Теми: 1

Матеріали для підготовки до практичного заняття №6

для студентів 2 курсу медичного факультету

спеціальність «Здоров’я людини»

Теми: Мікробіологічна діагностика стафілококових, стрептококових інфекцій. Мікробіологічна діагностика і профілактика захворювань, викликаних патогенними ентеробактеріями.Мікробіологічна діагностика і профілактика дифтерії і кашлюку.

Мікробіологічна діагностика і профілактика туберкульозу, прокази, мікобактеріозів. Мікробіологічна діагностика і профілактика анаеробних інфекцій (правець, ботулізм, газова анаеробна інфекція).

Лабораторна діагностика захворювань, які викликаються стафілококами і стрептококами.

Лабораторна діагностика захворювань, які викликаються менінгококами і гонококами

 

Мікроорганізми, які мають кулясту форму (коки), належать до найстародавніших на землі. Вони досить широко розповсюдженні в природі. Згідно з останньою класифікацією бактерій Бергі (1986) кокові мікроби поділяють на три родини:

1. Micrococcaceae (мікрококи, стафілококи, тетракоки, сарцини).

2. Deinococcaceae (стрептококи, пептококи, пептострептококи).

3. Neisseriaceae (нейсерії, вейлонели).

Характерною загальною ознакою патогенних коків є їх здатність викликати запальні процеси з утворенням гною. У зв’язку з цим їх часто називають гноєрідними (піогенними) коками. Найбільше значення в інфекційній патології людини мають стафілококи, стрептококи й нейсерії.

 

Стафілококи (Staphylococcus)

Патогенний стафілокок вперше відкрив Л. Пастер у 1880 році. Більш детально його властивості описав Ф. Розенбах (1884).

Морфологія і фізіологія. Стафілококи мають правильну круглу форму розміром 0,5 – 1,5 мкм (Рис. 1, 2). У мазках розміщуються у вигляді неправильних скупчень, які нагадують грона винограду (Рис. 3). При виготовленні мазків з гною типового розташування клітин може не бути. Стафілококи грампозитивні, нерухливі, не утворюють спор, окремі види в організмі мають ніжну капсулу. До складу клітинної стінки входять пептидоглікан (муреїн) і тейхоєві кислоти.

Стафілококи – факультативні анаероби, краще ростуть в аеробних умовах. До живильних середовищ невибагливі, добре культивуються на простих середовищах. На МПА колонії правильної круглої форми, опуклі, непрозорі, з гладенькою, блискучою, ніби полірованою поверхнею, забарвлені в золотистий, палевий, білий, лимонно-жовтий колір, залежно від кольору пігменту (Рис. 4).

Рис. 4. Ріст стафілококів на МПА.

На кров’яному агарі колонії оточені зоною гемолізу. У МПБ викликають помутніння й осад на дні (Рис. 5).

Рис. 5. Ріст стафілококів на КА.

 

У бактеріологічних лабораторіях стафілококи часто культивують на середовищах з 7-10 % хлориду натрію. Таку високу концентрацію солі інші бактерії не витримують. Отже, сольовий агар є селективним середовищем для стафілококів (Рис. 6).

Рис. 6. Ріст стафілококів на ЖСА.

 

Стафілококи виділяють протеолітичні й сахаролітичні ферменти. Вони розріджують желатин, викликають зсідання молока, ферментують ряд вуглеводів із виділенням кислоти.

 

Токсиноутворення. Стафілококи, особливо Staphylococcus aureus, виділяють екзотоксини і багато “ферментів агресії”, які мають важливе значення в розвитку стафілококових інфекцій. Токсини їх досить складні. Описують багато варіантів гемотоксинів, лейкоцидинів, некротоксинів, летальний токсин. Так, нині відомі альфа-, бета-, гама- і дельта-гемолізини, які викликають гемоліз еритроцитів людини і багатьох видів тварин (Рис. 7).

Рис. 7. Гемолітичні властивості стафілококів на КА.

 

Лейкоцидини руйнують лейкоцити, макрофаги та інші клітини, а в менших концентраціях пригнічують їх фагоцитарну функцію. Некротоксин спричиняє некроз шкіри, а летальний токсин при внутрішньовенному введенні – майже миттєву смерть. Золотисті стафілококи продукують ексфоліатини, які зумовлюють імпетиго дітей і пухирчатку новонароджених (Рис. 8).

Рис. 8. Пухирчатка новонароджених

 

Окремі види здатні виділяти ентеротоксини, які специфічно діють на ентероцити кишечника, що призводить до виникнення харчових токсикоінфекцій та ентероколітів. Описано шість різновидів ентеротоксинів (A, B, C, D, E, F), які є порівняно простими білками.

У патогенній дії стафілококів, окрім токсинів, важливе значення мають ферменти агресії: плазмокоагулаза, фібриназа, дезоксирибонуклеаза, гіалуронідаза, лецитиназа (Рис. 6), протеїназа, желатиназа, ліпаза, фосфатаза тощо. Вони є стабільною ознакою окремих видів. При визначенні окремих із них (коагулаза (Рис. 9), гіалуронідаза, ДНК-аза) вирішують питання про вид і вірулентність виділених культур.

Рис. 9. Тест на плазмокоагулазу.

 

Важливе значення у прояві патогенних властивостей стафілококів має білок А. Він здатний реагувати з IgG. Комплекс білок А+IgG інактивує комплемент, знижує фагоцитоз, викликає ушкодження тромбоцитів.

Антигени і класифікація. Антигенна структура стафілококів досить складна й варіабельна. Описано біля 30 антигенів, пов’язаних із білками, тейхоєвими кислотами, полісахаридами. Основним з них є капсульний білок А.

До роду Staphylococcus входять 29 видів, але не всі вони викликають захворювання у людини. Нині бактеріологічні лабораторії України ідентифікують лише три види: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus. Розроблені тести для визначення ще восьми видів.

Екологія і розповсюдження. Головними біотопами стафілококів у організмі хазяїна є шкіра, слизові оболонки й кишечник. Вони входять до складу нормальної мікрофлори тіла людини і знаходяться з нею в симбіозі. Однак, при виникненні стафілококових інфекцій можуть уражатися й інші органи та тканини. У наше довкілля стафілококи потрапляють від хворих людей і тварин та носіїв. Їх постійно знаходять у повітрі, воді, грунті, на різноманітних предметах вжитку. При контакті з хворими в окремих осіб може формуватись резидентне стафілококове бактеріоносійство, коли постійним місцем їх проживання стає слизова оболонка носа, звідки вони виділяються масивними дозами. Таке носійство особливо небезпечне серед медичного персоналу лікарень, оскільки носії можуть стати джерелом внутрішньогоспітальних інфекцій.

Стафілокококи досить стійкі в зовнішньому середовищі. При кімнатній температурі вони виживають на предметах догляду за хворими протягом 1-2 місяців. При кип’ятінні гинуть миттєво, при 70-80 °С – через 30 хв. Розчин хлораміну (1 %) викликає їх загибель через 2-5 хв. Дуже чутливі до брильянтового зеленого, який широко застосовують при лікуванні гнійних захворювань шкіри.

Захворювання людини. Стафілококи найчастіше уражають шкіру, її придатки, підшкірну клітковину. Вони викликають фурункули (Рис. 10), карбункули, панариції, абсцеси, флегмони, мастити, лімфаденіти, нагноєння ран. Їх виділяють також при пневмоніях, бронхітах, плевритах. Вони можуть викликати ангіни, тонзиліти, гайморити, отити, кон’юнктивіти. Стафілококи спричиняють також захворювання нервової системи (менінгіти, абсцеси мозку) та серцево-судинної системи (міокардити, ендокардити). Дуже небезпечними бувають харчові токсикоінфекції, ентероколіти, холецистити. При проникненні в кров або кістковий мозок викликають відповідно сепсис і остеомієліт (Рис. 11). Проте всі захворювання стафілококової етіології не розглядають як гострозаразні.

Рис. 10. Фурункульоз.

 

Рис. 11. Остеомієліт

 

Імунітет. Вродженої несприйнятливості до стафілококів у людей немає, проте резистентність до них досить висока. Не дивлячись на постійний контакт зі стафілококами, інфікування виникає порівняно рідко. У результаті перенесеної інфекції розвивається імунітет проти самих мікробів, їх токсинів, ферментів, протеїну А, але він недовготривалий.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження служить кров, гній, слиз, сеча, промивні води шлунка, випорожнення, залишки харчових продуктів. Гній досліджують бактеріоскопічним і бактеріологічними методом, решту матеріалів – бактеріологічним. Після виділення чистої культури встановлюють вид за такими факторами як здатність розкладати глюкозу і маніт в анаеробних умовах, утворення плазмокоагулази, гемолізинів, ДНК-ази, білку А, здатністю розкладати цукри. Для виявлення джерел інфекції та шляхів її передачі, особливо при спалахах захворювань у пологових будинках і хірургічних стаціонарах, проводять фаготипування виділених культур за допомогою міжнародного набору стафілококових бактеріофагів. Обов’язково визначають чутливість виділених культур до антибіотиків з метою призначення для лікування раціональних хіміотерапевтичних препаратів.

 

Профілактика й лікування. Попередження виникнення та розповсюдження стафілококових інфекцій спрямовано на виявлення й лікування носіїв золотистих стафілококів особливо серед медичного персоналу пологових будинків, хірургічних та дитячих відділень лікарень. Необхідно чітко витримувати суворий санітарний режим роботи в лікарняних закладах, систематично проводити дезинфекцію. Для профілактики стафілококових інфекцій у пологових будинках важли-ве значення має раціональний режим стерилізації, пастеризації та збереження грудного молока. На промислових підприємствах для профілактики нагноєнь при мікротравмах застосовують захисні мазі та пасти. З метою підвищення протистафілококового імунітету практикують проведення імунізації стафілококовим анатоксином осіб, у яких часто виникають травми і мікротравми. При лікуванні гострих стафілококових захворювань призначають антибіотики, сульфаніламідні та нітрофуранові препарати, мірамістин. Вибір препаратів залежить від результатів визначення чутливості до них виділеної культури. Для лікування сепсису, остеомієліту та інших важких стафілококових інфекцій використовують імунологічні препарати: стафілококовий імуноглобулін, гіперімунну плазму. При хронічних захворюваннях застосовують стафілококовий анатоксин, аутовакцину.

 

Стрептококи (Streptococcus)

Вперше стрептококи відкрив Т. Більрот у 1874 р. при ранових інфекціях, пізніше Л. Пастер виявив їх при сепсисі, а Ф. Розенбах виділив у чистій культурі.

Морфологія і фізіологія. Стрептококи мають круглу або овальну форму розміром 0,6-1,0 мкм, розташовуються у вигляді ланцюжків різної довжини, грампозитивні, нерухомі, не мають спор, деякі види утворюють мікрокапсули.

Рис. 12. Електронна фотографія стрептококів.

Рис. 13. Стрептококи в мазку з гною (за методом Грама)

 

За типом дихання – факультативні анаероби, хоч є окремі види із сильним анаеробізом. Оптимальна температура для їх культивування – 37 °С. На простих середовищах не ростуть. Вирощують їх на глюкозному бульйоні та кров’яному агарі. У рідких середовищах утворюють осад, бульйон залишається прозорим. За характером росту на кров’яному агарі  стрептококи поділяють на три типи: β-гемолітичні, утворюють навколо колоній зони гемолізу (Рис. 14 а); α-гемолітичні – навколо колоній непрозорі зеленуваті зони (Рис. 14 в); γ-негемолітичні стрептококи.

 а    в

Рис. 14. Гемолітичні властивості стрептококів на КА

 

Ізольовані колонії маленькі, напівпрозорі, блискучі, гладенькі, рідше шорсткі. Стрептококи біохімічно активні, розкладають ряд вуглеводів до кислоти, желатин не розріджують.

Токсиноутворення. Стрептококи продукують складний екзотоксин, окремі фракції якого мають різну дію на організм: гемотоксин (O- і S-стрептолізини), лейкоцидин, летальний токсин, цитотоксини (ушкоджують клітини печінки, нирок), еритрогенний (скарлатинозний) токсин. Крім токсинів стрептококи виділяють ряд ферментів патогенності, які відігріють важливу роль у розвитку захворювань – гіалуронідазу, фібриназу, ДНК-азу, протеїназу, амілазу, ліпазу тощо. Для стрептококів характерна наявність термостабільних ендотоксинів і алергенів.

Антигени і класифікація. Клітини стрептококів  мають М-антиген (білок), який зумовлює їх вірулентні та імуногенні властивості, складний Т-антиген (білок), С-антиген (полісахарид) і Р-антиген (нуклеопротеїд). За наявністю полісахаридних фракцій усі стрептококи поділені на 20 серологічних груп, які позначаються великими літерами латинського алфавіту від А до V. Всередині окремих груп вони ще поділяються на види, серовари, позначені цифрами. Більшість хвороботворних для людини стрептококів входить до групи А. Крім того, певне клінічне значення мають групи B, C, D, H, K.

Рід Streptococcus нараховує багато видів. Найбільше значення з них мають
S. pyogenes, S. viridans, S. pneumoniae, S. faecalis, анаеробні стрептококи. До умовно-патогенних видів належать представники нормальної мікрофлори ротової порожнини (S. salivarius, S. mitis, S. sanguis тощо), а також інших біотопів людини.

Екологія. Стрептококи в зовнішньому середовищі зустрічаються рідше, ніж стафілококи. За екологічними ознаками вони поділяються на декілька груп. Одна з них включає види, патогенні тільки для людини (S. pyogenes), друга – для тварин і людей (S. faecalis), третя – умовно-патогенні (S. salivarius, S. mitis). Стрептококи людських ековарів, крім ротової порожнини, зустрічаються на слизових оболонках верхніх дихальних шляхів і статевих органів, на шкірі, в кишечнику. Джерелом зараження можуть бути хворі та носії. Захворювання людини виникають як в результаті екзогенного, так і ендогенного інфікування. Основний механізм зараження – повітряно-краплинний. У виникненні й розвитку стрептококових інфекцій велике значення має не тільки імунодефіцитний стан, а й попередня сенсибілізація організму алергенами.

Резистентність стрептококів у зовнішньому середовищі менша, ніж у стафілококів. У висушеному вигляді, особливо оточені білковою оболонкою, вони зберігаються декілька днів, але втрачають вірулентність. При нагріванні до 70 °С гинуть протягом 1 год, найбільш вживані дезинфікуючі розчини викликають їх загибель через 15-20 хв.

Захворювання людини. Стрептококи можуть викликати такі ж різноманітні гнійно-септичні інфекції, як і стафілококи, (фурункули, абсцеси, флегмони, панариції, сепсис, остеомієліт, тонзиліт (Рис. 15) тощо). Але вони можуть спричиняти й інші захворювання, не властиві стафілококам – скарлатину (Рис. 17), ревматизм, бешиху (Рис. 16) тощо. Проникаючи в кров жінок при пологах, вони викликають післяпологовий сепсис. Зеленящі стрептококи викликають ендокардит (Рис. 18). Анаеробні і фекальні стрептококи спричиняють ентероколіти, беруть участь у розвитку карієсу зубів. Проникаючи в тканину зуба, вони руйнують дентин і обтяжують перебіг процесу.

Рис. 15. Клінічні прояви стрептококової інфекції (тонзиліт)

Рис. 16. Бешиха

 

Рис. 17. Висипка на шкірі при скарлатині

Рис. 18. Ендокардит

 

Основна маса грампозитивних коків ротової порожнини представлена гетерогенною групою стрептококів. До цієї групи входять: Streptococcus mutans, S.sanguis, S.mitis, S.salivarium. Вони здатні синтезувати із сахарози нерозчинні полісахариди (глюкан, мутан, фруктан), які є факторами адгезії. Відкладаючись на гладкій поверхні зубів, вони започатковують формування зубної бляшки: до стрептококів прикріпляються інші мікробні клітини, які не здатні самостійно адсорбуватися на зубній емалі. Формуються мікробні асоціації, які включають в себе різні види аеробних та анаеробних бактерій, що сприяють утворенню зубних бляшок, зубного каменю, розвитку карієсу, пародонтиту, одонтогенних запальних захворювань кістки, надкісниці та м’яких тканин. При розкладі вуглеводів вони утворюють органічні кислоти, сприяючи процесам демінералізації зубів (розчинення кальцієвої солі й органічної речовини).

Імунітет при стрептококових інфекціях, крім скарлатини, має слабкий, нестійкий і недовготривалий характер. Після перенесення захворювань утворюються різні антитіла, але захисне значення мають лише антитоксини і типоспецифічні М-антитіла. З іншої сторони, у людей, що перехворіли, часто виникає алергізація організму, чим пояснюється схильність до рецидивів та повторних захворювань.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження служать слиз із рото- та носоглотки, гній, рановий вміст, кров, мокротиння, сеча. Його засівають на цукровий бульйон і кров’яний агар. Бактеріологічне дослідження проводять так само, як і при стафілококових інфекціях. Виділені чисті культури ідентифікують за їх морфологічними ознаками, характером гемолізу, біохімічною активністю, що дає змогу визначити окремі види. Обов’язково досліджують чутливість до антимікробних препаратів. Проводять і серологічні реакції.

Профілактика і лікування. Стрептококи, особливо групи А, як і багато років тому, високочутливі до пеніциліну та еритроміцину. Деякі види резистентні до тетрациклінів. Аміноглікозиди підсилюють бактерицидну дію пеніциліну. Досить ефективні й сульфаніламідні препарати, але до них легко виробляється резистентність. Загальні методи профілактики стрептококових інфекцій, в основному, такі ж, як і при стафілококових. Специфічні методи профілактики і терапії досконало ще не розроблені.

Роль стрептококів в етіології скарлатини та ревматизму. Ще в кінці минулого століття було висловлено припущення, що збудником скарлатини є гемолітичний стрептокок. Його майже завжди висівали з мигдаликів хворих і з крові померлих від скарлатини дітей. У 1904 р. І.Г. Савченко отримав екзотоксин збудника цього захворювання і виготовив протискарлатинозну сироватку. Подружжя Дік (1923) одержали токсин (еритрогенін), який викликав характерне почервоніння та висип і продукувався лише стрептококами, виділеними при скарлатині.

Скарлатина – гострозаразне дитяче захворювання з раптовим початком, тонзилітом, підвищенням температури, характерним дрібним висипом на шкірі (Рис. 17). Зараження відбувається повітряно-краплинним способом. Джерело інфекції – хворі та бактеріоносії. У перший період хвороби діє токсин, у другий – стрептокок виступає збудником багатьох ускладнень (отити, флегмони шиї, нефрити, запалення суглобів, сепсис). Після перенесеної хвороби виробляється антитоксичний і антимікробний імунітет. Можливі випадки повторного захворювання. Діагноз скарлатини ставиться на основі клінічної картини та епідеміологічних даних. У сумнівних випадках сіють слиз із ротоглотки, виділяють та ідентифікують стрептококи.

Лікування проводять антибіотиками (пеніцилін, ампіокс, гентаміцин, цефамезин) і сульфаніламідними препаратами. З профілактичною метою хворого ізолюють. Перехворілих допускають у дитячі заклади і школи через 12 днів після видужання, а тих, що були в контакті – через 7 днів після ізоляції. З профілактичною метою контактованим дітям іноді вводять імуноглобулін.

Вважають, що S. pyogenes може також викликати ревматизм – гостре гарячкове інфекційно-алергічне захворювання з переважним ураженням серця і суглобів. У хворих стрептококи часто виділяють із зіва і крові, а в більш пізній період знаходять специфічні антитіла – антистрептолізини, антифібринолізини, антигіалуронідазу. У виникненні і перебігу ревматизму важливе значення має сенсибілізація організму алергенами, яка може виникнути при будь-якій формі стрептококової інфекції. При лікуванні ревматизму в усіх стадіях застосовують пеніцилін, біцилін та інші антибіотики.

Video: Скарлатина

 

Streptococcus pneumoniae (пневмокок)

Стрептококи пневмонії (за старою номенклатурою – пневмококи) вперше були описані Л. Пастером у 1881 р. У чистій культурі їх виділили і з’ясували їх роль при запаленні легень К. Френкель і А. Вейксельбаум (1886).

Морфологія і фізіологія. Стрептококи пневмонії – попарно розташовані коки витягнутої ланцетоподібної форми, які нагадують контури полум’я свічки (Рис. 19). Розміри їх коливаються від 0,5 до 1,5 мкм. В організмі людини утворюють капсулу (Рис. 21), яка оточує дві клітини разом. При вирощуванні на живильних середовищах вона відсутня. Спор і джутиків не мають, грампозитивні (Рис. 20).

Рис. 19. Електронна фотографія пневмококів.

Рис. 20. Пневмококи, зафарбовані за Грамом.

Рис. 21. Капсулоутворення у пневмококів.

 

Пневмококи – факультативні анаероби, але добре ростуть і в аеробних умовах при 37 °С. На простих середовищах не культивуються. Їх вирощують на середовищах із додаванням крові або сироватки. На кров’яному агарі утворюють дрібні прозорі колонії-росинки, оточені зоною позеленіння (Рис. 22).

Рис. 22. Колонії пневмококів на кров’яному агарі

На рідких середовищах викликають слабке помутніння з осадом. Біохімічно активні, розкладають ряд вуглеводів до кислоти, желатин не розріджують. Вірулентні пневмококи розкладають інулін і розчиняються в жовчі, що використовують для їх ідентифікації. Вони продукують гемотоксин, лейкоцидин, гіалуронідазу, а також мають ендотоксин. Вірулентні властивості пневмококів, в основному, визначають капсули, які пригнічують фагоцитоз.

 

Антигени і класифікація. Стрептококи пневмонії мають три основні антигени – полісахарид клітинної стінки, капсульний полісахарид і М-білок. За капсульним антигеном усі пневмококи поділені на 85 сероварів, 15 із них можуть викликати у людей крупозну пневмонію, септицемію, менінгіт, артрит, отит, гайморит, риніт, повзучу виразку рогівки.

Екологія. Основними біотопами пневмококів у людини є ротоглотка і носоглотка. Звідси вони потрапляють у нижні дихальні шляхи і при зниженні резистентності організму та ослабленні імунітету можуть викликати запалення легенів та інші захворювання. Якщо збудник виділяється з мокротинням, можливе екзогенне зараження здорових людей повітряно-краплинним способом. Носійство пневмококів і захворюваність мають сезонний характер з максимальною частотою взимку. Поза організмом стрептококи пневмонії швидко гинуть. Мають високу чутливість до дезинфікуючих засобів. Нагрівання до 60 °С інактивує їх через 10 хв. Чутливі до пеніциліну та його похідних.

Імунітет має типоспецифічний характер, але слабкого напруження і недовготривалий. Навпаки, у деяких людей після перенесеної хвороби виникає підвищена чутливість до повторних заражень або захворювання переходить у хронічну форму.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є мокротиння, кров, слиз із рото- та носоглотки, гній, спинномозкова рідина тощо. Первинна бактеріоскопія матеріалу і посів його на живильні середовища дають мало, оскільки в ротовій порожнині та інших біотопах є подібні за морфологією, але непатогенні пневмококи. Основним, найбільш точним, раннім і надійним методом лабораторної діагностики є постановка біологічної проби на білих мишах, які є найчутливішими тваринами до стрептококів пневмонії. Після внутрішньоочеревинного зараження у них виникає сепсис, посів крові із серця дає змогу швидко виділити чисту культуру й ідентифікувати її.

Рис. 24. РІФ для діагностики пневмококової пневмонії.

Профілактика і лікування. Загальні профілактичні заходи зводяться до загартування організму, оберігання від сильного переохолодження. Специфічна профілактика не проводиться, вакцин немає. Для лікування з успіхом використовують пеніцилін, еритроміцин, олеандоміцин і сульфаніламідні препарати.

До роду стрептококів належить ще S. faecalis (фекальний стрептокок, ентерокок), кулястої або овальної форми диплокок, який населяє кишечник людей і тварин. Здатність ентерококів розмножуватись у харчових продуктах іноді призводить до виникнення харчових токсикоінфекцій. Як умовно-патогенний мікроб при ослабленні захисних сил організму він може викликати гнійно-септичні захворювання, частіше у вигляді змішаної інфекції. Більшість клінічних штамів ентерококів мають високу стійкість до антибіотиків та інших хіміотерапевтичних препаратів.

Лабораторна діагностика стафілококових і стрептококових інфекцій

Матеріалом для дослідження є гній, кров, мокротиння, слиз із рото-, носоглотки, запальний ексудат, сеча; в разі підозри на харчову токсикоінфекцію – промивні води шлунка, блювотні маси, випорожнення, залишки їжі; при санітарно-бактеріологічних контролях – змиви з рук, столів та інших предметів.

Із відкритих гнійних уражень матеріал беруть ватним тампоном після видалення ранового нальоту, в якому є сапрофітні стафілококи з повітря, шкіри тощо. Із закритих гнояків роблять пункцію стерильним шприцом. Слиз із рото- й носоглотки беруть стерильним тампоном. Мокротиння й сечу збирають у стерильні пробірки, банки. Кров (10 мл), взяту із ліктьової вени, й ліквор – при пункції спинномозкового каналу, з дотриманням асептики сіють біля ліжка хворого в 100 мл цукрового бульйону.

З усіх матеріалів, крім крові й змивів, виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом, мікроскопують, роблять посіви на кров’яний і жовтково-сольовий агар і протягом доби вирощують при 37 °С. Посіви потрібно робити негайно і на свіжі середовища. Через 24 години досліджують колонії, відмічають наявність гемолізу, лецитинази, пігменту; у мазках із колоній виявляють типові грампозитивні коки. Роблять пересів на скошений агар для виділення чистої культури і після її отримання визначають ферментаціію глюкози в анаеробних умовах та фактори вірулентності – плазмокоагулазу, ДНК-азу, гіалуронідазу, некротоксин тощо. Обов’язково визначають чутливість культури до антибіотиків із метою раціонального вибору препаратів при лікуванні. Для виявлення джерела інфекції за допомогою міжнародного набору стафілококових бактеріофагів встановлюють фаговар виділеної культури. У штамів, виділених при харчових токсикоінфекціях, визначають здатність продукувати ентеротоксин. Для цього культуру сіють на спеціальне середовище й інкубують при 37 °С в атмосфері 20 % СО2 протягом 3-4 діб, фільтрують через мембранні фільтри і вводять кошенятам-сосункам у черевну порожнину або зондом у шлунок.

При стрептококових інфекціях для лабораторної діагностики беруть аналогічним способом той же матеріал, що й при захворюваннях стафілококової етіології. У мазках із досліджуваного матеріалу стрептококи розташовуються короткими ланцюжками, інколи у вигляді диплококів або одиничних клітин, так що відрізнити їх від стафілококів часто неможливо. Отже, необхідно проводити й бактеріологічне дослідження. Оскільки стрептококи вибагливі до живильних середовищ, посіви роблять на цукровий бульйон і кров’яний агар. Через добу в рідкому середовищі спостерігають ріст у вигляді осаду на дні пробірки. На агарі виростають дрібні, плоскі, сухуваті колонії із зонами гемолізу або позеленіння. У мазках із колоній стрептококи розташовуються поодинці, парами або короткими ланцюжками, тоді як у мазках із культури на бульйоні вони утворюють типові довгі ланцюжки. У наступні дні виділяють чисту культуру, визначають вид, серогрупу і серовар.

Визначення чутливості стрептококів до антибіотиків проводять на середовищі АГВ з додаванням 5-10 % дефібринованої крові кролика.

Для виділення анаеробних стрептококів посіви проводять на середовище Кітта-Тароцці, де вони ростуть із утворенням газу. Вірулентність стрептококів визначають за їх здатністю продукувати токсини і ферменти (гемолізин, гіалуронідаза, фібриназа тощо) або шляхом зараження білих мишей.

Бактеріологічне дослідження для діагностики скарлатини у більшості випадків не проводиться, так як діагноз захворювання встановлюють за клінічними симптомами.

Серологічну діагностику стрептококових інфекцій проводять рідко, в основному тоді, коли збудник виділити неможливо. При цьому в крові хворих визначають антитіла проти стрептококових токсинів (антистрептолізин О, антистрептолізин S, антистрептогіалуронідаза). Частіше такі дослідження проводять при хронічних стрептококових інфекціях, наприклад, при ревматизмі.

З метою контролю за санітарним станом підприємств громадського харчування та особистої гігієни їх працівників проводять бактеріологічні обстеження методом посівів змивів з рук, посуду, обладнання. Такі ж змиви роблять з рук хірургів, акушерок, операційних сестер, інструментарію тощо для виявлення гноєрідних коків. Крім того, у медичних працівників досліджують слиз із носоглотки для встановлення носійства золотистих стафілококів. Із цією метою лабораторія готує стерильні ватні тампони на дерев’яних паличках або алюмінієвому дроті в пробірках із цукровим бульйоном. Таким тампоном, змоченим у середовищі, роблять змиви з рук (долонь, тильного боку, між пальцями, нігтьового ложа), та предметів. Тампон опускають у пробірку, зануривши його в бульйон, і ставлять у термостат при 37 °С. Через 18-20 год роблять пересів з метою виділення чистої культури і визначення виду.

При діагностиці пневмококових інфекцій використовують бактеріоскопічний, бактеріологічний і біологічний методи. Досліджуваний матеріал – мокротиння, гній, ліквор, кров, мазки з рото- та носоглотки. Стрептококи пневмонії швидко гинуть, тому досліджуваний матеріал потрібно якнайскоріше доставити в лабораторію. Із матеріалу (крім крові) виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і за Гінсом, мікроскопують. Виявлення ланцетоподібних диплококів, оточених капсулою, дозволяє припустити наявність пневмококів . Але на слизовій носоглотки можуть бути сапрофітні диплококи. Тому проводять бактеріологічне дослідження. Матеріал сіють на кров’яний агар і сироватковий бульйон, виділяють чисту культуру і визначають вид. Одночасно використовують біологічний метод. Для цього білим мишам вводять матеріал у черевну порожнину. Тварини через 12-18 год гинуть. Посів крові з серця при розтині дає чисту культуру збудника. Для диференціації його від інших стрептококів культуру сіють у жовчевий бульйон, де пневмококи, на відміну від інших видів, швидко лізуються.

 

Грамнегативні коки

Грамнегативні коки входять до родини нейсерій (Neisseriaceae). Родина дістала назву на честь А. Нейсера, який першим відкрив у 1879 р. один із видів цієї групи – збудника гонореї. Важливе значення в інфекційній патології людини має ще збудник менінгококової інфекції. Інші види належать до умовно-патогенних мікроорганізмів, які є представниками нормальних мікробіоценозів людини, але іноді можуть викликати госпітальні інфекції.

 

Гонококи (Neisseria gonorrhoeae)

Морфологія і фізіологія. Гонокок – збудник гонореї і бленореї – має досить характерну морфологію. Бактерійні клітини бобоподібної форми, розташовані парами, вігнутими сторонами всередину і опуклими – назовні (Рис. 25 а, в), грамнегативні (Рис 27). Розміри їх – 0,7-1,8 мкм.

У мазках із гною розташовуються всередині лейкоцитів, а в мазках із чистих культур гонококи мають форму кавових зерен. Вони не утворюють спор, нерухливі, але мають фімбрії, за допомогою яких прикріплюються до епітеліальних клітин сечостатевого тракту.

 

Рис. 25 в. Електронна фотографія нейсерій.

 

Рис. 26. Нейсерії в матеріалі (фарбування метиленовим синім)

Рис. 27. Нейсерії в матеріалі (фарбування за Грамом).

Явище незавершеного фагоцитозу.

 

При хронічній гонореї, а також під впливом лікарських препаратів гонококи змінюють форму, розміри, забарвлення, що необхідно враховувати при лабораторній діагностиці захворювання.

До живильних середовищ нейсерії гонореї дуже вибагливі. В аеробних умовах ростуть на свіжовиготовлених середовищах із нативним білком (кров, сироватка, асцитична рідина) при достатній вологості, 3-10 % СО2 в атмосфері. Колонії дрібні, прозорі, круглі, з рівними краями і блискучою поверхнею. У бульйоні утворюють слабку каламуть і плівку на поверхні.

Рис. 28. Колонії гонококів.

 

 Їх ферментативні властивості слабо виражені, з вуглеводів розкладають тільки глюкозу, протеолітичні ферменти відсутні. Екзотоксину гонококи не виділяють, але мають термостабільний ендотоксин, токсичний для людини і лабораторних тварин.

Антигенна структура гонококів гетерогенна і мінлива. Вона представлена білковими і полісахаридними комплексами. Описано 16 сероварів, але визначення їх у лабораторіях не проводиться.

Екологія. На гонорею хворіє лише людина. Головними біотопами гонококів є слизова оболонка статевих органів і кон’юнктива. Поза організмом вони існувати не можуть, так як швидко гинуть від висихання, охолодження і дії температури вище 40 °С. Дуже чутливі до розчинів нітрату срібла, фенолу, хлоргексидину і багатьох антибіотиків. Проте в зв’язку зі значним збільшенням захворювань в останні роки і неправильним лікуванням зросла кількість нейсерій, стійких до антибіотиків і сульфаніламідних препаратів.

Захворювання людини. Джерелом гонококової інфекції є тільки хвора людина. Збудник передається статевим шляхом, рідше – через побутові предмети (рушники, губки тощо). Потрапивши на слизову облонку сечостатевих органів, гонококи завдяки фімбріям проявляють високі адгезивні властивості, фіксуються на епітеліальних клітинах, розмножуються і проникають у сполучну тканину. Виникає гнійне запалення уретри, шийки матки. У жінок уражаються також труби і яєчники, у чоловіків – передміхурова залоза і сім’яні міхурці. Гонококи рідко викликають генералізовані процеси, але часом можуть спричиняти сепсис, запалення суглобів, ендокардит, менінгіт. При бленореї новонароджених виникає гнійне запалення слизової оболонки очей 

Імунітет. Видового імунітету до гонококів у людини не існує. Перенесене захворювання також не залишає стійкого і тривалого імунітету. Утворені антитіла не мають захисних властивостей. Клітинний імунітет не формується, фагоцитоз має незавершений характер: гонококи не тільки зберігаються в лейкоцитах, але й розмножуються і можуть переноситись в інші органи.

Лабораторна діагностика. Досліджуваний матеріал – виділення з уретри, піхви, шийки матки, сеча; при бленореї – гній із кон’юнктиви ока . Основний метод діагностики – мікроскопічний. Мазки забарвлюють за Грамом  і метиленовою синькою. Виявлення при мікроскопії бобовоподібних диплококів всередині лейкоцитів дає змогу поставити діагноз гонореї. Значно рідше проводять виділення чистої культури та її ідентифікацію. При хронічному перебігу захворювання використовують РЗК або реакцію непрямої гемаглютинації.

Профілактика і лікування. Попереджувальні заходи полягають у проведенні санітарно-освітньої роботи серед населення, своєчасному виявленні й лікуванні хворих. Для індивідуальної профілактики після випадкових статевих контактів використовують 0,05 % розчин хлоргексидину. Із метою попередження бленореї всім новонародженим закапують в очі розчин пеніциліну або нітрату срібла. Вакцинопрофілактика не проводиться. Лікують гонорею пеніциліном і сульфаніламідними препаратами. При хронічних формах із лікувальною метою застосовують гонококову убиту вакцину.

 

Менінгококи (Neisseria meningitidis)

Збудник епідемічного гнійного цереброспінального менінгіту вперше описав і виділив у чистій культурі А. Вейксельбаум у 1887 р.

Морфологія і фізіологія. Клітини менінгококів мають бобовоподібну форму або вигляд кавових зерен, розташовуються як диплококи, спор і джгутиків не утворюють, в організмі мають ніжні капсули. За морфологією подібні до гонококів. У мазках із спинномозкової рідини розташовані переважно всередині лейкоцитів (Рис. 30).

Рис. 30. Менінгококи у мазках із спинномозкової рідини.

 

У менінгококів є фімбрії, за допомогою яких вони здійснюють адгезію до клітин слизової оболонки верхніх дихальних шляхів.

Менінгококи – аероби і факультативні анаероби – дуже вибагливі до живильних середовищ, до яких додають кров або сироватку. Оптимум культивування при 37 °С, краще в атмосфері 5-8 % СО2. На щільному середовищі утворюють ніжні прозорі безбарвні колонії слизової консистенції (Рис. 31), на рідкому – помутніння й осад на дні, з часом на поверхні виникає плівка.

Рис. 31. Ріст менінгококів на кров‘яному агарі.

Біохімічна активність менінгококів виражена слабо, вони ферментують лише глюкозу і мальтозу до кислоти.

Справжнього екзотоксину нейсерії менінгіту не виділяють, їх ендотоксин термостійкий і високотоксичний. Від нього значною мірою залежить тяжкість клінічного перебігу менінгококової інфекції. Фактором патогенності є капсула, фімбрії, гіалуронідаза, нейрамінідаза та білок зовнішньої мембрани.

Антигени і класифікація. За полісахаридним капсульним антигеном менінгококи поділені на 9 серологічних груп, які позначаються великими латинськими літерами (А, В, С, D, X, Y, Z, W-135, E-29). До недавнього часу в нашій країні домінували менінгококи груп А і В, причому перші частіше викликали епідемічні спалахи менінгококової інфекції. Тепер зустрічаються й інші серологічні групи.

Екологія. Основним біотопом менінгококів в організмі є слизова оболонка носоглотки хворих і носіїв. Саме вони є джерелом менінгококової інфекції. Передача відбувається повітряно-краплинним способом при значних скупченнях людей (казарми, навчальні заклади, дитячі садки), де можливі тісні й тривалі контакти. Потрапляючи у зовнішнє середовище, менінгококи швидко гинуть. Відомі дезинфікуючі розчини вбивають їх за кілька хвилин. Дуже чутливі вони до пеніциліну, еритроміцину, тетрацикліну.

Захворювання людини. Хворіють частіше діти 1-8 років. Місцем первинної локалізації збудника є носоглотка. Звідси менінгококи проникають у лімфатичні судини і кров. Розвивається або локальна (назофарингіт), або генералізована форма інфекції (менінгіт, менінгококемія, менінгоенцефаліт, ендокардит, артрит тощо (Рис. 33, 34, 35).

Рис. 33. Клінічні прояви менінгококової інфекції.

 

Рис. 34. Клінічні прояви менінгоенцефаліту.

Рис. 35. Геморагічна висипка при гострій менінгокоцемії

 

При масовому розпаді мікробних клітин звільняється ендотоксин, наступає токсинемія. Може виникнути ендотоксичний шок. Різні клінічні прояви захворювання залежать як від активності захисних сил організму, так і від вірулентності менінгококів. В останні роки почастішали випадки менінгококемії із важким перебігом. В оточенні хворого серед контактованих осіб дуже часто виникає бактеріоносійство.

Імунітет. Вроджений імунітет досить стійкий. Захворювання виникає в одного з 200 бактеріоносіїв. Після генералізованої форми менінгококової інфекції розвивається стійкий імунітет. Повторні випадки захворювання трапляються рідко. У процесі хвороби організм виробляє аглютиніни, преципітини, комплементзв’язуючі антитіла.

Лабораторна діагностика. Для діагностики назофарингітів і виявлення бактеріоносійства досліджують слиз із носоглотки , менінгіту – ліквор , при підозрі на менінгококемію й інші форми генералізованої інфекції – кров. Проби з матеріалом оберігають від охолодження і досліджують негайно. З осаду спинномозкової рідини й крові виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом  і метиленовою синькою

Чисту культуру менінгококів виділяють на сироваткових середовищах і визначають серогрупу. Останнім часом у лабораторну практику впроваджені імунологічні методи експрес-діагностики з виявлення менінгококового антигена в лікворі за допомогою імунофлюресенції, реакції ензиммічених антитіл тощо.

Профілактика і лікування. Загальні профілактичні заходи зводяться до ранньої діагностики, госпіталізації хворих, санації бактеріоносіїв, карантину в дитячих закладах. З метою специфічної профілактики в період епідемічних спалахів менінгококової інфекції застосовують хімічну вакцину з полісахаридних антигенів серогруп А, В і С. Щеплення проводять дітям 1-7 років. Для лікування використовують пеніцилін, рифампіцин, левоміцетин та сульфаніламідні препарати, особливо сульфамонометоксин.

РОДИНА ENTEROBACTERIACEAE

До родини Enterobacteriaceae входять 14 родів: Salmonella, Shigella та ін. Бактерії цієї родини — це грамнегативні палички 0,3— 1 мкм завширшки й 1—6 мкм завдовжки. Вони не утворюють спор, не мають оксидази, відновлюють нітрати в нітрити, ферментують глю­козу з утворенням або без утворення газу, рухливі (перитрихи) або нерухомі, добре ростуть на звичайних середовищах, факультативні анаероби.

Одні види бактерій постійно живуть у кишках людини (Е. соlі), інші — тільки частково або під час захворювання.

Ферментативна здатність у них різна: Е. соїі відрізняється від сальмонел черевного тифу, паратифів А, В та інших бактерій цієї родини   більш   вираженою   біохімічною   активністю.

Деякі види бактерій мають фімбрії, за допомогою яких вони при­кріплюються до рецепторів клітин хазяїна. Багато сероварів ентеро-бактерій продукують бактеріоцини (коліцини та ін.), що виконують селективну роль в екологічному балансі. Вважають, що вони беруть участь у формуванні бактеріального ценозу кишок.

Імунітет при ентеробактеріальних інфекціях антиінфекційний (гу­моральний  і  клітинний).

Диференціацію кишково-тифозно-паратифозних і дизентерійних бактерій здійснюють за такими ознаками: рухливістю, ферментацією вуглеводів, амінокислотним метаболізмом, утворенням індолу і сір­ководню, а також за антигенними властивостями, що виявляються в серологічних реакціях із наперед відомими видоспецифічними, групоспецифічними і типоспецифічними аглютинуючими сироватками.

Нижче докладніше розглядаються деякі представники родів Sal­monella, Shigella, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Yersinia, які мають найбільше значення для медичної мікробіології.

Токсиноутворення грамнегативних бактерій

Ендотоксини – складні ліпополісахаридні комплекси, які утворюються клітинними  стінками бактерій і виділяются при лізісі мікробів. Це термостабільні речовини загальною малекулярною масою від 100000 до 900000. Ліпополісахариди можуть бути екстраговані з бактерій сумішшю фенол-вода. Вони складаються з трьох фрагментів:

– комбінації олігосахаридів, які повторюються  (маноза-рамноза-галактоза) і є типоспецифічнми гаптенними детермінантами;

– N-ацетилглюкозамін, глюкоза, галактоза, гептоза (однакові у всіх грамнегативних бактерій);

– основа з гептоз і фосфатних  груп, які чергуються, зв’язаніз ліпідом.

Дія всіх  ендотоксинів незалежить від їх походження.

Введення ендотоксину тваринам або людям призводить до розвитку явищ, пов’язаних із захватом його ретикулоендотеліальними і ендотеліальними клітинами  клітинами, наступної деградації або нейтралізації. В клінічних експериментах відмічено такі найбільш виражені зміни:

 

– гарячка ( через 60-90 хвилин після введення токсину);

– лейкопенія (пізніше розвивається лейкоцитоз);

– гіпотонія;

– порушення кровопостачання органів і ацидоз;

– активація С3-фракції та системи комплементу (за рахунок цього прискорюється продукція анафілотоксинів, хемотаксис, пошкодження мембран);

– дисемінована внутрішньосудинна коагуляція (активація ХІІ фактора – фактора Хагемана) – приклеювання тромбоцитів до ендотелія судин і закупорка дрібних кровоносних судин, що в свою чергу спричиняє  розвиток  ішемічного та геморагічного некрозу в різних органах;

– смерть (через виражений розлад функцій органів, шок, ДВК.

                         

При введенні ендотоксину розвиваються різноманітні прояви імунологічних реакцій у вигляді гіперергічних реакцій прискореного та сповільненого типів, імунологічної толерантності (IgM можуть попереджати розвиток ДВК), утворення антитіл (вини захищають людину від шоку і смертельного наслідку при бактеріємії, що викликаються грамнегативними бактеріями

Ешеріхії (РІД ESCHERICHIA)

Представники цього роду – обширна група мікроорганізмів, що складаються з близьких за біологічними властивостями мікроорганізмів. Об’єднує лактозопозитивні та лактозонегативні різновидності, в тому числі й безгазові.

Природне місце знаходження – вміст товстого кишечника людей, савців, більшості птахів, багатьох плазунів, риб, комах. З випорожненнями вони попадають в оточуюче середовище (грунт, вода, овочі, фрукти), де легко призвичаюются  до нових умов існування.

Історія відкриття. T. Escherich – педіатр, професор клініки дитячих хвороб в Граце, шукав збудник “дитячої холери”, що панувала в місті. В 1895 р. з фекалій хворого немовля виділив бактерії, запідозрив їх як збудник дитячої діареї. Невдозі подібні мікроорганізми було знайдено у калі здорових дітей, а потім – в кишечнику людей різного віку. Їх було названо Bacterium coli cоmmunae. На початку століття виявилось, що це не одна різновидність, а група бактерій.

 

Ешерихії викликають кишкові інфекції та парентеральні форми ешерихіозів, які перебігають як менінгіт, сепсис,  енцефаліт, множиннй неврит, пієліт, пієлонефрит, цистит, холецистит, перитоніт, апендицит, панкреатит, пневмонія, бронхіальна астма, назофарингіт, отит, кон’юнктивіт, офтальміт, тиреоїдит, виділяють при отітах, з ран.

Ешерихіозна інфекція характеризується поліморфізмом клінічної картини, що пов’язано не тільки  з особливостями організму хворого, але біологічними валстивостями збудника. В цьому плані особливий інтерес представляють генетичні детермінанти  – плазміди, яким притаманна передача не тільки в межах одного виду, але й серед інших родів бактерій.

Морфологія.Ешерихії – дрібні і середні, рухомі і нерухомі, грамнегативні, неспороносні палички, деколи мають капсулу, добре ростуть на простих твердих і рідких поживних середовищах.

 

E. coli

 

Культуральні властивості.На твердому середовищі утворюють  опуклі, середньої величини, блискучі, круглі, прозорі і непрозорі колонії з рівними краями (S-, гладенька форма).

Колонії E. coli

 

В рідких середовищах ростуть  дифузно або дають осад або плівку на поверхні, кільце на стінці.

На селективно-диференціальних середовищах типу Ендо – червоні з металевим блиском,  Левіна – сині, Плоскирєва – червоні.

Ріст E. coli на середовищі Ендо

 

Ріст E. coli на середовищі Левіна

 

E. coli ферментують вуглеводи з газоутворенням, не ферментують адоніт, інозит, не утворюють сірководень на середовищах з FeCl₃, не утілізують цитрат, не мають фенілаланіндезаміназної активності, не продукують уреази, желатинази, негативні в реакції Фогес-Проскауера, продукують лізиндекарбоксилазу.

 

                          Ферментативні властивості ешеріхій і тифозно-паратифозних бактерій

 

Примітка: «к» – розкладання цукру з виділення кислоти; «г» –  розкладання цукру з виділенням газу

   Антигени. Антигенна структура кишкових паличок дуже складна. Описано антигени О, R, K, (L, B, A), H, M, CFA/1, f⁺,  a, b  та інші. Структурно ці антигени розміщено неоднозначно: О-атигеннийкомплекс – в оболонці; рібосомні – в середині цитоплазми; f⁺ – фімбріальні; К – в оболонці або за її межами; a, b – подібні до еритроцитарних антигенів.

За хімічним складом О-антигени  ешерихій поділено на хемотипи.  Деякі антигени – спільні  для ешерихій та сальмонел (1-8, Х-ХІІІ), клебсієл, шигел, інші – специфічні.

За морфологічними, ферментними, культуральними властивостями патогенні та непатогенні ешерихії не диференціюються. Тому надзвичайно актуальним є пошук в матеріалі патогенних ешерихій. Для цього використовуються орієнтовна реакція аглютинації.

 

Орієнтовна реакція аглютинації

 

Реакція аглютинації в пробірках

 

При ешерихіозній інфекції, напевно, найбільше патогенентичне значення має система захисту, пов’язана з К-антигенами і коліцинами; фактори колонізації (адгезії), зумовлені фімбріями; наявність у ешерихій власних агресивних речовин – токсинів, гемолізинів, які контролюються плазмідами  Ent, Hly; фактори активного захисту, детерміновані R-плазмідами. Всі детермінанти, які контролюють певні власивості ешерихій та їх здатність до внутрішньоепітеліального розмноження, корелюють з вірулентністю E. Coli і певним патогенезом захворювання, тому їх вважають і факторами патогенності.

 

Сальмонельози (РІД  SALMONELLA)

Історія відкриття. Родова назва була дана J. Lignieres в 1900 р. на честь американця D. Salmon, який в 1885 р. описав B. suipestifer (тепер S. cholerae-suis), і якого вважали збудником чуми свиней (зараз доказали, що вона супутник віруса. Першим доказав бактеріальну етіологію сальмонельозів A.  Gärtner, який в 1888 р. під час спалаху ентериту у Франкенхаузені виділив з м’яса забитої корови і померлої людини ідентичні бактерії S. enteritidis.  В 1880 р. C. Eberth описав збудника черевного тифу при мікроскопічному дослідженні селезінки та інших внутрішніх органів людей, що померли від черевного тифу.

В 1884 р. учень Р. Коха  G. Gaffky виділив в чистій культурі   S. typhi. В 1892 р. Löffler  від мишей під час епізоотії в пітомнику Грейсвальдського університету виділив  S. typhimurium. В 1896 р. Achard, Bensaund, а в 1898  Schottmüller  описали S. paratyphi B; в 1898 р. Gwyn, Kayser – S. paratyphi A, потім  S. paratyphi C.

Зараз ця група мікроорганізмів надзвичайно обширна. В назвах мікроорганізмів відбито назви хвороб людей або тварин (S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. enteritidis, S. abortus-bovis, S. abortus-equi, S. cholerae-suis, S .typhimurium), країн (S. brasil, S. canada, S. congo), міст (S. aberden, S. hamburg, S. moscow, S. dar-es-salam), кварталів міст (S. amager), вулиць, де знаходився інститут, що виділив сальмонели (S. kuessel, S. sterrenbos), вулиць, де жив хворий (S. irenea), шпиталів (S. blegdam, S. virchow), прізвища осіб, що її описали (S. arechavaeeta, S. morehead), зоологічні назви тварин (S. fulica, S. cairina), матеріал, з якого виділено  (S. aqua, S. os),  назви річок (S. humber, S. mendosa), гір, долин (S. carmel, S. emek, S. shubra), комбінації складів,  літер [S. anfo (animal food), S. ceyco (ceylonese coconut0, S. chinovum (chinese ovum), S. ank (adress not known)],  прізвища композиторів і лібретистів (з свіжезаморожених яєць виділено S. sullivan i S. gilbert), описано S. charity (милосердя), S. verity (істина), S. patience (терпіння). Щорічно список поповнюється 50 новими назвами.

 

Черевиний тиф і паратифи

 

Черевний тиф і паратифи – гострі інфекційні захворювання, які супроводжуються бактеріємією, тривалою постійною гарячкою, ураженням лімфатичних утворів кишечника, вираженою інтоксикацією, мають фекально-оральний механізм передачі. Збудниками черевного тифу є Salmonella typhi, паратифу А – S. paratyphi A,  паратифу В – S. schottmuelleri, паратифу С – S. paratyphi C. Черевний тиф і паратиф А – типовові антропонози, збудники паратифів В і С окрім людини можуть ще викликати захворювання тварин і птахів. Всі названі бактерії належать до роду Salmonella, родини Enterobacteriaceaе. Хворі або бактеріоносії виділяють збудників з випорожненнями, сечею і слиною. За клінічною картиною розрізнити черевний тиф і паратифи практично неможливо. Остаточний клінічний діагноз можна встановити лише після виділення та ідентифікації збудника.

Взяття матеріалу для дослідження. Важливе значення для успішного проведення лабораторної діагностики черевного тифу і паратифів має правильний і своєчасний забір досліджуваного матеріалу в залежності від фази патогенезу і строків черевнотифозного захворювання. Мікробіологічні дослідження при паратифах проводять так само, як і при черевному тифі. Досліджуваний матеріал для виділення чистої культури збудника по можливості слід брати до початку антибіотикотерапії. Найчастіше беруть кров, кістковий мозок, дуоденальний вміст (жовч), ексудат із розеол, випорожнення, сечу, гній, спинномозкову рідину, секційний матеріал при летальних випадках.

 

Бактеріологічні методи дослідження

 

 Для ранньої діагностики черевного тифу і паратифів найефективнішим є виділення збудника з крові й кісткового мозку, в меншій мірі з жовчі, сечі, випорожнень та інших досліджуваних матеріалів. Висів паличок черевного тифу і паратифів із кров‘яного русла чи кісткового мозку має абсолютну, 100 % діагностичну цінність.

Метод гемокультури. Ретельно дотримуючись правил асептики кров хворого в кількості 10 мл беруть за допомогою шприца із ліктьової вени в ранні строки (починаючи з перших годин захворювання) й біля ліжка хворого сіють у флакон із 100 мл жовчного бульйону або середовища Рапопорт (10 % жовчний бульйон із 2 % глюкози, 1 % індикатора Андраде; перед стерилізацією в середовище вміщають скляний поплавок для уловлювання газу).

 В разі неможливого посіву крові біля ліжка хворого її доставляють до лабораторії в пробірці. Сироватку відділяють від згустка і використовують для серологічного дослідження. Згусток ретельно подрібнюють і засівають на ті ж самі середовища у співвідношенні 1:10. Таке розведення необхідне для усунення бактерицидних властивостей крові. У більш пізні періоди хвороби при наявності гарячки треба брати 15-20 мл крові й сіяти на 150-200 мл живильного середовища. Жовчні середовища є елективними для збудників черевного тифу і паратифів. У маленьких дітей кров для посіву беруть із мочки вуха, п‘ятки або пальця і в меншій кількості.

Засіяні флакони інкубують при 37 ⁰С. На другий день вивчають характер росту. При відсутності росту флакони залишають у термостаті до 10 днів, а при підозрінні на L–форми – до 3-4 тижнів. Наступні висіви на диференціальні середовища роблять через 48 і 72 год, на 5 та 10 добу.

Сальмонели черевного тифу викликають почервоніння бульйону Рапопорт внаслідок ферментації глюкози до кислоти, а збудники паратифів ще й газ, який накопичується у поплавку. Культуру, що виросла у флаконі, висівають на трицукрове середовище Олькеницького та Ендо (Плоскірєва, Левіна, вісмут-сульфіт-агар). Якщо культура чиста (при мікроскопії грамнегативні палички), далі працюють лише з середовищем Олькеницького.

Посіви лише на Ендо (або інші елективні середовища) досліджують у тих випадках, коли на агарі Олькеницького виростає не чиста культура, що трапляється рідко. В такому разі типові ізольовані колонії пересівають на середовище Олькеницького (або скошений МПА), отримують чисту культуру й ідентифікують її. Колонії всії трьох збудників на середовищах Ендо, Левіна і Плоскірєва безбарвні, ніжні, прозорі, на вісмут-сульфітному агарі – чорного кольору.

 

Метод мієлокультури. У фазі перенхіматозної дифузії збудники черевного тифу і паратифів можна виділити з кісткового мозку. Методика стернальної пункції безпечна для хворого, вона розширила можливості бактеріологічної діагностики цих захворювань. Місце пункції обробляють спиртом, знеболюють новокаїном. Для забору матеріалу використовують голку Біра з рухливою муфтою, що дозволяє регулювати глибину проникнення голки. Після проколу за допомогою шприца відсмоктують 0,3-0,5 мл пунктату з грудної кістки і сіють у 5-10 мл жовчного бульйону або середовища Рапопорт. Виділення чистої мієлокультури проводять так само, як і при посіві крові. Метод мієлокультури дає позитивні результати частіше ніж метод гемокультури. Його особливо рекомендують застосовувати при легких і стертих клінічних формах захворювань.

Метод білікультури. Для бактеріологічного дослідження жовчі проводять дуоденальне зондування. Спочатку через тонкий зонд вводять у дванадцяти палу кишку 30-40 мл 25 % розчину сірчанокислої магнезії. До лабораторії доставляють пробірки з двома або трьома порціями жовчі (А і В, або А, В, С). Кожну з порцій можна сіяти окремо або ж суміш усіх трьох разом у кількості 5-10 мл засівають у флакони з 50-100 мл селенітового бульйону чи середовища Рапопорт. Кислий дуоденальний вміст, білуватий його відтінок та наявність пластівців роблять матеріал непридатним для бактеріологічного дослідження. Посіви інкубують при 37 ⁰С протягом 18-20 год, виділяють та ідентифікують чисті культури. Метод заслуговує особливої рекомендації для виявлення бактеріоносіїв та встановлення формування стійкого бактеріоносійства у реконвалесцентів.

Метод розеолокультури використовують у випадках невиразного перебігу хвороби, коли методи гемо- та білікультури не дали позитивних результатів а на шкірі хворого є типова висипка. Шкіру в місці локалізації розеоли протирають спиртом, гострим скальпелем скарифікують розеол до появи крапельок лімфи. Стерильною піпеткою на них наносять кілька крапель жовчного бульйону, змішують і швидко втягують суміш у пастерівську піпетку. Посів роблять біля ліжка хворого у 50 мл селенітового або жовчного бульйону. При необхідності доставляти матеріал до лабораторії кінець піпетки запаюють на вогні.

Метод урінокультури застосовують переважно для діагностики бактеріоносійства у реконвалесцентів. Найчастіше бактерії в сечі виявляють на 3-4 тижні хвороби. Після ретельного туалету зовнішніх статевих органів сечу краще брати за допомогою катетера в стерильний посуд. У лабораторії 30-50 мл сечі центрифугують і осад сіють в середовище збагачення (селенітове, Мюллера, Кауфмана), а також на 1-2 чашки з середовищем Ендо (Плоскірєва, вісмут-сульфіт-агар). Виділення й ідентифікацію проводять так само, як і при дослідженні інших матеріалів.

Метод копрокультури для діагностики захворювання використовують рідко так як бактерії в фекаліях появляються пізно. Частіше його застосовують для обслідування реконвалесцентів на бактеріоносійство та здорових осіб, які поступають на роботу і працюють в системі громадського харчування, водопостачання та дитячих закладах. Матеріал у хворих і реконвалесцентів беруть без дачі проносного. Здоровим особам за 3-4 год до забору матеріалу дають 30 г магнезіальної солі. Пробу відбирають з рідкої частини фекалій. При патологічних домішках у випорожненнях (слиз, гній, кров) їх включають до взятого матеріалу. Проби фекалій в кількості 5-10 г набирають дерев‘яним шпателем у спеціальні стандартні стерильні пластмасові патрони одноразового використання або скляні широкогорлі баночки. На них наклеюють етикетку де вказують дату забору, прізвище та ініціали хворого і мету дослідження. Краще всього посів зробити біля ліжка хворого. При неможливості швидко доставити матеріал до лабораторії його вносять у консервант у співвідношенні 1 : 3. Найчастіше для цього використовують рідину, що містить 30 % стерильний розчин гліцерину у фосфатному буфері.

У бактеріологічній лабораторії фекалії сіють одночасно двома способами – прямим на елективне середовище (вісмут-сульфат-агар, Плоскірєва, Ендо, Левіна) і на одно із середовищ збагачення (селенітове, Мюллера, Кауфмана). Вибір середовищ проводить бактеріолог.

При прямому висіві на відповідне щільне середовище невелику кількість випорожнень розміщують у пентонній воді або у 0,85 % розчині хлориду натрію і залишають на 30 хв для осідання крупних частинок. Із поверхні рідини беруть краплю матеріалу і засівають у чашки з елективним середовищем.

Посів на середовище збагачення (в ньому сальмонели розмножуються краще і швидше ніж супутня мікрофлора) одночасно з прямим посівом є обов’язковим при дослідженні здорових людей на бактеріоносійство, оскільки вони виділяють невелику кількість бактерій. Однак, у зв‘язку з широким вживанням населенням різноманітних антибіотиків, необхідно використовувати середовища збагачення і при посівах випорожнень від хворих, особливо при епідемічних показаннях.

При посіві на середовища збагачення шматочок фекалій емульгують у 10 мл цього ж середовища. Наступний висів із нього на щільне елективне середовище доцільно робити вже через 5-6 год підрощування в термостаті.

Спинномозкову рідину досліджують при наявності менінгеальних і менінгоенцефалітичних синдромів. Посіви гною, ексудату, мокротиння, грудного молока породіль проводять у такому ж порядку, як описано вище. При дослідженні секційного матеріалу сіють кров із серця, шматочки паренхіматозних органів, вміст тонкого кишечника. В лабораторії матеріал розтирають у ступках із стерильним піском, переводять у рідку фазу і досліджують так само, як і випорожнення.

Дослідження води на виявлення тифозних і паратифозних мікробів проводять при розслідуванні водних спалахів захворювань та інших епідеміологічних показаннях. Оскільки збудники у воді знаходяться у невеликій кількості, для їх надійнішого виявлення застосовують методи, які дозволяють концентрувати бактерії з досліджуваного об’єму води. Найкраще це можна зробити за допомогою мембранних фільтрів. Для цього 2-3 л води пропускають через фільтри № 2 (або № 3). Фільтри з адсорбованими на них бактеріями опускають у селенітовий бульйон або накладають на вісмут-сульфітний агар. Через 8-10 год інкубування в термостаті роблять висів із селенітового бульйону на одне з диференціальних щільних середовищ з метою отримання ізольованих колоній і наступного виділення чистих культур. Із поверхні фільтрів на вісмут- сульфіт-агарі після 24-48 год вирощування в термостаті пересівають колонії чорного кольору на середовище Олькеницького й ідентифікують виділені культури.

Якщо виявити збудників черевного тифу і паратифів не вдається, можна досліджувати воду на наявність відповідних бактеріофагів. Для цього воду спочатку фільтрують через фільтр і 1-2 мл фільтрату вносять у стерильну чашку Петрі, заливають 15 мл розтопленого і охолодженого до 45-50 ⁰С МПА, ретельно переміщують. На поверхню застиглого агару засівають секторами культури збудників черевного тифу і паратифів. Поява негативних колоній свідчить про присутність відповідного фагу.

Ідентифікація чистих культур. Виділенні культури ідентифікують за морфологічними, культуральними, біохімічними властивостями, антигенною структурою та фаголізабельністю. При мікроскопії мазків, забарвлених за Грамом, черевнотифозні і паратифозні бактерії мають вигляд паличок червоного кольору із заокругленими кінцями розміром 0,5-0,8 ´ 1-3 мкм, активно рухливі у висячій чи надавленій краплі.

Ріст у МПБ супроводжується помутнінням. На МПА виростають ніжні, круглі, гладенькі, прозорі або напівпрозорі колонії розміром 2-4 мм. Однак колонії тифозних мікробів, що мають Vi-антиген, каламутні. У S. paratyphi B колонії грубіші, через кілька днів по периферії колоній утворюються слизовий валик.

На середовищах Ендо, Левіна, Плоскірєва колонії безбарвні, прозорі, часом рожевуваті (Ендо) або злегка голубуваті (Левіна). На вісмут-сульфітному агарі черевнотифозні мікроби утворюють колонії чорного кольору, іноді зі світлим обідком. Паратифозні бактерії на цьому середовищі можуть утворювати коричневі або зеленуваті колонії. Після зняття колонії на середовищі залишається чорний слід.

На середовищі Олькеницького тифозна паличка розкладає глюкозу до кислоти (жовтіє стовпчик агару), не ферментує лактозу і сахарозу (забарвлення скошеної частини не змінюється), виділяє сірководень (почорніння на межі стовпчика і скошеної частини). Паратифозні бактерії ферментують глюкозу до кислоти і газу (пожовтіння та розриви стовпчика агару).

Біохімічні ознаки тифозно-паратифозних мікробів вивчають при посіві на середовища “строкатого” ряду Гісса

Коринебактерії. Мікробіологічна діагностика дифтерії.

Мікобактерії. Лабораторна  діагностика туберкульозу.

 

КОРИНЕБАКТЕРІЇ

До роду Corynebacterium належать грампозитивні бактерії з булавоподібним стовщенням на кінцях; вони поділяються на види, пато­генні для людини і тварин, патогенні для рослин і непатогенні.

До патогенних видів коринебактерій належить збудник дифтерії. Раніше дифтерія була грізним захворюванням у дітей, яке часто при­зводило до летального кінця. Завдяки запровадженню обов’язкової імунізації проти цієї інфекції захворюваність на дифтерію тепер зни­зилась до поодиноких випадків і летальний кінець спостерігається дуже   рідко.

Дифтері́я — гостре антропонозне інфекційне захворювання з крапельним механізмом передавання збудника, що характеризується ураженням ротоголотки та дихальних шляхів, рідше шкіри, з розвитком фібринозного (дифтеритичного) запалення в місці проникнення збудника, а також токсичним ураженням серцево-судинної й нервової систем, а також нирок.

Згадки про захворювання, що нагадує дифтерію, зустрічаються ще в працях Гіппократа в V–IV столітті до нашої ери. Захворювання в подальшому описане під назвою «сирійської хвороби», «єгипетської хвороби», «задушливої хвороби» і т. д. Відомі великі епідемії дифтерії (наприклад, у XVII столітті в Європі) — в Іспанії хвороба стала відома як El garatillo («душитель»), в Італії та Сицилії, як «хвороба горла» (італ. la malattia gola). Французький лікар П. Бретонну описав у 1820–1860 рр. різні клінічні форми «смертельної виразки глотки», він же запропонував назву хвороби — «дифтерит», але його учень А. Труссо пізніше замінив «дифтерит» терміном, яким ми користуємося і натепер — «дифтерія». Збудника дифтерії вперше виявив у 1883 р. Е. Клебс. У 1884 р. Ф. Льоффлер (русифікована неправильна вимова — Леффлер) виділив чисту культуру збудника, а у 1894 р. Е. Беринг запропонував для лікування хворих антитоксичну протидифтерійну сироватку (ПДС). У 1923 р. Г. Рамон одержав дифтерійний анатоксин, який стали застосовувати для планової вакцинації проти дифтерії.

Збудник Corynebacterium diphtheriae належить до роду Corynebacterium, сімейства Corynebacteriaceae, є аеробом, не утворює спор і капсул. Морфологічно являє собою грампозитивну паличку із потовщеннями на кінцях (булавовидна форма через тільця Бабеша-Ернста). У мазках дифтерійні палички розташовані під кутом одна до одної подібно до латинської літери V. Завдяки таким характерним морфологічним властивостям вони й отримали свою назву (грец. korýne (κορινε) — вузловий стрижень, булава).

За своїми біологічними властивостями коринебактерії дифтерії поділяють на три біовари: mitis (40 сероварів), gravis (14 сероварів) й близький до нього intermedius (4 серовари). Кожен з цих варіантів має токсигенні і нетоксигенні штами, нетоксигенні штами захворювання не спричиняють, але за певних умов можуть трансформуватися в токсигенні. Синтез токсину детермінований геном tox+.

Основний фактор патогенності збудника — екзотоксин. Дифтерійний токсин має всі властивості екзотоксинів: виражена тропність до клітин-мішеней (в даному випадку до слизових оболонок, міокарду, нервової системи, трохи менша — до нирок), термолабільність, здатність стимулювати специфічну імунну відповідь й нейтралізуватися антитоксичною сироваткою. Є одним з самих сильних токсинів у природі, поступається лише ботулінічному і правцевому токсинам. Складається з двох фракцій (А і В), фракція В (термостабільна) сприяє зв’язуванню токсину з рецептором і проникненню фракції А в тканини. В свою чергу фракція А (термолабільна) забезпечує цитотоксичний ефект.

Дифтерійний мікроб стійкий в навколишньому середовищі — у дифтерійних плівках, на предметах побуту, в трупах зберігається близько двох тижнів, у воді — до трьох тижнів, але майже миттєво гине при кип’ятінні й протягом 2-3-х хвилин під дією звичайних дезінфікуючих засобів. Дуже рідко збудниками дифтерії можуть бути Corynebacterium pseudodiphtheriticum, hoffmanii, xerosis, яких об’єднують у понятті «дифтероїди».

Джерелом інфекції при дифтерії є хворі на будь-яку клінічну форму, а також бактеріоносії.

Основний механізм передавання — повітряно-крапельний, рідше може реалізуватися й контактний (наприклад, при дифтерії шкіри). Бактеріовиділення у хворого починається з кінця інкубаційного періоду й триває до повної санації ротоглотки, у деяких випадках може формуватися вторинне носійство. При спалахах дифтерії первинними носіями можуть бути до 10% зовнішньо здорових людей. Перебіг хвороби та пов’язаний з цим механізм передачі залежить від географічного регіону. В країнах помірного клімату переважно відбуваються дифтерійні ураження дихальних шляхів з повітряно-крапельним механізмом передачі інфекції, в країнах субтропічного і тропічного поясів — переважно дифтерія шкіри та контактний механізм її передавання від хворого до здорового (так звана «повзуча виразка джунглів»).

Сприйнятливість до дифтерійної інфекції залежить від напруженості антитоксичного імунітету, індекс контагіозності коливається від 10 до 15%. Сезонність — осінньо-зимова, імунітет стійкий антитоксичний, а не антибактеріальний, можливі повторні захворювання, а також виникнення інфекції у вакцинованих осіб, в обох випадках перебіг захворювання, як правило, легкий.

Дифтерійний екзотоксин — це первинний фактор, що спричиняє різні патологічні зміни у організмі людини, бактеріємія цьому захворюванню не притаманна. Тяжкий перебіг дифтерії виникає лише за відсутності або при низьких титрах антитоксичних антитіл. У місці проникнення і розмноження збудника під дією дифтерійного токсину й інших додаткових факторів ушкодження (гіалуронідаза, нейрамінідаза тощо) виникає місцева запальна реакція. Частіше пошкоджується слизова оболонка піднебінних мигдаликів. Перші прояви — набряк і/або катаральне запалення, при цьому нейрамінідаза, що є в збудника, знижує больову чутливість.

У подальшому токсин проникає в клітини слизової оболонки, де утворює вогнища місцевого некрозу. Надалі завдяки дії тромбокінази активується перехід фібриногену у фібрин, завдяки чому утворюються такі характерні фібринозні плівки. У місцях, що вкриті багатошаровим плоским епітелієм (мигдалики, ротоглотка, ніс, статеві органи, очі) фібринозна плівка пронизує всю товщу слизової оболонки й міцно з нею пов’язана, при цьому патологічний процес може розповсюджуватися і далі, виходячи за межі мигдаликів. Таке нашарування визначають як дифтеритичний тип фібринозного запалення. Ці плівки дуже погано знімаються з поверхні, а завдяки інтенсивному всмоктуванню екзотоксину у таких випадках переважають виразні симптоми інтоксикації. Навпаки, у місцях, що вкриті одношаровим циліндричним епітелієм (гортань, трахея, бронхи) характерний розвиток так званого крупозного типу фібринозного запалення. Такі плівки нещільно спаяні та легко відшаровуються, інтоксикаційний синдром не виражений, але небезпека їх відриву та обтурації дихальних шляхів дуже велика; окрім цього, при потраплянні плівки, що відірвалась, на біфуркацію трахеї наступає миттєва смерть від зупинки серця. Інколи при дифтерії має місце активація вторинної мікрофлори — стрептококів, стафілококів та ін., що змінює й маскує місцеві клінічні прояви хвороби.

По лімфатичним шляхам, з місця утворення, екзотоксин та інші біологічно активні речовини просуваються вглибину тканин. Наслідком є збільшення регіонарних лімфовузлів, виникає токсичний лімфаденіт і набряк навколишніх тканин, що може поширюватися на підщелепну ділянку, шию та грудну клітку. Від моменту проникнення екзотоксину в кров до появи клінічних симптомів ураження органів — мішеней проходить латентний період. Тривалість його визначається переважно кількістю циркулюючого екзотоксину й біологічно-активних речовин.

При дифтерії можуть бути ушкодженими будь-які клітини організму, особливо при великій концентрації екзотоксину. Частіше за все ушкоджуються клітини-мішені: кардіоміоцити, олігодендрогліоцити, лімфоцити, ендотеліальні клітини артерій, тромбоцити, гранулоцити. Сам процес зв’язування екзотоксину з рецепторами перебігає в дві стадії: перша — зворотна, здійснюється за 8 —12 годин; друга — незворотна, завершується протягом 30-60 хвилин. Незворотна стадія фіксації дифтерійного екзотоксину завершується утворенням транспортної системи для А-фрагменту і проходженням його у цитоплазму клітини, що робить його недосяжним для дії ПДС. Встановлено значне зменшення синтезу білку в культурі клітин за наявності дифтерійного екзотоксину. Клітина зазнає енергетичний «голод». Наслідком є активація метаболізму вуглеводів, що супроводжується значною інтенсифікацією гліколізу (гліколітичний «вибух»). Міокард, на відміну від скелетних м’язів, має відносно малий потенціал активності ферментів гліколізу, цей механізм компенсації швидко виснажується.Гіпоксія, що розвивається, поглиблює специфічну дію дифтерійного екзотоксину.

Вказані процеси спостерігаються при дії дифтерійного екзотоксину на будь-яку клітину й обумовлюють ушкодження різних органів і систем. Виключенням є головний мозок, щитовидна залоза, а також хрящі, кістки, зв’язки, клітини яких характеризуються дуже низьким рівнем метаболізму. Це пов’язане з тим, що дифтерійний екзотоксин не проходить крізь їх захисні бар’єри.

Основними причинами смерті при дифтерії є ураження серця, асфіксія при дифтерії дихальних шляхів, синдром дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ-синдром) з розвитком гострої ниркової недостатності або гострого респіраторного дистрес-синдрому дорослих та приєднання вторинної бактеріальної флори.

Дифтерія ротоглотки

Субклінічний перебіг

Частіше проходить під діагнозом “носійство C. diphtheriae. Клінічні прояви, як місцеві, так й загальні практично відсутні. Біль в горлі не турбує. Самопочуття хворого не порушене. Ця клінічна форма може бути виявлена при призначенні відповідного бактеріологічного дослідження, що спостерігається при обстеженні спалахів захворювання.

Легкий перебіг

Характеризується незначним токсикозом: невеликою загальною слабкістю, температура тіла протягом всієї хвороби може залишатися нормальною або субфебрильною. Порушень гемодинаміки немає. Місцеві зміни — переважно катаральні, у деяких випадках — острівчасті, рідко — локалізована плівчаста форма дифтерії піднебінних мигдаликів і/або носоглотки. Набряк мигдаликів, язичка — помірний. Можуть збільшуватися підщелепні лімфатичні вузли. Біль в горлі відсутній або незначний. Ускладнення у вигляді міокардитуможе виникати і при таких формах у пізні терміни. Для такого міокардиту характерним є доброякісний перебіг.

Перебіг середньої тяжкості Дифтерія піднебінних мигдаликів, дифтерійний назофарингіт — найчастіша локалізація при цьому ступені тяжкості. Починається гостро, характерним є помірний токсикоз. Хворі скаржаться на загальну слабкість, розбитість, ломоту у тілі, головний біль. Температура тіла зазвичай сягає 38 —38,5 °C, але може залишатися і субфебрильною. Біль у горлі часто помірний, не займає ведучого місця серед скарг. При огляді виявляється блідість шкіри, незначний ціаноз губ і слизових оболонок; в ротоглотці — характерне фібринозне нашарування на мигдаликах, яке може розповсюджуватися на м’яке піднебіння, язичок та ін. (розповсюджена форма), а також на сусідні анатомічні області (комбінована форма). Процес може мати й однобічний характер. Пальпуються збільшені, дещо болючі підщелепні лімфовузли. Може з’явитися незначний набряк у підщелепній ділянці. Часто ускладнюється міокардитом і/або поліневритом. Іноді виявляється мононеврит у вигляді парезу м’якого піднебіння. Ці ускладнення носять переважно доброякісний характер і наслідків не залишають.

Тяжкий перебіг Може зустрічатися при локалізованих формах, але частіше — при розповсюджених і комбінованих. Характерним є гострий початок, висока температура в перші дні. В подальшому можливе її зниження до субфебрильної і/або навіть нормальної на тлі значного погіршення стану. Хворі скаржаться на головний біль, ломоту у м’язах і суглобах, утруднення дихання, безсоння, значну загальну слабкість, відсутністьапетиту і іноді блювання. Біль у горлі нерідко відступає на другий план. Хворого більше турбує відчуття «кома в горлі», утруднення ковтання. При загальному огляді звертає увагу виразна блідість шкіри, ціаноз губ, носогубного трикутника, нігтьових фаланг. При огляді мигдаликів і глотки спостерігається ціаноз, значно виражений набряк. Нерідко слизову детально оглянути не вдається, тому що вона покрита суцільним брудно-сірим плівчастим нальотом. Мигдалики змикаються, не дозволяючи оглянути глотку. При об’єктивному обстеженні хворого: глухість серцевих тонів, тахікардія, іноді — різні аритмія, брадикардія або навіть ембріокардія (через порушення провідності). Навіть за невеликого фізичного навантаження виникає задишка, яка поступово зникає у спокої. Часто з’являється набряк шиї різної розповсюдженості — від підщелепної ділянки до ключиць і нижче. Збільшені задньошийні та підщелепні лімфовузли. Пропальпувати чітко їх не завжди вдається через набряк підшкірної клітковини. Хвороба швидко прогресує. Знижується артеріальний тиск, задишка зберігається і в спокої. Майже завжди виявляється ранній міокардит з порушеннями провідності, серцевого ритму і проявами недостатності кровообігу. Поліневрит з′являється вже наприкінці першого тижня хвороби. Досить часто приєднується ураження нирок.

Гіпертоксичний перебіг Для нього характерні ті ж самі прояви, що і для тяжкої форми, але ці зміни розвиваються надзвичайно швидко. У хворого вже на 1 —3 добу від початку хвороби може наступити смерть від інфекційно-токсичного шоку (ІТШ). Особливістю є те, що місцеві прояви іноді значно відстають від загальнотоксичних. Це утруднює діагностику. На слизовій м’якого і твердого піднебіння можуть з’явитися геморагії. Тоді плівки набувають чорного кольору, що є грізною ознакою і свідчить про розвиток ДВЗ-синдрому. Варіантом гіпертоксичного перебігу є геморагічний варіант, що характеризується раннім розвитком ДВЗ-синдрому. Він проявляється геморагічним просочуванням фібринозних плівок, значним набряком шиї, геморагіями на шкірі та крововиливами у різні внутрішні органи.

Дифтерія гортані і трахеї

Ларинготрахеальна дифтерія (або дифтерійний круп) як самостійна форма у дорослих зустрічається досить рідко, зазвичай, у поєднанні з дифтерією мигдаликів та/або носоглотки. Буває у вигляді локалізованої форми (вражається лише гортань) і розповсюдженій (окрім гортані вражаються трахея і навіть бронхи). При ларинготрахеальній дифтерії загально-інтоксикаційний синдром виражений досить помірно завдяки слабкому всмоктуванню токсину. Тяжкість стану обумовлюється розвитком виразної гіпоксії внаслідок порушення прохідності дихальних шляхів, обтурації їх плівками. Чим нижче рівень патологічного процесу (бронхи і навіть бронхіоли), тим більше виражені ознаки гострої дихальної недостатності. Дифтерія гортані має більш легкий перебіг у дорослих, ніж у дітей. Це пов’язано з анатомічними особливостями дитячого віку. Тому класична тріада дифтерійного крупу характерна саме для дітей — осиплий голос, грубий гавкаючий кашель і голосне стенотичне дихання. Ці прояви можуть бути відсутні у дорослих.

Дифтерійний круп у своєму розвитку проходять послідовно 3 стадії:

·            I-а стадія — катаральна, коли при ларингоскопії виявляється лише набряк та ціаноз/гіперемія слизової оболонки. При цій стадії загальний стан хворого порушений мало — загальна слабкість, відсутність апетиту, температура тіла може залишатися нормальною або субфебрильною. Клінічні симптоми наростають поступово. За кілька годин з’являється вологий кашель, осиплість голосу, за добу кашель стає гавкаючим.

·            II-а стадія — стенотична. За 2 —3 доби при відсутності лікування круп переходить до наступної стадії — стенотичної. Виникає утруднення при вдиханні повітря. Дихання стає голосним. З’являється втягнення міжреберних проміжків. Голос афонічний, кашель — беззвучний. Хворі неспокійні, не знаходять собі місця у постелі. Наростає ціаноз губ, кінчика носа, пальців. Тони серця приглушені, наростає тахікардія. Артеріальний тиск може дещо знижатися. Тривалість цього періоду коливається від кількох годин до 2 —3 діб.

·            III-а стадія — асфіктична — характеризується наростаючими ознаками гострої дихальної недостатності. Дихання часте, поверхневе, аритмічне, наростає ціаноз. Хворі намагаються зайняти більш вигідне, зручне положення. Пульс частий, аритмічний, знижується артеріальний тиск. Від значної гіпоксії страждає перш за все ЦНС, що проявляється сплутаністю свідомості, потім її втратою, судомами і смертю.

В тому випадку, коли ушкоджене усе трахео-бронхіальне дерево, клінічні симптоми можуть наростати дуже швидко. З моменту появи перших ознак захворювання до смерті від асфіксії проходить від декількох годин до 2 —3 діб. Особливу загрозу представляє наявність плівок у трахеї. Рухливий неспокій хворого та кашель сприяють відторгненню плівок. «Сівши» на біфуркацію трахеї вини призведуть до раптової смерті.

Інші форми дифтерії

Дифтерія переднього відділу носу відноситься до досить рідких клінічних варіантів. За характером патологічного процесу її поділяють на:

·            катаральну форму;

·            катарально —виразкову форму;

·            плівчасту форму.

Дифтерія іншої локалізації — очей, шкіри, ран, поверхневих статевих органів майже завжди вторинна.

Комбінована форма дифтерії Найчастіше відбуваються такі комбінації: дифтерія мигдаликів + задньої стінки глотки (дифтерія ротоглотки); дифтерія мигдаликів + передніх відділів носа; дифтерія мигдаликів + гортані. Комбіновані форми оцінюються за тяжкістю на порядок вище, ніж локалізовані чи розповсюджені.

Найбільший ефект від введення ПДС спостерігається у перші три доби від початку хвороби. Хворим з легким або середньо-тяжким ступенем тяжкості введення ПДС здійснюється в/м. З тяжким або гіпертоксичним — переважно в/в введення ПДС на фізіологічному розчині з частотою крапель 8 —12 за 1 хвилину разом з глюкокортикостероїдами (ГКС). У разі необхідності повторне введення проводять через 8 —12 годин після першого. Це здійснюють в тому випадку, якщо відсутній антитоксичний ефект від першого введення. Слід використовувати сироватку іншої серії, а вводити її у тій самій дозі. Доцільність введення ПДС 3 рази і більше сумнівна. ПДС при в/м введенні циркулює в крові до 12 —14 діб. У разі адекватного вибору дози її цілком хватає, щоб нейтралізувати дію токсину. Слід пам’ятати, що токсин циркулює в крові до 12 годин. Токсиноутворення продовжується, доки зберігається місцевий патологічний процес. Повторні багатократні введення ПДС збільшують вірогідність виникнення алергічних реакцій. Незалежно від терміну поступлення хворого до стаціонару, ПДС вводиться за наявності змін на слизовій оболонці і з урахуванням ступеню тяжкості. При пізньому поступленні (у періоді реконвалесценції, коли токсикоз і місцеві зміни відсутні) ПДС не вводиться. ПДС має лише антитоксичну дію і не впливає на саму C. diphtheriae. Антитоксична специфічна терапія обов’язково поєднується з антибактеріальними засобами.

Етіотропна терапія

Найбільш ефективними препаратами при лікуванні дифтерії зарекомендували себе наступні:

·            бензилпеніцилін по 1 млн. ОД × 6 разів на добу в/м;

·            азитроміцин по 0,5 г × 1 раз на добу

·            кларитроміцин по 0,5 г × 2 рази на добу.

Курс лікування повинен тривати до ліквідації місцевого процесу, але не менше 5 —7 діб.

Патогенетична терапія

Направлена на зменшення загальноінтоксикаційних проявів, нормалізацію гомеостазу, роботи серцево-судинної системи і профілактику ускладнень. Жорстких схем патогенетичного лікування не існує. З метою стабілізації електролітного балансу і КОС в/в призначають переважно полійонні розчини — «Ацесоль», «Трисоль», 5% розчин глюкози та інші під контролем рівня електролітів крові. Гідратацію необхідно підтримувати на достатньому рівні — до 2500 мл/на добу. У разі розвитку міокардиту і/або ураженні нирок кількість рідини слід зменшити до 1000 —1500 мл/на добу. При тяжкому перебігу дифтерії патогенетично обґрунтованим є застосування інгібіторів протеаз — контрикала, гордокса, трасилола у загально-терапевтичних дозах. Призначають препарати, що покращують реологічні властивості крові і мікроциркуляцію — гепарин, пентоксифілін, декстрани, дипірідамол (за показниками коагулограми).

Лікування ускладнень

Метою терапії дифтерійних міокардитів є забезпечення адекватної гемодинаміки. Недоцільним є призначення у найближчі терміни серцевих глікозидів. При тяжкому міокардиті, окрім метаболічної терапії, обґрунтованим є використання симпатоміметичних амінів та бета-блокаторів. Лікування гострої серцевої недостатності здійснюється шляхом призначення сечогінних препаратів (в першу чергу салуретиків), які зменшують перенавантаження на міокард.

Краще лікування міокардиту проводити разом з кардіологом, включаючи нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП). При крупі хворі отримують літичні суміші (з включенням до їхнього складу аміназина, промедола,антигістамінних засобів, парові інгаляції, НПЗП. При стенозі II–III ступеня необхідна інтубація або, навіть, трахеотомія з переходом на штучну вентиляцію легень.

При ураженні нервової системи додатково призначають неостігмин, вітаміни групи В, ноотропні препарати. В період реконвалесценції — масаж, ЛФК. Ураження нирок не потребують проведення специфічної терапії.

Corynebacterium diphtheriae, забарвлення за Грамом

 

Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжево-червоного кольору на фоні жовтозелених тіл бактерійних клітин.

       

Дифтерійні палички ( заб. за Нейсером )

Дифтерійні палички ( заб. за Леффлером)

За культуральними властивостями коринебактерії дифтерії поді­ляються на біовари gravis і mitis.

Коринебактерії gravis на телуритовому агарі, що містить дефібри-новану кров і телурит калію, утворюють крупні шорсткі (R-форми) розеткоподібні колонії  чорного або сірого кольору. Вони ферментують декстрин, крохмаль і глікоген, у бульйоні утворюють поверхневу плівку і зернистий осад, звичайно високотоксичні і мають більш виражені  інвазивні  властивості.

Коринебактерії mitis на телуровому агарі ростуть з утворенням темних гладеньких (S-форми) блискучих колоній. Вони не ферментують крохмаль і глікоген, непостійно ферментують дек­стрин, спричиняють гемоліз еритроцитів усіх видів тварин, у бульйо­ні даюгь дифузне помутніння, менш токсичні та інвазивні.

Ферментативні властивості. Коринебактерії дифтерії не зсідають молоко, не розкладають сечовину, не виділяють індол, слабко утво­рюють сірководень, відновлюють нітрати в нітрити, а також телурит калію до металу, внаслідок чого колонії збудника дифтерії на телу­ровому агарі стають чорними або сірими. Коринебактерії дифтерії ферментують глюкозу і мальтозу, непостійно — галактозу, крохмаль, декстрин,   гліцерин.

Токсиноутворення. Коринебактерії дифтерії продукують у буль­йонних культурах сильні екзотоксини (гістотоксин, дермонекротизин, гемолізин). Токсигенність коринебактерій пов’язана з лізогенністю (наявністю у токсигенних штамах помірних фагів — профагів). Кла­сичний міжнародний еталонний штам Парк-Вільямс 8 — продуцент екзотоксину — також лізогенний і понад 85 років зберігає власти­вість токсиноутворення. Генетичні детермінанти токсигенності (tox⁺-гени) локалізовані в геномі профага, інтегрованого з нуклеоїдом коринебактерій дифтерії.

Дифтерійний екзотоксин складається із двох (А і В) поліпептидних ланцюгів, з’єднаних дисульфідним містком. Під впливом відновних агентів розщепляються дисульфідні зв’язки, що з’єднують А- і В-лан-цюги. А-ланцюг переходить у цитоплазму, а В-ланцюг залишається в мембрані ендосоми і спричиняє зв’язування токсину з рецепторами на поверхні клітин.

Дифтерійний токсин нестійкий, легко руйнується під впливом температури, світла і кисню повітря, але порівняно резистентний до діяння ультразвуку. Після додавання до токсину 0,3—0,4 % форма­ліну і наступного витримування при температурі 38—40 °С протягом З—4 тижнів він перетворюється в анатоксин, який має біль­шу стійкість щодо фізичних і хімічних дій, чим вихідний ток­син.

Коринебактерії дифтерії продукують бактеріоцини (коринецини), що надають їм деяких селективних переваг.

Антигенна структура. За допомогою реакції аглютинації у збуд­ника дифтерії виявлено  11  сероварів.

Токсини, що утворюються різними штамами gravis і mitis, не мають специфічності і повністю нейтралізуються стандартним дифте­рійним антитоксином.

Доведено, що в коринебактерій дифтерії є варіантоспецифічні термолабільні поверхневі білкові антигени (К-антигени) і групоспе-цифічні  термостабільні  соматичні   полісахаридні   антигени.

Серед коринебактерій розрізняють 15 фаговарів, за допомогою яких виявляють джерела інфекції: фаговари враховують також при ідентифікації виділених культур.

Резистентність. Коринебактерії дифтерії порівняно стійкі до впли­ву факторів зовнішнього середовища. На зсілій сироватці вони зали­шаються життєздатними близько року, при кімнатній температурі — до 2 місяців, на дитячих іграшках — кілька діб. Коринебактерії довго зберігаються у плівках хворих на дифтерію. Від дії темпера­тури 60 °С і 1 % розчину фенолу збудник дифтерії гине протягом 10   хв.

Патогенність для тварин. У природних умовах вірулентні корине­бактерії дифтерії виявлено у коней, корів, собак, інфікованих, оче­видно, від людей — хворих на дифтерію і носіїв. Проте свійські тва­рини не р джерелом зараження людини.

Із лабораторних тварин найбільш сприйнятливі морські свинки і кролі. При зараженні культурою або токсином коринебактерій у них розвивається типова картина токсикоінфекції з утворенням на місці введення запалення, набряку, некрозу. Внутрішні органи гіпере-мійовані, у надниркових залозах спостерігаються крововиливи. Доза 0,06 мкг токсину вбиває морську свинку масою 250 г.

 Патогенез захворювання: Вхідні ворота для збудника – слизові оболонки носоглотки, іноді очей, статевих органів (у жінок), пошкоджені шкірні покриви. Дифтерійна паличка колонізує тканини в місці проникнення, викликаючи розвиток місцевого фібринозного запалення. Подібний тип уражень відомий як дифтитритичне запалення.

Поширення плівок і перехід процесу на дихальні шляхи може викликати асфіксію. Системні прояви обумовлені дією токсину, що вражає нервову систему (переважно периферичні симпатичні вузли), серце і судини, надниркові залози і нирки. Ферменти C. diphtheriae (гіалуронідаза, нейрамінідаза, фібринолізин) забезпечують проникнення збудника в різні тканини.

Органи-мішені для збудника дифтерії

Резервуар інфекції – людина (хворий, реконвалесцент, бактеріоносій); максимальну епідемічну небезпеку становлять хворі люди. Реконвалесценти виділяють дифтерійну паличку на протязі 15-20 діб. Основний шлях передачі повітряно-краплинний; також можливе зараження через предмети, використовувані хворими і інфікованими харчовими продуктами (найчастіше молоко).

Клінічні прояви дифтерії:

Дифтерія носа

 

Дифтерійні плівки на мигдаликах

 

 

Дифтерія ротоглотки і гортані

 

 

         Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для дослідження є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше виділення з ока, вуха, рани, піхви, ураженої ділянки шкіри. На вимогу епідеміолога досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (молоко, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікування натще або через 2 год після прийому їжі.

       Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені 5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. Досліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами, намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними рухами, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпателем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

       Якщо необхідно провести первинну бактеріоскопію на вимогу лікаря, матеріал беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки, ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

       Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких надписують номер, дату і час відбору, прізвище лікаря. Вони повинні бути доставлені до лабораторії не пізніше 3-х год після взяття матеріалу. Якщо схема забору передбачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направляють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють  через 20-23 год, в холодну пору в сумках із грілками.

        Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановського-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які при звичайних методах культивування не ростуть).

       Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен валютину, забарвлених за методами Леффлера і Нейссера, було основою лабораторної діагностики дифтерії та виявлення бактеріоносійства. Тепер, у зв’язку з мінливістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія досліджуваного матеріалу не рекомендується.

       Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипових колоній на кров’яно-телуритових середовищах та при перевірці чистоти виділених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.                

     Бактеріологічне дослідження.

Оскільки середній медичний персонал часто забирає матеріал для мікробіологічного дослідження, необхідно детально вивчити методику забору. Відповідно до інструкцій, від хворих із підозрою на дифтерію забір матеріалу проводять протягом 3-4 год (не пізніше 12 год) після огляду лікаря і не раніше ніж через 2 год, після прийому їжі, бажано до початку лікування. Перед процедурою не можна полоскати горло розчинами антисептиків. Для взяття матеріалу використовують стерильні сухі ватні тампони на дерев’яних паличках, вміщених у пробірки. Матеріал із мигдаликів і носа беруть окремими тампонами при доброму освітленні з використанням шпателя, не торкаючись тампоном язика, слизової щік і зубів. Якщо є наліт на мигдаликах, матеріал необхідно брати на межі уражених і здорових тканин, злегка натискуючи на них тампоном. Для взяття матеріалу з носа використовують один тампон, який вводять спочатку в один, потім у другий носовий хід. Тампони доставляють у лабораторію не пізніше 3-х год після забору. Пробірки з тампонами надписують, вказуючи зів (З) і ніс (Н), на супровідному папері пишуть прізвище й ім’я хворого, його адресу, попередній діагноз, час взяття матеріалу. При дифтерії рідких локалізацій (очі, вуха, шкіра, рана, піхва) матеріал забирають окремим додатковим тампоном з уражених ділянок, а також із зіва та носа.
   Первинна бактеріоскопія мазків із тампонів проводиться лише на вимогу лікаря і не стільки для виявлення дифтерійних паличок, а щоб не пропустити діагноз некротичної ангіни Симановського-Плаута-Венсана, яку викликає асоціація B. fusiformis і спірохет. У такому разі повинен бути ще один тампон виключно для бактеріоскопії.
   Матеріал із мигдаликів, носа й інших уражених ділянок засівають роздільно на поверхню кров’яного (сироваткового) телуритового агару або середовище Клауберга в чашках Петрі. Посів від одного хворого проводять на єдину чашку, використовуючи одну половину середовища для посіву з мигдаликів, а другу – з носа. При посіві з інших ділянок додають ще одну чашку. При посіві матеріал втирають у середовище на ділянці 2х1 см2, повертаючи тампон, а потім ним же засівають круговими рухами, втираючи в поверхню середовища. Такий метод дозволяє засіяти весь матеріал із тампона, отримати ізольовані колонії, що скорочує тривалість аналізу на одну добу. Для посіву використовують підігріті в термостаті (15-20 хв) середовища.
   Коротка схема бактеріологічного аналізу виглядає так:
   перший день – посів матеріалу на середовище й інкубування в термостаті при температурі 37 °С протягом 24-х год;
   другий день – вивчення колоній, які виросли, постановка проб на токсигенність і цистиназу, пересів ізольованих колоній на скошений сироватковий агар;
   третій день – облік проб на токсигенність і цистиназу; якщо вони позитивні – видають документовану відповідь про виділення токсигенних коринебактерій дифтерії; при негативних пробах вивчають біохімічні властивості чистої культури (ферментація глюкози, сахарози, крохмалю, сечовини);
   четвертий день – облік проби на токсигенність у разі запізнення виділення чистої культури, пересів її для біохімічної ідентифікації, видача відповіді про виділення токсигенних чи нетоксигенних коринебактерій дифтерії із зазначенням біоварів;
   п’ятий день – облік усіх посівів і проб, видача остаточної відповіді про культури, які виділені із запізненням.
   Отже, основа мікробіологічної діагностики дифтерії – виділення чистої культури і визначення її токсигенності.
   Визначення токсигенності проводять in vivo та in vitro. При першому варіанті двох морських свинок підшкірно заражають виділеною культурою, але напередодні одній з них вводять антитоксичну протидифтерійну сироватку. Заражена тварина гине, а та, якій ввели сироватку, залишається жива.
   У лабораторній практиці токсигенність дифтерійних бактерій визначають переважно in vitro за допомогою методу імунопреципітації в агаровому гелі. Для цієї мети мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних мікроорганізмів (ВТДМ) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною протидифтерійною сироваткою і висушені.
   На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски діаметром 6 мм. На відстані 6-7 мм від нього засівають навколо окремими бляшками п’ять культур, дві з них завідомо токсигенні (контроль). Цей метод оснований на здатності токсину (антигену) і сироватки (антитіла) дифундувати в агаровий гель і в місці їх оптимальних співвідношень утворювати білі лінії преципітації. Метод дуже економічний, за чутливістю не поступається біологічному, але результат відомий значно раніше (24 год).
   Дифтерійне бактеріоносійство можна виявити лише бактеріологічним способом. Взяття матеріалу проводять описаним вище методом стерильними тампонами і висівають на скошений сироватковий агар. Через 24 год з культури виготовляють мазок, забарвлюють метиленовою синькою або за Нейссером. При виявленні типових за морфологією дифтерійних паличок встановлюють наявність бактеріоносійства.
   Коринебактерії дифтерії не завжди мають типову морфологію. У таких випадках необхідно диференціювати їх від псевдодифтерійних бактерій і дифтероїдів, які населяють шкіру і слизові оболонки людини. Відмінні ознаки коринебактерій наведені в інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії.

Клінічний матеріал засівають на кров’яний агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори. Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до дії телуриту калію, тому їх ріст на телуритових середовищах може пригнічуватись. Для виявлення дифтерійного бактеріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в посівному матеріалі може міститись невелика кількість дифтерійних паличок, ріст яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою. При цьому допускається використання і транспортного середовища.

            Кров’яно-телуриновий агар. До 100 мл 2 % розплавленого й охолодженого до 50 °С живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі шаром товщиною 3-4 мм.

     У C. diphtheriae виділяють три біовари – gravis, mitis, intermedius

                •Бактерії біовару gravis – короткі, неправильної форми, з невеликою кількістю метахроматичних гранул.

                •Биовар mitis утворює довгі зігнуті поліморфні палички, що містять багато волютинових зерен (тільця Бебеша-Еріста)

                •Бактерії біовару intermedius найбільш великі з бочкоподібними контурами, для них характерні поперечні перегородки, що розділяють клітину на декілька сегментів.  На даний час біовар intermedius відносять в групу gravis.

ріст на кровяному агарі (біовар intermedius)

 

    Біовар gravis                                                         Біовар mitis

(ріст на кровяному агарі)

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцеринову суміш готують шляхом додавання 20 мл стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холодильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34 мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

       Транспортне напіврідке середовище. До 100 мл перевару Хоттінгера або м’ясо-пептонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, стерилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 % телуриту калію. Середовище розливають у пробірки по 5 мл. При можливості використовують і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

       Посів від одного хворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка), а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із шкіри, ока, вуха та інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засівати матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігрівають у термостаті 15-20 хв.

       При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в окрему ділянку кров’яного агару площею 2х1 см, потім аналогічно на кров’яно-телуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час повертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Така техніка посіву дозволяє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосередньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засіяні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-24 год.

       На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують характер колоній. Якщо ріст відсутній на обох середовищах роблять повторний забір матеріалу. Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих колоній можна і не проводити.

       Культуральні властивості. Колонії дифтерійних паличок на кров’яному агарі білуватого або жовтуватого кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно вони мають маслянисту консистенцію, хоч деякі можуть утворювати крихкі шорсткі R-колонії.

       На кров’яно-телуритових середовищах колонії C.diphtheriae через 24 год росту мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають темносірого або чорного кольору з металевим блиском, рівними або злегка фестончастими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-форми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею. За структурою 48-годинних колоній на телуринових середовищах і деякими ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культурально-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

      Якщо типовий ріст відсутній, з інших, сумнівних, колоній готують мазки. При виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджівта ін., дослідження на дифтерію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що дифтерійні бактерії, які утворили нетипові колонії на середовищах з інгібіторами росту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм та характерне розташування.

       При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсигенності та ідентифікації.          

       Токсигенні властивості. досліджують не менше як у 2-х ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середовище для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C. diphtheriaе, необхідно при  множинному рості підозрілих колоній дослідити токсигенні властивості біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише однієї колонії її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не прожарюючи петлю, – у пробірку з середовищем Пізу. Якщо застосовували транспортне середовище,

висів із нього роблять на щільні кров’яно-телуритові середовища.

       На третій день при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й позитивній пробі на цистиназу виділену культуру визначають як токсигенну С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще на протязі доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший вид коринебактерій.

 Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглеводневі середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби на виявлення уреази, піразинамідази та нітратнедуктази.

       На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргументований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    

               Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токсину з антитоксином в агаровому гелі. В місцях оптимального кількісного співвідношення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном називають Елек-тестом.

Визначення токсигенності C. diphtheriaе

       Пробу на токсигенність, як правило, проводять із чистими культурами. Можна визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її повторюють з виділеною чистою культурою.

       Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних мікробів (ВТДМ) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною протидифтерійною сироваткою, і висушені.

       На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски з антитоксином (не більше чотирьох на одну чашку). На відстані 0,5 см від диску навколо нього засівають культури у вигляді “бляшок” діаметром 7-8 мм, чергуючи “бляшки” досліджуваної культури і контрольного штаму.

       Результати враховують через 18-24 і 48 год. Критерієм специфічності преципітатів є злиття ліній преципітації досліджуваної культури з лініями токсигенного штаму. В такому разі виділену культуру вважають токсигенною.

      При відсутності стандартних паперових дисків можна використати смужки фільтрувального паперу, просочені дифтерійним антитоксином. Їх виготовляють безпосередньо в лабораторії. Нарізані за вказаними розмірами і простерилізовані в автоклаві при 121°С протягом 30 хв паперові смужки змочують 0,25 мл очищеного дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 мл. В такому разі на чашку з відповідним середовищем накладають змочену антитоксином смужку паперу, підсушують, відкривши чашку на 15-20 хв у термостаті й перевернувши її догори дном. Після цього з обох боків смужки засівають культури “бляшками”, чергуючи досліджувані і контрольні штами.

       Для визначення токсигенности збудника дифтерії можна використати також і інші середовища (АГВ, мартенівський агар тощо), рецепти виготовлення яких приведені в “Інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії”, Київ (1999).

       Впродовж багатьох років токсигенність дифтерійних бактерій визначали підшкірним або внутрішньошкірним введенням культури двом гвінейським свинкам, одній з яких напередодні вводять 100-1000 МО антитоксичної протидифтерійної сироватки. Тепер цей метод бактеріологічні лабораторії практично майже не використовують із-за його дороговизни та значної затримки відповіді.

 

Вивчення токсигенності внутрішкірним введенням культури

гвінейській свинці.

                                       

       Останнім часом розроблено дуже чутливий і високоспецифічний метод визначення гену дифтерійного токсину шляхом полімеризації ланцюгової реакції. Він оснований на визначенні ділянки ДНК C. diphtheriaе, де локалізований ген дифтерійного токсину, за допомогою ДНК-полімерази. Метод має переваги перед традиційним визначенням токсигенності: високу чутливість, швидкість отримання результатів (4-6 год), не потребує виділення чистої культури.

 Але для його проведення необхідні спеціальна апаратура, дорогі реактиви й відповідне приміщення, а тому може бути проведений лише в спеціалізованій лабораторії. Всі нетоксигенні штами дифтерійних бактерій, які виділені від хворих та бактеріоносіїв, необхідно направляти до Українського центру держсанепіднагляду (де є така лабораторія) для остаточного визначення токсигенних властивостей C. diphtheriaе.                                              

    Ферментативні властивості. Визначення цистинази (проба Пізу). C. diphtheriaе, C. ulcerans,   C. Pseudotuberculosis виділяють фермент цистиназу, псевдодифтерійні бактерії та інші дифтероїди його не продукують.

       Виділену культуру засівають уколом в середовище з цистином, розлите стовпчиком у вузькі пробірки. Цистиназопозитивні бактерії розщеплюють цистин із виділенням сірководню, який із оцтовокислим свинцем, що входить до середовища, утворює сірчанокислий свинець, в результаті чого середовище забарвлюється в темно-коричневий колір. C. diphtheriaе викликає не лише потемніння середовища по ходу уколу а й утворює навколо нього “хмаринку” темно-коричневого кольору на відстані 1 см від поверхні.

Результати враховують через 20-24 год інкубування в термостаті.

       Визначення уреази (проба Заксе). Дифтерійні бактерії цього ферменту не утворюють. Позитивну пробу на уреазу дають лише деякі інші види коринебактерій. Для постановки проби виділену культуру сіють на бульйон із сечовиною. Уреаза розкладає сечовину, змінює рН середовища, що супроводжується його почервонінням. Якщо фермент не виділяється, зміна забарвлення бульйону не відбувається.

       Визначення піразинамідази проводять шляхом гідролізу піразинаміду до піразинової кислоти та амонію. Для цього в стерильну пробірку вливають 0,25 мл стерильної дистильованої води, в якій готують густу завись виділеної культури, потім вносять одну діагностичну таблетку Rosko 598-21.  Інкубують протягом 4-х год при 37 °С, після чого добавляють одну краплю щойно приготовленного 5 % водного розчину сульфату амонійного заліза. При наявності ферменту суспензія набуває червоного або оранжевого кольору.

Патогенні коринебактерії не виділяють піразинамідазу, а отже й не змінюють кольору суспензії.  Цукролітичні ферменти визначають шляхом посіву повної петлі виділеної культури в кожну пробірку вкороченого строкатого ряду Гіса (глюкоза, сахароза, розчинний крохмаль). Результати враховують через 24 год інкубування в термостаті. Розщеплення крохмалю може затримуватись до 48 год.

             Визначення нітратредуктази є додатковим тестом для ідентифікації С. belfanti i C. ulcerans, які не утворюють цього ферменту. У пробірку з бульйоном, до якого додають 0,1 % KNO3, засівають досліджувану культуру, інкубують в термостаті протягом доби. Обов’язково ставлять контроль з незасіяним середовищем. В разі  наявності нітратредуктази при додаванні до засіяного бульйону 3-х крапель реактиву Касаткіна виникає червоне забарвлення. Середовище в контрольній пробірці кольору не змінює.

       Для ідентифікації коринебактерій останнім часом використовують паперові індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем із набору “Б” для ідентифікації ентеробактерій (фірма “ІмБіо”, м.Нижній Новгород). У 4-х пробірках готують густу завись досліджуваної культури і в кожну з них занурюють диск із відповідним вуглеводом чи іншим реактивом. Після інкубування в термостаті облік виділення уреази проводять через 40-120 хв, а визначення цукролітичної активності – через 5-24 год. При наявності уреази білий диск із сечовиною стає рожево-малиновим, при відсутності – залишається білим. Диски з глюкозою та сахарозою при наявності відповідних ферментів вже через 5-6 год змінюють колір з червоного на жовтий. При визначенні амілази в пробірку з відповідним субстратом додають індикаторний диск з йодом. Якщо ферменту немає – з’являється темно-синє забарвлення, якщо є – колір розчину

залишається без змін. 

Лікування: Оскільки патогенез порушень обумовлений дією токсину, то основу специфічної терапії складе протидифтерійна кінська сироватка (антитоксин), що містить не менше 2000 міжнародних антитоксичних одиниць активності (МЕ) в 1 мл. Антитоксин вводять внутрішньом’язево  або внутрішньовенно в дозах, відповідних тяжкості захворювання (від 20000 до 100000 ЕД).

Профілактика: Для імунопрофілактики застосовують дифтерійний анатоксин, розроблений Р. Рамоном. Препарат – токсин, позбавлений отруйних властивостей оброблений 0,4% розчином формаліну і витриманий в термостаті  при температурі 40°С протягом 30 діб, але він зберіг імуногенність. Очищений і концентрованний препарат входить до складу комбінованих вакцин – АКДС, АДС, АДС-м.

                                                                                   

Бордетели

   До роду Bordetella входять три види мікроорганізмів, патогенних для людини: B. pertussis – збудник коклюшу, B. parapertussis – збудник паракоклюшу і B. bronchiseptica – збудник бронхісептикозу. Всі вони мають подібні властивості, виділяються з верхніх дихальних шляхів і спричиняють схожі за клінічною картиною захворювання.

Збудник коклюшу

   Коклюш (син.: кашлюк) – гостра інфекційна хвороба, яка характеризується катаральним запаленням дихальних шляхів і нападами спазматичного кашлю. Збудник коклюшу B. pertussis вперше виділили від хворої дитини Ж. Борде й О. Жангу в 1906 році.

 
   Морфологія і фізіологія. Збудник коклюшу, як інші види бордетел, – невеликі грамнегативні овоїдної форми палички завдовжки 1-1,2 мкм і завширшки 0,3-0,5 мкм . Спор не утворюють, капсули є тільки у B. pertussis, а джгутики – лише у B. bronchiseptica. Слабо забарвлюються аніліновими бавниками, трохи інтенсивніше на полюсах. Бордетели – суворі аероби, вибагливі до умов вирощування. Культивують їх на середовищі Борде-Жангу (картопляно-гліцериновий агар із кров’ю) або на казеїно-вугільному агарі (КВА). Колонії всіх видів гладенькі, блискучі, прозорі, опуклі, нагадують крапельки ртуті. Виростають через 48-72 год. На кров’яному агарі колонії оточені зонами гемолізу.
   Біологічні властивості бордетел дуже слабкі. Вони не розкладають білки і вуглеводи, не відновлюють нітрати, але виділяють каталазу.
   Антигенна структура. Бордетели мають загальний термостабільний О-антиген, гемаглютинін, протективний антиген. Серед 14 виявлених компонентів специфічні антигени позначають арабськими цифрами: 1 властивий для B. pertussis, 12 – B. bronchoiseptica, 14 – B. parapertussis.
   Токсиноутворення. Збудник коклюшу виділяє термолабільний білковий токсин, який діє на нервові рецептори дихальних шляхів, що викликає спазматичний кашель. Він також збуджує дихальний центр, спричиняє спазм м’язів дрібних бронхів.
   Екологія. Основним біотопом бордетел є верхні дихальні шляхи хворої людини і бактеріоносія. Джерелом інфекції служить переважно хвора людина, яка виділяє збудник протягом 25-45 днів хвороби. Найбільш небезпечними є хворі на стерті й субклінічні форми та нерозпізнані бактеріоносії. Механізм передачі – повітряно-краплинний. Сприйнятливість до коклюшу дуже висока, особливо в дітей до 10 років.
   Потрапляючи в навколишнє середовище, бордетели швидко гинуть від дії прямих сонячних променів і висушування. Кип’ятіння викликає їх загибель у перші секунди. Низькі температури вони також переносять погано. Дезинфікуючі розчини досить швидко інактивують їх.
   Захворювання людини. Інкубаційний період триває 5-9 днів. Перебіг хвороби поділяють на три періоди: катаральний (2 тижні), спазматичний або конвульсивний (4-6 тижнів) і завершення (2-3 тижні).
   Хвороба починається запаленням верхніх дихальних шляхів, незначним підвищенням температури. Потім з’являються кашель, нежить, чхання. Пізніше окремі покашлювання переходять у приступи кашлю, які набувають тривалого характеру. Після серії кашльових поштовхів настає форсований свистящий вдих. Це може повторюватися багато разів. Захворювання супроводжується такими ускладненнями, як ларингіт, бронхіт, пневмонія.
   Імунітет. Після перенесення хвороби виникає стійкий і тривалий імунітет. Він носить гуморальний характер і зумовлений утворенням антитоксинів, аглютинінів, преципітинів, комплементзв’язуючих антитіл. Повторні випадки хвороби не виникають. Перехресний імунітет між захворюваннями, викликаними трьома видами бордетел, не розвивається.
   Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є мокротиння або слиз із носоглотки, взятий спеціальним (зігнутим) тампоном. Можна зробити посів за методом “кашльових пластинок”: під час кашлю чашку Петрі з живильним середовищем тримають на відстані 10-15 см перед ротом. Збудник коклюшу можна виділити протягом перших двох тижнів хвороби. Культури виростають через 2-5 днів. Колонії на середовищі Борде-Жангу нагадують краплини ртуті. Види виділених культур визначають за морфологічними, культуральними, ферментативними й антигенними властивостями.
   Із 10-12 дня захворювання проводять серологічну діагностику, використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу і непрямої гемаглютинації.
   Профілактика і лікування. Для попередження виникнення захворювань важливе значення має рання діагностика й ізоляція хворих дітей протягом 30 днів від початку хвороби. Дезинфекцію не проводять, так як бордетели нестійкі в зовнішньому середовищі. Ослабленим дітям, які були в контакті з хворими, з профілактичною метою вводять 3 мл імуноглобуліну.
   Для специфічної профілактики застосовують адсорбовану коклюшно-дифтерійно-правцеву (АКДП) вакцину. Перше щеплення роблять у віці 3 місяців, ревакцинацію – через 1,5-2 роки. Лікування проводять протикоклюшним імуноглобуліном і антибіотиками, з яких найбільш ефективними є левоміцитин, еритроміцин, ампіцилін і тетрациклін, але вони діють лише в катаральному і в перші дні спазматичного періоду хвороби.

Туберкульо́з (від лат. tuberculum — горбок), також Сухоти — інфекційна хвороба, яка викликаєтьсямікобактеріями туберкульозу і характеризується утворенням специфічних гранульом в різноманітнихорганах та тканинах (найчастіше у легенях) і поліморфною клінічною картиною.

Сьогодні у світі налічується 50–60 мільйонів хворих на туберкульоз, щороку захворює 7–10 мільйонів, помирає 3 мільйони осіб. Одна хвора людина може інфікувати за рік 10–15 людей.

Туберкульоз супроводжував людство з давніх-давен. Ще у залишках кісток древніх людей знаходили сліди туберкульозного ураження. Опис хвороби знаходили у єгипетських ієрогліфах, старих перських книгах, індійських ведах. У вавилонських законах Хаммурапі (початок II століття до н. е.) встановлено право на розлучення із жінкою, якщо вона захворіла на сухоти. Давньогрецький лікар Гіппократ у наприкінці V — на початку IV століття до н. е. описав прояви туберкульозу та описав йогопатогенез, але вважав цю хворобу спадковою, оскільки вона вражала цілі сім’ї. Аристотель першим описав туберкульозний горбик (phymos), а Клавдій Гален у Стародавньому Римі стверджував, що ця хвороба є заразною.

Очевидно, під цією недугою описувались різні хвороби, що супроводжувались інтоксикацією, виснаженням, кровохарканням,кровотечами, тому і виникла така назва як сухоти (лат. phthisis), що означає виснаження. Під терміном tuberculum розуміли зміни, які спостерігаються на поверхні органів, або ж будь-що, що виступало над його поверхнею при розтині. У древніх руських літописах теж згадується ця хвороба як запалення регіонарних лімфатичних вузлів. Тоді її лікували хірургічним методом та припіканням. Так лікували зокрема князя Київського Святослава Ярославича в 1076 році.

Незважаючи на значне поширення туберкульозу в Середні віки, вчені здебільшого користувалися трактатами давньогрецьких мудреців, а твори Гіппократа і Галена вважали непогрішними. Лише у XVI столітті венеціанець Джироламо Фракасторо стверджував, що туберкульоз заразний і його переносить якесь «насіння». У XVII ст.голандський лікар Франциск Сільвій описав туберкульозний горбик у легенях померлого і назвав його tuberculum. Проте він вважав, що це змінений лімфатичний вузол. 1689 року англійський лікар Річард Мортонопублікував свій трактат під назвою «Фтизіологія, або трактат про сухоти», де виклав подібні припущення^[1][2]. Лише 1793 року також англієць Бейлі довів, що ті горбики — не змінені лімфатичні вузли, а специфічні утворення, характерні тільки для туберкульозу, і які можуть зливатися і розпадатися.

Цей напрямок досліджень розвинув і доповнив французький науковець Рене Лаєннек (1881–1926). Він довів що горбик і казеознийнекроз — універсальний субстрат туберкульозу. Він також запропонував першу класифікацію туберкульозу та висунув концепцію про апікокаудальне поширення туберкульозу в легенях. Запропонований ним метод аускультації разом із розробленою ще 1760 рокуЛеопольдом Ауенбругером перкусією, надали широкі можливості для клінічного розпізнавання туберкульозу.

1865 року французький морський лікар Жан-Антуан Вільмен експериментально довів інфекційну природу туберкульозу. Проте йому не вдалося практично продемонструвати збудника і результати його досліджень не були визнані. Лише 1882 року німецький бактеріологРоберт Кох у Берліні довів інфекційну природу туберкульозу. Він розробив спеціальний метод забарвлення збудника і виділив його в чисті культури. Він отримав водно–гліцеринову витяжку культури мікобактерій (яку назвав туберкуліном), і вважав, що вона допоможе в лікуванні та діагностиці туберкульозу. Проте результати не виправдали сподівань, після введення тяжким хворим у них спостерігалось погіршення стану. Проте в діагностичних цілях туберкулін Коха використовували ще впродовж ста років.

Російський медик Микола Пирогов в період 1842–1848 років описав клініку та патогенез уражень туберкульозом кісток, суглобів,лімфатичних вузлів шиї. Виділив тифоїдну форму міліарного туберкульозу. Вивчив гістологічну будову гранульоми і описав гігантські багатоядерні клітини — відомі нині як клітини Пирогова-Лангханса.

1887 року відкрився перший протитуберкульозний диспансер, де проводили не тільки лікування, але і спостереження та соціальну підтримку хворих. Активне лікування вперше запропонував італійський медик Фораліні — створення відносного спокою хворому органові і зближення країв рани, що мало сприяти успішному перебігу репаративних процесів. Штучний пневмоторакс застосовували у багатьохкраїнах.

Величезну роль у діагностиці туберкульозу відіграло відкриття Вільгельмом Конрадом Ренгеном в 1895 році Х-променів. Це дало можливість виявляти найменші зміни в легенях. 1916 року німецький науковець Карл Ернст Ранке виділив три стадії перебігу туберкульозу: період первинного інфікування, підвищена чутливість організму до збудника, перехід в обмежений органоуражуючий процес. Не всі формулювання відповідають сучасним положенням, але він вніс певну систему у невпорядковані уявлення про патогенез захворювання.

Основним досягненням у боротьбі з туберкульозом в 20 столітті стало відкриття французькими вченими Альбертом Кальметом і Камілем Гереном у 1919 році протитуберкульозної вакцини, названої на їх честь — БЦЖ (BCG — Bacilles Calmette, Geurin). Перше щепленняздійснили 1921 року, а в 1925 році вакцина була передана в Радянський Союз. Масово виявлення туберкульозу стало можливим після запровадження флюорографічного обстеження, яке вперше застосували 1924 року в місті Арбе, Бразилія.

Довготривалі пошуки ліків проти туберкульозу не давали ніяких результатів аж до 1943 року, коли Зельман Ваксман (американський мікробіолог, народжений в Україні) отримав антибіотик стрептоміцин, за що став лауреатом Нобелівської премії з фізіології та медицини. Іншим значним вітчизняним фтизіатром був Олександр Рабухін. До 1966 року стали застосовуватися й інші протитуберкульозні препарати, найефективніший з них — ізоніазид. Також значно полегшило долю хворих використання хіміотерапії.

Вивчення туберкульозу триває і на сучасному етапі. Фонтесу і Кальмету вдалось відкрити форми мікобактерій, які проходять через бактеріальні фільтри, а Басерман, завдяки електронним мікроскопам, описав L-форми мікобактерій.

Еволюція

Туберкульоз супроводжував розвиток людини впродовж тисяч або навіть мільйонів років, хоча найдавніші залишки людини мають 9000 річну давність. Протягом цього часу бактерія зазнала багатьох змін у генетичному коді, що дає можливість виділити багато її штамів. Це пояснює відмінність штамів у різних географічних регіонах, що в подальшому може бути використане для визначення походження та руху кожного штаму.

1.            Туберкульозна інтоксикація дітей та підлітків.

2.            Туберкульоз органів дихання:

·                                         первинний туберкульозний комплекс;

·                                         туберкульоз внутрішньогрудних лімфатичних вузлів.

3.            Дисемінований туберкульоз:

·                                         вогнищевий туберкульоз;

·                                         інфільтративний туберкульоз;

·                                         казеозна пневмонія;

·                                         туберкульома;

·                                         фіброзно-кавернозний туберкульоз;

·                                         циротичний туберкульоз;

·                                         туберкульозний плеврит;

·                                         туберкульоз бронхів, трахеї та верхніх дихальних шляхів;

·                                         туберкульоз органів дихання;

·                                         комбінований туберкульоз;

·                                         міліарний туберкульоз.

4.            Туберкульоз інших органів і систем:

·                                         туберкульоз мозкових оболонок і ЦНС;

·                                         туберкульоз кишок очеревини та брижових лімфовузлів;

·                                         туберкульоз кісток та суглобів;

·                                         туберкульоз сечових та статевих органів;

·                                         туберкульоз шкіри та підшкірної клітковини;

·                                         туберкульоз периферійних лімфовузлів;

·                                         туберкульоз ока;

·                                         туберкульоз інших органів.

·                 кашель більше 2 тижнів,

·                 підвищена температура тіла більше 7 днів,

·                 поганий апетит,

·                 постійна слабкість,

·                 безпідставна втрата ваги,

·                 підвищена пітливість, особливо вночі,

·                 задишка,

·                 біль в грудній клітці,

·                 крововідхаркування.

Під час розвитку хвороби проявляються симптоми інтоксикації: зниження апетиту, загальна слабкість, підвищена пітливість, температура тіла піднімається до 37,2–38,0 °C. З‘являється кашель, на який хворий спершу не звертає уваги, пов‘язуючи його з курінням чи застудою. Харкотиння виділяється мало, воно слизисто–гнійне. На початкових стадіях і задишка, і біль в грудях проявляються рідко.

Як правило, описані симптоми проявляються на тлі задовільного самопочуття і збереження працездатності. Тому важливо не нехтувати загальним правилом: коли кашель триває більш ніж 21 день — обов’язковим є рентгенологічне обстеження. Позачергово обстежуватись необхідно особам з бронхо-легеневими симптомами, з тривалою інтоксикацією невідомої причини. Раз на рік повинні флюорографічнообстежуватись особи з, так званої, «групи ризику» щодо туберкульозу: хворі на часті пневмонії, цукровий діабет, виразкову хворобу шлунка і дванадцятипалої кишки.

Лікування туберкульозу проходить у два етапи:

1.            основна фаза;

2.            фаза підтримування;

Основна фаза лікування проходить в умовах стаціонару й триває 2−3 місяці. Під час цієї фази має місце:

·                 швидке знищення мікобактерій туберкульозу;

·                 запобігання лікарській стійкості бактерій;

·                 хворий стає незаразним.

Фаза підтримування може проводитися амбулаторно й триває від 3 до 4 місяців. У цій фазі зменшується кількість прийнятих препаратів, у порівнянні з основною фазою лікування.

У цій фазі має місце:

·                 вплив на решту мікобактерій туберкульозу (у тому числі на дрімаючі форми);

·                 повне знезаражування вогнища в ураженому органі.

Повний курс лікування триває не менше 6 місяців.

Піразинамід 

Таблетки. Під час приймання можуть фіксуватися періодичні болі в суглобах.

Етамбутол 

Таблетки. При лікуванні препарат як побічний ефект може знижувати гостроту зору.

Стрептоміцин 

порошок для ін’єкцій. Найчастіше призначають у перші 2 місяці, а потім скасовують. Не призначають хворим із порушеннями слуху, нирковою недостатністю.

       Мікобактерії туберкульозу (Mycobacterium tuberculosis) людини відкрив у 1882 р. Р. Кох. Цей же вчений розробив питання патогенезу й імунітету.

Важливою подією було виготовлення живої вакцини проти туберкульозу, завдяки чому стало можливим широке здійснення специфічної профілактики. Введення у практику антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів озброїло сучасну медицину могутніми засобами боротьби з туберкульозом.

Морфологія. Мікобактерії туберкульозу — тонкі прямі або трохи зігнуті палички завдовжки 1—4 мкм і завширшки 0,3—10,6 мкм, іноді з незначним здуттям на кінцях, нерухомі, грампозитивні, не утворю­ють спор і капсул, поліморфні . Виявлено паличкоподібні, ниткоподібні, гіллясті, кокоподібні, фільтрівні та L-форми мікобактерій. У зв’язку з йисоким вмістом міколової кисло­ти мікобактерії туберкульозу погано забарвлюються звичайними ме­тодами, але добре — за Цілем — Нельсеном.

Основними особливостями збудників туберкульозу — М. tuber­culosis, М. africans (проміжний вид) і М. bovis — є кислотостійкість і повільний ріст на живильних середовищах. Кислотостійкійсть повязана з наявністю у туберкульозних мікобактерій великої кількості міколової   кислоти   і   ліпідів.

Доведено існування фільтрівних форм туберкульозних мікобакте­рій; при введенні в організм морської свинки вони перетворюються у типові кислотостійкі і видимі в світловий мікроскоп бактерії, які можуть спричиняти генералізований інфекційний процес. ^Виявлено також абацилярні G-форми (дрібні утворення), які здебільшого вини­кають за несприятливих умов. Цитоплазма молодих культур гомогенна, старих — зерниста.

Серед туберкульозних мікобактерій є зернисті кислотоподатливі форми, які забарвлюються за Грамом у фіолетовий колір,— зерна Муха і кислотостійкі фрагменти мікобактерій туберкульозу — осколки Шпленгера.

Культивування. Мікобактерії туберкульозу — аероби, оптимальна температура їх росту 37 °С, крайні температурні границі 24—42 °С, реакція середовища майже нейтральна (рН 6,4—7,0), можуть рости при діапазоні рН 6,0—8,0. Збудник туберкульозу росте на елективних середовищах: зсілій сироватці крові, гліцериновому агарі, гліцерино­вій картоплі, у гліцериновому бульйоні та яєчних середовищах (Пет­рова, Левенштейна — Йєнсена, Виноградова та ін.).  ЇХ можна культиівувати на сйнтєтичному середовищі Сотена, що містить аспарагін, гліцерин, цитрат заліза, фосфат калію і  інші речовини.

Мікобактерії туберкульозу потребують відповідної концентрації вітамінів (біотин, нікотинова кислота, рибофлавін та ін.). На гліце­риновому (2—3 %) агарі ледь помітний ріст їх спостерігається через 8—10 діб після висівання, а через 2—3 тижні утворюється сухий наліт блідо-жовтого кольору. Оптимальний ріст (на 6—8-му добу) мікобак­терії туберкульозу спостерігається на яєчному середовищі Петрова, що складається з яєчного жовтка, м’ясного екстракту, агару, гліце­рину та генціанового фіолетового.

На густих живильних середовищах утворюються шорсткі підви­щені густі колонії з потовщеною або зморшкуватою поверхнею і тон­кими нерівними краями. У гліцериновому (4—5 %) агарі мікобактерії туберкульозу через 10—15 діб утворюють тонку ніжну плівку, яка поступово потовщується, стає ламкою, набираючи горбисто-зморшкува­того вигляду і жовтуватого кольору; бульйон залишається прозори м.

Колонії мікобактерій туберкульозу дисоціюють із типових R-форм в атипові S-форми. Окремі штами в старих культурах виробляють жовтий  пігмент.

Хімічна структура. Мікобактерії туберкульозу складаються з ту-беркулополісахаридів, які надають їм властивостей антигенів або гаптенів; туберкулопротеїнів, що беруть участь в імунних процесах та алергічних реакціях; туберкулоліпідів і восків, що локалізовані в клітинних стінках і відповідають за високу резистентність до фізич­них та хімічних діянь і вірулентність, забезпечують захист мікобакте­рій від фагоцитозу, повільний ріст у живильних середовищах і кисло­тостійкість. За розчинністю в органічних речовинах воски поділяють на 4 фракції (А, В, С, D), що містять ефіри, міколову кислоту та інші компоненти. Із них на особливу увагу заслуговує корд-фактор (трега-лоза-6, диміколат), який не має імуногенності, але виконує функцію гаптену, зумовлює вірулентність, склеювання мікобактерій та їх ріст у вигляді кіс і джгутиків. Корд-фактор мікобактерій туберкульо­зу руйнує мітохондрії клітин інфікованого організму, порушує фун­кцію дихання і фосфорилювання, пригнічує міграцію лейкоцитів, спричиняє  утворення  хронічних  гранулем.

      Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і суглобів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних препаратів. Першовідкривач туберкульозної палички – Р. Кох  (1843 – 1910).

 

      В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium tuberculosis і  M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняє M. avium. В країнах Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsassii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін. Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобактерій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів мікобактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

      Патогенез захворювання. Джерело інфекції – хвора людина. Зараження туберкульозом відбувається повітряно- краплинним і повітряно- пиловим шляхом, іноді перорально ( при вживанні харчових продуктів інфікованних мікобактеріями туберкульозу).       Інкубаційний період.Від кількох тижнів до кількох років.

      Токсиноутворення. Мікобактерії туберкульозу не продукують екзотоксин.Вони містять токсичні речовини, що вивільняються при розпаді клітин. Токсин мікобактерій туберкульозу складається з альбумінів і нуклеопротеїдів. Вірулентні бактерії на відміну від невірулентних містять.

      Імунітет. Людина має природну резистентність до туберкульозної інфекції. Імунітет при туберкульозі нестерильний, його в широких маштабах відтворюють штучним способом (введення вакцини БЦЖ).

        Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведення мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і постановки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збудника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

      Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномозкова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, путктати, рідше кров, патологічний матеріал отримують також при бронхоскопії.                   

      Хворий збирає харкотиння в чисту баночку або кишенькову плювальницю. Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12-24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклеюють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважають потенційно патогенним.

      Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отримують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки. Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомогою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину предметного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібріну обережно розправляють на пердметному склі. Сечу центрифугують і мазки виготовляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходитися у сечі здорових людей.

      Морфологія. Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсена або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно поза клітинами.

 

Збудник туберкульозу у мазках із харкотиння і сечі

 

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію, потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульозні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення L-форм мікробактерій застосовують переважно фазово-контрастну і люмінесцентну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку після перегляду не менше 100 полів зору, обов’язково вказуючи кількість бактерій у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити діагноз туберкульозу.

       Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: мікобактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу. Окрім того за цим методом неможливо відрізнити збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи збагачення – гомогенізації та флотації.

   

  Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавляють рівний об’єм 1 % розчину NaOH, щільно закривають гумовою пробкою і струшують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану рідину центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують 2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

      Метод флотації. Прислану порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують як описано вище. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять у водяну баню при 55 0С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу), струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобактеріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дистильовану воду, щоб цей шар піднявся у  горлечко колбочки чи флакона. Стерильною пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло, яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі 60 0С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріалу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

      Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою гомогенізації або флотації.     Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріоскопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу    20-100 і більше мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості мікобактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення змінених варіантів, особливо       L-форм.

      Культуральні властивості. Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз містять супутню мікрофлору (окрім крові, спинномозкової рідини). Тому виділити чисту культуру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення стороніх мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють 20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кислоти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 0С протягом 18-20 год. Потім оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізують, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

      Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середовищем Левенштейна-Йенсена  (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попереднє, але в ньому аспарагін замінено на глутатінат натрію.                                                                    

     

Ці середовища рекомендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петраньяні, Павловського, Сотона.

 

   

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим парафіном для попередження висихання середовища.

      Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 0С протягом 3-4 тижнів. Ті пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою,  пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім вертикально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторонньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до 5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто негативну відповідь щодо туберкульозу.

      Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі, шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної капусти або бородавки (рис.9). Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам.

            S-форма колоній жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів мікобактерій. Але під впливом  антибактеріальних препаратів  M. tuberculosis також може утворювати м’які, вологі, пігментовані S-форми колоній. Необхідно відмічати швидкість і рясність росту.

      Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд ніжної плівки, яка з часом товщає, грубішає, становиться крихкою і випадає в осад. Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

      Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу досліджуваний матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікрофлору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування, швидше виростають колонії.

      Прискорені методи культивування. Щоб значно швидше отримати ріст мікобактерій туберкульозу запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової. Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець (звичайні скельця розрізають навпів по довжині). Висушені мазки беруть стерильним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кислоти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видалення кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким середовищем Сотона

або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють 10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 0С. Через 3-4 доби скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем-Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препаратах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора. Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день.

       Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школьнікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощування культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за методом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів. 

      Щоб виявити L-форми мікобактерій туберкульозу посів матеріалу після відповідної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 0С протягом 1-2 міс. Ріст L-форм нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи. Виготовлені мазки досліджують під  фазово-контрастним мікроскопом, за допомогою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх можна виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомогою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені антитіла проти антигенів L-форм.

      Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уреази, нікотинамідази.

    Найвідмітніша ознака M. tuberсulosis – ніациновий тест – здатність синтезувати значну кількість нікотинової кислоти (ніацину).

Каталазна активність відносно слабка і втрачається при 68 0С. Для швидкої диференціації збудників туберкульозу людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і 1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на цьому середовищі не ростуть.

      Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних проб і виявленні корд-фактора. Останній визначають методом мікрокультур Прайса а також на основі міцного зв’язування таких барвників як нейтральний червоний або нільський голубий. При нанесені на мазок розчину NaOH туберкульозні палички зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють відповідне забарвлення.

      Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних матеріалах як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст шлунка, тканини тощо. Ці об’єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необмежений час і в будь-який момент можуть бути досліджені. Серед них найбільшої уваги заслуговує молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції.    Він оснований на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть якщо в матеріалі знаходиться  всього 5-10 мікробних клітин за допомогою олігонуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у циклотермостаті, які потім можна ідентифікувати методом гельелектрофорезу. Результати досліджень отримують через 3-4 години.

      Антигенні властивості. Антигени туберкульозної палички складаються з білкових фракцій, ліпідів, фосфатидів і полісахаридів.Антигенна структура різних видів мікобактерій туберкульозу подібна. Туберкуліновий протеїн має виражені алергенні властивості. Специфічні антигени можна швидко виявити за допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла,

адсорбовані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

      Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберкульозних паличок через кожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

      Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий. При прямому способі безпосередньо сіють  відповідно роброблений матеріал на середовища з різними концентраціями антибіотиків чи інших хіміопрепаратів. Він ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявлють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на середовище з протитуберкульозними препаратами сіють попередньо виділені культури мікобактерій. В обох випадках обов’язковий контроль — посів на таке саме середовище без туберкулостатиків.

      У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської стійкості мікобактерій:

      1) культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

      2) мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

      3) глибинні посіви в напівантетичні середовища.

      У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну (без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних тіл в 1мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній, культуру вважають стійкою. Резистентність даного штаму виражають тією максимальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається ріст, наближений до росту в контролі.

                Біологічний метод діагностики туберкульозу – зараження гвінейських свинок – є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих

тварин складає всього декілька бактерійних клітин.

 Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотонічного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Такий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках, коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніазиду та інших хіміопрепаратів.

      Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільшених лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів. Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних результатах тварин умертвляють через 3-4 міс, гістологічно досліджують перенхіматозні органи і роблять посіви на елективні середовища.

 

Розтин гвінейської свинки з метою дослідження внутрішніх органів.

 

      Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій туберкульозу. В таких випадках потрібно зробити декілька послідовних заражень, оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякісний перебіг туберкульозу, який при реверсії L-форм може перейти в генералізований процес.

      Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, заражаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тваринах – це своєрідний “золотий стандарт” при діагностиці туберкульозу.

       Серологічна діагностика. Для виявлення протитуберкульозних антитіл спочатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комплементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати реакції непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізовані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із туберкульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів додають 20 мл естракту мікобактерій, витримують при 37 0С протягом 2-х год і відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигена. Перед постановкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усунення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1 : 2 до 1 :272.

Діагностичним титром вважають розведення 1 : 8. При туберкульозі РНГА буває позитивною у 70-90 % випадків.

 

Хороші результати дає також імуноферментний аналіз, імуноблотинг і реакція агрегат-гемаглютинації для визначення циркулюючих імунних комплексів.    

      Ще точнішим є радіоімунний метод, але із-за високої вартості діагностикумів і відсутності радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

      Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налагодити випуск моноклональних антитіл до різних антигенів мікобактерій. З їх допомогою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій а також відповідні їм антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

 

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специфічним  діагностичним тестом.

 

Проба Манту

Проведення проби Манту

                Його використовують для визначення інфікованості населеня туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків, відбору осіб, яким потрібно проводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність а також із метою діагностики туберкульозу та визначення активності процесу. Для постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропонував перший препарат, так  званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або АТК).

Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого типів, вирощених у гліцериновому бульйоні протягом 5-6 тижнів. Культуру стерилізують  текучою парою 30 хв, випарюють при 70 0С до 1/10 первісного об’єму, фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починабчи з 1934 р. і для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений  препарат туберкуліну, який назвали РРD–S (Purified protein derivative – Seibert).Через 5 років М.А. Ліннікова виготовила очищений туберкулін під назвою ППД-Л.

Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухих очищений туберкулін по 50000 ТО в ампулі і ППД-Л у стандартному розведенні в ампулах по 3 мл. У 0,1 мл розчину міститься одна доза (2 ТО).

         Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шприцом в об’ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя.

Перед ін’єкцією шкіру протирають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх уводять у поверхневий шар шкіри паралельно до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: негативна проба – повна відсутність папули; сумнівна – папула розміром 2-4 мм або лише гіперемія будь-якого розміру; позитивна – папула діаметром 5 мм і більше; гіперергічна – у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих – 21 мм і більше.

Вимірювання проби Манту

           Застосовують атенуйований штам M. Bovis; так звані бацили Кальметта-Герена (БЦЖ). Імунізацію проводять внутрішньошкірним введенням 0,1 мл вакцини всім новонародженим. Після вакцинації на деякий час відмовляються від постановки шкірних проб для попередження гіперергіних ускладнень (некротичні реакції). Реакцію проводять у віці 7, 12, 17, 22, 17-30 років особам з від′ємними реакціями Манту.

 

Мікобактеріози

     У навколишньому середовищі існує багато атипових потенційно патогенних мікобактерій. Частина з них виділяється від людей і тварин

при різноманітних захворюваннях легень, шкіри, лімфатичних вузлів, інших тканин і органів. Вони отримали загальну назву мікобактеріози.

Роль умовно-патогенних мікобактерій в інфекційній патології людини зростає з кожним роком. У цю групу захворювань не входять туберкульоз і проказа, хоч деякі з них мають подібний перебіг. Існуючі методи лікування туберкульозу і мікобактеріозів різні у зв’язку з чим мікробіологічна ідентифікація збудників набуває особливого значення.

      За класифікацією Раньйона атипові мікобактерії поділяються на 4 групи: фотохромогенні, скотохромогенні, нефотохромогенні та швидкоростучі.

      До фотохромогенних мікобактерій належать Mycobacterium kansassii,     M. marinum, M. ulcerans, M. simiaе, M. szulgai. Вони кислотостійкі, утворюють жовто-оранжевий пігмент на світлі, викликають туберкульозоподібні захворювання легень, лімфаденіти, ураження шкіри і підшкірної клітковини. M. ulcerans, наприклад, спричиняє виразку Бурулі.

      Скотохромогенні мікобактерії (M. scrofulaceum, M. aquaе, M. flavescens та ін.) утворюють жовто-оранжевий пігмент у темноті, викликають шийні лімфаденіти у дітей, рідше патологічні процеси в легенях.

          Нефотохромогенні види M. avium, M. intracellulare, M. xenopi – мають дуже слабку пігментацію колоній, або вони зовсім не забарвлені, викликають туберкульозоподібні захворювання легень, шкіри, нирок, кісток і суглобів, небезпечні для хворих з імунодифіцитами, особливо при ВІЛ-інфекції. Вони викликають туберкульоз у птахів і рідко у людини (M. avium).

          До групи швидкоростучих мікобактерій віднесені M. fortuitum,  M. friеdmanii, M. malmoense, M. smegmatis, M. phlei. Вони причетні до виникнення абсцесів після ін’єкцій у накроманів, запалення навколо імплантованих об’єктів (наприклад, протезів серцевих клапанів). Ураження легень і лімфаденіти у дітей викликає M. malmoense. Практичне значення в плані диференціації різних видів мікобактерій має M. smegmatis, особливо при лабораторній діагностиці захворювань сечостатевої системи.

        Мікробіологічна діагностика. Матеріалом для дослідження служить харкотиння, вміст виразок та інших уражень шкіри, пунктати лімфатичних вузлів, промивні води бронхів, сеча та ін. Лабораторні дослідження проводять за тими ж принципами і методами, що й при туберкульозі.

      Після первинної мікроскопії матеріал сіють на середовища Левенштейна-Йенсена, Фінна і обов’язково на середовище з саліцилатом натрію. Перед посівом патологічний матеріал обробляють 15-20 хв 2-5 % розчином сірчаної кислоти або 10 % розчином фосфату натрію протягом 18-20 год при 37 0С. Атипові мікобактерії більш чутливі до такої обробки, ніж палички туберкульозу. Якщо обробляти харкотиння малахітовим зеленим або генціановим фіолетовим – виділення збудників мікобактеріозів збільшується в 3-4 рази.

      Для ідентифікації атипових мікобактерій запропоновано багато тестів. Однак у бактеріологічних лабораторіях практичних медичних установ використати їх просто неможливо. Найчастіше для встановлення виду збудника враховують колір колоній, швидкість росту субкультур, ріст при різних температурах і особливо на середовищі з саліцилатом натрію, визначення каталази, синтезу ніацину та ін. Практично всі види атипових мікобактерій дають ріст на середовищі з саліцилатом натрію, в той час як збудники туберкульозу на ньому не ростуть. Ніацин синтезує лише M. tuberculosis, а збудники мікобактеріозів не утворюють нікотинової кислоти.

      Розроблені методи ідентифікації атипових мікобактерій в реакціях преципітації і фаголізису. Серологічні реакції для діагностики мікобактеріозів, особливо такі як РЗК, РІФ,  РНГА, можна буде використовувати при умові виготовлення специфічних тест-систем.

Великі можливості для визначення збудників цих захворювань відкриває впровадження ланцюгової полімеразної реакції.

 

Лепра (проказа)

                                                                 

      Лепра – первинно-хронічна генералізована інфекційна хвороба людини, яка характеризується специфічними ураженнями шкіри, слизових оболонок, периферичних нервів і внутрішніх органів. Збудник захворювання – Mycobacterium leprae. Окрім того, у щурів лепру викликає M. lepraemurium, морфологічно і тінкторіально дуже подібна до паличка прокази людини.   

 

Збудники лепри

 

      Розрізняють дві основні клінічні форми хвороби: туберкулоїдну і лепроматозну.

Клінічні прояви лепри

 

     Остання має більш тяжкий прогресуючий перебіг. Прокажений виділяє збудника при кашлі, чханні і розмові, оскільки він у великій кількості знаходиться у слизовій оболонці носоглотки. Зараження людей відбувається частіше повітряно-краплинним способом при тісному контакті з хворими на проказу.

При лабораторній діагностиці лепри використовують переважно бактеріоскопічний метод дослідження, значно рідше біопробу на мишах і броненосцях-армадилах та алегрічну пробу з лепроміном.

      Матеріалом для дослідження служать зіскоби слизової оболонки носа, скарифікати з уражених ділянок шкіри, особливо з надбрівних дуг, мочок вушних раковин, підборіддя а також біоптати лепром і ліфматичних вузлів.

      Зіскоб слизової оболонки з обох боків носової перегородки проводять металевою ложечкою до появи краплі крові. Для взяття скарифікату шкіру в місці ураження зажимають двома пальцями в складку, впродовж якої скальпелем роблять невеликий розріз глибиною 1-2 мм. Зіскоб зі стінок надрізу переносять на предметне скло. Виготовлені мазки забарвлюють за Цілем-Нільсеном або за методом Семеновича-Марциновського. При проведені гістологічних досліджень біоптатів частину зрізів також фарбують одним із вказаних методів для виявлення мікобактерій.

      Морфологія.У мазках лепрозні бактерії мають вигляд рубіново-червоний прямих або ледь зігнутих паличок з округленими кінцями.

Збудники лепри

 При мікроскопії гістологічних зрізів видно їх скупчення всередині клітин, де палички розташовуються паралельно, нагадуючи пачки сигар. Це дає змогу диференціювати їх від мікобакте рій туберкульозу, які за своїми морфологічними і тінкторіальними властивостями подібні до збудника лепри

               При посівах лепрозних матеріалів на елективні для мікобактерій середовища ріст відсутній. Гвінейські свинки не чутливі до M. lepraе.

      Біологічну пробу ставлять на мишах (особливо чутлива японська танцююча миша). Гомогенат досліджуваного матеріалу вводять у подушечку задньої лапки тварин, імунологічну реактивність яких понижують введенням Т-імунодепресантів. У позитивних випадках на місці інокуляції матеріалу через декілька місяців виникає інфільтрат, що місить гранулеми із розташованими всередині клітин мікобактеріями. При зараженні броненосців (армадил) у них розвиваються типові множинні вузли (лепроми) в тканинах і органах, де мікроскопічно виявляють багато лепрозних бактерій.

      Алергічну пробу з лепроміном використовують, в основному, для диференціації лепроматозної від туберкулоїдної форм прокази.

Алерген готують із простерилізованих в автоклаві гомогенатів уражених тканин, що містять величезну кількість мікобактерій. Лепромін уводять внутрішньошкірно в середній третині передпліччя в об’ємі 0,1мл.

      Через 48 год у позитивних випадках розвивається п’ятно гіперемії або папула (реакція Фернандеса). Значно пізніше (1-2 міс.) може утворитися бугорок, часто з некрозом (реакція Міцуди).                          

      У хворих на лепроматозну форму алергічна проба буде негативна, а у хворих на туберкулоїдну форму та здорових людей – позитивна. Отже лепромінова проба діагностичного значення не має, її використовують лише для визначення клінічної форми хвороби і прогнозу.

                                                                          

Анаеробна інфекція

Анаеробна інфекція (газова гангрена) — захворювання поліетіоло-гічного характеру. Вона зумовлюється діянням кількох видів збудни­ків із роду Clostridium в асоціації з різними аеробними мікроорганіз­мами (патогенні стафілококи і стрептококи).

Спори клостридіїв стійкі до дії факторів зовнішнього середовища, у грунті вони зберігаються 20—25 років, витримують кип’ятіння від 10—15 хв до 1 год, знешкоджуються 5 % розчином формаліну, кам’я­новугільним дьогтем.

До збудників анаеробної інфекції належать С. perfringens, С. novyi, C. septicum, С. histolyticum, С. difficile.

До непатогенних клостридіїв, що відіграють роль у патогенезі захворювання тільки в поєднанні з патогенними мікроорганізмами, належать С. aerofoetidum, G. tertium, C. sporogenes та ін. Перші чо­тири патогенних види можуть спричиняти анаеробну інфекцію кожний зокрема, але звичайно захворювання виникає при певному поєднанні кількох співчленів паразитоценозу. Менш патогенні і непатогенні види клостридіїв самі по собі не спричиняють захворювання, але вони руйнують тканини, знижують окислювально-відновний потенціал і тим самим створюють сприятливі анаеробні умови для розвитку патогенних  видів.

Clostridium perfringens

Збудника відкрили в 1892 р. М. Уелчем і Г. Неттал. Цей мікроорганізм — нормальний насельник кишок у людей і тварин. Поза організмом зберігається роками у вигляді спор. Майже постійно є в грунті. Під час першої світової війни його виявляли в 70—80 % усіх випадків анаеробної інфекції, а під час другої світової війни —у 91 —100 %.

Морфологія. С. perfringens— товста поліморфна нерухома паличка з округленими кінцями завдовжки 3—9 мкм і завширшки 0,9—1,3 мкм.

 

 

 

В організмі тварин і людини утворює капсулу, у зовнішньому середови­щі — овальної форми спору, що розташована субтермінально і перевищує поперечник самого мікроорганізму. Збудник забарвлюється всіма аніліновими барвниками,   грампозитивний.

Культивування. С perfringens росте в усіх живильних середовищах, що застосовуються для культивування анаеробів (рН 6,0—8,0). Оптимальна тем­пература для росту 35—37 °С (крайні границі — 16 і 50 °С).

У середовищі Кітта — Тароцці дає рівномірну каламуть із значним виді­ленням газу. В глибині агару стовпчиком колонії мають вигляд дисків або сочевичок (рис. 82, б). На кров’яному агарі з глюкозою утворює гладенькі дископодібні колонії сірого кольору з рівними краями і підвищенням у центрі.

Токсиноутворення. Збудник продукує складний за антигенним і хімічним складом токсин, що включає кілька фракцій: а-гемолізину, 6-гемолізину, Р-токсину (некротоксину), е-токсину (нейротоксину) та ентеротоксину, С. per­fringens утворює протеїназу, плазмін, колагеназу, гіалуронідазу, нейраміні-дазу,  дезоксирибонуклеазу.

Антигенна структура. С perfringens має шість сероварів: А, В, С, D, Е, F, які різняться між собою серологічно і специфічністю своїх токсинів.

Серовар А живе в кишках людини в природних умовах і є збудником ана­еробної інфекції, коли проникає парентеральним шляхом; серовар D спричиняє інфекційну ентеротоксемію у людей і тварин; серовар Е — некротичний енте­рит у людей.

Патогенність для тварин. З експериментальних тварин сприйнятливі мор­ські свинки, кролі, голуби, миші. На розтині заражених тварин, що загинули, у місці введення утворюється набряк, помітне розплавлення тканини, скуп­чення газу, в крові майже завжди виявляють клостридії. С. perfringens пато­генна для свійських тварин, спричиняє у них низку тяжких захворювань.

Clostridium novyi

Збудника відкрив Ф. Нові в 1894 р. Етіологічну роль йо го довели в 1915 р. М. Вайнберг і К- Сеген. Щодо частості виникнення анаеробна інфекція займає друге місце; у грунті   виявляють у 64 % випадків.

Морфологія. С. novyi — крупна поліморфна паличка з округленими кінця­ми завдовжки 4,7—22,5 мкм, завширшки 1,4—2,5 мкм. Часто розташовується короткими ланцюжками (рис. 83, а), рухлива, перитрих, має до 20 джгутиків; у зовнішньому середовищі утворює овальні спори, розташовані звичайно суб-термінально, в організмі тварин і людини капсул не продукує, забарвлюється грампозитивно.

Культивування.   С   novyi — строгий  анаероб.   Оптимальна  температура росту 37—45 °С (крайні границі — 15 і 50 °С), рН 7,8. У середовищі Кітта — Тароцці росте з накопиченням газу, випаданням осаду  і  просвітленням сере­довища. На глюкозокров’яному агарі утворює шорсткі  колонії з трохи піднятим центром і бахромчастими краями з зонами гемолізу. У посіві в агарі стовпчиком розвивається у вигляді пластівчастих колоній з компакт­ним центром і тонкими нитками, що відходять від нього.

 

Антигенна структура. С. novyi має чотири серовари: А, В, С, D, із них тільки серовар А є збудником анаеробної інфекції у людини.

Токсиноутворення. С. novyi серовар А продукує а, у, б, є-токсини, се­ровар В — а-, Р-, £-, г -токсин; серовар С слабкотоксигенний, у культурах виділяє активний гемолізин,  що має властивості фосфоліпази.

Патогенність для тварин. При підшкірному введенні культури кролям, білим мишам, морським свинкам, голубам виникає драглистий, желеподібний набряк, звичайно без пухирців газу. На розтині набрякла тканина безбарвна або трохи гіперемійована, помітна  незначна зміна м’язів.

Clostridium septicum

Збудник виділений у 1877 р. Л. Пастером і Ж- Жубером із крові корови. У 1881 р. Р. Кох довів, що цей мікроорганізм спричиняє злоякісний набряк. У грунті трапляється у 80 %  досліджуваних проб.

Морфологія. Клостридії поліморфні, довжина їх коливається від 3,1 до 14,1 мкм, товщина — від 1,1 до 1,6 мкм; трапляються і ниткоподібні форми до 50 мкм завдовжки. Мікроорганізми рухливі, перитрихи, в організмі тварин не продукують капсул, спори їх розташовуються центрально або субтермінально,    грампозитивні.

Культивування. Клостридії злоякісного набряку — строгі анаероби, тем­пературний оптимум росту 37—45 °С, рН середовища 7,6. Добре розвива­ються в МПБ і на МПА з додаванням 0,5 % розчину глюкози. На глюкозо-кров’яному агарі утворюють суцільний ніжний наліт у вигляді химерно пере­плетених ниток на тлі гемолізу. В агарі стовпчиком колонії мають вигляд клуб­ків вовни (рис. 84, б). У бульйоні спричиняють рівномірне помутніння з на­ступним випаданням пухкого білуватого слизистого осаду.

Токсиноутворення. Збудник злоякісного набряку виробляє летальний екзотоксин, який некротизує токсин, гемотоксин, гіалуронідазу, нейраміні-дазу,    колагеназу.

Гемолітичні властивості проявляються щодо еритроцитів людини, коней, барана,  кроля  і морської свинки.

Антигенна структура. За допомогою РА у С. septicum виявлено шість сероварів на основі відмінностей Н-антигенів. Має спільні антигени з С chau–voei, яка спричиняє анаеробну інфекцію у тварин.

Патогенність для тварин. Із свійських тварин сприйнятливі коні, вівці, свині, велика рогата худоба. Заражені морські свинки гинуть через 18— 48 год. У мазках-відбитках із зрізів печінки загиблих тварин можна виявити довгі зігнуті нитки,  що складаються з С. septicum.

Clostridium histolyticum

Збудник виділений у 19І6 р. М. Вайнбергом та Е. Сегеном. Це грампозитивна, рухлива паличка завдовжки 1,6—3 мкм і діаметром 0,6—1 мкм, утво­рює овальні спори, розташовані субтермінально. С. histolyticum має власти­вість продукувати колагеназу, протеїназу і діалізабельний токсин, які роз­плавляють тканини зараженого організму. При внутрішньовенному введенні тваринам екзотоксин спричиняє лізис (3-клітин підшлункової залози, в резуль­таті чого швидко настає смерть.

 

Лабораторна діагностика.

 Матеріал для досліджень. В якості досліджуваного матеріалу беруть шматочки уражених тканин, рановий вміст, eкcудат, випіт при набряках; при харчових токсикоінфеціях – блювотні маси, прогмивні води шлунка, випорожнення, кров, залишки підозрілої їжі; при псевдомембранозному коліті – біоптати слизової оболонки сігми та випорожнення. В разі необхідності перев’язувальний та шовний матеріал (шовк, кетгут), одяг, грунт, секційний матеріал (шматочки некротизованих тканин, печінки, селезінки). З метою попередження шкідливої дії кисню повітря на анаеробну мікрофлору тверді матеріали для дослідження краще брати у короткі пробірки, що герметично закриваються. Рідкі досліджувані матеріали можна набирати у шприц, на голку насадити гумовий корок і в такому вигляді транспортувати до лабораторії (рис. 1).

 

Рис. 1.   Забір і доставка матеріалу до лабораторії

    

Мікробіологічна діагностика газової гангрени зводиться до виділення чистих культур збудників, їх ідентифікації на основі морфологічних, культуральних і біохімічних властивостей та визначення типів токсинів.

Бактеріоскопія є необхідним етапом для орієнтації в характері ранової мікрофлори. Для цього готують мазки-відбитки з уражених тканин, ексудату чи випоту, забарвлюють за Грамом або метиленовою синькою. Наявність у мазках великої кількості крупних грампозитивних паличок зі спорами чи капсулами     (C. perfringens) або без них може служити ознакою можливого розвитку газової гангрени (рис. 2 )

                                                                           

1

 

 

2

 

Рис. 2. C. Perfringens: 1- капсули 2-спори

 

З метою орієнтовної  ідентифікації клостридій можна  використати люмінісцентно-серологічний метод, коли мазки обробляють діагностичними флуоресцентими сироватками. За видом сироватки яка викликає специфічне світіння навколо оболонок бактерій  під  люмінесцентним мікроскопом, визначають вид збудника.

Бактеріологічне дослідження. Рідкі досліджувані матеріали сіють у нативному вигляді. Шматочки уражених тканин та інші щільні матеріали спочатку гомогенізують у фарфорових ступках з піском, добавляючи рівний об’єм ізотонічного розчину хлориду натрію. Будь-який матеріал розділяють на 2 частини;  одну з них прогрівають 20 хв при 80 °С, другу не піддають термічній обробці. Обидві проби паралально висівають на спеціальні сердовища для культивування анаеробних мікроорганізмів.

Для первинного накопичення анаеробів широко використовують середовище Кітта-Тароцці. На ньому C. perfringens росте з інтенсивним  помутнінням і бурхливим газоутворенням. Інші види утворюють помутніння і менше виділення газу або без нього (C. histolyticum ). При посіві на стерильне знежирене лакмусове молоко C. perfringens  вже через 4-5 год викликає його звудження з утворенням цегляного кольору губчастого згустка, який газ підіймає на поверхню пептонізованої рідини.

Класичним середовищем  для отримання ізольованих колоній є кров’яний цукровий агар Цейслера (до МПА додають 15% дефібринованої крові і 2% глюкози). Чашки з посівами вирощують в анаеростаті. На цьому агарі колонії основних збудників мають гладеньку дископодібну форму сіруватого кольору з рівними або бахромчастими краями і піднятим центром, оточені зоною гемолізу  (рис. 3 ).

 

 

                                      Рис. 3.   Зони гемолізу навколо

колоній C. perfringens                       Рис.  4.  Колонії C. novyi на агарі

 

 

На середовищі Вілліса-Хоббса (МПА з лактозою, індикатором нейтральним червоним, яєчним жовтком і знежириниь молоком) колонії          C. perfringens червоного кольору і зоною опалесценції; колонії C. novyi, безбарвні (не розкладають лактози), але із зоною опалесценції; колонії              С. septicum червоні; навколо колоній C. novyi на агарі (ферментують лактозу), але C. perfringens не мають райдужних вінчиків.

 Колонії C. histolyiticum, С. sordellii, C. difficile безбарвні, а ореол опалесценції мають лише колонії C. sordellii. На кров’яному агарі з бензидином колонії C. novyi  чорніють після перебування на повітрі ( рис. 4.)

При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через     3-4 години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Харакерні особливості  росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експрес-діагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.

Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікроскопують, пересівають на середовище Кітта – Тароцці, отримують чисту культуру й ідентифікують її за морфологічними, культуральними, і біохімічними властивостями (табл. 1.). Важливе значення має також визначення типів екзотоксинів.

Таблиця 1

Диференціація основних видів патогенних клостридій

                                                                                                     

 

При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних умов ізоліовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолодженому до 45 °С цукровому агарі, розлитому в пробірки по 10 мл. Із кожного розведення агар натягують у трубки а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інкубації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії петлею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й ідентифікують їх.

    Використовують також сучасні апарати і тест-системи  для культивування й ідентифікації анаеробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при повній відсутності кисню повітря.

Однак у рутинних бактеріологічних лабораторіях виділення і повну ідентифікацію чистих кудьтур проводять рідко, так як весь процес займає багато часу, вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів.  У зв’язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.

Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використовують видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) бульйонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до основних видів збудників (табл. 2 ). У 6-у пробірку вносять 6 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом 40 хв і кожну з них в об’ємі 0,5 мл вводять внутрішньовенно двом мишам. Видову належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі тварин контрольної та інших дослідницьких груп.

Таблиця 2

Схема постановки реакцій нейтралізації на білих мишах