ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ГЕЛЬМІНТОЗІВ.
Медична гельмінтологія – наука про паразитичних червів – гельмінтів, які є збудниками захворювань гельмінтозів.
Гельмінтози поділяються на трематодози, збудниками яких є сисуни, цестодози – викликані стьожаками, нематодози – круглими червами.
Лабораторна діагностика гельмінтозів
Ще наприкінці XIX століття розпочалася розробка методів лабораторної діагностики гельмінтозів. М.М. Якимович у 1894 р. описав метод нативного мазка у 10%-ному розчині натрію хлориду, Є.Д. Гінзбург у 1911 році використав новий спосіб дослідження калу на яйця гельмінтів – метод збагачення. У вдосконаленні цих і розробці нових методів велику роль зіграли вчені і практичні лікарі клінічних і санітарно-епідеміологічних закладів.
За епідеміологічною класифікацією К.І.Скрябіна і Р.С.Шульца (1951), залежно від біологічного циклу збудників і шляхів зараження людини гельмінтози поділяють на дві групи – геогельмінтози і біогельмінтози.
Збудники геогельмінтозів (геогельмінти) розвиваються прямим шляхом без проміжних хазяїнів. Яйця цих гельмінтів дозрівають переважно у ґрунті, а зараження людини відбувається при проковтуванні інвазійних яєць із розвинутими личинками або шляхом активного проникнення личинок через шкіру. До геогельмінтів відносяться аскарида, волосоголовець, анкілостоміди, стронгілоїдос, гострик. Людина, що інвазована цими гельмінтами (за винятком гостриків), не може бути безпосереднім джерелом зараження оточуючих при контакті.
Збудники біогельмінтозів (біогельмінти) розвиваються за участі одного або двох проміжних хазяїнів. Зараження людини здійснюється при вживанні в їжу проміжних хазяїнів, що містять личинки або іншими шляхами. У тих випадках, коли людина є проміжним хазяїном для біогельмінтів (ехінокок і альвеокок), зараження відбувається шляхом проковтування яєць при контакті з хворими тваринами (кінцевими хазяїнами). До біогельмінтів відносяться всі сисуни, стьожкові гельмінти і деякі нематоди (трихінела, ришта, філярії). Особливе місце серед біогельмінтів займає карликовий ціп’як, розвиток якого може відбуватися з проміжним господарем – членистоногим і прямим шляхом (звичайний шлях передачі). Тому хворий на гіменолепідоз є джерелом зараження при контакті з оточуючими. По відношенню до озброєного ціп’яка людина може бути кінцевим і проміжним хазяїном, заражаючись цистицерками. У зв’язку з цим носій стьожкової стадії небезпечний для оточуючих. Таким чином, можна виділити групу гельмінтозів, що передаються контактним шляхом: ентеробіоз, гіменолепідоз та цистицеркоз.
В епідеміологічному відношенні досить важливою є група гельмінтозоонозів, збудниками яких є типові гельмінти тварин, що здатні паразитувати й у людей: фасціола, дикроцеліум, ехінококи, трихостронгіліди та ін. Резервуарами таких гельмінтів у природі є домашні і дикі тварини.
На даний час існує велика кількість різноманітних методів гельмінтооволярвоскопії, які відрізняються економічністю, ефективністю та складністю дослідження при виявленні тих або інших гельмінтозів.
Методи лабораторної діагностики гельмінтозів поділяються на дві великі групи: спеціальні (прямі) і опосередковані методи досліджень.
Спеціальні методи базуються на безпосередньому виявленні самих гельмінтів та їх фрагментів, а також личинок і яєць гельмінтів. До цієї групи відносяться методи дослідження фекалій, сечі, жовчі, дуоденального вмісту, харкотиння, крові і матеріалу, отриманого при зскрібку з періанальної ділянки, піднігтьових просторів та ін. Опосередковані методи виявляють вторинні зміни, що виникають в організмі людини в результаті життєдіяльності гельмінтів. До даної групи відносяться загальні клінічні методи обстеження: клінічний огляд хворого, дослідження морфологічного складу крові, серологічні, імунологічні, хімічні та біохімічні реакції, рентгенологічні дослідження, ультразвукова діагностика, комп’ютерна томографія тощо.
Макроскопічні методи дослідження
Макроскопічні методи направлені на пошук гельмінтів або їх фрагментів (сколексів, члеників і частин стробіли цестод).
Вони можуть застосовуватися:
– для діагностики тих гельмінтозів, збудники яких або не виділяють яйця з екскрементами хворого або виділяють їх у невеликій кількості і не завжди (при ентеробіозі у фекаліях виявляються гострики, при теніїдозах – членики цестод);
– для визначення ефективності лікування;
– при діагностичній дегельмінтизації;
– при підозрі на гельмінтози, які не виявляються іншими методами.
Уніфікований для широкого застосування у практиці охорони здоров’я є метод перегляду розріджених фекальних мас у чорних фотографічних кюветах або на чорному фоні чашки Петрі. Часто використовуються методи перегляду під лупою або неозброєним оком, відстоювання або поступового промивання, промивання через сита (прилад Воскресенського-Енштейна) та ін.
Принцип. У розріджених фекаліях на темному фоні фотографічних кювет або чашок Петрі добре виділяються світлі гельмінти.
Обладнання. Мікроскоп, лупа, чорні фотографічні кювети, чашки Петрі, пінцети або препарувальні голки, предметні скельця.
Хід дослідження. Фекалії розмішують з водою до отримання рівномірної суспензії, після чого при доброму освітленні ретельно переглядають окремими невеликими порціями у чорних фотографічних кюветах або на темному фоні у чашках Петрі. У випадку підозрілих часточок або коли завчасно передбачають виявлення дрібних форм гельмінтів (гостриків, карликового ціп’яка та ін.), а також у випадку пошуку карликових ціп’яків чи голівок цестод після лікування, всі підозрілі білі часточки пінцетом переносять на предметне скельце у краплю гліцерину або води і досліджують під лупою або під мікроскопом. При виявленні у випорожненнях утворень, схожих на фрагменти гельмінтів, потрібно розглядати їх під лупою, затиснувши між двома предметними скельцями.
Аналіз отриманих результатів. Диференційна діагностика між окремими гельмінтами ґрунтується на їх морфологічних відмінностях. Визначення приналежності нематод можливе лише по суцільних екземплярах, рідше – по великих фрагментах, що зберігають характерні для діагностики органи. Цестод можна діагностувати за сколексами, зрілими та гермафродитними члениками.
Відстоювання або послідовне промивання
Збирають всі порції випорожнень хворого після прийому протиглисних і проносних препаратів.
Випорожнення кладуть у скляні циліндри (дво-, трилітрові) або високі склянки чи відра. Розбивають сильним струменем води і відстоюють; при цьому гельмінти спускаються на дно. Каламутний шар води над осадом зливають без збовтування, до осаду доливають чисту воду, перемішують, знову зливають і так до тих пір, поки верхній шар не стане прозорим.
Промитий осад переглядають у чорних фотографічних кюветах або у глибокому посуді покритих чорним лаком. Осад переглядають неозброєним оком або під лупою. Для контролю переглядають і промивні води, оскільки деякі черви (наприклад, карликовий ціп’як) часто спливають на поверхню.
Промивання через сита
Прилад Воскресенського-Енштейна складається з 5-6 сит з отворами різного діаметра.
Принцип. Часточки випорожнень, які розбиваються струменем води, виносяться у відвідну трубу, а гельмінти залежно від розміру, затримуються на ситах різного діаметра.
Мікроскопічні методи дослідження
Мікроскопічні методи дослідження спрямовані на виявлення яєць і личинок гельмінтів. Застосовують:
– з метою діагностики;
– для контролю ефективності лікування;
– для оцінки якості проведення комплексу протигельмінтних заходів.
1. Метод товстого мазка з целофановою накривною платівкою за Като
Принцип. Виявлення гельмінтів у просвітленому товстому мазку фекалій.
Обладнання. Мікроскоп.
Посуд. Предметні скельця, гумові корки.
Реактиви. 1. Розчин Като: гліцерин, 6 мл 3%-ного розчину малахітової зелені, 500 мл 6 %-ного розчину фенолу. 2. Целофан.
Хід визначення. Целофанові смужки розміром 8,2 см2 готують із гідрофільного целофану і попередньо обробляють шляхом занурення їх у розчин Като: гліцерин розмягчує целофан, підвищує його проникливість, просвітлює препарат і запобігає його висиханню; фенол призначається для захисту дослідника від патогенних бактерій; малахітова зелень зменшує втомлюваність очей. Смужки повинні розташовуватись у рідині так, щоб вони прилягали одна до одної. Через 24 год розчин проникає у целофан і смужки стають придатними для використання. Готові смужки тривалий час можуть зберігатися у вказаній суміші в посуді, який добре закривається.
Наносять 100 мг фекалій без додавання води або будь-якої іншої рідини на предметне скельце, покривають замість накривного скельця спеціально обробленою смужкою целофану і придавлюють (ущільнюють) на предметному скельці гумовим корком таким чином, щоб фекалії не видавлювалися з-під целофану.
Мікроскопічне дослідження мазка рекомендується проводити через годину після його приготування. За цей період при кімнатній температурі мазок висихає і стає більш прозорим, що полегшує знаходження та диференціювання яєць гельмінтів. У теплу пору року для запобігання надмірному висиханню мазка мікроскопію слід проводити через 30-40 хв, а в деяких випадках рекомендують класти на целофанову смужку вологу губку.
Аналіз отриманих результатів. Під мікроскопом проводиться підрахунок яєць у всьому мазку.
Діагностичне значення. Описаним методом можна виявити зараження аскаридами, волосоголовцями, стьожаками, трематодами, теніїдами та іншими видами гельмінтів, у меншій мірі анкілостомідами і карликовим ціп’яком.
1. Дослідження фекалій з використанням насиченого розчину натрію азотнокислого за методом Калантарян або суміші азотнокислого натрію і калію за методом Брудастова і Красноноса
Принцип. Фекалії суспензують у насиченному розчині азотнокислого натрію або в суміші азотнокислих натрію і калію, які мають значно більшу питому вагу, ніж яйця гельмінтів. При цьому яйця гельмінтів спливають на поверхню рідини. Утворена плівка досліджується під мікроскопом.
Обладнання. Мікроскоп.
Посуд. Склянки, скляні палички, предметні й накривні скельця.
Реактиви. 1. Насичений розчин натрію азотнокислого. Для приготування цього розчину один об’єм натрію азотнокислого розчиняють у рівному об’ємі води, суміш кип’ятять до утворення плівки і переливають без фільтрації у сухі пляшки. Питома вага розчину 1,38. 2. Суміш азотнокислих натрію і калію. Для приготування суміші в 1 л води розчиняють при підігріванні 900 г натрію азотнокислого і 400 г калію азотнокислого. Питома вага розчину 1,47-1,48.
Хід визначення. Фекалії 5-10 г у невеликих склянках ретельно розмішують паличкою у 20 частинах насиченого розчину азотнокислого натрію або суміші азотнокислих натрію і калію. Одразу ж після закінчення розмішування паличкою або паперовим совочком видаляють великі частки, що сплили на поверхню. До поверхні сольового розчину прикладають предметне скельце. Якщо між сумішшю і предметним скельцем утворюється простір, у склянку доливають сольовий розчин до повного контакту суміші з предметним скельцем. Суспензію залишають на 20-30 хв. Предметне скельце знімають із склянки, повертають нижньою поверхнею догори і досліджують під мікроскопом без накривного скельця.
Аналіз отриманих результатів. Під мікроскопом переглядають всю плівку, що прилипла до предметного скельця (з метою запобігання висушуванню препарату й утворенню кристалів солі до плівки додають 2-3 краплі 50 %-ного розчину гліцерину).
Діагностичне значення. Описаним методом можна виявити зараження аскаридами, волосоголовцями, анкілостомідами, теніїдами, трематодами, стьожаками та іншими видами гельмінтів.
3. Дослідження фекалій на яйця гельмінтів з використанням синтетичних детергентів за методом Красильникова
Принцип. Концентрування яєць гельмінтів в осаді під дією поверхнево-активних речовин, що входять до складу детергентів (синтетичних миючих засобів).
Обладнання. Мікроскоп, сушильна шафа.
Посуд. Флакони з поліетиленовим корком ємністю 30 мл, предметні скельця, пастерівські піпетки з високо відбитим кінцем.
Реактиви. 1. 1%-ний розчин миючого засобу.
Пральний порошок висушують у сушильній шафі при 1000С протягом 1-2 год, з нього роблять наважки по 10 г. Одна така наважка розчиняється в 1 л водопровідної води і в такому вигляді використовується для дослідження. За відсутності сушильної шафи порошок висушують у кюветах на будь-якому нагрівальному приладі 1-2 год.
2. Накривні скельця або целофан 20х30 мм. Можна користуватися целофаном, який приготовлений для дослідження фекалій методом товстого мазка за методом Като.
Хід визначення. У флакони ємністю 30 мл наливають 20-25 мл розчину детергента і роздають пацієнтам. Обстежуваний повинен покласти в цей розчин шматочок фекалій об’ємом приблизно з великий лісний горіх. Фекалії повинні міститися в розчині не менше доби. За цей час на дні флакона утворюється дво- або тришаровий осад. Нижній шар складається з грубих важких часток, у середньому шарі концентруються яйця гельмінтів, над якими інколи осідають легкі пластівці. Пастерівська піпетка з високо відбитим кінцем закривається пальцем і занурюється у середній шар осаду якомога нижче, але не торкаючись дна флакона. Палець відбирається і розчин зі зваженими у ньому яйцями гельмінтів потрапляє у піпетку, звідки переноситься на предметне скельце. Крапля покривається накривним скельцем або шматочком целофану, що приготовлений для дослідження фекалій методом товстого мазка за методом Като і досліджується під мікроскопом. Рекомендується готувати два препарати на одному склі.
За необхідності термінового дослідження свіжих фекалій їх розміщують у детергент у ваговому співвідношенні 1:10, механічно перемішують шпателем або паличкою до утворення суспензії і залишають на 30 хв. Потім вміст пробірки струшують 1-2 хв і центрифугують 5 хв при 1000-1500 об/хв або залишають на 2-4 год до утворення осаду, з якого готують два препарати на одному склі й досліджують під мікроскопом. Якщо воду для приготування розчину беруть із відкритих водойм (ставків, озер, джерел та ін.), її слід прокип’ятити.
Аналіз отриманих результатів. Під мікроскопом переглядають повністю два препарати і підраховують всі яйця в них.
Діагностичне значення. Описаним методом можна виявити яйця всіх видів гельмінтів, що виділяються з фекаліями.
4. Виявлення личинок гельмінтів за методом Бермана
Принцип. Метод базується на термотропізмі личинок, які мігрують у напрямку тепла.
Обладнання. Мікроскоп, центрифуга, металевий штатив, металева сітка (можна використовувати цідилко для молока), металеві затискачі.
Посуд. Лійки, центрифужні пробірки, гумові корки, предметні скельця.
Хід визначення. Металеву сітку, на якій знаходиться 5-10 г фекалій, розміщують у скляній лійці, яка прикріплена до металевого штатива. На нижній кінець лійки одягають гумову трубку із затискачем. Сітку з фекаліями припіднімають і заливають лійку нагрітою до 50 С водою так, щоб нижня частина сітки з фекаліями була занурена у воду. За наявності у фекаліях личинок стронгілоїдеса вони активно переходять у теплу воду і накопичуються у нижній частині гумової трубки, одягнутої на лійку. Через 4 год затискач на трубці відкривають і випускають рідину в 1-2 центрифужні пробірки. Після центрифугування протягом 2-3 хв поверхневий шар швидко зливають, а осад розміщують на предметному склі і досліджують під мікроскопом.
Аналіз отриманих результатів. Знаходження личинок стронгілоїдеса в осаді на предметному склі.
Діагностичне значення. Дослідження проводять при підозрі на стронгілоїдоз.
5. Культивування личинок на фільтрувальному папері за методом Харада та Морі
Принцип. Філярієподібні личинки анкілостом або некаторів розвиваються з яєць у пробірках на фільтрувальному папері.
Обладнання. Мікроскоп, предметні скельця, лупа, термостат, пробірки, корки, фільтрувальний папір.
Хід визначення. На смужку фільтрувального паперу розміром 1515 см наносять 0,5 г свіжих фекалій таким чином, щоб смужка на кінцях залишалася вільною, і в пробірку, яка заповнена на 1/4-1/5 водопровідною водою, занурюють нижній кінець, вільний від фекалій. Верхній кінець, що виступає з пробірки, фіксується корком. Пробірки витримують у термостаті при 28С протягом 5-6 днів. У теплу пору року пробірки можна витримувати на повітрі, але експозиція у цьому випадку повинна збільшуватися. Філярієподібні личинки, що розвинулися за цей період, спускаються по паперу у воду й осідають на дні. Смужку витягають з пробірки, а рідину досліджують під лупою або неозброєним оком при боковому освітленні дна пробірки. У сумнівних випадках рідину переносять на предметне скло і досліджують під мікроскопом.
Аналіз отриманих результатів. Під лупою або неозброєним оком при боковому освітленні дна пробірки виявлють філярієподібні личинки анкілостом або некаторів.
Діагностичне значення. Описаним методом можна виявити зараження анкілостомами або некаторами і провести диференціальну діагностику захворювань, що ними викликаються.
6. Зскрібок із періанальних складок дерев’яним шпателем
Принцип. Виявлення яєць гостриків, відкладених самкою в періанальних складках і яєць теніїд, що потрапили з проглотид, які відірвалися і можуть виповзати з відхідника.
Обладнання. Мікроскоп.
Посуд. Предметні скельця, накривні скельця, дерев’яні шпателі.
Реактиви. 50%-ний розчин гліцерину або 1%-ний розчин натрію двовуглекислого (харчової соди).
Хід визначення. Зскрібок із періанальних складок роблять зранку до дефекації, а в жінок і до сечовипускання, бажано до того, як пацієнт встане з ліжка або ввечері через 2-3 год після того, як він ліг спати. Зскрібок роблять відточеним у вигляді шпателя сірником або спеціально нарізаними дерев’яними шпателями, змоченими у 50%-ному розчині гліцерину або в 1%-ному розчині харчової соди. Зскрібок проводиться обережно з поверхні складок навколо відхідника.
Отриманий матеріал щільно знімають із шпателя краєм накривного скельця на предметне в краплю того розчину, яким змочений шпатель. Краплю покривають цим накривним скельцем і досліджують під мікроскопом. Після одноразового використання шпатель спалюють. За необхідності транспортування матеріалу шпатель після зскрібка переносять у краплю цього ж розчину на предметне скельце. Після висихання препарату його разом з шпателем накривають іншим предметним скельцем і загортають у папір (щоб поверхні скелець не доторкалися, між ними кладуться чисті шпателі). У лабораторії перед мікроскопуванням на суху краплю наносять розчин лугу або гліцерину, розтирають тим же шпателем і досліджують під мікроскопом.
Аналіз отриманих результатів. Підраховують кількість яєць у краплі на предметному склі.
Діагностичне значення. Застосовують для діагностики теніаринхозу й ентеробіозу.
7. Зскрібок із періанальних складок клейкою стрічкою
Принцип. Яйця гельмінтів приклеюються до клейкої стрічки, прикладеної до періанальних складок.
Обладнання. Мікроскоп, пінцет.
Посуд. Предметні скельця.
Реактиви. Клейка стрічка.
Хід дослідження. Смужка клейкої стрічки 5-6 см довжиною і 1,5-2 см шириною за допомогою пінцету захоплюється з одного боку і наклеюється на періанальну ділянку. Стрічка повинна бути повністю притиснута до шкіри, для чого її пригладжують скляною паличкою. Потім стрічку відклеюють і знову приклеюють, але вже на інше місце періанальної ділянки. Цю процедуру повторюють декілька разів, після чого стрічку наклеюють на предметне скло. Між склом і стрічкою не повинно бути пухирців повітря. Препарат проглядають під мікроскопом того ж дня. Якщо це не можливо, то препарат зберігають у холодильнику протягом трьох днів.
Аналіз отриманих результатів. Під мікроскопом переглядають смужку клейкої стрічки і підраховують всі яйця гельмінтів.
Діагностичне значення. Крім яєць гостриків і бичачого ціп’яка, при такому дослідженні можуть бути виявлені яйця й інших гельмінтів.
8. Метод нативного мазка
Невеликий шматочок випорожнень (величиною з просяне зернятко) беруть сірником чи скляною паличкою (можна і дерев’яною) з різних місць порції калу, щільно розтирають на предметному склі у краплі 50%-ного розчину гліцерину, фізіологічного розчину або води, накривають накривним склом, яке злегка придавлюють. Препарат повинен бути тонким, прозорим і рівномірним. Переглядають не менше 2 препаратів.
Цей метод використовується як додаток до інших методів.
9. Метод закручування за Шульманом
Беруть 2-3 г випорожнень, ретельно перемішують з три- або п’ятикратною кількістю води чи фізіологічного розчину за допомогою скляної палички частими колоподібними рухами. Личинки яєць геогельмінтів накопичуються в центрі біля скляної палички. Після закінчення перемішування краплі суміші швидко переносять скляною паличкою на предметне скло, накривають накривним скельцем і досліджують.
10. Метод Фюллеборна
Завчасно готують насичений розчин кухонної солі (400 г солі розчиняють у 1 л води, нагрівають до кипіння і розчинення всіх кристалів, фільтрують). Розчин застосовують холодним (питома вага 1,2).
Хід дослідження. Випорожнення у кількості 5-10 г кладуть у склянку місткістю 100-200 мл і щільно розтирають скляною або дерев’яною паличкою в насиченому розчині кухонної солі. Розчин переливають поступово в міру розмішування випорожнень, причому загальна кількість розчину повинна бути приблизно у 20 разів більшою від взятих випорожнень. Після розмішування з поверхні суміші видаляють шпателем або шматочком чистого паперу великі частинки, що виплили на поверхню (непереварені рештки їжі та ін.). Суміш залишають стояти 1-1,5 год. Знімають на предметне скло всю поверхневу плівку шляхом повторних дотиків платиновою або дротяною петлею діаметром не більше 1 см. Всього готують на двох предметних скельцях не менше чотирьох препаратів. Після кожного аналізу петлю прожарюють на слабкому вогні.
Приготовлені препарати переглядають під мікроскопом.
Діагностичне значення. За даним методом виявляють яйця всіх нематод (за винятком незапліднених яєць аскарид), яйця карликового ціп’яка і стьожаків.
У районах широкого розповсюдження цих гельмінтів у додаток до методу Фюллеборна необхідно переглядати 2-4 препарати з дна посуду. Після зняття плівки з поверхні рідину зливають, а з осаду беруть декілька крапель піпеткою або петлею, переносять на предметне скло в краплю гліцерину (для просвітлення), накривають накривним склом і досліджують.
11. Метод Телемана
Фекалії величиною з лісовий горіх розтирають у маленькій ступці або склянці з сумішшю рівних об’ємів ефіру та 50% НС1. Соляна кислота розчиняє слиз та вапнякові солі, ефір екстрагує нейтральні жири та жирні кислоти. Отриману емульсію проціджують через металеве ситечко в центрифужну пробірку і центрифугують біля 1 хв. У пробірці утворюється 3 шари. Верхній – ефір та розчинені в ньому жири. Середній – соляна кислота з розчиненим у ній слизом, і третій нижній шар або осад, який складається з нерозчинених часток калу. Піпеткою забирають осад, переносять на предметне скло, накривають накривним склом і мікроскопують
Морфологія яєць гельмінтів
Яйце печінкового сисуна (Fаsсіоlа hераtiса) овальної, яйцеподібної форми, оболонка тонка, гладенька, жовтого кольору, на одному з полюсів кришечка. У цитоплазмі численні жовткові включення. Розміри 130-145´70-90 мкм.
Яйце стьожака широкого (Diphyllobothrium latum) яйцеподібної форми, оболонка товста, гладенька, добре видно кришечку на одному з полюсів, жовто-сірого кольору. Зерниста внутрішня структура. Розміри 68-70´45 мкм. Інколи (при обробці калу гліцерином або при підсиханні матеріалу) яйця набувають форми “човника”.
Яйце ланцетоподібного сисуна (Dicrocoelium lanceatum) неправильної яйцеподібної форми, оболонка товста, гладенька, жовтого або темно-коричневого кольору. На верхньому полюсі міститься кришечка. Один бік яйця сплющений і злегка ввігнутий. У середині яйця виявляють дві великі жовточні клітини. Розміри 38-45´25-30 мкм.
Яйце сибірського (котячого) сисуна (Opisthorchis felineus) яйцеподібної форми, оболонка тонка, гладенька, блідо-жовтого кольору, на верхньому полюсі яйця розташована кришечка, на протилежному – шпичка. Нижня половина яйця розширена. У середині яйця дрібна зернистість. Розміри 26-32´11-15 мкм.
Яйця (онкосфери) бичачого (Teaniarhynchus saginatus) і свинячого (Teania solium) ціп’яків (солітерів) кулеподібної форми. Онкосфера (зародок) має товсту, радіально посмуговану оболонку темно-коричневого кольору з шістьма ембріональними гачками. Розміри 30´40 мкм.
Яйця аскариди (Ascaris lumbricoides):
а) запліднене яйце овальної (рідше кулеподібної) форми, оболонка товста, багатошарова, зовнішня оболонка горбкувата, темно-жовтого або жовто-бурого кольору. Внутрішня оболонка двоконтурна, гладенька і прозора, часто безбарвна. У середині яйця є дрібнозернистий кулеподібний бластомер, який займає весь простір за виключенням полюсів. Розміри 50-70´40-50 мкм;
б) незапліднене яйце – видовженої, інколи неправильної (грушоподібної, трикутної) форми: білкова оболонка тонка, дрібногорбкувата, жовтуватого кольору. У середині яйця великі жовткові кулі, що займають весь простір, включаючи і полюси. Рідше яйця бувають без білкової оболонки, прозорі, сіро-зеленого кольору. Розміри 50-100´40-50 мкм.
Яйце гострика (Enterobius vermicularis) неправильної овальної форми, асиметричне. Один бік сплющений, інший опуклий. Оболонка тонка, гладенька, прозора. У середині яйця трапляється різні стадії дроблення, до пуголовкоподібної личинки включно. Розміри 50-60´30-32 мкм.
Яйце анкілостоми (Ancylostoma duodenalae) правильної овальної форми, оболонка тонка, прозора; у щойно відкладених яйцях по 4 бластомери. Розміри 54-70´36-40 мкм.
Яйця карликового ціп’яка (Hymenolepis nana) овальної форми, оболонка прозора, у середині онкосфера, яка має 6 зародкових гачків. Розміри 40´50 мкм.
Яйце волосоголовця (Trychoceрhalus trichiurus) форми лимона, діжечки. Оболонка товста, багатошарова, золотисто-жовтого кольору, інколи з коричневим відтінком, на полюсах пробочки. У середині яйця дрібнозерниста цитоплазма. Розміри 50-54´36-40 мкм.
Правила проведення лабораторних досліджень
Техніка безпеки при роботі зі зразками
Неправильний забір, перенесення й отримання матеріалу в лабораторії викликають ризик інфікування персоналу.
Контейнери для зразків
Контейнери для зразків мають бути скляними або пластиковими, міцними і не проливатися при закритій пробі або загвинченій кришці. На зовнішній поверхні контейнера не повинно залишатися вмісного в ньому матеріалу.
Для правильної ідентифікації матеріалів контейнери необхідно маркувати. Контейнери слід розміщувати у пластикових сумках.
Заявки на зразки слід поміщати в окремі, бажано пластикові, конверти. На контейнерах із матеріалом, підозрілим на патогенні агенти, має бути нанесена спеціальна помітка «Небезпека зараження».
Транспортування в лабораторію
Для запобігання випадковому проливанню матеріалу рекомендується застосовувати спеціальні зовнішні контейнери для забезпечення вертикального положення контейнерів із зразками. Ці додаткові контейнери можуть бути пластиковими або металічними, обов’язково стійкими до автоклавування, а також до різних хімічних дезінфектантів. Вони підлягають регулярному деконтамінуванню.
Отримання зразків
Лабораторії, які отримують велику кількість зразків, повинні мати спеціальну кімнату або приміщення для їх прийому й оформлення.
Розкриття упаковок
Персонал, який отримує і розпаковує зразки, повинен бути ознайомлений з потенційною загрозою цих матеріалів для здоров’я. При обробці пошкоджених матеріалів робота має здійснюватися за участі асистента. Необхідно користуватися дезінфектантами.
Зразки слід розпаковувати на спеціальних лотках. Всі зразки з поміткою «Небезпека зараження», які надійшли авіапоштою, мають розпаковуватися в боксах.
Робота з піпетками і піпетуючими засобами
1. Користуватися слід піпетуючими засобами. Піпетування ротом абсолютно заборонено.
2. Обов’язково має бути ватний корок на тупому кінці піпетки, який зменшує можливість контамінації піпетуючого матеріалу.
3. Категорично виключається продування повітря крізь рідину, яка містить інфекційний матеріал.
4. Інфекційний матеріал не слід перемішувати шляхом піпетування.
5. Інфіковний матеріал не слід сильно викидати з піпетки.
6. Щоб запобігти випадковостям, пов’язаним із втратою крапель інфекційних культур із кінчика піпетки, робочу поверхню вкривають матеріалами, просякнутими дезінфектантами, їх належить автоклавувати по завершенні роботи.
7. Слід відбирати піпетки достатнього об’єму і відповідного маркування, за допомогою яких можна переносити матеріал, не видавлюючи його до останньої краплі.
8. Контаміновані піпетки слід повністю поміщати у відповідний дезінфектант, налитий у стійкий контейнер. Перед знищенням їх слід витримати в ньому 18-24 год.
9. Лоток з використаними піпетками слід зберігати в робочому боксі, а не поза ним.
10. Не слід використовувати для піпетування шприци з гострими голками для підшкірних ін’єкцій. Такі голки необхідно замінити на тупокінцеві канюлі. Існують спеціальні пристрої для розкриття флаконів із кришками.
Запобігання попаданню інфекційного матеріалу в рот, на шкіру і в очі
1. Великі частки і крапельки матеріалу (5 мкм і більше), які утворюються під час маніпуляцій, потрапляють на відкриті поверхні тіла і руки персоналу. Руки необхідно часто мити. Не слід торкатися руками рота й очей.
2. У лабораторії не можна зберігати і вживати їжу й напої.
3. У лабораторії не слід курити й жувати жуйку.
4. У лабораторії не слід користуватися косметичними засобами.
5. Під час проведення досліджень лице й очі повинні бути захищені щитком або іншими засобами.
Техніка обробки сироватки крові
1. До виконання цієї роботи допускається тільки персонал лабораторії, який пройшов спеціальний інструктаж.
2. Необхідно носити рукавички.
3. Для запобігання утворенню аерозолей і проливанню зразків необхідно, щоб персонал мав добрі навички роботи в лабораторії. Кров і сироватка повинні піпетуватися обережно, не проливатися. Піпетування ротом заборонено.
4. Використані піпетки слід повністю занурювати в розчин натрію гіпохлориту або інший дезінфектант. Перед ліквідацією або знезаражуванням для повторного використання вони повинні витримуватися в цьому розчині не менше 12 год.
5. Використані пробірки з-під зразків, які містять згустки крові та ін., необхідно розміщувати у водонепроникних контейнерах для автоклавування або спалювати.
6. Свіжоприготовлений розчин натрію гіпохлориту використовують для витирання пролитої крові або сироватки.
Забір, маркування і транспортування зразків
1. Під час всіх процедур обов’язкове носіння гумових рукавичок.
2. Забір крові має здійснювати досвідчений персонал.
3. Після венепункції голки виймають із шприців спеціальними цапками і поміщають в окремі лотки. Кров обережно збирають у пробірки, після чого шприци розміщують у спеціальні лотки, пробірки з кров’ю – у спеціальному штативі.
4. На пробірках та інших ємностях із матеріалом, а також на бланках робиться помітка «Небезпека зараження».
5. Пробірки розміщують у пластикові сумки для перенесення в лабораторію. Бланки поміщають в окремі пластикові сумки або конверти.
6. Персонал, який приймає зразки, не повинен відкривати ці сумки.
Клінічні та імунологічні методи діагностики гельмінтозів
Поряд із специфічними методами діагностики гельмінтозів, що ґрунтуються на безпосередньому виявленні гельмінтів, їх фрагментів, личинок або яєць, існують і загальноклінічні методи діагностики, якими користуються при глистних захворюваннях.
I. Морфологічний склад крові
Морфологічний склад крові і вміст гемоглобіну досить часто змінюються при багатьох глистних захворюваннях. Малокрів’я легкого і середнього ступеня частий супутник різноманітних гельмінтозів. Зрідка, особливо при дифілоботріозі, спостерігають типові або атипові форми злоякісної анемії. При гельмінтозі, а також при теніаринхозі і теніозі, крім вираженої перніціозної анемії, більш часто доводиться мати справу з так званою фрустальною формою злоякісної анемії. Анкілостомідозам, навпаки, властива гіпохромна анемія.
Склад білої крові у тій чи іншій мірі часто змінюється при гельмінтозах; спостерігають нейтропенію і лейкоцитоз, частіше відносний, а інколи й абсолютний, зсув вліво й еозинофілію, якій прийнято приділяти велике значення. При аскаридозі та деяких інших гельмінтозах часто спостерігається зменшення числа тромбоцитів і зрідка швидкості осідання еритроцитів.
Еозинофілія у крові – одна з трьох основних ознак, що характеризують трихінельоз, при якому число еозинофілів сягає інколи 80-90% усіх формених елементів крові. Еозинофілія має також велике діагностичне значення при стронгілоїдозі, при деяких нематодозах у період міграції їх личинок в організмі (аскаридоз, анкілостомоз, некатороз), при шистозоматозах і в меншій мірі при інших трематодозах. Що стосується аскаридозу й анкілостомідозів у стадії паразитування в кишечнику, а також трихоцефальозу, теніаринхозу, теніозу, дифілоботріозу та деяких інших гельмінтозів, то для них еозинофілія не характерна і не є надійною діагностичною ознакою. Її потрібно враховувати окремо при кожному з цих гельмінтозів, брати до уваги тривалість інвазії (якщо можливо) і обов’язково вік хворого. Крім того, потрібно звертати увагу і на її стійкість, особливо в районах широкого розповсюдження аскаридозу й анкілостомідозів (враховувати можливість одночасної міграції личинок нематод в організмі), щоб не приписати наявність еозинофілії, викликаної іншими причинами гельмінтозу, що вивчається.
Таким чином, картина крові при різних гельмінтозах, характеризує той чи інший ступінь інтоксикації організму, є завжди прогностичне значення, проте відіграє важливу роль у діагностиці лише деяких глистних інвазій. Для найбільш розповсюджених кишкових гельмінтів діагностичне значення її невелике.
ІІ. Імунологічні методи діагностики гельмінтозів
Імунологічні методи діагностики гельмінтозів за останній час набувають все більшого значення.
Найбільшу діагностичну інформацію при гельмінтозах має алергічна внутрішньошкірна реакція, зокрема, при ехінококозі, стронгілоїдозі, шистозоматозах, філяріїдозах, а також при трихінельозі.
При аскаридозі (період паразитування в кишечнику), трихоцефальозі та ентеробіозі внутрішньошкірна реакція, напевно, не специфічна. Відповідний антиген дає інколи яскраву картину позитивної реакції при інвазії як цим, так і іншим паразитом або навіть у цілком здорових осіб, але часто за наявності інвазії паразитами, з яких готується антиген, реакція буває негативною. Ще рідше, отримується позитивна внутрішньошкірна реакція при теніаринхозі.
Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)
Це високоефективний серологічний метод імунологічної діагностики ехінококозу, який дає позитивний результат у 80-90% випадків захворювання.
Антигеном для реакції є стерильно забрана рідина із ехінококового міхура людини або барана. Її зберігають у запаяних ампулах при температурі 20С. Кожну нову серію антигену перевіряють на активність і специфічність у реакції із сироватками хворих на ехінококоз і здорових (контроль) людей.
Для приготування сенсибілізованих антигеном еритроцитів беруть 8-10 мл танізованих еритроцитів, з’єднують з рівним об’ємом антигену і на 15 хв залишають при кімнатній температурі. Після цього суміш відмивають шляхом центрифугування протягом 10 хв при 2000 об/хв. Осад ресуспензують у фосфатно-сольовому розчині кролячої сироватки (1:250) і знову центрифугують 2%-ну суспензію, яку і використовують для реакції. Постановку реакції проводять у плексигласових пластинках із заглибинами. Дослідну сироватку розводять 10%-ною нормальною кролячою сироваткою від 1:10 до 1:5120 і до кожного розведення першого ряду додають по 2 краплі сенсибілізованих антигеном еритроцитів барана, а в заглибини другого ряду – еритроцити барана, оброблені таніновою кислотою, але без антигену (контрольний ряд). Реакцію оцінюють після витримування їх при кімнатній температурі 5-6 год (попередній результат) і 18-24 год (кінцевий результат).
Реакція оцінюється як негативна у випадках осідання еритроцитів у вигляді рівного кружечка або купки на дні заглибини.
Позитивною реакція вважається при аглютинації еритроцитів у вигляді “парасольки” за відсутності реакції в контрольному ряду. Титр реакції оцінюється по останньому розведенню сироватки, яке дало позитивну реакцію.
Реакція латекс-аглютинації з ехінококовим діагностикумом
Для постановки реакції у хворого беруть 5-6 мл крові з вени й отримують сироватку, яку і використовують.
У центрифужні пробірки розливають досліджувану сироватку, розведену боратно-сольовим буфером від 1:4 до 1:64. Для отримання вказаних розведень у першу пробірку наливають 0,25 мл досліджуваної сироватки і 0,75 мл боратно-сольового буфера (рН 8,2). Це розведення 1:4. У всі інші пробірки наливають по 0,5 мл такого ж буфера. З першої пробірки відбирають піпеткою 0,5 мл суміші і переносять у другу пробірку (розведення 1:8), із другої – у третю, і так до кінця ряду. Із останньої пробірки 0,5 мл суміші виливають так, щоб в усіх пробірках залишилася однакова кількість розведеної сироватки (по 0,5 мл).
У кожну пробірку додають по 0,5 мл ехінококового діагностикума.
Буферний боратно-сольовий розчин кухонної солі (рН 8,2) готують із 50 мл борної кислоти (6,18 г сухої борної кислоти на 1000 мл дистильованої води) і 5,9 мл 0,1М NaOH (8 мл насиченого розчину або 4,0 г кристалічного NaOH на 1000 мл дистильованої води), до суміші додають дистильовану воду до 100 мл і на кожні 100 мл рідини – 0,85 NaCl.
Ехінококовий діагностикум – це антиген (рідина з ехінококового міхура людини або овець), адсорбований на полістирольному латексі з боратно-сольовим буфером (0,1 мл робочого розведення латексу і 0,5 мл антигену в 10 мл боратно-сольового буфера). Діагностикум застосовують як антиген для реакції латекс-аглютинації і випускається в комплекті. У кожний комплект входить 10 ампул (20 діагностичних доз) ехінококового антигену, одна ампула (0,5 мл – дві діагностичні дози) гіперімунної кролячої сироватки й одна ампула (0,5 мл – дві діагностичні дози) контрольної (нормальної) сироватки.
Контролем служать:
1) суміш 0,5 мл боратно-сольового буфера з 0,5 мл діагностикума (1 пробірка);
2) суміш нормальної (контроль) кролячої сироватки в розведеннях від 1:4 до 1:64 з діагностикумом (5 пробірок);
3) суміш відомої позитивної (аглютинуючої) сироватки в розведеннях від 1:4 до 1:64 з діагностикумом.
Пробірки витримують 3 год у термостаті при 37ᵒС і ніч у холодильнику при 4-8Сᵒ. Потім центрифугують при 2-2,5 тис об/хв протягом 5 хв, за кількістю осаду і кольором надосадової рідини оцінюють отриману реакцію.
Реакція вважається негативною, якщо рідина в пробірках мутно-білого кольору (рівномірний розпад часток діагностикума). Реакція буде позитивною, якщо на дні пробірки утворюється білий осад з дрібних флокул, які при легкому струшуванні здіймаються вверх і помітні неозброєним оком або під лупою при збільшенні в 2-3 рази; надосадова рідина злегка мутна. Реакція різко позитивна, коли на дні утворюється великий осад із великих пластівців (флокул); надосадова рідина прозора.
Титр реакції враховують по останньому розведенню сироватки, яке дало позитивний результат. Діагностичний титр реакції не менше 1:8.
Шкірно-алергічна проба (реакція Кацоні)
Позитивні результати і певну діагностичну цінність має внутрішньошкірна реакція при цистицеркозі.
Однією з цінних діагностичних ознак при ехінококозі (проба Кацоні). Вона дозволяє виявити до 90-96% випадків ехінококозу. Для постановки шкірної проби внутрішню поверхню передпліччя обробляють етанолом, після чого внутрішньошкірно вводять 0,1-0,2 мл антигену. Антигеном є стерильна рідина з ехінококових міхурів тварин або полісахаридно-білковий комплекс, виділений із сколексів ехінококових міхурів. На внутрішній поверхні передпліччя іншої руки роблять контроль – вводять 0,1-0,2 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. При правильному введенні на місці ін’єкції утворюється бліда папула. Реакцію враховують через 30 хв (рання реакція) і через 24 год (пізня реакція) за умов відсутності проявів на місці введення ізотонічного розчину.
При слабкій гіперемії реакція вважається негативною.
Сумнівною – якщо діаметр папули на місці введення антигену не перевищує 1,5 см і наявна гіперемія, яка утримуються до 2 год.
У випадках, коли діаметр папули становить 2 см, а гіперемія до 2,5 см і ці явища утримуються 2 год – реакція вважається позитивною.
При різко позитивній реакції розмір папули досягає 3-4 см, гіперемія поширюється на все передпліччя й утримується до 24 год. Через 24 год враховують позитивні результати гіперемії діаметром понад 5-6 см, набряк.
Гіперемія в діаметрі менше 5 см без набряку вважається сумнівною.
Незважаючи на простоту та високу чутливість, цю реакцію не можна здійснювати повторно (можливі анафілактичні явища).
Важливе значення для діагностики деяких гельмінтозів має і реакція преципітації (філяріатози, шистосомози, трихінельоз); вона виявилася неефективною при ехінококозі.
Реакція зв’язування комплементу неодноразово застосовується з метою діагностики багатьох гельмінтозів, але вона поступається в точності алергічній (внутрішньошкірній) і реакції преципітації та практично рідко використовується.
Важливими методами імунодіагностики є:
– РСП (реакція сколекс-преципітації)
– РДДГ (реакція позитивної імунодифузії в гелі)
– РІЕФ (реакція імуноелектрофорезу)
– РІФ (реакція імунофлуоресценції)
– РЛА (реакція латекс-аглютинації)
– РНГА (реакція непрямої гемаглютинації)
– РЕМА (реакція ензиммічених антитіл)
