СЕРОЛОГІЧІНІ РЕАКЦІЇ ДЛЯ СЕРОЛОГІЧНОЇ ІДЕНТИФІКАЦІЇ

Серологічіні nреакції для серологічної ідентифікації. Серологічні реакції для серологічної nдіагностики.

 Сучасні методи імунологічних досліджень при nінфекційних хворобах (імунофлуоресцентний, імуноферментний аналіз, nгенодіагностика, полімеразна ланцюгова реакція). Серологічні реакції, які nвикористовуються у вірусології. Гіперчутливість негайного і сповільненого типу.

 

Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою: 1) nдля виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних nантигенів-діагностикумів – для серологічної діагностики інфекційної nхвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, nвірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами – для серологічної nідентифікації збудників.

Якщо в реакції nантитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени n(бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації n(РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антиге­нами (полісахариди, nбілки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У nреакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й nантитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких nзалежить від кількісного співвідношення антигену й ан­титіла  

Коли до комплексу антиген — антитіло приєднується комплемент, nвідбувається  реакція зв’язування  комплементу (РЗК).

Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати nнейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію nнегайної  гіперчутливості.

Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають nвластивості спричинювати РП, nРА, РЗК-

У nряді випадків з’єднання антитіла з антигеном може бути неміц­ним; nоборотність комплексу антиген—антитіло відбувається в результа­ті nконформаційних змін молекули антитіла, при надлишку антигену або зменшенні nспорідненості між антигеном і антитілом, а також під впли­вом nзовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).

Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й nполісистемні.

РЕАКЦІЯ nАГЛЮТИНАЦІЇ Аглютиніни n— антитіла, що мають властивість спричиняти скле­ювання відповідних nбактерій, еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, клітин тканин, nкорпускулярних хімічних часточок з адсорбованими на них антигенами або nантитілами з утворенням конгломератів (аглю-тинатів), видимих nнеозброєним оком.

Додавання відповідних nімунних сироваток до зависі бактерій спричиняє їх аглютинацію  і випадання в осад у вигляді пластівців або зерен. В реакції аглютинації n(моносистемній, прямій, двокомпонентній) nберуть участь антитіло (аглютинін) і корпускуляр­ний антиген (аглютиноген); вони взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях і при наявності електроліту (0,85 n% розчин натрію хлориду).

 

РА бактерій з відповідними nаглютинуючими сироватками харак­теризується специфічністю. nПроте може траплятися групова аглютина­ція, тобто склеювання nблизьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в слабших розведеннях nсироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, nбактерія В — b, c, d, бактерія С — с, d, є, nа в сироватках крові імунізованих тварин утво­рюються  відповідні  nїм  аглютиніни.

Для nвиявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тва­рин, імунізованих складним комплексом антигенів nбактеріальної клітини, застосовують nметод адсорбції аглютинінів (реакція висна­ження   Кастеллані).

За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають також nанти­генну структуру бактерій; крім nтого, його використовують для при­готування nспецифічних аглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті nметодом адсорбції аглютинінів, nназивають монорецепторними. Вони дають nзмогу точніше визначати видову залежність низки збудників інфекційних  nзахворювань.

При імунізації nтварин рухливими бактеріями, що містять джгути­кові (Н) і nсоматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. nДжгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких nпластівців, сома­тичні аглютиніни порівняно повільно утворюють nконгломерати бакте­рій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається крупнопластівцевою, а nО-аглютинація — дрібнозер­нистою.

 

                

 

   

 

Бактерії, що містять nVi-антиген, слабко або зовсім не аглютинують­ся О-сироватками, але добре nаглютинуються Vi-сироватками. Це до­водить, що О- і Vi-антигени, так само як О- nі Vi-антитіла, мають різну структуру.

 

 

 

При здійсненні РА nтреба враховувати феномен затримки аглюти­нації. Це буває як при занадто великих, так і при nмалих концентра­ціях імунної сироватки, взятої для РА. Цей феномен властивий nусім реакціям імунітету і має враховуватись nпри лабораторній діагно­стиці nінфекційних захворювань.

РА широко застосовують для серологічної діагностики nчеревного тифу, паратифів А nі В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями nПровачека), туляремії, лепто­спірозу nта інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці nкрові хворих відповідні аглютиніни.

 

 

 

РА використовують для nідентифікації виділених у хворих, людей і тварин мікроорганізмів із nзастосуванням заздалегідь відомих аглюти­нуючих сироваток.

Крім прямої аглютинації, у практиці діагностики nінфекційних за­хворювань застосовують nтакож реакцію непрямої гемаглютинації (РИГА), сутність якої полягає в тому, що антиген, який використо­вується для проведення РА з сироватками крові nхворих, попередньо адсорбований на nповерхні еритроцитів барана. Зокрема, РНГА засто­совують при діагностиці черевного, висипного тифу і паратифів, ту­беркульозу, токсоплазмозу та ін. Для здійснення nРНГА можна вико­ристати спеціальні nеритроцитарні діагностикуми (завись формалізова­них еритроцитів, «навантажених» антигенами або антитілами).

 

 

Реакція аглютинації латекса (РАЛ) Для постановки РАЛ використовують сенсибілізовані nчастинки полістиролового латекса діаметром  n0,5-1,2 мкм, які в присутності гомологічного імунологічного реагента n(антигена або антитіла) склеюються. Ця реакція відбувається досить швидко – nпротягом 2-7 хв, що дозволяє її застосовувати як експрес-метод виявлення nантигенів і антитіл. Навантажені антитілами часточки латексу nшироко використовуються для виявлення антигенів вірусів і бактерій.

Навантажуючи nлатекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у сироватці хворого. Таку nмодифікацію РАЛ використовують для виявлення протигрипозних, протикраснушних, nпротикорових антитіл тощо.

 

Реакція коаглютинації (КОА). Для постановки nКОА  використовують золотисті стафілококи n(штам Cowan 1). У клітинній стінці цих мікроорганізмів міститься білок А, який nмає значну спорідненість до Fc фрагмента IgG людини і кролика. Тому молекули nIgG після адсорбції на стафілококах, що мають білок А, орієнтовані в оточуюче nсередовище своїми вільними Fab фрагментами, в яких знаходиться активний центр nантитіла.

Реакцію ставлять на скляних nпластинках,  змішуючи рівні об’єми (1-2 краплі) nдосліджуваного матеріала (кров, сеча, слина, фільтрати фекалій та інш.) і nстафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують  і через 2-5 хв на темному фоні враховують nрезультати.  На темному фоні повинна nчітко буде проглядатись дрібнозерниста аглютинація стафілококів.

 

 

1. Реакція преципітації відрізняється nвід аглютинації за характером антигенів: в реакції аглютинації вони nкорпускулярні, навіть цілі клітини, а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному nстані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, nхімічні речовини.

Реакція преципітації (РП) — взаємодія розчинного антигену (пре-ципітиногену) й антитіла (преципітину) nв присутності електроліту (0,85 %   nрозчин натрію хлориду).

РП має високу чутливість і nспецифічність. Вона дає змогу виявити антиген (преципітиноген) у розведенні 1 : 1 000 n000 і 1 : 10 000 000. Як преципітиногени nможуть бути використані білки тваринного, рос­линного і бактеріального nпоходження: кров, сироватка крові, екстрак­ти з різних органів і тканин, харчових продуктів білкового похо­дження (м’ясо, риба, молоко), фільтрати культур nмікроорганізмів або тканин, уражених nними. Преципітиногени збудників сибірки, чуми, туляремії термостійкі. Деякі преципітиногени витримують нагрівання до температури  n120—180 °С.

Відомо понад 20 nмодифікацій РП, які поділяють на кілька груп: РП у пробірках, nкапілярах, на предметних стеклах, фільтрувальному папері,  ацетатцелюлозній плівці, в гелі та ін.

РП nвикористовують у діагностиці сибірки, туляремії, віспи та ін., а nтакож при вивченні антигенної структури деяких груп бактерій. У nсудовій медицині за допомогою РП визначають видову належність плям nкрові, сперми; в санітарній експертизі виявляють домішки мо­лока nодного виду тварини у молоці іншого виду, добавляння штучного меду nдо натурального, фальсифікацію м’ясних, рибних, борошняних виробів nі т. д. У біології РП застосовують для встановлення генетич­них nзв’язків близьких між собою видів тварин, рослин, мікроорга­нізмів.

Феномен nпреципітації полягає в тому, що антитіла (преципітини), зєднуючись nіз розчинними антигенами (преципітиногенами), зумовлюють утворення nосаду (преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції nприймають найбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.

Феномен преципітації широко nвикористовується в мікробіологічній практиці.  nВ судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової nналежності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка nлюдини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена nкров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, nмед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального nменінгіту, чуми, дизентерії,  визначення nінфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження n(шкіра, хутро, щетина).

 

 

               n

 

Для nаналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципітації в гелі. nРозрізняють просту і подвійну дифузію в гелі.

Проста імунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, nякий містить преципітуючу сироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху nнашаровують розчин антигена. Дифундуючи в гель, антиген звязується nз відповідними антитілами, утворюючи мутні лінії преципітації (рис. 17.10.). nРозміщення ліній в агарі визначається концентрацією відповідного антигена.

Подвійна імунодифузія за Оклі і Фулторпом. На відміну від попереднього методу у подвійній nімунодифузії реагенти розділені шаром нейтрального гелю, який не містить nреагентів. На поверхню гелю, змішаного з специфічною сироваткою, вносять шар nнейтрального гелю, після застигання якого нашаровують антиген. Дифундуючи nназустріч один одному, антиген і антитіла зустрічаються в шарі нейтрального nгеля та утворюють лінії преципітації.

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який nрозлитий тонким шаром в чашках Петрі або на предметних скельцях, за допомогою nспеціальних штампів роблять круглі лунки на однаковій відстані одна від одної n(4-10 мм). nУ лунки вносять досліджувану сироватку і розчин антигена в різних розведеннях nабо різні антигени. Із лунок антигени й антитіла дифундують назустріч один nодному, і в точці їх оптимального співвідношення утворюється преципітат у вигляді nтоненьких білих ліній. Якщо в сироватці є різні антитіла або антигени декількох nвидів, зявляються nдекілька ліній преципітації.

 

 

 

 

Ухтерлоні розрізняв 4 основні варіанти nреакції між антигеном і антитілом :

1) при nвзаємодії ідентичних  антигенів із специфічними nантитілами лінії преципітації зливаються, утворюючи дугу;

2) коли nобидва антигени неідентичні – лінії преципітації перехрещуються при умові, що nсироватка містить антитіла проти двох антигенів;

3) при nчастковій ідентичності лінії преципітації нагадують дугу із шпорою. Чим більшою nє спорідненість антигенів, тим шпора менше виражена і розміщується ближче до nдуги;

4) обидві лінії перехрещуються і nодночасно зливаються. Це означає, що обидва антнгена містять як одинакові, так nі різні детермінанти, які вступають в реакцію з антитілами поліспецифічної nсироватки

Однією із різновидностей реакції преципітації в nгелі є проста радіальна імунодифузія за Манчіні. За її допомогою nвизначають концентрацію імуноглобулінів у сироватці крові.

Методика nпостановки реакції наступна. Розтоплений агар при температурі 56°С змішують з відповідною антисироваткою (анти IgG, IgM чи nIgA) у співвідношенні 3:1 і швидко вливають у чашку Петрі або на скляні nпластинки. Після його застигання з допомогою трафарета роблять лунки. У кожну nдослідну лунку вносять по 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні nлунки додають у чотирьохкратних розведеннях стандартну сироватку  з відомим вмістом імуноглобулінів.

Після чого чашки або пластинки  поміщають у вологе середовище в ексикатор на n24-48 год при 4°С і nоцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець преципітації навколо nлунок. За величиною діаметрів кілець преципітації навколо лунок із стандартною nсироваткою будують калібровальну криву. При цьому враховують, що у певному   інтервалі концентрації імуноглобулінів nдіаметр кільця прямо пропорційний логарифму концентрації імуноглобулінів .

 

 Реакція радіальної nімунодифузії Манчіні

Феномен nпреципітації широко використовується в мікробіологічній практиці. Зокрема, у nсудово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності nкрові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, nрізних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. nТаким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, nмед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального nменінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція nтермопреципітації Асколі, яку використовують для визначення інфікованості nзбудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, nщетина). Із досліджуваного матеріалу шляхом кипятіння nекстрагують сибірковий антиген, який потім використовують для реакції.

Реакція nУхтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить nфеномен преципітації. Її використовують для визначення антигенного складу nорганів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у nскладних системах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та nінших захворювань.

2. Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – nелектрофорезу в гелі і наступної після нього подвійної імунодифузії.

Для проведення реакції імуноелектрофорезу nвикористовують скляні пластинки, предметні скельця, на які наносять тонкий шар nагару або агарози. Спочатку антигени розміщують в центрі пластинки і розділяють nїх в електричному полі. Потім у канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії nрозділу антигенів, вносять специфічну сироватку. Дифундуючи назустріч один nодному, антигени і антитіла у місці контакту утворюють дуги преципітації.

 

 

 

 

Лізини і реакції лізису

Лізинами називають nспецифічні антитіла, які спричиняють розчи­нення бактерій, клітин nрослин і тварин. Лізис бактерій відбувається за участю двох nінгредієнтів: специфічного антитіла, яке є в імунній сироватці, і nнеспецифічної речовини будь-якої нормальної й імунної сироватки — nкомплементу.

Лізини мають властивість розчиняти бактерії, трепонеми, nлептоспіри (бактеріолізини), а також спричиняти глибокі порушення структури еритроцитів (гемолізини), лейкоцитів та nінших клітин (ци­толізини). Вони мають усі основні властивості nантитіл, але діють на антиген тільки  в присутності  nкомплементу.

Реакція лізису nмоносистемна, непряма, трикомпонентна. У зв’язку з нестійкістю nкомплементу в реакціях лізису використовують консервований nкомплемент, найчастіше сироватку крові морської свинки. Консервують nкомплемент добавлянням натрію хлориду в концентра­ції nдо 10 %, або 4 % борної кислоти, або 5 % натрію сульфату, а та­кож висушуванням при nнизькій температурі у вакуумі (ліофілізація).

 

              а                                           б                                            в

                      Послідовні nфази лізису (а, б, в) холерних вібріонів.

 

При імунізації кролів nзависсю еритроцитів барана у них в крові накопичуються антитіла, що nмають властивість змінювати еритроцити, в результаті чого адсорбційний nзв’язок між гемоглобіном і стромою еритроцитів порушується, nгемоглобін легко проникає з еритроцитів в оточуючу рідину і вона nзабарвлюється в рожевий колір. Нагрівання імунної сироватки при nтемпературі 56 °С протягом ЗО хв супроводить­ся втратою її nгемолітичних властивостей внаслідок інактивування комплементу, а добавляння nсвіжої сироватки крові тварини, навіть неімунізованої, знову nвідновлює гемолітичні властивості імунної сироватки. Якщо в пробірку nвмістити у відповідних кількісних спів­відношеннях гемолітичну сироватку n(антитіло), еритроцити барана (антиген) і комплемент, то протягом nкількох хвилин суміш із каламут­но-червоної   стає   nрожевою   (лаковою).

Реакція nгемолізу має яскраво виражену специфічність. її викори­стовують nяк індикатор для реакції зв’язування комплементу.

Отже nдля реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. nАнтигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) nвикористовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того, nпроти яких клітин спрямована дія лізинів, вони мають свої назви: проти бактерій n– бактеріолізини, спірохет – спірохетолізини, еритроцитів – гемолізини, проти nінших клітин – цитолізини. Комплемент при утворенні комплексу клітина (антиген) n– антитіло, звязується nз ним, активується за класичним шляхом і викликає розчинення клітини. Без nкомплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька реакцій лізису: nбактеріолізу, гемолізу, цитолізу.

Реакція лізису

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити барана), антитіло n(гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської свинки або nстандартний сухий комплемент). Для одержання еритроцитів у барана беруть кров nіз яремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергійно струшують, nщоб нитки фібрину намотались на кульках, і кров не згорнулась. Потім nізотонічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми. Для цього nкров центрифугують 10 хв при 2000 об/хв. Плазму відсмоктують піпеткою, а до nосаду еритроцитів знову додають ізотонічний розчин, ретельно перемішують і nцентрифугують. Таке промивання еритроцитів роблять тричі. Рідину обережно nвідсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотонічному nрозчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації nкроликів еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої nготують сироватку, де містяться антитіла проти еритроцитів. Для інактивації комплементу, nщо знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і визначають nтитр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у nпотрійному титрі. Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до n1:600. Комплемент беруть у розведенні 1:10.

Схема постановки реакції гемолізу

 

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити nлізувались. Рідина черво­ного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні nпробірки немає. Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осіли на дно, nрідина над ними безбарвна.

 

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації nє участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка nвиступає у ви­гляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не nзавжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. nПроте відомо, що при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди nприєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, nкомплемент не зв’язується, залишається вільним у системі. При додаванні nкомплексу еритроцити барана – гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, nвикликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При nвідповідності антигена антитілу з ним зв’язується комплемент. Щоб переконатись nв цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності nгемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – nреакція негативна (рис. 54).

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні nсироватки відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку nпрогрівають при 56 °С протягом 30 хв, для інактивації власного комплементу, а nпотім готують ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. nАнтигенами можуть бути бактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні nречовини, екстракти органів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою nгвінейської свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку використовують у nпотрійному титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному nрозчині хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолітичні nсироватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому nзберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед основним дослідом nтитрують. У ряді пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні розведення nгемолізину до титру. У кожну пробірку вносять по 0,5 мл 3 % зависі еритроцитів, nпо 0,5 мл комплементу у розведенні 1:10 і по 0,5 мл фізіологічного nрозчину. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину. При відсутності nгемолізу в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за nтрьохплюсовою систе­мою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), nвідсутність гемолізу (–).

За титр гемолітичної сироватки приймають nте найбільше її розведення, яке в присутності комплементу викликає повний nгемоліз еритроцитів. В РЗК беруть робочу дозу гемолітичної сироватки у nпотрійному титрі. Якщо титр сироватки складав 1:1800, то робочою дозою буде n1:600.

Схема титрування nгемолітичної сироватки

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК для nвизначення дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб nповністю зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу nзалишиться незв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, nостанні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про nнегативний результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом nдодають 1 мл ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково розводять 1:10 і nвикористовують як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози nкомплементу, починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого nоб’єму 1,5 мл додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з nрівних об’ємів 3 % суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в nробочому титрі. Її витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що nнеобхідно для зв’язування еритроцитів із гемолізином.

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробірки nвносять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 – 0,5 мл ізотонічного nрозчину. Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину.

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром nкомплементу буде та його найменша кількість, при якій спостерігається повний nгемоліз (+++). Робоча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і nпрактично вона буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, nякщо в першій пробірці, де є повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за nробочу дозу приймають 0,25, ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

 

Схема nтитрування комплементу

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК запропонували Ж. nБорде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з цією методикою nкожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний об’єм її nстановить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній послідовності. nСпочатку в пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають nрівні об’єми антигена і комплементу в робочій дозі. Пробірки ретельно струшують nі ставлять у термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з nантитілом, і на цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в термостаті nінкубують гемолітичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду nдодають по 1 мл гемолітичної системи і знову ставлять у термостат. Через 30-45 nхв проводять облік реакції при умові повного гемолізу в контролях сироватки, nантигена і комплементу.

Схема постановки основного досліду РЗК

 

РЗК оцінюють за чотириплюсовою nсистемою: різко позитивна реакція (++++, +++) – повна затримка гемолізу, рідина nбезколірна або блідо-рожевого кольору, еритроцити осідають на дно; позитивна nреакція (++) – часткова затримка гемолізу, рідина рожевого кольору, компактний nосад еритроцитів; сумнівна реакція (+) – незначна затримка гемолізу, на дні nледь помітний осад, рідина рожевого кольору; негативна реакція (–) – повний nгемоліз, осад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу nвідзначається більш високою специфічністю ніж реакція аглютинації, проте вона nменш чутлива. Антитіла, nякі зв’язують комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту захворювання, в nтой же час аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох nінфекційних захворювань, алергічних станів. Вона використовується для nсерологічної діагностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, nлептоспірозу, бруцельозу, туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та ін.), nвірусного походження (грипу, паротиту, цитомегалії, поліомієліту, nлімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), грибкових (кандидозу, nасперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

 

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь nв ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у nвигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не nзавжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. nПроте відомо, що при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди nприєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, nто комплемент не звязується, залишається вільним у nсистемі. При додаванні комплексу еритроцити барана – гемолізини вільний nкомплемент, звязуючись nз ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу nРЗК. При відповідності антигена антитілу з ним звязується nкомплемент. Щоб переконатись в цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну nсироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при nнаявності гемолізу – реакція негативна.

 

 

 

Методи ідентифікації вірусів

 

 

 

Важливим етапом лабораторної nдіагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у nдосліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних nсироваток.

Реакція гемаглютинації – феномен nсклеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді n«парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

 

 

 

Реакція гемадсорбції

 

Реакція nгальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція nбазується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за nдопомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка nаглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі nантигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі nклітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні nпротивірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для nрозведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин n(рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців n(гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та nзберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити nпопередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних nінгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення nтермолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, nбентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових nпланшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності nвірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують nробочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця n– максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію nеритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з nнерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про nнегативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” nна дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій nаглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

 

Облік nреакції  гальмування гемаглютинації

 

Для постановки реакції з метою nвизначення невідомого вірусу або його антигенів у буферному розчині (0,2) nроблять двократні розведення імунної сироватки (вихідне розведення 1:10), а nпотім додають невідомий антиген в об’ємі 0,2 мл (4‑8 ГАО). Систему інкубують залежно від nвластивостей вірусу при температурі 4 °С, 18 °С, 37 °С 1-18 год. Потім до nкомплексу додають подвійний об’єм зависі еритроцитів. Пробірки або пластини nінкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання nеритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності nаглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів nгрипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі nгемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності nадсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок nпояви в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при nвзаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, nзв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, nкультура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням n1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської nсвинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. nСпецифічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють nферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб nзвільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних nпластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає nв тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом nта інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль nвикористовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед nдослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від nбаластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають nпо 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні nпробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. nПробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали nклітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки nдодають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній nтемпературі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для nресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. nРозглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на nнаявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При nпозитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному nсередовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують nдля ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних nвірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на nвзаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до nнейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком nрезультатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та nфеноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції nінші живі систе­ми – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в nкультурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна nрідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна nсироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища nІгла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають nзалежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують nкультури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи nлюдських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні nдесятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл nкожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. nПеред проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як nправило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення nвірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. nКлітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за nнаявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну nцитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше nрозведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями nімунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), nа після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають nодношарові культури клітин. Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і nвраховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про nнейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За nідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах. n

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою nклітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не nзмінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при nвідсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. nВони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого nутворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу nсторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне nрН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл nдосліджуваного вірусміст­кого матеріалу, який містить 100 ТЦД₅₀, з nрізними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після n30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл nклітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової nолії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 n°С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в nдослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на nоранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо nвимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу nособливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

Надійним методом ідентифікації вірусів є реакція nнейтралізації бляшкоутворення вірусів у культурах клітин. Принцип nреакції полягає в тому, що антитіла специфічної імунної сироватки, які нейтралізують nвіруси, сприяють зменшенню числа бляшок – зон некрозів – в одношаровій культурі nклітин.

Для постановки реакції на одношарову культу клітин у чашках nабо матрацах наносять суміш вірусів і специфічної імунної сироватки, які nпопередньо інкубовані при 37 °С протягом 1 год для нейтралізації. Після цього nповерхню моношару клітин заливають освітленим індиферентним агаром у суміші з nусіма необхідними компонентами і суправітальним барвником нейтральним червоним. nЗаражені клітини інкубують у вологій камері в атмосфері з 5 % вуглекислого газу nпротягом 5 діб при температурі 37 °С.

Більш чутливим методом вивчення утворення бляшок є nвикористання бентонітового покриття. Цей метод набув широкого застосування при nвивченні ентеровірусів. Особливість його полягає в тому, що заражені сумішшю nвірусів та імунної сироватки моношарові культури клітин заливають рідким nживильним середовищем, яке містить гель бентоніту. Часточки бентоніту nадсорбуються на поверхні культур клітин і гальмують вільне поширення вірусів nсеред клітин. Вже через 2 дні після зараження з’являються вірусні бляшки у nвигляді прозорих плям на молочно-матовому фоні моношару клітин (див. вкл., рис. n28).

Про нейтралізуючу активність сироватки свідчить зменшення nчисла та величини бляшок, які утворюються під агаровим покриттям у порівнянні nіз контролем без специфічної сироватки. Реакцію вважають позитивною, якщо число nбляшок або їх величина зменшились на 80 % у порівнянні з контролем. nНейтралізуючим титром сироватки є те її найбільше розведення, при якому ще спостерігають nнейтралізацію вірусів, що попереджує утворення бляшок в культурі клітин.

При постановці реакції нейтралізації в курячих ембріонах або nлабораторних тваринах їх заражають сумішшю вірусмісткого матеріалу та nспецифічної імунної сироватки. При обліку результатів враховують кількість nзагиблих ембріонів чи тварин, утворення зон некрозів на хоріоналантоїсній nоболонці курячих ембріонів або оцінюють ступінь нейтралізації вірусів за їх, nнаприклад, гемаглютинуючою активністю. РН часто застосовують для лабораторної nдіагностики герпесу, грипу, парагрипу, паротиту, поліомієліту тощо.

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у nвірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить nдо непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі nвзаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього nне відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів.

Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна nімунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та nелектроліт. Зважаючи на високу чутливість реакції, всі її компоненти перед nпостановкою основного досліду обов’язково титрують для визначення робочих доз nінгредієнтів.

При виконанні реакції в окремих пробірках змішують nвірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. nПісля інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані nгемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних nпробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною nсироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне nдодавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не nсупроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та nантитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими nеритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження nгемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна nреакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція n(відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”).

До особливостей РЗК при вірусологічних інфекціях належить те, nщо її можна ставити як при температурі 37 °С (інкубуючи систему “антиген – nантитіло – комплемент” протягом 1 год), так і на холоду (+4 °С протягом 18 nгод), а також використовуючи мікрометод, коли всі інгредієнти реакції беруться nв об’ємі не 0,5 мл, а 0,25 мл. РЗК використовують майже при всіх вірусних nінфекціях.

 

Облік РЗК

 

У реакціях імунодифузії використовують nпринцип дифундування антигенів і антитіл назустріч один одному в напіврідкому nсередовищі, наприклад, агаровому гелі. У зоні оптимальних співвідношень nантигенів та антитіл утворюються лінії преципітації. Їх число залежить від nкількості антигенів, які відрізняються своїми епітопами, так як кожна лінія nвідповідає своїй системі антиген – антитіло.

Реакцію ставлять, як правило, на стерильному склі, яке nпокривають 1 % агарозою. Після застигання в ній роблять лунки. У центральну nлунку вносять специфічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють nматеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом n24-48 год. Поява ніжних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного nантигена.

Тест є більш чутливим при поєднанні із електрофорезом. Метод зустрічного nімуноелектрофорезу найчастіше використовують для визначення HВsAg вірусу nгепатиту В або інших вірусних антигенів, які мають негативний заряд. Сутність nцього методу полягає в тому, що на скляну пластинку наносять шар агарози, в nякому після застигання роблять паралельні ряди лунок. Антиген наливають у nлунки, які роз­ташовані ближче до катоду, а сироватки – в лунки поблизу аноду. nПісля цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають постійний nелектричний струм. Вірус­ні антигени з негативним зарядом рухаються в напрямку nдо аноду, а антитіла сироватки – до катоду. Через 24 год в агаровому гелі nспостерігають появу ліній преципітації, які утворюються в зонах, що містять nеквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

Метод імунної електронної мікроскопії (ІЕМ) дозволяє nвизначити комплекси, які утворюються внаслідок взаємодії вірусних антигенів із nспецифічними антитілами сироваток. У багатьох випадках цей метод є більш nефективним, ніж використання звичайної електронної мікроскопії. Для реалізації nметоду матеріал, який містить віруси, змішують з імунною сироваткою, інкубують протягом n1 год при температурі 37 °С, потім 8-12 год при 6 °С. Комплекси вірусів з nантитілами осаджують при ультрацентрифугуванні. Після промивання осаду до нього nдодають 3 % вольфрамово-оцтову кислоту або ураніл-ацетат. Встановлюють nвідповідне значення рН, наносять матеріал на спеціальну мідну сітку і вивчають nпід електронним мікроскопом, спостерігаючи наявність агрегації вірусів, nнавантажених антитілами. ІЕМ використовують для виявлення та ідентифікації nвірусів гепатиту А і В, поліомієліту, цитомегалії, ротавірусного ентериту тощо.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) набув широкого застосування у nвірусології внаслідок високої специфічності та зручності в користуванні. nІснують численні модифікації цього методу. Зокрема, можна виявляти та nідентифікувати віруси як безпосередньо в досліджуваному матеріалі, так і після nпопереднього зараження ними, наприклад, культур клітин. Принцип методу полягає nу взаємодії антигенів з антитілами, які заздалегідь мічені флуорохромами n(родаміном, який дає люмінесценцію червоного кольору, або nфлуоресцеїнізотіоцианатом натрію, який зумовлює зелене світіння комплексу в nультрафіолетових променях). Метод непрямої імунофлуоресценції можна ефективно nвикористовувати для ідентифікації більшості вірусів.

При непрямому методі дослідження культуру клітин, яка nрозташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають nдосліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних nпараметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та nнаносять на них специфічну сироватку. Систему інкубують у вологій камері при nтемпературі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сироватки і наносять nтонкий шар флуоресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця nвідмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під nлюмінесцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне світіння.

РІФ

При реакції радіального nгемолізу відбувається взаємодія вірусних антигенів, які адсорбовані на nеритроцитах, суспендованих в агарозному гелі, з антитілами, що внесені в лунки nі дифундують в шар агару. При цьому утворюються специфічні імунні комплекси на nповерхні еритроцитів. У присутності комплементу спостерігається лізис nеритроцитів і, відповідно, утворення зон гемолізу навколо лунок. Реакцію оцінюють за допомогою nстереоскопічної лупи. При позитивному тесті діаметр зони гемолізу навколо лунки nможе досягати 2 мм nі більше. При відсутності гемолізу або його діаметрі менше 2 мм реакцію розцінюють як nнегативну. Вважається, що за своєю чутливістю ця реакція не поступається РГГА.

 

Реакція nзворотної непрямої гемаглютинації використовується nу вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність nїї полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними nпротивірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок nчого вони склеюються і випадають в осад.

Таким чином, компонентами реакції nє еритроцити, оброблені таніновою кислотою з адсорбованими на них молекулами nпротивірусних антитіл (сенсибілізовані еритроцити), вірусні антигени і розчин nелектроліту.

Реакцію можна ставити в пробірках, лунках, на склі, в nкапілярах, а також мікрометодом.

Для постановки реакції досліджуваний матеріал (0,025 мл) nрозводять дво­кратно електролітом, після чого додають такий самий об’єм nеритроцитарного анти­тільного діагностикуму. Експозиція відбувається протягом n30 хв при температурі 37 °С після чого проводять облік реакції.

При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають nвиражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими nкраями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – n“перевернута парасоль­ка”. При негативному результаті – щільний, компактний nосад з рівними краями.

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при nцьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки nнеобхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання nантигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої nсуміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза nхрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім nпероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній nв людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або nнерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при nвикористанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох nантигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній nпрактиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення nциркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве nзначення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим nпероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат n(наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо nантиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. nМетодика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу nменшої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, nутворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять nпротиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим nкомплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись nадсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. nПерші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова nкислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують nможливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, nмає 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, nможна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, nтаких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях nпочали за­стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх nвикористання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. nБіотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для nцього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Непрямий ІФА

 

Облік ІФА

 

Техніка nподвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні nантитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої nхарактеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій nлімфоцитів. На клітинах nодночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються nміж собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання nавідин-біотин-пер­оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне nмоноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при nцьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі nзабарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом nавідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового nпродукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують nкінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в nнаступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових nпланшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи nантитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджува­ну nсироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів nлюдини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають ­субстрат nдля використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, nпісля затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного nметоду, найчас­тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і nхарактеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо nважливими є моди­фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають nдосліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з nантигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені nферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені nантитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці nбуде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, nстандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, nфіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається nвисока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, nв яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два nнукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність nзаміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є nпоказником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також nавторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні nконкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого nізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим nбільша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена nзв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку nантитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в nякому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. nПри наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись nз антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у nпробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У nданому випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До nутвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке nзв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від nкількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для nвивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з nантитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження nантитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану nсироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є nпропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST n(radioallergo­sorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його nмодифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на nтвердій фазі (­фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), nреагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла nпроти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 nпг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних nметодів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). nПроте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують nпроведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і nнедостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти nбіополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які nбули розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що nлокалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, nоскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим nбуло розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, nпереносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій nвони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на nповерхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних nдосліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та nімобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а nодержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку nрозділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично ­переносять nна листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. ­Фіксова­ні nблоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають ра­діо­активно nмічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в nкасеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці nпоявляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні nантитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат nдля ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну nмембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується nблотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, nWestern блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких nвикористовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на nфеномені реакції антиген-антитіло.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає nу використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний nзонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні ­зонди, що nзастосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, ­штучно­го nсинтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на від­міну nвід РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділи­ти nдві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним nізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного nзонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі якого nзнаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним ­аналогом nтрифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце nтимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде nкомплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи nавідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який зна­ходиться nв яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має nчотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину nреагують з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, ­свідченням чого nє зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфіч­ний субстрат. Зонди з nбіо­тином можна виявити, використовуючи мічені флуоро­хромом антитіла проти ­біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які nмістять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, nантивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, nвірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В nостанньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі nдуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги nелектрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, на nякій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть nна смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх nпевний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. ­Смуги nпромивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену nантиглобулі­нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення nантиглобулінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, nде наступила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна nвикористовувати мічені ізотопом антитіла .

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є nбіотин, за­стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає nнебезпеку, пов’язану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування nбіотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання nавідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення nсубстрату). В результаті хімічної реакції наступає зміна кольору і дуги стають nвидимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для nдослі­дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку nінфекційного процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу nIgG, але також анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ nна основі виявлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і nВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують nдля діагностики захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями n(наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

 

 

Чотири типи nреакцій гіперчутливості за Coombs i Gell: 

1. Реакції анафілактичні, атопічні.

2. Реакції цитолітичні, цитотоксичні.     Гіперчутливість nнегайного типу

3. Реакції імунних комплексів (гістотоксичні).

4. Реакції туберкулінового типу     – Гіперчутливість сповільненого типу

 

 Алергени поділяються на nнеінфекційні та інфекційні. Найбільш багаточисленною і різноманітною є група nнеінфекційних алергенів.

      До nних відносяться: пилкові, побутові, епідермальні, харчові алергени.

      nОднією із найбільш розповсюджених груп неінфекційних алергенів є група nалергенів із пилка рослин, яка спричиняє масові алергічні захворювання – nполінози. Полінози тісно пов’язані з сезоном цвітіння різноманітних рослин. У nцей час у повітрі одночасно може знаходитись декілька десятків видів пилка.

      Розрізняють такі види пилкових nалергенів:

    1. nІз  пилку бур’янів – амброзії, лободи, nполину, пирію тощо.

    2. nІз  пилку дерев – клена, дуба, берези, nліщини, ясеня.

    3. nІз  пилку злаків – жита, сонячника, nкукурудзи. 

    4. nІз  пилку лугових трав.

ГІПЕРЧУТЛИВІСТЬ НЕГАЙНОГО ТИПУ

До гіперчутливості nнегайного типу відносять анафілаксію, сиро­ваткову хворобу, атопії та nін. Гіперчутливість негайного типу про­являється незабаром після nвведення антигену. У розвитку її бере участь реакція антиген — nантитіло в тканинах і рідких тканинних середовищах. Гіперчутливість негайного nтипу може передаватися від однієї тварини до іншої пасивним nспособом, тобто при введенні імунної сироватки сенсибілізованих nтварин. У більшості випадків стан гіпер­чутливості негайного типу nможна зняти десенсибілізацією.

Анафілаксія

Однією з форм зміненої реактивності є nанафілаксія (лат. ana — проти, phylaxis — захист) — стан підвищеної чутливості організму, спричинений nповторним введенням антигенів (сироваток, антибіоти­ків та ін.). Анафілаксію nвідкрив і вивчив Ш. Ріше, дослідження якого в n1913 р. були відзначені Нобелівською премією.

Першу дозу антигену, яка спричиняє nпідвищену чутливість, нази­вають сенсибілізуючою (лат. sensibilitas — nчутливість), другу дозу, від введення якої розвивається анафілаксія,— nвирішальною. Сенси­білізуючу дозу вводять тваринам nпідшкірно, внутрішньоочеревинно, внутрішньовенно, внутрішньосерцево, вирішальну — nвнутрішньо­венно або внутрішньосерцево і в nбільшій кількості, ніж сенсибілізу­ючу. nСтан підвищеної чутливості у тварин розвивається не відразу після введення антигену, а через певний n(інкубаційний) період (8— 21 день).

Основну nроль у механізмі анафілаксії в людини відіграє реакція антигенів з антитілами (IgE), що мають цитофільність nдо тканинних базофілів (тучних клітин). Повторне введення антигену nзумовлює з’єднання його з антитілом на поверхні клітин, що nприводить до утворення біологічно активних речовин — медіаторів n(гістамін, аце­тилхолін, серотонін, брадикінін та ін.) і nспричиняє розвиток патоло­гічного процесу: зниження дисперсності nгуморального середовища, закупорку капілярів, подразнення нервових nзакінчень, зміни обмін­них процесів і порушення життєдіяльності nклітин.

Антитіла (IgE) можуть сполучатися з nантигенами як на поверхні клітин, так і в крові, де утворюється nбагато розчинного комплексу антиген — антитіло, який може фіксувати nкомплемент. Різні прояви клінічних форм анафілаксії у різних видів nтварин залежать від швид­кості вивільнення медіаторів, їх кількості і nнеоднакової чутливості до них органів і тканин.

 

 

Найбільш nдемонстративно клінічна картина анафілаксії відтво­рюється у морських свинок. nЯкщо попередньо сенсибілізувати мор­ську свинку підшкірним введенням 0,01 мл кінської nсироватки, к по­тім через 8—21 день внутрішньосерцево ввести nїй 0,1—0,5 мл тієї ж сироватки, то в неї розвивається картина анафілактичного nшоку. Через 1—2 хв після повторного введення сироватки у nморської свинки виникає неспокій, її шерсть стає скуйовдженою; тварина чухає лап­ками ніс, у неї спостерігається мимовільне nвиділення сечі і калу, чхан­ня, різка ядуха, тонічні і клонічні судороги, nсповільнене й утруднене дихання. Через 5—10 хв тварина гине від асфіксії nпри явищах зни­ження температури тіла, nзменшення кількості комплементу і зниження зсідання крові. На розтині виявляють емфізему легень внаслідок спазму м’язів бронхів, незсідання крові, гіперемію nі крововиливи у слизовій оболонці nшлунка, кишок та в інших органах.

У людей nанафілактичний шок виникає внаслідок повторного вве­дення n(через кілька хвилин — діб) гетерогенних імунних сироваток при nлікуванні хворих на різні інфекційні захворювання (дифтерія, правець, сибірка, nанаеробна інфекція), притому антибіотиків (пені­цилін та ін.). Настає ядуха, частішає пульс, знижується артеріальний тиск, температура тіла, з’являються судороги, nспазм бронхів, набря­ки, біль у nсуглобах, висипи на тілі та ін. У деяких випадках шок при­зводить до летального кінця.

У розвитку nгіперчутливості негайного типу певне значення має спадковий фактор (схильність nдо алергійних захворювань, яка пере­дається за рецесивним типом).

Частість nрозвитку гіперчутливості негайного типу залежить од віку людей, nінтенсивності синтезу білка і продукції антитіл. У но­вонароджених і дітей nгрудного віку внаслідок слабкого розвитку нер­вової та інших nсистем організму вона проявляється менш інтенсивно; у nвіці від 1^х/₂ року до періоду статевого дозрівання буває nзначно ча­стіше і з важчим перебігом; у дорослих схильність nдо алергічних захво­рювань знижується і в похилому віці стає nнезначною.

Місцевий прояв nанафілаксії. Багаторазові, з 6-денними інтервалами підшкірні nшєкци антигену (сироватки) кролям спричиняють після 5—6-го nвведення інфільтрат і некроз шкіри (реакція, або феномен, Артюса). Місцева nанафілаксія розвивається від введення й інших антигенів n(бактерії, токсини, антибіотики і т. д.), які можуть сполу­чатися з IgE.

 

 

Анафілаксію можна nстворити у сенсибілізованих тварин і на окре­мих ізольованих органах (реакція nШультца — Дейла) з гладенькою м’язовою тканиною (матка,  кишки та ін.).

Пасивна анафілаксія. nПідвищену чутливість відтворюють в ін­тактних nморських свинок пасивним способом, тобто ін’єкцією імунної сироватки nсенсибілізованих тварин. Стан сенсибілізації у них настає не відразу, а через 24 год при підшкірному, через n12 год при внутріш-ньоочеревинному й через 4 год при внутрішньовенному nвведенні; під­вищена чутливість nзберігається у тварин від 3—4 тижнів до 2 мі­сяців.

Десенсибілізація. nЯкщо вирішальна доза не спричинила анафі­лаксії, то тварина втрачає nпідвищену чутливість до цього антигену, десенсибілізується на 2—3 nтижні, а потім знову стає чутливою, іноді ще більше. Десенсибілізація настає і nпісля перенесеної анафілаксії.

Специфічний, nпростий і дуже ефективний метод десенсибілізації дробним введенням nантигену (сироватки) запропонував О. М.. Безред­ка (1907). Введені nроздрібнені невеликі дози антигену (сироватки) зв’язують циркулюючі в крові IgE і тим самим запобігають nутворенню у високих концентраціях гістаміну та інших токсичних nречовин, які спричиняють анафілактичний шок.

Розвиткові анафілаксії можна запобігти nвведенням у гіперчутли-вий організм (з n7-денними інтервалами) невеликих кількостей високо-молекулярного антигену, при цьому в сироватці nкрові з’являються блокуючі антитіла (IgG), які взаємодіють з антигеном і nзапобігають реакції IgE з nтканинними базофілами.

Для лікування nанафілактичного шоку застосовують введення кисню, штучне дихання, nлікарські засоби — адреналін, кордіамін, кортикостероїди, nантигістамінні препарати; в разі пеніцилінового _ШОКу — nантишокову терапію і введення пеніцилінази.

Атопії

Одним nіз видів гіперчутливості негайного типу є атопії (грец. atopos — nнезвичайний, дивний), що являють собою генетично детермі­новану nсхильність до патологічних імунних реакцій у відповідь на дію nподразників (алергенів), які для більшості людей (80—90 %} нешкідливі.

Атопії nзумовлені появою в окремих людей антитіл (IgE) з шкірно-сенсибілізуючою nактивністю. Фіксовані на клітинах різних органів і тканин IgE вступають у реакцію з nалергенами (атопенами), і в ре­зультаті утворення медіаторів nрозвивається клінічний прояв атопії.

Форма алергічної nреакції залежить від того, де утворюється і ло­калізується комплекс nантиген — антитіло. Якщо антиген вступає у реакцію з антитілом в nшкірі, виникає кропив’янка; у верхніх дихаль­них шляхах — nалергічний риніт, у слизовій оболонці ока — кон’юнк­тивіт, nу слизовій оболонці бронхів — бронхіальна астма.

У патогенезі атопічних nреакцій важливе значення має спадкова схильність, що реалізується за допомогою алельних nгенів Н і h (ге­нотип   НН — здоровий,   hh — алергічний).

Понад 10 % населення nземної кулі уражені атопією. У половини хворих в анамнезі є аналогічне захворювання nбатьків. Атопічні ре­акції  піддаються   nгіпосенсибілізації.

Атопени n(алергени) поділяють на побутові й епідермальні (пил пухових nперин, подушок, епідерміс шкіри, шерсть свійських тварин та ін.), nвиробничі (бібліотечний пил, пил шерсті, бавовни, деякі барв­ники, мила, лаки, nдеревина, вибухові й синтетичні речовини та ін.), рослинні n(пилок квітуючих лучних трав, садових і кімнатних рослин), харчові (яйця, полуниці, nраки, цитрусові, кава, шоколад та ін.), лі­карські n(ацетилсаліцилова кислота, антибіотики і сульфаніламідні препарати).

Діагностика атопій nпровадиться за клінічними ознаками і лабора­торними даними (шкірні алергічні nпроби, виявлення антитіл до алер­генів).

Лікування і nпрофілактика спрямовані на припинення контакту З алергенами, nвведення (внутрішньошкірне, нашкірне, пероральне, інгаляційне, nв слизові оболонки і кон’юнктиву) хворим зростаючих Доз nалергену, до якого виявлена підвищена чутливість, відтворення толерантності nза допомогою толергенів; в разі відсутності ефекту від гіпосенсибілізації nпризначають антигістамінні препарати (бронхолі-тики  та  nін.).

 

Цитотоксичні реакції спостерігаються при переливанні групонесумісної nкрові, резус конфлікті  та вживанні nрізних лікарських засобів. До комплексу клітина (антиген) – антитіло nприєднується комплемент. Активуючись за класичним шляхом зумовлює лізис клітин n(еритроцитів, лейкоцитів тощо) і виділення факторів запалення.

Ізоімунні реакції при переливанні крові: а) при nпереливанні групонесумісної крові ізогемаглютиніни зумовлюють склеювання nвведених еритроцитів, що приводить до їx лізису; nб) гемолітична хвороба новонароджених при резус-конфлікті.    

Схема розвитку гемолітичної nхвороби новонароджених, зумовленої

Rh –конфліктом

 

Медикаментозні реакції. Різноманітні фармакологічні nпрепарати i продукти їx деградації можуть зв’язуватися з тканинами i клітинами організму i тим caмим із nгаптенів перетворюються на повноцінні антигени, які індукують синтез антитіл, nщо реагують з ними. Часто це відбувається на поверхні форменних елементів nкрові. До утвореного комплексу антиген-антитіло приєднується комплемент, що nобумовлює лізис цих клітин.

 

Реакції третього типу – nімунокомплексні супроводжуються утворенням імунних nкомплексів. При тривалому  контакті nорганізму з надлишком антигена  n(персистентна інфекція, при синтезі аутоантитіл проти власних тканин nтощо),  взаємодія антигену з антитілом nприводить до утворення розчинних імунних комплексів-преципітатів, які здатні nвідкладатись на стінках кровоносних судин i блокувати циркуляцію крові, а це nспричиняє порушення трофіки в даній ділянці. Якщо з такими комплексами nзв’язуються компоненти комплемен­та, то утворюються продукти розщеплення СЗа i C5a, які є анафілатоксинами. Ці речовини nвикликають виділення активних біологічних факторів, що зумовлюють місцеве nпошкодження тканини i стимулюють запальний процес.

 

 

 

Механізм nрозвитку гіперчутливості сповільненого типу. Після першого контакту з антигеном зростае кілъкість nсенсибілізованих CD4 Т-лімфоцитів (Th-1), частина iз них – це Т-лімфоцити пам’яті.  При nповторному попаданні антигену в організм Th-1 хелпери  його nрозпізнають у комплексі з антигеном гістосумісності другого класу на nповерхні макрофага, що стимулює їx бласттрансформацію і проліферацію. nАктивовані Th–l клітини виділяють значну кількість цитокінів nклітинного імунітету: фактор nпереносу, мітогенний фактор, фактор, що nзамінює Т-лімфоцити; фактор, який стимулює nТ-лімфоцити; фактор, який стимулює В-лімфоцити, фактор, який пригнічує міграцію макрофагів (МПФ), фактор, який nактивує макро­фаги (МАФ) лімфотоксин, інтерферон та інші.

 

Узагальнена таблиця гіперчутливості

Виявити стан nсенсибілізації організму можна за допомогою клінічних алергічних проб.

       

Проби    in nvivo

1. Епікутанна nпроба

2. nCкарифікаційна шкірна nпроба

3. nАплікаційна проба

5. nВнутрішньошкірні проби.

6. nКон’юктивальна проба

7. nНазальна провокаційна проба.

Проби         in nvitro

Реакція ушкодження нейтрофілів–лейкоцитолізу

Реакція агломерації лейкоцитів.

Реакція дегрануляції базофілів за Шеллі.

Реакція специфічної  бласттрансформації лейкоцитів (РБТЛ

 

Імунологічна толерантність

Імунна nсистема суворо контролює антигенну стабільність організму, швидко реагує на чужорідні nагенти, що проникають в організм, елімінуючи і знищуючи їх. У той же час вона nне реагує на антигени власного організму. Таким чином імунна система терпима, nтолерантна до своїх речовин, але нетерпима до речовин не властивих власному nорганізму.

Такий nвид реакції організму, який оберігає “своє” та елімінує “чуже” одержав назву nприродньої толерантності. Основна роль природньої толерантності – збереження nбіологічної характеристики індивіда.

Толерантність завжди розвивається тільки на конкретний антиген, який її nіндукував. Організм не відповідає на нього видимою реакцією. У той же час nорганізм зберігає здатність реагувати імунною відповідю на будь-який інший nчужорідний чинник.

Така nзакономірність пояснюється тим, що здатність розрізняти свої і чужі антигени nвиникає у тварин, як правило, після народження. В ембріональному і ранньому nпостнатальному періодах імунна система сприймає введені в організм чужорідні nантигени як свої.

АУТОІМУННІ nПРОЦЕСИ

 

Аутоімунний процес – це такий стан, при якому nз’являються антитіла або сенсибілізовані лімфоцити до антигенів власних тканин.

Залежно від локалізації патологічного процесу аутоімунні nзахво-рювання поділяють на органоспецифічні i неорганоспецифічні.

Аутоімунними захворюваннями вважаються nтакі патологічні процеси, при яких аутоімунні peaкцiї nвідіграють основну патогенетичну роль.

Аутоантитіла можна виявити у здорових oci6, nнаприклад, проти ядер клітин епітелію щитовидноі залози, міоглобіну, nтиреоглобуліну, клітин гладкої мускулатури та інші. Кількість nаутоантитіл підвищується з віком, причому в жінок у більшій мipi, ніж у nчоловіків.

 

 

При органоспецифічних виявляють аутоантитіла специфічні до антигену nвідповідного органу. До таких захворювань відносять аутоімунні хвороби крові, nщитовидної залози, поліендокринопатії, ураження центральної нервової системи та nочей.

Для вcix цих захворювань характерне деструктивне уражен­ня nпевного органа, зумовлене імунною клітинною відповіддю (в основному nаутореактивними Т-лімфоцитами).

 

До неорганоспецифічних системних захворювань відносять сис­тем ний червоний nвовчак, псоріаз, хвороби сполучної тканини. У цих хворих виробляються nаутоантитіла до різних клітинних i позаклітинних структур (ядер, мітохондрій тощо). Тканинні nпошкодження часто розвиваються внаслідок утворення імунних комплексів.

Критерії nпідтвердження аутоімунної патології:

і) nнаявністъ аутоантигенів;

2) наявність відповідних аутоантитіл або сенсибілізованих nлімфоцитів;

3)  пасивний пepeбir захворювання.

У життєдіяльності людського організму важливу nроль віді гра­ють  природні   n(нормальні)  протитканинні  аутоантитіла,  nщо мають властивість знешкоджувати і nзв’язувати продукти розпаду й метабо­лізму nклітин; 3 віком концентрація аутоантитіл у крові і тканинах збільшується.

При розмноженні в nклітинах нервової системи вірусів поліомієліту, кліщового енцефаліту, деяких штамів вірусу nгерпесу та ін. утворю­ються проміжні n(вірусіндуковані) антигени, які спричиняють синтез аутоантитіл. Реакція цих антитіл з антигенами nнормальної нервової тканини зумовлює nїї глибоке ушкодження.

При старінні різко nзнижується імунологічна активність лімфоїдної тканини, настає nдефіцит Т- і В-лімфоцитів, значно підвищується ча­стість nмутацій імунокомпетентних клітин, у них з’являється агресив­ність nпроти нормальних систем.

Ушкодження nтканин виникають в результаті утворення у великій кількості nрозчинних комплексів антиген — антитіло. До них відне­сено nхвороби імунних комплексів (імунокомплексні): інфекційний ендокардит, nгломерулонефрит, системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит та інші nаутоімунні захворювання. Аутоімунний харак­тер nмають також деякі гемолітичні анемії і тромбоцитопенії.

Генетична nзумовленість аутоімунної відповіді в патології лю­дини nвизначає родинні випадки захворювання, розподіл їх за статтю і nвіком. У монозиготних близнюків буває більш високий ступінь конкордантності nза цими ознаками, ніж у дизиготних. Аутоімунний про­цес nіндукується клітинною (сенсибілізовані клітини лімфоїдного ряду) і nгуморальною (сироваткові антитіла) імунною системою.

Імунологічні nреакції, що відбуваються у вагітнит жінок, мають значення в^розвитку nбезплідності, невиношування вагітності, гемолі­тичної хвороби nновонароджених, коли настає невідповідність плода й nорганізму матері щодо еритроцитарних, лейкоцитарних, тканин­них nта  інших  nантигенів.

Аутоімунні реакції nвиникають також в результаті реакцій між ідіотипами (антигенними nдетермінантами, розташованими у варіабель­них ділянках поліпептидних nланцюгів антитіл, й антиідіотиповими антитілами).

Клітинні і гуморальні nзахисні реакції — це ефективна система, яка забезпечує збереження nсталості внутрішнього середовища макро­організму. Вони проявляються на nмолекулярному, клітинному й орга-нізмовому рівнях, що наділяє nїх широким діапазоном дії на пато­генні  агенти.

Незважаючи на важливу nроль клітинного і гуморального імуні­тету, стан несприйнятливості nне вичерпується цими формами за­хисту. Несприйнятливість до nінфекційних агентів може проявлятися без участі фагоцитозу й nантитіл. Помічено, що діти, уражені агамагло-булінемією, іноді nпорівняно легко переносять кір, видужують і по­вторно не хворіють. У ряді nвипадків високий рівень антитіл не захи­щає організм від nзахворювання. Явища незавершеного фагоцитозу і тривалого носійства nпатогенних бактерій свідчать про те, що клі­тинні і гуморальні форми nімунітету не завжди можуть забезпечити той складний процес nнесприйнятливості, який потрібний для захисту організму  вищих   nтварин   і   людини.