Тема 1. Генетика мікроорганізмів. Організація генетичного матеріалу бактерій. Генотипова та фенотипова мінливість Мутації.

Заняття 11

Тема 1. Генетика мікроорганізмів. Організація генетичного матеріалу бактерій. Генотипова та фенотипова мінливість Мутації.

Тема 2. Генетичні рекомбінації (трансформація, кон’югація, трансформація). Генна інженерія і біотехнологія. Використання мікроорганізмів людиною.

 

 

Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипні прояви.

   Вона започаткована блискучими експериментами Грегора Менделя в 60-х роках минулого століття. Закони Менделя були підтверджені дослідами Г. де Фріза, К. Клорренса, Е. Чермака. Значний вклад у розвиток вчення про мінливість мікроорганізмів внесли К. Негелі (засновник теорії плеоморфізму – про безмежну мінливість бактерій), Р. Кох і Ф. Кон, які висунули ідеї мономорфізму, що стверджували постійність та незмінність бактерійних ознак, притаманних певним видам.

   Значний внесок у вивчення законів мінливості мікроорганізмів зробили Л. Пастер, І. Мечніков, Л. Ценковський, М. Вавілов, М. Тимофєєв-Ресоцький. У 1944 р. О. Ейвері, К. Маклауд, М. Мак-Карті довели, що саме ДНК є речовиною, яка зберігає генетичну інформацію. Д. Уотсон і Ф. Крик, М. Уілкінсон у 1953 р. розшифрували генетичний код, встановивши особливості механізмів синтезу білка.

 

 

 

F. Crick i  J. Watson – відкривачі структури ДНК

 

 

 

Історія розвитку молекулярної біотехнології

 

 

Організація генетичного матеріалу бактерії

   Як відомо, генетичний апарат прокаріотів побудовано з двоспіральної нитки ДНК, яка складається з 3х109 пар нуклеотидів і замкнута в кільце. Вона суперспіралізована завдяки поліамінам (сперміну, спермідину), іонам магнію і на електронних мікрофотографіях має форму намиста.

 

 

ДНК E. coli

 

 

ДНК складається з пуринових (аденін, гуанін) та піримідинових (тимін, цитозин) нуклеїнових основ – гетероциклічних азотистих сполук, до складу яких входить цукор дезоксирибоза.

Будова ДНК

 

З’єднує полімери фосфорна кислота. Між ланцюгами існують ковалентні та водневі зв’язки, тому молекули легко розпадаються. Кількість аденінових основ дорівнює тиміновим, а гуанінових – цитозиновим.

 
   Хромосома у функціональному відношенні поділяється на фрагменти, які називаються генами. Ген – елементарна одиниця спадковості, що контролює синтез специфічного поліпептидного ланцюга (структурний ген) або діяльність структурних генів (ген-регулятор, ген-оператор). Представлено його невеликими ділянками геномної або епісомної ДНК. Кожний ген складається з триплетів (кодонів) нуклеїнових основ, які кодують одну амінокислоту.
   Гени, які відповідають за синтез сполуки, позначають рядковими літерами латинського алфавіту, які відповідають назві сполуки. Наприклад, his+ – гістидиновий ген, leu+ – лейциновий ген. Гени, що контролюють резистентність до антибіотиків, інших препаратів, позначаються літерою r (resistance – стійкість). Чутливі до препаратів бактерії позначаються літерою s (sensitive – чутливий). За цим принципом позначення kanr, risr означає резистентні до канаміцину та ристоміцину штами, а kans, riss – чутливі. Фенотип батерій позначається аналогічно генотипу, однак прописними літерами.

   Сукупність генів нуклеоїда та позахромосомних факторів спадковості зумовлюють генотип бактеріальної клітини. Фенотип – індивідуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

   Існує певний механізм, за допомогою якого послідовність нуклеотидів у гені визначає послідовність амінокислот у білку.

   Спочатку ДНК клітини деспіралізується, і на одній із її ниток, як на матриці, фермент ДНК-залежна РНК-полімераза за принципом комплементарності формує полірибонуклеотидний ланцюг, який називається інформаційною або матричною РНК (іРНК, мРНК). Ця стадія синтезу білка називається транскрипція (transcriptio – переписую). 

  Інформаційна РНК переноситься клітиною в цитоплазму, де розташовані рибосоми. Розпочинаєтся наступний етап – трансляція (translatio – перенесення). Саме в цей період на рибосомах відбувається зчитування генетичного коду іРНК та побудова поліпептидних ланцюгів.

   У цитоплазмі клітини завжди існують особливі специфічні нуклеїнові кислоти, які називаються транспортними РНК (тРНК). На одному з кінців вони мають триплет нуклеотидів (антикодон), а на іншому – місце для з’єднання з відповідною амінокислотою (кодон). Вони доставляють необхідну амінокислоту до рибосоми, на якій відбувається елонгація (elongatio – подовження) поліпептидного ланцюга.

   Генетична інформація клітини може бути закодована як хромосомними генами, так і генами, які знаходяться у позахромосомному стані, тобто відмежовані від хромосоми, але здатні до тривалого підтримання та відтворення в такій формі. Їх виявлено у бактерій багатьох родів. Позахромосомні елементи спадковості представлено плазмідами, транспозонами, Is-елементами та фагами.

   

Найдрібнішими за своїми розмірами є Is-послідовності (insertion sequenses – вставлені послідовності).

 

Вони складаються з 1000 пар нуклеотидів і не несуть інших генів, крім генів, що відповідають за їх переміщення у різні ділянки бактеріальної ДНК. В усіх випадках вони пов’язані з хромосомною або плазмідною нуклеїновою кислотою і не здатні до самостійної реплікації.

Функції:

    Координуюча: взаємодія транспозонів, плазмід, помірних фагів між собою та хромосомою бактерії, забезпечуючи їх реплікацію.

    2. Регуляторна: викликають інактивацію генів, або служать промоторами (ділянки ДНК, які регулюють експресію клітинних генів).

    3. Індукують мутації за типом делеції або інверсії

   Транспозони (transposition – переміщення) є нуклеотидними послідовностями, які крім генів, що відповідають за транспозицію, можуть нести гени, кодуючі інші функції. Довжина їх сягає 2000-20000 нуклеотидних основ.

 Вони можуть існувати самостійно у вигляді кільцевої молекули ДНК, не здатної до реплікації, або бути включеними до складу бактерійних геномів і плазмід. Вони можуть нести інформацію про синтез, наприклад, бактеріальних ентеротоксинів, ферментів, руйнуючих антибіотики.
   Транспозони виявлено у клітинах дріжджів, бактерій, рослин, комах, хребетних і навіть людей. Найважливіша їх властивість – здатність до міграції з одного реплікона до іншого. За рахунок цього вони виконують функції:

    1. Регуляторна.

    2. Кодуюча.

    3. Індукують генні мутації за типом делеції або інверсії.

    4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями (структурними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявляються інсерції, делеції, інверсії

Плазміди – кільцеві молекули ДНК молекулярною масою до 10⁶-10⁸ Д з 1,5-400 тис пар основ. Вони можуть існувати в цитоплазмі у вільному стані або бути інтегрованими з клітинною хромосомою. Тоді їх називають епісомами. Плазміди містять у своєму складі tra-оперон (transfer – перенос), який забезпечує їх здатність до передачі, і гени, які кодують якусь ознаку. Їх називають трансмісивними, якщо вони самостійно передаються іншим клітинам за допомогою кон’югації, і нетрансмісивними, коли не мають власного апарату передачі, а переносяться разом трансмісивними або при трансдукції. Вони можуть існувати в клітині у декількох копіях.
   

 

Види плазмід

    1. Трансмісивні (кон’югація).

    2. Нетрансмісивні (трансдукція)

    3. “Криптичні”.

    4. Монокопійні

    5.Мультикопійні

Плазміди виконують регуляторну та кодуючу функції. Регуляторний ефект їх полягає в здатності представляти власні реплікони при порушенні функціонування клітинних генів; кодуюча роль – у внесенні в клітину нових ознак, які надають їй певних переваг при взаємодії з організмом хазяїна.
    Сьогодні відомо декілька десятків різноманітних плазмід. Серед них найдетальніше вивчено плазміди F, Col, R, Ent, Hly, бактеріоциногенності, біодеградації. Плазміди F забезпечують перенос бактеріальної хромосоми при кон’югації. R-плазміди є факторами множинної резистентності до лікарських засобів. Вони кодують стійкість до 10 антибіотиків та солей важких металів (Ni, Cu, Hg). Col-плазміди забезпечують синтез коліцинів – білків з летальною активністю проти коліформних мікроорганізмів. Hly-плазміди зумовлюють утворення гемолізинів у золотистих стафілококів, Ent-плазміди забезпечують ентеротоксигенну активність штамів кишкової палички. Плазміди біодеградації надають мікроорганізмам здатність утилізувати незвичні субстрати: Cam-плазміда – камфору, Oct-плазміда – октану тощо.

Функціональні властивості плазмід

   

Про плазмідну локалізацію гена можуть свідчити високі темпи втрати ознаки спонтанно, а також підсилення її під впливом підвищеної температури, хімічних речовин (акридинові барвники), спільна втрата і спільне набуття декількох ознак.

   

Сприяти проявам мінливості бактерій можуть деякі помірні та дефектні бактеріофаги. За своїми біологічними властивостями вони подібні до плазмід, можуть самостійно існувати в цитоплазмі бактеріальних клітин. При інтеграції з хромосомою мікроба вони можуть надавати йому нові ознаки.
   Таким чином, плазміди убіквітарні. Вони не мають вирішального значення для забезпечення існування бактерійних клітин, однак відіграють чи не найважливішу роль у створенні розмаїття генетичного матеріалу при природному відборі.

 

Мінливість мікроорганізмів

    Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представники мікробного царства.

   Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.
   Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

   Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу, зміну морфології холерного вібріона в результаті дії гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати свою клітинну стінку, перетворюючись у L-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду.

   Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.

   При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.
   Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутаційний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послідовність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

 
   Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проявом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група – це мутації стійкості. Після них мікроорганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентрації речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність до антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

 
   За своїм походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 10⁵-10¹² без втручання експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів. Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх факторів.

   Індуковані мутації виникають під впливом дії на клітину встановлених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища, ніж спонтанних.

   За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості – плазмідах; за кількістю генів, які мутували, – на генні та хромосомні, за величиною – на великі (хромосомні) та малі (точкові).

   Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки ДНК).

   Точкові мутації частіше спостерігаються як делеція, вставка фрагменту ДНК (інсерція) або заміна основ. Якщо спостерігають заміну пуринових основ на пуринові, а піримідинових на піримідинові, таку мутацію називають транзицією. За умови заміни пуринової основи на піримідинову і навпаки, мутація називається трансверсією.
   Будь-яка мутація, що змінює генотип дикого штаму, називається прямою мутацією. Якщо внаслідок мутації відновлюється вихідний генотип дикого штаму, вона називається зворотньою. Однак, коли відновлюється фенотип дикого штаму, але мутація відбувається в локусі, не зачепленому прямою мутацією, такий тип змін одержав назву супресорної мутації. Вона може бути внутрішньогенною та позагенною. Плейотропними називають такі мутації, які ведуть до зміни двох і більше ознак.

Мутації є ще таких видів:

    1. Пряма мутація

    2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія

    3. Супресорна мутація (внутріш-ньогення, позагенна). Веде до відновлення фенотипу а не генотипу.

    4. Плейотропна мутація (зміна 2-ох і більше властивостей клітини)

    5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)   

   Збільшувати частоту мутаційного процесу можуть особливі фактори, які називають мутагенами. Найдоступніший мутаген – ультрафіолетове випромінювання з довжиною хвилі 2600 А°. Воно викликає особливі пошкодження – утворення димерів тиміну та заміну основ. Іонізуюче опромінення (рентгенівські промені, γ-промені) також спричиняє мутації різної природи. Велику групу складають хімічні мутагени. Найбезпечніший з них – азотиста кислота, яка дезамінує аденін. N-нітрозометилсечовина є супермутагеном й канцерогеном, здатним викликати різні типи мутацій. Не поступаються їй за своєю активністю нітрозогуанідин, етилметансульфонат. Високу мутагенну активність мають акридини, аналоги основ (5-бромурацил), які включаються до складу ДНК між основами, викликаючи зсув рамки зчитування. До біологічних мутагенів належить перекис водню, що утворюється при метаболізмі всередині клітин, лікарські препарати, такі як нітрофурани, деякі антибіотики (мітоміцин С).   

 

Класифікація мутагенів

    Фізичні:

    1. УФО (λ-2600 А) – найсильніша мутагенна дія; утворюються димери тиміну, заміна основ

    2. Іонізуюче опромінення (рентгенівське, гамма-промені)

    Хімічні:

     1. Азотиста кислота (самий доступний і безпечний)

     2. N-нітрозометилсечовина – супермутаген, канцероген

     3. Етилметансульфонат

     4. Акридини

     5. Нітрозогуанідин

     6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин)

     7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики

    Біологічні: перекис водню віруси, фаги

Дія різних мутагенів на бактерії

Своєрідною формою генотипної мінливості бактерій є явище дисоціації. Його можна спостерігати при культивуванні мікроорганізмів на щільних живильних середовищах. Ізольовані колонії мікроорганізмів певного виду утворюють на поверхні середовища колонії двох типів – S-форми (smooth – гладенький) і R-форми (rough – шорсткий). Колонії першого типу – гладенькі, блискучі, з рівними краями. Колонії R-типу, навпаки, мутні, шорсткі, з нерівним зазубреним краєм. Виявилось, що деякі властивості мікроорганізмів, незважаючи на те, що вони належать до одного й того ж виду, також відрізняються. Так, клітини S-форми колоній, нормальної морфології, викликають дифузне помутніння бульйону, біохімічно вони більш активні, повноцінні в антигенному відношенні, більш вірулентні, їх виділяють, як правило, в гострому періоді захворювання. Збудники чутливі до бактеріофагів і стійкі до фагоцитів, бактрицидної дії сироватки крові.
   Мікроорганізми, що утворюють R-форми колоній, мають слабшу біохімічну активність, менш чутливі до дії бактеріофагів і мають менш виражені вірулентні властивості. Винятком є збудники туберкульозу, сибірки, чуми.
   Дослідження довели, що такі зміни відбуваються внаслідок мутацій у генах, що детермінують синтез окремих компонентів мембран бактерій.

   Вважається, що дисоціація надає мікробам певних селективних переваг при існуванні в організмі хазяїна, і в той же час вона утруднює діагностику інфекційних хвороб, насамперед, дизентерії та ешерихіозів.

R і S форми колоній

 

Властивості мікробів S-колоній

    Клітини нормальної морфології

    Дифузне помутніння бульйону

    У рухомих видів є джгутики

    У капсульних варіантів є капсули

    Біохімічно більш активні

    Повноцінні в антигенному відношенні

    У патогенних видів – вірулентні

    Виділяються в гострому періоді хвороби

    Чутливі   до бактеріофагів

    Менш чутливі до фагоцитозу

Однак протягом своєї еволюції бактерійні клітини виробили певні механізми, що забезпечують стабільність генетичного коду, оберігають його від мутацій або ліквідують їх негативні наслідки. Вони називаються репараціями. Репаративні процеси поширені у мікробів і контролюються за допомогою спеціальних генів.
   Виділяють види репарацій: фотореактивація, темнова та SOS–реактивація.

Фотореактивація захищає клітину від негативної дії ультрафіолетової радіації, яка викликає утворення тимінових димерів. На сонячному світлі (λ – 300-400 нм) утворюються особливі ферменти, які руйнують зв’язки між піримідиновими димерами.

Феномен темнової репарації складніший за попередній. Його сутність полягає в тому, що особливі ферменти знаходять мутовану ділянку ДНК і вирізають її. За допомогою ДНК-залежної ДНК-полімерази комплементарно відновлюється вихідна структура молекули, і ферменти лігази зшивають її з материнською ниткою.

Для одержання мутантів розроблено методи, засновані на виявленні різниці в швидкості росту бактерій, різної здатності їх до виживання тощо.

SOS-реактивація

    При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК

 

Методи виявлення мутантів

    За різницею в швидкості росту (посів на мінімальне середовище; Мутанти виростають)

    Різна здатність до виживання

    Метод реплік Ледерберг

 

Найчастіше використовують метод реплік Ледербергів. Для цього чисту культуру бактерій, на яку діяв мутагенний фактор, засівають на повноцінне щільне живильне середовище з розрахунку, щоб виросло 100-200 ізольованих колоній. Після цього за допомогою штампа-реплікатора, вкритого оксамитом, діаметром дещо меншим за чашку Петрі колонії переносять на мінімальне живильне середовище.

Метод реплік для виявлення ауксотрофних мутантів

На ньому виростають тільки колонії прототрофних організмів. Порівнюючи їх розташування з вихідною материнською чашкою, знаходять колонії, утворені бактеріями-мутантами. Їх відсівають на живильні середовища для одержання чистої культури і вивчають морфологічні, культуральні, антигенні, біохімічні, біологічні та інші властивості.

 
   

 

Генетичні рекомбінації

    Рекомбінації – особливі феномени спадкової мінливості мікроорганізмів, які не пов’язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох “батьківських” клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне джерело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими rec-генами (recombination – рекомбінація).

 
   Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансформація, трансдукція та кон’югація.

 
   Трансформація – процес гібридизації внаслідок переносу генетичних детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

   Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 р., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утворюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів ІІІ типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами ІІ типу (R-форма) лабораторна тварина через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи ІІ серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова генетичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу.

 

Дослід Ф. Гриффітса

 

 

 

Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака передавалась спадково.

 
   У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компетентності, природа якої остаточно не з’ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка – компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клітинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.
   Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Згодом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлюється ендонуклеазами, а інша – вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу – експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п’яти-десятихвилинного контакту клітини-реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год.

 

 

 

 

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.

 
   Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів – представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одержання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.
   При кон’югації внаслідок фізичного контакту між бактеріями-донорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача генетичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-пілі.

Вперше це явище дослідили Д. Ледерберг та E. Тейтум на моделі кишкової палички (1946). Необхідною умовою для процесу кон’югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility – плодючість). Він є кон’югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів переносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-факторами позначаються як F⁺-, а без нього – F^–– клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон’югації. Статеві ворсинки – особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує величину бактерії.

   Процес кон’югації починається з того, що за допомогою статевих ворсинок клітина-донор торкається клітини-реципієнта, фіксує її та притягує до себе. Після цього плазміда починає реплікуватись, і одна її нитка передається в реципієнтний штам, а інша залишається на місті. Відбувається комплементарний синтез іншої нитки ДНК. Таким чином, F⁺-фактор мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала кон’югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже, може сама вступати в кон’югацію. Частота цього процесу – 10^-6-10^-8. В деяких випадках F-плазміда здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон’югацію з досить високою частотою – 10^-1-10^-4. Такий штам називають штамом Hfr (high frequency of recombination – висока частота рекомбінацій). На відміну від F+-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон’югацію з F–штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 510⁴ пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора.
   Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор називається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

    Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різноманітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон’югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування. 

_­­­_­­

   Явище кон’югації досліджено для багатьох представників мікробного царства – кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших. Встановлено, що процес кон’югації може відбуватись не тільки в межах одного виду, але й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує на увагу факт передачі за допомогою кон’югації фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.
   Трансдукція. У 1952 р. Н. Ціндер і Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон’югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон’югації, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бактеріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу фагами фрагментів ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта одержало назву трансдукції.
   Вона часто відбувається в ентеробактерій, псевдомонад, стафілококів та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі профаг, тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищем у мікробному світі.
   Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та абортивну.

 

   Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприклад, фаг λ E. coli має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag i bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag i bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна. Бактеріофаг φ 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.

   Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприйнятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.
   Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

 
   Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

   Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набувають токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

 
   При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

 
   Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репродукції віріонів.

 
   Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також феномени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кроликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок курчат – штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви численних генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivо, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

 

 

Практичне значення генетики бактерій (Video–Бioтехнологiя)

   

Генетичні феномени знайшли широке практичне застосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біотехнології, сільського господарства.
   Завдяки застосуванню генетичних методів, одержано високоактивні штами бактерій, грибів, актиноміцетів, дріжджів, які продукували у 200-1000 разів і більше амінокислот, органічних кислот, ферментів, вітамінів, кормового білка, порівняно з вихідними, а також вакцинні штами мікроорганізмів та вірусів. Використання різноманітних мутагенів (ультрафіолетове та радіоактивне опромінення, хімічні речовини) дозволило створити мутантний штам гриба Penicillium chryzogenum, який у дикому стані продукував 100 од/мл пеніциліну, а після направленої селекції – 10000 од/мл

.
   Встановлено, що деякі мікроорганізми, наприклад, Fuzarium monilifore, синтезують біологічно активні субстанції типу фітогормонів, гіберелінів, біоінсектицидів та інших, які є ефективними стимуляторами росту й розвитку вищих рослин. Генетичні підходи дозволили проводити цілеспрямований селекційний процес для одержання продуцентів цих речовин

.
   Суттєвий вклад вносить генетика у зменшення забруднення довкілля: очистка стічних вод, переробка відходів і побічних продуктів сільськогосподарського виробництва та промисловості, запропонувавши спеціально селекціоновані з цією метою мікроорганізми.

   Стрімкий розвиток біологічної науки яскраво проявився у становленні генної та клітинної інженерії – сукупності експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени від одного організму до іншого. Вона народилась у 1972 р., коли американським дослідникам П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коену вдалось одержати гібрид вірусу мавпи SV-40 і бактеріофага λ.

    Ще донедавна можливість конструювання живих організмів із заданими властивостями здавалась недосяжною. Для здійснення цього фантастичного експерименту необхідно одержати відповідний ген, приєднати його до спеціального вектора – провідника, щоб не бути знищеним клітинними ферментами, ввести в іншу клітину і заставити там працювати. Для всіх цих операцій необхідна участь спеціальних ферментів (їх відомо вже декілька сотен), які здатні розрізати донорську ДНК і ДНК вектора в певних ділянках на окремі фрагменти. Інші ферменти необхідні для приєднання відповідних генів до ДНК. Для розшифровування будови генів використовують методи біохімічного синтезу за участю ферментів ревертаз. Як вектори використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги, деякі віруси. Вони здатні реплікуватись у клітині-реципієнті і містять один або декілька маркерів, що дозволяють розпізнавати рекомбінантні клітини.

 

 

Про високу ефективність генно-інженерних методів одержання хімічно чистих біологічно активних речовин свідчить такий факт. Щоб одержати 5 мг соматотропіну, було використано мозок 500 000 овець протягом 5 років, в той час як аналогічну кількість гормону дають 9 л бульйонної суспензії кишкової палички.

   Генна інженерія надала можливість одержати інсулін, простагландини, енкефаліни, інтерферон, інтерлейкіни, гормони, різноманітні ферменти, численні хімічно чисті вуглеводи – глюкозу, ксиліт тощо.

Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами

   Медична наука стоїть на порозі розробки методів генної хірургії. Наприклад, у людини деколи зустрічається вроджена недостатність ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). У такому випадку вона схильна до подагри, часто спостерігається біль у суглобах, розвивається нирково-кам’яна хвороба. Експерименти на тваринах переконливо довели, якщо вмонтувати ген, відповідальний за синтез цього ферменту, в ретровірус і ввести його у спинний мозок білих мишей, вони починають синтезувати ГГФРТ. Клонований з макрофагів людини ген фактору некрозу пухлин у кишковій паличці при введенні її білим мишам із саркомами викликає їх руйнування.
   Широкі перспективи відкриває генна інженерія на шляху створення високоефективних засобів специфічної профілактики інфекційних захворювань. Введення в геном кишкових паличок, вірусів вісповакцини, дріжджів деяких генів вірусів гепатиту В, ящура дозволили розробити субодиничні вакцини.

 

СФЕРИ ВИКОРИСТАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Таким чином, мікробіологічна наука дозволяє створити струнку систему взаємопов’язаних галузей біотехнології, які мають унікальну перевагу – вони засновані на функціонуванні природних систем, які підпорядковуються інтересам людини.

 

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ

    Способи збільшення інформації:

    – дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів

    – зсув рамки трансляції

    – сплайсинг  (вирізання інтронів)

    – транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

 

У вірусів можуть бути:

    Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин)

    Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах

    Рекомбінації

 

ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ

               1. Рекомбінація: Обмін генами (міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)

Схрещування близьких за властивостями вірусів при одночасному культивуванні.

Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена  чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і  вірусу вісповакцини

               2. Множинна реактивація: вірусна інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси

               3.  Пересортування генів:  між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.

 

               4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.

               Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл

               5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.

Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.

               6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)

 

 

ВИДИ НЕГЕНЕТИЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

    1. Фенотипове змішування

    2. Негенетична реактивація

    3. Комплементація

    4. Стимуляція

    5. Інтерференція

 

 

  Фільм “Біотехнологія”

 

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/video/med_bio/index.php?name_film=biot

 

 

 

Мінливість мікроорганізмів

    Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представники мікробного царства.

   Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.
   Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

   Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу, зміну морфології холерного вібріона в результаті дії гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати свою клітинну стінку, перетворюючись у L-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду.

   Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.

   При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.    Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутаційний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послідовність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

 
   Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проявом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група – це мутації стійкості. Після них мікроорганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентрації речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність до антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

 
   За своїм походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 10⁵-10¹² без втручання експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів. Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх факторів.

   Індуковані мутації виникають під впливом дії на клітину встановлених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища, ніж спонтанних.

   За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості – плазмідах; за кількістю генів, які мутували, – на генні та хромосомні, за величиною – на великі (хромосомні) та малі (точкові).

   Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки ДНК).

   Точкові мутації частіше спостерігаються як делеція, вставка фрагменту ДНК (інсерція) або заміна основ. Якщо спостерігають заміну пуринових основ на пуринові, а піримідинових на піримідинові, таку мутацію називають транзицією. За умови заміни пуринової основи на піримідинову і навпаки, мутація називається трансверсією.
   Будь-яка мутація, що змінює генотип дикого штаму, називається прямою мутацією. Якщо внаслідок мутації відновлюється вихідний генотип дикого штаму, вона називається зворотньою. Однак, коли відновлюється фенотип дикого штаму, але мутація відбувається в локусі, не зачепленому прямою мутацією, такий тип змін одержав назву супресорної мутації. Вона може бути внутрішньогенною та позагенною. Плейотропними називають такі мутації, які ведуть до зміни двох і більше ознак.

Мутації є ще таких видів:

    1. Пряма мутація

    2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія

    3. Супресорна мутація (внутріш-ньогення, позагенна). Веде до відновлення фенотипу а не генотипу.

    4. Плейотропна мутація (зміна 2-ох і більше властивостей клітини)

    5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)   

   Збільшувати частоту мутаційного процесу можуть особливі фактори, які називають мутагенами. Найдоступніший мутаген – ультрафіолетове випромінювання з довжиною хвилі 2600 А°. Воно викликає особливі пошкодження – утворення димерів тиміну та заміну основ. Іонізуюче опромінення (рентгенівські промені, γ-промені) також спричиняє мутації різної природи. Велику групу складають хімічні мутагени. Найбезпечніший з них – азотиста кислота, яка дезамінує аденін. N-нітрозометилсечовина є супермутагеном й канцерогеном, здатним викликати різні типи мутацій. Не поступаються їй за своєю активністю нітрозогуанідин, етилметансульфонат. Високу мутагенну активність мають акридини, аналоги основ (5-бромурацил), які включаються до складу ДНК між основами, викликаючи зсув рамки зчитування. До біологічних мутагенів належить перекис водню, що утворюється при метаболізмі всередині клітин, лікарські препарати, такі як нітрофурани, деякі антибіотики (мітоміцин С).   

 

Класифікація мутагенів

    Фізичні:

    1. УФО (λ-2600 А) – найсильніша мутагенна дія; утворюються димери тиміну, заміна основ

    2. Іонізуюче опромінення (рентгенівське, гамма-промені)

    Хімічні:

     1. Азотиста кислота (самий доступний і безпечний)

     2. N-нітрозометилсечовина – супермутаген, канцероген

     3. Етилметансульфонат

     4. Акридини

     5. Нітрозогуанідин

     6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин)

     7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики

    Біологічні: перекис водню віруси, фаги

Дія різних мутагенів на бактерії

Своєрідною формою генотипної мінливості бактерій є явище дисоціації. Його можна спостерігати при культивуванні мікроорганізмів на щільних живильних середовищах. Ізольовані колонії мікроорганізмів певного виду утворюють на поверхні середовища колонії двох типів – S-форми (smooth – гладенький) і R-форми (rough – шорсткий). Колонії першого типу – гладенькі, блискучі, з рівними краями. Колонії R-типу, навпаки, мутні, шорсткі, з нерівним зазубреним краєм. Виявилось, що деякі властивості мікроорганізмів, незважаючи на те, що вони належать до одного й того ж виду, також відрізняються. Так, клітини S-форми колоній, нормальної морфології, викликають дифузне помутніння бульйону, біохімічно вони більш активні, повноцінні в антигенному відношенні, більш вірулентні, їх виділяють, як правило, в гострому періоді захворювання. Збудники чутливі до бактеріофагів і стійкі до фагоцитів, бактрицидної дії сироватки крові.
   Мікроорганізми, що утворюють R-форми колоній, мають слабшу біохімічну активність, менш чутливі до дії бактеріофагів і мають менш виражені вірулентні властивості. Винятком є збудники туберкульозу, сибірки, чуми.
   Дослідження довели, що такі зміни відбуваються внаслідок мутацій у генах, що детермінують синтез окремих компонентів мембран бактерій.

   Вважається, що дисоціація надає мікробам певних селективних переваг при існуванні в організмі хазяїна, і в той же час вона утруднює діагностику інфекційних хвороб, насамперед, дизентерії та ешерихіозів.

R і S форми колоній

Властивості мікробів S-колоній

    Клітини нормальної морфології

    Дифузне помутніння бульйону

    У рухомих видів є джгутики

    У капсульних варіантів є капсули

    Біохімічно більш активні

    Повноцінні в антигенному відношенні

    У патогенних видів – вірулентні

    Виділяються в гострому періоді хвороби

    Чутливі   до бактеріофагів

    Менш чутливі до фагоцитозу

Однак протягом своєї еволюції бактерійні клітини виробили певні механізми, що забезпечують стабільність генетичного коду, оберігають його від мутацій або ліквідують їх негативні наслідки. Вони називаються репараціями. Репаративні процеси поширені у мікробів і контролюються за допомогою спеціальних генів.

Феномен темнової репарації складніший за попередній. Його сутність полягає в тому, що особливі ферменти знаходять мутовану ділянку ДНК і вирізають її. За допомогою ДНК-залежної ДНК-полімерази комплементарно відновлюється вихідна структура молекули, і ферменти лігази зшивають її з материнською ниткою.

Для одержання мутантів розроблено методи, засновані на виявленні різниці в швидкості росту бактерій, різної здатності їх до виживання тощо.

SOS-реактивація

    При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК

 

Методи виявлення мутантів

    За різницею в швидкості росту (посів на мінімальне середовище; Мутанти виростають)

    Різна здатність до виживання

    Метод реплік Ледерберг

 Найчастіше використовують метод реплік Ледербергів. Для цього чисту культуру бактерій, на яку діяв мутагенний фактор, засівають на повноцінне щільне живильне середовище з розрахунку, щоб виросло 100-200 ізольованих колоній. Після цього за допомогою штампа-реплікатора, вкритого оксамитом, діаметром дещо меншим за чашку Петрі колонії переносять на мінімальне живильне середовище.

 

Метод реплік для виявлення ауксотрофних мутантів

На ньому виростають тільки колонії прототрофних організмів. Порівнюючи їх розташування з вихідною материнською чашкою, знаходять колонії, утворені бактеріями-мутантами. Їх відсівають на живильні середовища для одержання чистої культури і вивчають морфологічні, культуральні, антигенні, біохімічні, біологічні та інші властивості.

Генетичні рекомбінації

    Рекомбінації – особливі феномени спадкової мінливості мікроорганізмів, які не пов’язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох “батьківських” клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне джерело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими rec-генами (recombination – рекомбінація).

 
   Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансформація, трансдукція та кон’югація.

 
   Трансформація – процес гібридизації внаслідок переносу генетичних детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

   Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 р., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утворюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів ІІІ типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами ІІ типу (R-форма) лабораторна тварина через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи ІІ серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова генетичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу.

Дослід Ф. Гриффітс

Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака передавалась спадково.

 
   У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компетентності, природа якої остаточно не з’ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка – компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клітинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.
   Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Згодом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлюється ендонуклеазами, а інша – вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу – експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п’яти-десятихвилинного контакту клітини-реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год.

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.

 
   Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів – представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одержання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.
   При кон’югації внаслідок фізичного контакту між бактеріями-донорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача генетичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-пілі.

Вперше це явище дослідили Д. Ледерберг та E. Тейтум на моделі кишкової палички (1946). Необхідною умовою для процесу кон’югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility – плодючість). Він є кон’югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів переносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-факторами позначаються як F⁺-, а без нього – F^–– клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон’югації. Статеві ворсинки – особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує величину бактерії.

   Процес кон’югації починається з того, що за допомогою статевих ворсинок клітина-донор торкається клітини-реципієнта, фіксує її та притягує до себе. Після цього плазміда починає реплікуватись, і одна її нитка передається в реципієнтний штам, а інша залишається на місті. Відбувається комплементарний синтез іншої нитки ДНК. Таким чином, F⁺-фактор мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала кон’югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже, може сама вступати в кон’югацію. Частота цього процесу – 10^-6-10^-8. В деяких випадках F-плазміда здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон’югацію з досить високою частотою – 10^-1-10^-4. Такий штам називають штамом Hfr (high frequency of recombination – висока частота рекомбінацій). На відміну від F+-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон’югацію з F–штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 510⁴ пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора.    Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор називається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

 

    Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різноманітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон’югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування. 

 

   Явище кон’югації досліджено для багатьох представників мікробного царства – кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших. Встановлено, що процес кон’югації може відбуватись не тільки в межах одного виду, але й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує на увагу факт передачі за допомогою кон’югації фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.
   Трансдукція. У 1952 р. Н. Ціндер і Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон’югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон’югації, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бактеріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу фагами фрагментів ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта одержало назву трансдукції.
   Вона часто відбувається в ентеробактерій, псевдомонад, стафілококів та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі профаг, тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищем у мікробному світі.
   Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та абортивну.

 
   Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприклад, фаг λ E. coli має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag i bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag i bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна. Бактеріофаг φ 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.

   Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприйнятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.
   Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

 
   Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

   Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набувають токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

 
   При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

 
   Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репродукції віріонів.

 
   Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також феномени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кроликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок курчат – штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви численних генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivо, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

 

Практичне значення генетики бактерій (Video–Бioтехнологiя)

   

Генетичні феномени знайшли широке практичне застосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біотехнології, сільського господарства.    Завдяки застосуванню генетичних методів, одержано високоактивні штами бактерій, грибів, актиноміцетів, дріжджів, які продукували у 200-1000 разів і більше амінокислот, органічних кислот, ферментів, вітамінів, кормового білка, порівняно з вихідними, а також вакцинні штами мікроорганізмів та вірусів. Використання різноманітних мутагенів (ультрафіолетове та радіоактивне опромінення, хімічні речовини) дозволило створити мутантний штам гриба Penicillium chryzogenum, який у дикому стані продукував 100 од/мл пеніциліну, а після направленої селекції – 10000 од/мл

.
   Встановлено, що деякі мікроорганізми, наприклад, Fuzarium monilifore, синтезують біологічно активні субстанції типу фітогормонів, гіберелінів, біоінсектицидів та інших, які є ефективними стимуляторами росту й розвитку вищих рослин. Генетичні підходи дозволили проводити цілеспрямований селекційний процес для одержання продуцентів цих речовин

.
   Суттєвий вклад вносить генетика у зменшення забруднення довкілля: очистка стічних вод, переробка відходів і побічних продуктів сільськогосподарського виробництва та промисловості, запропонувавши спеціально селекціоновані з цією метою мікроорганізми.

   Стрімкий розвиток біологічної науки яскраво проявився у становленні генної та клітинної інженерії – сукупності експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени від одного організму до іншого. Вона народилась у 1972 р., коли американським дослідникам П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коену вдалось одержати гібрид вірусу мавпи SV-40 і бактеріофага λ.

    Ще донедавна можливість конструювання живих організмів із заданими властивостями здавалась недосяжною. Для здійснення цього фантастичного експерименту необхідно одержати відповідний ген, приєднати його до спеціального вектора – провідника, щоб не бути знищеним клітинними ферментами, ввести в іншу клітину і заставити там працювати. Для всіх цих операцій необхідна участь спеціальних ферментів (їх відомо вже декілька сотен), які здатні розрізати донорську ДНК і ДНК вектора в певних ділянках на окремі фрагменти. Інші ферменти необхідні для приєднання відповідних генів до ДНК. Для розшифровування будови генів використовують методи біохімічного синтезу за участю ферментів ревертаз. Як вектори використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги, деякі віруси. Вони здатні реплікуватись у клітині-реципієнті і містять один або декілька маркерів, що дозволяють розпізнавати рекомбінантні клітини.

Про високу ефективність генно-інженерних методів одержання хімічно чистих біологічно активних речовин свідчить такий факт. Щоб одержати 5 мг соматотропіну, було використано мозок 500 000 овець протягом 5 років, в той час як аналогічну кількість гормону дають 9 л бульйонної суспензії кишкової палички.

   Генна інженерія надала можливість одержати інсулін, простагландини, енкефаліни, інтерферон, інтерлейкіни, гормони, різноманітні ферменти, численні хімічно чисті вуглеводи – глюкозу, ксиліт тощо.

Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами

   Медична наука стоїть на порозі розробки методів генної хірургії. Наприклад, у людини деколи зустрічається вроджена недостатність ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). У такому випадку вона схильна до подагри, часто спостерігається біль у суглобах, розвивається нирково-кам’яна хвороба. Експерименти на тваринах переконливо довели, якщо вмонтувати ген, відповідальний за синтез цього ферменту, в ретровірус і ввести його у спинний мозок білих мишей, вони починають синтезувати ГГФРТ. Клонований з макрофагів людини ген фактору некрозу пухлин у кишковій паличці при введенні її білим мишам із саркомами викликає їх руйнування.
   Широкі перспективи відкриває генна інженерія на шляху створення високоефективних засобів специфічної профілактики інфекційних захворювань. Введення в геном кишкових паличок, вірусів вісповакцини, дріжджів деяких генів вірусів гепатиту В, ящура дозволили розробити субодиничні вакцини.

 

СФЕРИ ВИКОРИСТАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ

 

Таким чином, мікробіологічна наука дозволяє створити струнку систему взаємопов’язаних галузей біотехнології, які мають унікальну перевагу – вони засновані на функціонуванні природних систем, які підпорядковуються інтересам людини.

 

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ

    Способи збільшення інформації:

    – дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів

    – зсув рамки трансляції

    – сплайсинг  (вирізання інтронів)

    – транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

 

У вірусів можуть бути:

    Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин)

    Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах

    Рекомбінації

 

ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ

               1. Рекомбінація: Обмін генами (міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)

Схрещування близьких за властивостями вірусів при одночасному культивуванні.

Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена  чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і  вірусу вісповакцини

               2. Множинна реактивація: вірусна інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси

               3.  Пересортування генів:  між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.

 

               4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.

               Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл

               5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.

Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.

               6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)

 

 

ВИДИ НЕГЕНЕТИЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

    1. Фенотипове змішування

    2. Негенетична реактивація

    3. Комплементація

    4. Стимуляція

    5. Інтерференція

 

Генетика — наука про спадковість і мінливість усіх живих істот, її основи були закладені відкриттями, зробленими Г.Менделем у 1866 р.Процеси спадковості й мінливості широко вивчаються у світі мікробів, оскільки мікроорганізми є найзручнішим об’єктом для генетичних досліджень, бо за короткий час утворюють велику кількість генерацій.

 

Вивчення генетики бактерій та інших мікроорганізмів має дуже важливе як теоретичне, так і практичне значення для спрямованої селекції високопродуктивних штамів, які останнім часом почали широко застосовуватися в різних галузях народного господарства. Використання в селекції мікроорганізмів методів природного добору, індукованого мутагенезу, популяційної мінливості, клонування, гібридизації соматичних клітин тощо дало можливість одержати високопродуктивні штами мікроорганізмів.  Останні знайшли широке застосування в мікробіологічній промисловості для виробництва кормового білка, амінокислот, ферментів, вітамінів, антибіотиків, бактеріальних добрив, засобів захисту рослин, анатоксинів, лікувально-профілактичних препаратів — вакцин, інтерферонів, гормонів, інтер-лейкінів та ін. Наприклад, з індукованих мутантів із наступною селекцією їх було одержано штам  — продуценти амінокислот, продуктивність яких у 100 разів вища від такої у вихідних штамів. Продуцент лізину дає в 300-400 разів більший вихід цієї незамінної амінокислоти, ніж природний штам.  

2. Способи і напрямки застосування досягнень генетики Багатонадійні перспективи для сільського господарства, біології та медицини й інших галузей народного господарства відкриваються у зв’язку з розробкою і вдосконаленням методів генної і клітинної інженерії, за допомогою яких експериментальне доведена можливість передачі не тільки

природних генів, а й штучно синтезованих, які кодують синтез різноманітних біологічно активних сполук. Наприклад, ще в перших дослідах з генної інженерії, проведених у 1973 p., було введено за допомогою фага в геном Е.соїі ген LIG, який контролює синтез лігази. Внаслідок цього вміст лігази в кліти-нах-реципієнтах збільшився в 500 разів. Тепер у клітини кишкової палички клоновані і функціонують гени інтерферонів, гормону росту, інсуліну та ін. За допомогою клонованих штамів Е.соїі одержують препарати інтерферону, інсуліну і соматотропіну.  

Є також дані про те, що успішно функціонують клоновані у бактерії гени вірусів грипу, гепатиту В, герпесу, ген білка оболонки віру-  

су ящуру, що в найближчий час дозволить розробити технологію виробництва молекулярних вакцин без баластних білків. тенсивно вивчаються методи трансплантації генів за допомогою плазмід, які ще часто називають «генною інженерією в природі». Вони відіграють велику роль у передачі генетичного матеріалу між бактеріями, які належать навіть до віддалених філогенетичних груп. Плазміди є фактично каналом генетичної комунікації в бактеріальному світі. Наприклад, методами генної інженерії було зроблено пересадку гена nif з азотфіксуючої бактерії в неазотфік-суючу, і остання набула властивості фіксувати молекулярний азот. Тепер ведуться роботи з перенесення генів від бактерій до клітин вищих рослин.

 

В лабораторних умовах одержано рекомбінантні плазміди, які містять гени двох різних бактерій, бактерій і вірусів, бактерій і рослин, бактерій і тварин, бактерій і людини. Дуже важливим є те, що такі рекомбінантні плазміди, інтродуковані в бактеріальні клітини, дали експресію.  

Особливої ваги набувають нині методи одержання енергії та переробки

відходів промисловості і сільського господарства з метою одержання цінних біопродуктів і захисту біосфери від забруднення за допомогою  мікроорганізмів. Мікробіологічна наука і мікробіологічна індустрія можуть зробити помітний внесок у розв’язання енергетичних проблем, які пов’язані зі значним зменшенням запасів нафти і вугілля на нашій планеті.

 

Відомо, що поверхня Землі щорічно отримує таку кількість сонячної енергії, яка в тисячі разів перевищує рівень виробленої у світі енергії з паливних ресурсів, що видобуваються. Сучасне вирощування рослин

використовує фотосинтез із ККД запасання фотосинтетичне активної радіації (ФАР) в урожаї на рівні 0,1—0,5 %. У XXI ст. інтенсифікація рослинництва має забезпечити ККД агрофітоценозів приблизно до 3—5 % ФАР.

Мікроорганізми здатні трансформувати сонячну енергію в хімічну з ККД до 15-18 %, що свідчить про набагато вищу ефективність цього процесу в мікроорганізмів порівняно з вищими рослинами.  

У США, Німеччині, Індії, КНР, Англії та в інших країнах здійснюється мікробіологічна переробка гною і різних побутових та сільськогосподарських відходів на біогаз. Це відбувається шляхом метанового бродіння в анаеробних умовах. У спеціальних газових установках метаноутворюючі бактерії перетворюють до 95 % вуглецю органічного субстрату на метан. Одержуваний на очисних спорудах біогаз в Англії використовують для освітлення вулиць уже протягом десятків років. У США біля 2 % енергії одержують внаслідок переробки міських відходів на

біогаз.

 

Останніми роками проводяться також інтенсивні дослідження з розробки мікробіологічних методів одержання рідких нафтоподібних продуктів — рідких вуглеводнів і гліцеролів із біомаси мікроскопічних водоростей.

Виявлено понад 100 видів фототрофних мікроорганізмів, які мають здатність утворювати водень внаслідок розщеплення води, а як вважають, водень є найперспективнішим екологічно чистим паливом майбутнього.

3. Біоклітинні технології на службі у людини  

Не применшуючи значення класичної селекції та генної інженерії, необхідно зазначити, що сьогодні народжується принципово новий перспективний напрямок повністю безклітинної біотехнології — використання в біотехнологічних процесах не живих клітин, а заміна їх біореакторами, в яких вибірковий синтез будь-яких заданих продуктів здійснюється за допомогою безклітинних систем, які містять лише необхідний набір очищених клітинних компонентів.

 

Розшифрування геному людини поки що взагалі важко оцінити. Цю подію прирівнюють до розщеплення атомного ядра або польоту в Космос. Відкриваються перспективи вирощування органів для трансплантації, клонування тварин і людини, створення принципово нових транс генних організмів, розробки методів боротьби з хворобами, які раніше вважалися невиліковними.

 Людина використовував бактерії, не знаючи про їхнє існування. З допомогою заквасок, містять Бактерії, готували кисломолочні продукти, оцет, тісто тощо. Вперше бактерії побачив А. Левенгук — творець мікроскопа, досліджуючи рослинні настої і зубноїналет. Наприкінці 19 — початку 20 ст. виділили велика кількість бактерій, які у грунті, воді, харчові продукти тощо., було відкрито багатьох видів хвороботворних бактерій. Класичні дослідження Л. Пастера у сфері фізіології бактерії послужили підвалинами вивчення вони обміну речовин. Внесок у дослідження бактерії внесли росіяни й радянські вчені С.Виноградский, В.Л.Омелянский, Л. Ісаченка,вияснившие роль бактерії в круговерті речовин, у природі, що робить можливої життя в Землі. Цей напрям у мікробіології нерозривно пов'язане з розвитком геології, біогеохімії, ґрунтознавства, з вченням В.І. Вернадського про біосфері. 

Фізіологія мікроорганізмів вивчає життєдіяльність мікробних клітин, процеси їхнього живлення, дихання, зростання, розмноження, закономірності взаємодії з довкіллям.

Генетика (від грецькогоgenesis – походження) – наука про спадковість і мінливості організмів. Початок генетики як науки поклав Мендель, який, схрещуючи між собою сорти гороху з якісноразличающимися ознаками, встановив головні закономірності спадковості. Вивчення і аналіз законів передачі спадкових ознак від покоління до покоління, і навіть з'ясування механізмів, які забезпечують наслідування всіх рівнях організації живих істот, є головним метою генетики. Успіхи генетики відбуваються завдяки спільну роботу мікробіологів, генетиків, хіміків і фізиків, котрі у своїх дослідженнях використовували мікроорганізми. Саме бактерії і віруси виявилися найбільш простий та зручною моделлю на вирішення нагальних потреб молекулярної генетики.

 

Мікроорганізми служать улюбленими об’єктами для вирішення спільних питань генетики, біохімії, біофізики, космічної біології та ін Культури бактерій застосовуються для кількісного визначення амінокислот, вітамінів, антибіотиків. Родючість грунтів в значній мірі пов’язано з життєдіяльністю бактерії, минерализующих рослинні і тваринні залишки з утворенням сполук, засвоюваних с.-г. рослинами. Разом з тим, синтезуючи жива речовина клітин, бактерії накопичують велику кількість органічних сполук у грунті. У верхніх шарах окультуреної грунту на площі в 1 га міститься кілька тонн бактеріальних клітин. Що живуть у грунті азотфіксуючі бактерії збагачують грунт азотом. Виключно велика роль бульбочкових бактерій, які фіксують газоподібний азот. Зараження насіння бобових рослин нитрагином – препаратом, що містить клітини бульбочкових бактерій, підвищує урожай рослин і накопичення азоту в грунті. За допомогою бактерій, зброджують пектинові речовини, здійснюють мочку льону, коноплі, кенафу та інших луб’яних культур. Різні види бактерії застосовують при отриманні з молока кисломолочних продуктів, масла та сиру.

Використання досягнень генетики бактерій на практиці

Вивчення генетики бактерій та інших мікроорганізмів має дуже важливе як теоретичне, так і практичне значення для спрямованої селекції високопродуктивних штамів, які останнім часом почали широко застосовуватися в різних галузях народного господарства. Використання в селекції мікроорганізмів методів природного добору, індуко­ваного мутагенезу, популяційної мінливості, клонування, гібридизації соматичних клітин тощо дало можливість одержати високопродук­тивні штами мікроорганізмів. Останні знайшли широке застосуван­ня в мікробіологічній промисловості для виробництва кормового білка, амінокислот, ферментів, вітамінів, антибіотиків, бактеріаль­них добрив, засобів захисту рослин, анатоксинів, лікувально-про­філактичних препаратів — вакцин, інтерферонів, гормонів, інтер-лейкінів та ін. Наприклад, з індукованих мутантів із наступною се­лекцією їх було одержано штами — продуценти амінокислот, продуктивність яких у 100 разів вища від такої у вихідних штамів. Продуцент лізину дає в 300-400 разів більший вихід цієї незамінної амінокислоти, ніж природний штам.

Багатонадійні перспективи для сільського господарства, біології та медицини й інших галузей народного господарства відкриваються у зв’язку з розробкою і вдосконаленням методів генної і клітинної інженерії, за допомогою яких експериментальне доведена можливість передачі не тільки природних генів, а й штучно синтезова­них, які кодують синтез різноманітних біологічно активних сполук. Наприклад, ще в перших дослідах з генної інженерії, проведених у 1973 p., було введено за допомогою фага в геном Е.соїі ген LIG, який контролює синтез лігази. Внаслідок цього вміст лігази в кліти-нах-реципієнтах збільшився в 500 разів. Тепер у клітини кишкової палички клоновані і функціонують гени інтерферонів, гормону росту, інсуліну та ін. За допомогою клонованих штамів Е.соїі одержують препарати інтерферону, інсуліну і соматотропіну.

Є також дані про те, що успішно функціонують клоновані у бактерії гени вірусів грипу, гепатиту В, герпесу, ген білка оболонки вірусу ящуру, що в найближчий час дозволить розробити технологію виробництва молекулярних вакцин без баластних білків.

Останнім часом інтенсивно вивчаються методи трансплантації генів за допомогою плазмід, які ще часто називають «генною інжене­рією в природі». Вони відіграють велику роль у передачі генетичного матеріалу між бактеріями, які належать навіть до віддалених філоге­нетичних груп. Плазміди є фактично каналом генетичної комуніка­ції в бактеріальному світі. Наприклад, методами генної інженерії бу­ло зроблено пересадку гена nif з азотфіксуючої бактерії в неазотфіксуючу, і остання набула властивості фіксувати молекулярний азот. Тепер ведуться роботи з перенесення генів від бактерій до клітин вищих рослин.

В лабораторних умовах одержано рекомбінантні плазміди, які містять гени двох різних бактерій, бактерій і вірусів, бактерій і рос­лин, бактерій і тварин, бактерій і людини. Дуже важливим є те, що такі рекомбінантні плазмід й, інтродуковані в бактеріальні клітини, дали експресію.

Особливої ваги набувають нині методи одержання енергії та пе­реробки відходів промисловості і сільського господарства з метою одержання цінних біопродуктів і захисту біосфери від забруднення за допомогою мікроорганізмів. Мікробіологічна наука і мікробіологіч­на індустрія можуть зробити помітний внесок у розв’язання енерге­тичних проблем, які пов’язані зі значним зменшенням запасів нафти і вугілля на нашій планеті.

Відомо, що поверхня Землі щорічно отримує таку кількість сонячної енергії, яка в тисячі разів перевищує рівень виробленої у світі енергії з паливних ресурсів, що видобуваються. Сучасне вирощуван­ня рослин використовує фотосинтез із ККД запасання фотосинте­тичне активної радіації (ФАР) в урожаї на рівні 0,1-0,5 %. У XXI ст. інтенсифікація рослинництва має забезпечити ККД агрофітоценозів приблизно до 3—5 % ФАР. Мікроорганізми здатні трансформувати сонячну енергію в хімічну з ККД до 15-18 %, що свідчить про наба­гато вищу ефективність цього процесу в мікроорганізмів порівняно з вищими рослинами.

У США, Німеччині, Індії, КНР, Англії та в інших країнах здійс­нюється мікробіологічна переробка гною і різних побутових та сіль­ськогосподарських відходів на біогаз. Це відбувається шляхом метанового бродіння в анаеробних умовах. У спеціальних газових уста­новках метаноутворюючі бактерії перетворюють до 95 % вуглецю органічного субстрату на метан. Одержуваний на очисних спорудах біогаз в Англії використовують для освітлення вулиць уже протягом десятків років. У США біля 2 % енергії одержують внаслідок переробки міських відходів на біогаз.

Останніми роками проводяться також інтенсивні дослідження з розробки мікробіологічних методів одержання рідких нафтоподіб-них продуктів — рідких вуглеводнів і гліцеролів із біомаси мікро­скопічних водоростей. Виявлено понад 100 видів фототрофних мікроорганізмів, які мають здатність утворювати водень внаслідок розщеплення води, а як вважають, водень є найперспективнішим екологічно чистим паливом майбутнього.

Не применшуючи значення класичної селекції та генної інженерії, необхідно зазначити, що сьогодні народжується принципово новий перспективний напрямок повністю безклітинної біотехнології — використання в біотехнологічних процесах не живих клітин, а заміна їх біореакторами, в яких вибірковий синтез будь-яких заданих про­дуктів здійснюється за допомогою безклітинних систем, які містять лише необхідний набір очищених клітинних компонентів.

Розшифрування геному людини поки що взагалі важко оцінити. Цю подію прирівнюють до розщеплення атомного ядра або польоту в Космос. Відкриваються перспективи вирощування органів для трансплантації, клонування тварин і людини, створення принципово нових трансгенних організмів, розробки методів боротьби з хворобами, які раніше вважалися невиліковними.

Класична генетика

На початку 20 століття роботи Менделя звернули до себе увагу у зв’язку із дослідженнями Карла Корреса, Еріха фон Чермака та Гуго де Фриза у сфері гибридизіції рослин. Вони підтвердили основні висновки про незалежне наслідування ознак і про чисельні співвідношення про розщепленні ознак у нащадків.

Невдовзі англійський натураліст Вільям Бетсон запропонував назву нової наукової дисципліни — Генетика. У 1909 році ботанік із Данії Вільгельм Йоганнсен запропонував слово ген.

Важливим доробком є також Хромосомна теорія спадковості Томаса Ганта Моргана і його учнів. Ці автори працювали із дрозофілою (Drosophila melanogaster). Вивчення закономірностей зціпленого успадкування дозволило шляхом аналізу результатів схрещування скласти карти розташування генів у «групах зціплення», а також зіставити групи зчеплення із хромосомами (1910—1913 роки).

У СРСР із 1930-тих до 1960-тих класична генетика вважалась ідеалістичною псевдонаукою, а за істинну генетику приймалися ідеї Т.Д. Лисенка, І.І. Презента, О.Б. Лепешинської, Т.М. Бошьяна та інш. (так звана “мічурінська генетика”). ДНК два ланцюги ДНК тримаються разом завдяки слабким зв’язкам (водневий зв’язок). Залишку цукру (пентози дезоксирибози) у ланцюгах виділені блакитним кольором.

Епоха молекулярної генетики розпочинається у 1940 — 1950 роках. У той час була доведена роль ДНК у передачі спадкової інформації. Найважливішими кроками стали розшифрування структури ДНК, створення теорії про триплетність генетичного коду, опис механізму біосинтезу білків, відкриття рестріктаз та сиквенс (встановлення послідовності нуклеотидів) ДНК.

Молекуля́рна гене́тика — галузь науки, яка вивчає структури, що зберігають та формують генетичну інформацію (гени та інші структури, котрі беруть участь у генетичних процесах на субклітинному й молекулярному рівнях) та їх функціональні властивості. У центрі цієї науки лежить концепція генетичного коду, який первинно зумовлює такі ознаки живої матерії, як спадковість і мінливість.

Напрямки досліджень

Основні напрямки досліджень:

• Збереження генетичної інформації: тонка структура генів, еволюція генетичних систем клітин і вірусів.

• Передача генетичної інформації: біосинтез ДНК, механізми та закономірності передачі генетичної інформації від клітини до клітини, від покоління до покоління.

• Реалізація генетичної інформації: експресія генів, що проявляються в конкретних ознаках і властивостях клітин, вірусів.

• Змінювання генетичної інформації: молекулярна природа та механізми мутацій, рекомбінацій, кросинговеру та репарацій.

• Розроблення нових методів і біотехнологій для практичного використання.

 ЕКОЛОГІЧНА БІОТЕХНОЛОГІЯ-НОВА КОМПЛЕКСНА ГАЛУЗЬ

У сучасній біотехнології у відповідності зі специфікою сфер її застосування доцільно виділити в якості самостійних ряд розділів:

– Харчова біотехнологія;

– Промислова мікробіологія;

– Медична біотехнологія;

– Технологічна біоенергетика;

– Сільськогосподарська біотехнологія;

– Біогідрометаллургія;

– Інженерна, ензимологія;

– Клітинна і генетична інженерія;

– Екологічна біотехнологія.

Біотехнологічні процеси на відміну від хімічних протікають в м’яких умовах, при нормальному тиску і рН середовища, а також при фізіологічних температурах; вони меншою мірою забруднюють довкілля відходами і побічними продуктами, крім того, вони мало залежать від кліматичних і погодних умов, що не потребують великих земельних площ, що не потребують застосування пестицидів, гербіцидів та інших чужорідних для навколишнього середовища агентів.

Екологічна біотехнологія – це спеціальне застосування біологічних систем і процесів для вирішення завдань охорони навколишнього середовища та раціонального природокористування.

Ці процеси включають утилізацію сільськогосподарських, побутових і промислових відходів, очистку стоків та газо-повітряних викидів, деградацію ксенобіотиків, отримання ефективних і нетоксичних препаратів для боротьби з хворобами і шкідниками культурних рослин і домашніх тварин, а також створення альтернативних і нешкідливих для навколишнього середовища способів виготовлення їжі, лікарських препаратів, енергоносіїв та видобутку корисних копалин.

Біотехнологія, або технологія біопроцесів, це виробнич-ничих використання біологічних агентів або їх систем (мік-роорганізмов, рослинних і тваринних клітин та їх компонентів) для отримання цінних продуктів і здійснення цільових перетворюється-щений.

Біотехнологія розробляє такі процеси, в яких мікроорганізми, культури рослинних і тваринних клітин, виділений-ні з них ферменти, мембрани та клітинні органели у вільному або іммобілізованим стані використовуються для отримання біо-маси (білка одноклітинних), отримання органічних кислот, спиртів, амінокислот, лікарських речовин, ферментів, гормонів і т.д., трансформації органічних речовин (наприклад, біогазу, вилуговування металів, очищення стічних вод, утилізація відходів сільськогосподарських та промислових вироб ¬ ництва і т. д.).

Людина використовував біотехнологію багато тисяч років: люди пекли хліб, варили пиво, робили сир, інші молочнокислі про-дукти, використовуючи різні мікроорганізми, при цьому навіть не підозрюючи про їх існування. Власне сам термін “Біотехніялогія” з’явився в нашій мові не так давно, замість нього вживають слова “промислова мікробіологія», «технічна біохімія” та ін

Сучасна біотехнологія тісно стикується з низкою наукових дисциплін, здійснюючи їх практичне застосування або ж явля ¬ чись їх основним інструментом.

Мікробіологічна промисловість в даний час викорис ¬ зует тисячі штамів різних мікроорганізмів. У більшості випадків вони поліпшені шляхом індукованого мутагенезу і після селекції. Це дозволяє вести широкомасштабний синтез різних речовин.

Деякі білки і вторинні метаболіти можуть бути отримані тільки шляхом культивування клітин еукаріотів. Рослинні клітини можуть служити джерелом ряду сполук – атропін, алкалоїди, сапоніни та ін Клітини тварин і людини також продукують ряд біологічно активних сполук. Наприді заходів, клітини гіпофіза – ліпотропін, стимулятор розщеплення жирів, і соматотропін – гормон, що регулює ріст. Створені культури клітин тварин, які продукують моноклональні антитіла (для діагностики).

У біохімії, мікробіології, цитології безсумнівний інтерес викликають методи іммобілізації як ферментів, так і цілих клітин мікроорганізмів, рослин і тварин.

У ветеринарії широко використовуються такі біотехнологічні методи, як культура клітин і зародків, овогенез в пробірці, ис-штучного запліднення.

 

1. Основні напрямки біотехнології.

1.1. Біоенергетика

Біотехнологічне одержання палива з біомаси енергетично вигідніше термохімічних процесів. Анаеробне зброджування біомаси дозволяє отримувати біогаз, добрива і кормові добавки. Процес метаноутворення триває 8-10 днів. Під дією бактерій органічні речовини гною перетворюються на метан, вуглекислоту і аміак. Тверді  , що містяться в залишку служать джерелом білка для тварин, а рідка фракція, багата азотом, використовується як добриво.

1.2. Біотехнологія обробки стоків і контролю забруднення води важкими металами

Побутові відходи діляться на 2 групи: тверді відходи і стічні води. Тверді побутові відходи складаються з целлюлозосодержащих матеріалів (до 40% паперу, 2,5% дерева, 8% текстиля) і харчових відходів (40%). Най економічніша і радикальна переробка їх метанового бродіння, в результаті утворюється легко транспортується паливо-метан. Стічні води зазвичай містять складну суміш нерозчинних і розчинних компонентів різної природи і концентрації.

 Мета очищення стічних вод – видалення розчинних і нерозчинних компонентів, елімінування патогенних мікроорганізмів і проведення детоксикації таким чином, щоб компоненти стоків не шкодили людині, що не забруднювали водойми.

Бактерії роду Pseudomonas практично всеїдні. Наприклад, П. putida можуть утилізувати нафталін, толуол, алкани, камфору та ін з’єднання. Виділено чисті культури мікроорганізмів, здатного розкладати специфічні фенольні сполуки, компоненти нафти в забруднених водах і т.д. Мікроорганізми роду Pseudomonas можуть утилізувати і незвичайні хімічні сполуки – інсектициди, гербіциди та інші ксенобіотики.

1.3. Сільськогосподарська біотехнологія

Біологічна азотфіксація – процес фіксації атмосферного азоту бактеріями, що живуть у симбіозі з представниками сімейства бобових. Методами генної інженерії виведені мутанти бактерій з підвищеною здатністю до азотфіксації. Ведуться роботи по створенню азотфіксуючих рослин, здатних до симбіозу із злаковими.

Мікробні інсектициди. Для отримання мікробних інсектицидів використовуються вируси, гриби, найпростіші, найбільш зручні – спороутворюючі бактерії. Мікробні інсектициди високоспецифічні і діють тільки на певних шкідливих комах, залишаючи неушкодженими поліз ¬ ні. Патогенність мікроорганізмів викликана дією визначений ¬ них токсинів, тому вироблення стійкості до биопрепаратам у комах не відбувається. Мікробні пестициди схильні біодег ¬ радаціі.

Мікроорганізми можуть регулювати ріст рослин і тварин, придушувати захворювання. Деякі бактерії змінюють кислотність і солоність грунту, інші продукують сполуки, що зв’язують залізо, треті – виробляють регулятори росту. Як правило, мікроорганізмами інокуліруют насіння і чи рослини перед посад ¬ кою. У тваринництві біотехнологія також знаходить застосування. Це діагностика, профілактика, лікування захворювань з вико ¬ ристанням техніки моноклональних антитіл, генетичне поліпшення порід тварин.

1.4. Біогеотехнологія

Деякі мікроорганізми можуть каталізувати певні окислювально-відновні реакції – окислення Fe і Мп у воді, окислення сірковмісних сполук, окислення-відновних азотовмісних сполук. Аеробні бактерії можуть виокремлять залізо, мідь, сульфати.

Біогеотехнологія – екстракція і концентрування металів при біологічному очищенню стічних вод підприємств гірничодобувальної промисловості і флотаційних процесах: вилуговування бідних і відпрацьованих руд, десульфірування кам’яного вугілля, окисленя пиритов і пірітсодержащіе порід.

Витягувати метали з навколишнього середовища здатні все микроорганізми, оскільки такі метали, як залізо, магній, цинк, мідь, молібден і багато інших входять до складу ферментів або пігментів, подібних цитохромам і хлорофілу. У ряді випадків метали накопичуються мікроорганізмами в значних кількіснихвах. В результаті метаболічних ре акцій, що протікають у мікроорганізмів, можуть відбуватися различні перетворення металів: в довкілля продукти метаболізму здатні утворювати комплекси з металами або осаджувати їх з розчинів; деякі метали можуть переводитися в летючу форму і віддалятися з розчину; метали можуть окис ¬ ляться або відновлюватися.

1.5. Біоелектроніка

В області електроніки біотехнологія може бути використана для створення поліпшених типів біосенсорів і нових призводять пристроїв, званих біочіпи. Біосенсори (ферментні електро-ди), в яких ферменти використовуються для індикації ряду ве ¬ вин, є і тепер, але їх використання обмежене вузьким спектром визначених речовин і температурної нестабільністю. Біотехнологія пропонує більш досконалі сенсори на основі ферментів і моноклональних антитіл.

 

2. Основні типи біопроцесів

В даний час існують такі основні типи біоп-роцессе:

– Виробництво біомаси (наприклад, білок одноклітинних);

– Клітинних компонентів (ферменти, нуклеїнові кислоти іт.д.);

– Метаболітів (хімічні продукти метаболічної активністюти),

– Включаючи первинні метаболіти, такі як етанол, молочна кислота;

– Вторинних метаболітів;

– Односубстратние конверсії (перетворення глюкози під фруктозу);

– Многосубстратние конверсії (обробка стічних вод, утилізації-зація лігноцелюлозних відходів).

2.1. Виробництво біомаси

Людина традиційно отримує білки, жири і вуглеводи (основ-ні компоненти їжі) з тварин і рослинних джерел. Вже сьогодні ці джерела не покривають все збільшуються потреб людства. З’ясувалося, що білки і жири микроорганиз ¬ мов з успіхом можуть замінити білки і жири традиційного проис-ходіння. Переваги мікроорганізмів як продуцентів білка складається у високому вмісті білка в біомасі і високої скорос ¬ ти росту мікроорганізмів. Крім висо ¬ кого вмісту білка, мікробна біомаса містить також жири, нуклеїнові кислоти, вітаміни і мінеральні компоненти.

 Для отримання БОК використовують найрізноманітніші субси-трати, включаючи парафіни нафти, метан, водень, метанол, етанол, оцтову кислоту, вуглекислий газ, молочну сироватку, мелясу, крохмаль і целлюлозосодержащіе відходи промисловості і сільського господарства. Для промислового використання перспективними є ¬ ються термофільні (що ростуть при високих температурах до 50 ° С) мікроорганізми.

2.2. Отримання спиртів.

Деякі дріжджі і бактерії здатні продукувати етанол і бутанол, Ці продукти зазвичай синтезують з нафти,

Ферментація меляси різними видами Clostridium. може бути використана для отримання не тільки етанолу, а й ацетальдегіду, оцтової кислоти, етилацетату і діетилового ефіру.

2.3. Виробництво вторинних метаболітів

З усіх продуктів, одержуваних за допомогою мікробних процес-сов, найбільше значення мають вторинні метаболіти. Ця група включає в основному антибіотики, токсини, алкалоїди та стимуля-тори росту рослин.

Фармакологічно активні сполуки мікробного походження не обмежені антибіотиками. Живі й убиті мікроорганізми використовуються як антигени і токсінообразователі для отримання антитіл і антитоксинів. Патогенні бактерії також виробляються у великих кількостях для отримання вакцин. Живі клітини молочнокислих бактерій і кишкової палички використовуються для профілактики та лікування кишкових захворювань. Віруси використовуються як індуктори синтезу інтерферону.

2.5. Виробництво ферментів

Отримання ферментів за допомогою мікроорганізмів більш вигод-но, ніж з рослинних і тваринних джерел. Мікробні клітини продукують більше 2 тисяч ферментів, які каталізують біохімічес ¬ кі реакції, пов’язані з ростом, диханням і освітою про ¬ дуктів. Багато з цих ферментів можуть бути виділені і проявля ¬ ють свою активність незалежно від клітини. У світі виробляється близько 20 ферментів в обсязі 65 тис. тонн (а існує, як припускають, 25000 ферментів).

Ферменти для медичних або аналітичних цілей повинні бути високоочищеними. Для підвищення стабільності виділених ферментів використовують техніку іммобілізації, тобто зв’язування ферментів на поверхні нерозчинного у воді носія, напри-мер, органічних полімерів, скла, мінеральних солей, силикатів і т. п.

2.6. Амінокислоти, органічні кислоти, вітаміни

Виробництво амінокислот відноситься до однієї з найбільш передових областей біотехнології. Амінокислоти отримують шляхом хімічного синтезу або екстракцією з білкових гідролізатів. Незамінні амінокислоти можуть виходити мікробіологічними шляхом більш ефективно, ніж шляхом хімічного синтезу. За рубе ¬ жом 60% потужностей з виробництва амінокислот займають глута-нова кислота, далі йдуть метіонін, лізин і гліцин.

За допомогою мікроорганізмів можна отримати до 60 органічних кислот. Багато хто з них виходять в промисловому масштабі – ітаконовою, молочна, оцтова, лимонна.

Вітаміни синтезують в основному хімічним шляхом або одержують із природних джерел. Мікроорганізми є також цінним джерелом отримання нікотинової кислоти (вітамін РР) і вітамін В2.

3. Об’єкти біотехнології

Субклітинні структури – віруси і плазміди.

Мікроорганізми – бактерії, гриби і водорості.

Рослини: нижчі – папороть азолла, вищі – представники сімейства ряскових.

Первинні та перещеплюваних культури рослинних і тваринних клітин і тканин.

3.1. Мікроорганізми

Мікроорганізмів, що синтезують продукти або здійснюють реакції, корисні для людини, кілька сотень видів.

1. Корисні бактерії відносяться до еубактеріям. Оцтовокислі бактерії, представлені пологами Gluconobacter і Acetobacter,-це грамнегативні бактерії, що перетворюють етанол в оцтову кислоту, а оцтову кислоту у вуглекислий газ і воду: Рід Bacillus відноситься до грампозитивних бактерій,

До молочнокислим бак ¬ теріям відносяться представники родів Lactobacillus, Leuconostoc і Streptococcus, які не утворюють спор, грамположітельни і нечутливі до кисню.

2 До грибів відносяться актиноміцети, дріжджі і цвілі. Істинні актиноміцети – строгі аероби, вони грампозитивні і не утворюють спор. Найбільш представницький в цій групі – рід Streptomyces, окремі види якого продукують антибіотики. При зростанні на твердих середовищах актиноміцети утворюють дуже тонкий міцелій з повітряними гифами, які дифференціруються в ланцюжки конідіоспор.

З 500 відомих видів дріжджів перший люди навчилися вико ¬

пользовать Saccharornyces CEREVISIAE.

Цвілі викликають численні перетворення у твердих сре-дах, які відбуваються перед бродінням. Їх наявністю пояснюється гідроліз рисового крохмалю при виробництві саке.

Вимоги до штамів:

• здатність до зростання на дешевих поживних середовищах, висока швидкість росту і освіти цільового продукту,

• мінімальне утворення побічних продуктів, стабільність продуцента щодо виробничих властивостей,

• нешкідливість продуцента та цільового продукту для людини і навколишнього середовища.

 У зв’язку з цим всі мікроорганізми, використовувані в промисловості, проходять тривалі випробування на нешкідливість для людей, тварин і навколишнього середовища. Важливою властивістю продуцента є стійкість до інфекції, що важливо для поддержаня стерильності, і фагоустойчівость.

3. Водорості використовуються, в основному, для отримання білка.

Хлорела (Chlorella) – яскраво-зелена одноклітинна водорість,

мешкає в різноманітних екологічних умовах. Клітини крейдакі, кулясті, з дзвоноподібних хроматофорах. Може давати до 70 грам сухої органічної речовини на 1 кв. метр водойми. У ухій речовині міститься до 40% білків, вуглеводи, жири, вітаміни В, С, К. Анаб (Anabaena) – нитчатая синьо-зелена водоросль.

Всі синьо-зелені водорості (або ціанобактерії) мають спо-можності до азотфіксації, що робить їх дуже перспективними продуцентами білка

Водорості також можуть служити джерелом вуглеводнів і рідкісних хімічних речовин. У широко поширеною зеленої водорості (мешкає в прісній і солоній воді помірних і тропічних зон) вуглеводні в залежності від умов зростання і різновидів можуть складати до – 75% сухої маси. Вони накопичуються всередині клітин, і водорості, в яких їх багато, плавають на поверхні. Після збору водорослей ці вуглеводні легко відокремити екстракцією яким-небудь розчинником або методом деструктивної відгону. Таким шляхом може бути отримано речовину, аналогічне дизельному паливу і гасу.

3.2. Рослини

Водний папороть азолла цінується як органічне азотне добриво, так як росте в тісному симбіозі з синьо-зеленою во-доросли анабена. Це дозволяє симбиотическому організму анабена-азолла накопичувати багато азоту у вегетативній масі. Ана-Бену-азоллу вирощують на рисових полях перед посівом рису, що дозволяє знижувати кількість внесених мінеральних добрив.

Представники сімейства ряскових (ряскових) – найдрібніші і прості за будовою квіткові рослини, величина яких ред ¬ ко перевищує 1 см.

Ряска служать кормом для тварин, для качок та інших водоплавних птахів, риб, ондатри. Їх використовують і в свіжому, і в сухому вигляді як цінний білковий корм для свиней та домашньої птиці. Ряскова містять багато протеїну (до 45% від сухої маси), 45% углеводів, 5% жирів і інше – клітковина і т.д.

3.3. Культури клітин

Розрізняють культури рослинних і тваринних клітин. Культу ¬ ри тварин клітин бувають первинними і Перещеплювані. А первинні ¬ ми називаються культури клітин, отримані з експланти тканини і перенесені в живильне середовище з попередньою тріпсініза-цією або без неї. Зазвичай такі культури, приготовані ІЕ здо-рових тканин, мають обмежену здатність до розмноження: їх вдається підтримувати протягом певного часу (дні, тижні), після чого культура гине, або використовується для клонування з метою отримання перещеплюваної лінії.

Перещеплювані культури, як правило, отримують з пухлинних клітин, що володіють здатністю необмеженої проліферації.

На відміну від тварин, рослинні клітини пред’являють жорсткі вимоги до умов культивування. У результаті виходять рослини, ідентичні за генотипом. Культура рослинної тканини дозволяє отримати численні популяції в порівняно короткий час і в обмеженій просторі; в таких популяціях можуть бути отримані мутанти, які можна застосовувати в селекційних цілях.

Культури рослинних клітин також є продуцентами багатьох хімічних сполук – алкалоїдів (кодеїн, хінін, ді-гоксін), інсектицидів (пиретрин), ароматичних речовин і т.д.

 

5. Основні принципи промислового здійснення біотехнологічних процесів

Існує 5 стадій біотехнологічного виробництва.

Дві початкові стадії включають підготовку сировини і біологічно Дейсі ¬ твующего початку. Вони зазвичай складаються з приготування розчину субстрату із заданими свойс ¬ твами (рН, температура, концентрація) та підготовки партії фер ¬ ментно препарату даного типу, ферментного або иммобилизован ¬ ного. При здійсненні мікробіологічного синтезу необхідні стадії приготування живильного середовища і підтримки чистої культури, яка могла б постійно або в міру необхідності використовуватися у процесі.

Третя стадія – стадія ферментації, на якій відбувається утворення цільового продукту. На цій стадії йде мікробіологічних гическое перетворення компонентів живильного середовища спочатку в біомасу, потім, якщо це необхідно, в цільової метаболіт.

На четвертому етапі з культуральної рідини виділяють і очищають цільові продукти.

Заключна стадія біотехнологічного виробництва-приготування товарних форм продуктів. Загальною властивістю біль-шості продуктів мікробіологічного синтезу є їх не-достатня стійкість до зберігання, оскільки вони схильні до раз-розкладання і в такому вигляді представляють прекрасне середовище для роз-ку сторонньої мікрофлори. Крім того, препарати для медичних це ¬ лей вимагають спеціальних рішень на стадії фасування та Укупоріть ¬ ки, так як мають бути стерильними. Нижче наводяться характе ¬ ристики кожної з стадій промислового мікробіологічного сін ¬ теза.

5.1. Технологія приготування поживних середовищ для біо-синтезу

Предферментаціонная стадія

На предферментаціонной стадії здійснюють зберігання та підготовку культури продуцента (інокуляту), отримання і підго-товку поживних субстратів і середовищ, ферментаційної апарату ¬ ри, технологічних та реціркуліруемих води і повітря.

Підтримання і підготовка чистої культури У відділі ¬ нії чистої культури здійснюють зберігання виробничих штамів і забезпечують їх реактивацію і напрацювання інокуляту в кількостях, необхідних для початку процесу. При вирощуванні посівних доз інокуляту застосовують принцип масштабування, тобто проводять послідовне нарощування біомаси продуцента в колбах, бутлях, далі в серії послідовних ферментерів.

Приготування поживних середовищ здійснюється в спеціних реакторах, обладнаних мішалками.

Тому дозування живильних компонентів підбирається і здійснюється індивідуально на кожному виробництві відповідно до технологічного регламенту конкретного процесу.

Приготування поживних засобів.

Основу поживних середовищ для культивування микроорганизмов становлять джерела вуглецю. Крім вуглецю клітини мікроорганізмів у процесі росту відчувають потребу в азоті, фосфорі, макро-і мікроелементи. Всі речовини цього роду находятся в поживних середовищах у вигляді солей.

Відділення приготування живильного середовища являє собій цех, обладнаний ємностями для зберігання рідких і твердих речовин, засобами їх транспортування і апаратами з перемішують вающими пристроями для приготування розчинів, суспензій або емульсій. При цьому поживні солі зберігаються зазвичай у твердому вигляді, а приготування їх суміші з заданим співвідношенням компонентів здійснюється в апараті з мішалкою, куди подаються твер ¬ лоді компоненти в необхідній кількості і далі відбувається їх розчинення. Іноді з’єднуються і перемішуються заздалегідь приго ¬ лення розчини.

Рідкі і тверді джерела вуглецю зазвичай вводять у вже готову живильне середовище безпосередньо перед ферментацією.

Найважливішим елементом приготування поживних середовищ являються дотримання вимог асептики. Це або створення заданого значення рН, що забезпечує придушення сторонніх мікроорганізмів, або повна стерилізація всіх подаваних потоків і самого біореактора. Для стерилізації газових потоків (у першу чергу повітря) використовують процес фільтрації через спеці ¬ ні волокнисті фільтри.

Рідинні потоки стерилізують різними методами, з ко-торих практичний інтерес представляють термічний, радіаційного за-ний, фільтраційний і частково хімічний. Термічний – найпоширеніший, при температурах близько 120-150 ° С. Радіація-ційний – випромінювання, застосовується рідко через труднощі созда ¬ ня та експлуатації потужних джерел цього випромінювання. В окремих випадках застосовують хімічні стерилизующие агенти (речовини з яскраво вираженим асептичним дією).

 

5.2. Підтримка чистої культури

У технологічному процесі використовуються корисні властивості штаму, отже, необхідно зберігати і, якщо можливо, покращувати його виробничі якості. Тому в біотехнологи-зації виробництві є відділення чистої культури. Таке відділення прово ¬ дить лабораторні операції з контролю і збереженню чистої куль ¬ тури, а також маломасштабний культивування для постійної пе ¬ редачі штаму на стадію ферментації. Фактично це мікробіологічних ¬ гічна лабораторія з музеєм штамів-продуцентів.

У міру необхідності з відділення чистої культури поступае задана маса інокуляту, що йде у виробництво. При пери-Одичний процесі культивування (при виробництві метаболитів) у відділенні чистої культури готують засевной дозу клітин для кожної з операцій основного виробництва. При безперервному виробництві кормового білка цього не потрібно. Для цього у відділенні є ферментаційна частина, де виробляється вирощування досить великих партій мікроорганізму Продуція та. Посівні дози вирощуються послідовно в колбах і пляшок на 10-20 літрів, що знаходяться на гойдалках або просто в термостатіруемом приміщенні, і далі в послідовності ферменті ¬ рів обсягом (по необхідності) 10, 100, 500 і 1000 літрів, в яких здійснюється перемішування, аерація і термостатірова-ня культуральної рідини з клітинами.

5.3. Ферментація

Стадія ферментації – центральна серед етапів промислово ¬ го виробництва. Під ферментацією розуміють всю сукупність послідовних операцій від внесення в заздалегідь приготовлену і термостатовому середу інокуляту до завершення процесів росту, біосинтезу або біотрансформації.

Ферментація проходить в спеціальних ємностях, званих ферментерами або біореактора. Конструкція біореактора приве-Дена на рис. 2. Основними елементами ферментера є двой ¬ ні стінки, проміжок між якими заповнюється охолоджуючої

вихо повсорочка живильне середовище або нагріваючої рідиною, вхідні отвори для газових і жид ¬ ких потоків, система контролю за складом живильного середовища і умовами всередині реактора.

Оскільки в промисловій біотехнології виділяють 2 типи процесів – накопичення біомаси і накопичення цінних речовин, що виникають в ході росту і подальшого розвитку культури, то змінюється і характер побудови виробництва в часі. Біомаси ¬ са одноклітинних вирощується безперервним способом в апаратах хемостатного типу, а всі процеси другої груші; здійснюються періодично,

Технологічне оформлення процесів промислової биотехлогії значною мірою визначається ставленням микроорга ¬ нізму-продуцента до кисню .. Технологічне оформлення строго анаеробних процесів складніше, ніж для процесів бродіння, так. як в цьому випадку необхідно повністю виключити можливість потрапляння кисню в газову, а звідти і в рідку середу.

В аеробних умовах мікробіологічний синтез протікає зі значним тепловиділяючих ¬ ленням, що викликає необхідність відводу тепла з апаратів великого обсягу (сотні і тисячі кубометрів). Найбільш прийом ¬ лемий на практиці спосіб тепловідведення – охолодження водою через змійовики, сорочки та ін пристрою.

– Важливо також підтримувати певний склад живильного середовища. У безперервних процесах біосинтезу завдання технолога сво ¬ диться до підтримання концентрації всіх поживних речовин (і кисню) і дозованому введенню кислоти або лугу для рН-статірованія системи на заданому рівні.

5.4. Виділення та очищення продуктів

Продукти мікробного синтезу надходять з біореактора у вигляді водних суспензій або розчинів, при цьому характерно невисо ¬ дещо зміст основного компонента і наявність багатьох домішкових речовин. У більшості промислових виробництв на першому етапі переробки культуральної рідини виробляють відділення маси продуцента від рідкої фази.

Технологічні прийоми, використовувані для відділення клітин від середовища, залежать від природи продуцента. Наприклад, сахароміцети (хлібопекарські дріжджі) мають відносно великі клітини і спо ¬ собни флотувати, тому після згущення біомаси флотацией їх відділяють на звичайних барабанних вакуум-фільтрах. Надалі біомасу, зняту з фільтра, піддають пресуванню і отримують продукт з високим вмістом живих клітин, що мають високу хлібопекарську активність. Дріжджі ж роду Candida, службовці кормового білка погано флотируются і фільтруються. Поетого дріжджі, що ростуть на вуглеводнях, а також бактерії-продуценти білка на основі метану і метанолу, на першому етапі сепаріруются, причому в декілька ступенів. Вода, що залишилася видаляє ¬ ся шляхом випарювання, а всі компоненти рідкої фази залишаються в кінцевому продукті.

При виділенні і очищенні метаболітів біомаса, якщо вона не містить помітних кількостей цільового продукту, осідає до ¬ додаванням вапна або інших твердих компонентів, що захоплюють клітини або міцелій на дно. Отримана культуральна рідина переробляється шляхом екстракції, іонообміну, кристалізації або за допомогою мікро-та ультрафільтрації через полімерні мемб ¬ рани зі спеціально підібраним розміром пор. Для виділення і очищення продуктів, що знаходяться всередині клітин продуцента (наприклад, інтерферонів, гормонів) вводиться стадія руйнування клеточ ¬ них оболонок (дезінтеграція біомаси); зазвичай для цього примі ¬ няются механічні, хімічні (розчинники типу толуолу) або комбіновані методи.

Продукти

Асортимент продуктів, одержуваних у біотехнологічних про ¬ цессах, надзвичайно широкий. За різноманітністю і обсягами виробниц ¬ ства на першому місці стоять продукти, одержувані в процесах, заснованих на життєдіяльності мікроорганізмів. Ці продукти поділяються на три основні групи:

/ Група – біомаса, яка є цільовим продуктом (білок одноклітинних) або використовується як біологічного агента (біометаногенеза, бактеріальне вилуговування металів);

2 група – первинні метаболіти – це низькомолекулярні

сполуки, необхідні для росту мікроорганізмів в якості

будівельних блоків макромолекул, коферментів (амінокислоти,

вітаміни, органічні кислоти);

3 група – вторинні метаболіти (ідіоліти) – це сполуки, що не вимагаються для росту мікроорганізмів і не пов’язаний.

 

 

Фільм “Біотехнологія”

 

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/video/med_bio/index.php?name_film=biot

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/uk/med/lik/ptn/.