Рід Corynebacterium об’єднує в собі грампозитивні паличкоподібні безспорові мікроорганізми з булавоподібними потовщеннями на кінцях. Звідси походить назва роду (coryna – булава). До нього входять види, які заселяють різні біотопи людей і тварин. Одні з них патогенні для людини – збудник дифтерії (Corynebacterium diphtheriae) та тварин – C. ulcerans; інші непатогенні, але подібні за морфологією (C. pseudodiphtheriticum, C. xerosis, C. bovis, C. lipophylicum та ін.). Вони є представниками нормальної мікрофлори шкіри, слизових оболонок, кишкового тракту. До роду Bordetella належать збудники коклюшу та паракоклюшу.
n
Збудник дифтерії (C. diphtheriae)
n
Уперше дифтерійні бактерії описали і виділили в чистій культурі Е. Клебс і Ф. Леффлер у 1883-1884 рр., дифтерійний екзотоксин отримали Е. Ру та А. Ієрсен (1888), протидифтерійну сироватку – Е. Берінг, Я. Бардах, Е. Ру (1892-1894). У 1923 р. Г. Рамон виготовив дифтерійний анатоксин.
n
Морфологія і фізіологія. Коринебактерії дифтерії мають досить характерну морфологію. Це прямі або трохи зігнуті тонкі грампозитивні нерухомі безспорові палички довжиною 1-8 мкм(рис. 12.1), шириною 0,3-0,8 мкм із невеликими булавоподібними стовщеннями на кінцях. На полюсах бактерійних клітин розташовані метахроматичні зерна волютину або зерна Бабеша-Ернста(рис. 12.2)(рис. 12.3). За хімічною природою вони належать до поліметафосфатів і є запасом поживних речовин. Найкраще ці зерна виявляють при забарвленні за методом Нейссера: цитоплазма забарвлюється в світло-коричневий, а зерна волютину – в темно-синій колір. Скупчення нуклеїнових кислот у цитоплазмі може надавати їм характерної смугастості (зеброподібної зернистості). У збудника дифтерії виявлено фімбрії, які зумовлюють адгезивність.
n
Бактерії в мазках виглядають досить характерно і нагадують купку розкиданих сірників. Взаємне розташування паличок також своєрідне: під гострим або прямим кутом, у вигляді латинських літер V, L, Y. У носоглотці часто знаходять псевдодифтерійні палички, коротші й товстіші, ніж дифтерійні, розташовані паралельно, у вигляді частоколу(рис. 12.4). Зерна волютину в них бувають рідко.
n
Останнім часом морфологія збудника дифтерії дуже змінилася. Поряд із типовими паличками в полі зору можна зустріти зернисті й незернисті, тонкі й товсті, гіллясті й нерозгалужені, паличкоподібні й кокоподібні форми. Така безмежна мінливість виникла під впливом антибіотиків, її обов’язково потрібно враховувати при лабораторній діагностиці дифтерії.
n
Інший патогенний представник C. ulcerans є природним патогеном великої рогатої худоби і викликає мастит у корів, однак може спричинити захворювання і в людей, особливо в сільській місцевості.
n
Збудник дифтерії добре росте в аеробних умовах на сироваткових середовищах Ру (згорнута кінська сироватка), Леффлера (сироватка з 1/3 цукрового бульйону) та на мартенівському бульйоні. Широко використовуються сироватковий і кров’яний телуритовий агар, середовище Клауберга та ін. На мартенівському бульйоні утворюється ніжна плівка, яка поступово товстішає, стає крихкою і опускається на дно. На згорнутій сироватці, навіть при густих посівах, колонії ізольовані, ніколи не зливаються, бугристі, нагадують шагренєву шкіру. Вони круглі, сухуваті, кремувато-жовтого кольору, матові, з трохи піднятим центром.
n
За характером росту на телуритових середовищах і деякими іншими ознаками збудник дифтерії поділяють на три біовари: gravis, mitis, intermedius. Біовар gravis утворює великі сірі колонії з радіальною зчерченістю і фестончатим краєм (“маргаритки”)(рис. 12.5), високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген. Колонії біовару mitis (рис. 12.6) малі, опуклі, чорні, гладенькі, токсичність їх менша, бактерії викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген. Біовар intermedius за своїми властивостями займає проміжне становище(рис. 12.7). Раніше біовар gravis виділяли при тяжких формах дифтерії, а mitis – при легких. Тепер така закономірність втрачена.
n
Дифтерійні бактерії розкладають глюкозу, мальтозу, галактозу, не ферментують сахарозу, виділяють цистиназу і не утворюють уреазу. Ці ознаки важливі для диференціації їх від інших коринеформних бактерій.
n
Токсиноутворення. Коринебактерії дифтерії утворюють сильний екзотоксин, який є основним фактором їх вірулентності. Крім токсину вони продукують гіалуронідазу і нейрамінідазу. Дифтерійний токсин – білок із молекулярною вагою 62000 дальтон(рис. 12.8). Він вибірково уражає м’язи серця, наднирникові залози, периферичну нервову систему. Синтез токсинів контролюють спеціальні tox+ гени(рис. 12.9). До складу екзотоксину входять гістотоксин, гемотоксин, некротоксин(рис. 12.10). Його силу вимірюють у мінімальних смертельних дозах. За 1 DLM приймають ту найменшу дозу токсину, яка при введенні в черевну порожнину гвінейським свинкам вагою 250 г викликає їх загибель на четверту добу. Існують токсигенні й нетоксигенні штами коринебактерій дифтерії. C. ulcerans також виділяє екзотоксин, але є штами, які не продукують його.
n
Дифтерійний токсин нестійкий, він швидко інактивується при кімнатній температурі, від дії світла, кисню, повітря, різних хімічних речовин. При дії 0,3-0,4 % формаліну при температурі 38-40 °C протягом місяця він перетворюється в неотруйну сполуку – анатоксин. Останній зберігає імуногенні властивості й використовується для імунізації людей. Він входить до складу різних вакцин.
n
Антигенна структура. У дифтерійних бактерій виявлені як термостабільні, так і термолабільні антигени, за якими вони поділяються на 11 сероварів, але всі вони продукують однаковий екзотоксин, який нейтралізує будь-яка антитоксична протидифтерійна сироватка.
n
Екологія. Основний хазяїн коринебактерій дифтерії – хвора людина і бактеріоносій. Збудник локалізується переважно в рото- і носоглотці. Захворювання передається, в основному, повітряно-краплинним шляхом, але може бути зараження і через посуд, іграшки, книги й інші предмети вжитку, а також харчові продукти, контаміновані збудниками. Важливе значення у виникненні й розповсюдженні хвороби мають дифтерійні бактеріоносії. Виділені від хворих і носіїв коринебактерії дифтерії зберігаються в зовнішньому середовищі декілька днів, у висушених плівках – значно довше. Стійкі до низьких і чутливі до високих температур, добре переносять висушування. Усі дезинфікуючі розчини в звичайних концентраціях (3-5 %) вбивають їх через 20-30 хв. Чутливі до пеніциліну, еритроміцину, тетрацикліну. Токсигенні штами більш чутливі до антибіотиків, ніж нетоксигенні.
n
Захворювання людини. Дифтерія – гостра інфекційна хвороба, яка характеризується фібринозним запаленням слизових оболонок зіва(рис. 12.11)(рис. 12.12), носа(рис. 12.13), гортані(рис. 12.14), токсичним ураженням серцево-судинної, нервової систем і наднирникових залоз. Частіше виникає в дітей від 2 до 8 років. Останнім часом дифтерія “подорослішала”. В Україні були численні випадки захворювань із тяжким перебігом у дорослих, які не мали імунітету. Інкубаційний період триває від 2 до 10 днів. Найчастіше виникає дифтерія зіва (98 %), рідко – носа, вуха, очей, шкіри, статевих органів. На місці вхідних воріт інфекції виникає запалення з утворенням сірувато-жовтої фібринозної плівки (diphthera – плівка), яка міцно спаяна з підлеглою тканиною. Якщо її зняти – тканина кровоточить. Інколи процес із глотки переходить на гортань, трахею, виникає набряк, розвивається асфіксія. Захворювання супроводжується загальною інтоксикацією організму. В кров можуть проникнути і самі бактерії (бактеріємія). Смерть може настати від ядухи або паралічу серця.
n
Імунітет. Після хвороби виникає антитоксичний імунітет, хоча можливі повторні випадки захворювання. Його формування залежить від накопичення в крові антитіл – антитоксинів. Коли їх кількість досягає 1/30 МО, такі діти несприйнятливі до дифтерії.
n
Лабораторна діагностика. Успіх бактеріологічного дослідження значною мірою залежить від своєчасного і правильного взяття матеріалу від хворого. Це повинен робити лікар або спеціально підготовлені середні медичні працівники. Матеріал з мигдаликів і носа беруть окремими стерильними сухими ватними тампонами натщесерце або не раніше, ніж через дві години після прийому їжі. У зв’язку з мінливістю морфології збудника дифтерії, бактеріоскопічне дослідження в сучасних умовах малокорисне. Основне значення має виділення чистої культури і визначення її токсигенності. Результати дослідження видають через 48-96 год. Діагноз дифтерії встановлює лікар. Мікробіологічне дослідження тільки підтверджує клінічний діагноз. Розпізнавання дифтерійного бактеріоносійства можливе лише за допомогою лабораторних методів. Детальніше ці питання викладені в матеріалах до практичного заняття.
n
Профілактика і лікування. Загальні профілактичні заходи зводяться до ранньої діагностики, госпіталізації хворих, виявлення бактеріоносіїв, проведення повноцінної дезинфекції приміщення і предметів вжитку. Основне значення має специфічна профілактика – активна імунізація людей дифтерійним анатоксином, який входить до складу багатьох вакцин: АКДП – адсорбована коклюшно-дифтерійно-правцева, АДП-М – адсорбований дифтерійно-правцевий анатоксин із зменшеним вмістом антигенів, АД-М – адсорбований дифтерійний анатоксин із зменшеним вмістом дифтерійного антигена.
n
Основний метод лікування – введення специфічної антитоксичної протидифтерійної сироватки. Її вводять методом дробної десенсибілізації. При легких формах дифтерії вводять 10000-20000 МО сироватки, при середній тяжкості – 40000-50000 МО, при тяжкій, гіпертоксичній формах – від 60000 до 120000 МО. При поєднанні дифтерії із стафіло- та стрептококовою інфекцією призначають антибіотики (пеніцилін, еритроміцин, тетрациклін) і сульфаніламідні препарати.
n
Бордетели
n
До роду Bordetella входять три види мікроорганізмів, патогенних для людини: B. pertussis – збудник коклюшу, B. parapertussis – збудник паракоклюшу і B. bronchiseptica – збудник бронхісептикозу. Всі вони мають подібні властивості, виділяються з верхніх дихальних шляхів і спричиняють схожі за клінічною картиною захворювання.
n
Збудник коклюшу
n
Коклюш (син.: кашлюк) – гостра інфекційна хвороба, яка характеризується катаральним запаленням дихальних шляхів і нападами спазматичного кашлю. Збудник коклюшу B. pertussis вперше виділили від хворої дитини Ж. Борде й О. Жангу в 1906 році.
n
Морфологія і фізіологія. Збудник коклюшу, як інші види бордетел, – невеликі грамнегативні овоїдної форми палички завдовжки 1-1,2 мкм і завширшки 0,3-0,5 мкм (рис. 12.5)(рис. 12.6). Спор не утворюють, капсули є тільки у B. pertussis, а джгутики – лише у B. bronchiseptica(рис. 12.17). Слабо забарвлюються аніліновими бавниками, трохи інтенсивніше на полюсах. Бордетели – суворі аероби, вибагливі до умов вирощування. Культивують їх на середовищі Борде-Жангу (картопляно-гліцериновий агар із кров’ю) або на казеїно-вугільному агарі (КВА). Колонії всіх видів гладенькі, блискучі, прозорі, опуклі, нагадують крапельки ртуті(рис. 12.18)(рис. 12.19). Виростають через 48-72 год. На кров’яному агарі колонії оточені зонами гемолізу.
n
Біологічні властивості бордетел дуже слабкі. Вони не розкладають білки і вуглеводи, не відновлюють нітрати, але виділяють каталазу.
n
Антигенна структура. Бордетели мають загальний термостабільний О-антиген, гемаглютинін, протективний антиген. Серед 14 виявлених компонентів специфічні антигени позначають арабськими цифрами: 1 властивий для B. pertussis, 12 – B. bronchoiseptica, 14 – B. parapertussis.
n
Токсиноутворення. Збудник коклюшу виділяє термолабільний білковий токсин, який діє на нервові рецептори дихальних шляхів, що викликає спазматичний кашель. Він також збуджує дихальний центр, спричиняє спазм м’язів дрібних бронхів.
n
Екологія. Основним біотопом бордетел є верхні дихальні шляхи хворої людини і бактеріоносія(рис. 12.20). Джерелом інфекції служить переважно хвора людина, яка виділяє збудник протягом 25-45 днів хвороби. Найбільш небезпечними є хворі на стерті й субклінічні форми та нерозпізнані бактеріоносії. Механізм передачі – повітряно-краплинний. Сприйнятливість до коклюшу дуже висока, особливо в дітей до 10 років.
n
Потрапляючи в навколишнє середовище, бордетели швидко гинуть від дії прямих сонячних променів і висушування. Кип’ятіння викликає їх загибель у перші секунди. Низькі температури вони також переносять погано. Дезинфікуючі розчини досить швидко інактивують їх.
n
Захворювання людини. Інкубаційний період триває 5-9 днів. Перебіг хвороби поділяють на три періоди: катаральний (2 тижні), спазматичний або конвульсивний (4-6 тижнів) і завершення (2-3 тижні).
n
Хвороба починається запаленням верхніх дихальних шляхів, незначним підвищенням температури. Потім з’являються кашель, нежить, чхання. Пізніше окремі покашлювання переходять у приступи кашлю, які набувають тривалого характеру(рис. 12.21). Після серії кашльових поштовхів настає форсований свистящий вдих. Це може повторюватися багато разів. Захворювання супроводжується такими ускладненнями, як ларингіт, бронхіт, пневмонія.
n
Імунітет. Після перенесення хвороби виникає стійкий і тривалий імунітет. Він носить гуморальний характер і зумовлений утворенням антитоксинів, аглютинінів, преципітинів, комплементзв’язуючих антитіл. Повторні випадки хвороби не виникають. Перехресний імунітет між захворюваннями, викликаними трьома видами бордетел, не розвивається.
n
Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є мокротиння або слиз із носоглотки, взятий спеціальним (зігнутим) тампоном. Можна зробити посів за методом “кашльових пластинок”: під час кашлю чашку Петрі з живильним середовищем тримають на відстані 10-15 см перед ротом. Збудник коклюшу можна виділити протягом перших двох тижнів хвороби. Культури виростають через 2-5 днів. Колонії на середовищі Борде-Жангу нагадують краплини ртуті. Види виділених культур визначають за морфологічними, культуральними, ферментативними й антигенними властивостями.
n
Із 10-12 дня захворювання проводять серологічну діагностику, використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу і непрямої гемаглютинації.
n
Профілактика і лікування. Для попередження виникнення захворювань важливе значення має рання діагностика й ізоляція хворих дітей протягом 30 днів від початку хвороби. Дезинфекцію не проводять, так як бордетели нестійкі в зовнішньому середовищі. Ослабленим дітям, які були в контакті з хворими, з профілактичною метою вводять 3 мл імуноглобуліну.
n
Для специфічної профілактики застосовують адсорбовану коклюшно-дифтерійно-правцеву (АКДП) вакцину. Перше щеплення роблять у віці 3 місяців, ревакцинацію – через 1,5-2 роки. Лікування проводять протикоклюшним імуноглобуліном і антибіотиками, з яких найбільш ефективними є левоміцитин, еритроміцин, ампіцилін і тетрациклін, але вони діють лише в катаральному і в перші дні спазматичного періоду хвороби.
n
Матеріали до практичного заняття
n
Оскільки середній медичний персонал часто забирає матеріал для мікробіологічного дослідження, необхідно детально вивчити методику забору. Відповідно до інструкцій, від хворих із підозрою на дифтерію забір матеріалу проводять протягом 3-4 год (не пізніше 12 год) після огляду лікаря і не раніше ніж через 2 год, після прийому їжі, бажано до початку лікування. Перед процедурою не можна полоскати горло розчинами антисептиків. Для взяття матеріалу використовують стерильні сухі ватні тампони на дерев’яних паличках, вміщених у пробірки. Матеріал із мигдаликів і носа беруть окремими тампонами при доброму освітленні з використанням шпателя, не торкаючись тампоном язика, слизової щік і зубів. Якщо є наліт на мигдаликах, матеріал необхідно брати на межі уражених і здорових тканин, злегка натискуючи на них тампоном. Для взяття матеріалу з носа використовують один тампон, який вводять спочатку в один, потім у другий носовий хід. Тампони доставляють у лабораторію не пізніше 3-х год після забору. Пробірки з тампонами надписують, вказуючи зів (З) і ніс (Н), на супровідному папері пишуть прізвище й ім’я хворого, його адресу, попередній діагноз, час взяття матеріалу. При дифтерії рідких локалізацій (очі, вуха, шкіра, рана, піхва) матеріал забирають окремим додатковим тампоном з уражених ділянок, а також із зіва та носа.
n
Первинна бактеріоскопія мазків із тампонів проводиться лише на вимогу лікаря і не стільки для виявлення дифтерійних паличок, а щоб не пропустити діагноз некротичної ангіни(рис. 12.22) Симановського-Плаута-Венсана, яку викликає асоціація B. fusiformis і спірохет(рис. 12.23). У такому разі повинен бути ще один тампон виключно для бактеріоскопії.
n
Матеріал із мигдаликів, носа й інших уражених ділянок засівають роздільно на поверхню кров’яного (сироваткового) телуритового агару або середовище Клауберга в чашках Петрі. Посів від одного хворого проводять на єдину чашку, використовуючи одну половину середовища для посіву з мигдаликів, а другу – з носа. При посіві з інших ділянок додають ще одну чашку. При посіві матеріал втирають у середовище на ділянці 2х1 см2, повертаючи тампон, а потім ним же засівають круговими рухами, втираючи в поверхню середовища. Такий метод дозволяє засіяти весь матеріал із тампона, отримати ізольовані колонії, що скорочує тривалість аналізу на одну добу. Для посіву використовують підігріті в термостаті (15-20 хв) середовища.
n
Коротка схема бактеріологічного аналізу виглядає так:
n
перший день – посів матеріалу на середовище й інкубування в термостаті при температурі 37 °С протягом 24-х год;
n
другий день – вивчення колоній, які виросли, постановка проб на токсигенність і цистиназу, пересів ізольованих колоній на скошений сироватковий агар;
n
третій день – облік проб на токсигенність і цистиназу; якщо вони позитивні – видають документовану відповідь про виділення токсигенних коринебактерій дифтерії; при негативних пробах вивчають біохімічні властивості чистої культури (ферментація глюкози, сахарози, крохмалю, сечовини);
n
четвертий день – облік проби на токсигенність у разі запізнення виділення чистої культури, пересів її для біохімічної ідентифікації, видача відповіді про виділення токсигенних чи нетоксигенних коринебактерій дифтерії із зазначенням біоварів;
n
п’ятий день – облік усіх посівів і проб, видача остаточної відповіді про культури, які виділені із запізненням.
n
Отже, основа мікробіологічної діагностики дифтерії – виділення чистої культури і визначення її токсигенності.
n
Визначення токсигенності проводять in vivo та in vitro. При першому варіанті двох морських свинок підшкірно заражають виділеною культурою, але напередодні одній з них вводять антитоксичну протидифтерійну сироватку. Заражена тварина гине, а та, якій ввели сироватку, залишається жива(рис. 12.24).
n
У лабораторній практиці токсигенність дифтерійних бактерій визначають переважно in vitro за допомогою методу імунопреципітації в агаровому гелі. Для цієї мети мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних мікроорганізмів (ВТДМ)(рис. 12.25) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною протидифтерійною сироваткою і висушені.
n
На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски діаметром 6 мм. На відстані 6-7 мм від нього засівають навколо окремими бляшками п’ять культур, дві з них завідомо токсигенні (контроль). Цей метод оснований на здатності токсину (антигену) і сироватки (антитіла) дифундувати в агаровий гель і в місці їх оптимальних співвідношень утворювати білі лінії преципітації (рис. 12.26). Метод дуже економічний, за чутливістю не поступається біологічному, але результат відомий значно раніше (24 год).
n
Дифтерійне бактеріоносійство можна виявити лише бактеріологічним способом. Взяття матеріалу проводять описаним вище методом стерильними тампонами і висівають на скошений сироватковий агар. Через 24 год з культури виготовляють мазок, забарвлюють метиленовою синькою або за Нейссером. При виявленні типових за морфологією дифтерійних паличок встановлюють наявність бактеріоносійства.
n
Коринебактерії дифтерії не завжди мають типову морфологію. У таких випадках необхідно диференціювати їх від псевдодифтерійних бактерій і дифтероїдів, які населяють шкіру і слизові оболонки людини. Відмінні ознаки коринебактерій наведені в інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії.
n
Практична робота
n
1. Забір матеріалу із носа і зіва для проведення бактеріологічного дослідження на дифтерію.
n
2. Вивчити і замалювати морфологію збудника дифтерії в готових забарвлених препаратах-мазках.
n
3. Ознайомитись із препаратами, які використовують для лікування і профілактики дифтерії (антитоксична протидифтерійна сироватка, вакцини, антибіотики, сульфаніламідні препарати).
n
Питання для самоконтролю
n
1. Морфологічні й тинкторіальні особливості збудника дифтерії. Біовари та їх біологічні властивості.
n
2. Токсиноутворення дифтерійних паличок. Значення у розвитку захворювання. Шляхи передачі збудника.
n
3. Протидифтерійний імунітет. Значення вакцинації в профілактиці хвороби. Визначення рівня протидифтерійного імунітету в людини.
n
4. Методика і правила забору матеріалу у хворого та ідентифікація збудника. Значення проб на токсигенність.
n
5. Специфічна терапія дифтерії.
n
6. Збудник коклюшу. Біологічні властивості, шляхи передачі, особливості перебігу хвороби, методи мікробіологічної діагностики та профілактики коклюшу.
n
Ситуаційні задачі
n
1. У дитини з важкою формою ангіни із ротоглотки тампоном було взято матеріал і засіяно на телуритове середовище. Через добу на ньому виросли великі, з нерівними краями колонії чорного кольору. Мікроскопія мазка засвідчила метахроматичні властивості цих бактерій, що дозволило запідозрити дифтерію. Яким чином довести роль паличок у виникненні захворювання?
n
2. Протидифтерійний імунітет обумовлений достатнім рівнем антитоксинів у сироватці крові.
n
А. Яким чином визначити їх наявність?
n
Б. Що треба зробити при відсутності або низькому рівні антитоксинів?
n
3. У дитини протягом 9 днів спостерігались катаральні симптоми, на десятий день з’явився судорожний кашель при нормальній температурі. Приступи кашлю виникали на будь-які зовнішні подразники. Педіатр поставив діагноз “Коклюш” і для підтвередження призначив мікробіологічне дослідження.
n
Які методи мікробіологічної діагностики можна застосувати?
n
Відповіді
n
1. Поставити пробу на токсигенність.
n
2. А – поставити РНГА з еритроцитами, навантаженими дифтерійним анатоксином.
n
Б – імунізувати дифтерійним анатоксином.
n
3. Висіяти виділення хворого методом “кашльових” пластинок та ідентифікувати культуру. Поставити реакцію аглютинації або РЗК з сироваткою дитини.
n
