Використання імунологічних реакцій у діагностиці інфекційних захворювань. Реакції, що базуються на феномені аглютинації та преципітації. Реакції лізису і зв

Використання імунологічних nреакцій у діагностиці інфекційних захворювань. Реакції, що базуються на nфеномені аглютинації та преципітації. Реакції лізису і зв¢язування комплементу.

 

Всі серологічні реакції nвикористовуються з двоякою метою: 1) для виявлення nантитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів – для nсерологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення nневідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними nсироватками-антитілами – для серологічної ідентифікації збудників.

Якщо в nреакції антитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени (бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації (РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антиге­нами (полісахариди, nбілки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У реакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й антитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких залежить від кількісного співвідношення антигену й ан­титіла  

Коли до комплексу антиген — антитіло приєднується nкомплемент, відбувається  реакція nзв’язування  комплементу (РЗК).

Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати nнейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію nнегайної  гіперчутливості.

Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають nвластивості спричинювати РП, РА, РЗК-

У ряді випадків nз’єднання антитіла з антигеном може бути неміц­ним; nоборотність комплексу антиген—антитіло відбувається в результа­ті конформаційних змін молекули антитіла, при надлишку nантигену або зменшенні спорідненості між nантигеном і антитілом, а також під впли­вом nзовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).

Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й полісистемні.

 

РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ Аглютинація – це серологічна реакція між антитілами n(аглютинінами) і антигенами (аглютиногенами), розміщеними на поверхні nбактеріальної клітини, яка приводить до утворення специфічного комплексу nантиген – антитіло.

Клітини nз приєднаними до них аглютинінами з’єднуються у великі агрегати, які nназиваються аглютинатами, і внаслідок цього рівномірна суспензія клітин, nспочатку мутна, склеюється в грудки або пластівці, які зависають у прозорій nрідині або осідають на дно. В аглютинації приймають участь nвиключно поверхневі антигени, які доступні антитілам. Антигени, розміщені у nвнутрішніх структурах клітини, не приймають участі в цій реакції з приводу nвідсутності доступу до них антитіл. Механізм реакції полягає в тому, що під впливом nіонів електроліту зменшується негативний поверхневий заряд бактерійних клітин, nі вони можуть зблизитись на таку відстань, при якій між ними виникає nаглютинація бактерій

 

Механізм nреакції аглютинації

Реакцію nпроводять у пробірках, лунках полістиролових планшеток, на склі, пластмасових nпластинках.

Реакція nаглютинації на склі або пластмасових пластинках найчастіше використовується для nідентифікації поверхневого антигена бактерій з допомогою відомих сироваток. nМетоди аглютинації в пробірках  і полістиролових nпланшетках переважно застосовуються з метою виявлення титру аглютинінів у nдосліджуваній сироватці хворого з допомогою відомих суспензій бактерій n(діагностикумів).

Найбільше nрозведення сироватки, при якому ще спостерігається аглютинація бактерій приймається nза титр сироватки, який характеризує рівень специфічних аглютинінів.

Макроскопічний  і мікроскопічний вигляд аглютинації бактерій nзалежить від виду поверхневого антигена бактерійної клітини, який приймає nучасть у реакції. Аглютиніни, які реагують з О-соматичним антигеном, дають nсоматичну аглютинацію, дрібнозернисту. Соматична аглютинація в пробірках nзавершується через 24 години, при цьому утворюються компактні зерна, грудки, nякі тяжко розбити при струшуванні. Мікроскопічно можна помітити, що бактерії nсклеюються полюсами, утворюючи сітку.

В nаглютинації з поверхневими Vi-антигенами nспостерігається склеювання бактерій між собою всією поверхнею, що дає nрівномірний осад. У певній мірі макроскопічно Vi-аглютинація нагадує соматичну.

Сироватки, які містять антитіла проти джгутиків nбактерій, аглютинують значно швидше. Вже через 30-40 хв окремі конгломерати nбактерій у вигляді пластівців вільно осідають на дно пробірки. Аглютиніни nанти-Н безпосередьо взаємодіють із джгутиками, знерухомлюючи бактерії. nМікроскопічно можна спостерігати склеювання бактерійних клітин з допомогою nджгутиків. Це джгутикова, або Н-аглютинація, крупнозерниста.

 

 

 

 

 

РА бактерій з відповідними аглютинуючими сироватками nхарак­теризується специфічністю. Проте може траплятися nгрупова аглютина­ція, тобто склеювання nблизьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в nслабших розведеннях сироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, бактерія В — b, c, d, бактерія nС — с, d, є, а в сироватках крові імунізованих тварин утво­рюються  відповідні  їм  nаглютиніни.

Для nвиявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тва­рин, імунізованих складним комплексом антигенів nбактеріальної клітини, застосовують nметод адсорбції аглютинінів (реакція висна­ження   Кастеллані).

За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають nтакож анти­генну структуру бактерій; крім того, його використовують для при­готування специфічних nаглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті nметодом адсорбції аглютинінів, називають монорецепторними. Вони дають змогу точніше визначати nвидову залежність низки збудників інфекційних  nзахворювань.

 

При імунізації nтварин рухливими бактеріями, що містять джгути­кові (Н) і соматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. Джгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких пластівців, сома­тичні аглютиніни порівняно повільно утворюють конгломерати бакте­рій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається nкрупнопластівцевою, а О-аглютинація — дрібнозер­нистою.

 

Бактерії, що містять Vi-антиген, слабко або зовсім не аглютинують­ся nО-сироватками, але добре аглютинуються Vi-сироватками. Це до­водить, що О- і Vi-антигени, так само як О- і Vi-антитіла, мають різну структуру.

 

 

 

При здійсненні РА nтреба враховувати феномен затримки аглюти­нації. Це буває як при nзанадто великих, так і при малих концентра­ціях імунної сироватки, взятої для nРА. Цей феномен властивий усім реакціям nімунітету і має враховуватись при лабораторній діагно­стиці інфекційних захворювань.

 

РА широко nзастосовують для серологічної діагностики черевного тифу, паратифів А і В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями Провачека), туляремії, лепто­спірозу та інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці крові хворих відповідні аглютиніни.

 

 

 

РА використовують для ідентифікації виділених у nхворих, людей і тварин мікроорганізмів із застосуванням заздалегідь відомих аглюти­нуючих nсироваток.

Реакція непрямої (пасивної) аглютинації.

 Реакція непрямої (пасивної) аглютинації за своєю nчутливістю значно перевищує звичайну реакцію аглютинації і дозволяє виявити nмінімальну кількість антитіл і антигенів. Така висока чутливість досягається nзавдяки адсорбції антигенів або антитіл на спеціальних інертних частинках n(латекс, бентоніт) або клітинах (еритроцити). Якщо антигени адсорбовані на nеритроцитах, така реакція називається реакцією непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Навантажені nантигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних антитіл і випадають в nосад у вигляді конгломератів (перевернутої «парасольки») на дні пробірок або nлунок

           Антигени для РНГА називаються еритроцитарними nдіагностикумами. Це стандартні препарати, які складаються з антигенів різних nбактерій і вірусів, адсорбованих на поверхні еритроцитів. За допомогою nеритроцитарних діагностикумів можна виявляти в сироватці хворих антитіла до nбудь-якого збудника.

  РНГА можна використовувати й для серологічної nідентифікації збудника. У цьому випадку як індикатор використовують еритроцити, nнавантажені відповідними антитілами. При додаванні до них культури збудника nвиникає феномен гемаглютинації. На відміну від попередньої реакції, її nназивають реакцією оберненої (зворотньої) непрямої гемаглютинації (РОНГА).

Недоліком nпасивної гемаглютинації є те, що антитіла, які знаходяться на поверхні nеритроцитів можуть не викликати їх склеювання. Частково це можна пояснити тим, nщо поверхня еритроцитів має негативний електричний заряд, тому еритроцити в nрозчині утворюють завись і в звичайних умовах утримуються на відстані біля 25 nнм один від одного.

Реакція пасивної гемаглютинації широко використовується у nдіагностиці вірусних, бактеріальних, грибкових і паразитарних інфекцій. Для nнавантаження еритроцитів найчастіше використовуються полісахаридні антигени nбактерій або грибів, які легко адсорбуються на поверхні свіжих еритроцитів nбарана і людини групи 0 Rh(-). Поверхню еритроцитів можна змодифікувати, nвикористовуючи хімічні сполуки (танін, двоазобензидин) і тоді на них з успіхом nможна адсорбувати і білкові антигени.

Реакція пасивної гемаглютинації відноситься до найбільш nчутливих реакцій у порівнянні з аглютинацією, преципітацією і зв’язуванням nкомплементу. З допомогою цієї реакції антитіла в сироватці nхворого при деяких захворюваннях виявляють вже з 3 доби від момента зараження.

 

 

Реакція аглютинації латекса (РАЛ)

РАЛ nза своїм механізмом аналогічна РНГА, в якій приймають участь еритроцити, nсенсибілізовані антигенами або антитілами. Для постановки РАЛ використовують nсенсибілізовані частинки полістиролового латекса діаметром  0,5-1,2 мкм, які в присутності гомологічного nімунологічного реагента (антигена або антитіла) склеюються. Ця реакція nвідбувається досить швидко – протягом 2-7 хв, що дозволяє її застосовувати як nекспрес-метод виявлення антигенів і антитіл.

Навантажені nантитілами часточки латексу широко використовуються для виявлення антигенів nвірусів і бактерій. Наприклад, антигени стрептококів у мазках із зіву можна nвиявити вже через 10-60 хв. Збудників. які викликають запалення мозкових nоболонок (H. ninfluenzae, nS. npneumoniae, nN. nmeningitidis, nC. nneoformans) nможна безпосередньо виявити протягом 15 хв. Латекс-аглютинація широко вживається nдля ідентифікації антигенів ротавірусів, герпес вірусів тощо. Чутливість цих nтестів виносить понад 90 %, а специфічність – 97-99 %. РАЛ використовується nтакож для ідентифікації деяких бактерій (наприклад групи Streptococcus за Ленсфільд, групи Salmonella nі nінш.). В останній час у деяких латекс системах замість поліклональних сироваток nвикористовують частинки латексу, навантажені моноклональними антитілами n(наприклад для виявлення S. nagalactiae).

Навантажуючи nлатекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у сироватці хворого. Таку nмодифікацію РАЛ використовують для виявлення протигрипозних, протикраснушних, nпротикорових антитіл тощо.

Реакцію nаглютинації латексу можна проводити на склі або рівній пластмасовій пластинці nтемного кольору, додаючи до 1-2 крапель кожного розведення сироватки по 1 nкраплі латексного діагностикуму. В залежності від досліджуваного матеріалу, nвеличини частинок латексу та активності діагностикуму облік результатів можна nпроводити через 1-10 хв після змішування інгредієнтів.

При nпозитивній реакції частинки латексу склеюються, утворюючи аглютинат, який добре nпомітний неозброєним оком або при використанні лупи з невеликим збільшенням. У nвипадку негативної реакції суспензія латекса залишається мутною, без крупинок nаглютинату і ділянок просвітління.

 

 

 

Реакція nкоаглютинації (КОА).

 Для nпостановки КОА  використовують золотисті nстафілококи (штам Cowan n1). У клітинній стінці цих мікроорганізмів міститься білок А, який має значну nспорідненість до Fc nфрагмента IgG nлюдини nі кролика. Тому молекули IgG nпісля адсорбції на стафілококах, що мають білок А, орієнтовані в оточуюче nсередовище своїми вільними Fab nфрагментами, в яких знаходиться активний центр антитіла. 

 

 

 

n

Схема механізму реакції коаглютинації

Цим nстафілококові діагностикуми відрізняються від інших антитільних препаратів, в nяких носії (еритроцити, бентоніт, латекс) не мають специфічних рецепторів для Fc фрагмента IgG. На таких інертних частинках nмолекули імуноглобулінів адсорбуються будь-якою ділянкою, без суворої nпросторової конфігурації.

Для nодержання антитільного стафілококового діагностикуму культуру стафілокока, яка nвиросла на рідкому живильному середовищі, центрифугують при 2500 – 3000 об/хв nпротягом 15 хв. Центрифугат двічі промивають ізотонічним розчином хлориду nнатрія, готують 10 % суспензію бактерій  nі фіксують їх 0,5-3,0 % формаліном протягом    20-120 хв. Після фіксації стафілококи nпромивають 4 рази ізотонічним розчином хлориду натрія і знову готують 10 % nсуспензію, яку прогрівають протягом 1 години при температурі 80°С. Перед nзберіганням до суспензії стафілококів додають мертиолят до кінцевої nконцентрації 1: 10000.

Для nсенсибілізації в 10 % суспензію фіксованих стафілококів вносять рівний об’єм nімунної сироватки кролика або її гамаглобулінової фракції у відповідному nрозведенні від 1:10 до 1:20. Стафілококи сенсибілізуть імуноглобулінами nвпродовж 15-30 хв при температурі 20 – 30° С, після чого промивають розчином nхлориду натрія. Готують 0,5-5,0 % суспензію, яку консервують азидом натрія і nзберігають у холодильнику при температурі 4° С.

Зазвичай, nреакцію коаглютинації ставлять на скляних пластинках,  змішуючи рівні об’єми (1-2 краплі) nдосліджуваного матеріала (кров, сеча, слина, фільтрати фекалій та інш.) і nстафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують  і через 2-5 хв на темному фоні враховують nрезультати. Використання темного фону – необхідна умова чіткої реєстрації nреакції КОА, тому що при спостереженні за її результатами при звичайному nосвітленні лише на темному фоні чітко буде проглядатись дрібнозерниста nаглютинація стафілококів.

Кожен nдослід повинен супроводжуватись декількома негативними контролями: 1) nстафілококи, сенсибілізовані  нормальною nсироваткою + досліджуваний матеріал; 2) стафілококовий коаглютинуючий nдіагностикум + матеріал, який не містить збудника; 3) стафілококовий nкоаглютинуючий діагностикум + фосфатно-буферний розчин; 4) досліджуваний nматеріал + фосфатно-буферний розчин.

Реакція nКОА широко використовується для виявлення антигенів різних стрептококів, N. meningitidis  i N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, шигел, сальмонел nтощо.

На nвідміну від бактерій, які часто досліджують у чистій культурі, віруси завжди nвиявляють в якомусь біологічному матеріалі. Тому, щоб попередити неспецифічні nреакції необхідна адсорбція суспензією стафілокока цього матеріала, в якому nможуть міститись IgG n(кров, фекалії). Для цього змішують рівні об’єми 10 % зависі стафілококового nреагента і досліджуваного вірусного матеріала. Суміш інкубують протягом 30 хв nпри 37° С, центрифугують і надосадову рідину використовують для подальшої nроботи для виявлення в ній збудників хвороби.

Метод nз успіхом використовується для ідентифікації вірусів грипу, параміксовірусів, nротавірусів, вірусів гепатиту В тощо.

Реакція Кумбса.

Принцип

При наявності неповних (блокуючих) антитіл на поверхні nеритроцитів досліджуваного пацієнта відбувається аглютинація еритроцитів при nінкубації їх з антиглобуліновою сироваткою (прямий тест Кумбса) або з nрозведеннями сироватки пацієнта в реакції з попередньо сенсибілізованими nеритроцитами донора (непрямий тест).

 

Реактиви.

1. nРозчин 5% цитрату натрію.

2. n0,9% розчин хлориду натрію.

3. nАнтіглобулінюва сироватка (сироватка. Кумбса) з титром преціпітинів не нижче n1:256 – 1:512.

 

Пряма реакція Кумбса.

Хід визначення.

3 nмл крові беруть з ліктьової вени досліджуваного в одну пробірку з попередньо nвнесеним 1 мл 5% розчину цитрату натрію. Еритроцити тричі відмивають у великому nобсязі  ізотонічного розчину натрія nхлориду шляхом центрифугування при 1500 об / хв, протягом 10 хв. З відмитих nеритроцитів готують 5% завис на фізіологічному розчині (1 крапля відмитих nеритроцитів і 19 крапель ізотонічного розчину). На суху чисту білу тарілку наносять nкраплю антіглобулінової сироватки, до неї додають краплю 5% суспензії nеритроцитів досліджуваного. Сироватку перемішують з еритроцитами скляною nпаличкою. Поруч ставлять, контроль, використовуючи замість сироватки  ізотонічний розчин. Кожну нову серію антиглобулінової сироватки ставлять аналогічним nшляхом зі стандартними сенсибілізованими еритроцитами і з інтактними nдонорськими еритроцитами різної групи. Змішані еритроцити з сироваткою злегка nпохитують не більше 10 хв.

 

Облік реакції

Поява nаглютинації вказує на наявність неповних антитіл на поверхні еритроцитів. nРеакція може бути проведена в пробірках. У цьому випадку 2 краплі (0,1 мл) nрізного розведення антиглобуліновоі nсироватки (в залежності, від титру преципітинів) поміщають в пробірки і додають краплю nвідмитих еритроцитів. Обережно струшують і інкубируют 30 хв при 37 ° С.

Облік реакції проводять nпісля центрифугування при 1500 об / хв протягом 1 хв (центрифуга ЦЛК-1).

Непряма реакція Кумбса.

Хід nвизначення.

З ліктьової вени досліджуваного nберуть 3 мл крові в чисту суху пробірку.

Реакція йде в два етапи:

1. сенсибілізація стандартних еритроцитів неповними nантитілами, імовірно знаходяться в досліджуваній сироватці;

2. аглютинація сенсибілізованих еритроцитів nантиглобуліновою сироваткою.

Необхідно використовувати триразово відмиту в ізотонічному розчині суміш nеритроцитів різних аллотипів 0 (I) групи резуспозитивних. Краплю цих nеритроцитів вносять в пробірку і на них нашаровуються 3 краплі досліджуваної nсироватки. Пробірки енергійно струшують і поміщають в термостат при 37 ° С на n40 хв. Паралельно досліду nставлять контрольні проби. Перша: у пробірку з 2 краплями стандартних відмитих nрезуспопозитивних nеритроцитів 0 (1) групи вносять 3 краплі антирезусної сироватки АВ (IV); друга: nу пробірку з 2 краплями відмитих стандартних резуснегативних еритроцитів 0 (1) nвносять 3 краплі сироватки AB (IV). Контрольні пробірки вміщують, так само як і nдослідні, у nтермостат при 37 ° С на 40 хв.

Після термостатування з nпробірок обережно відсмоктують сироватку. Еритроцити тричі відмивають у nфізіологічному розчині натрію хлориду. На суху чисту тарілку наносять в 3 nточках по 1 краплі антиглобуліновоі nсироватки. В першу краплю додають еритроцити, сенсибілізовані сироваткою nпацієнта, в другу і третю – еритроцити контролю 0 (I) резуспозитивних з антирезусною сироваткою AB (IV) і 0 (I) резуснегативні з антирезусною сироваткою AB (IV). Еритроцити ретельно nперемішують скляною паличкою з антиглобуліновою сироваткою. Після цього обережно похитують nтарілку протягом 10 хв, але не більше.

Облік реакції.

При наявності в сироватці пацієнта неповних антитіл у nдослідній суміші буде спостерігатися аглютинація. Контроль з резуспозитивними 0 n(I) еритроцитами повинен дати аглютинацію. У nконтролі з резуснегативними n0 (I) еритроцитами аглютинації не повинно бути. У ряді випадків неповні nантитіла вступають у реакцію при низькій температурі (4° С), про що необхідно nпам’ятати в дослідженнях при підозрі на холодову імунну цитопенії.

Клінічне nзначення.

Виявлення nантитіл до еритроцитів відіграє провідну роль у діагностиці аутоімунних nгемолітичних анемій, есенціальних або вторинних.

При системних захворюваннях (системний nчервоний вовчак, хронічний активний гепатит, хвороба Шегрена) буває частіше nпозитивної непряма реакція Кумбса.

 

До теперішнього часу проба Кумбса широко застосовується в лабораторній nпрактиці для діагностики імунопатологічних станів, зокрема при аутоімунних nгемолітичних анеміях, що характеризуються деструкцією еритроцитів внаслідок nзв’язування клітинної мембрани з антитілами і (або) компонентами системи nкомплементу. З його допомогою виявляють присутність на еритроцитарній мембрані Ig G (зазвичай Ig G1 і Ig G3), які можуть активувати комплемент, а іноді і nкомпоненту комплементу (С3d). Однак в гострому періоді захворювання у зв’язку з nруйнуванням еритроцитів, на яких фіксувалася велика кількість антитіл, при nгемолітичних кризах, а також при недостатній кількості антитіл при хронічному nперебігу хвороби може відзначатися негативна пряма проба Кумбса

Необхідно підкреслити, що непряма проба Кумбса залишається найкращим nметодом індивідуального підбору трансфузійних середовищ, так як дозволяє nнайбільш точно встановити індивідуальну сумісність донора і реципієнта за nеритроцитарних антигенів.

Додаткове виконання прямого антиглобулінового тесту на nнаявність аутоантитіл рекомендується при обстеженні всіх реципієнтів органів і nтканин в передтрансплантаційному періоді і реципієнтів гемопоетичних nстовбурових клітин також і після трансплантації

Крім імуногематології та трансфузіології антиглобулінові nпроби широко застосовуються при діагностиці цілого ряду патологічних станів: nпри гематологічних захворюваннях, включаючи лімфопроліферативні, при системних nзахворюваннях сполучної тканини, хвороби Шегрена, хронічному активному гепатиті nта ін

Активно nвикористовуються проби Кумбса в медичній генетиці та судовій медицині для nвизначення поверхневих еритроцитарних антигенів.

Проба Кумбса відноситься до досить трудомістким методів дослідження, що вимагають особливої nретельності у виконанні. При її використанні зустрічаються деякі труднощі, nпов’язані, зокрема, з інтерпретацією слабопозитивних реакцій. Відомо, що помилкові nслабопозитивні nабо негативні реакції при виконанні проб Кумбса можуть бути наслідком недостатньо nефективного nвідмивання еритроцитів, нейтралізації антиглобулінового реагенту слідами сироватки, а також nконтакту з незнежиреною nповерхнею, на якій може фіксуватися антиглобулін, nвтрачаючи при цьому свою активність. Ще один недолік проби Кумбса – нестійкість nантиглобулінового реагенту, отримання і зберігання якого nмають певні особливості, що також робить важкою кількісну оцінку реакції гемаглютинації з антиглобуліновою сироваткою.

Крім того, дослідження, проведені А. Holburn, D. Voak et al., показали, що причиною хибнонегативних результатів може nбути надмірне струшування при ресуспендуванні суспензії еритроцитів. Помилкові nрезультати при виконанні антиглобулінових тестів можуть також обумовлюватися nприсутністю в антіглобуліновому nреагенті домішок nанти комплементарних антитіл, зокрема до С3d-, С3c-, С4c-і С4d-компонентів комплементу, які адсорбуються на nповерхні тест-еритроцитів в процесі інкубації і створюють видимість позитивного nрезультату.

Зазначені недоліки nлегко усуваються при ретельніму nвідмиванні досліджуваних зразків та контролю за умовами проведення реакції.

В останнє nдесятиліття для скорочення часу проведення непрямої проби Кумбса та підвищення nїї чутливості використовують ізотонічний розчин з низькою іонною силою (LISS) .

Незаперечною перевагою антиглобулінових проби, на думку nряду авторів, є їх висока чутливість, значно переважаюча роздільну здатність nальтернативних методів дослідження, які використовуються для виявлення неагглютинуючих nантитіл.

 

Було проведено порівняння роздільної здатності методів дослідження nсироваток крові на наявність неповних антитіл із застосуванням поліглюкіну, nжелатину і антиглобулінової сироватки. В ході дослідження було здійснено nконтроль титрів неповних анти-D-антитіл у 140 зразках сироваток крові ізоімунних донорів nіз застосуванням желатинового, поліглюкінового і непрямого антиглобулінового nтестів. Постановка даних методів здійснювалася у відповідності із nзагальноприйнятими методиками.

Було встановлено, що за своєю роздільною здатністі методи виявлення nсенсибілізації еритроцитів анти-D-антитілами розташовуються в такій послідовності: nнайбільш чутливий – непряма проба Кумбса, потім желатиновий тест і найменш nінформативний – поліглюкіновий. Отримані в цій серії дослідів результати повною nмірою відповідають літературним даним, що дозволяє зробити висновок про досить nвисокий рівень чутливості проб Кумбса, що дозволяє з великим ступенем nвірогідності ідентифікувати присутність в організмі антиеритроцитарних антитіл, nщо не викликають аглютинації червоних кров’яних клітин.

Тим не менш, при nпостановці проб Кумбса в практиці зустрічаються випадки, коли неповні антитіла nне виявляються, хоча клінічна картина захворювання або попередня імунізація nвказує на можливу nїх присутність. У таких випадках можна припустити, що кількості антитіл nнедостатньо для того, щоб вони преципітувались nантитілами антіглобулінової nсироватки.

Зроблений висновок nпідтверджено nекспериментом, у якому за допомогою методу аналітичного мікроелектрофорезу nклітин було встановлено наявність на тест-еритроцитах анти-D-антитіла, не визначених в непрямій пробі nКумбса. У цій серії дослідів антиглобулінова сироватка додавалася до еритроцитів, nпопередньо інкубованих з сироватками, отриманими з крові імунних nдонорів, в період антитілогенезу, тобто в період, коли відомими nметодами, в тому числі пробою Кумбса, антитіла в них не визначалися.

У проведених дослідженнях доказом присутності неповних антитіл на поверхні nеритроцитів служила статистично значуща зміна величини електрофоретичної nрухливості сенсибілізованих червоних кров’яних клітин після додавання nантиглобулінової сироватки. Необхідно відзначити, що в nподальшому у всіх імунізованих донорів в непрямій пробі Кумбса в сироватці nкрові визначалися анти-D-антитіла.

Gillerand et al. також показали, що для антиглобулінових тестів nхарактерний певний поріг чутливості: позитивний результат відзначається лише nтоді, коли на поверхні одного еритроцита фіксуються не менше 500 молекул Ig G.

Крім того, в літературі наводяться дані на користь того, що можливий nнегативний результат проби Кумбса може бути пов’язаний з низькою афінності nантитіл, сенсибілізуючих еритроцити, внаслідок чого вони легко елюють з nповерхні червоних кров’яних клітин в процесі відмивання.

З урахуванням nвищесказаного можна зробити висновок, що в ряді випадків негативний результат nпроби Кумбса ще не є доказ відсутності фіксованих на поверхні еритроцитів nантитіл.

Відомо, що реакції Кумбса володіють високою специфічністю і дозволяють nвиявити більшість різновидів неповних антитіл. Однак, як nпоказують деякі експериментальні дані, анти глобулінові проби можуть виявитися nпозитивними і при неімунологічних nстанах. E. Muirhead et al. на другий день після введення фенілгідразину собакам nспостерігали позитивну пробу Кумбса. Настільки швидка поява позитивної реакції свідчить проти nїї імунологічної природи і, скоріше, пов’язана з неспецифічної адсорбцією білка на nповерхні еритроцитів.

M. Williams et al. встановили, що клавуланова кислота також може бути причиною позитивної nреакції, що, на думку авторів, пов’язано з неспецифічної адсорбцією плазмових nбілків на еритроцитарній поверхні. Аналогічний ефект спостерігався і при nлікуванні цефалоспориновими антибіотиками .

Автори вищенаведених досліджень підкреслюють неімунологічний характер nотриманих позитивних результатів проб Кумбса і наполягають на тому, що nзазначені речовини здатні викликати модифікацію мембран червоних кров’яних nклітин, в результаті якої еритроцити можуть адсорбувати білки (зокрема, nальбумін), в нормі присутні в плазмі крові і не володіють властивостями nантитіл. Крім того, можливо, саме ксенобіотик, адсорбуючись на клітинній nповерхні, служить сполучною ланкою між мембраною клітини і білками плазми.

Для правильного тлумачення результатів постановки антиглобулінових проб nслід враховувати і кількісне співвідношення між молодими і зрілими еритроцитами nв периферичної крові. Було встановлено, що ретикулоцити, виділені з організму в nперіод посиленої регенерації еритрона, можуть агглютинуватися антиглобуліновою nсироваткою.

Позитивний результат прямого антиглобулінового тесту відзначається і при nрізних патологічних станах, що супроводжуються порушеннями імунної системи, nзапальними процесами, ведучими до неспецифічної адсорбції антитіл різної nспецифічності на мембранах еритроцитів. Це дає підставу вважати, що молекули Ig G не взаємодіють зі специфічними антигенами еритроцитів, а тільки фіксуються nна поверхні досліджуваних клітин.

Слід враховувати, що при постановці проби Кумбса у випадках захворювань, що nхарактеризуються розвитком диспротеїнемії або появою парапротеінів, позитивний nрезультат обумовлений присутністю на поверхні еритроцитів білків, які не nволодіють властивостями антитіл, що також свідчить про недостатню специфічності nантиглобулінових проб щодо природи виявленого з їх допомогою білка.

 

Таким чином, як показали численні дослідження, позитивні nрезультати прямої і непрямої антиглобулінових тестів не є абсолютним доказом наявності nантитіл, оскільки позитивні реакції можуть спостерігатися і при різних nпатологічних станах, не пов’язаних з ізосенсибілізацією або аутосенсибілізацією nорганізму. Тому тільки зіставлення результатів декількох імуносерологичних nметодів з клінічною картиною захворювання дозволяє в повній мірі судити про nхарактер патологічного процесу.

Позитивний непрямий антиглобуліновой тест при негативній прямий пробі nзазвичай вказує на присутність в досліджуваній сироватці алоантитіл у вільному nстані, пов’язане з попередніми переливання крові або вагітностями.

Проба Кумбса nчасто буває позитивною при загостренні пароксизмальної нічної гемоглобінурії; nпозитивна проба Кумбса з анти-С3 і анти-С3dg є маркером холодової аглютиніноваї хвороби.

У випадках, коли великий ризик розвитку гемолітичної хвороби nновонароджених, велике значення для постановки діагнозу (найчастіше під час nвагітності) і при необхідності динамічного спостереження за появою і зміною nтитру антитіл мають результати прямої і непрямої антиглобулінових тестів. nНайчастіше гемолітична хвороба новонароджених пов’язана з несумісністю матері і nплоду по антигену D, рідше – за антигенами системи АВ0 і ще рідше – з інших антигенів (С, с, К nта ін.) Утворені nпри цьому антитіла, будучи, як правило, неповними антитілами класу Ig G, чітко nвиявляються в непрямому антиглобуліновому тесті. При даному захворюванні велике nзначення мають правильне nвстановлені титру nі специфічність виявлених антитіл, оскільки існує певна кореляція між рівнем nантиеритроцитарних антитіл у крові вагітної жінки і можливим прогнозом тяжкості nгемолітичної хвороби.

Непряма проба Кумбса nтакож необхідна в клінічній практиці в цілях забезпечення проведення безпечної nтрансфузійної терапії. Її виконання є обов’язковою складовою імуногематологічних досліджень донорів та різних категорій nреципієнтів, а також планових обстежень всіх пацієнтів nлікувально-профілактичних закладів, яким може знадобитися переливання крові та nїї компонентів.

Непрямий антіглобуліновой тест застосовується в наступних випадках:

– Для більш точного встановлення резус-приналежності (антиген D) при nнечітких результатах визначення резус-фактора іншими методами (поліглюкіновий, nжелатиновий та ін);

– Для виявлення слабких еритроцитарних антигенів (системи Келл, Кідд, Льюіс nта ін) і антитіл до цих антигенів;

– Для виявлення та ідентифікації алоімунних антиеритроцитарних антитіл, nвключаючи антитіла, що викликають гемолітичні посттрансфузійні реакції;

– Для визначення наявності імунних антитіл системи АВ0 при трансфузійних nгемолітичних ускладненнях;

– В якості проби на сумісність при індивідуальному підборі переливання nкрові та її компонентів.

 

Таким чином, проба Кумбса є важливим діагностичним nтестом, що застосовується у різних галузях медицини (гематологія, акушерство, nревматологія, трансфузіологія, клініко-лабораторна діагностика та ін.) Знання nособливостей постановки проби Кумбса допоможе підвищити достовірність отриманих nрезультатів і буде сприяти правильніому nтрактуванні nлабораторних даних.

 

 

Реакція преципітації відрізняється від аглютинації за характером nантигенів: в реакції аглютинації вони корпускулярні, навіть цілі клітини, а в nреакції преципітації – молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути nекстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні речовини.

Реакція преципітації (РП) — nвзаємодія розчинного антигену (пре-ципітиногену) й антитіла n(преципітину) в присутності електроліту (0,85 %   розчин натрію хлориду).

РП має високу чутливість і nспецифічність. Вона дає змогу nвиявити антиген (преципітиноген) у розведенні 1 : 1 000 000 і 1 : 10 000 000. Як преципітиногени можуть бути використані білки nтваринного, рос­линного і бактеріального походження: кров, сироватка крові, nекстрак­ти з різних органів і тканин, nхарчових продуктів білкового похо­дження n(м’ясо, риба, молоко), фільтрати культур мікроорганізмів або тканин, уражених ними. Преципітиногени збудників nсибірки, чуми, туляремії термостійкі. nДеякі преципітиногени витримують нагрівання до температури  120—180 °С.

 

Відомо понад 20 модифікацій РП, які поділяють на nкілька груп: РП у пробірках, капілярах, на предметних стеклах, фільтрувальному папері,  ацетатцелюлозній плівці, в гелі та ін.

РП використовують у nдіагностиці сибірки, туляремії, віспи та ін., а nтакож при вивченні антигенної структури деяких груп бактерій. У судовій медицині за допомогою РП визначають видову nналежність плям крові, сперми; в санітарній nекспертизі виявляють домішки мо­лока nодного виду тварини у молоці іншого виду, добавляння штучного меду до натурального, фальсифікацію м’ясних, рибних, nборошняних виробів і т. д. У біології РП nзастосовують для встановлення генетич­них nзв’язків близьких між собою видів тварин, рослин, мікроорга­нізмів.

Феномен преципітації полягає в тому, nщо антитіла (преципітини), зєднуючись із nрозчинними антигенами (преципітиногенами), зумовлюють утворення осаду n(преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції приймають nнайбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.

 

Феномен преципітації широко використовується в nмікробіологічній практиці.  В nсудово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності nкрові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, nрізних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. nТаким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики nепідемічного цереброспінального менінгіту, чуми, дизентерії,  визначення інфікованості збудником сибірки nпродуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина).

 

 

              

 

Для аналізу складу антигенів nширокого поширення набула реакція преципітації в гелі. Розрізняють просту і nподвійну дифузію в гелі.

Проста nімунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, який містить преципітуючу nсироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху нашаровують розчин антигена. nДифундуючи в гель, антиген звязується з відповідними антитілами, утворюючи nмутні лінії преципітації (рис. 17.10.). Розміщення ліній в агарі визначається nконцентрацією відповідного антигена.

Подвійна nімунодифузія за Оклі і Фулторпом. На відміну від попереднього nметоду у подвійній імунодифузії реагенти розділені шаром нейтрального гелю, nякий не містить реагентів. На поверхню гелю, змішаного з специфічною nсироваткою, вносять шар нейтрального гелю, після застигання якого нашаровують nантиген. Дифундуючи назустріч один одному, антиген і антитіла зустрічаються в nшарі нейтрального геля та утворюють лінії преципітації.

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який розлитий тонким nшаром в чашках Петрі або на предметних скельцях, за допомогою спеціальних nштампів роблять круглі лунки на однаковій відстані одна від одної (4-10 мм). У лунки вносять nдосліджувану сироватку і розчин антигена в різних розведеннях або різні nантигени. Із лунок антигени й антитіла дифундують назустріч один одному, і в nточці їх оптимального співвідношення утворюється преципітат у вигляді тоненьких nбілих ліній. Якщо в сироватці є різні антитіла або антигени декількох видів, зявляються nдекілька ліній преципітації.

 

 

 

 

Ухтерлоні розрізняв 4 основні варіанти реакції між nантигеном і антитілом :

1) при nвзаємодії ідентичних  антигенів із специфічними nантитілами лінії преципітації зливаються, утворюючи дугу;

2) коли обидва nантигени неідентичні – лінії преципітації перехрещуються при умові, що nсироватка містить антитіла проти двох антигенів;

3) при nчастковій ідентичності лінії преципітації нагадують дугу із шпорою. Чим більшою nє спорідненість антигенів, тим шпора менше виражена і розміщується ближче до nдуги;

4) обидві лінії nперехрещуються і одночасно зливаються. Це означає, що обидва антнгена містять nяк одинакові, так і різні детермінанти, які вступають в реакцію з антитілами nполіспецифічної сироватки

        

 

 

                                Варіанти результатів постановки реакції nімунодифузії Ухтерлоні

 

Однією із різновидностей реакції преципітації в гелі є проста радіальна імунодифузія за nМанчіні. За її допомогою визначають концентрацію імуноглобулінів у nсироватці крові.

Методика постановки реакції nнаступна. Розтоплений агар при температурі 56°С змішують з nвідповідною антисироваткою (анти IgG, IgM чи IgA) у співвідношенні n3:1 і швидко вливають у чашку Петрі або на скляні пластинки. Після його nзастигання з допомогою трафарета роблять лунки. У кожну дослідну лунку вносять nпо 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні лунки додають у nчотирьохкратних розведеннях стандартну сироватку  з відомим вмістом імуноглобулінів.

Після чого nчашки або пластинки  поміщають у вологе nсередовище в ексикатор на 24-48 год при 4°С і оцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець преципітації nнавколо лунок. За величиною діаметрів кілець преципітації навколо лунок із nстандартною сироваткою будують калібровальну криву. При цьому враховують, що у nпевному   інтервалі концентрації nімуноглобулінів діаметр кільця прямо пропорційний логарифму концентрації nімуноглобулінів .

 

 

 

 Реакція nрадіальної імунодифузії Манчіні

Феномен преципітації широко nвикористовується в мікробіологічній практиці. Зокрема, у судово-медичній nекспертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За nдопомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин nі птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином nвизначають можливу фальсифікацію продуктів (мясо, мед). Ця nреакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального менінгіту, nчуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція термопреципітації Асколі, nяку використовують для визначення інфікованості збудником сибірки продуктів і nматеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із досліджуваного nматеріалу шляхом кипятіння екстрагують сибірковий антиген, nякий потім використовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за nінформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить феномен nпреципітації. Її використовують для визначення антигенного складу органів і nтканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у складних nсистемах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та інших nзахворювань.

 

2. Імуноелектрофорез є поєднанням двох nметодів – електрофорезу в гелі і наступної після нього подвійної імунодифузії.

Для проведення реакції імуноелектрофорезу використовують скляні пластинки, nпредметні скельця, на які наносять тонкий шар агару або агарози. Спочатку nантигени розміщують в центрі пластинки і розділяють їх в електричному полі. Потім nу канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії розділу антигенів, вносять nспецифічну сироватку. Дифундуючи назустріч один одному, антигени і антитіла у nмісці контакту утворюють дуги преципітації.

 

Лізини і реакції лізису

Лізинами називають nспецифічні антитіла, які спричиняють розчи­нення бактерій, клітин рослин і тварин. Лізис бактерій відбувається за участю двох інгредієнтів: специфічного антитіла, яке є в імунній сироватці, і неспецифічної речовини будь-якої нормальної й імунної сироватки — комплементу.

Лізини мають властивість розчиняти бактерії, nтрепонеми, лептоспіри (бактеріолізини), а також спричиняти глибокі порушення структури еритроцитів n(гемолізини), лейкоцитів та інших клітин (ци­толізини). Вони мають усі основні властивості антитіл, але діють nна антиген тільки  nв присутності  комплементу.

Реакція лізису моносистемна, nнепряма, трикомпонентна. У зв’язку з nнестійкістю комплементу в реакціях лізису використовують консервований комплемент, найчастіше сироватку крові морської nсвинки. Консервують комплемент добавлянням натрію хлориду в nконцентра­ції до 10 %, або 4 % борної nкислоти, або 5 % натрію сульфату, а та­кож висушуванням при nнизькій температурі у вакуумі (ліофілізація).

 

                                                                      а                                                  nб                                                   в

Послідовні фази лізису (а, б, в) холерних nвібріонів.

При імунізації кролів nзависсю еритроцитів барана у них в крові накопичуються nантитіла, що мають властивість змінювати еритроцити, в результаті чого адсорбційний зв’язок між nгемоглобіном і стромою еритроцитів nпорушується, гемоглобін легко проникає з еритроцитів в оточуючу рідину і вона забарвлюється в рожевий nколір. Нагрівання імунної сироватки при nтемпературі 56 °С протягом ЗО хв супроводить­ся nвтратою її гемолітичних властивостей внаслідок інактивування комплементу, а nдобавляння свіжої сироватки крові тварини, навіть неімунізованої, знову відновлює гемолітичні nвластивості імунної сироватки. Якщо в nпробірку вмістити у відповідних кількісних спів­відношеннях гемолітичну nсироватку (антитіло), еритроцити барана (антиген) nі комплемент, то протягом кількох хвилин суміш із каламут­но-червоної   nстає   рожевою   (лаковою).

Реакція гемолізу має яскраво виражену специфічність. її викори­стовують як індикатор для реакції зв’язування nкомплементу.

Отже для nреакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші nклітини. Як антитіло (лізин) використовують специфічну сироватку або сироватку nхворого. Залежно від того, проти яких клітин спрямована дія лізинів, вони мають nсвої назви: проти бактерій – бактеріолізини, спірохет – спірохетолізини, nеритроцитів – гемолізини, проти інших клітин – цитолізини. Комплемент при nутворенні комплексу клітина (антиген) – антитіло, звязується з ним, активується за класичним шляхом і nвикликає розчинення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. nРозрізняють декілька реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу.

Реакція зв’язування комплементу

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації nй преципітації є участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції nгемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з nантитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити nрезультат реакції. Проте відомо, що при утворенні комплексу антиген – антитіло nдо нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають nодин одному, то комплемент не звязується, залишається вільним у nсистемі. При додаванні комплексу еритроцити барана – гемолізини вільний nкомплемент, звязуючись nз ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповідності антигена nантитілу з ним звязується nкомплемент. Щоб переконатись в цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну nсироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при nнаявності гемолізу – реакція негативна.

n

Дослідна система АНТИГЕН (Бактерія,  клітина, вірус тощо)                                                                   АНТИТІЛО (сироватка)                                                                 КОМПЛЕМЕНТ   Комплемент зв’язався  з комплексом антиген-антитіло

Індикаторна  гемолітична система       ЕРИТРОЦИТИ  БАРАНА                      (АНТИГЕН)       ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКА                     (АНТИТІЛО)    Комплемента немає – зв’язався з дослідною системою. Без  комплементу  гемоліз еритроцитів    неможливий.

 

Схема механізму реакції зв’язування комплементу

Для сероідентифікації використовують стандартні nдіагностичні сироватки відомого титру. Для серологічної діагностики nдосліджувану сироватку прогрівають при 56 °С nпротягом 30 хв, для інактивації власного комплементу, а потім готують ряд nпослідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами можуть бути nбактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні речовини, екстракти nорганів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою nсироваткою гвінейської свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку nвикористовують у потрійному титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію nв ізотонічному розчині хлориду натрію.

Підготовка nреагентів. Промисловість випускає стандартні nгемолітичні сироватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при nдовготривалому зберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед nосновним дослідом титрують. У ряду пробірок в обємі 0,5 nмл готують послідовні розведення гемолізину до титру. У кожну пробірку вносять nпо 0,5 мл 3 % зависі еритроцитів, по 0,5 мл комплементу у розведенні 1:10 і по n0,5 мл фізіологічного розчину. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину (табл.17.8). При nвідсутності гемолізу в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за nтрьохплюсовою системою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), nвідсутність гемолізу (–).

Таблиця 17.8

Схема nтитрування гемолітичної сироватки

 

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її розведення, яке в присутності комплементу nвикликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть робочу дозу гемолітичної nсироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки складав 1:1800, то робочою nдозою буде 1:600.

Титрування комплементу проводять в день постановки nРЗК для визначення дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути nтакою, щоб повністю звязалась комплексом антиген-антитіло. nЯкщо якась частина комплементу залишиться незвязаною, nвільною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, останні будуть nлізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний результат nРЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим nкомплементом додають 1 мл ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково nрозводять 1:10 і використовують як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 nмл дози комплементу, починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до nкінцевого обєму n0,5 мл додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка nскладається з рівної кількості 3 % суспензії еритроцитів барана і гемолітичної nсироватки в робочому титрі. Її витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що необхідно для звязування nеритроцитів з гемолізином.

Після приготування відповідних розведень комплементу nв усі пробірки вносять по 1,0 мл гемолітичної системи і до обєму n2,0 0,5 мл ізотонічного розчину. Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину (табл.17.9).

Таблиця 17.9

Схема nтитрування комплементу

 

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. nТитром комплементу буде та його найменша кількість, при якій спостерігається повний nгемоліз (+++). Робоча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і nпрактично вона буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій nпробірці, де є повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу nприймають 0,25, ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Постановка nосновного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК nзапропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з nцією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний nобєм nїї становить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній nпослідовності. Спочатку в пробірки, в яких міститься розведена сироватка nхворого, додають рівні обєми антигена і комплементу в робочій nдозі. Пробірки ретельно струшують і ставлять у термостат при 37 °С на 1 год. За цей час зєднується nантиген з антитілом, і на цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в nтермостаті інкубують гемолітичну систему. Через годину в усі пробірки основного nдосліду додають по 1 мл гемолітичної системи і знову ставлять у термостат. nЧерез 30-45 хв проводять облік реакції при умові повного гемолізу в контролях nсироватки, антигена і комплементу (17.10).

Таблиця 17.10

Схема nпостановки основного досліду РЗК

 

РЗК оцінюють за чотириплюсовою системою: різко позитивна nреакція (++++, +++) – повна затримка гемолізу, рідина безколірна або nблідо-рожевого кольору, еритроцити осідають на дно; позитивна реакція (++) – nчасткова затримка гемолізу, рідина рожевого кольору, компактний осад nеритроцитів; сумнівна реакція (+) – незначна затримка гемолізу, на дні ледь nпомітний осад, рідина рожевого кольору; негативна реакція (–) – повний гемоліз, nосад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу відзначається більш nвисокою специфічністю ніж реакція аглютинації, проте вона менш чутлива. nАнтитіла, які зв’язують комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту nзараження, у той же час аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики nбагатьох інфекційних захворювань, алергічних станів. Вона використовується для nсерологічної діагностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, nлептоспірозу, бруцельозу, туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та інш.), nвірусного походження (грипу, паротиту, цитомегалії, поліомієліту, nлімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), грибкових (кандидозу, nасперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Реакція імунофлуоресценції (РІФ)

 Позитивні результати реакцій аглютинації, преципітації, лізису, nРЗК й інших спостерігають тільки при оптимальному співвідношенні реагентів. Якщо nця умова не виконується, то зафіксувати видимий позитивний результат не завжди nвдається.

Чутливість імунологічних реакцій значно зростає завдяки nвикористанню мічених реагентів, наприклад, антитіл, конюгованих nз флуохромом. При звязуванні таких імуноглобулінів з nантигеном в люмінесцентному мікроскопі спостерігають світіння обєктів n(бактерій, вірусів, клітин), покритих міченими антитілами. Імунофлуоресцентним nметодом можна також визначати антитіла в сироватці хворого, на поверхні клітин nі тканин. У цьому випадку використовують мічені флуоресцеїном сироватки проти nглобулінів людини (антиглобулінові), якими обробляють комплекс антиген-антитіло. nВнаслідок цього він під дією ультрафіолетових променів починає світитись nзеленим світлом.

У першому випадку говорять про прямий, у другому – nпро непрямий імунофлуоресцентний метод.

Імунофлуоресцентні методи вживаються для виявлення nаутоантитіл до тканинних і клітинних антигенів. Використовуючи зрізи тканин, на nпредметному склі можна виявити антитіла до декількох різних антигенів.

Імунофлуоресцентні методи дозволяють ідентифікувати nокремі клітини в суспензії клітин з допомогою виявлення антигенів на поверхні nживих клітин. Для цього суспензію живих клітин, які були попередньо пофарбовані nфлуоресцентними реагентами, пропускають через спеціальний прилад, який заміряє nінтенсивність світіння  кожної клітини в nрізних ділянках спектру і потім розділяє клітини за параметрами світіння.

 

Принципи імуноферментного аналізу nосновні види ІФА застосування в діагностиці

ІФА nбуло розроблено в 70-х роках ХХ століття на перетині імунохімії та інженерної nензимології та являється еволюційним продовженням і альтернативою радіоімунному nаналізу в послідовності серологічних методів діагностики.

На nсьогодні ІФА зайняв міцну позицію в діагностиці інфекційної патології людини, nтварин та рослин, в онкології та ендокринології. Основними перевагами ІФА є:

• висока чутливість і специфічність

• відтворюваність результатів

• простота виконання

• доступність та стабільність реагентів

• гнучкість та можливість модифікації конструкцій

• експресивність та можливість автоматизації для проведення масових аналізів

n

Весь nпроцес імуноферментного аналізу можна умовно поділити на три основні стадії:

1.     Формування специфічного комплексу антиген-антитіло

2.     Введення в утворений комплекс мітки

3.     Візуалізація мітки

З nточки зору способу виконання всі методи ІФА можна розділити на дві групи:

• системи, що не потребують розділення компонентів (гомогенні методи): якщо активність мічених молекул, які зв’язані з антитілами, суттєво відрізняється від активності вільних мічених молекул

• системи, які потребують розділення (гетерогенні методи): отримують дві окремі фракції міченого ліганда – зв’язану з антитілами і вільну, а лише потім вимірюють активність зв’язаних мічених молекул (твердофазний імуноферментний аналіз, ТІФА)

n

В nякості твердої фази в ТІФА використовують 96-лункові полістиролові планшети, nякі здатні сорбувати макромолекули. В кожній лунці планшету проводиться аналіз nокремого зразку.

Основні компоненти в ТІФА

Основними nкомпонентами твердофазного ІФА є: імуносорбент – адсорбовані на твердій фазі nантигени або антитіла (залежно від цілей аналізу), імуноферментний кон’югат – nковалентно зшиті з ферментом специфічні антитіла або антигени та досліджуваний nматеріал – біологічні рідини організму.

В nякості антигенів можуть використовуватися очищені нативні антигени nмікроорганізмів або їх аналоги – рекомбінантні білки та синтетичні пептиди.

В nякості антитіл використовують поліклональні (пул специфічних антитіл, виділених nз сироваток тварин) або моноклональні (моноспецифічні антитіла, отримані nметодами клітинної інженерії) антитіла.

Імуноферментні nкон’югати – це ковалентно зшиті молекули антигенів або антитіл з ферментом. nОдним із біологічних феноменів, на якому базується ІФА, являється висока nкаталітична активність ферментів, які використовуються в якості індикатора в nІФА.

Основними nферментними мітками є:

• пероксидаза хрону – фермент, що найчастіше використовується; містить вуглеводні залишки, що легко окиснюються періодатом, через які може відбуватися зв’язування ферменту з антитілами або антигеном

• лужна фосфатаза – дуже стабільний, але дорогий фермент

• β-D-галактозидаза – рідко використовується

• глюкооксидаза – рідко використовується

n

Основні nваріанти ТІФА

• Непрямий ТІФА

n

• ТІФА на основі IgM-захоплення

n

• “Сендвіч”-ТІФА

n

• Комбінований IgM-захоплення

n

• Конкурентний ТІФА

n

 

Полімеразна nланцюгова  реакція (ПЛР)

Метод молекулярних зондів базується на гібридізації nміж фрагментом нуклеотидної послідовності (зондом), який несе найбільш nхарактерний для даного виду бактерій ген з полімерною ДНК мікроба, якого досліджують. nДля збільшення кількості полінуклеотидів у досліджуваному матеріалі, а також nдля одержання значної кількості копій молекулярних зондів використовується полімеразна ланцюгова  реакція.

Полімеразна ланцюгова  реакція є багатократно повторюваними циклами nсинтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК-мішені (бактерії, віруса тощо) у nприсутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидтрифосфатів (дНТФ), nвідповідного буфера та олігонуклеотидних затравок-праймерів, nякі визначають границі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.

 

ДНК-полімераза – фермент, який здатний подовжувати nкороткі ланцюги ДНК, так звані нуклеотидні праймери, при умові, що вони nзв’язані з більш довгим матричним ланцюгом ДНК. При цьому полімераза приєднує nдо 3^‘  – кінця зв’язаного nпраймера відповідний комплементарний нуклеотид. Проте, якщо додати nдидезоксиаденозин (ддА) подальше подовження ланцюга буде неможливим, оскільки nдо 3′  – кінця ддА нуклеотиди nприєднуватись вже не будуть.

Кожний цикл складається з трьох стадій. На першій nстадії при 94° С відбувається nрозділення ланцюгів ДНК, на другій – при 50-65° nС праймери приєднуються до гомологічних послідовностей на ДНК-мішені і на nтретій стадії при температурі 72° nС синтезуються нові ланцюги за допомогою подовження праймера в напрямку 5′  – 3′ .

У кожному циклі nздійснюється подвоєння кількості копій ампліфікованої ділянки, що дозволяє за n25-30 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою відібраних праймерів, у nкількості, достатньої для її виявлення з допомогою електрофорезу.

Ланцюгова полімеразна реакція

Для діагностики кожної інфекції підбирається система праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, який має для кожної системи праймерів свою довжину.

Чутливість метода дуже висока, так як дозволяє nзбільшити кількість копій досліджуваного ланцюга ДНК в 10⁶-10⁸ nраз. Він може бути використаний для виявлення будь-якого інфекційного агента, nколи відома нуклеотидна послідовність гена (або його фрагмента) специфічного nвиключно для даного збудника.

Особливо доцільно використовувати ЛПР у тих nвипадках, коли важко виділити збудник у чистій культурі, якщо мікроорганізм nвідзначається високою антигенною мінливістю, коли в досліджуваному матеріалі nнизька концентрація збудника, або він розміщений внутріклітинно:

1. Бактерії – Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferi,  Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae, C. trachomatis, Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pilori, Neisseria gonorrhoeae та інш.

2. Віруси – HIV 1 і HIV 2, ентеровіруси, ротавіруси, nвіруси гепатитів, герпесу 6 і 7 тощо.

ЛПР широко застосовується в судовій медицині, nтрансплантології (типування лейкоцитарних антигенів), діагностиці пухлин, nвиявленню генетичних захворювань.

Імуноблот (вестерн блот)

 

Вестерн – блот n( вестерн- блот, білковий імуноблот, англ. Western blot ) – аналітичний метод, nякий використовується для визначення специфічних білків у зразку. На першому nетапі використовує електрофорез білків у поліакриламідному гелі для розділення nденатурованих поліпептидів по довжині (як правило, у присутності SDS) або по nтривимірній структурі білка (в нативному стані). Далі білки переносять на nнітроцелюлозну або PVDF мембрану, потім детектируют з використанням антитіл, nспецифічних до заданого білку.

Існує безліч nкомерційних компаній, що спеціалізуються на виробництві антитіл (як nмоноклональних так і поліклональних ) до десятків тисяч різних білків.

Вестерн – блот nвикористовується в молекулярній біології, біохімії, генетики і в інших nприродничо-наукових дисциплінах.

Інші подібні nметоди використовують антитіла для визначення білків в тканинах і клітинах nдопомогою іммуноокрашіванія та імуноферментного аналізу ( ІФА, англ. ELISA).

Вестерн – блот nбув розроблений в лабораторії Джорджа Старка ( англ. George Stark ) у nСтенфорді. Назва вестерн- блот було дано техніці У. Нейлом Бурнетт ( англ. W. nNeal Burnette ) і є грою слів від назви Саузерн блот, – методики визначення ДНК, nрозробленої раніше Едвіном Саузерном. Аналогічний метод визначення РНК nназивається Нозерн блоттинга, детекція посттрансляційних модифікацій білків nназивається істерн блоттинга ( англ. Eastern blotting ).

1 Підготовка nзразка

2 Гель- nелектрофорез

3 Перенесення nна мембрану

4 Блокування

5 Детекція

6 Аналіз

6.1 nколориметрична детекція

6.2 nхемілюмінесцентних детекція

6.3 nРадіоактивна детекція

6.4 nФлюоресцентна детекція

7 Протоколи

8 Примітки

9 Див також

10 Посилання

Підготовка зразка

Зразок може nбути взятий з цілісної тканини або з клітинної культури. У більшості випадків, nтверді тканини спочатку подрібнюються механічно з використанням блендера ( для nзразків великого обсягу ), з використанням гомогенізатора (менші обсяги), або nобробки ультразвуком. При цьому бактерії, віруси і інші компоненти nнавколишнього середовища також є джерелом білків.

Різні nдетергенти, солі і буфери можуть бути застосовані для поліпшення лізису клітин nі розчинення білків. Інгібітори протеаз і фосфатаз часто додаються для nзапобігання розщеплення зразків їх власними ферментами. Підготовка тканин часто nвиконується при низьких температурах, щоб уникнути денатурації білка.

Для розділення nрізних клітинних компартментов і органел застосовують комбінації біохімічних і nмеханічних методик фракціонування, в тому числі, різні типи фільтрації і nцентрифугування.

Гель- електрофорез

Білки nрозділяються за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Поділ білків nможна робити по ізоелектричної точці ( pI ), молекулярній масі, електричному nзаряду або за поєднанням цих параметрів.

Найбільш nпоширений спосіб розділення білків – електрофорез у поліакриламідному гелі в nприсутності додецилсульфату натрію ( англ. SDS ) за Леммлі. SDS викликає nденатурацію білків і підтримує їх у денатурованому стані, для руйнування nвторинних і третинних структур білків використовують відновники дисульфідних nзв’язків, наприклад, дітіотреїтолу і меркаптоетанол. Денатуровані поліпептиди nмігрують в електричному полі через акріламідний гель до анода, при цьому білки nменшого розміру рухаються швидше і, таким чином, поділяються відповідно з nмолекулярною масою. Концентрація акриламіду визначає роздільну здатність гелю – nчим вище концентрація акриламіду, тим кращий розподіл низькомолекулярних nбілків. Низька концентрація акриламіду покращує роздільну здатність для nвисокомолекулярних білків. Також можливе використання двомірного електрофорезу n( 2- D). У такому випадку поділ білків відбувається у двох напрямках – nвідповідно до їх ізоелектричної точкою в першому напрямку, і відповідно з молекулярною nмасою – у другому.

Зразки на гель nнаносять у кишені. Як правило, одну з « доріжок » залишають для маркерів nмолекулярної маси (суміші білків з відомими масами ). Після подачі напруги nбілки рухаються в електричному полі з різною швидкістю. Відмінності у швидкості nпросування – електрофоретичної рухливості призводить до поділу білків на смуги n( англ. bands ).

Перенесення на мембрану

 

Щоб зробити nбілки доступними для антитіл і подальшої детекції, їх разом з смужкою гелю nпереносять на мембрану, виготовлену з нітроцелюлози або полівініліденфториду ( nангл. PVDF ). Мембрана накладається поверх гелю, а поверх неї кладуть стопку nфільтрувального паперу. Всю стопку поміщають в буфер для переносу, який nпросувається верх по паперу під дією капілярних сил, забирає із собою білки. nІнший метод перенесення білків називається електроблоттінгом і використовує nелектричний струм, який переносить білки з гелю на мембрану. Білки nпереміщуються з гелю на мембрану із збереженням свого розташування. В nрезультаті цього « промаківанія » ( від. англ. Blotting ) процесу білки nутримуються на тонкому поверхневому шарі мембрани для детекції. Обидва варіанти nмембран використовують через їх властивості неспецифічно пов’язувати білки. nЗв’язування білків засноване як гідрофобних взаємодіях, так і на nелектростатичних взаємодіях між мембраною і білком. Нітроцелюлозна мембрана nдешевше PVDF, але набагато більш тендітна і гірше витримує повторне нанесення nміток.

Однаковість і nзагальна ефективність переносу білків з гелю на мембрану може бути перевірена nфарбуванням мембрани барвниками Coomassie blue або Ponceau S. Coomassie nнайбільш поширений з двох, а барвник Ponceau S має більшу чутливість і краще nрозчинний у воді, що спрощує подальшу відмивання і нанесення міток на мембрану.

Блокування

 

Як тільки обрана nмембрана за її здатність зв’язувати білки, обрані антитіла і цільовий білок, nповинні бути вжиті заходи по виключенню взаємодії між мембраною і антитілом, nвикористовуваним для детекції цільового білка (бо антитіло саме по собі білок). nБлокуванням неспецифічних зв’язувань досягається периміщення мембрани в nрозчинений розчин білка – зазвичай бичачий сироватковий альбумін або нежирне nсухе молоко, з невеликим відсотком детергенту типу Tween 20 або Triton X -100. nБілок з розчиненого розчину прикріплюється до мембрани у всіх місцях, де не nприкріпився цільовий білок. Тому, при додаванні антитіл, їм ( антитілам ) немає nвільного місця на мембрані, куди б вони могли прикріпитися, крім сайтів nзв’язування на специфічних цільових білках. Цей фоновий “шум” в nостаточному продукті вестерн блоту призводить до чистих результатів і nвиключенню помилково- позитивних.

Виявлення

 

Під час nпроцесу виявлення мембрана « мітиться » досліджуваним білком з модифікованим nантитілом, яке пов’язане з ферментом, який витримується на відповідній nпідкладці, приводячи до колориметричої реакції і даючи колір. У силу різних nпричин, детекція проводиться в два етапи, хоча зараз доступний однокроковий nметод детекції для певних областей застосування.

Антитіла nвиробляють, впливаючи на клас хазяйських або на культуру імунних клітин деяким nбілком (або його частиною). Зазвичай це частина імунної відповіді, а тут ( в nаналізі ) зібрані антитіла використовуються як специфічний і чутливий nінструмент детекції, який безпосередньо зв’язується з білком.

Після nблокування розведений розчин первинних антитіл ( зазвичай між 0.5 і 5 мкг / мл) nінкубується з мембраною і злегка струшується. Зазвичай розчин складається з nбуферного розчину солі з невеликою відсотковим вмістом детергенту, іноді з nсухим молоком або БСА. Розчин антитіл і мембрана можуть бути разом закриті і nінкубувати де завгодно від 30 хвилин до залишення на ніч. Також вони можуть nбути інкубували при різних температурах, при підвищеній температурі nспостерігається краще скріплення – і специфічне ( цільового білка, « сігнал1 » n) і неспецифічне ( « шум »).

Після nполоскання мембрани для видалення незв’язаних первинних антитіл, мембрану nвитримують в інших антитілах, безпосередньо зв’язуються з клас – специфічними nділянками первинних антитіл. Вони відомі як вторинні антитіла і відповідно до nїх цільовими властивостями, як правило називаються за типом « anti – mouse », « nanti – goat », і так далі. Антитіла отримують з тваринного джерела ( або тварин n- джерел культури гібридом ) ; анти- мишачі вторинні антитіла будуть nзв’язуватися з більшістю первинних антитіл, отриманих з мишей. Це створює деяку nекономію, дозволяючи окремої лабораторії використовувати одне джерело масового nвиробництва антитіл, і веде до набагато більш відтворюваним результатами. nВторинні антитіла зазвичай пов’язують з біотином або з репортерного ферментом, nтаким як лужна фосфатаза або пероксидаза хрону. Це означає, що кілька вторинних nантитіл можуть зв’язуватися з одним первинним і підсилювати сигнал.

Найбільш nпоширені, пов’язані з пероксидазою хрону вторинні антитіла використовуються для nрозрізання хемілюмінесцентного агента, і продукт реакції виробляє люмінесцентне nвипромінювання пропорційно кількості білка. Лист світлочутливої ​​фотографічної плівки поміщається навпроти мембрани і nпіддається дії випромінювання реакції, створюючи зображення смуг антитіл на nблотом. Більш дешевий, але менш чутливий підхід з використанням 4- nхлоронафтольного фарбування в суміші з 1% перекисом водню ; реакція nпероксидного радикала з 4- хлоронафтолом дає темно – коричневе забарвлення, яке nреєструється без використання спеціальної фотографічної плівки.

Як і в nметодиках ELISPOT та ІФА, фермент може забезпечуватися молекулою субстрату, яка nперетворюється ферментом у кольоровій продукт реакції, а він буде видно на nмембрані. Інший метод детекції вторинними антитілами використовує антитіла зі nзв’язаним флюорофором, який випромінює в ближній інфрачервоній області ( NIR ). nСвітло, що випромінюється флюоресцентним барвником, постійний і робить nфлюоресцентную детекцию більш точним і чутливим способом вимірювання різниці в nсигналі, виробленому білками, які мічені антитілами, на вестерн блот. Білки nможуть бути визначені кількісно, так як сигнал розраховується як різниця ( nвипромінювання ) по відношенню до всіх білків на мембрані, визначеному у nстатиці, до (випромінювання) хемілюмінесценції, яка вимірюється в динаміці.

Третій nальтернативний метод використовує радіоактивну мітку замість ферменту, nпов’язаного з вторинним антитілом, таку як мічене антитіло -зв’язуючий білок nтипу білка А Staphylococcus з радіоактивним ізотопом йоду. Інші методи nбезпечніші, швидші і дешевші, тому радіоактивна детекція використовується nрідко.

Аналіз

Після nвідмивання незв’язаних міток, вестерн блот готовий до виявлення зондів, що nзв’язалися з цільовим білком. На практиці, не у всіх вестернах виявляють білки nлише по одному бенду на мембрані. Приблизний розмір обчислюють порівнюючи nпофарбовані бенди з маркерами молекулярної маси, доданими при електрофорезі. nПроцес повторять з структурними білками, такими як актин або тубулін, які не nзмінюють між експериментами. Кількість цільового білка залежить від кількості nконтрольного структурного білка між групами. Цей прийом забезпечує корекцію nкількості загального білка на мембрані у разі помилки або неповного переносу.

Колориметричне виявлення

Метод nколориметричої детекції заснований на інкубації вестерн блоту з субстратом, nякий реагує з репортерним ферментом (таким як пероксидаза хрону, англ. nHorseradish peroxidase ), « яке приєднане » до вторинного антитіла. Розчинний nбарвник переходить в нерозчинну форму іншого кольору, осідаючи гопоруч з nферментом і фарбуючи мембрану. Зростання плями обмежується змиванням розчинної nбарвника. Рівень кількості білка оцінюється денситометрично за інтенсивністю nфарбування або спектрофотометрично.

Хемілюмінесцентне виявлення

Метод nхемілюмінесцентного виявлення грунтується на інкубації нітроцелюлозної мембрани nз субстратом, який люмінесцує після взаємодії з вторинним антитілом. Світло nреєструється фотоплівкою або CCD -камерою, яка виробляє цифрову зйомку вестерн nблоту. Зображення аналізується денситометрично, оцінюючи відносну кількість nпофарбованого білка і дає кількісний результат в одиницях оптичної щільності. nНове програмне забезпечення дозволяє провести подальший аналіз даних, nнаприклад, визначити молекулярну вагу, якщо використовувався відповідний nстандарт.

 

 

Радіоактивне виявлення

Радіоактивні nмітки не потребують ферментних субстратів, а дозволяють поміщати медичну nРадіографічну плівку навпроти вестерн блоту, даючи їй  можливість взаємодіяти з мітками і створюючи nтемні ділянки, які відповідають смугам досліджуваного білка.

 

 

 

Матеріали для самопідготовки склали доц. Творко М.С.,  доц. Романюк Л.Б.