Термін nпридатності розчину – не більше 30 хв.

4. Перевірка придатності хроматографічної системи.

Хроматографічна система вважається приданою, nякщо:

–                     nна nхроматограмах, отриманих з точок 1 і 3 чітко видно плями;

–                     nна nхроматограмі, отриманій з точки 4 видно чітко три плями.

 

 

Визначення nвмісту специфічних домішок у субстанції кофеїну.

         0,2 г (точна наважка) субстанції nпоміщають у мірну колбу місткістю 10,0 мл, розчиняють у суміші розчинників nметанол – хлороформ (4:6) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю nрозчинників до позначки, перемішують (випробуваний розчин).

         0,5 мл випробуваного розчину поміщають nу мірну колбу місткістю 100,0 мл і  nдоводять об’єм випробуваного розчину сумішшю розчинників метанол – nхлороформ (4:6) до позначки і перемішують (розчин порівняння).

         На лінію старту хроматографічної nпластинки розміром 10 х 20 із закріпленим шаром силікагелю (зв’язуючий nкомпонент – гіпс, флуоресцентний індикатор – 254 нм) наносять в точку 1 10 мкл (200 мкг кофеїну) nвипробуваного розчину і в точку 2 10 мкл (1 мкг кофеїну) розчину порівняння. nПластику поміщають у камеру із сумішшю розчинників розчин аміаку концентрований n– ацетон – хлороформ – бутанол (10:30:30:40). Коли фронт розчинників пройде 15 nсм від лінії старту, пластинку виймають із камери, сушать на повітрі і nпереглядають в УФ-світлі з довжиною хвилі 254 нм.

         На хроматограмі випробуваного розчину nбудь-яка пляма, крім основної, не має бути інтенсивнішою за пляму на nхроматограмі розчину порівняння (не більше 0,5 %).

Примітка. 1. Перевірка придатності nхроматографічної системи.

Хроматографічна система вважається приданою, nякщо:

–                                             nна nхроматограмі, отриманій з точки 2 чітко видно пляму.

 

Визначення nвмісту специфічних домішок у субстанції гліцину.

0,1 г (точна наважка) субстанції поміщають у мірну колбу місткістю n10,0 мл розчиняють у воді і доводять об’єм розчину до позначки, перемішують n(випробуваний розчин (а)).

1,0 мл випробуваного розчину (а) nпоміщають у мірну колбу місткістю 10,0 мл і доводять об’єм розчину до позначки nводою і перемішують (випробуваний розчин (b)).

0,01 г (точна наважка) стандартного зразка гліцину поміщають у мірну nколбу місткістю 10,0 мл, розчиняють у воді і доводять об’єм розчину водою до nпозначки, перемішують (розчин порівняння (а)).

1,0 мл випробуваного розчину (а) nпоміщають у мірну колбу місткістю 200,0 мл і доводять об’єм розчину водою до nпозначки та перемішують (розчин порівняння (b)).

0,01 г (точна наважка) стандартного зразка гліцину і 0,1 г (точна nнаважка) стандартного зразка аланіну поміщають у мірну колбу місткістю 25,0 мл, nрозчиняють у воді і доводять об’єм розчину водою до позначки, перемішують n(розчин порівняння (с)).

На лінію старту хроматографічної пластинки розміром 10 х 20 із nзакріпленим шаром силікагелю наносять 5 мкл (50 мкг) випробуваного розчину (а), n5 мкл (5 мкг) випробуваного розчину (b), 5 мкл (5 мкг) розчину порівняння (а), 5 мкл (0,25 мкг) розчину nпорівняння (b) і n5 мкл (2 мкг гліцину і 2 мкг аланіну) розчину порівняння (с). Пластинку nпоміщають у камеру із сумішшю розчинників кислота оцтова льодяна – вода – nбутанол (20:20:60). Коли фронт розчинників пройде 2/3 довжини пластинки виймають nз камери, сушать при температурі 80°С протягом 30 хв, обробляють розчином nнінгідрину і нагрівають при температурі від 100 до 105 °С протягом 15 хв.

На хроматограмі випробуваного розчину (а) будь-яка пляма, крім nосновної, не має бути інтенсивнішою за пляму на хроматограмі розчину порівняння n(b) (не більше 0,5 %).

Примітка. 1. Перевірка придатності nхроматографічної системи.

Хроматографічна система вважається приданою, nякщо:

–                                             nна nхроматограмі, отриманій з розчину порівняння (b), чітко видно пляму;

–                                             nна хроматограмі, nотриманій з розчину порівняння (с)  видно nдві чітко розділені плями;

–                                             nна nхроматограмах, отриманих з випробуваного розчину (b) і  nрозчину порівняння (а) чітко видно плями і коефіцієнти рухливості R_f повинні бути однакові.

2. Приготування розчину нінгідрину. 0,2 г нінгідрину поміщають у мірну колбу nмісткістю 100,0 мл і розчиняють у суміші розчинників кислота оцтова розведена – nбутанол (5:95), доводять об’єм розчину цією ж сумішшю до  позначки і перемішують.

Розчин застосовують свіжоприготовленим.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ

 

а) Основні: 1. Гайдукевич О.М., Болотов В.В. та ін. Аналітична хімія. n– Харків “Основа”, 2000.–С.382-390.

2. nКузьма Ю.Б., Чабан Н.Ф., Ломницька Я.Ф. Аналітична хімія

б) Додаткові: 1. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. ч. 2. – М.: nВысшая школа, 1982. – С. 261-277.

2. nХаритонов Ю.Я. Аналитическая химия. Ч.2. – М.: Высшая школа, 2001. – С.402-445.

3. nОсновы аналитической химии: Ч.2 / Под ред. акад. Ю.А.Золотова. – М.: “Высшая nшкола”, 2002.

4.Яшин nЯ.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. – М.:Химия, 1976. n– 215с.

5. nАйвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. – М.:Высшая школа, n1968. – 280с.

6. nХаррис В., Хэбгуд Г. Газовая хроматография с программированием температуры. – nМ.:Мир, 1968. – 340с.